CN101985618A - 一种能源植物小桐子基因组dna提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因组DNA提取方法，具体为一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法。一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤：a)DNA的提取；b)DNA的纯化；c)于-20℃下保存备用；d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。通过一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法可提取高质量的能源植物小桐子基因组DNA，并能用于小桐子的种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等研究。

Description

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法

技术领域

本发明涉及基因组DNA提取方法，具体为一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法。

背景技术

传统的植物基因组DNA提取方法中，多采用的是CTAB(2％)法，但小桐子属于大戟科，是多乳汁型的植物，即使是在叶片中乳汁含量也很高，含有大量的多糖和多酚成分，传统的阳离子型去污剂十六烷及三甲基溴化铵(2％CTAB)法是无法有效去除这些杂质以获得高质量的基因组DNA。

发明内容

本发明正是针对以上技术问题，提供一种能有效去除杂质，优化DNA提取和纯化操作流程的一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：

a)DNA的提取：先采集小桐子新鲜的嫩叶片，用蒸馏水清洗干净，将叶片表面水分擦净；将叶片0.1-0.2克在研钵中加液氮磨成粉末，研磨的时候加入约10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)以防止氧化；再将研磨的粉末转移到2mL离心管，加入0.5ml 65℃预热的4×CTAB抽提缓冲液(4％CTAB，20mM EDTA，3.5MNaCl，100mM Tris-HCl pH 8.0和2％β-巯基乙醇)，充分摇匀，再于65℃水浴90分钟，每5分钟缓慢摇动一次，使混合物进一步充分混匀；待混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)轻柔混匀并抽提，每次抽提时间为5分钟；以8000转/分钟高速离心8分钟后取上层液体；用氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)重复抽提一次；定量移取上层清液于新的2ml离心管中，再加入5M NaCl(在混合液中达到终浓度为2M)和0.6倍体积的异丙醇，室温孵育1小时；移取上清液，加入2倍体积80％乙醇，并在室温放置10分钟，以使DNA沉淀；以10,000转/分钟高速离心15分钟；弃上层液体，获得DNA沉淀，并用70％乙醇漂洗2次后，室温或通气风干DNA，用200uLTE溶液溶解。

b)DNA的纯化：在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37℃处理30分钟以去除RNA；加入等体积的Tris饱和酚，混合均匀(注意动作轻柔，避免引起DNA断裂)，直至形成乳白状混合物；以10,000转/分钟高速离心5分钟；将上清液移至新的2mL离心管；再用氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)抽提两次；移取的上清液用0.6倍体积的异丙醇(NaCl终浓度为2.0M)孵育10分钟；移取上清液，加入20uL醋酸钠和1倍体积的80％乙醇，静置30分钟，以10,000转/分钟高速离心15分钟，收获DNA沉淀；沉淀的DNA用70％乙醇洗涤2次，风干后用50uL TE溶液溶解。

c)于-20℃下保存备用。

d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中增加了提取缓冲液CTAB的浓度，达到了4％。提取缓冲液的NaCl浓度达到了3.5M，优化了能源植物小桐子基因组DNA的提取。

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中，在DNA的纯化中增加了用Tris饱和酚单独抽提的步骤，纯化了能源植物小桐子基因组DNA的提取。

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中，使用的是在2.0M NaCl条件下用80％乙醇进行DNA的沉淀，且所有步骤可以在室温下操作这样获得小桐子优质的基因组DNA适于各种分子遗传研究方面应用。

本发明的技术效果表现在：可提取高质量的能源植物小桐子基因组DNA，并能用于小桐子的种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等研究。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明

实施例：

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，包括以下步骤：

a)DNA的提取：先采集小桐子新鲜的嫩叶片，用蒸馏水清洗干净，将叶片表面水分擦净；将叶片0.1-0.2克在研钵中加液氮磨成粉末，研磨的时候加入约10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)以防止氧化；再将研磨的粉末转移到2mL离心管，加入0.5ml 65℃预热的4×CTAB抽提缓冲液(4％CTAB，20mM EDTA，3.5MNaCl，100mM Tris-HCl pH 8.0和2％β-巯基乙醇)，充分摇匀，再于65℃水浴90分钟，每5分钟缓慢摇动一次，使混合物进一步充分混匀；待混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)轻柔混匀并抽提，每次抽提时间为5分钟；以8000转/分钟高速离心8分钟后取上层液体；用氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)重复抽提一次；定量移取上层清液于新的2ml离心管中，再加入5M NaCl(在混合液中达到终浓度为2M)和0.6倍体积的异丙醇，室温孵育1小时；移取上清液，加入2倍体积80％乙醇，并在室温放置10分钟，以使DNA沉淀；以10,000转/分钟高速离心15分钟；弃上层液体，获得DNA沉淀，并用70％乙醇漂洗2次后，室温或通气风干DNA，用200uLTE溶液溶解。

b)DNA的纯化：在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37℃处理30分钟以去除RNA；加入等体积的Tris饱和酚，混合均匀(注意动作轻柔，避免引起DNA断裂)，直至形成乳白状混合物；以10，000转/分钟高速离心5分钟；将上清液移至新的2mL离心管；再用氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)抽提两次；移取的上清液用0.6倍体积的异丙醇(NaCl终浓度为2.0M)孵育10分钟；移取上清液，加入20uL醋酸钠和1倍体积的80％乙醇，静置30分钟，以10,000转/分钟高速离心15分钟，收获DNA沉淀；沉淀的DNA用70％乙醇洗涤2次，风干后用50uL TE溶液溶解。

c)于-20℃下保存备用。

d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中增加了提取缓冲液CTAB的浓度，达到了4％。提取缓冲液的NaCl浓度达到了3.5M，优化了能源植物小桐子基因组DNA的提取。

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中，在DNA的纯化中增加了用Tris饱和酚单独抽提的步骤，纯化了能源植物小桐子基因组DNA的提取。

一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法中，使用的是在2.0M NaCl条件下用80％乙醇进行DNA的沉淀，且所有步骤可以在室温下操作这样获得小桐子优质的基因组DNA适于各种分子遗传研究方面应用。

运用一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法可提取高质量的能源植物小桐子基因组DNA，并能用于小桐子的种群遗传学、系统进化、分子标记辅助育种等研究。

Claims (1)

1.一种能源植物小桐子基因组DNA提取方法，其特征在于：

包括以下步骤：

a)DNA的提取：先采集小桐子新鲜的嫩叶片，用蒸馏水清洗干净，将叶片表面水分擦净；将叶片0.1-0.2克在研钵中加液氮磨成粉末，研磨的时候加入约10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)；再将研磨的粉末转移到2mL离心管，加入0.5ml 65℃预热的4×CTAB抽提缓冲液(4％CTAB，20mM EDTA，3.5M NaCl，100mM Tris-HCl pH 8.0和2％β-巯基乙醇)，充分摇匀，再于65℃水浴90分钟，每5分钟缓慢摇动一次；待混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)轻柔混匀并抽提，每次抽提时间为5分钟；以8000转/分钟高速离心8分钟后取上层液体；用氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)重复抽提一次；定量移取上层清液于新的2ml离心管中，再加入5M NaCl(在混合液中达到终浓度为2M)和0.6倍体积的异丙醇，室温孵育1小时；移取上清液，加入2倍体积80％乙醇，并在室温放置10分钟，以使DNA沉淀；以10,000转/分钟高速离心15分钟；弃上层液体，获得DNA沉淀，并用70％乙醇漂洗2次后，室温或通气风干DNA，用200uLTE溶液溶解。

b)DNA的纯化：在粗DNA的TE溶液中加入20uL 10mg/mL的RNA酶，于37℃处理30分钟以去除RNA；加入等体积的Tris饱和酚，混合均匀直至形成乳白状混合物；以10,000转/分钟高速离心5分钟；将上清液移至新的2mL离心管；再用氯仿/异戊醇(24∶1，V V^-1)抽提两次；移取的上清液用0.6倍体积的异丙醇(NaCl终浓度为2.0M)孵育10分钟；移取上清液，加入20uL醋酸钠和1倍体积的80％乙醇，静置30分钟，以10,000转/分钟高速离心15分钟，收获DNA沉淀；沉淀的DNA用70％乙醇洗涤2次，风干后用50uL TE溶液溶解。

c)于-20℃下保存备用。

d)用紫外分光光度计在260nm、280nm和230nm下对DNA进行纯度和浓度检测。