CN102286461A - 成品烟烟丝总dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种成品烟烟丝总DNA的提取方法，改良了传统的CTAB法提取DNA方法，事先采用70％乙醇水溶液对样品的前处理，加大CTAB沉淀缓冲液体积，解决了成品烟烟丝中DNA提取难度大的难题，为各类卷烟的总DNA提取提供了一套稳定、完整、可行的方法。本发明的提取方法提高了DNA的沉淀效率，降低DNA提取难度。

Description

成品烟烟丝总DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及烟丝技术领域，尤其是成品烟烟丝总DNA的提取方法。

背景技术

在实际生产中，由于年景的不同，烟叶会受到气候等因素的影响，某些地区的烟叶质量会发生波动，造成卷烟质量也发生波动。卷烟企业就会根据烟叶变化情况对叶组配方进行调整，即进行烟叶临时替代。在烟叶临时替代过程中，烟叶品种的变化对卷烟感官品质有重要影响。通过提取得到卷烟烟丝中DNA，建立卷烟产品的DNA指纹数据库，将卷烟配方DNA指纹图谱与卷烟感官评吸相结合，能对卷烟市场产品质量监督检查提供更科学的依据，如通过对卷烟烟丝DNA的分析，能从根本上鉴别出卷烟的真伪；卷烟作为一种转基因的模式植物，为杜绝进出口卷烟中的转基因成分，对卷烟进行出口前检测是必不可少的工作环节。

因此，研究一种简单、快速的卷烟烟丝中DNA的提取方法对卷烟质量的监控、卷烟真伪鉴别和卷烟转基因检测都有重要意义。然而卷烟是一种深加工食品，而加工程度越深，DNA的提取难度就越大。成品卷烟烟丝已经不能提取得到完整的基因组DNA。因为成品烟丝与新鲜烟叶的不同在于其经过初烤、复烤、切丝、烘丝等工序中的高温、高压、高湿、机械加工剪切以及加香加料后制成烟丝，不但增加了DNA提取过程中的污染物，还使基因组DNA严重降解，成为小于1000bp的小片段。由于烟草植物中次生代谢产物多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响烟草DNA纯度最常见的问题。

朱生伟等利用改良后SDS法提取得到新鲜烟叶中可用烟草育种，较纯净、高产率、大分子量的基因组DNA。

寇姝燕等通过对比研究表明二次选择法得到的高分子量DNA总量更高，同时二次选择法得到的纯度更高，可以用于制备烟草BAC文库。

任如意等以改良CTAB法提取复烤烟叶DNA，经U-3000紫外分光光度计测定，所获DNA呈典型的吸收曲线，且OD260/OD280在1.7～1.9之间；对烟草叶绿体不编码序列进行PCR扩增，获得理想条带。

国际烟草科学研究中心介绍了提取新鲜烟叶基因组DNA的碱裂解法、改良后的CTAB法和酚/氯仿抽提法，同时指出，烟丝DNA的提取还需进一步研究。

国内外关于烟草DNA的提取技术研究都是基于新鲜烟叶或者复烤烟叶，而对成品卷烟烟丝的DNA提取技术研究，国内外鲜见相关文献报道。

发明内容

本发明针对不足，提出一种成品烟烟丝总DNA的提取方法，减少成品烟烟丝中的杂质，提高烟丝总DNA的提取效率，便于后续的成品烟品牌鉴定和转基因检测等。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种成品烟烟丝总DNA的提取方法，包括以下步骤：

①、用65％～80％的乙醇水溶液浸泡成品烟烟丝，室温下7～9小时；过滤取滤液，40℃～50℃烘干；

②、向步骤①烘干产品中加入2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液，充分混匀，于60℃～70℃保温20～40min；

③、步骤②反应产物降温至室温，加入与步骤②提取缓冲液相同体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀后离心，取上清液；

④、步骤③上清液中加入用量与步骤②提取缓冲液相同体积的2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液，以及用量与步骤②提取缓冲液相同体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀；离心，取上清液；

⑤、向步骤④上清液中加入1～2倍体积的十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液，混匀，静置；离心，得沉淀物；

⑥、向步骤⑤的沉淀物中加入1.2～1.5mol/L NaCl溶液，搅拌溶解；离心取上清液；

⑦、向步骤⑥得到的上清液中加入2～4倍体积经-20℃～-30℃预冷的无水乙醇，混匀，静置；离心，得沉淀物。

优选的，步骤③、④、⑤、⑥或⑦中离心的条件为12000～15000r/min，10～15min。

优选的，所述步骤②或④中2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液由下述组分构成：

优选的，所述步骤⑤中十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液由下述组分构成：

优选的，步骤②中的2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液为在65℃预热过的。

优选的，步骤①中用的乙醇水溶液为70％。

优选的，步骤①中浸泡时间为8小时。

优选的，步骤⑤中十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液的用量为上清液体积的2倍。

优选的，步骤⑤中静置为0.8～2小时。

优选的，步骤⑦中静置为20℃下静置30min。

与现有技术相比，本发明根据烟丝中的外加香精香料，如单糖等，大部分是水溶性或醇溶性混合物，以及DNA在一定浓度(65％～80％)的乙醇水溶液中溶解度最小，利用乙醇水溶液处理成品烟烟丝，处理掉部分杂质，而又不溶出部分烟丝断面细胞中的DNA。

本发明的提取方法与传统的十六烷基三乙基溴化铵法(CTAB法)相比，将传统CTAB法在DNA沉淀时使用的等体积CTAB沉淀缓冲液，增加直至2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，提高了DNA的沉淀效率，降低DNA提取难度。

附图说明

图1是本发明实施例1产品的烟丝总DNA琼脂糖凝胶电泳检测图；

图2是本发明实施例2产品的烟丝总DNA琼脂糖凝胶电泳检测图；

附图说明：1为DNA标样；M为250bp DNA ladder marker。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

实施例1

从成品烟的烟丝中提取总DNA的方法，包括以下步骤：

1)将购于郑州某品牌卷烟一支成品烟的烟丝取出，用70％的乙醇水溶液浸泡烟丝，室温放置8小时；

2)吸出浸泡之后的溶液，40℃，30分钟烘干；

3)转至研钵中，用液氮冷却研磨，将烟末分装置6个1.5mL离心管中。

4)向盛有样品的1.5ml离心管中，加入750μL 65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀；

5)于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管4-5次；

6)冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀后，12000r/min离心10min；

7)取上清，加入等体积的2×CTAB提取缓冲液和氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心10min；

8)加入2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，颠倒混匀后，室温静置1h，使沉淀生成；

9)10000r/min离心10min，弃去上清液；

10)沉淀用800μL 1.2mol/L NaCl溶液溶解；

11)12000r/min离心10min，弃不溶物；

12)转移上层水相至1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，颠倒混匀后，于20℃下静置30min；

13)12000r/min离心20min，小心弃去上清液；

14)沉淀溶于40μL超纯水中，4℃保存备用。

实施例2

从成品烟的烟丝中提取总DNA的方法，包括以下步骤：

1)将购于郑州某品牌A卷烟一支成品烟的烟丝取出，用70％的乙醇水溶液浸泡烟丝，室温放置8小时；

2)吸出浸泡之后的溶液，40℃，30分钟烘干；

3)转至研钵中，用液氮冷却研磨，将烟末分装置6个1.5mL离心管中。

4)向盛有样品的1.5ml离心管中，加入750μL 65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀；

5)于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管4-5次；

6)冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀后，12000r/min离心10min；

7)取上清，加入等体积的2×CTAB提取缓冲液和氯仿/异戊醇，混匀，12000r/min离心10min；

8)加入1.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，颠倒混匀后，室温静置1h，使沉淀生成；

9)10000r/min离心10min，弃去上清液；

10)沉淀用800μL 1.2mol/L NaCl溶液溶解；

11)12000r/min离心10min，弃不溶物；

12)转移上层水相至1.5mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，颠倒混匀后，于20℃下静置30min；

13)12000r/min离心20min，小心弃去上清液；

14)沉淀溶于40μL超纯水中，4℃保存备用。

实施例1和实施例2中，采用相同的某品牌卷烟，不同的是实施例1中DNA沉淀(步骤8)采用的是2×CTAB沉淀缓冲液。对实施例1和2的产品进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1和2所示。

在DNA的琼脂糖凝胶电泳分析中，DNA与溴化乙锭结合后，在紫外透射的情况下显红色，琼脂糖显淡蓝色，但是在文献、著作中常采用黑白图片。

DAN分子通过具有网络结构的琼脂糖凝胶时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力大，因此，在相同时间相同电压下，DNA片段越大，位移越小，DNA片段越小，位移越大。此外，DNA片段浓度越大，在琼脂糖凝胶上显示的亮度越亮。如图2，在250bp DNA ladder marker条带中，1000bp条带到点样孔的距离比500bp条带小。1000bp条带DNA片段量为150ng，而500bp条带DNA片段量为50ng(参照250bp DNA laddermarker使用说明书：每次取5μL 250bp DNA ladder marker电泳时，每条带的DNA量为50ng，其中1000bp的DNA片段量为150ng，显示亮带)，因此1000bp条带比500bp条带亮。

本发明中，提取得到的成品烟烟丝总DNA是大小不一的DNA片段，在琼脂糖凝胶上显示白色涂带。图1中样品DNA在1000bp以下都出现亮带，说明图1中样品DNA最大片段为1000bp，同理在图2中样品DNA最大片段为500bp，且图1中样品DNA明显比图2中样品DNA亮，说明图1中样品DNA浓度比图2中样品DNA大。

因此，本发明中采用的2.0倍体积CTAB沉淀缓冲液，不但能提高DNA的浓度，而且能获得烟丝中更大片段DNA(1000bp)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种成品烟烟丝总DNA的提取方法，包括以下步骤：

①、用65％～80％的乙醇水溶液浸泡成品烟烟丝，室温下7～9小时；过滤取滤液，40℃～50℃烘干；

②、向步骤①烘干产品中加入2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液，充分混匀，于60℃～70℃保温20～40min；

③、步骤②反应产物降温至室温，加入与步骤②提取缓冲液相同体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀后离心，取上清液；

④、步骤③上清液中加入用量与步骤②提取缓冲液相同体积的2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液，以及用量与步骤②提取缓冲液相同体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀；离心，取上清液；

⑤、向步骤④上清液中加入1～2倍体积的十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液，混匀，静置；离心，得沉淀物；

⑥、向步骤⑤的沉淀物中加入1.2～1.5mo l/L NaCl溶液，搅拌溶解；离心取上清液；

⑦、向步骤⑥得到的上清液中加入2～4倍体积经-20℃～-30℃预冷的无水乙醇，混匀，静置；离心，得沉淀物。

2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤③、④、⑤、⑥或⑦中离心的条件为12000～15000r/min，10～15min。

3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤②或④中2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液由下述组分构成：

4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤⑤中十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液由下述组分构成：

5.如权利要求1或3所述的提取方法，其特征在于：步骤②中的2×十六烷基三乙基溴化铵提取缓冲液为在65℃预热过的。

6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤①中用的乙醇水溶液为70％。

7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤①中浸泡时间为8小时。

8.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤⑤中十六烷基三乙基溴化铵沉淀缓冲液的用量为上清液体积的2倍。

9.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤⑤中静置为0.8～2小时。

10.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤⑦中静置为20℃下静置30min。

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