CN111206112B

CN111206112B - 快速检测杭白菊中三种真菌的引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111206112B
Application number: CN202010087155.9A
Authority: CN
Inventors: 宋阳; 申屠旭萍; 曹瑱艳; 俞晓平; 许益鹏; 刘光富
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2020-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2040-02-11
Also published as: CN111206112A

Abstract

本发明公开了一种快速检测杭白菊中三种真菌的引物组、试剂盒及方法，针对病原菌在杭白菊不同的发育时期和环境条件下所表现的症状可能一样的问题以及现有检测方法耗时久的问题。本发明利用巢氏多重PCR建立了一种对杭白菊上三种主要病原菌的多目标快速检测的引物组和方法，整个检测流程只需要5～6个小时，方法的检出限可以达到1ng/μL，且检出率可达90％以上。该方法能更快、更准确地检测病原体，甚至可以在杭白菊未出现病害表征时检测到相应的病原菌。

Description

快速检测杭白菊中三种真菌的引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种快速检测杭白菊中三种主要真菌引物组、试剂盒及方法。

背景技术

杭白菊(Chrysanthemum morifolium Ramat)又称小汤黄、甘菊、茶菊，菊科菊属多年生草本植物，是我国传统的药用栽培植物和浙江省八大药材“浙八味”之一，主产地为浙江省桐乡市。2010年版《中国药典》将杭白菊、贡菊、滁菊、亳菊列为中国的“四大”驰名药用菊花，作为卫生部首批批准的药食同源的道地药材之一。杭白菊以干燥头状花序入药，主要成分为黄酮类、绿原酸、糖类、挥发油等。现代药理学研究表明，杭白菊具有舒血管、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎、驱铅等多种药理作用。目前浙江杭白菊常年种植面积约7万亩，干花总产量达到5000-7000吨，年均总产值超过5亿元，占全国菊花总销量的近90％。随着杭白菊知名度的提高，其种植规模也在不断的扩增，但由于种植技术的不规范加上农药的乱用滥用，使得植株抗病性减弱、病原累积严重、病虫害大量爆发，农药的滥用乱用，严重影响了杭白菊的产量与质量。因此，及早诊断，及早防治杭白菊病害是提高杭白菊产量与质量至关重要一环。

经田间调查发现叶枯病、枯萎病、黑斑病是杭白菊病害中三种发生频率较高的真菌病害，引起这三种病害的病原菌分别是球毛壳菌Chaetomium globosum，半裸镰刀菌Fusarium inarnatum和互隔交链孢菌Alternaria alternata。这些病原菌长期存活于土壤，遇到适宜的气候条件时，便会造成病害的大量爆发。此外这些病害常常混合发生，存在多种病原菌复合侵染的现象，且不同的病原菌在杭白菊不同的发育时期，不同的环境条件下所表现的症状可能一样，仅靠人为的肉眼鉴定存在一定的困难与误差。因此，建立快速检测技术对杭白菊病害的防治具有重要的指导意义。随着分子生物学的发展，免疫技术和PCR技术不断引入该领域，但植物病害的病原体种类繁多，血清类型多，漏检问题难以避免，而且血清反应的特异性较差，从而使得免疫技术在大范围的实际应用中受到制约。PCR及其相关衍生技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的检测研究。巢氏PCR即两步PCR，它使用了两对PCR引物进行扩增：一对普通引物一对巢式引物，以第一轮普通引物扩增出的产物作为第二轮PCR的模板，巢式引物也是根据第一轮普通引物扩增出的片段所设计的特异性引物，因此巢氏PCR显著的提高了反应的灵敏度及特异性。多重PCR是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物，当体系中存在与各引物对特异互补的模板时,就会出现相应的条带。因此当巢氏PCR与多重PCR结合应用于植物病原菌的快速检测时，不仅可以提高检测的灵敏度还可以实现多种病原菌的多目标快速检测。

传统的植物病害的诊断大多依靠平板分离法，先分离出病原真菌，再对病原真菌进行鉴定，这不仅需要先进的分类学知识，而且需要时间和成本，整个过程可能需要15～20天。但在疾病的早期发现和诊断对于农民预防疾病暴发和选择准确的控制策略至关重要。因此，有必要建立一种准确、快速、经济的检测方法，用于田间植物病原菌的早期诊断。利用巢氏多重PCR所建立的杭白菊上三种病原真菌的快速检测体系整个流程只需要5～6个小时，并且具有高特异性、高灵敏度等优点。

发明内容

本发明利用巢氏多重PCR建立了一种对杭白菊上三种主要病原菌的多目标快速检测体系，并对该体系进行了优化，使的该体系的检出限可以达到1ng/μL。并在实际应用中发现与传统平板分离法相比，该体系能更快、更准确地检测病原体，且检出率可达90％以上。

本发明的目的是为杭白菊主要真菌病害的早期诊断提供一项新技术。本发明的另一目的是提供该快速检测方法在杭白菊病害早期诊断上的应用，从而早期防治杭白菊病害，减少杭白菊产量损失，保证杭白菊的高品质。

本发明三种病原真菌特异性引物的设计与筛选：

为了同时、准确的检测三种病原真菌，引物必须是特异性的，且扩增出的片段大小也应不同，这样才可以通过凝胶电泳将各个条带分离开，再根据每个病原菌所对应条带的有无以及亮度来实现对病原真菌的定性及半定量。根据NCBI数据库中球毛壳菌C.globosum，半裸镰刀菌F.inarnatum和互隔交链孢菌A.alternata三种病原真菌的核糖体内转录间隔区(ITS)序列设计他们的种特异性引物。

本发明中设计出的球毛壳菌C.globosum特异性引物对一：

正向引物QM5-F：CGTTACCTATACCGTTGC(SEQ ID NO.1所示)；反向引物QM5-R：AGAGCGAGATGTATGCTACT(SEQ ID NO.2所示)；目的片段大小为409bp；

半裸镰刀菌F.inarnatum特异性引物对二：

正向引物HG1-F：GAGGACCCTAAACTCTGTT(SEQ ID NO.3所示)；反向引物HG1-R：ATGATTACTACGCTATGGAA(SEQ ID NO.4所示)；目的片段大小为311bp；

互隔交链孢菌A.alternate特异性引物对三：

正向引物Al-F：GTCTTTTGCGTACTTCTTGTTT(SEQ ID NO.5所示)；反向引物Al-R：GAACAGGCATGCCCTTTGGA(SEQ ID NO.6所示)；目的片段大小为249bp；

三对特异性引物均只能在其对应的病原真菌中扩增出单一明亮的条带，而在其他两种病原真菌及健康杭白菊中没有条带；灵敏度检测结果表明，引物QM5-F/QM5-R的灵敏度可达10pg/μL、HG1-F/HG1-R的灵敏度可达1pg/μL、Al-F/Al-R的灵敏度可达10fg/μL、整体巢氏多重PCR灵敏度可达1ng/μL。

本发明公开了一种快速检测杭白菊中三种主要病原菌的试剂盒，包括所述的引物组(SEQ ID NO.1～6所示)。所述试剂盒中引物浓度均为10μM/L，包含QM5-F/QM5-R 0.6μL、HG1-F/HG1-R 1μL、Al-F/Al-R 1.6μL。

进一步的，所述的试剂盒还包括真菌通用引物对，其序列如下：

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG(SEQ ID NO.7所示)；

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO.8所示)。

多重巢氏PCR对杭白菊中三种主要病原菌的检测方法，按以下步骤进行：

(1)带病植株DNA的提取：取2g带病植物组织，于液氮中冷冻后打碎成粉末，使用适合多糖多酚植物DNA的提取方法提取其DNA，本发明采用了改良的CTAB法提取，具体操作如下：在打成粉末的植物组织中加入500μL的CTAB溶液，于液氮内冷冻2min，再放于75℃水浴锅内融化2min，重复3次，最后1次于75℃水浴锅内融化30min，接着加入500μL的DNA提取液(25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇)，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清液400μL，再重复上述步骤一次后加入800μL冰无水乙醇及5M的氯化钠溶液200μL沉淀1h，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，自然风干后用50μL ddH₂O溶解DNA，-20℃保存备用。提取的DNA用分光光度计测量OD值，使OD_260/280控制在1.8-2.0之间，用作后续PCR模板

(2)巢氏PCR的扩增：第一轮PCR使用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增带病植株中病原真菌的ITS序列，扩增条件如下：PCR反应为25μL体系，包括10，包括条件如下(含Mg²⁺)2μL，dNTP(10mol/L)0.5μL，引物(10μM/L)ITS1/ITS4 3μL，Taq polymerase(2U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O 18.1μL。扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最终72℃延伸10min。第二轮PCR使用第一轮PCR的产物作为模板，三对种特异性引物的混合液作为引物，扩增条件如下：PCR反应为25μL体系，包括10，包括模板，三(含Mg²⁺)2μL，dNTP(10mol/L)0.5μL，引物(10μM/L)QM5-F/QM5-R 0.6μL、HG1-F/HG1-R 1μL、Al-F/Al-R 1.6μL、Taqpolymerase(2U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O 17.9μL。扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共20个循环；最终72℃延伸8min。

(3)扩增结果的检测：第二轮的扩增产物使用2％的琼脂糖凝胶检测，120V，40min，结果于凝胶成像仪下观察，根据扩增出的条带片段大小判断其对应的病原真菌，从而实现对植物病害的早期诊断。

本发明的有益效果：

一是本发明构建了一个基于巢氏多重PCR的快速检测体系，可以同时检测杭白菊中三种主要的病原菌(球毛壳菌C.globosum，半裸镰刀菌F.inarnatum和互隔交链孢菌A.alternata)，为杭白菊病害的早期诊断提供了一项新的技术；

二是本发明提供了快速诊断杭白菊病害的方法，为今后杭白菊病害早期的快速诊断提供新的技术。

附图说明

图1单个引物特异性检测1:C.globosum 2:F.inarnatum 3:A.alternates 4:健康杭白菊；a:QM5-F/QM5-R引物特异性检测；b:HG1-F/HG1-R；c:Al-F/Al-R引物特异性检测；M:1000bp DNA maker。

图2为巢式多重PCR针对杭白菊中三种病原真菌扩增效果图。

图3.单种引物的灵敏度检测结果(a)C.globosum(10pg/μL)(b)F.inarnatum(1pg/μL)(c)A.alternate(10fg/μL).1～10:不同浓度的DNA模板(100ng/μL～100ag/μL)；M:1000bp DNA maker。

图4.多重巢氏PCR体系灵敏度检测结果1～10:不同浓度三种病原真菌的DNA混合液模板(100ng/μL～100ag/μL)；M:1000bp DNA maker。

图5.多重巢氏PCR检测体系的应用.1～15:不同病害症状的杭白菊植株；16:健康杭白菊植株；M:1000bp DNA maker。

具体实施方式

实施例1：(三种病原真菌DNA的提取)

各取杭白菊主要病原真菌球毛壳菌C.globosum，半裸镰刀菌F.inarnatum和互隔交链孢菌A.alternata的菌丝体2g，于液氮中冷冻后打碎成粉末，采用CTAB法提取DNA，具体操作如下：在打成粉末的菌丝体中加入500μL的CTAB溶液，于液氮内冷冻2min，再放入75℃水浴锅内融化2min，重复3次，最后1次于75℃水浴锅内融化30min，接着加入500μL的DNA提取液(25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇)，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清液400μL，再重复上述步骤一次后加入800μL冰无水乙醇沉淀1h，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，自然风干后用50μL ddH₂O溶解DNA，-20℃保存备用。提取的DNA用分光光度计测量OD值，使OD₂₆₀/₂₈₀控制在1.8-2.0之间，用作后续PCR模板。

实施例2：(三种病原真菌特异性引物的设计)

根据NCBI数据库中球毛壳菌C.globosum，半裸镰刀菌F.inarnatum和互隔交链孢菌A.alternata三种病原真菌的核糖体内转录间隔区(ITS)序列设计他们的种特异性引物。本发明中设计出的球毛壳菌C.globosum特异性引物QM5-F(CGTTACCTATACCGTTGC)/QM5-R(AGAGCGAGATGTATGCTACT),目的片段大小为409bp；半裸镰刀菌F.inarnatum特异性引物HG1-F(GAGGACCCTAAACTCTGTT)/HG1-R(ATGATTACTACGCTATGGAA),目的片段大小为311bp；互隔交链孢菌A.alternate特异性引物Al-F(GTCTTTTGCGTACTTCTTGTTT)/Al-R(GAACAGGCATGCCCTTTGGA)，目的片段大小为249bp。且三对特异性引物均通过了特异性及灵敏度检测：特异性检测结果表明，三对特异性引物均只能在其对应的病原真菌中扩增出单一明亮的条带，而在其他三种病原真菌及健康杭白菊中没有条带(图1)。

实施例3：(多重巢氏PCR扩增体系的建立与优化)

第一轮PCR使用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增带病植株中病原真菌的ITS序列，扩增条件如下：PCR反应为25μL体系，包括10×buffer(含Mg²⁺)2μL，dNTP(10mol/L)0.5μL，引物(10μM/L)ITS1/ITS4 3μL，Taq polymerase(2U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O 18.1μL。扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最终72℃延伸10min。第二轮PCR使用第一轮PCR的产物作为模板，四对种特异性引物的混合液作为引物，扩增条件如下：PCR反应为25μL体系，包括10×buffer(含Mg²⁺)2μL，dNTP(10mol/L)0.5μL，引物(10μM/L)QM5-F/QM5-R 0.6μL、HG1-F/HG1-R 1μL、Al-F/Al-R 1.6μL、Taq polymerase(2U/μL)0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O 17.9μL。扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共20个循环；最终72℃延伸8min。

扩增结果的检测：第二轮的扩增产物使用2％的琼脂糖凝胶检测，120V，40min，结果于凝胶成像仪下观察，根据扩增出的条带片段大小判断其对应的病原真菌。

实施例4：(多重巢氏PCR扩增体系灵敏度检测)

将三种病原真菌DNA浓度依次从100ng稀释至100ag，分别进行多重巢氏PCR扩增，然后使用2％的琼脂糖凝胶检测，120V，40min，结果于凝胶成像仪下观察，根据目的条带的有无判断对应引物对的最低检测限。

灵敏度检测结果表明，引物QM5-F/QM5-R的灵敏度可达10pg/μL、HG1-F/HG1-R的灵敏度可达1pg/μL、Al-F/Al-R的灵敏度可达10fg/μL、整体巢氏多重PCR灵敏度可达1ng/μL。该巢氏多重PCR体系灵敏度结果见图3-4。

实施例5：(带病植株DNA的提取)

于田间收集15株杭白菊病株，分别提取DNA，具体过程如下：取2g植物组织，于液氮中冷冻后打碎成粉末，使用改良过的CTAB法提取方法提取其DNA，具体操作如下：在打成粉末的植物组织中加入500μL的CTAB溶液，于液氮内冷冻2min，再放入75℃水浴锅内融化2min，重复3次，最后1次于75℃水浴锅内融化30min，接着加入500μL的DNA提取液(25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇)，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min，取上清液400μL，再重复上述步骤一次后加入800μL冰无水乙醇，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗涤两次，自然风干后用50μL ddH₂O溶解DNA，-20℃保存备用。提取的DNA用分光光度计测量OD值，使OD₂₆₀/₂₈₀控制在1.8-2.0之间，用作后续PCR模板。

实施例6：(多重巢氏PCR扩增体系灵敏度检测)

根据实施例3中建立的多重巢氏PCR扩增体系，检测实施例5中提取的15个DNA样品中病原真菌。具体结果见图5。

图5表明，通过巢氏多重PCR方法对病原真菌的检出率可达90％以上，灵敏度高，且用时较短，一般只需要5-6h。该检测体系的建立可以为杭白菊早期诊断病害提供有效、快速、灵敏的方法，从而提早预防病害的发生及蔓延，控制农药乱用滥用的现象，最终达到提高杭白菊质量与产量的效果。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 快速检测杭白菊中三种真菌的引物组、试剂盒及方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgttacctat accgttgc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagcgagat gtatgctact 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggacccta aactctgtt 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgattacta cgctatggaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcttttgcg tacttcttgt tt 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaacaggcat gccctttgga 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种快速检测杭白菊中三种真菌的方法，所述三种真菌分别为球毛壳菌Chaetomiumglobosum、半裸镰刀菌Fusarium inarnatum和互隔交链孢菌Alternaria alternata；其特征在于包括如下步骤：

1)带病植株DNA的提取：

取带病植物组织，于液氮中冷冻后打碎成粉末，提取其DNA；

2)巢氏多重PCR的扩增：

第一轮PCR使用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增带病植株中病原真菌的ITS序列，其中ITS1序列如SEQ ID No.7所示，ITS4序列如SEQ ID No.8所示；步骤2)中第一轮PCR扩增体系及条件具体为：PCR反应为25μL体系，包括含Mg²⁺10×buffer 2μL，10mol/L dNTP 0.5μL，10μM/L引物ITS1/ITS4 3μL，2U/μL Taq polymerase 0.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O 18.1μL；扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最终72℃延伸10min；

第二轮PCR使用第一轮PCR的产物作为模板，采用的引物组包括三对特异性引物对，每对特异性引物对的具体引物序列如下：

特异性引物对一：

正向引物QM5-F：CGTTACCTATACCGTTGC；

反向引物QM5-R：AGAGCGAGATGTATGCTACT；

特异性引物对二：

正向引物HG1-F：GAGGACCCTAAACTCTGTT；

反向引物HG1-R：ATGATTACTACGCTATGGAA；

特异性引物对三：

正向引物Al-F：GTCTTTTGCGTACTTCTTGTTT；

反向引物Al-R：GAACAGGCATGCCCTTTGGA；

第二轮PCR扩增体系及条件具体为：PCR反应为25μL体系，包括含Mg²⁺的10×buffer 2μL，10mol/L dNTP 0.5μL，10μM/L引物QM5-F/QM5-R 0.6μL、HG1-F/HG1-R 1μL、Al-F/Al-R1.6μL、2U/μL Taq polymerase 0.4μL，DNA模板1μL，ddH2O 17.9μL；扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，55-58℃退火30s，72℃延伸45s，共20个循环；最终72℃延伸8min；

3)扩增结果的检测：

根据步骤2)扩增出的条带片段大小判断其对应的病原真菌；其中球毛壳菌C.globosum目的片段大小为409bp；半裸镰刀菌F.inarnatum目的片段大小为311bp；互隔交链孢菌A.alternate目的片段大小为249bp。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中的DNA提取方法具体为：

a)在打成粉末的植物组织中加入500μL的CTAB溶液，于液氮内冷冻2min，再放于75℃水浴锅内融化2min，重复1-3次，其中最后1次于75℃水浴锅内融化时间为30min；

b)接着加入500μL的DNA提取液混匀，12000r/min离心10min，取上清液400μL，所述DNA提取液由苯酚∶氯仿∶异戊醇按体积比25∶24∶1组成；

c)再重复步骤b)一次后加入800μL冰无水乙醇及5M的氯化钠溶液200μL沉淀1h，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗涤，自然风干后用50μL ddH2O溶解DNA，-20℃保存备用；提取的DNA用分光光度计测量OD值，使OD_260/280控制在1.8-2.0之间，用作后续PCR模板。