CN113322340A

CN113322340A - 一种使用dna特征序列鉴定植物的方法

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Publication number: CN113322340A
Application number: CN202110607746.9A
Authority: CN
Inventors: 袁媛; 华中一; 蒋超; 黄璐琦
Original assignee: Institute of Materia Medica of CACMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CACMS
Priority date: 2021-06-01
Filing date: 2021-06-01
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-06-01
Also published as: CN113322340B

Abstract

本发明公开了一种使用DNA特征序列鉴定植物的方法，通过检测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列实现；目标物种的DSS为长度为20‑100bp、目标物种的核酸序列中存在且非目标物种的核酸序列中不存在的核酸序列片段。以白术DNA例，本发明能够将其从亲缘关系极近的其他苍术属植物中鉴定出来，弥补了之前的技术只能区分苍术和白术的不足。DSS不局限于基因组的特定区域，数据来源丰富，特异性好。本发明在鉴定药用植物中具有重要的应用价值。

Description

一种使用DNA特征序列鉴定植物的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使用DNA特征序列鉴定植物的方法。

背景技术

DNA检测技术逐渐成为物种鉴定的首选技术。合适的变异速率、测序技术的发展以及日渐增多的核酸数据赋予了DNA检测技术的优势。现有DNA检测技术中，Hebert等人提出的DNA条形码技术(DNA barcoding)是目前使用最为广泛的方法之一。DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。近年来，随着参考数据库(如Barcode of Life Data System，BOLD)数据量的增加、计算机算法的提升(如OverlapPER)以及相关研究的增多，DNA条形码的通用性和准确性都大大提高。DNA条形码技术最成功的应用案例莫过于使用细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome c oxidasesubunit Igene，COI)基因片段对脊椎动物、昆虫和其他动物类群进行鉴定。

然而不同于动物，DNA条形码技术在植物中的使用受到诸多限制。一方面是目前仍未在植物中发现通用的条形码区域。针对不同类型的植物往往需要使用不同的DNA条形码，这限制了植物DNA条形码技术的通用性。另一方面，现有的DNA条形码的鉴定成功率也不够理想。CBOL植物条形码工作组提出了以叶绿体基因rbcL和matK以及核基因组的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)作为植物核心DNA条形码的方案。然而该方案在种水平的鉴定成功率不足80％，并且使用多个条形码协同鉴定物种的操作和分析过程十分繁琐(Li D Z，Gao L M，Li H T，et al.Comparative analysis of a large datasetindicates that internal transcribed spacer(ITS)should be incorporated intothe core barcode for seed plants[J].Proceedings of the National Academy ofSciences，2011.)。

基于上述原因，目前实际生产应用中多使用以特征性片段扩增区域(sequencecharacterized amplified region，SCAR)标记为代表的特异性鉴别方法。《中国药典》(2020版)中收录的DNA分子鉴定技术均基于SCAR标记。与基于通用引物扩增的DNA条形码标记相比，基于特异性引物的SCAR标记更加稳定、简便、高效，因而被广泛用于众多物种在种间或种内的高效鉴别上。然而传统的SCAR标记通常是由RAPD、SRAP、SSR标记等转化而来，使用上述类型标记向SCAR标记转化往往面临着开发周期长、工作量大等问题。因此，目前亟需一种能够高通量开发特异性标记的方法。

DNA特征序列(DNAsignaturesequence，DSS)被定义为能够被用来检测某一物种是否出现且能够将其与其他所有物种分开的特定长度的核酸序列，即在给定的核酸序列范围内，只在待鉴定物种的核酸序列中出现的核酸序列片段。目前尚未出现利用DSS开发用于药用植物鉴定标记并用于药用植物鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的是鉴定植物物种，尤其是药物植物的物种。

本发明首先保护一种鉴定待测植物物种的方法，为检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列，进行如下判断：如果待测植物的基因组中含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种为或疑似为目标物种；如果待测植物的基因组中不含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种不为或疑似不为目标物种；

所述目标物种的DSS为长度为20-100bp(如20-40bp、40-60bp、60-80bp、80-100bp、20bp、40bp、60bp、80bp或100bp)、目标物种的核酸序列中存在且非目标物种的核酸序列中不存在的核酸序列片段；

获得目标物种的DSS的步骤依次如下：

(1)从数据库下载或大量数据中分析获取若干个植物物种的基因组序列；

(2)针对同一植物物种，从每个植物个体的基因组序列上的每个位点开始截取长度为30-50bp的序列片段；将所有个体产生的片段合并，进行100％相似度聚类，保留在所有个体中出现的序列片段，命名为物种的序列片段组合；

(3)将若干个植物物种的序列片段组合合并，进行100％相似度聚类；如果某植物物种的某序列片段与其他植物物种的序列片段组合中的任一序列片段无法聚类，则该序列片段为该物种的DSS。

上述方法中，所述基因组可为叶绿体基因组。

上述方法中，所述检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列的方法可为A1)或A2)：

A1)根据目标物种的DSS在基因组中的位置合成上游引物和下游引物组成的特异引物对，之后采用特异引物对对待测植物的基因组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；测序；

A2)直接测序。

上述方法中，所述植物可为药用植物。

上述方法中，所述目标物种可为白术。所述白术的DSS可为DSS1、DSS2、DSS3、DSS4或DSS5；DSS1的核苷酸序列可如SEQ ID NO:1所示；DSS2的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示；DSS3的核苷酸序列可如SEQ ID NO:7所示；DSS4的核苷酸序列可如SEQ ID NO:10所示；DSS5的核苷酸序列可如SEQ ID NO:13所示。

检测DSS1的特异引物对具体可为引物对1，由SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:3所示的单链DNA分子组成。检测DSS2的特异引物对具体可为引物对2，由SEQ IDNO:5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:6所示的单链DNA分子组成。检测DSS3的特异引物对具体可为引物对3，由SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:9所示的单链DNA分子组成。检测DSS4的特异引物对具体可为引物对4，由SEQ ID NO:11所示的单链DNA分子和SEQID NO:12所示的单链DNA分子组成。检测DSS5的特异引物对具体可为引物对5，由SEQ IDNO:14所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:15所示的单链DNA分子组成。

上述方法中，所述目标物种可为人参。所述人参的DSS可为DSS6、DSS7、DSS8或DSS9；DSS6的核苷酸序列可如SEQ ID NO:16所示；DSS7的核苷酸序列可如SEQ ID NO:19所示；DSS8的核苷酸序列可如SEQ ID NO:22所示；DSS9的核苷酸序列可如SEQ ID NO:25所示。

检测DSS6的特异引物对具体可为引物对6，由SEQ ID NO:17所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:18所示的单链DNA分子组成。检测DSS7的特异引物对具体可为引物对7，由SEQID NO:20所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:21所示的单链DNA分子组成。检测DSS8的特异引物对具体可为引物对8，由SEQ ID NO:23所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:24所示的单链DNA分子组成。检测DSS9的特异引物对具体可为引物对9，由SEQ ID NO:26所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:27所示的单链DNA分子组成。

本发明还保护用于鉴定白术真伪性的试剂盒或用于鉴定人参真伪性的试剂盒。

所述用于鉴定白术真伪性的试剂盒，包括用于检测DSS1、DSS2、DSS3、DSS4和/或DSS5的物质；

DSS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

DSS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

DSS3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

DSS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

DSS5的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。

所述用于鉴定白术真伪性的试剂盒具体可由用于检测DSS1、DSS2、DSS3、DSS4和/或DSS5的物质组成。

进一步的，检测DSS1的特异引物对具体可为引物对1，由SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:3所示的单链DNA分子组成。检测DSS2的特异引物对具体可为引物对2，由SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:6所示的单链DNA分子组成。检测DSS3的特异引物对具体可为引物对3，由SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:9所示的单链DNA分子组成。检测DSS4的特异引物对具体可为引物对4，由SEQ ID NO:11所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:12所示的单链DNA分子组成。检测DSS5的特异引物对具体可为引物对5，由SEQ ID NO:14所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:15所示的单链DNA分子组成。

所述用于鉴定人参真伪性的试剂盒，包括用于检测DSS6、DSS7、DSS8和/或DSS9的物质；

DSS6的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

DSS7的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

DSS8的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；

DSS9的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。

所述用于鉴定人参真伪性的试剂盒具体可由用于检测DSS6、DSS7、DSS8和/或DSS9的物质组成。

本发明还保护K1)或K2)。

K1)检测上述任一所述DSS1、DSS2、DSS3、DSS4和/或DSS5的物质在鉴定白术真伪性中的应用。

K2)检测上述任一所述DSS6、DSS7、DSS8和/或DSS9的物质在鉴定人参真伪性中的应用。

与其他标记相比(包括但不限于DNA条形码、SSR)，DSS不局限于基因组的特定区域，数据来源丰富，特异性更好。本发明首次提供了一种应用DSS鉴定药用植物的方法，与具体药用植物物种无关，通用性强。以白术DNA例，本发明能够将其从亲缘关系极近的其他苍术属植物中鉴定出来，弥补了之前的技术只能区分苍术和白术的不足(陈川，刘逸慧，李攀等.中药白术聚合酶链反应鉴定引物及鉴定方法)。本发明在鉴定药用植物中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为3899个物种的DSS数量分布情况。

图2为165个物种的可靠DSS比例的分布情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

DNA特征序列(DNA signature sequence，DSS)指长度在20bp-100bp，在给定的核酸序列范围内，只在待鉴定物种的核酸序列中出现的核酸序列片段。

实施例1、使用DNA特征序列鉴定植物的方法的建立

本发明的发明人通过大量实验，建立了使用DSS鉴定植物的方法，具体步骤如下：

一、DSS的获得

1、从数据库下载或大量数据中分析获取3899个(植物)物种的4356条叶绿体基因组序列。

3899个物种中具有代表性的500个分别为Solidago decurrens、Erycibeobtusifolia、Erycibeschmidtii、Syzygiumaromaticum、Panax ginseng、Illiciumverum、Murraya exotica、Murrayapaniculata、Senegalia catechu、Canavalia gladiata、Panax notoginseng、Saururus chinensis、Sparganiumstoloniferum、Berberis vernae、Berberis poiretii、Berberis soulieana、Berberis wilsoniae、Zingiber officinale、Toxicodendron vernicifluum、Inula helenium、Bolbostemmapaniculatum、Pseudolarixamabilis、Smilax glabra、Callicarpa macrophylla、Sargentodoxa cuneata、Glycinemax、Gleditsia sinensis、Isatis tinctoria、Ziziphus jujuba、Rheum palmatum、Rheumtanguticum、Rheum officinale、Allium sativum、Cirsium japonicum、Areca catechu、Podophyllum hexandrum、Justicia gendarussa、Foeniculum vulgare、Helwingiajaponica、Stachyurushimalaicus、Stachyurus chinensis、Cirsiumarvensevar.integrifolium、Liriope spicata var.prolifera、Liriope muscari、Sophora tonkinensis、Cornus officinalis、Dioscoreapolystachya、Kaempferiagalanga、Turpinia arguta、Lonicera confusa、Lonicera macrantha、Lonicerahypoglauca、Crataegus pinnatifida、Crataegus pinnatifida var.major、Pleionebulbocodioides、Cremastraappendiculata、Pleione yunnanensis、Homalomena occulta、Senecio scandens、Euphorbia lathyris、Dolomiaeasouliei、Dolomiaeasoulieivar.cinerea、Clematis montana、Clematis armandii、Fritillariaunibracteatavar.wabuensis、Fritillaria cirrhosa、Fritillaria przewalskii、Fritillaria taipaiensis、Fritillaria unibracteata、Fritillaria delavayi、Cyathula officinalis、Aconitum carmichaelii、Ligusticumsinense 'Chuanxiong'、Iris tectorum、Melia azedarach、Callicarpa kwangtungensis、Choerospondiasaxillaris、Desmodiumstyracifolium、Pogostemoncablin、Ligustrumlucidum、Euphorbia hirta、Portulaca oleracea、Strychnosnux-vomica、Verbenaofficinalis、Vaccariahispanica、Saussureainvolucrata、Hyoscyamus niger、Asparaguscochinchinensis、Trichosantheskirilowii、Trichosanthesrosthornii、Bambusatextilis、Cephalostachyumchinense、Arisaema heterophyllum、Arisaema erubescens、Arisaema amurense、Gastrodiaelata、Semiaquilegiaadoxoides、Cinnamomum camphora、Chaenomelesspeciosa、Hibiscus mutabilis、Aucklandiacostus、Equisetum hyemale、Akebia quinata、Akebia trifoliata、Akebia trifoliata subsp.australis、Bombaxceiba、Oroxylum indicum、Momordica cochinchinensis、Eleutherococcusnodiflorus、Schisandra chinensis、Pseudostellaria heterophylla、Plantago depressa、Plantagoasiatica、Orostachys fimbriata、Silybum marianum、Persicariaorientalis、Arctiumlappa、Achyranthes bidentata、Terminalia bellirica、Actaea cimicifuga、Actaeaheracleifolia、Actaea dahurica、Curcuma wenyujin、Citrus maxima、Citrus maxima'Tomentosa'、Rosa chinensis、Salvia miltiorrhiza、Lindera aggregata、Prunus mume、Cannabis sativa、Croton tiglium、Gynochthodes officinalis、Polygonatum odoratum、Mahonia bealei、Mahonia fortunei、Nardostachysjatamansi、Glycyrrhiza uralensis、Glycyrrhiza glabra、Glycyrrhiza inflata、Euphorbia kansui、Blumea balsamifera、Artemisia argyi、Pyrrosia lingua、Pyrrosiasheareri、Pyrrosiapetiolosa、Lysionotuspauciflorus、Acorus gramineus、Dendrobium nobile、Dendrobiumfimbriatum、Dendrobium chrysotoxum、Punica granatum、Microcospaniculata、Gentianarigescens、Gentiana triflora、Gentiana scabra、Gentiana manshurica、Dimocarpuslongan、Sauropusspatulifolius、Fritillaria usuriensis、Siphonostegia chinensis、Menispermumdauricum、Glehnialittoralis、Ilex chinensis、Curculigoorchioides、Agrimonia pilosa、Bletilla striata、Atractylodesmacrocephala、Pulsatillachinensis、Paeonia lactiflora、Angelica dahurica、Angelicadahuricavar.formosana、Sauromatumgiganteum、Imperata cylindrica var.major、Ginkgo biloba、Chelidonium majus、Cynanchumstauntonii、Cynanchumglaucescens、Lablab purpureus、Ampelopsis japonica、Dictamnus dasycarpus、Cynanchumatratum、Cynanchum versicolor、Polygala japonica、Benincasahispida、Isodonrubescens、Malvaverticillata、Scrophularianingpoensis、Lobelia chinensis、Scutellariabarbata、Pinelliaternata、Luffa aegyptiaca、Geranium carolinianum、Geranium wilfordii、Erodium stephanianum、Illicium difengpi、Kochia scoparia、Lyciumbarbarum、Lyciumchinense、Rehmanniaglutinosa、Sanguisorba officinalis、Sanguisorbaofficinalis var.longifolia、Euphorbia humifusa、Euphorbia maculata、Cissampelospareira var.hirsuta、Linumusitatissimum、Crocus sativus、Terminalia chebula、Tamarix chinensis、Panax quinquefolius、Lilium browniivar.viridulum、Liliumlancifolium、Lilium pumilum、Stemona japonica、Stemonasessilifolia、Stemonatuberosa、Angelica sinensis、Swertia pseudochinensis、Cistanchedeserticola、Cistanchetubulosa、Myristica fragrans、Cinnamomum cassia、Ardisia crenata、Panaxjaponicus、Phyllostachys nigra var.henonis、Bambusabeecheyanavar.pubescens、Bambusatuldoides、Corydalis yanhusuo、Physochlainainfundibularis、Fritillariapallidiflora、Fritillaria walujewii、Calamus draco、Albizia julibrissin、Sennatora、Phellodendronamurense、Juncus effusus、Erigeron breviscapus、Styraxtonkinensis、Stephania tetrandra、Saposhnikoviadivaricata、Knoxiaroxburghii、Carthamus tinctorius、Gentiana rhodantha、Hedysarumpolybotrys、Alpinia galanga、Rhodiolacrenulata、Ophiopogon japonicus、Hordeum vulgare、Polygala sibirica、Polygala tenuifolia、Vigna angularis、Vigna umbellata、Paeonia veitchii、Daphnegenkwa、Zanthoxylum bungeanum、Zanthoxylum schinifolium、Brassica juncea、Sinapisalba、Atractylodeslancea、Xanthium strumarium、Euryale ferox、Aloe vera、Aloeferox、Phragmites australis、Biancaeasappan、Liquidambar orientalis、Eucommiaulmoides、Polygonum perfoliatum、Epimedium wushanense、Wurfbainia compacta、Amomum kravanh、Anemone raddeana、Zanthoxylum nitidum、Glechoma longituba、Forsythia suspensa、Tetradiumruticarpum、Paeonia suffruticosa、Vitex negundovar.cannabifolia、Fallopia multiflora、Lycopodium japonicum、Citrus medicavar.sarcodactylis、Phyllanthus emblica、Setariaitalica、Eriocaulon buergerianum、Magnolia denudata、Magnolia sprengeri、Magnolia biondii、Hanseniaforbesii、Hanseniaweberbaueriana、Phyllolobiumchinense、Hippophaerhamnoides、Commiphoramyrrha、Aquilaria sinensis、Terminalia chebulavar.tomentella、Cullencorylifolium、Ferulafukanensis、Ferulasinkiangensis、Citrus reticulata、Lonicerajaponica、Spatholobussuberectus、Abruspulchellussubsp.cantoniensis、Celosiacristata、Sinomenium acutum、Swertia leducii、Canarium album、Celosia argentea、Artemisia annua、Strobilanthescusia、Persicaria tinctoria、Rosa rugosa、Picrasmaquassioides、Picriafelterrae、Corydalis bungeana、Prunusarmeniacavar.ansu、Prunus armeniaca、Prunus sibirica、Prunus mandshurica、Sophoraflavescens、Abutilon theophrasti、Eriobotrya japonica、Pinus massoniana、Pinustabuliformis、Liquidambar formosana、Eleutherococcussenticosus、Prunus humilis、Prunus pedunculata、Prunus japonica、Curcuma kwangsiensis、Curcuma longa、Curcumaphaeocaulis、Reynoutria japonica、Saccharina japonica、Eckloniakurome、Changiumsmyrnioides、Bergenia purpurascens、Apocynumvenetum、Siraitiagrosvenorii、Aconitum kusnezoffii、Anemarrhenaasphodeloides、Sedumsarmentosum、Potentilla chinensis、Combretum indicum、Platycladusorientalis、Eupatorium fortunei、Eschenbachiablinii、Tinosporasagittata、Inula japonica、Inula linariifolia、Fagopyrum dibotrys、Lysimachiachristinae、Psammosilenetunicoides、Rosa laevigata、Boswellia sacra、Sarcandra glabra、Houttuynia cordata、Cibotium barometz、Euphorbia pekinensis、Rhododendron molle、Selaginella tamariscina、Selaginella pulvinata、Lycopuslucidusvar.hirtus、Alismaplantago-aquatica subsp.orientale、Dalbergia odorifera、Asarum sieboldii、Asarumheterotropoides、Hypericum perforatum、Nepeta tenuifolia、Rubia cordifolia、Piperlongum、Litsea cubeba、Alpinia hainanensis、Lanxangiatsaoko、Artemisia scoparia、Artemisia capillaris、Leonurus japonicus、Trigonella foenum-graecum、Neopicrorhizascrophulariiflora、Piper nigrum、Litchi chinensis、Schisandrasphenanthera、Adenophora stricta、Adenophora triphylla、Daucus carota、Citrusaurantium、Gardenia jasminoides、Ilex cornuta、Diospyros kaki、Clematishexapetala、Clematis chinensis、Clematis ternifloravar.mandshurica、Magnoliaofficinalis、Wurfbainiavillosa、Wurfbainiavillosavar.xanthioides、Wurfbainialongiligularis、Ipomoea purpurea、Ipomoea nil、Bruceajavanica、Alliumtuberosum、Drynariaroosii、Uncaria macrophylla、Uncariarhynchophylla、Uncariasinensis、Uncariahirsuta、Uncariasessilifructus、Periplocasepium、Cyperusrotundus、Citrus medica、Citrus wilsonii、Mosla chinensis、Parispolyphyllavar.yunnanensis、Paris polyphyllavar.chinensis、Echinopsgrijsii、Echinopsdavuricus、Scaphium affine、Phlomoidesrotata、Angelica biserrata、Impatiens balsamina、Peucedanumpraeruptorum、Lagotis brevituba、Datura metel、Dioscoreanipponica、Andrographis paniculata、Trachelospermum jasminoides、Gentiana macrophylla、Gentiana straminea、Gentiana dahurica、Gentianacrassicaulis、Fraxinus chinensis、Fraxinus chinensis subsp.rhynchophylla、Fraxinus stylosa、Panax bipinnatifidus、Panax japonicus var.major、Raphanussativus、Nelumbo nucifera、Platycodongrandiflorus、Prunus persica、Prunusdavidiana、Juglans regia、Corydalis decumbens、Prunella vulgaris、Bupleurumchinense、Bupleurum scorzonerifolium、Codonopsispilosulavar.modesta、Codonopsispilosula、Codonopsispilosulasubsp.tangshen、Commelina communis、Dendrobium catenatum、Centella asiatica、Laggeracrispata、Iris domestica、Vincetoxicumpycnostelma、Euphorbia ebracteolata、Euphorbia fischeriana、Campsisgrandiflora、Campsis radicans、Pegaeophytonscapiflorum、Alpinia officinarum、Bistorta officinalis、Dioscoreacollettiivar.hypoglauca、Puerariamontanavar.thomsonii、Alpinia oxyphylla、Fritillaria thunbergii、Aesculuschinensis、Aesculus chinensis var.wilsonii、Piper kadsura、Lygodium japonicum、Sargassum fusiforme、Sargassum pallidum、Spirodelapolyrrhiza、Marsdeniatenacissima、Tetrapanaxpapyrifer、Morus alba、Taxillus chinensis、Smilaxchina、Thlaspiarvense、Dioscoreapanthaica、Scutellariabaicalensis、Astragalusmongholicus、Coptisteeta、Coptis chinensis、Coptisdeltoidea、Phellodendronchinense、Abelmoschus manihot、Polygonatumcyrtonema、Polygonatumsibiricum、Polygonatumkingianum、Fibraurearecisa、Cuscuta australis、Cuscuta chinensis、Cichorium intybus、Cichorium glandulosum、Chrysanthemum xmorifolium、Ilex rotunda、Hydrangea febrifuga、Eupatorium lindleyanum、Stauntoniachinensis、Chrysanthemum indicum、Cnidiummonnieri、Stellariadichotomavar.lanceolata、Cucumis melo和Ranunculus ternatus。

2、针对同一物种，从每个个体的叶绿体基因组序列上的每个位点开始截取长度为40bp的序列片段；将所有个体产生的片段合并，进行100％相似度聚类，保留在所有个体中出现的序列片段，命名为物种的序列片段组合。

3、将3899个物种的序列片段组合合并，进行100％相似度聚类，如果来自某物种的某序列片段与其他物种的序列片段组合中的任一序列片段无法聚类，则该序列片段为该物种的DSS。

3899个物种的DSS数量分布情况见图1。结果表明，3808个物种可以鉴定到DSS序列，占比为97.95％；91个物种(分别为Capsicum tovarii、Cotoneaster acuminatus、Cotoneaster microphyllus、Cotoneaster rubens、Isatis tinctoria、Citrusaurantium、Brassica juncea、Aconitum brachypodum、Aconitum hemsleyanum、Cremastraappendiculata、Dendrobium catenatum、Sorghum bicolor、Magnoliaodoratissima、Populus deltoides、Populus gonggaensis、Populus haoana、Populuskangdingensis、Populus schneideri、Populus x canadensis、Populusxiangchengensis、Prunus persica、Echinochloafrumentacea、Aconitum carmichaelii、Lagerstroemia siamica、Prunus armeniaca、Miscanthus sinensis、Camellia pitardii、Vitis heyneana、Vitis vulpina、Saposhnikoviadivaricata、Oryza rufipogon、Populuslasiocarpa、Saccharum hybrid cultivar、Triticum aestivum、Glycine max、Gossypiumarboreum、Avenaabyssinica、Saccharum officinarum、Avenabarbata、Avena brevis、Avenafatua、Perilla frutescens var.hirtella、Populus yunnanensis、Juglansmandshurica、Oryza sativa subsp.indica、Iphigenia indica、Carya cathayensis、Chonemorphamegacalyx、Acmella calva、Acmellapaniculata、Sigesbeckiaglabrescens、Sigesbeckiaorientalis、Eupatorium chinense、Periplocaforrestii、Delphiniumyunnanense、Actaea cimicifuga、Solanum aculeatissimum、Solanum pseudocapsicum、Solanum septemlobum、Solanum coagulans、Anisodusacutangulus、Daphne odora、Gynandropsisgynandra、Bupleurum chinense、Epimedium brevicornu、Sinapis alba、Cuscuta australis、Perilla frutescens、Quercus mccormickii、Paris qiliangiana、Triticum zhukovskyi、Capsicum annuum、Withaniasomnifera、Pentanemabritannicum、Vaccariahispanica、Crataegus pinnatifida、Eupatorium lindleyanum、Clematishexapetala、Abelmoschus manihot、Eupatorium fortunei、Crataegus pinnatifidavar.major、Clematis ternifloravar.mandshurica、Achyranthes bidentata、Akebiatrifoliata subsp.australis、Inula japonica、Cyathula officinalis、Murrayapaniculata、Bambusa textilis、Solanum violaceum、Curcuma wenyujin和Quercus mongolica)不能鉴定到DSS序列。由此可见，大部分物种可以获得DSS。

一个植物的DSS能够作为植物鉴定标记使用的前提是其只在该物种中出现而不在其他物种中出现。因此，随机对上述3808个物种中的165个物种(分别为Euphorbia esula、Hydrangea febrifuga、Hydrangea paniculata、Adenophora triphylla、Aristolochiadebilis、Actaea dahurica、Adenophora stricta、Angelica dahurica、Daphne giraldii、Aconitum gymnandrum、Senna occidentalis、Senna tora、Angelica sinensis、Atractylodeslancea、Atractylodesmacrocephala、Dioscoreapolystachya、Medicagofalcata、Paris verticillata、Lysimachia candida、Phlomoidesmelanantha、Flueggeasuffruticosa、Flueggeavirosa、Euphorbia hylonoma、Euphorbia pulcherrima、Euphorbia sieboldiana、Euphorbia tithymaloides、Medicago lupulina、Stephaniadielsiana、Stephania delavayi、Impatiens balsamina、Impatiens leptocaulon、Impatiens pritzelii、Piper hongkongense、Hydrangea strigosa、Parispolyphyllavar.chinensis、Senecio nemorensis、Senecio scandens、Achilleawilsoniana、Ligulariatsangchanensis、Ligularianelumbifolia、Inula helenium、Inulasalsoloides、Heyneavelutina、Heyneatrijuga、Fallopia multiflora var.ciliinervis、Persicariafiliformis、Persicariasagittata、Cynanchummongolicum、Cynanchumotophyllum、Periploca calophylla、Periplocasepium、Aristolochiachampionii、Aristolochiakwangsiensis、Buddlejalindleyana、Delphiniumcandelabrum var.monanthum、Delphinium anthriscifolium、Ranunculus sceleratus、Ranunculus ternatus、Actaea japonica、Clematis apiifolia、Clematis florida、Clematis intricata、Aconitum nagarum、Aconitum hemsleyanumvar.circinatum、Aconitum pendulum、Aconitum scaposumvar.vaginatum、Aconitum tanguticum、Eriocapitellavitifolia、Eriocapitellahupehensis、Solanum procumbens、Solanumerianthum、Wikstroemiacanescens、Wikstroemia nutans、Daphne acutiloba、Daphnepapyracea、Daphne genkwa、Phytolacca acinosa、Phytolacca americana、Zephyranthescandida、Zephyranthescarinata、Rhamnus crenata、Rhamnus davurica、Rhamnusparvifolia、Dioscoreahispida、Celastrus orbiculatus、Celastrus angulatus、Euonymus grandiflorus、Euonymus maackii、Pedicularisdavidii、Pedicularisdissecta、Pedicularisresupinata、Laporteabulbifera、Laporteacuspidata、Urtica angustifolia、Urtica cannabina、Urtica laetevirens、Urtica lobatifolia、Meconopsishorridula、Meconopsis integrifolia、Iriscollettii、Iris japonica、Iris speculatrix、Iris uniflora、Zanthoxylum armatum、Zanthoxylum austrosinense、Zanthoxylum bungeanumvar.punctatum、Zanthoxylumailanthoides、Zanthoxylum multijugum、Zanthoxylum stipitatum、Zanthoxylumnitidum、Celosia cristata、Polygonatumkingianum、Piper longum、Rheum tanguticum、Aesculus chinensis、Alpinia hainanensis、Eleutherococcusnodiflorus、Cirsiumarvensevar.integrifolium、Phlomoidesrotata、Persicariaorientalis、Persicariatinctoria、Mahonia fortunei、Polygonum perfoliatum、Gentiana rigescens、Fallopiamultiflora、Euphorbia pekinensis、Prunus sibirica、Achillea alpina、Clinopodiumchinense、Iris tectorum、Cirsium japonicum、Polygonatum odoratum、Dianthus chinensis、Berberis poiretii、Typha angustifolia、Polygonum aviculare、Dianthus superbus、Typha orientalis、Ardisia japonica、Celosia argentea、Lysimachiachristinae、Clematis armandii、Gentiana scabra、Gentiana triflora、Gentiana manshurica、Callicarpa formosana、Clematis chinensis、Callicarpakwangtungensis、Dioscorea spongiosa、Aesculus chinensis var.wilsonii、Dioscoreapanthaica、Uncaria sinensis、Stephania tetrandra、Rheum officinale、Ardisia crenata、Buddleja officinalis、Clinopodiumpolycephalum、Clematismontana、Uncariarhynchophylla、Alpinia officinarum、Angelica biserrata、Prunusmume、Berberis vernae、Mahonia bealei和Eleutherococcussenticosus)的可靠DSS比例进行评估(评估方法参考如下文献：Raime K，

K，RemmM.Method for theIdentification of Plant DNA in Food Using Alignment-Free Analysis ofSequencing Reads：A Case Study on Lupin[J].Frontiers in Plant Science，2020，11:646.)，具体步骤如下：

(1)针对每个物种，准备三种高通量数据集，分别为通用背景数据集、近源物种数据集和物种数据集；

通用背景数据集：包含来自常见作物、水果、蔬菜的测序序列的数据集；具体包括水稻、银杏、南洋百合、杏、大豆、黄瓜、甘蓝、辣椒、向日葵、咖啡和番茄；

近源物种数据集：包含来自同属其他植物测序序列的数据集；

物种数据集：来自本物种测序序列的数据集。

(2)对于每一条DSS，若其能够在物种数据集中被检测到，且不能在通用背景数据集和近源物种数据集中检测到，则认为这条DSS可靠，称其为可靠DSS。

(3)物种中可靠DSS占全部DSS的比例为该物种的可靠DSS比例。

165个物种的可靠DSS比例的分布情况见图2，数据符合beta分布，期望值为73.10％。其中，133个物种的可靠DSS比例大于20％，占165种植物的80.60％；32个物种的可靠DSS比例为20％以下，分别为Euphorbia esula、Adenophora triphylla、Actaeadahurica、Adenophora stricta、Senna occidentalis、Senna tora、Parispolyphyllavar.chinensis、Fallopia multiflora var.ciliinervis、Cynanchummongolicum、Periploca calophylla、Delphinium candelabrumvar.monanthum、Ranunculus sceleratus、Ranunculus ternatus、Daphne acutiloba、Daphne papyracea、Rhamnus davurica、Rhamnus parvifolia、Pedicularisdissecta、Urtica lotabifolia、Zanthoxylum bungeanumvar.、Punctatum Zanthoxylumstipitatum、Mahonia fortunei、Iris tectorum、Dianthus chinensis、Typhaangustifolia、Dianthus superbus、Typha orientalis、Callicarpa formosana、Aesculuschinensis var.wilsonii、Ardisia crenata、Clinopodiumpolycephalum和Angelicabiserrata。

上述结果表明，对于绝大多数物种，从5-10个DSS中筛选出能够用于鉴定植物的标记是可行的。

二、使用DSS鉴定植物

1、从步骤一获得的某物种DSS中随机抽取1-10条，根据其在基因组中的位置的上下游200bp片段，分别设计并合成用于扩增DSS的引物对。

2、以待测植物的DNA为模板，随机采用步骤1合成的一个引物对进行PCR扩增，得到扩增产物。

3、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收扩增产物的目的条带进行测序。

4、分析测序结果中是否含有DSS或DSS的反向互补序列，之后进行如下判断：如果测序结果中含有DSS或DSS的反向互补序列，则该待测植物为或疑似为该物种；如果测序结果中不含有DSS或DSS的反向互补序列，则该待测植物不为或疑似不为该物种。

实施例2、使用DNA特征序列鉴定白术的方法

1、白术DSS的获得

按照实施例1中步骤一的方法，获得白术DSS。

共获得白术DSS 1327条，其中前100条见表1。

表1

2、从步骤1获得的1327条白术DSS中随机抽取5条，根据其在基因组中的位置的上下游200bp片段，分别设计并合成用于扩增DSS的引物对。

具体选取的5条白术DSS、用于扩增DSS的5个引物对(由上游引物和下游引物组成)和扩增产物长度见表2。

表2

注：引物中含有“F”的为上游引物，引物中含有“R”的为下游引物。

3、分别使用步骤2合成的5个引物对鉴定白术

待测样本分别为4个白术(Atractylodesmacrocephala)样本、4个苍术(Atractylodeslancea)样本和4个朝鲜苍术(Atractylodeskoreana)样本。白术、苍术和朝鲜苍术均为市售，均符合中国药典(2020年版)一部正文各药材项下的有关规定。每个待测样本采用每个引物对进行如下检测：

(1)取50mg待测样本，置于2.0ml离心管中，使用球磨仪粉碎成粉末。将20mg粉末加入2.0ml离心管中，使用

Plant Mini Kit(Cat.No.69106，QIAGEN，Germany)提取DNA。之后用微量分光光度计(NanoDrop 2000，Thermo，U.S.)测定待测样本的DNA浓度和质量后，置于-20℃保存备用。

(2)制备反应体系。反应体系为25μL，包括待测样本的DNA 1μL、上游引物水溶液(浓度为10μmol·L^-1)1μL、下游引物水溶液(浓度为10μmol·L^-1)1μL、2×M5 SuperFastTaq PCR(北京聚合美生物科技有限公司的产品，货号为20FB0857)12.5μL和水。

(3)取步骤(2)制备的反应体系，进行PCR扩增，得到扩增产物。

反应程序：95℃预变性10min；95℃15s，55℃10s，72℃30s，35次循环；72℃5min。

(4)将扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收扩增产物的目的条带进行测序。测序由北京六合华大基因科技有限公司进行。

(5)分析测序结果中是否含有DSS或DSS的反向互补序列，之后进行如下判断：如果测序结果中含有DSS或DSS的反向互补序列，则该待测样本为或疑似为白术；如果测序结果中不含有DSS或DSS的反向互补序列，则该待测样本不为或疑似不为白术。

是否含有DSS或DSS的反向互补序列的统计结果见表3。结果表明，步骤2合成的5个引物对均可以准确鉴定白术，即步骤2选取的5条白术DSS均可以作为白术的鉴定标记。

表3

实施例3、使用DNA特征序列鉴定人参的方法

1、人参DSS的获得

按照实施例1中步骤一的方法，获得人参DSS。

共获得人参DSS 5927条，其中前100条见表4。

表4

2、从步骤1获得的5927条人参DSS中随机抽取5条，根据其在基因组中的位置的上下游200bp片段，分别设计并合成用于扩增DSS的引物对。

具体选取的5条人参DSS、用于扩增DSS的5个引物对(由上游引物和下游引物组成)和扩增产物长度见表5。

表5

3、分别使用步骤2合成的5个引物对鉴定白术

待测样本为8个人参(Panaxginseng)样本和8个西洋参(Panax quinquefolius)样本。人参和西洋参均为市售，均符合中国药典(2020年版)一部正文各药材项下的有关规定。每个待测样本采用每个引物对进行如下检测：

(2)制备反应体系。反应体系为25μL，包括待测样本的DNA 1μL、上游引物水溶液(浓度为10μmol·L^-1)1μL、下游引物水溶液(浓度为10μmol·L^-1)1μL、2×M5 SuperFastTaqPCR(北京聚合美生物科技有限公司的产品，货号为20FB0857)12.5μL和水。

(3)取步骤(2)制备的反应体系，进行PCR扩增，得到扩增产物。

反应程序：95℃预变性10min；95℃ 15s，55℃ 10s，72℃ 30s，35次循环；72℃5min。

(5)分析测序结果中是否含有DSS或DSS的反向互补序列，之后进行如下判断：如果测序结果中含有DSS或DSS的反向互补序列，则该待测样本为或疑似为人参；如果测序结果中不含有DSS或DSS的反向互补序列，则该待测样本不为或疑似不为人参。

是否含有DSS或DSS的反向互补序列的统计结果见表6。结果表明，步骤2合成的5个引物中的4个可以准确鉴定人参，即步骤2选取的5条人参DSS中有4条可以作为人参的鉴定标记。

表6

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国中医科学院中药研究所

<120> 一种使用DNA特征序列鉴定植物的方法

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ataaccttcg cgaaatagaa gaaactcttg gaaaggtcag 40

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

acacggcttt ccctctgtat 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tggctcggaa ttattggaag a 21

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tagaataaaa cagctaggcc tattcttcat atttcaactt 40

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ggcccaaaac ctcgctaatt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

acgtgcgact atctccacta 20

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atggtttggc aattcctcat gaggggatga gtcgagataa 40

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

tcaaaccgac ccatttacta tct 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

aagttatcgc tgcaaacccc 20

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

agtagtaaaa gcgagggtgc cggtataaga accagaacga 40

<210> 11

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

aatccccacc acgatcgtta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

ttgaacccac aaatgcctgt 20

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

ctccgccctt atcttactct tacaaggaaa gggaaaaaat 40

<210> 14

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

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<210> 15

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

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<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

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<210> 19

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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tttcagtgtt tttggcaaac catatctatc aaaactcctc 40

<210> 20

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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ctacctagcc gggccttttt 20

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

cgaacagggg aattaggcgt 20

<210> 22

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

tctgtatcga ggatcatcga aataagcaat aatactcttt 40

<210> 23

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

cccactcggc ttcttgtagt 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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tatctggcca ttctccacgc 20

<210> 25

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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ccagaaggag atatttttta agctggaaag ggattttatc 40

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

ttgtaccctc cccctaggtg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

acaagtgagg ggagcactct 20

Claims

1.一种鉴定待测植物物种的方法，为检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列，进行如下判断：如果待测植物的基因组中含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种为或疑似为目标物种；如果待测植物的基因组中不含有目标物种的DSS或其反向互补序列，则待测植物的物种不为或疑似不为目标物种；

所述目标物种的DSS为长度为20-100bp、目标物种的核酸序列中存在且非目标物种的核酸序列中不存在的核酸序列片段；

获得目标物种的DSS的步骤依次如下：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测植物的基因组中是否含有目标物种的DSS或其反向互补序列的方法为A1)或A2)：

A2)直接测序。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目标物种为白术。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述白术的DSS为DSS1、DSS2、DSS3、DSS4或DSS5；

DSS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

DSS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

DSS3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

DSS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

DSS5的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：

检测DSS1的特异引物对为引物对1，由SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:3所示的单链DNA分子组成；

检测DSS2的特异引物对为引物对2，由SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:6所示的单链DNA分子组成；

检测DSS3的特异引物对为引物对3，由SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:9所示的单链DNA分子组成；

检测DSS4的特异引物对为引物对4，由SEQ ID NO:11所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:12所示的单链DNA分子组成；

检测DSS5的特异引物对为引物对5，由SEQ ID NO:14所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:15所示的单链DNA分子组成。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目标物种为人参。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述人参的DSS为DSS6、DSS7、DSS8或DSS9；

DSS6的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

DSS7的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

DSS8的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；

DSS9的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：

检测DSS6的特异引物对为引物对6，由SEQ ID NO:17所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:18所示的单链DNA分子组成；

检测DSS7的特异引物对为引物对7，由SEQ ID NO:20所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:21所示的单链DNA分子组成；

检测DSS8的特异引物对为引物对8，由SEQ ID NO:23所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:24所示的单链DNA分子组成；

检测DSS9的特异引物对为引物对9，由SEQ ID NO:26所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:27所示的单链DNA分子组成。

9.用于鉴定白术真伪性的试剂盒或用于鉴定人参真伪性的试剂盒；

DSS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

DSS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

DSS3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

DSS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

DSS5的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

进一步的；

所述用于检测DSS1的物质为引物对1，由SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:3所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测DSS2的物质为引物对2，由SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:6所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测DSS3的物质为引物对3，由SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:9所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测DSS4的物质为引物对4，由SEQ ID NO:11所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:12所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测DSS5的物质为引物对5，由SEQ ID NO:14所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:15所示的单链DNA分子组成；

DSS6的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

DSS7的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

DSS8的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；

DSS9的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；

进一步的；

所述用于检测DSS6的物质为引物对6，由SEQ ID NO:17所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:18所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测DSS7的物质为引物对7，由SEQ ID NO:20所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:21所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测DSS8的物质为引物对8，由SEQ ID NO:23所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:24所示的单链DNA分子组成；

所述用于检测DSS9的物质为引物对9，由SEQ ID NO:26所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:27所示的单链DNA分子组成。

10.K1)或K2)：

K1)检测DSS1、DSS2、DSS3、DSS4和/或DSS5的物质在鉴定白术真伪性中的应用；

K2)检测DSS6、DSS7、DSS8和/或DSS9的物质在鉴定人参真伪性中的应用；

DSS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

DSS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

DSS3的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

DSS4的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

DSS5的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

DSS6的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

DSS7的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

DSS8的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；

DSS9的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。