KR100673070B1 - 실시간 ｐｃｒ법을 이용한 인삼의 종간 유전자 감별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실시간 중합효소 연쇄 반응법(Real-time PCR(Polymerase chain reaction)법)에 의한 인삼의 종간 유전자 감별 방법에 관한 것으로써, 상세하게는 고려삼과 서양삼을 실시간 중합효소 연쇄 반응법에 의하여 유전자형을 분석하고, 인삼의 종간 특이성 시퀀싱 프라이머를 고안하여 파낙스 종(Panax species)의 종간 연관성과 유전적 변이를 평가하기 위한 감별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 감별 방법을 통하여 인삼의 종을 판별함으로써 정확한 인삼 원료를 공급할 수 있으며, 인삼의 품질관리 방법으로 활용 할 수 있다.

고려삼, 서양삼, 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR)법, 감별 방법

Description

실시간 ＰＣＲ법을 이용한 인삼의 종간 유전자 감별 방법 {A genetical identification method for discrimination of ginseng species by using Real-time PCR}

도 1은 인삼의 종에 대해 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)법을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR)법에 의한 인삼의 종간 유전자 감별 방법에 관한 것이다.

인삼은 예로부터 한국과 중국에서 전통적인 약물로 사용되어 왔다(Kang BS., et al., Boncho-Hak, 6th Ed., Seoul:Young-Lim Press, pp400-1, pp531-3, 1991). 한약 보유 시장은 과거 10년간 빠르게 성장해 왔다. 파낙스(Panax)속은 한의학에서 의학적으로 가장 중요한 속(genus)들 중의 하나이다. 이것은 동아시아와 동북아메리카에 분포되어 있는 대략 120가지 식물의 속들 중의 하나이다.

인삼은 파낙스(Panax)속에 속하는 다년생 식물로, 파낙스속 식물은 식물 분류학상 오가과(Araliaceae)에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 십여 종이 알려져 있다. 대표적인 종으로 고려삼(Panax ginseng), 서양삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼 (Panax trifolia), 히말라야삼 (Panax pseudoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis) 등이 있다 (고려삼의 이해, 고려인삼학회, pp9, 1995; Advances in Ginseng Research, 고려인삼학회, pp127-137, 1998). 기타 파낙스속 식물로는 파낙스 엘레가티오르(Panax elegatior), 파낙스 완지아누스(Panax wangianus), 파낙스 비핀라티푸스(Panax bipinratifidus) 등이 있다.

고려삼(Korean ginseng)으로 알려진 파낙스 진생(P. ginseng)과 서양삼(American ginseng)으로 알려진 파낙스 쿠인쿼폴리우스(P. quinquefolius)는 한국과 중국에서 중요한 약물로 여겨진다(Kaul PN., et al., Prog Drug Res., 57, pp1-75, 2001; Bhattaram VA., et al., Phytomedicine, 9 Suppl 3, pp1-33, 2002; Wen J., et al., Mol. Phylogenet. Evol., 6(2), pp167-77, 1996). 이 두 가지 종 사이에서, 고려삼은 서양삼에 비하여 노화, 허약 및 스트레스에 더 효과적으로 기(氣, Qi)를 강화시킨다고 알려져 있다. 한국의 시장에서 고려삼의 가격은 서양삼에 비하여 매우 고가이다. 몇몇 상인들은 서양삼을 고려삼으로 속여서 판매하기도 한다. 더구나, 많은 상업적 인삼 제품들은 절편이나 분말 또는 추출물 형태여서 확인하는 것이 매우 어려운 문제점들이 있어왔다(Um JY., et al., Biol. Pharm. Bull., 24(8), pp872-5, 2001). 또한, 화학적 측면의 분석을 통한 확인은 토양 조건, 기 후, 영양적 요소 등의 다양성 때문에 인삼을 구별하는 것은 매우 어려운 실정이다(Mihalov JJ., et al., J. Agric. Food Chem., 48(8), pp3744-52, 2000).

또한, 기존의 인삼 감별 유전자 분석법의 경우 주관적인 요소가 있을 수 있는 겔을 토대로 한 방법(gel-based method)으로 판독자에 따라 감별 결과가 달라질 가능성이 있었다.

이에 본 발명자들은 최근 발전되고 있는 유전적 변이를 평가하는데 사용되는 DNA 분석 기술인 '실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR) 법'을 이용하여 파낙스 종(Panax species)들로부터 추출된 DNA로부터 단일 염기 형태의 변이를 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 자동적인 유전자 분석법인 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR)법에 의해 인삼의 종간 유전적 변이를 분석하여 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼의 종간 유전적 변이를 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR)법에 의해 분석하여 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 방법을 제공한다.

인삼 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1단계; 추출된 DNA 및 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 빅(VIC) 프라이머, 팜(FAM) 프라이머를 포함하는 프라이머의 반응 용액을 제조하는 제 2단계; 상기 제조된 반응 용액을 증폭시키는 제 3단계; 증폭된 DNA를 조합하여 실시간 중합효소 연쇄 반응법을 수행함으로써 얻어진 유전자형 분석을 통하여 인삼의 종을 감별하는 제 4단계를 포함함을 특징으로 하는 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 방법을 제공한다.

상기 감별 방법을 위한 인삼 시료로는 파낙스 종(Panax species), 예를 들어, 고려삼(Panax ginseng), 서양삼(Panax quinquefolia), 전칠삼(삼칠, Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonica), 삼엽삼(Panax trifolia), 히말라야삼 (Panax pseudoginseng), 베트남삼 (Panax vietnamensis), 파낙스 엘레가티오르(Panax elegatior), 파낙스 완지아누스(Panax wangianus), 또는 파낙스 비핀라티피두스(Panax bipinratifidus)의 전초, 뿌리, 줄기, 또는 잎 등이 가능하다.

상기 센스프라이머는 서열번호 1을 포함함을 특징으로 하고, 상기 안티센스 프라이머는 서열번호 2를 포함함을 특징으로 하며, 상기 빅(VIC) 프라이머는 서열번호 3을 포함함을 특징으로 하고, 상기 팜(FAM) 프라이머는 서열번호 4를 포함함을 특징으로 하는 감별방법을 제공한다.

상기 서열번호 1과 2로 기재되는 프라이머는 20 내지 22 염기서열(mer)로써 염기서열을 바탕으로 고안됨을 특징으로 한다.

또한, 상기 서열번호 3과 4로 기재되는 프라이머는 3'말단에 택맨 엠지비(TaqMan^® MGB) 프로브가 부착된 프라이머로 유전자형 분석에 사용됨을 특징으로 한 다.

본원에서 정의되는 프라이머는 10 내지 35 mer, 바람직하게는 15 내지 25 mer인 프라이머를 사용함이 바람직하다.

상기 제 3단계의 실시간 중합효소 연쇄 반응 법을 수행 시, ABI Prism^®7000 sequence detection system(Applied Biosystems, USA) 기구를 이용하며 신장되는 DNA 가닥에서 누클레오티드가 합성될 때 빛이 발생되며, 이러한 과정을 통하여 인삼의 다형성(polymorphism)이 판별됨을 특징으로 한다.

상기 제 4단계의 유전자형 분석은 15분 안에 96개 시료의 동시 분석이 가능한 자동화된 프로그램(SDS 7000 software(Applied Biosystems, USA))으로 실행되며, 유전적 변이의 정확한 서열(sequence)의 측정에 빠른 방법으로 이용될 수 있다.

본 발명의 감별 방법은 소량의 시료를 이용하여 단시간 내에 감별이 가능하며, 겔을 이용하지 않는 방법(non-gel based method)으로써 주관적인 요소가 배재된 보다 정확한 진단이 가능하다.

본 발명의 감별 방법은 육안으로 감별이 어려운 인삼에 있어서 종특이적 프라이머를 이용하여 인삼의 종, 바람직하게는 고려삼 또는 서양삼을 감별 할 수 있다.

또한, 본 발명은 DNA 추출시약, 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 빅(VIC) 프라이머 또는 팜(FAM) 프라이머를 포함하는 PCR용 시약을 포함하는 RT(real time) PCR 에 의해 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

상기 센스 프라이머는 서열번호 1을 포함하고, 상기 안티센스 프라이머는 서열번호 2를 포함하며, 상기 빅(VIC) 프라이머는 서열번호 3을 포함하고, 상기 팜(FAM) 프라이머는 서열번호 4를 포함하는 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 키트를 제공한다.

또한, 상기 빅(VIC) 또는 팜(FAM) 프라이머는 3'말단에 택맨 엠지비(TaqMan^®MGB) 프로브가 부착된 프라이머로 5 내지 20 염기서열(mer)로써 유전자형 분석에 사용됨을 특징으로 하는 감별 키트를 포함한다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 인삼 시료의 준비

고려삼 시료는 전라북도 진안에서 재배된 것을 전북진안농협(진안, 전북, 대한민국)으로부터 검열 받은 표준화된 포장으로 구입하여 사용하였다. 서양삼 시료는 중국 요녕(Liaoning)에서 재배된 것을 요녕중의학원(요녕, 중국)의 본초학 전공 교수가 확인한 것을 제공 받아 사용하였다.

실시예 1. 인삼의 DNA 정제

뿌리부분 전체가 포함된 형태의 인삼 3g을 멸균된 작은 칼로 잘게 썰고, 멸균된 분쇄기로 분쇄하여 분말화 하였다. DNA 분리용 키트(DNeasy, No. 69104, Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)는 제조사의 설명서에 의하여 약간 변형하여 사용하였다. 분말화 된 인삼 시료 300 mg은 세정과정을 거쳐 사용하였다. 시료를 용출(elution)하기 전에, 컬럼(column)은 남은 에탄올을 증발시키기 위해 5분 동안 37 ℃에서 건조시켰다. 시료들은 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) 총 부피 200 ㎕에서 용출시켰다.

실험예 1. 중합효소 연쇄 반응(PCR) 법을 이용한 DNA 증폭

추출된 DNA의 증폭은 PCR법에 의하여 수행되었다. 각 인삼 시료의 ITS(internal transcribed spacer regions) 구역은 DNA 25 ng, 각 프라이머 (정방향(forward): 서열번호 1, 역방향(reverse): 서열번호 2, 빅(VIC) 프라이머: 서열번호 3, 팜(FAM) 프라이머: 서열번호 4) 5 pmol을 사용하여 증폭되었다. 본 실험에 사용되는 형광 프로브와 5' 뉴클레이즈 분석(nuclease assay)에 대한 내용은 Livak에 의해 이미 설명된 바 있다(Livak KJ. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet Anal. 1999;14(5-6):143-9). 위 프라이머는 Assays-by-Design service^SM(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 40X assay mix로 준비하였다. 실시간 중합효소 연쇄 반응을 위한 준비는 제조사 의 표준 프로토콜(protocol)을 따라 수행되었다.

실험예 2. 실시간 중합효소 연쇄 반응(Real-time PCR) 법에 의한 유전자형 분석(Genotyping)

PCR 반응을 위해 반응액은 template DNA 11.875㎕, 40X assay mix 0.625㎕, TaqMan^® Universal PCR master mix(2X) 12.5㎕로 총 25㎕로 조정하였다. 실시간 중합효소 연쇄 반응은 ABI Prism^® 7000 sequence detection system(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행되었는데 PCR 수행은 95 ℃에서 10분간 변성과정을 거치고, 92 ℃, 15초, 60 ℃, 1분간의 2단계로 PCR을 40 cycles 수행하였다.

PCR 수행이 끝난 후 결과의 분석은 SDS 7000 software(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 실시하였다. 이러한 과정으로부터 인삼의 다형성(polymorphism)은 자동적으로 유전자형이 판별되었다.

상기 실험예 2에서 고려삼과 서양삼의 두 가지 인삼의 종을 구별하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄 반응 법에 의하여 동정하였고, 그 결과, 서양삼은 고려삼과 비교하여 다른 형태를 보여 명백한 차이를 나타내었다.

고려삼은 빅(VIC) 프로브와 반응하여 X 축에 근접하게 나타났으나, 서양삼은 팜(FAM) 프로브와 반응하여 Y 축에 근접하게 나타났다(도 1 참조). 또한, 고려삼과 서양삼을 비교하기 위한 인삼의 종간 특이성 프라이머를 고안하였다. 시퀀스 상에 서, 고려삼은 A 뉴클레오티드 염기를 갖고 있으나, 서양삼은 C 누클레오티드 염기를 갖고 있었다. 따라서 본 발명의 인삼의 종간 특이성 프라이머가 적합하게 고안되었음을 확인 할 수 있었다.

본 발명은 인삼에 대하여 실시간 중합효소 연쇄 반응법을 이용하여 유전자형을 분석하고, 인삼의 종간 특이성 프라이머를 고안하여 파낙스 종(Panax species)의 종간 연관성과 유전적 변이를 감별하는 인삼의 종간 확인시험법을 확립함으로써 정확한 인삼 원료를 공급하고 인삼의 품질관리 방법으로 활용 할 수 있으며, 인삼 외에 기타 한약재 자원에 대한 신물질 탐색이나 품종간 감별에 대한 기초 자료로 유용하게 사용될 수 있다.

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Claims (12)

1. 인삼 시료로부터 DNA를 추출하는 제 1단계; 추출된 DNA, 센스 프라이머(CCAAGTTGCA AACCCATGGT), 안티센스 프라이머(TTTGATTTCC TTGGCGCATT CC), 3′말단에 택맨 엠지비(TaqMan® MGB) 프로브가 부착된 빅(VIC) 프라이머(VIC-5′-TTGGGTGG A T CTCGT-3′-MGB) 및 3′말단에 택맨 엠지비(TaqMan® MGB) 프로브가 부착된 팜(FAM) 프라이머(FAM-5′-TTGGGTGG C T CTCGT-3′-MGB)로 구성되는 프라이머의 반응 용액을 제조하는 제 2단계; 상기 제조된 반응 용액을 증폭시키는 제 3단계; 증폭된 DNA를 조합하여 실시간 중합효소 연쇄 반응법을 수행하여, A 뉴클레오티드 염기를 갖고 있는 상기 제 2단계에서 수득한 빅(VIC) 프라이머와 결합하는 고려삼의 DNA 및 C 뉴클레오티드 염기를 갖고 있는 상기 제 2단계에서 수득한 팜(FAM) 프라이머와 결합하는 서양삼의 DNA를 SDS 7000 software(Applied Biosystems, USA)를 이용하여 도 1과 같은 유전자 분석(고려삼과 서양삼을 감별하는 구체적인 설명 기재)을 통하여 고려인삼 및 서양인삼의 종을 감별하는 제 4단계를 포함함을 특징으로 하는 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 방법.
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7. DNA 추출시약, 센스 프라이머(CCAAGTTGCA AACCCATGGT), 안티센스 프라이머(TTTGATTTCC TTGGCGCATT CC), 3′말단에 택맨 엠지비(TaqMan® MGB) 프로브가 부착된 빅(VIC) 프라이머(VIC-5′-TTGGGTGG A T CTCGT-3′-MGB) 및 3′말단에 택맨 엠지비(TaqMan® MGB) 프로브가 부착된 팜(FAM) 프라이머(FAM-5′-TTGGGTGG C T CTCGT-3′-MGB)를 함유한 PCR용 시약으로 구성되는 RT(real time) PCR 에 의해 인삼의 종을 감별하기 위한 감별 키트.
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