KR20040034332A

KR20040034332A - 고려인삼과 외국삼의 단일염기다형성을 이용한 판별방법

Info

Publication number: KR20040034332A
Application number: KR1020030019421A
Authority: KR
Inventors: 인준교; 이범수; 양덕춘; 박태형
Original assignee: (주)바이오피아
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2004-04-28

Abstract

본 발명은 고려인삼과 외국삼을 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 이용하여 구별하는 방법으로서, 좀 더 상세하게는 고려인삼과 외국삼으로부터 DNA를 추출하고 SNP 프라이머(Primer)를 제작하여 ITS 영역을 유전자증폭기(PCR, polymerase chain reaction)로 증폭한 후에 염기서열분석(Sequencing)을 하고 이들을 비교·분석하여 SNP 부분을 찾아내고 이들 영역에 대하여 특이적인 프라이머를 제작한 다음 이를 사용하여 PCR로 증폭한 후에 전기영동을 하여 나타나는 밴드를 관찰하여 고려인삼과 외국삼을 판별하는 시스템이다.

본 시스템을 이용하면 극히 소량(50-100mg)의 시료를 사용하여 고려인삼과 외국삼을 간단하고 신속하게 판별할 수 있다.

Description

고려인삼과 외국삼의 단일염기다형성을 이용한 판별방법{Distinction of Korean Ginseng from Foreign Ginseng using Single Nucleotide Polymorphism}

본 발명은 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 이용하여 고려인삼과 외국삼을 판별하는 방법으로, 더욱 상세하게는 고려인삼과 외국삼의 잔뿌리(50-100mg)로부터 DNA를 추출하고 PCR을 이용하여 효율적으로 고려인삼과 외국삼을 판별하는 방법이다.

고려인삼은 오가피과(Araliaceae) 파나스속(Panax)의 인삼종으로 분류되는 대표적인 약용식물로서, 한국과 중국을 비롯한 동양권에서 오랫동안 보혈강장제로 애용되어 왔고 1843 소련의 과학자 C.A. Meyer가 만병을 치료한다는 뜻을 가진 Panax ginseng C.A. Meyer로 명명하였다.

인삼의 효능에 대해서는 예로부터 한방의학에서 수 천년 동안의 경험에 의하여 그 약효가 특출한 것으로 알려져 왔다. 현대에 이르러서는 세계 각국의 저명한 학자들에 의해 활발한 과학적 연구가 진행되어 인삼의 효능이 생리학, 생화학, 약리학, 병리학적인 지식에 바탕을 둔 임상학적인 연구결과가 보고되고 있다. 인삼의 주요 약리효능은 사포닌(ginsenoside)이라고 하는 배당체로 다른 식물에서 발견되는 사포닌과 다른 특이한 구조뿐만 아니라 그 효능에서도 탁월하다. 최근 분리분석 기술의 발달에 따라 지금까지 30여종의 인삼사포닌의 화학구조가 밝혀졌다. 인삼사포닌은 화학구조의 특성에 따라 플로토파낙사디올(PD계), 프로토파낙사트리올(PT계), 올레안계 사포닌으로 구분하는데 현재까지 각각 19종, 10종, 1종의 화합물이 분리 정제되었다. 인삼의 주 약리 효능을 살펴보면 간장보호 작용, 혈당강하작용, 암세포증식 및 성장억제 효과, 항피로작용, 항스트레스 작용, 학습활동과 기억력 및 스트레스반응의 적응력 증진, 강심작용, 적혈구 생성촉진 효과, 면역증강 및 소염작용, 강정작용, 위궤양을 예방하고 치료하며 혈소판의 응집을 억제하고 모발의 인장강도를 증가하여 피부질환의 치유와 피부를 강화하는 작용 등 많은 효능이 있는 것으로 밝혀져 왔다.

이처럼 다양한 약리효능을 나타내는 인삼은 그 경제성이 인정되어 세계적으로 큰 시장을 형성하여 상품으로 유통되고 있는데 이들은 크게 3종류로 나눌 수가 있다. 한국을 비롯한 아시아 극동지역에서 재배되고 있는 고려인삼[PanaxginsengC.A. Meyer]과 미국 및 캐나다 지역에서 재배되고 있는 화기삼(花旗蔘: PanaxquinquefoliumL.), 그리고 중국남부의 운남성(雲南省), 광서성(廣西省)에서 생산되고 있는 전칠삼(田七蔘 또는 三七, Panaxnotoginseng(Burk) F.H. Chen)이다. 이중에서도 한국에서 생산되고 있는 고려인삼은 다양한 약리효능을 가진 인삼으로 품질이 가장 우수한 거승로 평가되어 왔고, 오래 전부터 우리나라뿐만 아니라 홍콩, 대만 등 외국 인삼시장에서도 고가로 거래되어 왔다. 그러나, 최근에는 품질이 낮은 저가의 화기삼 및 중국산 인삼이 대량 밀반입되어 고려인삼으로 둔갑하여 거래되고, 게다가 최근에는 미국 등지에서 재배되고 있는 산양삼이 밀반입되어 고가의 산삼으로 거래되기도 하여 인삼 소비자의 피해가 속출하고 있다. 인삼은 형태적으로 차이가 별로 없어 인삼소비자가 저가 인삼과 고가 인삼, 산양삼과 산삼간의 차이를 쉽게 구별할 수 없기 때문에 인삼소비자의 피해는 더욱 심해질 것으로 전망된다. 최근 이러한 문제점을 해결하기 위한 한국산 산삼을 판별하는 방법(특2002-0022491)등이 제시되었으나 이들 방법은 일부 전문가와 고가의 분석기기를 필요로 하기 때문에 일반화하기는 어려운 방법들이다. 고려인삼과 외국삼(중국삼, 일본삼, 화기삼)은 같은Panax속에 속하지만 종이 달라 유전적인 차이가 있다는 것이 알려져 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 점에 착안하여 고려인삼과 외국삼으로부터 소량의 세근으로도 고려인삼과 외국삼을 구별해낼 수 있는 방법을 개발하고자 연구를 수행한 결과, 고려인삼과 외국삼의 유전자 염기서열차이(변이, SNP)를 발견하였고 이를 활용하여 SNP primer를 제작하였다. 그리고 50-100mg의 극히 소량의 생체시료를 사용하여 고려인삼과 외국삼을 구별해 낼 수 있는 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석시스템을 개발하였다. 본 발명의 목적은 극히 소량의 시료를 사용하여 재현성 있으며 단시간에 고려인삼과 외국삼을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기목적은 극히 소량의 시료를 사용하여 고려인삼과 외국삼을 SNP프라이머를 이용하여 신속하고 재현성 있게 판별하는 것으로서 고려인삼과 외국삼의 잔뿌리를 채취하여 DNA를 추출하고 제작된 특이적인 SNP 프라이머를 이용하여 유전자증폭기(PCR)로 반응시킨 후 일정시간 전기영동을 하여 나타나는 DNA 밴드패턴을 비교하여 고려인삼과 외국삼을 판별함으로서 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 우선 시료로 사용되는 고려인삼과 외국삼의 사진을 촬영한 후 이들의 세근 일부를 잘라서 DNA를 추출하는 단계, 고려인삼과 외국삼의 ITS(internal transcribed sequence)영역의 염기서열을 비교·분석하여 특이적인 SNP 프라이머를 제작하는 단계, 추출된 각 시료의 DNA와 SNP 프라이머를 혼합하여 PCR을 이용하여 증폭하는 단계 그리고 이들 각각의 증폭된 유전자 산물을 전기영동을 하여 DNA 밴드패턴을 비교하여 산삼과 재배인삼을 구별하는 단계로 구성되어 있다.

사진촬영 및 DNA 추출 : 고려인삼과 외국삼을 카메라로 증거사진을 촬영한 후 각 시료의 세근(50-100mg)을 채취한다. DNA 추출은 상용화되어 있는 컬럼타입의 DNA 추출킷트(Macherey-Nagel)를 사용하였으며, 전기영동을 하여 추출된 DNA량과 상태를 관찰하여 각 시료의 DNA량을 동일하게 조정하였다.

ITS 영역의 염기서열비교 및 SNP 프라이머제작 : 추출된 DNA를 이용하여 제작한 ITS 프라이머로 고려인삼과 외국삼의 ITS(internal transcribed sequence)1영역과 5.8S ribosome영역, ITS2영역을 PCR로 증폭한 후 자동염기서열분석기(sequencer)를 이용하여 염기서열을 결정하고 이를 비교·분석하여 SNP를 찾아낸 후 특이적인 SNP 프라이머를 제작하였다(Philip 등 1991, Clinical Chemistry).

그림 1. 고려인삼과 외국삼의 ITS 영역의 구조 및 SNP 프라이머의 제작

유전자 증폭 : 추출된 DNA 1-50 ng, 특수하게 제작된 각각의 SNP primer 0.2-2 uM, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 0.1 mM, MgCl₂200 uM, Taq polymerase 0.5-1U 등을 200 ul PCR 튜브(tube)에 첨가하고 유전자 증폭기의 조건을 94℃ 30초, 67℃ 30초, 72℃ 1분에서 30회 반복하여 증폭한 후 유전자 증폭을 완결하기 위하여 72℃에서 15분간 유지하였다.

전기영동 : 유전자 증폭기를 사용하여 증폭된 유전자산물을 관찰하기 위하여 1.0% 아가로스겔을 만들고 TAE 버퍼를 사용하여 50 volt에서 10분간 영동한 후 100 volt에서 15분간 영동하였다. 영동이 끝난 아가로스겔은 UV-transilluminator에 올려놓고 나타나는 DNA 밴드를 관찰한 후 폴라로이드필름을 사용하여 사진 촬영하였다. 실험상의 오차를 확인하기 위하여 고려인삼과 외국삼에서 공통으로 나타나는 대조구 DNA밴드(579bp)와 고려인삼에서만 나타나는 DNA밴드(254bp), 외국삼 특이적으로 나타나는 DNA밴드(325bp)로 구성된 본 시스템은 재현성있게 단기간에 고려인삼과 외국삼을 판별할 수 있었다.

그림 2. SNP 프라이머를 이용한 고려인삼(Panax ginseng)과 외국삼의 PCR 증폭을 통한 판별

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용할 경우 고려인삼과 외국삼으로부터 소량의 시료를 채취하여 DNA를 추출한 후 특수하게 제작된 SNP 프라이머로 단시간(5시간)에 재현성있는 결과를 얻을 수 있으므로 국내에서 불법적으로 수입되어 판매되고 있는 외국삼을 판별함으로서 국내 인삼시장의 유통질서를 보다 명확하고 투명하게 하는데 크게 기여할 것이다.

Claims

고려인삼과 외국삼의 ITS 1영역, 5.8S ribosome영역, ITS2 영역의 DNA 영기서열을 비교하여 나타나는 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 이용하여 제작되는 프라이머(primer)
제1항에 있어서 제작된 SNP 프라이머를 이용하여 유전자증폭기를 사용하여 증폭된 유전자 산물을 전기영동하여 나타난 DNA 밴드패턴의 차이를 이용하여 고려인삼과 외국삼을 구별하는 방법
제1항에 있어서 제작된 SNP 프라이머를 이용하여 실시간유전자증폭기(real time PCR)를 이용하여 증폭되는 유전자산물의 결과를 이용하여 고려인삼과 외국삼을 구별하는 방법