CN105219848B - 用于鉴别瘿椒树性别的引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于鉴别瘿椒树性别的引物及其应用，所述的引物包括TSMHF和TSMHR，具体序列为：TSMHF：5’‑TTGTCCCTCTCAACTTCGCT‑3’；TSMHR：5’‑AAAATCAACCAGCCAGTTCG‑3’；所述的鉴定瘿椒树性别的引物用于鉴别瘿椒树的雄性及两性性别的应用。本发明从150对微卫星引物中偶然获得了1对用于鉴定瘿椒树性别的特异性微卫星标记引物，带型清晰、重复性好，能100％鉴别，可靠性强，可作为瘿椒树鉴定性别的引物；本方法筛选的瘿椒树性别鉴定的引物特异性极高，稳定性极强，只需要常规PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色显影步骤，不需要进行片段分离，裸眼观察即可完成对瘿椒树性别的快速鉴定，为瘿椒树的定向育种提供理论和技术上的指导。

Description

用于鉴别瘿椒树性别的引物及其应用
技术领域
本发明属于植物分子生物技术领域，涉及一种用于鉴别瘿椒树性别的引物及其应用。
背景技术
瘿椒树(Tapiscia sinensis)，又称银鹊树，属于瘿椒树科(Tapisciaceae)、瘿椒树属，为我国特有的珍稀、古老树种。由于其种子发育周期长，自然更新能力差，加上人为破坏，已处于濒危状态，被列为国家三级保护植物。
瘿椒树为雄全异株的繁育系统，在种群中有雄株和两性株两种性别。雄株开雄花不结果，两性株开完全花并结果。雄全异株在自然界中极为罕见，其在植物繁育系统的进化与维持方面具有独特的研究价值。瘿椒树的叶片内富含黄酮类化合物，具有明显的抗溃疡、解痉、抗炎及降血脂等生物活性，在医药上应用广泛。在园林绿化方面，瘿椒树树形美观，秋叶黄色，枝繁叶茂，又可作园林绿化树种。因此，瘿椒树是一种集科研、经济、观赏于一身的珍稀树种，是一种优良的种质资源。
确定瘿椒树早期的性别有助于研究雄全异株植物性别决定的遗传原理，有助于理解植物繁育系统的进化与维持。另外，不同性别的瘿椒树具有不同的经济价值，如雄株长势较两性株好，适用于园林绿化及医药有效成分的提取。两性株可以产生种子，可以用来培育幼苗扩大繁育。因此在实际应用中，根据目的的不同可选择合适的性别比例进行栽培。
雌雄异株植物性别的鉴定常从外部形态、生理生化、染色体组型、同工酶、特异蛋白质、分子标记等方面的差异来进行(李瑞丽，2006；董莉娜，2007)。关于雄全异株植物性别的早期鉴定，以及运用微卫星分子标记对瘿椒树性别鉴定，目前国内外均未见文献报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷和不足，本发明提供了一种用于鉴定瘿椒树性别的引物及其应用，解决了现有技术中不易早期鉴定瘿椒树性别的技术问题。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
用于鉴定瘿椒树性别的引物，所述的引物对为TSMHF和TSMHR(TS为瘿椒树拉丁名Tapiscia sinensis的首字母缩写，M和H分别为雄性Male、两性Hermaphrodite的首字母，F为正向引物Forward首字母，R为反向引物Reverse首字母)，具体序列为：
TSMHF：5’-TTGTCCCTCTCAACTTCGCT-3’；
TSMHR：5’-AAAATCAACCAGCCAGTTCG-3’。
所述的用于鉴别瘿椒树性别的引物用于鉴别瘿椒树的雄性及两性性别的应用。
具体的，采用PCR扩增方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法利用引物TSMHF和引物TSMHR进行瘿椒树的雄性及两性性别的鉴别。
更具体的，所述的PCR扩增方法中的PCR扩增体系包括：PCR混合液7.5μL、TSMHF0.5μL、TSMFR 0.5μL、DNA模版20ng及H2O 6.0μL，DNA模版为瘿椒树树叶的基因组DNA。
再具体的，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法的电泳条件为电压300V、电流100mA及时间2.5h。
进一步的，在所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法后进行银染及显影，所述的银染的染色液为质量百分比为0.2％硝酸银溶液，染色时间为15min；所述的显影的显影液包括质量百分比为0.04％的碳酸钠、质量百分比为1.2％的氢氧化钠和体积百分比为0.4％的甲醛混合溶液，显影时间为10min。
本发明的有益效果：
(1)本发明对瘿椒树的转录组序列进行测序，并运用微卫星分子标记与生物性状相关的原理，对设计的150对瘿椒树微卫星分子标记引物进行性别鉴定方面的筛选，得到1对可以用于鉴定不同瘿椒树性别的引物TSMHF和TSMHR，带型清晰、重复性好，能100％鉴别，可靠性强，可作为瘿椒树鉴定性别的引物；
(2)本方法筛选的瘿椒树性别鉴定的引物特异性极高，稳定性极强的微卫星标记引物，只需要常规PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色显影步骤，不需要进行片段分离，裸眼观察即可完成对瘿椒树性别的快速鉴定，为瘿椒树的定向育种提供理论和技术上的指导。
附图说明
图1为引物TSMHF和TSMHR扩增的10个瘿椒树个体的微卫星图谱；1-5为两性瘿椒树，6-10为雄性瘿椒树，M为核苷酸片段长度标尺；
图2为引物TSMHF和TSMHR扩增的28个瘿椒树个体的微卫星图谱；1-15为两性瘿椒树，16-28为雄性瘿椒树，M为核苷酸片段长度标尺；
以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。
具体实施方式
现有的雌雄异株植物性别的鉴定常从外部形态、生理生化、染色体组型、同工酶、特异蛋白质、分子标记等方面的差异来进行。在本发明之前，未见到有关雄全异植物能够通过特定的引物进行性别鉴别的报道，不确定雄全异株瘿椒树能否通过设计特定的引物来进行性别的鉴定。
本发明对瘿椒树的转录组序列进行测序，并运用微卫星分子标记与生物性状相关的原理，对自主开发的(见表1)150对瘿椒树微卫星分子标记引物进行性别鉴定方面的筛选，得到1对可以用于鉴定不同瘿椒树性别的引物TSMHF和TSMHR，TS为瘿椒树拉丁名Tapiscia sinensis的首字母缩写，用于表示瘿椒树；M和H分别为雄性Male、两性Hermaphrodite的首字母，用于表示瘿椒树为雄全异植物；F表示正向引物，R表示反向引物；这是首个可以对雄全异株植物瘿椒树进行性别鉴定的引物，通过PCR扩增的方法就能简便的进行瘿椒树的性别鉴定，操作简单、可靠性强。
本发明所使用的瘿椒树个体的树叶采自陕西省西安市西北大学太白校区和陕西省安康市宁陕县旬阳坝镇的秦岭南坡。
本研究使用的SSR引物来自瘿椒树转录测序获得的Unigenes(非冗余基因序列)，数据已提交NCBI(The National Center for Biotechnology Information)数据库，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，检索号：PRJNA284864。
实施例一：
本研究使用的SSR引物来自瘿椒树转录测序获得的Unigenes，选取其中包含有微卫星分子标记的Unigenes序列并设计引物。使用primer3软件进行引物设计，具体参数为：(1)GC含量范围在40％-60％,(2)引物长度在18-27bp之间,(3)退火温度为55-63℃,(4)扩增长度为100-280bp。
150个包含的微卫星分子标记序列，以及设计得到的引物序列见表1。
10个瘿椒树个体采自陕西省西安市西北大学太白校区，其中雄性植株5个，两性植株5个；
用150对引物对10个瘿椒树个体的基因组DNA进行筛选，引物TSMHF(5’-TTGTCCCTCTCAACTTCGCT-3’)和TSMHR(5’-AAAATCAACCAGCCAGTTCG-3’)可以用于鉴定瘿椒树的不同性别，该引物的PCR扩增结果见图1，可知电泳检测得到两个条带的为雄性个体，检测到单一条带的为两性个体。
实施例二：
本实施例选取28个瘿椒树个体，28个瘿椒树个体采自陕西省安康市宁陕县旬阳坝镇的秦岭南坡，其中雄性植株13个，两性植株15个；
本实施例选用的植物基因组提取试剂盒为北京天根生化科技公司的DP305-02植物基因组DNA提取试剂盒；
1、用植物基因组提取试剂盒分别对28个瘿椒树个体提取基因组DNA，提取方法如下：
(1)取瘿椒树叶片干重约30mg，加入液氮充分碾磨；
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度体积百分比为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
(3)加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm(13,400倍的重力加速度)离心5min；
(4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀；
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm(13,400倍的重力加速度)离心30s，弃掉废液；
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入17ml无水乙醇)，12,000rpm(13,400倍的重力加速度)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入60ml无水乙醇)，12,000rpm(13,400倍的重力加速度)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(8)重复操作步骤(7)一次；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400倍的重力加速度)离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400倍的重力加速度)离心2min，将溶液收集到离心管中即得。
2、条带的筛选与验证
(1)以28个样品DNA为模板进行PCR扩增，15uL反应体系中包含以下溶液或试剂：
PCR扩增条件为：
(2)反应结束后，采用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。使用pBR322 DNA/MspI为参照，通过银染及显影后在日光灯下观察样品PCR扩增产物目的片段；
银染：用染色液(1g硝酸银，500ml纯水现配)染色15分钟。用清水冲洗两次后，用显影液(0.2g碳酸钠，6g氢氧化钠，2ml甲醛，500ml纯水配制)显影10分钟；
电泳条件：恒压电压300V，电流100mA，时间2.5h；
若电泳检测得到两个条带的为雄性个体，检测到单一条带的为两性个体(图2)。

Claims (1)

1.用于鉴别瘿椒树性别的引物用于鉴别瘿椒树的雄性及两性性别的应用，其特征在于，用于鉴别瘿椒树性别的引物，包括TSMHF和TSMHR，具体序列为：
TSMHF：5’-TTGTCCCTCTCAACTTCGCT-3’；
TSMHR：5’-AAAATCAACCAGCCAGTTCG-3’；
采用PCR扩增方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法利用引物TSMHF和引物TSMHR进行瘿椒树的雄性及两性性别的鉴别；
所述的PCR扩增方法中的PCR扩增体系包括：PCR混合液7.5μL、TSMHF 0.5μL、TSMFR 0.5μL、DNA模版20ng及H2O 6.0μL，DNA模版为瘿椒树树叶的基因组DNA；
所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法的电泳条件为电压300V、电流100mA及时间2.5h；
在所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法后进行银染及显影，所述的银染的染色液为质量百分比为0.2％硝酸银溶液，染色时间为15min；所述的显影的显影液包括质量百分比为0.04％的碳酸钠、质量百分比为1.2％的氢氧化钠和体积百分比为0.4％的甲醛混合溶液，显影时间为10min。
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