CN114277172B - 猴耳环品种鉴定的ssr多重检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物、试剂盒及方法。与单个标记的独立PCR检测相比，本发明方法具有经济性好、节约试剂和省时高效等优点，为猴耳环和近缘种的群体多样性分析、种质资源遗传评价、品种和药材真实性鉴定等提供了简便可靠的方法；将该方法用于猴耳环品种(扦插无性系)的SSR分子指纹的构建和待检品种的鉴定，具有准确可靠、有效快捷的优点，可有效甄别假冒和错乱的品种以及新的品种，这为保障良种培育人和营林种植者的权益提供了重要的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物、试剂盒及方法。
背景技术
猴耳环[Archidendron clypearia(Jack)I.C.Nielsen]是豆科(LeguminosaeJuss.)云实亚科(Caesalpinioideae DC.)猴耳环属(Archidendron F.Mueller)的重要药用树种，自然分布于亚洲热带和南亚热带地区。猴耳环的工业利用价值极高，其枝叶提取物可用于治疗上呼吸道感染、急性咽炎和扁桃体炎等疾病，药渣可制备高密度复合材料，其木材还可用于制作家具和生产纸浆。猴耳环天然更新能力较弱，加之人为活动的严重干扰，野生资源日趋匮乏，现存自然群体多为小或极小种群，人工栽培已成为猴耳环资源培育的主要途径。
目前，猴耳环人工林的种植材料包括种子培育的实生苗和优树扦插的无性系，其中无性系具有可大规模扩繁、生长普遍较好、林相整齐等优点，在生产中的应用越来越广泛。但是，随着扦插扩繁的代数增加和种植范围的扩大，开始出现品种(无性系)混乱的问题，一些品种在扦插和育苗过程中可能被错误标记，市场上还可能存在以次充好、将未经选择的母树进行扦插后冒充优树无性系进行销售的现象，这会损害品种培育人和种植者的权益，并扰乱市场秩序。因此，对猴耳环品种进行有效鉴别显得非常必要。
植物品种鉴定有多种方法，如国际植物新品种保护联盟(International Unionfor the Protection ofNew Varieties ofPlants，UPOV)建议的常规方法包括叶片形态、树皮纹理、果实性状和解剖特征等表型特征，但表型易受发育期、季节、气温和光照等条件的影响，判定标准还易受人为因素的影响，从而影响鉴别的可靠性。另一方面，随着分子生物学的进步而发展起来的DNA分子标记技术，则具有不受环境影响、不同发育期和各部位一致等优点，已成为植物品种鉴定的有效手段。其中，简单序列重复(simple sequencerepeats,SSR，也称微卫星)分子标记是以2–6个核苷酸为重复单位的串联重复序列，串联重复数的变异导致目的片段的长度变异而形成个体特有的片段长度，具有多态性高、稳定性和重复性好、检测技术较灵活、共显性遗传等优点，是品种鉴定中应用最广泛的分子标记技术。并且，SSR标记可进行多重的实验检测，即通过优化将2个或多个SSR标记置于一个聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)中进行实验和后续检测，比单个SSR标记的独立检测更为经济和快捷。遗憾的是，猴耳环品种鉴定尚无高效的多重SSR检测技术体系，急需开发且用于猴耳环品种的有效鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物、试剂盒及方法。针对目前猴耳环尚无高效的多重SSR标记的技术体系、品种(扦插无性系)尚待鉴定的现状，本发明包括两个内容：(1)15个SSR标记优化为7个组合的三重或二重检测技术体系；(2)构建猴耳环品种的SSR分子指纹，用于有效鉴定品种的真实性。
本发明的第一个目的是提供猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物，包括由15对SSR标记引物组成的如下7个组合：
组合A：ARCeSSR266、ARCeSSR141和ARCeSSR277的引物对；
组合B：ARCeSSR304和ARCeSSR665的引物对；
组合C：ARCeSSR425和ARCeSSR464的引物对；
组合D：ARCeSSR095和ARCeSSR006的引物对；
组合E：ARCeSSR075和ARCeSSR649的引物对；
组合F：ARCeSSR288和ARCeSSR366的引物对；
组合G：ARCeSSR474和ARCeSSR448的引物对；
所述的ARCeSSR266的引物对的前向引物为F:ggatcataatggaatggagca(如SEQ IDNO.1所示)，后向引物为R:ccctttctggtggaaagttg(如SEQ ID NO.2所示)；
所述的ARCeSSR141的引物对的前向引物为F:ggaatggaatcagacccttg(如SEQ IDNO.3所示)，后向引物为R:tgttcatggagaatggcaaa(如SEQ ID NO.4所示)；
所述的ARCeSSR277的引物对的前向引物为F:gtgaggatctcatcgggaag(如SEQ IDNO.5所示)，后向引物为R:acgtggctctccatatttcg(如SEQ ID NO.6所示)；
所述的ARCeSSR304的引物对的前向引物为F:catcatgctggaggtgagaa(如SEQ IDNO.7所示)，后向引物为R:cagcaaagaggccaacattt(如SEQ ID NO.8所示)；
所述的ARCeSSR665的引物对的前向引物为F:ctgaggccatctcttcaacc(如SEQ IDNO.9所示)，后向引物为R:ttggcatggtccttccttac(如SEQ ID NO.10所示)；
所述的ARCeSSR425的引物对的前向引物为F:cccttaacaacatggatttgg(如SEQ IDNO.11所示)，后向引物为R:gtcaagcgttttgggtgagt(如SEQ ID NO.12所示)；
所述的ARCeSSR464的引物对的前向引物为F:aacctccatcttcttcctctct(如SEQ IDNO.13所示)，后向引物为R:gcagagttctgaggagctagttt(如SEQ ID NO.14所示)；
所述的ARCeSSR095的引物对的前向引物为F:cacaattgagcaaggaatgg(如SEQ IDNO.15所示)，后向引物为R:gggatacagcaggacaggaa(如SEQ ID NO.16所示)；
所述的ARCeSSR006的引物对的前向引物为F:attggatgctgcaggaacag(如SEQ IDNO.17所示)，后向引物为R:ccagtttcatttggctccat(如SEQ ID NO.18所示)；
所述的ARCeSSR075的引物对的前向引物为F:acgcgtggagttgagtttg(如SEQ IDNO.19所示)，后向引物为R:gggacaccttgagtgtactgc(如SEQ ID NO.20所示)；
所述的ARCeSSR649的引物对的前向引物为F:gccattctgtccaagaaggt(如SEQ IDNO.21所示)，后向引物为R:ttcatcttgggaaggcaatc(如SEQ ID NO.22所示)；
所述的ARCeSSR288的引物对的前向引物为F:gagcgcgcagagacataca(如SEQ IDNO.23所示)，后向引物为R:tagaaggaacacggggtttg(如SEQ ID NO.24所示)；
所述的ARCeSSR366的引物对的前向引物为F:tgaattctgcaccaaaacga(如SEQ IDNO.25所示)，后向引物为R:tagccgacctcacctagtgg(如SEQ ID NO.26所示)；
所述的ARCeSSR474的引物对的前向引物为F:tgcaatccatgtagccaatc(如SEQ IDNO.27所示)，后向引物为R:tgcacatcatcctattctgga(如SEQ ID NO.28所示)；
所述的ARCeSSR448的引物对的前向引物为F:attgatgcaagctgggagag(如SEQ IDNO.29所示)，后向引物为R:gagctggttttcgattgagc(如SEQ ID NO.30所示)。
本发明的第二个目的是提供用于猴耳环品种鉴定的PCR试剂盒，其包括所述的猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物。
优选，所述的PCR试剂盒，包含体积为10μL的多重PCR体系，包括1.0μL 10×缓冲液，200μM各dNTP，0.084μM所述的组合A中的各前向/后向引物或0.125μM所述的组合B、C、D、E、F或G中的各前向/后向引物，1U Taq DNA聚合酶，10ng模板DNA，余量为去离子水。
优选，所述的PCR试剂盒，所述的猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物的同一组合中的各前向引物5’端用不同的荧光物质FAM、HEX、ROX或TAM修饰。
本发明的第三个目的是提供一种猴耳环品种鉴定的方法，包括以下步骤：
a.提取待鉴定猴耳环植株的DNA；
b.以步骤a提取的猴耳环的DNA为模板，利用所述的猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物按不同组合分别进行多重PCR扩增，得到PCR产物；
c.对PCR产物进行检测和分型，与猴耳环SSR分子指纹进行比对，确定待鉴定猴耳环品种。
优选，所述的方法，所述的步骤b中的多重PCR扩增，体系为10μL，包括1.0μL 10×缓冲液，200μM各dNTP，0.084μM所述的组合A中的各前向/后向引物或0.125μM所述的组合B、C、D、E、F或G中的各前向/后向引物，1U Taq DNA聚合酶，10ng模板DNA，余量为去离子水。所述的步骤b中的多重PCR扩增，程序为：94℃ 4min；35个循环：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃50s；最后72℃ 5min。
优选，所述的猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物的同一组合中的各前向引物5’端用不同的荧光物质FAM、HEX、ROX或TAM修饰。
与单个标记进行独立PCR和检测相比，在确保检测准确性的前提下，本发明的多重实验技术体系具有经济性好、节约试剂和省时高效等优点。并且，因兼顾了同一组合的不同标记的扩增片段长度范围不同，还可采用普通非荧光引物、聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行检测，更加节省实验费用。该技术体系也为猴耳环和近缘种的群体多样性分析、种质资源遗传评价、品种和药材真实性鉴定等提供了简便可靠的方法。
本发明内容的优点在于构建了现有32个猴耳环品种(扦插无性系)的分子指纹，可有效用于甄别假冒和错乱的品种，具有准确可靠、有效快捷的优点，对保障良种培育人和营林种植者的权益提供了重要的技术支撑。
附图说明
图1是猴耳环7个三重或二重组合的15个SSR标记对品种AcC002的有效检测。
图2是基于15个SSR标记的猴耳环32个品种(扦插无性系，品种号AcC001～AcC032)及待检20个品种(品种号AcC033～AcC052，右上角*号标示)的遗传聚类图，其中待检的AcC045*与现有品种AcC011为同一无性系。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
(1)猴耳环15个SSR标记优化为7个组合的三重或二重检测技术体系
基于本实验室前期开发的456个SSR标记的引物序列，兼顾引物间互不干扰(相互不配对)、PCR扩增程序相同、扩增片段的长度范围不同和扩增产物浓度(检测的峰高)类似等因素，选择15个多态性信息量(polymorphic information content,PIC)高于0.5的高多态性标记优化为三重或二重检测的7个组合，同一组合的前向引物5’端用不同的荧光(FAM、HEX、ROX或TAM)修饰；具体7个组合(星号标示为引物修饰荧光)为：
标记组合A：ARCeSSR266(*HEX)、ARCeSSR141(*FAM)和ARCeSSR277(*ROX)；
标记组合B：ARCeSSR304(*TAM)和ARCeSSR665(*HEX)；
标记组合C：ARCeSSR425(*ROX)和ARCeSSR464(*FAM)；
标记组合D：ARCeSSR095(*FAM)和ARCeSSR006(*TAM)；
标记组合E：ARCeSSR075(*FAM)和ARCeSSR649(*TAM)；
标记组合F：ARCeSSR288(*HEX)和ARCeSSR366(*ROX)；
标记组合G：ARCeSSR474(*TAM)和ARCeSSR448(*ROX)。
表1列示了各组合的标记及其引物序列、引物修饰荧光和PIC等。
表1猴耳环SSR多重检测之7个组合15个标记的引物序列、修饰荧光和多态性信息量(PIC)
*PIC的估算基于18株无亲缘关系的单株。
多重PCR体系的组成和PCR扩增的程序包括：
(I)多重PCR体系的组成：体积10μL，包括1.0μL 10×缓冲液(100mM Tris-HClpH9.0,100mM KCl,80mM(NH4)2SO4,0.5％NP-40和20mM MgCl2),200μM各dNTP,0.084(三重)或0.125μM(二重)前向/后向引物,1U Taq DNA聚合酶，约10ng DNA。
(II)PCR扩增的程序：94℃ 4min；35个循环：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s；最后72℃ 5min。
利用遗传分析仪ABI 3130xl(美国Applied Biosystems)检测PCR产物，从而进行SSR标记的等位片段长度的判读，即标记分型。取PCR产物1.0μL加入9.34μL超纯甲酰胺和0.16μL GeneScanTM 500LIZ内标，95℃变性5min后迅速放在冰上冷却，上机检测，具体参照遗传分析仪的操作手册，等位片段的判读和数据收集的软件为GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems)。图1显示了7个三重或二重组合的15个SSR标记对品种AcC002的有效检测。
(2)猴耳环品种的SSR分子指纹
利用上述优化为7个多重实验组合的15个SSR标记引物对，对猴耳环32个品种(扦插无性系，品种号AcC001～AcC032)进行实验和检测。32个品种来自广东省花都扦插苗圃(23°24'12"N,113°13'06"E)。因猴耳环为二倍体，各标记上最多有2个目的片段长度(即2个等位片段)，从而获得一个品种在所有SSR标记上的片段长度的特有集合(表2)，即其分子指纹。这为品种鉴定和品种间遗传关系检测提供了有效的分子生物学手段。
猴耳环品种的SSR分子指纹的获得包括以下步骤：
(I)提取各品种的DNA。
采集各品种的嫩叶3g左右，可临时冷藏或长期冷冻保存。
采用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法进行叶样DNA提取。CTAB提取液包括：100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，l.4M NaCl，2％CTAB(w/v)，2％PVP(聚乙烯毗咯烷酮)，1％β-琉基乙醇(每次使用之前加入)。
DNA提取过程如下：取叶样0.3g左右，在液氮中研碎，再转至2mL离心管，加入1mLCTAB提取液，封口膜封口，60℃～65℃保温45～60min，10min摇动一次。取出样品管，在冷冻离心机上12000rpm离心10min，取上清液。加入等体积的氯仿(24)：异戊醇(1)，封口、摇匀，再冷冻离心机12000rpm离心10min，取上清液；如上清稍显混浊，可重复一次本操作。向上清液中加入冷藏的、2/3体积的异丙醇，轻轻晃动混匀，冷藏2小时或-20℃下1小时左右。样品管再12000rpm离心10min，弃上清液，加入1mL 70％、95％乙醇水溶液各洗一次沉淀(主要为DNA)，洗后轻轻倒出乙醇、保留沉淀DNA，将管倒置于卫生纸上吸干，真空浓缩仪中真空离心干燥5min左右。加入110μL 1×TE(成份包括10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH 8.0)，浸泡沉淀物5～10min，弹动或振荡以充分溶解DNA。稍离心，溶液转入1.5mL离心管中，再10000rpm离心5min，取上清液至另一1.5mL离心管。DNA溶液可-80℃长期保存。DNA浓度和纯度可通过琼脂糖凝胶电泳和/或分光光度计进行检测。
(II)利用上步所提的DNA为模板，基于前述的多重PCR体系的组成和PCR扩增的程序，进行实验和检测，获得PCR产物。
(III)基于前述的遗传分析仪ABI 3130xl检测PCR产物，获得各标记的等位片段长度。
(IV)获得32个品种(扦插无性系，品种号AcC001～AcC032)的SSR分子指纹，即所有15个SSR标记上的片段长度的特有集合，结果如表2所示。
(V)如需品种鉴定，通过比较待检品种与现有32个品种的分子指纹，确定是何品种或为另外品种。
表2猴耳环32个品种(扦插无性系)的SSR分子指纹
实施例2：基于SSR分子标记的猴耳环20个待检品种(扦插无性系)的鉴定
(1)猴耳环品种的DNA提取。20个待检品种仍来自广东省花都扦插苗圃(23°24'12"N,113°13'06"E)。采集各品种的嫩叶3g左右，可临时冷藏或长期冷冻保存。
采用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法进行叶样DNA提取。具体方法同实施例1中(2)步骤(I)。
(2)15个SSR分子标记的多重聚合酶链式反应(PCR)和检测。基于本发明优化的15个SSR分子标记分为7组的三重或二重的检测技术(标记分组及引物修饰荧光同实施例1中(1))，以步骤(1)提取的DNA为模板，进行PCR扩增。多重PCR扩增体系为10μL，多重PCR体系组成、PCR扩增程序和扩增产物检测方法同实施例1中(1)步骤(I)、(II)。
(3)猴耳环待检品种的SSR分子指纹。对于待检的20个猴耳环品种(扦插无性系)，各品种在所有SSR分子标记上的片段长度的集合即构成其分子指纹(表3)。
表3猴耳环20个待检品种(扦插无性系)的SSR分子指纹
/>
/>
*标示待检品种。
(4)猴耳环待检品种的鉴定。因品种间SSR分子指纹的直接对比较烦琐，经常通过聚类分析进行品种间的遗传关系的鉴定。结合猴耳环32个现有品种和20个待检品种在15个SSR标记上的分子指纹，利用软件NTSYS-pc 2.1(RohlfFJ.1998.NTSYS-pc.Numericaltaxonomy and multivariate analysis system,version 2.02.Exeter Software,NewYork)计算品种间的遗传相似性系数，并基于非加权组平均法(UPGMA)构建所有品种的遗传聚类图(图2)。从图2可见，20个待检品种中，AcC045*与现有品种AcC011相同，应为同一品种；其他19个品种均不同于现有32个品种、可视为新的品种。
序列表
<110> 中国林业科学研究院热带林业研究所
<120> 猴耳环品种鉴定的SSR多重检测引物、试剂盒及方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatcataat ggaatggagc a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctttctgg tggaaagttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaatggaat cagacccttg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgttcatgga gaatggcaaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgaggatct catcgggaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgtggctct ccatatttcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catcatgctg gaggtgagaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagcaaagag gccaacattt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgaggccat ctcttcaacc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttggcatggt ccttccttac 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccttaacaa catggatttg g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcaagcgtt ttgggtgagt 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aacctccatc ttcttcctct ct 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcagagttct gaggagctag ttt 23
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cacaattgag caaggaatgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggatacagc aggacaggaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
attggatgct gcaggaacag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccagtttcat ttggctccat 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgcgtggag ttgagtttg 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gggacacctt gagtgtactg c 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gccattctgt ccaagaaggt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttcatcttgg gaaggcaatc 20
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gagcgcgcag agacataca 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tagaaggaac acggggtttg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgaattctgc accaaaacga 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tagccgacct cacctagtgg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgcaatccat gtagccaatc 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgcacatcat cctattctgg a 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
attgatgcaa gctgggagag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gagctggttt tcgattgagc 20
Claims (4)
1.一种猴耳环品种鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.提取待鉴定猴耳环植株的DNA；
b.以步骤a提取的猴耳环的DNA为模板，利用SSR多重检测引物按组合A、B、C、D、E、F、G分别进行多重PCR扩增，得到PCR产物；
c.对PCR产物进行检测和分型，与猴耳环SSR分子指纹进行比对，确定待鉴定猴耳环品种；
所述的SSR多重检测引物的组合A、B、C、D、E、F、G分别如下所示：
组合A：ARCeSSR266、ARCeSSR141和ARCeSSR277的引物对；
组合B：ARCeSSR304和ARCeSSR665的引物对；
组合C：ARCeSSR425和ARCeSSR464的引物对；
组合D：ARCeSSR095和ARCeSSR006的引物对；
组合E：ARCeSSR075和ARCeSSR649的引物对；
组合F：ARCeSSR288和ARCeSSR366的引物对；
组合G：ARCeSSR474和ARCeSSR448的引物对；
所述的ARCeSSR266的引物对的前向引物如SEQ ID NO.1所示，后向引物如SEQ ID NO.2所示；
所述的ARCeSSR141的引物对的前向引物如SEQ ID NO.3所示，后向引物如SEQ ID NO.4所示；
所述的ARCeSSR277的引物对的前向引物如SEQ ID NO.5所示，后向引物如SEQ ID NO.6所示；
所述的ARCeSSR304的引物对的前向引物如SEQ ID NO.7所示，后向引物如SEQ ID NO.8所示；
所述的ARCeSSR665的引物对的前向引物如SEQ ID NO.9所示，后向引物如SEQ IDNO.10所示；
所述的ARCeSSR425的引物对的前向引物如SEQ ID NO.11所示，后向引物如SEQ IDNO.12所示；
所述的ARCeSSR464的引物对的前向引物如SEQ ID NO.13所示，后向引物如SEQ IDNO.14所示；
所述的ARCeSSR095的引物对的前向引物如SEQ ID NO.15所示，后向引物如SEQ IDNO.16所示；
所述的ARCeSSR006的引物对的前向引物如SEQ ID NO.17所示，后向引物如SEQ IDNO.18所示；
所述的ARCeSSR075的引物对的前向引物如SEQ ID NO.19所示，后向引物如SEQ IDNO.20所示；
所述的ARCeSSR649的引物对的前向引物如SEQ ID NO.21所示，后向引物如SEQ IDNO.22所示；
所述的ARCeSSR288的引物对的前向引物如SEQ ID NO.23所示，后向引物如SEQ IDNO.24所示；
所述的ARCeSSR366的引物对的前向引物如SEQ ID NO.25所示，后向引物如SEQ IDNO.26所示；
所述的ARCeSSR474的引物对的前向引物如SEQ ID NO.27所示，后向引物如SEQ IDNO.28所示；
所述的ARCeSSR448的引物对的前向引物如SEQ ID NO.29所示，后向引物如SEQ IDNO.30所示；
所述的步骤b中的多重PCR扩增，体系为10μL，包括1.0μL 10×缓冲液，200μM各dNTP，0.084μM SSR多重检测引物的组合A中的各前向/后向引物或0.125μM SSR多重检测引物的组合B、C、D、E、F或G中的各前向/后向引物，1U Taq DNA聚合酶，10ng模板DNA，余量为去离子水；
所述的步骤b中的多重PCR扩增，程序为：94℃4min；35个循环：94℃30s，58℃30s，72℃50s；最后72℃5min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的SSR多重检测引物的同一组合中的各前向引物5’端用不同的荧光物质FAM、HEX、ROX或TAM修饰。
3.一种用于猴耳环品种鉴定的PCR试剂盒，其特征在于，包含体积为10μL的多重PCR体系，包括1.0μL 10×缓冲液，200μM各dNTP，0.084μM SSR多重检测引物的组合A中的各前向/后向引物或0.125μM SSR多重检测引物的组合B、C、D、E、F或G中的各前向/后向引物，1U TaqDNA聚合酶，10ng模板DNA，余量为去离子水；
所述的SSR多重检测引物的组合A、B、C、D、E、F、G如下所示：
组合A：ARCeSSR266、ARCeSSR141和ARCeSSR277的引物对；
组合B：ARCeSSR304和ARCeSSR665的引物对；
组合C：ARCeSSR425和ARCeSSR464的引物对；
组合D：ARCeSSR095和ARCeSSR006的引物对；
组合E：ARCeSSR075和ARCeSSR649的引物对；
组合F：ARCeSSR288和ARCeSSR366的引物对；
组合G：ARCeSSR474和ARCeSSR448的引物对；
所述的ARCeSSR266的引物对的前向引物如SEQ ID NO.1所示，后向引物如SEQ ID NO.2所示；
所述的ARCeSSR141的引物对的前向引物如SEQ ID NO.3所示，后向引物如SEQ ID NO.4所示；
所述的ARCeSSR277的引物对的前向引物如SEQ ID NO.5所示，后向引物如SEQ ID NO.6所示；
所述的ARCeSSR304的引物对的前向引物如SEQ ID NO.7所示，后向引物如SEQ ID NO.8所示；
所述的ARCeSSR665的引物对的前向引物如SEQ ID NO.9所示，后向引物如SEQ IDNO.10所示；
所述的ARCeSSR425的引物对的前向引物如SEQ ID NO.11所示，后向引物如SEQ IDNO.12所示；
所述的ARCeSSR464的引物对的前向引物如SEQ ID NO.13所示，后向引物如SEQ IDNO.14所示；
所述的ARCeSSR095的引物对的前向引物如SEQ ID NO.15所示，后向引物如SEQ IDNO.16所示；
所述的ARCeSSR006的引物对的前向引物如SEQ ID NO.17所示，后向引物如SEQ IDNO.18所示；
所述的ARCeSSR075的引物对的前向引物如SEQ ID NO.19所示，后向引物如SEQ IDNO.20所示；
所述的ARCeSSR649的引物对的前向引物如SEQ ID NO.21所示，后向引物如SEQ IDNO.22所示；
所述的ARCeSSR288的引物对的前向引物如SEQ ID NO.23所示，后向引物如SEQ IDNO.24所示；
所述的ARCeSSR366的引物对的前向引物如SEQ ID NO.25所示，后向引物如SEQ IDNO.26所示；
所述的ARCeSSR474的引物对的前向引物如SEQ ID NO.27所示，后向引物如SEQ IDNO.28所示；
所述的ARCeSSR448的引物对的前向引物如SEQ ID NO.29所示，后向引物如SEQ IDNO.30所示。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述的SSR多重检测引物的同一组合中的各前向引物5’端用不同的荧光物质FAM、HEX、ROX或TAM修饰。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Transcriptome‑derived microsatellite markers for population diversity analysis in Archidendron clypearia (Jack) I.C. Nielsen;Dandan Li;Molecular Biology Reports;第第48卷卷;第8255-8260页 * |
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