CN112941206A - 一种可视化的鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种可视化的鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可视化的鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及检测方法，该引物包括：FIP：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；BIP：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；F3：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；B3：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；本发明设计的用于可视化鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡的引物，可以特异性PCR扩增丝羽乌骨鸡基因组DNA，而不能扩增黑凤鸡的基因组DNA，可以用于鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体，反应完成后，若反应体系为天蓝色，则待测鸡种为丝羽乌骨鸡，若为淡紫色，则为黑凤鸡，该方法可以100％准确的判断丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体。

Description

一种可视化的鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物、试剂盒 及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种可视化的鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
丝羽乌骨鸡是江西省泰和县特产，原产于泰和县武山北麓，根据产地又称武山鸡，因具有“丛冠、缨头、绿耳、胡须、丝毛、毛脚、五爪、乌皮、乌肉、乌骨”十大特征以及高营养价值和药用价值而闻名。丝羽乌骨鸡是著名的饮食药用鸡，全身均可入药，骨、肉及内脏均有药用价值，可以配成多种成药和方剂。
但是原种丝羽乌骨鸡，长速慢、产蛋量低，于是商业育种公司以丝羽乌骨鸡以及快长类品种为育种素材，培育了黑凤鸡。黑凤鸡又称黑乌凤鸡、黑丝毛乌鸡，其具有与丝羽乌骨鸡完全相同的十全性状，黑凤鸡屠体与丝羽乌骨鸡屠体外观并无两样，消费者无法区分。基于此，常常有不良商家以屠宰后的快长型黑凤鸡假冒优质的丝羽乌骨鸡。
目前尚没有鉴定丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的有效办法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可视化的鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡的引物、试剂盒及检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明可准确鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于可视化鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物，包括：
FIP：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
BIP：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
F3：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
B3：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供一种包含上述的引物的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括：荧光目视检测试剂和羟基萘酚蓝。
进一步地，所述荧光目视检测试剂为羟基萘酚蓝。
本发明还提供一种上述的引物或上述的试剂盒在鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体中的应用。
本发明还提供所述的引物或上述的试剂盒在鉴别丝羽乌骨鸡中的应用。
本发明还提供一种用于鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡种的基因组DNA；
(2)采用上述的引物对所述基因组DNA进行PCR扩增，并在所述 PCR扩增体系中加入荧光目视检测试剂和羟基萘酚蓝；
(3)恒温扩增；
(4)观察PCR扩增体系的颜色，自然光下，颜色为天蓝色，则判定为丝羽乌骨鸡，颜色为淡紫色，则判定为黑凤鸡。
进一步地，所述恒温扩增的温度为64℃，时间为60min。
进一步地，所述PCR扩增体系为：2×反应缓冲液12.5μL，FIP 1μL，BIP 1μL，F3 1μL，B3 1μL，荧光目视检测试剂1μL，BstDNA聚合酶1μL，羟基萘酚蓝1μL，模板DNA 2μL，去离子水补充至25μL。
本发明公开了以下技术效果：
本发明设计的用于可视化鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡的引物，可以特异性PCR扩增丝羽乌骨鸡基因组DNA，而不能扩增黑凤鸡的基因组DNA，可以用于鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体，反应完成后，若反应体系为天蓝色，则待测鸡种为丝羽乌骨鸡，若为淡紫色，则非丝羽乌骨鸡，该方法可以100％准确的判断丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体，可用于市场上丝羽乌骨鸡和黑凤鸡的鉴别，打击以次充好的不良商家，并且该方法操作简单、易于现场操作、便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景。此外，基于本发明方法开发的试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1PCR扩增反应体系结果示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1验证丝羽乌骨鸡与黑凤鸡基因组差异
步骤1：模板准备
(1)组织采集：采集24只丝羽乌骨鸡和24只黑凤鸡皮肤样本。
(2)DNA模板准备：采集50mg左右皮肤样本，放入有500μL液氮的离心管中，用组织研磨器将被采集的样品磨碎。待液氮蒸干后，加入200 微升TE，1200rpm/min离心，抽取上清备用。
步骤2：PCR扩增
(1)PCR扩增反应体系
PCR扩增引物如表1所示：
表1 PCR扩增引物
Figure BDA0003010729730000051
PCR反应体系如表2所示：
表2 PCR扩增体系
试剂 体积(ul)
2×反应缓冲液 12.5
FIP(引物) 1
BIP(引物) 1
F3(引物) 1
B3(引物) 1
BstDNA聚合酶 1
羟基萘酚蓝(HNB) 1
模板DNA 2
去离子水 x
合计 25ul
(2)恒温扩增：将配置好的反应体系放置于恒温板中，64℃反应60min。
(3)结果判定：如图1所示，左边4个为黑凤鸡，右边4个为丝羽乌骨鸡，自然光下，丝羽乌骨鸡的PCR产物反应体系呈天蓝色，黑凤鸡则为淡紫色。
上述结果表明，通过该方法可准确的将丝羽乌骨鸡和黑凤鸡区分开来。
实施例2单盲检测判断方法的可靠性
本实施例采用单盲的方式，对已知品种的样本，根据分子检测结果再次判定其品种来源。
步骤1：模板准备
(1)组织采集：采集12只丝羽乌骨鸡和12只黑凤鸡皮肤样本。
(2)DNA模板准备：采集50mg左右皮肤样本，放入有500μL液氮的离心管中，用组织研磨器将被采集的样品磨碎。待液氮蒸干后，加入200 微升TE，1200rpm/min离心，抽取上清备用。
步骤2：PCR扩增
(1)PCR扩增反应体系
PCR扩增引物如表3所示：
表3 PCR扩增引物
Figure BDA0003010729730000061
PCR反应体系如表4所示：
表4 PCR扩增体系
试剂 体积(ul)
2×反应缓冲液 12.5
FIP(引物) 1
BIP(引物) 1
F3(引物) 1
B3(引物) 1
BstDNA聚合酶 1
羟基萘酚蓝(HNB) 1
模板DNA 2
去离子水 x
合计 25ul
(2)恒温扩增：将配置好的反应体系放置于恒温板中，64℃反应60min。
(3)结果判定：根据PCR产物颜色判定品种来源。自然光下，将PCR 产物为天蓝色的个体判定为丝羽乌骨鸡(SK)，紫色判定为黑凤鸡(HF)，判定结果如表5所示，说明本发明方法可以100％准确鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡。
表5分子检测鉴定黑凤鸡与丝羽乌骨鸡
编号 已知品种 检测结果 编号 品种 检测结果
1 黑凤鸡 HF 13 丝羽乌骨鸡 SK
2 丝羽乌骨鸡 SK 14 黑凤鸡 HF
3 黑凤鸡 HF 15 黑凤鸡 HF
4 丝羽乌骨鸡 SK 16 丝羽乌骨鸡 SK
5 丝羽乌骨鸡 SK 17 黑凤鸡 HF
6 丝羽乌骨鸡 SK 18 丝羽乌骨鸡 SK
7 黑凤鸡 HF 19 丝羽乌骨鸡 SK
8 黑凤鸡 HF 20 黑凤鸡 HF
9 丝羽乌骨鸡 SK 21 黑凤鸡 HF
10 黑凤鸡 HF 22 丝羽乌骨鸡 SK
11 丝羽乌骨鸡 SK 23 黑凤鸡 HF
12 黑凤鸡 HF 24 丝羽乌骨鸡 SK
注：“HF”表示黑凤鸡，“SK”表示丝羽乌骨鸡。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 南昌师范学院
<120> 一种可视化的鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物、试剂盒及检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagccagagg caacttgaat agtatgagca tatggaatgt cttg 44
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acacaatctg tatacactgg tactgagaaa ggagaaaaac agaggt 46
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttccttatc tagtagccac c 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctggaaaga accaagtgc 19

Claims (9)

1.一种可视化的鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的引物，其特征在于，包括：
FIP：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
BIP：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
F3：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
B3：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.包含权利要求1所述的引物的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：荧光目视检测试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光目视检测试剂为羟基萘酚蓝。
5.一种权利要求1所述的引物或权利要求2-4任一项所述的试剂盒在鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体中的应用。
6.一种权利要求1所述的引物或权利要求2-4任一项所述的试剂盒在鉴别丝羽乌骨鸡中的应用。
7.一种用于鉴别丝羽乌骨鸡和黑凤鸡屠体的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡种的基因组DNA；
(2)采用权利要求1所述的引物对所述基因组DNA进行PCR扩增，并在所述PCR扩增体系中加入荧光目视检测试剂；
(3)恒温扩增；
(4)观察PCR扩增体系的颜色，自然光下，颜色为天蓝色，则判定为丝羽乌骨鸡，颜色为淡紫色，则判定为黑凤鸡。
8.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于，所述恒温扩增的温度为64℃，时间为60min。
9.根据权利要求7所述的鉴别方法，其特征在于，所述PCR扩增体系为：2×反应缓冲液12.5μL，FIP 1μL，BIP 1μL，F3 1μL，B3 1μL，荧光目视检测试剂1μL，BstDNA聚合酶1μL，羟基萘酚蓝1μL，模板DNA 2μL，去离子水补充至25μL。
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