CN109880893A

CN109880893A - 用于丝尾鱯性别鉴定的特异性dna片段及应用

Info

Publication number: CN109880893A
Application number: CN201910293424.4A
Authority: CN
Inventors: 王忠卫; 周于琳; 桂建芳; 周莉
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2019-06-14
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: CN109880893B

Abstract

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段及应用，本发明在结合低覆盖度全基因组测序技术和2b‑RAD‑seq技术的基础上，并利用基因组步移技术，开发了丝尾鱯雄性性别特异性标记，所述的特异性DNA片段为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.1所示，针对该特异性序列，可以利用常规PCR扩增对丝尾鱯的性别进行鉴定，经验证准确率达100%。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点，为丝尾鱯性控育种、野生资源保护和养殖产业的发展提供帮助。

Description

用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段及应用

技术领域

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段及应用。

背景技术

丝尾鱯(Hemibagrus wyckioides)是一种亚广盐性底栖鱼类，仅分布于我国澜沧江水系及下游的湄公河流域，因其尾鳍上叶延长成丝状而得名(褚新洛等,1990)。丝尾鱯其适应性强，易繁殖，抗病力强并且肉质鲜美，营养价值高，是非常值得开发和推广的名优养殖新品种，是云南最名贵的野生鱼类之一。但由于过度捕捞及澜沧江干支流水电站建设等原因，导致野生资源越来越少，因此需要对其野生资源进行保护。同时，丝尾鱯与许多经济鱼类一样，雌雄个体间存在着显著的生长差异，雄性个体的生长速度快于雌性个体，全雄鱼的培育对丝尾鱯的产业发展具有重要的意义。但是，丝尾鱯的亲本性成熟时间较长，长达3-5年，且在性成熟前雌雄个体之间没有明显的第二性征，在其发育早期无法从形态上辨别雌雄。传统的丝尾鱯性别鉴定一般采用进行生殖突的初步观察，再对雌鱼进行人工挤卵验证，雄鱼进行解剖观察性腺的方法判定，此方法对雄鱼早期鉴定的准确性有一定误差，也会造成亲本的浪费，进而影响了丝尾鱯品种选育、人工繁育以及野生资源的保护。因此急需开发性别精准鉴定技术，加速新品种选育技术，培育全雄丝尾鳠群体。DNA分子标记已成为鉴别鱼类性别的重要分子工具，尽管利用AFLP、微卫星和RAPD等传统的分子标记开发技术，在部分鱼类中已经成功开发出性别特异的分子标记(Bello&Sánchez,1999；Shan et al,2015；Pan e t al,2015)，但是由于其遗传信息资源有限，在很多鱼类中无法检测到性别特异的DNA分子标记(Gao et al,2010；Sriphairoj et al,2007；Yarmohammadi et al,2011)。因此需要能够提供在基因组水平上更准确和快速的检测技术来鉴定丝尾鳠性别特异性标记。近年来，随着高通量测序技术的发展，测序技术作为一种高效且精确的手段被应用于分子标记的开发。为了得到高质量的丝尾鱯DNA性别特异分子标记，本发明在结合低覆盖度全基因组测序技术(genome survey)和2b-Restriction-Site Associated DNA sequencing(2b-RAD-seq)技术的基础上，并利用基因组步移技术，开发了丝尾鱯雄性性别特异性标记。

发明内容

本发明的目的在于提供了用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段，所述的DNA片段分别为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段的组合物，所述的组合物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列。

本发明还有一个目的在于提供了针对SEQ ID NO.2所示序列设计的引物。

本发明还有一个目的在于提供了针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列设计的引物组合物。

本发明的最后一个目的在于提供了丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段的应用，该特异性DNA解决了丝尾鳠早期性别鉴定的难题，开展丝尾鳠性控育种，加快丝尾鳠选育进程，促进丝尾鳠养殖产业的发展。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段，所述的DNA片段分别为SEQ ID NO.2所示。

用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段的组合物，所述的组合物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列。

针对SEQ ID NO.2所示序列设计的引物，优选的，所述的引物为F:CACACAGACACAAGCTAATCCTACATTCAC和R:GGTTGCGTGTTGAAATCCCAGCTC。

本发明还有一个目的在于提供了针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列设计的引物组合物，优选的，所述的引物组合物为：F:GCTGTGTATTTACTTACCGTTAACGGG、R:TGCTGCCGGGGACCATCCCGA、F:CACACAGACACAAGCTAATCCTACATTCAC和R:GGTTGCGTGTTGAAATCCCAGCTC。

丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段的应用，包括利用本领域的常规方式，对待测样本的DNA进行检测，是否含有SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示序列；

以上所述的应用中，其保护范围还包括针对SEQ ID NO.2序列设计的引物或针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列设计的引物组合物在丝尾鱯性别鉴定中的应用。

以上所述的检测的方法包括但不限于目前已有的基因组测序，PCR的方法。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明提供的性别特异性DNA分子标记，可以利用常规PCR扩增对丝尾鱯的性别进行鉴定，经验证准确率达100％。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点，为丝尾鱯性控育种、野生资源保护和养殖产业的发展提供帮助。

附图说明：

图1为丝尾鱯雄性性别特异性DNA片段MWMSM1在遗传性别鉴定的结果示意图。

图中个体编号1-9为雌性个体均无法扩增出条带，个体编号10-18为雄性个体都能扩增出146bp特异条带，M表示DL2000DNA marker。

图2为丝尾鱯雄性性别特异性DNA片段MWMSM2在遗传性别鉴定的结果示意图。

图中个体编号1-9为雌性个体均无法扩增出条带，个体编号10-18为雄性个体都能扩增出307p特异条带，M表示DL2000DNA marker。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA标签片段MWMSM1，MWMSM2的获得：

在繁殖季节通过人工挤卵和解剖观察性腺的方式鉴定出丝尾鱯雄鱼和雌鱼各10尾，剪取尾鳍并提取其全基因组DNA，用BsaXI和SapI两种酶对目的基因组进行酶切，构建测序文库，Illumina测序平台上机进行2b-RAD测序，并选取其中一条雄鱼进行全基因组survey测序获得参考序列。通过对雌雄个体的标签序列进行比较基因组学方法分析，获得性别特异性DNA片段标签序列，并根据标签序列在基因组survey中的位置在两端设计相应的引物进行群体有效性验证，最终获得了雄性特异性DNA标签序列MWMSM1(SEQ ID NO.1所示)，MWMSM2(SEQ ID NO.2所示)，通过GenBank数据库对比未发现同源序列。

实施例2：

丝尾鱯雄性特异DNA标签MWMSM1，MWMSM2的使用方法：

1)针对丝尾鱯雄性特异DNA标签序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示序列设计引物为：

MWMSM1，F:GCTGTGTATTTACTTACCGTTAACGGG和R:TGCTGCCGGGGACCATCCCGA.

MWMSM2,F:CACACAGACACAAGCTAATCCTACATTCAC和R:GGTTGCGTGTTGAAATCCCAGCTC。

2)PCR扩增：

反应体系为模板DNA约50ng；2×Es Taq MasterMix聚合酶12.5μl；ddH₂O为9.5μl；上下游引物浓度稀释为10μM并各加入1μl；模板加入1μl，最终体系为25μl。

所有引物的PCR反应条件均为95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸25s，35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。

PCR扩增结束后，配制2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增出特异性条带为雄性个体，扩增不出特异性条带为雌性个体，所述的MWMSM1和MWMSM2片段，单独使用或联合使用均能达到相同的鉴定效果。

实施例3：

雄性特异性DNA标签MWMSM1和/或MWMSM2在丝尾鱯群体性别鉴定中的应用：

1)收集已知性别的丝尾鱯个体雌雄各9尾，采集鳍条组织样本保存于无水乙醇中，利用DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，稀释至50ng/μL保存于-20℃备用；采集的样品包括野生样品。

2)利用实施例2的方法对上述丝尾鱯DNA样本进行PCR扩增；

3)扩增结果如下所示：

图1为丝尾鱯雄性性别特异性DNA片段MWMSM1在丝尾鱯群体遗传性别鉴定的结果示意图。图中个体编号1-9为雌性个体均无法扩增出条带，个体编号10-18为雄性个体都能扩增出146bp特异条带，M表示DL2000DNA marker。

图2为丝尾鱯雄性性别特异性DNA片段MWMSM2在丝尾鱯群体遗传性别鉴定的结果示意图。图中个体编号1-9为雌性个体均无法扩增出条带，个体编号10-18为雄性个体都能扩增出307bp特异条带，M表示DL2000DNA marker。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctgtgtatt tacttaccgt taacgggcag tctgcacagc cctttccccc tccttcccca 60

cagactgtag ctcctgcgtg cgttaaagcg cttaaaaata cagaaagtgc tgtgtattta 120

cttaatgctg ccggggacca tcccga 146

<210> 2

<211> 307

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacacagaca caagctaatc ctacattcac attgagtttg aagtttctaa tgttgcttag 60

ttagtcttct tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgagcaacta ctactactgt tgattgtggg 120

agtttttacc cagaaacagt agtaaccaaa tttatgcttc taaaacaagt taacataaca 180

agctaacaac ttaaataagc atttaatcaa cattaaacta gacttacaat ttatctcatt 240

ttatgtggag atgtggttgc tcagtggttt ttactgatcg gaaggttgcg tgttgaaatc 300

ccagctc 307

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgtgtatt tacttaccgt taacggg 27

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgctgccggg gaccatcccg a 21

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacacagaca caagctaatc ctacattcac 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacacagaca caagctaatc ctacattcac 30

Claims

1.用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段，所述的DNA片段分别为SEQ ID NO.2所示。

2.用于丝尾鱯性别鉴定的特异性DNA片段的组合物，所述的组合物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列。

3.针对SEQ ID NO.2所示序列设计的引物。

4.根据权利要求3所述的引物，所述的引物为F: CACACAGACACAAGCTAATCCTACATTCAC和R: GGTTGCGTGTTGAAATCCCAGCTC。

5.针对权利要求2所述DNA片段组合物设计的引物组合物，所述的引物组合物为：F:GCTGTGTATTTACTTACCGTTAACGGG、R: TGCTGCCGGGGACCATCCCGA 、F:CACACAGACACAAGCTAATCCTACATTCAC和R: GGTTGCGTGTTGAAATCCCAGCTC。

6.权利要求1所述的DNA片段或权利要求3所述的引物在丝尾鱯性别鉴定中的应用。

7.权利要求2所述的DNA片段组合物或权利要求4所述的引物组合物在丝尾鱯性别鉴定中的应用。