CN111154852B

CN111154852B - 大刺鳅性别鉴定的特异性dna片段及应用

Info

Publication number: CN111154852B
Application number: CN202010057366.8A
Authority: CN
Inventors: 王忠卫; 薛凌展; 郭新粉; 樊海平; 桂建芳
Original assignee: FRESHWATER FISHERIES RESEARCH INSTITUTE OF FUJIAN PROVINCE; Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: FRESHWATER FISHERIES RESEARCH INSTITUTE OF FUJIAN PROVINCE; Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111154852A

Abstract

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段及应用，本发明在2b‑RAD‑seq技术的基础上，并利用基因组步移技术，开发了大刺鳅雄性性别特异性标记，所述的特异性DNA片段为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，针对该特异性序列，可以利用常规PCR扩增和普通琼脂糖电泳对大刺鳅的性别进行鉴定，经验证准确率达100%。与之前解剖检测或生殖突观察相比，该技术具有准确、简单、快速，对鱼体伤害少等优点，为大刺鳅性控育种、野生资源保护和养殖产业的发展提供帮助。

Description

大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段及应用

技术领域

本发明属于水产养殖领域中的鱼类性别鉴定领域，具体涉及大刺鳅性别鉴定的特异性D NA片段及应用。

背景技术

大刺鳅(Mastacembelus armatus)俗称辣锥、石锥等，在分类上隶属于鲈形目刺鳅科刺鳅属，主要分布在热带和亚热带溪流和河流中(Cakmak and Alp,2010)，在我国则主要分布于广东省、广西壮族自治区、云南省、海南省和福建省(成庆泰和郑葆珊，1987)。大刺鳅肉质鲜美，营养价值高，市场需求旺盛，是一种非常受欢迎的食用鱼(Li and Xu et al.,2016)，具有重要的经济价值。大刺鳅为雌雄异体鱼类，同龄个体间雄性个体一般比雌性个体的体重大将近2倍，所以全雄大刺鳅的培育对大刺鳅的产业发展具有重要的意义。但是该物种亲本性成熟时间为2-3年，在性成熟前雌雄个体之间没有明显的第二性征，在其发育早期无法从形态上辨别雌雄，人工挤卵和性腺解剖观察的方法雄鱼早期鉴定的准确性有一定误差，这直接影响人工繁殖和选育等工作的开展。性别特异性DNA标记是进行性别判断的重要工具，可通过特异引物设计、PCR和琼脂糖电泳进行个体的性别，因此基于性别特异DNA标记建立的大刺鳅性别鉴定的方法将有助于在商业生产中开展性别控制育种技术研究，并最终生产出全雄大刺鳅。

针对上述问题，为了得到高质量的大刺鳅DNA性别特异分子标记，本发明在2b-Restri ction-Site Associated DNA sequencing(2b-RAD-seq)技术的基础上，利用基因组步移技术，并通过性别特异序列的比较，开发了大刺鳅雄性性别特异性标记。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段，所述的特异性DN A片段为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物。

本发明的另一个目的在于提供了大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段组合，包括SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示片段。

本发明还有一个目的在于提供了SEQ ID NO.1所示或针对其设计的引物的应用。

本发明的最后一个目的在于提供了大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段组合或针对该组合设计的引物的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段，所述的DNA片段分别为SEQ ID NO.1所示。

大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段组合，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示DNA片段。

针对SEQ ID NO.1所示序列设计的检测引物也属于本发明的保护内容。

针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示DNA片段设计的检测引物也属于本发明的保护内容。

以上所述的引物优选的，针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物为：MAMSM1-F:CTACACAGGCAATACTTGGCAAATGAATAC和MAMSM1-R:ATCAGTCATCTGTGCCTGGGATATATG。

针对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示DNA片段设计的检测引物组为：MAMSM1-F:CTACACAGGCAATACTTGGCAAATGAATAC和MAMSM1-R:ATCAGTCATCTGTGCCTGGGATATATG；和MAMSM2-F:CTAGAGGAATTGAACTCAGGTGTGATAAAC和MAMSM2-R:AGAGATATGGAGATAAAGACTGTTACTGGC。

大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段的应用，包括利用本领域的常规方式，对待测样本的DNA进行检测，是否含有SEQ ID NO.1或/和SEQ ID NO.2所示序列；

以上所述的检测的方法包括但不限于目前已有的基因组测序，PCR的方法。

以上所述的PCR方法，包括针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物；或针对SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示序列设计的引物组，进行PCR扩增进行鉴定。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明提供的性别特异性DNA分子标记，可以利用常规PCR扩增和琼脂糖电泳对大刺鳅的遗传性别进行鉴定，经验证准确率达100％。与之前的方法相比，该技术准确、简单、快速，对鱼体伤害少等，为大刺鳅性别控育种、野生资源保护和养殖产业的发展提供帮助。

该特异性DNA解决了大刺鳅早期性别鉴定的难题，开展大刺鳅性控育种，加快大刺鳅选育进程，促进大刺鳅养殖产业的发展。

附图说明

图1为大刺鳅雄性特异引物对MAMSM1-F和MAMSM1-R在遗传性别鉴定的结果示意图；

图中个体编号1-9为雌性个体均无法扩增出条带，个体编号10-18雄性个体都能扩增出431bp特异条带，M表示DL2000 DNA marker。

图2为大刺鳅雄性特异引物对MAMSM2-和MAMSM2-R在遗传性别鉴定的结果示意图。

图中个体编号1-9为雌性个体均无法扩增出条带，个体编号10-18雄性个体都能扩增出746bp特异条带，M表示DL2000 DNA marker。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

大刺鳅性别鉴定的特异性DNA标签片段MAMSM1和MAMSM2的获得：

用解剖观察性腺的方式鉴定出大刺鳅雄鱼和雌鱼各15尾，剪取尾鳍并提取其全基因组DNA，用Bsa XI限制性内切酶对目的基因组进行酶切，构建测序文库，Illumina测序平台上机进行2b-RAD测序，以公布的大刺鳅基因组电子酶切序列为参考序列。通过对雌雄个体的标签序列进行比较基因组学方法分析，获得性别特异性DNA片段标签序列，并根据标签序列在基因组中的位置设计相应的引物进行基因组步移，最终获得了雄性特异DNA标签序列MAMSM1(SEQ ID NO.1所示)和MAMSM2(SEQ ID NO.2所示)，通过GenBank数据库对比未发现同源序列。

实施例2：

大刺鳅雄性特异DNA标签MAMSM1和MAMSM2的使用方法：

1)针对大刺鳅雄性特异DNA标签序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2设计引物分别为：

MAMSM1-F:CTACACAGGCAATACTTGGCAAATGAATAC和MAMSM1-R:ATCAGTCATCTGTGCCTGGGATATATG；

MAMSM2-F:CTAGAGGAATTGAACTCAGGTGTGATAAAC和MAMSM2-R:AGAGATATGGAGATAAAGACTGTTACTGGC。

2)提取基因组：

剪取大刺鳅的鳍条，利用DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对所提DNA进行质量检测，用灭菌ddH₂O稀释至50ng/μL保存于-20℃备用。

3)PCR扩增：

反应体系为模板DNA约50ng；2×Es Taq Master Mix聚合酶12.5μl；ddH₂O为9.5μl；上下游引物浓度稀释为10μM并各加入1μl；模板加入1μl，最终体系为25μl。

所有引物的PCR反应条件均为95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸25s，35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。

PCR扩增结束后，配制1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增出特异性条带为雄性个体，扩增不出特异性条带为雌性个体。

其中针对MAMSM1设计的引物在雄性个体中可扩增出431bp特异条带，雌性个体中无扩增条带；

针对MAMSM2设计的引物在雄性个体中可扩增出746bp特异条带，雌性个体中无扩增条带。

实施例3：

雄性特异性DNA标签MAMSM1或/和MAMSM2在大刺鳅群体性别鉴定中的应用：

1)再收集已知性别的大刺鳅个体雌雄各18尾，采集鳍条组织样本保存于无水乙醇中，利用DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，稀释至50ng/μL保存于-20℃备用。

2)利用实施例2的方法对上述大刺鳅DNA样本进行PCR扩增；

3)扩增结果如下所示：

图1为针对大刺鳅雄性特异性DNA片段MAMSM1设计的引物(MAMSM1-F和MAMSM1-R)遗传性别鉴定的结果示意图；图中雌性个体(个体编号10-18，37-45)均无法扩增出条带，雄性个体(个体编号：28-36,46-54)都能扩增出431bp特异条带，M表示DL2000DNA marker。

图2为针对大刺鳅雄性特异性DNA片段MAMSM2设计的引物(MAMSM2-F和MAMSM2-R)在遗传性别鉴定的结果示意图。图中雌性个体(个体编号10-18，37-45)均无法扩增出条带，雄性个体(个体编号：28-36,46-54)都能扩增出746bp特异条带，M表示DL 2000DNA marker。

无论是单独使用DNA片段MAMSM1、MAMSM2或是联合使用，其大刺鳅在性别鉴定中的准确率均为100％。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

福建省淡水水产研究所

<120> 大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctacacaggc aatacttggc aaatgaatac attaattcct ggatttggtc ttttcataat 60

ttcttcccaa ttcaaagaaa atgaatatga atgtcaaaca aaggcatttc tatatctgtg 120

tacatgaaat agccatactg tgtagaaaca cctacactcc tcatagactt agccagcaaa 180

tactatgaga aagtttttta aactaccaaa tgaattgaat gacaataaaa gtatatattt 240

tcagacttga aaacttgaaa cttttcagac ttgagacaga tgacttgata tatatatata 300

atacaatatg tgctttatat atatatatat atatatatat gtattgtgtg tatatatata 360

tacatacaat acaaataaat ataagacaaa ggcggttaca actacatata tcccaggcac 420

agatgactga t 431

<210> 2

<211> 746

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagaggaat tgaactcagg tgtgataaac aacagttaag ttatgtttta acaggggggg 60

caaacacttt ttcacacagg gccatgaagt tttggatttt gtttacactt actaaaaacc 120

ttcatttaaa cactgcatgg tgtgtttact tgtgttatct ttgactaata tttaaatttg 180

tttgatgatc tgaaacatta aagtgtgacc aacatgcaaa aaaataagaa atcaggaagg 240

ggtcaacact ttttcacact actgtttttg aactcatgca ggatttttgt cccggtgcag 300

tttgtcaaca agcatattca tctaaccttt catggcttcc aggttgaacc tgctgtggtc 360

agttccctgt ctcttgctca aatccccaaa ctattgacta tcccttatac agtccagtgc 420

tttgtggagg tttgttgtaa atgtagaggt ctgctgcatc ttattgactg agggctcaca 480

ggacagagct gggatctctc ttgaatcctt tcattatttt caacttccac cagtggcacc 540

atgctttgtt gatggagtac tttagacaca ttaatgacag gcccctgcgt gatatatcct 600

gaatcatgga ctgccttagt cccagaggtc aagcattgca cttattcctc atatatgatt 660

gtccattatc aaagagttct tgaaattcct gttgaattgc taattgcctg cttttagcca 720

gtaacagtct ttatctccat atctct 746

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctacacaggc aatacttggc aaatgaatac 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcagtcatc tgtgcctggg atatatg 27

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagaggaat tgaactcagg tgtgataaac 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagatatgg agataaagac tgttactggc 30

Claims

1.大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段，所述的特异性DNA片段为SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于大刺鳅性别鉴定的引物，其特征在于，所述的引物为：CTACACAGGCAATACTTGGCAAATGAATAC和ATCAGTCATCTGTGCCTGGGATATATG。

3.大刺鳅性别鉴定的特异性DNA片段组合，包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示片段。

4.一种用于大刺鳅性别鉴定的引物组合，其特征在于，所述的引物组合为：CTACACAGGCAATACTTGGCAAATGAATAC、ATCAGTCATCTGTGCCTGGGATATATG ；和CTAGAGGAATTGAACTCAGGTGTGATAAAC、AGAGATATGGAGATAAAGACTGTTACTGGC。

5.权利要求2所述的引物在制备大刺鳅性别鉴定检测试剂盒中的应用。

6.权利要求4所述的引物组合在制备大刺鳅性别鉴定检测试剂盒中的应用。