CN111876498B - 一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法 - Google Patents

一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法，步骤包括：1)分别提取中华刺鳅和大刺鳅基因组DNA；2)PCR扩增中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区，得到目的片段的PCR产物；3)扩增产物纯化后，直接测序，中华刺鳅和大刺鳅扩增产物序列比对，序列的第108、110和111位点碱基为C、C和T的是中华刺鳅，序列的第108、110和111位点碱基为T、T和C的则是大刺鳅。采用本发明能够经济、快速、简便的进行中华刺鳅和大刺鳅的鉴定，结果稳定性好，重复率高，这种鉴定方法将在资源调查中发挥重要作用。

Description

一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法
技术领域
本发明属于分子鉴别形似近缘物种技术领域，具体涉及一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法。
背景技术
中华刺鳅(Sinobdella sinensis)和大刺鳅(Mastacembelus armatus)隶属于合鳃目刺鳅科，是生活于浅水区的中小型鱼类。中华刺鳅主要分布于我国辽河、黄河、长江、钱塘江、珠江等各大水系，而大刺鳅我国长江以南的各大水系。中华刺鳅和大刺鳅的实用价值较低，但是目前已作为观赏鱼类开发。近20年来，由于自然水体的污染，中华刺鳅和大刺鳅在野外水体的数量已经明显下降，相关资源调查的研究和保护工作亟待开展。
中华刺鳅和大刺鳅外部形态相似、鉴别特征不显著、容易混淆，形态分类学上大刺鳅臀鳍刺少，吻突尖长，口裂较短，斑条不明显，个体也较大。中华刺鳅之前被纳入刺鳅属，通过骨骼比对分析后，又被单独为中华刺鳅属。长江以南水系，中华刺鳅和大刺鳅存在混栖，大刺鳅幼体与中华刺鳅个体形态相似，在鱼类调查中难以区分鉴别，不利于资源的保护和管理。因此，需要一种快捷方便、准确可靠的鉴别中华刺鳅和大刺鳅的方法。
发明内容
针对中华刺鳅和大刺鳅形态区分的困难，本发明提供一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法，通过设计引物对实现对上述物种的高效鉴别。
因此，作为本发明的一个方面，本发明提供一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法，其包含以下步骤，(1)分别提取待鉴定的中华刺鳅和大刺鳅因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区，得到目的片段的PCR产物；(3)扩增产物纯化后，直接测序，进行中华刺鳅和大刺鳅扩增产物序列比对，序列的第108、110和111位点碱基为C、C和T的是中华刺鳅，序列的第108、110和111位点碱基为T、T和C的则是大刺鳅。优选的，所述的PCR扩增中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区，其使用的上游引物如序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，下游引物如序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。
优选的，所述的PCR反应体系为50μL：50ng/μL的模板DNA 1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl2，0.01％明胶组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，58℃退火1min，72℃延伸1min，经30个循环后再72℃延伸10min。
作为本发明的一个方面，本发明提供一种中华刺鳅和大刺鳅分子鉴别的引物对，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，所述下游引物如序列如序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。
作为本发明的一个方面，本发明提供一种上述引物对在制备中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别试剂中的应用。
作为本发明的一个方面，本发明提供一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别试剂，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3，所述下游引物如序列如序列SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4。
优选的，还包括PCR缓冲液和dNTP混合液，所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl2，0.01％明胶组成。
有益效果：
本发明针对中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区(Control region)序列差异，首次以中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区序列作为依据，从而定性鉴别中华刺鳅和大刺鳅。该方法可以快速、简便、准确、有效地鉴别中华刺鳅和大刺鳅，结果稳定性好，重复率高，填补了目前国内分子生物学标准鉴别中华刺鳅和大刺鳅的空白，将在渔业资源调查中发挥重要作用。
附图说明
图1为本发明中线粒体控制区序列比对结果，相同的碱基用连接号标识，差异的碱基用星号标识；中华刺鳅和大刺鳅第108、110和111位点存在稳定差异，中华刺鳅碱基为C、C和T，大刺鳅碱基为T、T和C，上述位点距离其他差异碱基的距离较远。而比对出的其他差异碱基在两种马鲅间不是稳定存在，鉴定准确率明显降低，部分个体间存在位点碱基一致情况，因此不能用于这两种鱼类的物种特异性鉴别。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
1、引物设计
设计特异性PCR扩增引物对，引物对1序列为：上游引物SEQ ID NO.1：5'-TGGTTCCTACTTCAGGGCCA-3'，下游引物SEQ ID NO.2：5'-GAGTTCCCTTGAGGGTGTGG-3'。引物对2序列为：上游引物SEQ ID NO.3：5'-CTGAATCGGAGGAATACCAG-3'，下游引物SEQ ID NO.4：5'-AGGTGGACGAGATGTTGGGT-3'。
2、样本采集
取待鉴定的中华刺鳅和大刺鳅个体各30尾。中华刺鳅采集于江苏洪泽湖湖区，体长9.1-19.6cm，体重2.4-25.2g。大刺鳅采集于广西百色，体长15.7-39.2cm，体重9.5-215.7g。
3、基因组DNA提取
利用基因组提取试剂盒提取中华刺鳅和大刺鳅的基因组DNA。取每尾鱼的肌肉组织约20mg，用滤纸吸干表面水分，装入1.5mL离心管，加入180μL的GL缓冲液、20μL的蛋白酶K和10μL的核糖核酸酶A，在56℃的水浴锅中温浴直到外套膜肌肉组织完全裂解，裂解时间为2至3小时左右。向裂解液中加入200μL的GB缓冲液和200μL的无水乙醇，并用移液枪充分吸打混匀。将核酸纯化柱安置于集液管上，溶液移至核酸纯化柱中，离心机12,000rpm，离心时间为2min，离心结束后弃掉核酸纯化柱中的滤液。将500μL的WA缓冲液加入核酸纯化柱中，离心机12000rpm下离心，时间为1min，离心结束后弃掉核酸纯化柱中的滤液。将700μL的WB缓冲液沿核酸纯化柱管壁四周加入，离心机12000rpm，离心时间为1min，离心结束后弃掉滤液，然后重复本步骤1次。将核酸纯化柱重新安置于集液管上，离心机12000rpm，离心时间为2min。将核酸纯化柱安置于新的1.5mL的离心管上，在滤膜的中央加入150μL的灭菌水，在室温下静置5min左右，离心机12000rpm，离心时间为2min，洗脱DNA。DNA完整性采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测其OD值并稀释至50ng/μL，-20℃保存备用。
4、PCR扩增与检测
已提取的DNA为模板，用上述引物对1(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和引物对2(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)进行PCR扩增。PCR反应体系为50μL：1μL模板DNA(50ng/μL)；PCR缓冲液5μL(10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl2，0.01％明胶)；dNTP混合液4μL(每种dNTP 0.1mmol/L)；上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2μL Taq酶(2IU)；双蒸水36μL。扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，58℃退火1min，72℃延伸1min，经30个循环后再72℃延伸10min。
PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120V电压下电泳30min之后，经凝胶成像分析系统确定PCR扩增产物的大小及纯度。
5、测序比对
检测后的PCR扩增产物直接送至生物公司纯化测序，引物对1(SEQ ID NO.1和SEQID NO.2)获得660bp左右的序列，比对后可以发现线粒体控制区序列第108、110和111位点存在差异中华刺鳅碱基为C、C和T，大刺鳅碱基为T、T和C。引物2(SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4)获得610bp左右的序列，比对后在该线粒体控制区序列段中未获得中华刺鳅和大刺鳅间稳定的差异性碱基，因此用该对引物对这两种鱼类进行特异性鉴别的准确率明显降低。
实施例2
1、样本采集
按照实施例1方法，将样本扩大到中华刺鳅和大刺鳅个体各60尾。中华刺鳅采集于江苏洪泽湖和骆马湖，体长范围，体长8.7-15.4cm，体重2.2-20.7g。大刺鳅采集于广西百色，体长15.7-39.2cm，体重9.5-215.7g。
2、样本总DNA提取
利用基因组提取试剂盒提取待检鱼样本总DNA。总DNA提取方法同实施例1。
3、PCR扩增与检测
运用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对待检测与总DNA进行PCR扩增，方法同实施例1。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中检测分离，120V电压下电泳30min之后，经凝胶成像分析系统确定PCR扩增产物的大小及纯度。
4、测序比对
检测后的PCR扩增产物直接送至生物公司纯化测序。结果依然显示，比对的线粒体控制区序列中，中华刺鳅第108、110和111位点碱基为C、C和T，大刺鳅第108、110和111位点碱基为T、T和C，全部鉴定准确。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 江苏省淡水水产研究所
<120> 一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法
<141> 2020-09-11
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tggttcctac ttcagggcca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gagttccctt gagggtgtgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctgaatcgga ggaataccag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aggtggacga gatgttgggt 20

Claims (2)

1.一种中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法，其特征在于：包含以下步骤，
(1)分别提取待鉴定的中华刺鳅和大刺鳅因组DNA；
(2)以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区，得到目的片段的PCR产物；
(3)扩增产物纯化后，直接测序，进行中华刺鳅和大刺鳅扩增产物序列比对，序列的第108、110和111位点碱基为C、C和T的是中华刺鳅，序列的第108、110和111位点碱基为T、T和C的则是大刺鳅；
所述的PCR扩增中华刺鳅和大刺鳅的线粒体控制区，其使用的上游引物如序列SEQ IDNO.1，下游引物如序列SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述的中华刺鳅和大刺鳅的分子鉴别方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为50μL：50ng/μL的模板DNA 1μL，PCR缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，每种dNTP0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2IU的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl 2 ，0.01％明胶组成；PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性45s，58℃退火1min，72℃延伸1min，经30个循环后再72℃延伸10min。
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