CN112280890A

CN112280890A - 一种基于rpa-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法

Info

Publication number: CN112280890A
Application number: CN202011297989.9A
Authority: CN
Inventors: 王荣波; 陈庆河; 赵玉梅; 刘裴清; 李本金; 翁启勇
Original assignee: Hainan University; Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Hainan University; Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2021-01-29

Abstract

本发明公开了一种基于RPA‑侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法，属于生物技术领域。本发明公开的一种基于RPA‑侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合包括2条引物PlRPA‑F和生物素标记的PlRPA‑R，以及1条探针PlRPALFD‑P。RPA检测引物与探针组合经过40℃恒温扩增后采用侧流层析试纸条检测，可观察到试纸条在检测区呈现出阳性条带。本发明公开的RPA‑侧流层析技术检测引物与探针组合及其检测方法能用于生产实践中荔枝霜疫霉感染植株及果实的快速、灵敏、准确的检测，同时能用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为荔枝霜疫霉引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis)是我国南方的一种名特优水果，栽培面积和年产量分别占世界的84.5％和70.5％，年总产值达到62.88亿元，为我国在世界上最具竞争实力的一种亚热带与热带水果。荔枝霜疫病目前是荔枝生产上的一种最重要的病害，其是由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchi)侵染引起的。它主要危害已近成熟的果实，也危害花穗、幼果、果柄、结果小枝和叶片，从而引起大量落花、落果、裂果及烂果，同时也是造成荔枝采后腐烂变质的重要因素。天气潮湿年份烂果率高达50％，损失率高达30％～80％，严重影响荔枝产量和鲜果品质，造成严重的经济损失。近几年该病有逐渐加重的趋势，已成为限制荔枝安全生产的重要障碍。因此建立荔枝霜疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及采摘果实进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况，及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失，尤其是荔枝采后储藏都具有重要的理论和实际意义。

疫霉菌传统的检测鉴定方法是以分离物形态学、生物学、致病性和生理生化特征指标作为依据，对照已有的研究数据确定其分类地位。但由于疫霉形态变异大，一些用于分类、鉴定的形态学特征易受环境条件和人为因素影响，存在不稳定性，特别是有些典型的形态学特征难以产生，使得传统鉴定十分困难。基于LAMP的恒温可视化检测技术已经成功用于荔枝霜疫霉的检测，但是其需要的恒温条件为60–65℃且反应时间在1小时以上，耗费时间较长，依赖专业的恒温装置，不能满足快速检测的需求。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase ploymerase amplification，RPA)技术是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、性价比高的特点。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在25℃～42℃等温条件下快速完成核酸扩增，产物可以通过探针法荧光定量进行实时监测，也可以与侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法相结合进行检测。

重组酶聚合酶核酸扩增技术(RPA)与侧流层析试纸条(lateral flow dipstick，LFD)结合应用形成的RPA-侧流层析体系经过恒温短时间扩增反应后，肉眼即可观察扩增产物在侧流试纸条上的检测结果，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测。目前RPA-侧流层析技术检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，但在植物病原卵菌检测中报道较少，尤其是对荔枝霜疫霉的检测国内外均未见相关应用报道。

因此，提供一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法，本发明的检测引物与探针组合特异性强、灵敏度高；检测方法简便快速，且结果可靠。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合，所述引物与探针核苷酸序列分别为：

PlRPA-F：5’-GAAGACACTGTCAGCACTCTAAACTACTAC-3’；SEQ ID NO.2；

PlRPA-R：5’-TCATACTATACTTGCGAAGGAAGGTCATCA-3’；SEQ ID NO.3；5’端加入一个生物素Biotin标记位点；

PlRPALF-P：5’-[FAM]CTACTACCCCATGTACATGGATGTCCACGT[THF]ATGATCTACATTGGT[C3 spacer]-3’。

与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30～35bp，探针序列的长度为46～52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加；因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合具备创造性。

进一步，一种利用所述基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合检测荔枝霜疫霉的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品基因组DNA；

当用于荔枝组织中存在荔枝霜疫霉的检测时，采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉的DNA，具体过程如下：(1)将荔枝病果或带病叶片、枝条、花穗洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病组织中加入10μl(0.5mol/L NaOH，0.5％PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，12,000rpm离心5min；(3)取上清20μl与80μl的0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)混合；(4)混匀后取2.0μl模板进行扩增；

(2)RPA检测反应体系：以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用引物PlRPA-F和生物素标记的PlRPA-R及PlRPALF-P探针进行扩增；反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液Rehydration buffer，10μM PlRPA-F和生物素标记的PlRPA-R各2.1μl，探针10μM PlRPALF-P 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到50mg RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁并颠倒混匀；

(3)RPA反应：步骤(2)的反应体系在40℃温育5min，将反应管再次混匀，继续40℃温育20min；

(4)采用侧流层析试纸条进行检测；取10μl步骤(3)的反应产物与100μlHybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果；试纸条出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有荔枝霜疫霉；当试纸条只有质控区出现一条紫红色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有荔枝霜疫霉。

进一步，所述的基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合在荔枝霜疫霉的诊断、检测、鉴定中的应用。

进一步，所述的基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉引物与探针组合进行LF-RPA反应检测荔枝霜疫霉的方法在荔枝霜疫病的诊断、检测、鉴定中的应用。

本发明方法可用于带荔枝霜疫霉菌的植株和果实的高灵敏度快速检测；建立荔枝霜疫霉快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于荔枝霜疫霉引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法，适用于生产实践中发病组织中荔枝霜疫霉的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中荔枝霜疫霉引起的病害防治具有重要的实用价值。具体具有以下的技术优势和积极效果：

(1)本发明首次采用RPA-侧流层析技术建立可视化快速检测荔枝霜疫霉的分子检测方法，其具有特异性强、灵敏度高、结果可靠、实用性好及操作简便快捷的特点；

(2)本发明基于荔枝霜疫霉Rh基因序列设计了特定引物和探针，该靶基因是通过比较基因组学的方法在卵菌中鉴定到的一类铵盐转运子，其特点在于该基因在与卵菌相似的真菌中不存在，因此可以有效的用于真菌与卵菌的区分；同时，该基因在卵菌中保守存在，但是不同种之间序列差异显著；由于目前对于RPA技术的引物和探针的设计尚未形成特定规则，也无专门的设计软件，因此本发明创造性地设计了引物与探针组合，扩增效果良好，条带特异性强，与其它病原菌无交叉反应；所建立的检测方法灵敏度高，对荔枝霜疫霉的检测灵敏度在DNA水平上可达到1pg；

(3)本发明的检测方法对荔枝霜疫霉DNA的扩增和可视化检测可在30min内完成，其反应在28℃-46℃之间均能实现扩增检测，无需变性，极大的扩展了RPA适用范围，同时，其结果肉眼直接可见，可以真正实现便捷式的现场快速检测；

(4)本发明对荔枝霜疫霉的检测方法实用性强，能够对组织中存在的荔枝霜疫霉进行快速检测和鉴定，是一种检测荔枝霜疫霉的有效手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明荔枝霜疫霉的RPA-侧流层析技术检测结果图；

其中，第1管(NTC)为阴性对照；第2管(荔枝霜疫霉)为含荔枝霜疫霉DNA的阳性检测；

图2附图为本发明荔枝霜疫霉RPA-侧流层析技术检测的反应时间结果图；

其中，NTC为阴性对照；1-7反应时间分别为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min；

图3附图为本发明荔枝霜疫霉RPA-侧流层析技术检测的反应温度结果图；

其中，NTC为阴性对照；1-8反应温度分别为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃、46℃；

图4附图为本发明荔枝霜疫霉的RPA-侧流层析技术特异性检测结果图；

其中，NTC为阴性对照；1为荔枝霜疫霉(福建、广东、海南的6株荔枝霜疫霉检测结果一致，放一个图为代表)；2-8分别为柑橘褐腐疫霉、辣椒疫霉、大豆疫霉、掘氏疫霉、肉桂疫霉、恶疫霉及芋疫霉DNA；

图5附图为本发明荔枝霜疫霉的RPA-侧流层析技术检测灵敏性结果图；

其中，NTC为阴性对照；1-7模板DNA浓度分别为10ng·μl^-1,1ng·μl^-1,100pg·μl^-1,10pg·μl^-1,1pg·μl^-1,100fg·μl^-1和10fg·μl^-1；

图6附图为本发明对人工接种荔枝霜疫霉发病组织检测结果图；

其中，NTC为阴性对照；1为荔枝霜疫霉DNA(阳性对照)；2-4为人工接种荔枝霜疫霉发病叶片DNA；5-7为人工接种荔枝霜疫霉发病果实DNA；8-9为健康的荔枝叶片和果实DNA。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

RPA扩增试剂盒TwistAmp^TM nfo kits是TwistDX公司的产品，产品目录号为TANF002KIT；其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以冻干粉状态储存于RPA反应管中；检测用Milenia GenLine HybriDetect试剂盒包含侧流层析试纸条和HybriDetect AssayBuffer溶液，为德国Milenia Biotec GmbH公司产品，货号041；检测引物与探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1荔枝霜疫霉RPA-侧流层析技术检测引物与探针的设计

(1)荔枝霜疫霉(Peronophythora litchi)Rh基因的获得

荔枝霜疫霉(Pe.litchi)的基因组数据下载自GenBank(ID：PRJNA290406)，从Pfam数据库(http://pfam.sanger.ac.uk/)中下载铵盐转运子结构域的隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model，HMM)，模型登录号为PF00909。利用HMMER 3.2.1程序(http://hmmer.org/)对荔枝霜疫霉全基因组中的蛋白进行搜索比对，设定目标功能域的E-value阈值为1e-10。随后，将比对到的候选基因提交到NCBI中与已鉴定的序列进行比对验证，获得Rh基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

5’-ATGTGTCTCATCTTCTTCGCCCTGAAATTCGACATGCCCAGTCCGAAAAACAACGACGAAGACACTGTCAGCACTCTAAACTACTACCCCATGTACATGGATGTCCACGTCATGATCTACATTGGTTTCGGCTTCTTGATGACCTTCCTTCGCAAGTATAGTATGAGTGCCGTGTCCCTCAACTTTGTCGTCGCTGTGTTGTCCCTCCAATGGGGTATCATTTGCGTCACGATGGCTCACCAGATTGGTTCGAACCACTTCACAACCAAGTTGATGGACATCCCAACAATGATCAATGGCGACTTTGCCGCTGGTGCCGTGCTCATCAGTTTTGGAGCTGTTCTGGGTAAAACTACCCCTACTCAGTTGGTGTGGATGACTTTCCTTGAAATTATCTTCTACGCTTTGAACGAGTACCTGGTGCTCGAGGAGCTCAAGGTCAGTGATGCTGGCGGTTCGATGGTTATCCACACATTCGGTGCTTTCTTCGGACTAGCGGTCACCATTATGTTGGGAGTCCCGACTGAAGTCGACCAAGTGCACAACCGGTCGCGTTACCACTCTGACGTGTTCGCCATGATTGGCACGCTCTTCTTGTGGATGTACTGGCCGTCCTTCAACGCTGCTTTGGTGGGTTCTGACGGTTTCCAGCAGGAGCGTGCTGTTATGAACACTGTGCTAAGTATTGCTGCTTCTTGCGCTTCGGCCTTTGCGGCATCGAAAATGATGAGTCACACCAAGAAATTCGACATGGTGCACGTCCAGAACGCCACACTTGCGGGTGGTGTGGCAATGGGCACGAGCTGCAACCTCGCTATTAGCCCTGCAGTTGCCATCACTGTGGGTCTCGTGGTGGGCATTGCATCCACTTTCGGCTTCTGCTACGTGACTCCCCGTCTCGAAAGGCTAATCCGAATGTCCGACACGTGTGGTATCCTCAACTTGCACGGTATGCCGGGTGTGGTCGGTGGCTTTGCCGGAGCCATTGTCACCTTCTCCGCTTCCGACGACTACTACGGAGACAGCTTGACGGACGTCTACGCTGCTCGTGCCTACCGTTCTGCTAACGAGCAGGGATGGTACCAGCTTCTTGCTATTGTTTCTTCTGCTGGAATTGGCGCTGTATCTGGATTCCTCGTTGGCTATGTGCTCAAGTCCCCATTGTTCCGTCAGCAGAAACTTAAATACGATGACGACGAGTGGTTCTATGTACCCGAAGAGCCTGAAGAGTGCCGTGCCTAA-3’；SEQ ID NO.1。

(2)荔枝霜疫霉RPA-侧流层析技术检测引物与探针的设计

将所得荔枝霜疫霉Rh基因的核苷酸序列与其它已知疫霉属及亲缘关系较近病原菌的序列进行多重序列比对，选取荔枝霜疫霉特异序列，设计检测引物与探针。

RPA引物长度一般为30至35个核苷酸，扩增片段大小在100～400bp之间，根据比对所得Rh基因的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0软件设计RPA上下游引物对，得到扩增效率高、灵敏度和特异性最好的引物对。引物序列如下：

PlRPA-F：5’-GAAGACACTGTCAGCACTCTAAACTACTAC-3’；SEQ ID NO.2；

PlRPA-R：5’-TCATACTATACTTGCGAAGGAAGGTCATCA-3’；SEQ ID NO.3；在SEQ IDNO.3序列的5’端加入一个生物素(Biotin)标记位点。

根据RPA引物扩增片段设计一条大小为45bp的探针，探针的5’端添加有FAM，3’端添加有C3-spacer，且在探针中距离5’端30bp处进行THF修饰。探针序列如下：

实施例2基于RPA-侧流层析技术的检测引物与探针组合对荔枝霜疫霉的可视化检测

(1)荔枝霜疫霉基因组DNA的提取：

采用CTAB法提取荔枝霜疫霉基因组DNA，具体过程如下：取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl 2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2％CTAB；100mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，pH 8.0；20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，pH 8.0；1.4mol/L NaCl)和90μl 10％SDS(十二烷基苯磺酸钠)后混匀，于55～60℃水浴1.5h，每10min振荡混匀一次，水浴1.5h后离心(12,000rpm)15min，取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)，离心(12,000rpm)5min，取上清液(水相)，加入与上清液等体积的氯仿抽提一次(12,000rpm)离心5min，吸上清(350μl)，加0.1倍体积(35μl)的3mol/L NaAC溶液和2倍体积(700μl)的冰无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700μl冰70％乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE(10mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/μl待用。

(2)RPA反应体系：反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液(Rehydrationbuffer)，10μM PlRPA-F和生物素标记的PlRPA-R各2.1μl，探针10μM PlRPALF-P 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁(MgAc)并颠倒混匀；将模板DNA替换为等量的ddH₂O做阴性对照。

(4)结果检测：取10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。试纸条出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有荔枝霜疫霉；当试纸条只有质控区出现一条紫红色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有荔枝霜疫霉。

本实施例的检测结果见图1。图1可视化检测结果表明：实验组以荔枝霜疫霉基因组DNA为模板，试纸条出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，为阳性；而对照组以ddH₂O为模板，只在质控区出现一条紫红色条带，检测区没有条带，为阴性。说明本发明的RPA检测引物与探针组合能够用于荔枝霜疫霉的可视化检测。

实施例3荔枝霜疫霉RPA检测的反应时间

(1)荔枝霜疫霉基因组DNA提取：采用实施例2中CTAB法提取荔枝霜疫霉基因组DNA。

(2)RPA反应体系：反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液(Rehydrationbuffer)，10μM PlRPA-F和生物素标记的PlRPA-R各2.1μl，探针10μMPlRPALF-P 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁(MgAc)并颠倒混匀；将模板DNA替换为等量的ddH₂O做阴性对照。

(3)RPA反应：步骤(2)的反应体系在40℃温育5min，将反应管再次混匀，继续40℃温育，总反应时间分别为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min。其中，5min、10min、15min、20min、30min、35min作为对比。

(4)结果检测：取10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。本实施例的检测结果见图2。结果显示试纸条在15min～35min之间均出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明检测反应均可进行，但是在总反应时间为25min时，其显色条带颜色最深且清晰，表明该检测反应最适时间为25min。

实施例4荔枝霜疫霉RPA检测的反应温度

(3)RPA反应：步骤(2)的反应体系分别在不同温度梯度(25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃、43℃、46℃)温育5min，将反应管再次混匀，继续相应温度温育20min。其中，25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、43℃、46℃作为对比。

(4)结果检测：取10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。

本实施例的检测结果见图3。结果显示试纸条在28℃-46℃之间均出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明检测反应均可进行，但是在40℃时，其显色条带颜色最深且清晰，表明本发明选用的反应温度40℃结果最佳。

实施例5基于RPA-侧流层析技术检测引物与探针组合对荔枝霜疫霉的特异性扩增

以我国福建、广东、海南的6株荔枝霜疫霉和7种其它疫霉属病原菌为供试材料，对检测引物与探针的特异性进行RPA验证。

(1)供试菌株

(2)供试菌株基因组DNA的提取：

采用实施例2中CTAB法提取供试菌株基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/μl待用。

(3)RPA反应体系：反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液(Rehydrationbuffer)，10μM PlRPA-F和生物素标记的PlRPA-R各2.1μl，探针10μM PlRPALF-P 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁(MgAc)并颠倒混匀；将模板DNA替换为等量的ddH₂O做阴性对照。

(4)LFD-RPA反应：步骤(3)的反应体系在40℃温育5min，将反应管再次混匀，继续40℃温育20min。

(5)结果检测：取10μl步骤(4)的反应产物与100μl HybriDetect Assay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果。试纸条出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有荔枝霜疫霉；当试纸条只有质控区出现一条紫红色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有荔枝霜疫霉。

本实施例的检测结果见图4。检测的特异性：除了荔枝霜疫霉检测结果可观察到试纸条出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区外，其它7种病原菌菌株检测试纸条只有质控区出现一条紫红色条带，检测区没有条带，说明此检测引物与探针组合具有很强的特异性。

实施例6基于RPA-侧流层析技术检测引物与探针组合对荔枝霜疫霉的灵敏性检测

(1)采用10倍浓度系列稀释法将提取的荔枝霜疫霉DNA稀释成10ng·μl^-1,1ng·μl^-1,100pg·μl^-1,10pg·μl^-1,1pg·μl^-1,100fg·μl^-1和10fg·μl^-1DNA，共7个不同浓度梯度。

(2)LFD-RPA反应体系：反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液(Rehydrationbuffer)，10μM PlRPA-F和生物素标记的PlRPA-R各2.1μl，探针10μM PlRPALF-P 0.6μl，待测模板DNA 2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁(MgAc)并颠倒混匀；将模板DNA替换为等量的ddH₂O做阴性对照。

(3)LFD-RPA反应：步骤(2)的反应体系在40℃温育5min，将反应管再次混匀，继续40℃温育20min。

本实施例的检测结果见图5。图5结果表明50μl体系中含有1pg/μl的荔枝霜疫霉DNA的试纸条出现两条紫红色条带，呈阳性反应，表明LFD-RPA检测荔枝霜疫霉DNA的灵敏度可达1pg/μl，具有很高的灵敏度。

实施例7发病组织中荔枝霜疫霉的检测。

(1)样品采集：人工接种荔枝叶片及果实样品。

(2)病组织基因组DNA提取：发病与健康植物组织采用NaOH快速裂解法提取病组织基因组DNA，具体过程如下：

(1)将荔枝病果或带病叶片、枝条、花穗洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病组织中加入10μl(0.5mol/L NaOH，0.5％PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，12,000rpm离心5min；(3)取上清20μl与80μl的0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)混合；(4)混匀后取2.0μl模板进行扩增。

(4)RPA反应：步骤(3)的反应体系在40℃温育5min，将反应管再次混匀，继续40℃温育20min。

本实施例的检测结果见图6；图6结果表明，人工接种荔枝霜疫霉的样品及阳性对照RPA检测试纸条呈现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，结果为阳性，表明样本中含有荔枝霜疫霉；健康的荔枝叶片、果实样品及阴性对照只有质控区出现一条紫红色条带，证明了基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的方法检测结果准确可靠，具有很强的实用性。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所海南大学

<120> 一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgtgtctca tcttcttcgc cctgaaattc gacatgccca gtccgaaaaa caacgacgaa 60

gacactgtca gcactctaaa ctactacccc atgtacatgg atgtccacgt catgatctac 120

attggtttcg gcttcttgat gaccttcctt cgcaagtata gtatgagtgc cgtgtccctc 180

aactttgtcg tcgctgtgtt gtccctccaa tggggtatca tttgcgtcac gatggctcac 240

cagattggtt cgaaccactt cacaaccaag ttgatggaca tcccaacaat gatcaatggc 300

gactttgccg ctggtgccgt gctcatcagt tttggagctg ttctgggtaa aactacccct 360

actcagttgg tgtggatgac tttccttgaa attatcttct acgctttgaa cgagtacctg 420

gtgctcgagg agctcaaggt cagtgatgct ggcggttcga tggttatcca cacattcggt 480

gctttcttcg gactagcggt caccattatg ttgggagtcc cgactgaagt cgaccaagtg 540

cacaaccggt cgcgttacca ctctgacgtg ttcgccatga ttggcacgct cttcttgtgg 600

atgtactggc cgtccttcaa cgctgctttg gtgggttctg acggtttcca gcaggagcgt 660

gctgttatga acactgtgct aagtattgct gcttcttgcg cttcggcctt tgcggcatcg 720

aaaatgatga gtcacaccaa gaaattcgac atggtgcacg tccagaacgc cacacttgcg 780

ggtggtgtgg caatgggcac gagctgcaac ctcgctatta gccctgcagt tgccatcact 840

gtgggtctcg tggtgggcat tgcatccact ttcggcttct gctacgtgac tccccgtctc 900

gaaaggctaa tccgaatgtc cgacacgtgt ggtatcctca acttgcacgg tatgccgggt 960

gtggtcggtg gctttgccgg agccattgtc accttctccg cttccgacga ctactacgga 1020

gacagcttga cggacgtcta cgctgctcgt gcctaccgtt ctgctaacga gcagggatgg 1080

taccagcttc ttgctattgt ttcttctgct ggaattggcg ctgtatctgg attcctcgtt 1140

ggctatgtgc tcaagtcccc attgttccgt cagcagaaac ttaaatacga tgacgacgag 1200

tggttctatg tacccgaaga gcctgaagag tgccgtgcct aa 1242

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaagacactg tcagcactct aaactactac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tcatactata cttgcgaagg aaggtcatca 30

Claims

1.一种基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合，其特征在于，所述引物与探针核苷酸序列分别为：

PlRPA-F：5’-GAAGACACTGTCAGCACTCTAAACTACTAC-3’；SEQ ID NO.2；

PlRPALF-P：5’-[FAM]CTACTACCCCATGTACATGGATGTCCACGT[THF]ATGATCTACATTGGT[C3spacer]-3’。

2.一种利用权利要求1所述基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合检测荔枝霜疫霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品基因组DNA；

(2)RPA检测反应体系：以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用引物PlRPA-F和生物素标记的PlRPA-R及PlRPALF-P探针进行扩增；反应体系为50μl，包含29.5μl反应缓冲液Rehydrationbuffer，10μM PlRPA-F和生物素标记的PlRPA-R各2.1μl，探针10μM PlRPALF-P0.6μl，待测模板DNA2.0μl，无菌双蒸水11.2μl，将上述组分混匀后加入到50mg RPA冻干酶粉中，随后加入2.5μl 280mM醋酸镁并颠倒混匀；

(4)采用侧流层析试纸条进行检测；取10μl步骤(3)的反应产物与100μl HybriDetectAssay Buffer混合，然后将试纸条垂直插入混合液中，室温静置5min后观察结果；试纸条出现两条紫红色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有荔枝霜疫霉；当试纸条只有质控区出现一条紫红色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有荔枝霜疫霉。

3.权利要求1所述的基于RPA-侧流层析技术检测荔枝霜疫霉的引物与探针组合在荔枝霜疫霉的诊断、检测、鉴定中的应用。