CN109055596B - 一种甘薯薯瘟病菌的lamp检测引物及其可视化检测方法 - Google Patents
一种甘薯薯瘟病菌的lamp检测引物及其可视化检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物及其可视化检测方法，主要设计了一组甘薯薯瘟病菌的LAMP引物F3、B3、FIP、BIP；利用LAMP恒温扩增，扩增反应后通过显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可肉眼直接观察到荧光绿色或者电泳时梯形条带特征。本发明针对甘薯薯瘟病菌建立的环介导等温扩增技术可实现对带病组织(植株、薯块)中甘薯薯瘟病菌的快速检测，具有扩增快速、高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，为甘薯薯瘟病菌防治提供可靠的技术依据。
Description
【技术领域】
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物及其可视化检测方法。
【背景技术】
由甘薯青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的甘薯薯瘟病是甘薯生产上一种图传细菌性病害，为植物检疫对象。近年来甘薯薯瘟病在我国国南方甘薯主产区不断扩大和蔓延，严重威胁着甘薯的生产。甘薯薯瘟病菌对甘薯的侵染过程普遍为从甘薯根茎部伤口或自然孔口侵入，先在皮层、细胞间隙等处定殖，随后在植物导管及附近组织内大量繁殖，并分泌胞外多糖堵塞导管并破坏周围组织，最终使植物萎蔫死亡，典型症状就是植株在萎蔫的状态下依然保持青绿颜色。但是，在发病中后期，甘薯茎秆变为褐色、黑褐色，植株萎蔫，与其他甘薯病害症状类似，如黑腐病、茎腐病等，且植物组织中微生物种类繁多。由于目前缺乏有效的病害早期诊断技术，发病后盲目大量使用药剂防治引起农药残留，造成食品安全问题，而且防治效果不理想。因此，研发出甘薯薯瘟病的早期快速诊断并进行及时监测，对保障甘薯产业健康生产及食品安全至关重要。
目前病害检测方法主要采用传统的病原分离检测方法和分子检测等技术。传统检测方法耗时、耗力，且检测结果可靠性低，免疫学检测技术的灵敏度较低，且抗体的制作过程耗时、复杂，检测成本高，PCR技术虽然快速、准确，但需昂贵的仪器设备，检测成本高，不适宜在基层部门推广应用。而最近科学家们研发出的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术是一种高效率的核酸等温扩增方法，该方法短时间内实现产物的大量扩增，灵敏度比PCR高，且操作步骤简便，无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合在基层生产部门推广应用。本发明基于环介导等温扩增(LAMP)技术，建立甘薯薯瘟病菌的可视化检测，根据LAMP技术原理和不同致病型薯瘟病菌菌株全基因组测序结果，选甘薯薯瘟病菌的特异序列的6个区域，设计出4条特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，以SYBR GreenⅠ的荧光显色指示剂作用，建立可视化LAMP检测技术。该体系对甘薯薯瘟病菌检测具有高的特异性与灵敏性。并在此基础上研发出可视化快速检测试剂盒。该技术是一种操作简单、灵敏度和特异性高的快速检测手段；无需特殊仪器设备，同时开发的快速检测试剂盒适合田间甘薯生产中开展实地检测与监测，从而保障甘薯健康生产及食品安全。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题之一，在于针对现有技术中的甘薯薯瘟病菌的传统的检测方法所需的检测周期长，特异性差，检测需要昂贵的仪器等问题，提供一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物，其具有快速、灵敏度高、特异性强等特点，可用于开发适合田间甘薯生产中开展实地检测的快速检测试剂盒，从而保障甘薯健康生产。
本发明是这样实现上述技术问题之一的：
一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物，所述检测引物包括如下二对特异性引物对：
外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；
外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；
内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；
内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'。
本发明要解决的技术问题之二，在于针对现有技术中的甘薯薯瘟病菌的传统的检测方法所需的检测周期长，特异性差，检测需要昂贵的仪器等问题，提供一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，期具有快速、灵敏度高、特异性强等特点，可用于开发适合田间甘薯生产中开展实地检测的快速检测试剂盒，从而保障甘薯健康生产。
本发明是这样实现上述技术问题之二的：
一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，所述检测方法步骤如下：
步骤(1)根据甘薯薯瘟病菌基因组测序结果中的特异基因序列设计引物，得到针对6个区域的二对特异性引物对，所述二对特异性引物对如下：
外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；
外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；
内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；
内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'；
步骤(2)进行甘薯薯瘟病原菌的分离和培养，得到甘薯薯瘟病原菌的菌液；
步骤(3)提取步骤(2)所得菌液中的甘薯薯瘟病原菌DNA；
步骤(4)LAMP扩增：以经步骤(2)处理所得的菌液和步骤(3)处理所得的甘薯薯瘟病原菌DNA为模板，在恒温条件下利用步骤(1)所得4条特异性引物进行LAMP扩增，并对扩增产物进行显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步地，所述步骤(2)的具体步骤如下：
步骤(2.1)甘薯薯瘟病原菌分离与纯化：
取新鲜采集的薯瘟病害标本，洗净晾干，室内切片，显微镜下观察有溢菌现象的采用平板划线法进行分离；
无菌条件下切取病、健交界处的维管束数块，放在灭菌的载玻片上，滴上几滴无菌水使病组织块完全被浸泡，静置数分钟，用酒精灯烧过的接种环蘸取浸泡液一环在TTC平板上划线，倒置，28℃恒温箱培养24-48h，挑取单菌落于新鲜的TTC平板上划线1-2次，即可得到纯化菌株，保存备用；
步骤(2.2)菌株培养：将保存纯化的菌株活化接种于TTC平板上，置于28℃培养24-48h，挑取单菌落于新鲜NB培养基中，28℃，180r/min，培养16-18h，获得对数生长期的甘薯薯瘟病原菌的菌液，4℃保存备用。
进一步地，所述步骤(3)是采用细菌基因组提取试剂盒进行提取甘薯薯瘟病原菌DNA的，具体步骤如下：
取过夜培养的甘薯薯瘟病原菌的菌液1ml，12000×g离心1分钟，尽量弃上清；加入100μl LB11和20μl Proteinase K，振荡至菌体彻底悬浮；55℃孵育15分钟直至溶液清亮状，每隔5分钟摇匀一次；加入20μl RNase A混匀静置2分钟；加入400μl BB11涡旋30秒；将全部的溶液加入离心柱中，1000g离心30秒，弃流出液；加入500μl CB11，12000×g离心30秒，弃流出液；重复上步一次；加入500μl WB11，12000×g离心30秒，弃流出液；重复上步一次；12000×g离心2分钟，彻底除去残留的WB11；将离心柱置于干净的离心管中，在柱中央加入100μl 60-70℃预热的EB溶液，室温静置2分钟，12000×g离心1分钟，洗脱DNA；稀释DNA浓度至50ng/μl，保存于-20℃备用。
进一步地，所述步骤(4)中25μL的LAMP反应体系中各组分含量如下：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、8.0mM MgSO4、50mM KCl、0.8mM甜菜碱、1.4mmol·L-1 dNTPs、Bst DNA聚合酶8U、1.6μmolL-1的FIP和BIP、0.2μmol·L-1的F3和B3、Tween-20wt 0.1％，1μL模板菌液或模板DNA，无菌双蒸水补充至25μL，在PCR管盖上加入2μL 1000×SYBR GreenⅠ，LAMP反应条件为65℃1h，85℃灭活10min，冰上终止反应，反应结束后瞬时离心，将1000×SYBR GreenⅠ离心到PCR管的底部，观察颜色变化。
进一步地，LAMP反应结束后，显色反应的显色结果为绿色荧光的判断为阳性，显色结果为橙色的判断为阴性，或取5μL反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带的判断为阳性，无条带的判断为阴性。
本发明具有如下优点：
1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物，已经采集分离不同地点的甘薯薯瘟病菌进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证。
2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物是针对甘薯薯瘟病菌基因组测序结果中特异性序列的6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，同时扩增甘薯薯瘟病菌和其他感番茄青枯菌、茄子青枯菌、辣椒青枯菌、马铃薯青枯菌、烟草青枯菌阳性样品没有扩增出特异条带，因此该方法特异性较强。
3、灵敏度高：LAMP对甘薯薯瘟病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到100fg·μL-1，具有较高的灵敏度。
4、操作简便：应用本发明方法且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要昂贵的仪器设备和试剂。
5、实用性强：本发明可直接对田间发病的甘薯组织，，可快速提取DNA后直接用本方法进行检测。
6、快速直观：对甘薯薯瘟病菌进行检测可在1小时内完成，恒温扩增过程中加入了SYBR GreenⅠ，在反应结束后不用打开盖子就能直接观测结果，实现了可视化的检测方法。
总之，本发明针对甘薯薯瘟病菌建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速、高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，在基层检测中有很好的应用前景。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明中实施例一的LAMP产物的电泳图。
图2为本发明实施例二的LAMP特异性分析电泳图。
图3为本发明实施例三的LAMP方法检测甘薯薯瘟病菌灵敏度电泳图。
图4为本发明实施例三的PCR方法检测甘薯薯瘟病菌灵敏度电泳图。
图5为本发明中实施例四甘薯薯瘟病发病组织的LAMP扩增产物的电泳图。
图6为本发明中实施例五中田间采样的LAMP扩增产物的电泳图。
【具体实施方式】
请参阅图1-6，本发明涉及一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测引物及其检测方法，所述检测引物包括如下二对特异性引物对：
外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；
外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；
内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；
内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例一
一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，所述检测方法步骤如下：
步骤(1)根据甘薯薯瘟病菌(Ralstonia solanacearum)基因组测序结果中的特异基因序列设计引物，应用LAMP引物设计软件primer explorer 5.0(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物，得到针对6个区域的二对特异性引物对，所述二对特异性引物对如下：
外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；
外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；
内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；
内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'；
并由福州尚亚生物技术有限公司合成上述二对特异性引物对。
所述甘薯薯瘟病菌(Ralstonia solanacearum)的特异性基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述外引物B3的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
步骤(2)进行甘薯薯瘟病原菌的分离和培养，得到甘薯薯瘟病菌病原菌的菌液；
步骤(2.1)甘薯薯瘟病原菌分离与纯化：
取新鲜采集的薯瘟病害标本，洗净晾干，室内切片，显微镜下观察有溢菌现象的采用平板划线法进行分离；
无菌条件下切取病、健交界处的维管束数块，放在灭菌的载玻片上，滴上几滴无菌水使病组织块完全被浸泡，静置数分钟，用酒精灯烧过的接种环蘸取浸泡液一环在TTC平板上划线，倒置，28℃恒温箱培养24-48h，挑取单菌落于新鲜的TTC平板上划线1-2次，即可得到纯化菌株，保存备用；
步骤(2.2)菌株培养：将保存纯化的菌株活化接种于TTC平板上，置于28℃培养24-48h，挑取单菌落于新鲜NB培养基中，28℃，180r/min，培养16-18h，获得对数生长期的甘薯薯瘟病原菌的菌液，4℃保存备用。
步骤(3)提取步骤(2)所得菌液中的甘薯薯瘟病原菌DNA；
所述步骤(3)是采用细菌基因组提取试剂盒进行提取甘薯薯瘟病原菌DNA的，所述试剂盒为北京全式金生物技术有限公司生产的EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit细菌基因组提取试剂盒，具体步骤如下：
取过夜培养的甘薯薯瘟病原菌的菌液1ml，12000×g离心1分钟，尽量弃上清；加入100μl LB11和20μl Proteinase K，振荡至菌体彻底悬浮；55℃孵育15分钟直至溶液清亮状，每隔5分钟摇匀一次；加入20μl RNase A混匀静置2分钟；加入400μl BB11涡旋30秒；将全部的溶液加入离心柱中，1000g离心30秒，弃流出液；加入500μl CB11，12000×g离心30秒，弃流出液；重复上步一次；加入500μl WB11，12000×g离心30秒，弃流出液；重复上步一次；12000×g离心2分钟，彻底除去残留的WB11；将离心柱置于干净的离心管中，在柱中央加入100μl 60-70℃预热的EB溶液，室温静置2分钟，12000×g离心1分钟，洗脱DNA；稀释DNA浓度至50ng/μl，保存于-20℃备用。
步骤(4)LAMP扩增：以经步骤(2)处理所得的菌液和步骤(3)处理所得的甘薯薯瘟病原菌DNA为模板，在恒温条件下利用步骤(1)所得4条特异性引物进行LAMP扩增，并对扩增产物进行显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测。
所述步骤(4)中25μL的LAMP反应体系中各组分含量如下：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、8.0mM MgSO4、50mM KCl、0.8mM甜菜碱、1.4mmol·L-1 dNTPs、BstDNA聚合酶8U、1.6μmolL-1的FIP和BIP、0.2μmol·L-1的F3和B3、Tween-20wt 0.1％，1μL模板菌液或模板DNA，无菌双蒸水补充至25μL，在PCR管盖上加入2μL 1000×SYBR GreenⅠ，LAMP反应条件为65℃1h，85℃灭活10min，冰上终止反应，反应结束后瞬时离心，将1000×SYBR GreenⅠ离心到PCR管的底部，观察颜色变化。
取5μLLAMP扩增产物用2％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在0.5×TBE和130V电压下电泳30min，用紫外透射仪观察。
阴性对照：所用模板为高纯水，扩增反应体系同上。
实验结果：显色反应结果中，LAMP产物颜色变为绿色，阴性对照为橙色。
电泳检测结果具体参阅图1，图1中各泳道表示如下：M:DL2000 DNA marker，1：LAMP产物(菌液)，2、3：阴性对照；4：LAMP产物(DNA)5、6：阴性对照。图1中应用LAMP反应体系扩增甘薯薯瘟病原菌，能产生LAMP产物特殊的阶梯状条带(条带为图中的1和4泳道)，而阴性对照(图中的2,3,5,6,泳道)不产生条带。
实施例二
LAMP的特异性验证：
分别提取感染甘薯薯瘟病菌、番茄青枯菌、茄子青枯菌、辣椒青枯病菌、马铃薯青枯菌、烟草青枯菌阳性样品的总DNA为模板，提取方法同实施例一，分别应用本实施例一设计的4对引物进行LAMP扩增，并对其进行特异性检测。
实验结果：显色反应结果中，只有感染甘薯薯瘟病菌的样品反应产物呈现荧光绿色，而其他5个样品均为橙色。
取5μL产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析，电泳检测结果如图2，其中各泳道表示如下：M:DL2000 DNA marker；1-6依次为感染甘薯薯瘟病菌、番茄青枯菌、茄子青枯菌、辣椒青枯病菌、马铃薯青枯菌、烟草青枯菌的阳性样品的总DNA的LAMP扩增产物。
只有甘薯薯瘟病菌检测结果有梯状条带(图2中的泳道1)，其他样品不产生条带(图2中的泳道2-6)，说明建立的LAMP检测体系对甘薯薯瘟病菌的检测具有较好的特异性。
实施例三
LAMP检测验证及灵敏度检测
为了考察本发明甘薯薯瘟病菌的LAMP检测方法的灵敏度，申请人对实施例一步骤(3)中的DNA样品采用10倍浓度系列稀释法稀释成浓度分别为10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1；1fg·μL-1共8个不同浓度梯度。然后分别用LAMP和PCR方法进行检测，再进行显示反应以及2％琼脂糖凝胶电泳。
实验结果：显色反应中观察到，DNA样品浓度在10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1，LAMP扩增产物均显示绿色荧光，判断为阳性；
电泳结果具体参阅图3-4，图3为LAMP方法检测甘薯薯瘟病菌灵敏度电泳图，各泳道表示如下：M:DL2000 DNA marker；1-8依次为浓度为：10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1；1fg·μL-1的DNA样品LAMP扩增产物。
图4为PCR方法检测甘薯薯瘟病菌灵敏度电泳图，各泳道表示如下：M:DL2000 DNAmarker；1-8依次为浓度为：10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1；1fg·μL-1的DNA样品PCR扩增产物。
由图3可知，稀释至100fg·μL-1时，LAMP仍能检测出甘薯薯瘟病菌，而由图4可知，PCR只能检测到1pg·μL-1的稀释浓度，表明LAMP检测甘薯薯瘟病菌的灵敏度是PCR的10倍，具有很高的灵敏度。
实施例四
发病植物组织中甘薯薯瘟病菌的检测
田间采集发病的甘薯组织，取发病部位的组织50-100g，，加入100-200ml ddH2O混匀，将收集到的混匀后的溶液置沸水中煮10min；取1μl作为DNA模板参加按照步骤(4)LAMP反应。检测结果：LAMP产物为特定的阶梯状条带，而阴性对照不产生条带；用肉眼观察，LAMP产物颜色变为绿色荧光，判断为阳性。
电泳结果参照图5，图5中各泳道表示如下：M:DL2000 DNA marker；泳道1为病样组织的LAMP扩增产物，泳道2为阴性对照(所用模板为高纯水)；泳道1检测结果有梯状条带，泳道2不产生条带。
实施例五
LAMP的检测方法的应用：
利用实施案例一中的步骤(2)提取田间采集的12份病样组织，取发病部位的组织50-100g，加入100-200ml ddH2O混匀，将收集到的混匀后的溶液置沸水中煮10min；取1μl作为DNA模板参加实施案例一中的步骤(4)进行LAMP恒温扩增。
实验结果：显色反应反应结果显示，12份样品均出现荧光绿色，阴性对照(所用模板为高纯水)出现橙色。
电泳结果参照图6，图6中各泳道表示如下：M:DL2000 DNA marker；1-12分别田间采集的12份病样组织的LAMP扩增产物，13为阴性对照；泳道1-12检测结果有梯状条带，泳道13不产生条带。
由此可见，本发明所设计出的LAMP引物，可用于甘薯薯瘟病菌的快速检测，实用性强，可满足甘薯薯瘟病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。
综上，本发明具有如下优点：
1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物，已经采集分离不同地点的甘薯薯瘟病菌进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证。
2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物是针对甘薯薯瘟病菌基因组测序结果中特异性序列的6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，同时扩增甘薯薯瘟病菌和其他感番茄青枯菌、茄子青枯菌、辣椒青枯菌、马铃薯青枯菌、烟草青枯菌阳性样品没有扩增出特异条带，因此该方法特异性较强。
3、灵敏度高：LAMP对甘薯薯瘟病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到100fg·μL-1，具有较高的灵敏度。
4、操作简便：应用本发明方法且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要昂贵的仪器设备和试剂。
5、实用性强：本发明可直接对田间发病的甘薯样本植株或薯块，菌液无需特殊处理，不需提取菌液DNA，可直接利用本方法进行检测。
6、快速直观：对甘薯薯瘟病菌进行检测可在1小时内完成，恒温扩增过程中加入了SYBR GreenⅠ，在反应结束后不用打开盖子就能直接观测结果，实现了可视化的检测方法。
总之，本发明针对甘薯薯瘟病菌建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速、高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，在基层检测中有很好的应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 福建省农业科学院作物研究所
<120> 一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物及其可视化检测方法
<130> 100
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> （Ralstonia solanacearum）
<400> 1
accagttaaa gaatgaccca agacatccag tgattgttgt caatgaaatg ggtaacagac 60
ttcaagccta ctggacaggc atggtcgtta cattgatcgc tgttactggt gcggcaggca 120
ttgcagcatt gttgaagtct tcaatcgcaa caaccgtcac caacgttttg gtgatcattg 180
ttggattcct tggattgcca 200
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
accagttaaa gaatgaccca 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
tggcaatcca aggaatcc 18
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
gtaacgacca tgcctgtcca gattgttgtc aatgaaatgg gt 42
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
gcaggcattg cagcattgtt aacaatgatc accaaaacgt 40
Claims (5)
1.一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物，其特征在于：所述检测引物包括如下二对特异性引物对：
外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；
外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；
内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；
内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'。
2.一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，其特征在于：所述检测方法步骤如下：
步骤(1)根据甘薯薯瘟病菌基因组测序结果中的特异基因序列设计引物，得到针对6个区域的二对特异性引物对，所述二对特异性引物对如下：
外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；
外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；
内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；
内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'；
步骤(2)进行甘薯薯瘟病菌病原菌的分离和培养，得到甘薯薯瘟病菌病原菌的菌液；
步骤(3)提取步骤(2)所得菌液中的甘薯薯瘟病菌病原菌DNA；
步骤(4)LAMP扩增：以经步骤(2)处理所得的菌液和步骤(3)处理所得的甘薯薯瘟病菌病原菌DNA为模板，在恒温条件下利用步骤(1)所得4条特异性引物进行LAMP扩增，并对扩增产物进行显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测。
3.根据权利要求2所述的一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体步骤如下：
步骤(2.1)甘薯薯瘟病原菌分离与纯化：
取新鲜采集的薯瘟病害标本，洗净晾干，室内切片，显微镜下观察有溢菌现象的采用平板划线法进行分离；
无菌条件下切取病、健交界处的维管束数块，放在灭菌的载玻片上，滴上几滴无菌水使病组织块完全被浸泡，静置数分钟，用酒精灯烧过的接种环蘸取浸泡液一环在TTC平板上划线，倒置，28℃恒温箱培养24-48h，挑取单菌落于新鲜的TTC平板上划线1-2次，即可得到纯化菌株，保存备用；
步骤(2.2)菌株培养：将保存纯化的菌株活化接种于TTC平板上，置于28℃培养24-48h，挑取单菌落于新鲜NB培养基中，28℃，180r/min，培养16-18h，获得对数生长期的甘薯薯瘟病原菌的菌液，4℃保存备用。
4.根据权利要求2所述的一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中25μL的LAMP反应体系中各组分含量如下：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、8.0mMMgSO4、50mM KCl、0.8mM甜菜碱、1.4mmol·L-1dNTPs、Bst DNA聚合酶8U、1.6μmolL-1的FIP和BIP、0.2μmol·L-1的F3和B3、Tween-20wt 0.1％，1μL模板菌液或模板DNA，无菌双蒸水补充至25μL，在PCR管盖上加入2μL 1000×SYBR GreenⅠ，LAMP反应条件为65℃1h，85℃灭活10min，冰上终止反应，反应结束后瞬时离心，将1000×SYBR GreenⅠ离心到PCR管的底部，观察颜色变化。
5.根据权利要求4所述的一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，其特征在于：LAMP反应结束后，显色反应的显色结果为绿色荧光的判断为阳性，显色结果为橙色的判断为阴性，或取5μL反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带的判断为阳性，无条带的判断为阴性。
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