CN108441569B - 桑源阴沟肠杆菌特异序列和引物组Yt4及其在检测阴沟肠杆菌方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一段桑源阴沟肠杆菌特异序列和引物组Yt4及其在阴沟肠杆菌分子检测方面的应用。所述特异序列如SEQ ID NO.1所示，引物组Yt4包括引物Yt4‑FIP、Yt4‑BIP、Yt4‑F3、Yt4‑B3，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2～5所示。基于所述特异序列可以特异性的检测阴沟肠杆菌，尤其是快速区分其它桑树病害，在阴沟肠杆菌的实际检测应用中具有重要的技术支撑价值和应用前景。所述引物组Yt4及构建的方法和试剂盒，使用方便，适用扩增模板非常多样，且检测结果可靠、特异性强、灵敏度高、可视化，在阴沟肠杆菌枯萎病的早期检测、快速检测方面有很好的效果，对桑枯萎病害的监控、预防和控制方面，具有很好的实际推广应用前景。

Description

桑源阴沟肠杆菌特异序列和引物组Yt4及其在检测阴沟肠杆 菌方面的应用

技术领域

本发明属于病原生物检测技术领域。更具体地，涉及一段桑源阴沟肠杆菌特异序列和引物组Yt4及其在阴沟肠杆菌分子检测方面的应用。

背景技术

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)是肠杆菌属中研究发现最多的一种植物病原，是一种条件致病菌，在高温高湿的条件下，使寄主致病。如阴沟肠杆菌导致榆树湿心病(1945)、椰子萎蔫病（1976）、番木瓜果内黄化病（1987）洋葱腐烂病(1990)等；另外在中国的桑树中，阴沟肠杆菌菌群是桑肠杆菌枯萎病又称桑枯萎病的致病菌（Wang et al，2010），是桑树的一种重要病害，近年来在华南蚕区桑园普遍发生，其发病速度快，蔓延迅速，对蚕桑业生产造成了严重的损失。

由于阴沟肠杆菌属寄主种类繁多、来源复杂，使桑枯萎病的检测和鉴别一直成为桑业研究的重点和难点。同时，桑枯萎病的后期病征与桑青枯病症状相似进一步增加了桑枯萎病检测和鉴别的难度。

目前，桑枯萎病检测技术主要是采用传统的分离技术和PCR技术，耗时长，效率低，敏感度也较低。因此，开展对桑枯萎病的快速诊断技术研究，为系统预防和控制桑枯萎病提供重要技术依据，提高桑树检疫的质量，对桑枯萎病的防治具有重要的科学意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有阴沟肠杆菌以及桑枯萎病的检测诊断技术的缺陷和不足，提供了一段桑源阴沟肠杆菌特异序列，并基于该序列设计了一组阴沟肠杆菌分子的检测引物组，而基于所述引物组可建立用于阴沟肠杆菌枯萎病的LAMP检测产品和方法，能够准确全面地判断样品是否含有阴沟肠杆菌分子，从而实现桑枯萎病的预测监控和防范，在阴沟肠杆菌分子的实际检测以及制备检测阴沟肠杆菌分子相关产品中具有广泛的应用价值和重要意义。

本发明的目的是提供一段桑源阴沟肠杆菌特异序列。

本发明另一目的是提供一组检测阴沟肠杆菌的LAMP引物组Yt4。

本发明再一目的是提供所述特异序列及引物组Yt4在阴沟肠杆菌分子检测方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一段桑源阴沟肠杆菌特异序列，如SEQ ID NO.1所示。

以该序列为靶标可以特异性的检测出阴沟肠杆菌，可用于桑枯萎病的检测诊断。因此所述特异序列在检测阴沟肠杆菌或桑枯萎病方面的应用，以及能特异性所述特异序列的引物组，均应在本发明的保护范围之内。

进一步地，本发明还提供了一组检测阴沟肠杆菌或桑枯萎病的LAMP引物组Yt4，包括引物Yt4-FIP、Yt4-BIP、Yt4-F3、Yt4-B3，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2～5所示。

所述引物组Yt4在检测阴沟肠杆菌或桑枯萎病方面的应用或在制备阴沟肠杆菌或桑枯萎病的检测产品方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

基于该引物组，本发明还提供了一种检测阴沟肠杆菌或桑枯萎病的方法，是以待测样品DNA为模板，利用权利要求4所述引物组Yt4进行恒温扩增或荧光恒温扩增反应，根据反应结果判断待测样品中是否含有阴沟肠杆菌。

优选地，所述扩增反应的条件为：62～64℃反应55～65 min；

更优选地，所述扩增反应的条件为：63℃反应60 min。

优选地，所述LAMP扩增反应的体系（总25 µL）为：2×反应缓冲液 12.5µL，40µmol/L外引物F3 0.5µL，10µmol/L外引物B3 0.5µL，40µmol/L内引物FIP 1µL，40µmol/L内引物BIP 1µL，8U/µL Bst DNA聚合酶1µL，样品DNA 2µL，ddH₂O补足至 25 µL，反应体系混匀后，加入5μL甘油（高压灭菌）密封。

更具体优选地，所述阴沟肠杆菌或桑枯萎病的检测的方法包括以下步骤：

S1.提取待测样品的DNA；

S2.利用权利要求1所述引物组对待测样品DNA进行恒温荧光扩增、显色反应、琼脂糖凝胶电泳三种方法即可判断样品中存在桑枯萎病病原阴沟肠杆菌；

S3.步骤S2所述恒温荧光扩增反应结束后，加入显色液或采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，根据恒温扩增检测仪是否出现S型曲线、显色反应颜色变化（橙红色变成绿色）、是否出现梯度扩增条带三种方法即可判断样品判断待测样品中是否存在阴沟肠杆菌分子。

优选地，所述待测样品可以是桑树茎部、枝条和/或叶子。

另外，反应结果的判断方法具体为：荧光扩增出现S型曲线则待测样品中含有阴沟肠杆菌；或将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定待测样品中含有阴沟肠杆菌；或向扩增产物中加入显色液（如SYBR green I或钙黄绿素），如果扩增产物变色（橙红色变成绿色），则判定待测样品中含有阴沟肠杆菌。

基于该方法，本发明还提供了一种检测阴沟肠杆菌或桑枯萎病的试剂盒，含有上述引物组Yt4。

进一步优选地，所述试剂盒还含有2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、阳性质粒、密封液、无菌水和显示液。

进一步优选地，2×反应缓冲液的组分包括40 mM Tris-HCl（pH8.8）、20 mM KCl、16 mM MgSO₄、20 mM （NH₄）₂SO₄、0.2% Tween20、2.8mM dNTPs 和 1.6 mM甜菜碱（Mbetaine）。

另外，所述试剂盒还可以集成包括DNA提取所需试剂或LAMP扩增反应所需其他试剂。

所述试剂盒的使用方法为：以待测样本DNA为模板，利用Yt4引物组进行恒温扩增或荧光恒温扩增反应（扩增体系和反应条件如上所述），反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段验证结果；所述判定结果的标准为：出现S型曲线、显色液由橙红色变成绿色且凝胶电泳扩增DNA片段呈现梯度扩增，证明存在有病原菌阴沟肠杆菌分子。

环介导等温扩增法( loopmediated isothermal amplification，LAMP )是日本学者Notomi等( 2000)发明的一种新型的核酸体外等温扩增技术（Notomi T, Okayama H,Masubuchi H et al…2000. Loop-mediated isothermal amolification of DNA.Nucleic Acids Research, 28(12): e63）。随着LAMP技术的发展，已广泛应用于农、林、牧、渔、食品以及人类疾病的诊断研究中，并在检测病毒、细菌以及寄生虫等病原检测方面得到突破性进展。但是该种方法涉及多个引物，不仅要求单个引物具有特异性，其组合关系也是解决检测准确性和特异性的关键。且针对特定基因，是否适用该方法，以及基于相关引物以及检测关键条件的研究也是至关重要的。

本发明首次研究得到了一段桑源阴沟肠杆菌特异序列，并成功以该序列为靶基因设计了4条特异性强、灵敏性好的阴沟肠杆菌特异性检测引物组，所述引物组可以将阴沟肠杆菌从桑树病原真菌如桑里白粉病病原菌（Phyllactinia moricola）、桑树细菌青枯病病原劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、桑污叶病病原菌-假尾孢菌属（Pseudocercospora），以及假单胞菌属、芽孢杆菌、克雷伯氏菌、曲霉菌、青霉菌、等各种桑树病原物，以及人源阴沟肠杆菌、阪崎肠杆菌、产气肠杆菌中区分出来，可以实现阴沟肠杆菌的快速检测。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一段桑源阴沟肠杆菌特异序列，基于该序列可以特异性的检测阴沟肠杆菌，尤其是快速区分其它桑树病害，在阴沟肠杆菌的实际检测应用中具有重要的技术支撑价值，可为桑叶的健康生产与资源利用提供保证，在阴沟肠杆菌的检测方面具有很好的应用前景。

进一步地，基于该特异序列本发明设计了一组阴沟肠杆菌分子的检测引物组，基于所述引物组建立了用于阴沟肠杆菌枯萎病的LAMP检测方法和试剂盒产品，能够准确全面地判断样品是否含有阴沟肠杆菌分子，从而实现桑枯萎病的预测监控和防范。

而且，所述LAMP检测方法和试剂盒使用方便，适用的LAMP扩增模板非常多样，适用范围广，可以是多种样品的DNA，桑茎部、枝条、土壤等提取的总DNA为模板，大大增加了检测对象的范围。

重要的是，本发明的特异检测引物和试剂盒均能够在侵染早期就能够特异性的检测出阴沟肠杆菌，且检测结果可靠、易于操作（简单快速）、特异性强、灵敏度高、可视化，可用于阴沟肠杆菌的快速检测，为阴沟肠杆菌枯萎病的早期检测提供了一种简单快速的方法，结果具有可通过肉眼直接观察，可以在桑枯萎病出现明显病症、病害大规模爆发前，检测病株中病原菌的存在及其含量，进而对桑园发病病株等进行及时相应的处理，及时监控灾害的发生以备采取相应的方法措施，具有很好的实际推广应用前景。

附图说明

图1为桑源阴沟肠杆菌获得的特异基因序列示意图。

图2：重组质粒的鉴定电泳图：M：TaKaRa DL5000 Marker：游道1-4：质粒片段，游道5：水。

图3：引物组筛选LAMP在恒温荧光检测仪结果示意图：1：Yt1引物组；2：Yt2引物组；3：Yt3引物组；4：Yt3.1引物组；5：Yt4引物组；6：ddH₂O。

图4：引物组Yt4在LAMP检测方法建立电泳结果示意图。其中， M：TaKaRa DL2000Marker；1：Yt1引物组；2：Yt2引物组；3：Yt3引物组；4：Yt3.1引物组；5：Yt4引物组；6：ddH₂O。

图5：引物组Yt4在LAMP检测方法建立显色反应结果示意图：其中，1：Yt1引物组；2：Yt2引物组；3：Yt3引物组；4：Yt3.1引物组；5：Yt4引物组；6：ddH₂O。

图6：引物组Yt4在不同温度下对桑源阴沟肠杆菌DNA模板扩增电泳结果示意图：1：60℃；2：61℃；3：62℃；4:63℃；5：64℃；6：65℃；7：水。

图7：引物组Yt4在不同温度下对桑源阴沟肠杆菌DNA模板扩增显示反应结果示意图：1：60℃；2：61℃；3：62℃；4:63℃；5：64℃；6：65℃；7：水。

图8：引物组Yt4的LAMP外、内引物浓度比优化在恒温荧光检测仪结果示意图：外、内引物浓度比分别为：1-1：4；2-1：6；3-1：8；4-1：10；5-水；6-阳性对照（质粒）。

图9：引物组Yt4的LAMP外、内引物浓度比优化电泳结果示意图：外、内引物浓度比分别为：1-1：4；2-1：6；3-1：8；4-1：10；5-水；6-阳性对照（质粒）。

图10：引物组Yt4的LAMP外、内引物浓度比优化显示反应示意图：外、内引物浓度比分别为：1-1：4；2-1：6；3-1：8；4-1：10；5-水；6-阳性对照（质粒）。

图11：Yt4引物组对桑树细菌性枯萎病病原LAMP特异性检测在恒温荧光检测仪结果示意图。注：图中 1：Ralstonia solanacearum（青枯劳尔氏菌）； 2：Pseudomonas属（恶臭假单胞菌）；3：Klebsiella属（产酸克雷伯氏菌）；4：Bacillus Cohn（芽孢杆菌）；5：Aspergillus属（曲霉）；6：小粒性菌核病病原菌-肉阜状杯盘菌（Crboria carunculoides）；7：Phyllactinia moricola（桑里白粉病病原菌-桑球针壳）；8：串珠镰刀菌（F.moniliforme）；9：产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）；10：阪崎肠杆菌（Enterobacter Sakazakii）；11：阴沟肠杆菌（寄主：人） ；12：阳性对照（质粒）；13：桑枯萎病枝条总DNA（柳州）； 14：健康桑树枝条总DNA（华南农业大学桑园） ；15：健康桑树根部木质部总DNA（华南农业大学桑园） ；16：水（空白对照）。

图12：Yt4引物组对桑树细菌性枯萎病病原LAMP特异性检测电泳结果示意图。其中，M：TaKaRa DL2000 Marker；泳道1-15： 1：Ralstonia solanacearum（青枯劳尔氏菌）；2：Pseudomonas属（恶臭假单胞菌）；3：Klebsiella属（产酸克雷伯氏菌）；4：Bacillus Cohn（芽孢杆菌）；5：Aspergillus属（曲霉）；6：小粒性菌核病病原菌-肉阜状杯盘菌（Crboria carunculoides）；7：Phyllactinia moricola（桑里白粉病病原菌-桑球针壳）；8：串珠镰刀菌（F.moniliforme）；9：产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）；10：阪崎肠杆菌（Enterobacter Sakazakii）；11：阴沟肠杆菌（寄主：人） ；12：阳性对照（质粒）；13：桑枯萎病枝条总DNA（柳州）； 14：健康桑树枝条总DNA（华南农业大学桑园） ；15：健康桑树根部木质部总DNA（华南农业大学桑园） ；16：水（空白对照）。

图13：Yt4引物组对桑树细菌性枯萎病病原LAMP特异性显色法检测结果示意图。注：1：Ralstonia solanacearum（青枯劳尔氏菌）； 2：Pseudomonas属（恶臭假单胞菌）；3：Klebsiella属（产酸克雷伯氏菌）；4：Bacillus Cohn（芽孢杆菌）；5：Aspergillus属（曲霉）；6：小粒性菌核病病原菌-肉阜状杯盘菌（Crboria carunculoides）；7：Phyllactinia moricola（桑里白粉病病原菌-桑球针壳）；8：串珠镰刀菌（F.moniliforme）；9：产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）；10：阪崎肠杆菌（Enterobacter Sakazakii）；11：阴沟肠杆菌（寄主：人） ；12：阳性对照（质粒）；13：桑枯萎病枝条总DNA（柳州）； 14：健康桑树枝条总DNA（华南农业大学桑园） ；15：健康桑树根部木质部总DNA（华南农业大学桑园） ；16：水（空白对照）。

图14：引物组Yt4灵敏度LAMP检测(DNA浓度）在恒温荧光检测仪结果示意图。其中，1：5.0×10^-1 ng/µL；2：5.0×10^-2 ng/µL；3：5.0×10^-3ng/µL；4：5.0×10^-4 ng/µL；5：5.0×10^-5 ng/µL；6:5.0×10^-6 ng/µL；7：5.0×10^-7 ng/µL；8：水（阴性对照）。

图15：Yt4引物组灵敏度LAMP检测(DNA浓度）电泳结果示意图。其中，M：TaKaRaDL2000 Marker；泳道1-8分别为：1：5.0×10^-1 ng/µL；2：5.0×10^-2 ng/µL；3：5.0×10^-3ng/µL；4：5.0×10^-4 ng/µL；5：5.0×10^-5 ng/µL；6:5.0×10^-6 ng/µL；7：5.0×10^-7 ng/µL；8：水（阴性对照）。

图16：引物组Yt4灵敏度LAMP(DNA浓度）显色法检测结果示意图：注：图中 1：5.0×10^-1 ng/µL；2：5.0×10^-2 ng/µL；3：5.0×10^-3ng/µL；4：5.0×10^-4 ng/µL；5：5.0×10^-5 ng/µL；6:5.0×10^-6 ng/µL；7：5.0×10^-7 ng/µL；8：水（阴性对照）。

图17：引物组Yt4灵敏度LAMP(质粒浓度）在恒温荧光检测仪检测结果示意图。其中，1：5.0×10^-1 ng/µL；2：5.0×10^-2 ng/µL；3：5.0×10^-3ng/µL；4：5.0×10^-4 ng/µL；5：5.0×10^-5 ng/µL；6:5.0×10^-6 ng/µL；7：5.0×10^-7 ng/µL；8：水（阴性对照）。

图18：Yt4引物组灵敏度LAMP检测(质粒浓度）电泳结果示意图。其中，M：TaKaRaDL2000 Marker；泳道1-8分别为：1：5.0×10^-1 ng/µL；2：5.0×10^-2 ng/µL；3：5.0×10^-3ng/µL；4：5.0×10^-4 ng/µL；5：5.0×10^-5 ng/µL；6:5.0×10^-6 ng/µL；7：5.0×10^-7 ng/µL；8：水（阴性对照）。

图19：引物组Yt4灵敏度LAMP(质粒浓度）显色法检测结果示意图。其中，1：5.0×10^-1 ng/µL；2：5.0×10^-2 ng/µL；3：5.0×10^-3ng/µL；4：5.0×10^-4 ng/µL；5：5.0×10^-5 ng/µL；6:5.0×10^-6 ng/µL；7：5.0×10^-7 ng/µL；8：水（阴性对照）。

图20：桑枯萎病在田间的症状。

图21：有阴沟肠杆菌枯萎病发作的桑树茎部；图中标尺为1 cm。

图22：健康桑树在田间的症状。

图23：引物组Yt4荧光LAMP检测各材料在恒温荧光检测仪的结果示意图。其中， 1：健康桑树枝条总DNA（华南农业大学桑园） ；2：健康桑树根部木质部总DNA（华南农业大学；3：患病桑树根际土总DNA（柳城县凤山示范园）；4：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树枝条总DNA；5：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树根部木质部总DNA；6：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树根际土总DNA；7：融安县隘口村患病桑树枝条总DNA；8：融安县隘口村患病桑树根部木质部总DNA；9：柳城县凤山示范园患病桑树枝条总DNA；10：柳城县凤山示范园患病桑树根部木质部总DNA；11：象州县阴沟肠杆菌DNA；12:水（空白对照）；13：顺德阴沟肠杆菌DNA；14：抗青283阴沟肠杆菌DNA；15：柳城县凤山示范园阴沟肠杆菌DNA；16：阳性对照（质粒）。

图24：引物组Yt4荧光LAMP检测各材料电泳结果示意图。其中，M：TaKaRa DL2000Marker；1：健康桑树枝条总DNA（华南农业大学桑园） ；2：健康桑树根部木质部总DNA（华南农业大学；3：患病桑树根际土总DNA（柳城县凤山示范园）；4：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树枝条总DNA；5：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树根部木质部总DNA；6：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树根际土总DNA；7：融安县隘口村患病桑树枝条总DNA；8：融安县隘口村患病桑树根部木质部总DNA；9：柳城县凤山示范园患病桑树枝条总DNA；10：柳城县凤山示范园患病桑树根部木质部总DNA；11：象州县阴沟肠杆菌DNA；12:水（空白对照）；13：顺德阴沟肠杆菌DNA；14：抗青283阴沟肠杆菌DNA；15：柳城县凤山示范园阴沟肠杆菌DNA；16：阳性对照（质粒）。

图25：引物组Yt4荧光LAMP检测各材料在显色法的结果示意图。其中，1：健康桑树枝条总DNA（华南农业大学桑园） ；2：健康桑树根部木质部总DNA（华南农业大学；3：患病桑树根际土总DNA（柳城县凤山示范园）；4：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树枝条总DNA；5：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树根部木质部总DNA；6：琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园患病桑树根际土总DNA；7：融安县隘口村患病桑树枝条总DNA；8：融安县隘口村患病桑树根部木质部总DNA；9：柳城县凤山示范园患病桑树枝条总DNA；10：柳城县凤山示范园患病桑树根部木质部总DNA；11：象州县阴沟肠杆菌DNA；12:水（空白对照）；13：顺德阴沟肠杆菌DNA；14：抗青283阴沟肠杆菌DNA；15：柳城县凤山示范园阴沟肠杆菌DNA；16：阳性对照（质粒）。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 桑源阴沟肠杆菌特异基因序列的获得

利用高通量全基因组测序的方法，桑源阴沟肠杆菌全基因组序列，总共组装出4.73Mb全基因组序列，G碱基数量为1039163 bp，占比28.04%；C碱基数量为1325068 bp，占比28.01% ，GC比例占56.05%，编码4600个基因；A碱基数量为1039163 bp，占比21.95%；T碱基数量为1325068 bp，占比为28%。阴沟肠杆菌在病桑的枝条及根部土壤中均有发现，该桑源阴沟肠杆菌与其他阴沟肠杆菌具有明显差异，与其相似性最高的(AP018340.1)的菌株相似性为97%。经

基于桑阴沟肠杆菌全基因组对比分析，获得其特异基因序列，示意图如图1所示，序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2 基于桑阴沟肠杆菌的特异基因克隆质粒的构建及测序分析

以桑阴沟肠杆菌DNA为PCR扩增模板，利用引物5f/2007r（5f:ggtgtctggacaatctcagt ；2007r:catttcaaccagttacgata ）进行PCR扩增。

PCR扩增产物经琼脂凝胶电泳检测后，在紫外灯下回收特异目的片段，按照DNA快速回收/纯化试剂盒（购自北京鼎国生物技术有限公司）步骤回收目的片段。

载体的连接：回收的目的与pEASY@-Blunt载体连接（体系为：PCR回收产物1 µL ，pEASY@-Blunt载体 1 µL ，dH2O 3 µL）充分混合后在25℃连接15 min 。

连接产物的转化：加连接产物与50 µL刚解冻Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混均，冰浴25min，在42℃ 水浴激活30 s ，立即置于冰上2 min，加入250µL LB培养基，200 rpm、37℃培养1 h，取8 µL 500 mM IPTG 和40 µL 20mg/ml X-gal 混合，均匀涂布在平板上，，待IPTG和X-gal被吸收后，取200µL菌液涂布在平板上，在37℃培养箱中过夜培养。

重组质粒的提取：用枪头挑取大小一致的白色菌落放在LB液体培养基培养，37℃，200 r/min振荡培养14 h 左右。在无菌条件下液体转移到无菌1.5mL的离心管中，参照上海生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行质粒提取。

重组质粒的鉴定：使用引物进行PCR验证（图2），扩增片段送上海生物工程有限公司测序鉴定，用DNAStar软件对克隆测序，测序结果大约2000 bp，为以下实验提供阳性对照。

实施例3 阴沟肠杆菌检测引物设计及LAMP扩增方法的建立

1、引物设计与筛选

基于实施例1获得的桑源阴沟肠杆菌特异基因（序列SEQ ID NO.1所示），设计了大量的引物，经过分析和筛选，最终获得一组具有优异的特异性和灵敏性的引物组，命名为Yt4。该引物组序列如下表1所示：

表1 引物组Yt4序列

2、LAMP扩增方法的建立

（1）LAMP扩增反应温度优化

以5 ng/μL 的桑源阴沟肠杆菌DNA为模板，分别以Yt4引物组为扩增引物，在60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃等6个不同的反应温度下进行LAMP扩增，扩增体系25μL（如表3所示）。

（2）LAMP扩增反应外、内引物浓度比优化

以5 ng/μL 的桑源阴沟肠杆菌DNA为模板，分别以Yt4引物组为扩增引物，使用恒温荧光检测仪进行LAMP扩增，扩增体系见下表2：

表2

（3）优化结果

以分离的桑源阴沟肠杆菌DNA为模板，使用引物组Yt4参照以下表3所示反应体系，在63℃下进行LAMP扩增。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

表3 反应体系：

3、结果判断

引物Yt4引物组：LAMP反应结束后根据恒温荧光检测仪是否显示有S型曲线判定样品中是否含有阴沟肠杆菌，反应管出现S型曲线为阳性，无曲线为阴性；LAMP反应结束后与显色液（核酸荧光染料SYBR Green I）反应，阳性为绿色，阴性为橙红色；琼脂糖凝胶电泳出现梯度扩增为阳性，无扩增条带为阴性。通过S型曲线、显色反应、梯度扩增条带三种方法即可判断样品中存在桑枯萎病病原阴沟肠杆菌。

具体实验结果如图3、4、5所示，5对引物组都能在检测阴沟肠杆菌DNA，但Yt4引物组能在7 min 检测到阴沟肠杆菌DNA，因此选择Yt4引物组进行后面的研究；结果如图6、7所示，选定63℃为Yt4引物组的最佳扩增温度；结果如图8、9、10所示，外引物与内引物比例为1：8时，扩增时间最短且信号强度较强，选定此比例为Yt4最优引物浓度之比。

实施例4 Yt4引物组的特异性检测

1、分别以多种从病株中的根、茎分离到的假单胞菌属DNA 、芽孢杆菌 DNA、克雷伯氏菌DNA等细菌，以及桑树病原真菌的桑里白粉病病原菌（Phyllactinia moricola）、桑树细菌青枯病病原劳尔氏菌DNA、小粒性菌核病病原菌-肉阜状杯盘菌（Crboria carunculoides）、Phyllactinia moricola（桑里白粉病病原菌-桑球针壳）、串珠镰刀菌（F.moniliforme）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、阪崎肠杆菌（Enterobacter Sakazakii）、阴沟肠杆菌（寄主：人）作为对照组，利用Yt4引物组，以实施例3的方法进行荧光扩增，显色反应、琼脂糖凝胶电泳检测。

2、引物的扩增结果分别如附图11、图12、图13所示。结果显示，桑源阴沟肠杆菌特异基因片段质粒和桑枯萎病枝条总DNA在目标位置出现S型曲线，显示结果变绿色，且琼脂糖凝胶电泳该目标位置出现梯度扩增。表明该引物组可以特异性地检测桑源阴沟肠杆菌。

实施例5 Yt4引物组的灵敏性检测

1、提取阴沟肠杆菌的DNA，原始浓度为5 ng/μL。

将上述DNA用1×TE进行稀释，分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍。即得到浓度梯度为5.0×10^-1、5.0×10^-2、5.0×10^-3、5.0×10^-4、5.0×10^-5、5.0×10^-6 、5.0×10^-7ng/μL。

以上述各浓度的DNA为模板，以Yt4引物组，以实施例3的方法进行LAMP荧光扩增、显色反应、琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图14、图15、图16所示，Yg2引物组能检测到病原菌DNA浓度为5.0×10^-3 ng/μL，具有很好的检测灵敏性。

2、提取基于桑源阴沟肠杆菌特异基因的质粒，原始浓度为8 ng/μL。

将质粒浓度用ddH₂O进行稀释，分别稀释10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍。即得到浓度梯度为8.0×10^-1、8.0×10^-2、8.0×10^-3、8.0×10^-4、8.0×10^-5、8.0×10^-6 、8.0×10^-7ng/μL。

将上述的质粒浓度为模板，以Yt4引物组，以实施例3的方法进行LAMP荧光扩增、显色反应、琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图17、图18、图19所示，Yt4引物组能检测到菌液浓度为8.0×10^-3ng/μL，具有很好的检测灵敏性。

以上实施例4和5的特异性和灵敏性实验结果，充分证明了引物Yt4引物组既能够特异性的检测阴沟肠杆菌，又具有很好的检测灵敏性。

实施例6 感染阴沟肠杆菌枯萎病的桑枝和桑茎部、土壤的病原菌以及各地桑源阴沟肠杆菌的检测

1、材料的选定

选取实验材料，包括海南省琼中黎族苗族自治县琼中生态产业园科技园、广西省柳州凤山镇凤山示范园桑园、融安县隘口村等地区患病桑园的桑树茎部和枝条、土壤，以及从广西象州县、柳城县、广东顺德分离的到的桑源阴沟肠杆菌，与无病的桑树茎部、枝条及新鲜的叶子等材料，如附图20～22所示。

按照以下步骤操作：

S1.包含桑树成分的材料总DNA提取

使用鼎国植物基因组DNA提取试剂盒（LOT：69700110）进行DNA的提取，步骤如下：

选取含植物组织材料，使用液氮充分研磨至粉末；1.5 mL离心管中加入800 μL的Lysis Buffer，并添加β-巯基乙醇至终浓度0.1%；加入液氮研磨后的粉末样品，65℃恒温金属浴30分钟至2小时；先使用500 μL酚/氯仿/异戊醇振荡混匀5分钟，后12000 r/min离心10分钟，取上清；加入500μL氯仿，振荡混匀5分钟，后12000 r/min离心10分钟，取上清；加入700 μL的Binding Buffer，混匀；吸取混合液于离心柱中，12000 r/min离心1分钟，弃滤液；加入700 μL的Washing Buffer A， 12000 r/min离心1分钟，弃滤液；加入700 μL的WashingBuffer B，12000 r/min离心1分钟，弃滤液；加入500 μL的Washing Buffer B，12000 r/min，离心1分钟，弃滤液；再次12000 r/min离心2分钟，弃滤液弃收集管；将离心柱装入1.5mL离心管中，加入50 μL TE Buffer，室温放置3分钟，12000 r/min离心2分钟；重复上一步骤，即获得纯度较高的总DNA。

S2.包含桑树根际土壤总DNA提取

称取病株根际土壤0.5 g ,采用TIANamp soil DNA Kit 提取DNA，具体步骤如下：

称取病株根际土壤0.5 g，加入2mL 离心管中，再加入750 µL 缓冲液SA和0.25g玻璃珠，充分振荡。

在加入60 µL 缓冲液SC ，涡旋振荡30 min 。

12000 rpm 离心1min ,转移上清液（约500 µL）至新的2 mL离心管，再加入250 µL缓冲液HA ，充分振荡，4℃放置5 min 。

12000 rpm 离心1min ,转移上清液（约500 µL）至新的2 mL离心管，再加入200 µL缓冲液HB ，充分振荡，4℃放置5 min 。

12000 rpm 离心1min ,转移上清液（约500 µL）至新的2 mL离心管，再加入1200 µL 缓冲液GF颠倒混均 。

将离心管的溶液700 µL转移到吸附柱CB3中，在室温条件下12000 rpm 离心1min,倒掉收集管的废液，在将吸附柱放回收集管（多次过柱）。

向吸附柱CB3中加入500 µL 漂洗液PWS ,在室温条件下12000 rpm 离心1min,倒掉收集管的废液，在将吸附柱放回收集管。

向吸附柱CB3中加入500 µL 70% 乙醇 ,在室温条件下12000 rpm 离心1min,倒掉收集管的废液，在将吸附柱放回收集管。

于12000 rpm 室温离心2 min，取出吸附柱CB3，放于新的1.5 mL离心管，加入50µLCE Buffer 静置5min，12000 rpm 室温离心2 min，收集DNA溶液，-20℃保存。

S3.以Yt4引物组作为引物进行恒温荧光扩增：

以步骤S1、S2得到的各材料提取DNA为模板，用特异性Yt4引物组进行荧光LAMP反应，反应条件：63℃反应60min，反应体系如实施例3所述。

S4.根据步骤S3所述LAMP荧光扩增结果，以及扩增结果的显色反应、琼脂糖凝胶电泳检测，判断待测样品中是否存在阴沟肠杆菌分子。

2、反应结果

如附图23所示，桑肠杆菌枯萎病病发作的桑园的桑枝条、根部、土壤及病原菌的位置均出现S型曲线，可检测出病原菌DNA的存在。

如附图24所示，显示反应结果显示，肠杆菌枯萎病病发作的桑园的桑枝条、根部、土壤及病原菌的位置反应管均变成绿色，可检测出病原菌DNA的存在。

如图25所示，肠杆菌枯萎病病发作的桑园的桑枝条、根部、土壤及病原菌的位置（泳道3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16），而用作对照的新鲜桑枝条则未检测出病原存在（泳道1、泳道2），证明有阴沟肠杆菌枯萎病发作过的桑园，其桑树枝条、根、土壤上都存在有病原菌。说明该引物可用于阴沟肠杆菌枯萎病病害诊断。

由图23、图24、图25结果可知，本发明所述引物组可以将桑源阴沟肠杆菌菌从桑树病原真菌如桑里白粉病病原菌（Phyllactinia moricola）、桑树细菌青枯病病原劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、桑污叶病病原菌（Pseudocercospora），以及假单胞菌属、芽孢杆菌、克雷伯氏菌、曲霉菌、等各种桑树病原物，以及人源阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、阪崎肠杆菌等亲缘种区分开来。并且检测结果可靠、易于操作（简单快速）、特异性强、灵敏度高，可用于阴沟肠杆菌的快速检测，尤其是快速区分其它桑树病害，在阴沟肠杆菌的实际检测应用中具有重要的技术支撑价值，可为桑叶的健康生产与资源利用提供保证。在桑树病害防控时，应考虑桑树枝条在病原菌传播循环中的作用，在桑园管理时，应做好桑枝条的处理工作。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 桑源阴沟肠杆菌特异序列和引物组Yt4及其在检测阴沟肠杆菌方面的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2061

<212> DNA

<213> 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)

<400> 1

caactagagg gtacaaatcg ggcttagagg gggaaaaatg tttgataagc gagatatagt 60

tttaaagggg acaataattg gtacacggaa tgtcctgatt tacttctttc tgtatgtttt 120

ctaatgtcgg tatagacaag agtttgacat agaatgatag atctggattt gaaatcgatg 180

tggagtgcat aaaccattcc ttcatccata gtggaaacat tcaacgccca aacatgattt 240

aaaaagccgg aacaataact tccggctgtt aaatttattg caatttttca atgtcaccat 300

tagttaacaa atcataggct aggaataact ttctgtagtc cgtttttaaa ttgtcatttt 360

cacaaacttt gaactgtggg aaagcttcat tttttacata tttttctaac gaatcatatg 420

agagatgttt tatgttttta attataacaa ataactcttt ctgtttgctt agccctgcat 480

tttttatctc atcaatttca aaaaaatctt ttgccgcatt tactttatct aaaattattg 540

cagatgttat cgcatcaagt ttgccatgcc tttctattct ttgatttaat ctacccaaaa 600

gtttcggtgt taactctaac tgttgaacac tggaggatgc gataatttta gaaaatggaa 660

gtcttaaagt gtttgttgag ccaattatga actcgattgc taatttattt gatatttcgt 720

ttttttcaaa taaataatcc tcaagataat tgagttcttt tatttgagtg aaaacgtatt 780

ttttatcgcc caatgcgact actagattct taccctgctt aacactttct tctaaccggt 840

caaggtcgga aggagaaact aataatgtgt ttaaattacc tttctcgcct tcattaacaa 900

taagtgtttt tatggctctt tgataacgaa gaacatcata cggagacaac ccttcgtkga 960

acagtgctaa tctcattata aatcttagta taattatctg tttctactga agtataagta 1020

acttgcaact gttggtctgt aatctgtttt gattcaacct cttgctcgtt aggtttatgt 1080

tgtatgagga taatcctttc agcagattta cgaccatctt ctttaggtaa ttgagatgaa 1140

aaatccgaaa gcaatttttt tacatttcta tccgttagcg agtaaccaat aaataatatt 1200

gggtttttta tcatgttcga taaaatcttg gcgcttataa ggatggcttt gtcatcatac 1260

ttctcgtaat cttcagtgtt tattattatc gatttagggt ctttaatatc cccatggatt 1320

ttatagagtt cactccaacc aatggtatct tcgaaaaaac cattgttacc tatataaagt 1380

ttaggtgtta tgttttgctc tagcagtaat tcttcgataa aagcatcata gtttgtcgta 1440

ataatcatct tggctttttt tagaagaact ttaaacgagt ttagctcctc ttgattaata 1500

tcatctttaa gttgagttac agagaatctc tggcagatgg aatatttgaa tggggaaatg 1560

ttctcgctaa aaactctttt agcatctaat ccatcaagct tgatagtgtt ttcagtaaac 1620

attcgattga aatccaattc aatctttgaa gcagcttcgg tatagatttt gtgatctaaa 1680

tcagattcat tatcaaatga acttttatgt ttttctttta ttgttaatag ataactataa 1740

aaatctattt ccgggtttgt ttttttccaa tattcatgca gcaattcctc ccaggttgga 1800

taatttttaa gatatctttt tgaaatgcca gaacctatga aaactattgg gtagcttttg 1860

aattcaaata ttttgtctga catgtcaaaa tccttctatt taaacatgat atattgtgtg 1920

tagtatcgta actggttgaa atgtaatgtt aaaactaatg taaaaacgcg ggttaatgat 1980

atttagttct attaaaaaat gctaatgcat gcaaaataag ttattgattc atgaatgctt 2040

tttattacag ggggctgaga a 2061

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物Yt4-F3(Primer Yt4-F3)

<400> 2

gagttctttt atttgagtga aaacg 25

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物Yt4-B3(Primer Yt4-B3)

<400> 3

aagggttgtc tccgtatg 18

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物Yt4-FIP(Primer Yt4-FIP)

<400> 4

gaccggttag aagaaagtgt taagctattt tttatcgccc aatgcg 46

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物Yt4-BIP(Primer Yt4-BIP)

<400> 5

tgtgtttaaa ttacctttct cgcctgttct tcgttatcaa agagcc 46

Claims (9)

1.一种检测阴沟肠杆菌或检测阴沟肠杆菌导致的桑枯萎病的引物组，其特征在于，该引物组能特异性的扩增如SEQ ID NO.1所示的序列；所述引物组为引物组Yt4，由引物Yt4-FIP、Yt4-BIP、Yt4-F3、Yt4-B3组成，其中Yt4-F3、Yt4-B3、Yt4-FIP、Yt4-BIP核苷酸序列依次如SEQ ID NO.2～5所示。

2.权利要求1所述引物组Yt4在非诊断目的检测阴沟肠杆菌方面的应用。

3.权利要求1所述引物组Yt4在检测阴沟肠杆菌导致的桑枯萎病方面的应用或在制备阴沟肠杆菌或阴沟肠杆菌导致的桑枯萎病的检测产品方面的应用。

4.一种检测阴沟肠杆菌导致的桑枯萎病或者非诊断目的的检测阴沟肠杆菌的方法，其特征在于，以待测样品DNA为模板，利用权利要求1所述引物组Yt4进行恒温扩增反应，根据反应结果判断待测样品中是否含有阴沟肠杆菌。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述恒温扩增反应为荧光恒温扩增反应。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，反应结果的判断方法为：荧光扩增出现S型曲线则待测样品中含有阴沟肠杆菌。

7.根据权利要求4或5所述方法，其特征在于，所述扩增反应的条件为62～64℃反应55～65 min；扩增反应体系为：2×反应缓冲液 12.5µL，40µmol/L外引物Yt4-F3 0.5µL，10µmol/L外引物Yt4-B3 0.5µL，40µmol/L内引物Yt4-FIP 1µL，40µmol/L内引物Yt4- BIP 1µL，8U/µL Bst DNA聚合酶1µL，样品DNA 2µL，ddH₂O补足至 25 µL。

8.一种检测阴沟肠杆菌或阴沟肠杆菌导致的桑枯萎病的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述引物组Yt4。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还含有2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、阳性质粒、密封液、无菌水和显示液。

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