CN116804207A - 瓜类蚜传黄化病毒病侵染性克隆载体构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物基因工程分子技术领域，特别涉及瓜类蚜传黄化病毒的侵染性克隆表达载体构建方法及其应用。本发明公开了瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301‑CABYV的构建法所涉及的引物，包括CABYV全序列扩增的七对引物、二次扩增的三对引物。本发明还同时提供了瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301‑CABYV的构建方法：由CABYV全基因组序列、融合的载体Pcb301制备得到Pcb301‑CABYV，所述载体Pcb301‑CABYV带2x35S启动子、Nos终止子。本发明为研究瓜类蚜传黄化病毒病抗性基因定位提供了侵染性克隆载体，为后续揭示植物抗病机制提供了便利。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程分子技术领域，特别涉及瓜类蚜传黄化病毒的侵染性克隆表达载体构建方法及其应用。
背景技术
瓜类蚜传黄化病毒病(Cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV)是一种在自然界中仅能依赖介体蚜虫进行传播种的病毒，CABYV侵染葫芦科作物后，起初会在近基部的老叶上引起褪绿斑，随之叶片增厚，后变为明亮的黄色，接下来症状在新叶上发展，引起花叶症状，叶脉大多仍呈绿色(麦麦提艾力·阿卜杜纳斯尔,等,2020；崔正秀,等,2022)。该病毒在叶片上引起严重的黄化症状，而果实的外部形状则没有明显变化。但当甜葫芦科作物被该病毒侵染在之后，葫芦科作物的平均结果数量会明显降低。由于该病毒病侵染后果实外观变化小，且引起的症状与营养元素缺乏、叶片老化等症状与田间常见生理和其他病害侵染的症状相似，这使得它很容易在田间调查时被忽视，而大面积发病时即造成减产、绝收等影响。
该病毒不能通过机械传播，只能通过蚜虫以循回、持久、非增殖型的方式进行远距离传播。这种传播的局限性造成了在瓜类有关该病毒的抗病机制与抗病基因定位等方面研究的阻碍。目前针对CABYV的检测方法有生物学检测法、血清学检测、RT-PCR技术等(吴洋,等,2015)。主要通过对甜瓜植株症状的观察、在寄主职植物上产生瓜类蚜传黄化病毒病特有症状，结合ELISA与RT-CPR结果检测和鉴定该植物病。
构建植物病毒侵染性克隆载体是在研究病毒的致病性中较为有利的工具，也是研究植物虫传病毒病基因定位中常用的有利手段(郑世玲,等,2012)。侵染性克隆的种类根据选用载体的启动子分为两类，分别是cDNA具有侵染性的体外转录物、具有侵染性的cDNA。前者将病毒全长cDNA置于T7、T3等原核启动子下游，并将获得的克隆之后利用RNA聚合酶在体外转录出有侵染活性的RNA；后者将病毒的全长接于35S启动子的下游，接种于植物且进入细胞后的cDNA进行复制与表达，产生侵染性病毒基因组(田延平,等,2019)。以上两类方法植物病毒侵染性克隆虽易于操作，但构建中存在诸多技术难点：由于植物病毒基因结构差异，对于克隆全长cDNA存在问题；利用病毒全长构建侵染性cDNA克隆涉及到的各项分子方法技专业术性极强，构建工作目前还需探索；RNA病毒载体转入宿主菌时不稳定，易致宿主菌死亡，导致获取侵染性克隆难度加大，目前国内关于RNA病毒侵染性克隆方面的报道有却相对较少。
参考文献
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发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种瓜类蚜传黄化病毒病侵染性克隆载体构建方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建法所涉及的引物：
一、CABYV全序列扩增的七对引物：
CABYV-a-insertF：5’-acaaaagatacgagcgggtgatgc-3’
CABYV-a-insertR：5’-gcaaagactttgggcatcttggaaatg-3’
CABYV-b-insertF：5’-catgccgggtatgctacctg-3’
CABYV-b-insertR：5’-ggatccgaccttgtcgaatcctg-3’
CABYV-c-insertF：5’-gatgtccattcgatagagaagcaggt-3’
CABYV-c-insertR：5’-aggcggtttcggacttccatatc-3’
CABYV-d-insertF：5’-GAGATAGCGTTGTGGAGAGTGGTTC-3’
CABYV-d-insertR：5’-atagagcgctgatttcttcgcct-3’
CABYV-e-insertF：5’-acacacgagttgcaagcattg-3’
CABYV-e-insertR：5’-tgtttgacgacgaactcaccatcag-3’
CABYV-f-insertF：5’-tactcacggcagaaaattcgaggaaca-3’
CABYV-f-insertR：5’-gttgggattgaaattggttatagtccggg-3’
CABYV-g-insertF：5’-tgaagacatttggaaggGtatttcccg-3’
CABYV-g-insertR：5’-GAAACAGGGGGATTCCCCCTGG-3’；
二、二次扩增的三对引物：
CABYV-zju1-F：5’-atggccatggaggccgaattcAAAAGATACGAGCGGGTGATGC
CABYV-zju1-R：5’-ttagctgcTTGATATGCCCGACAGCATCT
CABYV-zju2-F：5’-cgggcatatcaaGCAGCTAAAACAAATGGCCC
CABYV-zju2-R：5’-GTCGTGCCATTCCATCCCGTTGAT
CABYV-zju3-F：5’-ATCAACGGGATGGAATGGCACGA
CABYV-zjut3-R：5’-ccgctgcaggtcgacggatccACACCGAAACGCCAGGGG。
本发明还同时提供了一种瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法：由CABYV全基因组序列，融合的载体Pcb301制备得到Pcb301-CABYV，如图3所示，所述载体Pcb301-CABYV带2x35S启动子、Nos终止子。
CABYV全基因组序列，如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法的改进，包含以下步骤：
(1)用Sal I和Sac I双酶切处理Pcb301，获得Pcb301-cut_SalI_SacI；
以pGBKT7-CABYV为模板，设计全长扩增引物Pcb301-CA-F/Pcb301-CA-R，获得全长扩增片段CABYV-insert(图2)；
(2)以无缝连接技术将全长扩增片段CABYV-insert与Pcb301-cut_SalI_SacI连接，得到载体Pcb301-CABYV(图3)；
(3)将步骤(2)所得的Pcb301-CABYV采用液氮冻融法转化到农杆菌中获得Pcb301-CABYV重组载体的农杆菌菌株。
即，将Pcb301-CABYV质粒以液氮冻融法转入GV3101。
作为本发明的瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法的进一步改进：全长扩增片段CABYV-insert的获取方法为包括以下步骤：
①、采集带有瓜类蚜传黄化病毒的甜瓜叶片研磨过滤后，利用提纯后的病毒液(利用蔗糖密度梯度离心法获得提纯后的病毒液)，提取病毒液中的RNA，并反转录成cDNA，从而获得CABYV-cDNA；
②、根据CABYV保守序列设计七对测序引物，将扩增片段组装获得基因组全长为CABYV-zju；CABYV-zju的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
具体如下：
根据CABYV保守序列设计具有200bp重叠区域的七对测序引物CABYV-a-insertF/CABYV-a-insertR，CABYV-b-insertF/CABYV-b-insertR，CABYV-c-insertF/CABYV-c-insertR，CABYV-d-insertF/CABYV-d-insertR，CABYV-e-insertF/CABYV-e-insertR，CABYV-f-insertF/CABYV-f-insertR，CABYV-g-insertF/CABYV-g-insertR，以CABYV-cDNA为模板分段扩增，扩增获得的片段为CABYV-a，CABYV-b，CABYV-c，CABYV-d，CABYV-e，CABYV-f，CABYV-g，将7个扩增片段组装获得基因组全长为CABYV-zju，如SEQ ID NO.1所示；
③、利用EcoR I和Bam HI双酶切处理pGBKT7，过夜酶切获得pGBKT7-cut_EcoRI_BamHI；
④、分析CABYV-zju全长序列，避开局部区域GC含量高的序列设计三对二次扩增引物CABYV-zju1-F/CABYV-zju1-R，CABYV-zju2-F/CABYV-zju2-R，以CABYV-cDNA为模板扩增，分别对应获得扩增片段CABYV-zju1，CABYV-zju2，CABYV-zju3；
⑤、利用同源重组策略将步骤④所得的扩增片段CABYV-zju1，CABYV-zju2，CABYV-zju3与pGBKT7-cut_EcoRI_BamHI(即，用EcoR I和Bam HI双酶切处理后的pGBKT7)无缝连接，得到重组载体pGBKT7-CABYV；
⑥、以pGBKT7-CABYV为模板，设计全长扩增引物获得CABYV全长扩增片段CABYV-insert；全长扩增片段CABYV-insert的序列如SEQ ID NO.5所示；
全长扩增引物为：
Pcb301-CA-F：5’-aggcctgacctgcaggtcgacACAAAAGATACGAGCGGGTGAT-3’
Pcb301-CA-R：5’-cgatcggggaaattcgagctcACACCGAAACGCCAGGGG-3’。
说明：本发明利用病毒提纯液进行RNA提取，分段测序后拼接获得全长测定序列如NO.1所示，避开GC含量高的局部区域设计克隆片段的引物，最终获得全长扩增片段CABYV-insert。
作为本发明的瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法的进一步改进，所述步骤②中：
以cDNA为模板，以所述七对引物进行PCR扩增，获得重叠200bp的三个片段；
PCR扩增体系为：Kod one PCR Master Mix(1x)25ul，正向引物(10uM each)1.5ul，反向引物(10uM each)1.5ul，加入cDNA模板(100ng)1ul，加灭菌水定容至50ul。反应程序为：98℃5min；98℃10s，60℃5s，68℃5s，35cycles；72℃7min。
作为本发明的瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法的进一步改进，所述步骤④中：
以pGBKT7-CABYV为模板，以三对二次扩增引物进行PCR扩增，获得CABYV全长片段CABYV-insert(图2)；
PCR扩增体系为：Kod one PCR Master Mix(1x)25ul，正向引物(10uM each)1.5ul，反向引物(10uM each)1.5ul，加入cDNA模板(100ng)1ul，DMSO(5％)1ul，甘油1ul，加灭菌水定容至50ul；
反应程序为：98℃15min；98℃10s，60℃5s，68℃15s，35cycles；72℃7min。
本发明还同时提供了瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的用途：将所述Pcb301-CABYV注射入瓜类作物的子叶中，实现侵染瓜类作物，从而大量产生瓜类蚜传黄化病毒的侵染性克隆。
在本发明中：同源重组可使用New England Biolabs(NEB)的试剂HiFiDNA Assembly Master Mix；大肠杆菌可使用全式金CD201-01 DH5a感受态。
本发明以cDNA为模板，以三对引物进行PCR扩增，获得重叠50bp的三个大小不一的片段。
侵染性cDNA克隆可以克服RNA病毒难以进行遗传操作的问题，能够更加有效的实现在分子层面开展RNA病毒的研究。构建瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体，使得对CABYV病毒深入研究成为可能。另外，CABYV为蚜传黄化病毒病，目前已知仅由蚜虫作为介体传播，而蚜虫作为害虫对葫芦科作物本身就存在生物胁迫，葫芦科作物对蚜虫危害和对CABYV病毒危害分别的防御响应机制是否一致未可知，在对葫芦科作物进行抗CABYV基因定位等相关机制研究中，利用瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体对葫芦科进行接种可将蚜虫因素排除，有利于鉴定抗CABYV甜瓜等葫芦科作物和对CABYV病毒响应机制等各项研究的开展。
综上，本发明克服了在原有技术中CABYV基因组难以获得、且高效获得全长序列的问题，利用病毒提纯液提取RNA，避开高GC含量区域设计分段扩增引物；本发明设计采用无缝克隆方法分段克隆并利用获得的片段经同源重组与pGBKT7载体重构得到pGBKT7-CABYV重组载体(图1)，以高效克隆得到CABYV全长序列片段(图2)，并采用同源重组方式与Pcb301载体成功构建得到侵染性克隆载体Pcb301-CABYV(图3)。
本发明的有益效果：
1.本发明改进病毒RNA获取方法，制备瓜类蚜传黄化病毒病的病毒提纯液后，利用富集的病毒液进行总RNA提取，提高后续克隆的成功几率。
2.本发明测序拼接得到了瓜类蚜传黄化病毒的新序列，后发现该病毒基因组全长难以一步克隆至载体质粒，且分段难以与Pcb301载体重组，遂将瓜类蚜传黄化病毒的新序列全长cDNA以分段克隆无缝连接的方法与pGBKT7载体重组，高效克隆CABYV全长cDNA片段。
3.病毒序列的复杂程度对克隆影响较大，本发明的侵染性克隆重组载体构建使用高保真酶，并且避开GC含量高的片段区域设计三对引物进行分段扩增，大大提高了克隆成功几率与构建载体成功的概率。
4.本发明的侵染性克隆载体采用农杆菌介导结合Pcb301载体的方式，可大量产生瓜类蚜传黄化病毒的侵染性克隆，操作简单快捷，成本较低。
5.构建侵染性克隆选取的载体Pcb301中含有2x35s增强型启动子、选择的农杆菌为强感染力农杆菌菌株GV3101，提高了其侵染能力。
本发明为研究瓜类蚜传黄化病毒病抗性基因定位提供了侵染性克隆载体，为后续揭示植物抗病机制提供了便利。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为pGBKT7-CABYV构建示意图。
图2为pGBKT7-CABYV模板克隆CABYV全长胶图。
图3为Pcb301-CABYV构建示意图。
图4为Pcb301-CABYV农杆菌接种甜瓜症状表现，即，三种甜瓜接种Pcb301-CABYV第20天症状；
图4中：
A：三种甜瓜接种Pcb301-CABYV第20天整体情况；
B：三种甜瓜接种Pcb301-CABYV第20天叶部情况。
图5为Pcb301-CABYV农杆菌接种甜瓜RT-PCR检测结果：
1-5：Pcb301-CABYV接种东方蜜(DFM)20dpi检测结果，6：空白对照，7-11：Pcb301-CABYV接种中科蜜(ZKM)20dpi检测结果，12：空白对照，13-17：Pcb301-CABYV接种西周密(XZM)20dpi检测结果，18：空白对照，19-24：Mock组甜瓜检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、CABYV病毒液的富集提纯：
可参照周雪平发表于《微生物学通报》的《马铃薯Y病毒组病毒高产量提取方法的建立》中关于病毒粒子提纯方法进行，本实验在此基础上通过实验摸索，进行了适当的改进。
具体如下：
(1)采集新疆采集的甜瓜蚜传黄化病毒病叶400g，其中25g病叶提取植物总RNA后进行RT-PCR检测确认病叶为瓜类蚜传黄化病毒病病叶，剩下叶片剪碎成0.5cm大小，加入3x抽提缓冲液50ml，搅拌机搅碎之后利用已灭菌的三层纱布进行过滤，尽可能将上清收集到烧杯中；
(2)在第一步提取的上清加入1/4体积的四氯化碳，在冰上搅拌5分钟，静置10分钟后高速8000rpm，离心15分钟；
(3)取出离心管后收集上清，加入6％PEG(6000)，3％NaCl与1％TritonX-100，冰浴自动搅拌至全部药品溶解，冰上或4℃下放置6h或过夜。所有溶液，5000rpm离心60分钟，得沉淀Ⅰ。沉淀Ⅰ用0.5M PB悬浮缓冲液(内含有0.01M MgCl2，为上清体积的1/10)悬浮，10000rpm离心20分钟，分别得沉淀Ⅱ和上清Ⅱ，取上清Ⅱ；沉淀Ⅱ用上清Ⅱ的1/10体积的0.5M PB悬浮缓冲液(内含有0.01M MgCl2)进行悬浮，8000rpm离心30min，取上清。“沉淀用0.5M PB悬浮缓冲液(内含有0.01M MgCl2)悬浮，离心，取上清”这个步骤再重复2次，合并3次收集到的上清；在合并后的上清中加5mL提前配好的含0.3％TritonX-100的30％蔗糖垫(已灭菌)，25000rpm，离心2h；
(4)将步骤(3)所得沉淀用0.5M PB悬浮缓冲液(内含有0.01M MgCl2)15ml悬浮，超高速12000rpm离心30min，取上清。重复1次，合并2次上清摇晃均匀，作为含病毒样品的溶解液；采用不连续密度梯度蔗糖硫酸铯离心法进一步纯化，具体为：先在超速离心管中加入1mL上步所获取的含病毒样品的溶解液，上层梯度为30％蔗糖溶液(已灭菌)，以下依次为含有0.2mol/L、0.4mol/L、0.8mol/L硫酸铯的30％蔗糖溶液(已灭菌)，加的时候是用长针头伸到底部从下开始加。样品加样完毕后后立即以22000rpm，离心3h；
(5)离心管取出后，管中液体上端1/3体积处为病毒层，吸出后放置于新离心管并用0.5M PB悬浮缓冲液(内含有0.01M MgCl2)15ml稀释，超高速离心40000rpm，离心2h。离心后弃掉上清，沉淀用0.5mL 0.01M PB悬浮缓冲液悬浮，即为所提纯病毒溶液。
实施例2、病毒总RNA的提取及cDNA获取(具体步骤参考Easy-do总RNA提取试剂盒说明书)
(1)取200ul实施例1所得的病毒提纯液收集于2ml无RNA酶的离心管中，加入1mlbuffer UR1试剂，涡旋15s后加入200ul氯仿，后剧烈混匀，14000g室温离心3-5分钟；
(2)小心从离心机中取出，由于没有植物组织，液体易混，小心吸取上清液400ul，加入等体积的异丙醇颠倒混匀后将溶液转移至带有吸附柱的收集管中，14000g室温离心30s，弃掉废液；
(3)在收集管的吸附柱中加入600ul washing buffer，14000g室温离心30s后弃废液再重复洗涤一次；
(4)室温空离1min；
(5)将吸附柱放入1.5ml干净离心管中，在膜中央加入20-30ul无菌无RNA酶水，室温放置2分钟后离心14000g室温1min，所得液体即为RNA。
(6)以(5)中提取的RNA为模板，利用反转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RTMaster Mix with gDNA Remover，TOYOBO)，从而获得cDNA-CABYV。
实施例3、CABYV全序列扩增及全长序列测定
(1)根据NCBI上已报道的CABYV保守序列的信息，设计七对引物，其扩增片段依据设计顺序各与前后片段具有200bp左右重叠区域，引物序列为：
CABYV-a-insertF：5’-acaaaagatacgagcgggtgatgc-3’
CABYV-a-insertR：5’-gcaaagactttgggcatcttggaaatg-3’
CABYV-b-insertF：5’-catgccgggtatgctacctg-3’
CABYV-b-insertR：5’-ggatccgaccttgtcgaatcctg-3’
CABYV-c-insertF：5’-gatgtccattcgatagagaagcaggt-3’
CABYV-c-insertR：5’-aggcggtttcggacttccatatc-3’
CABYV-d-insertF：5’-GAGATAGCGTTGTGGAGAGTGGTTC-3’
CABYV-d-insertR：5’-atagagcgctgatttcttcgcct-3’
CABYV-e-insertF：5’-acacacgagttgcaagcattg-3’
CABYV-e-insertR：5’-tgtttgacgacgaactcaccatcag-3’
CABYV-f-insertF：5’-tactcacggcagaaaattcgaggaaca-3’
CABYV-f-insertR：5’-gttgggattgaaattggttatagtccggg-3’
CABYV-g-insertF：5’-tgaagacatttggaaggGtatttcccg-3’
CABYV-g-insertR：5’-GAAACAGGGGGATTCCCCCTGG-3’
(2)以实施例2所得的cDNA-CABYV为模板，以上步七对引物分别进行PCR扩增，获得各与前后片段有200bp左右重叠区域的七个片段。其中PCR扩增体系为：Kod one PCRMaster Mix(1x)25ul，正向引物(10uM each)1.5ul，反向引物(10uM each)1.5ul，加入cDNA模板(100ng)1ul，加灭菌水定容至50ul。反应程序为：98℃5min；98℃10s，60℃5s，68℃5s，35cycles；72℃7min。
从而相应获得七个片段扩增产物：CABYV-a，CABYV-b，CABYV-c，CABYV-d，CABYV-e，CABYV-f，CABYV-g。
CABYV-a：如SEQ ID NO.1的第1～第1074nt所示；
CABYV-b：如SEQ ID NO.1的第829～第1903nt所示；
CABYV-c：如SEQ ID NO.1的第1717～第2786nt所示；
CABYV-d：如SEQ ID NO.1的第2563～第3575nt所示；
CABYV-e：如SEQ ID NO.1的第3339～第4448nt所示；
CABYV-f：如SEQ ID NO.1的第4235～第5175nt所示；
CABYV-g：如SEQ ID NO.1的第5022～第5648nt所示。
(3)将上述七个片段扩增产物送测测序结果利用ContigExpress进行组装，获得新的5648nt的CABYV全基因组序列，如SEQ ID NO.1所示。
实施例4、瓜类蚜传黄化病毒克隆得到全长片段
(1)利用EcoR I和Bam HI双酶切处理pGBKT7，过夜酶切获得pGBKT7-cut_EcoRI_BamHI；
(2)分析实施例3所得的5648nt的CABYV全长基因序列(SEQ ID NO.1)，避开局部区域GC含量高于60％的序列设计二次扩增引物三对CABYV-zju1-F/CABYV-zju1-R，CABYV-zju2-F/CABYV-zju2-R，CABYV-zju3-F/CABYV-zjut3-R，以CABYV-cDNA为模板扩增，获得扩增片段CABYV-zju1，CABYV-zju2，CABYV-zju3；引物序列为：
CABYV-zju1-F：5’-atggccatggaggccgaattcAAAAGATACGAGCGGGTGATGC-3’
CABYV-zju1-R：5’-ttagctgcTTGATATGCCCGACAGCATCT-3’
CABYV-zju2-F：5’-cgggcatatcaaGCAGCTAAAACAAATGGCCC-3’
CABYV-zju2-R：5’-GTCGTGCCATTCCATCCCGTTGAT-3’
CABYV-zju3-F：5’-ATCAACGGGATGGAATGGCACGA-3’
CABYV-zjut3-R：5’-ccgctgcaggtcgacggatccACACCGAAACGCCAGGGG-3’；
扩增体系为Kod one PCR Master Mix(1x)25ul，正向引物(10uM each)1.5ul，反向引物(10uM each)1.5ul，加入cDNA模板(100ng)1ul，加灭菌水定容至50ul。
扩增程序为98℃5min；98℃10s，60℃5s，68℃5s，35cycles；72℃7min；
所得的扩增片段CABYV-zju1，CABYV-zju2，CABYV-zju3的序列分别如序列表的SEQID NO.2～SEQ ID NO.4所示。
(3)利用同源重组策略，将(2)中的3个片段与双酶切载体pGBKT7-cut_EcoRI_BamHI进行无缝连接，以获得重组载体pGBKT7-CABYV，如图1所示。其中，同源重组体系为：HiFi DNA Assembly Master Mix 10u，pGBKT7-cut_EcoRI_BamHI 3ul，(2)中的3个片段回收产物各1ul，加灭菌水体系定容至20ul，混匀后50℃15分钟后即进行转化。
(4)取5ul同源重组体系产物加入50ul融化后的DH5a感受态，冰浴半小时后42度热激45s，后冰浴2分钟，加入700ul LB液体培养基(不含抗生素)，于37℃、200rpm摇床中复苏1h；
(5)高速离心后在超净台中操作，倾倒部分上清液，将沉淀再次吸打混匀，取200ul涂布在LB固体培养基(50ng/ul Kana)上；倒置放于37℃培养14h；
(6)第二天挑菌测序，测序正确(含有SEQ ID NO.1所述序列)的质粒为pGBKT7-CABYV，可用于CABYV全长片段的高效获取，如图2所示。
实施例5、瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆Pcb301-CABYV的构建，如图3所示
(1)以实施例4所得的pGBKT7-CABYV为模板，设计全长扩增引物Pcb301-CA-F/Pcb301-CA-R，获得带有Pcb301接头的扩增片段CABYV-insert，如SEQ ID NO.5所示；其中PCR扩增体系为：Kod one PCR Master Mix(1x)25ul，正向引物(10uM each)1.5ul，反向引物(10uM each)1.5ul，加入cDNA模板(100ng)1ul，DMSO(5％)1ul，甘油1ul，加灭菌水定容至50ul。反应程序为：98℃15min；98℃10s，60℃5s，68℃15s，35cycles；72℃7min；引物序列如下：
Pcb301-CA-F：5’-aggcctgacctgcaggtcgacACAAAAGATACGAGCGGGTGAT-3’
Pcb301-CA-R：5’-cgatcggggaaattcgagctcACACCGAAACGCCAGGGG-3’
(2)用Sal I和Sac I双酶切处理Pcb301，过夜酶切获得Pcb301-cut_SalI_SacI；
(3)利用同源重组策略，将(1)中的片段与全长双酶切载体Pcb301-cut_SalI_SacI进行无缝连接，以获得重组载体Pcb301-CABYV(图3)。其中，同源重组体系为：HiFi DNA Assembly Master Mix 10u，Pcb301-cut_SalI_SacI 2.4u，(1)中的片段CABYV-insert回收产物3ul，加无菌水定容至体系20ul，混匀后50℃15分钟后即进行转化。
(4)取5ul同源重组体系产物加入50ul融化后的DH5a感受态，冰浴半小时后42度热激45s，后冰浴2分钟，加入700ul LB液体培养基(不含抗生素)，于37℃、200rpm摇床中复苏1h；
(5)高速离心后在超净台中操作，倾倒部分上清液，将沉淀再次吸打混匀，取200ul涂布在LB固体培养基(50ng/ul Kana)上；倒置放于37℃培养14h；
(6)第二天挑菌，利用引物对Pcb301-F/R、CABYV-pf/pr分别对菌液进行PCR扩增，体系均为Kod one PCR Master Mix(1x)25ul，正向引物(10uM each)1.5ul，反向引物(10uMeach)1.5ul，加入cDNA模板(100ng)1ul，加灭菌水定容至50ul。扩增程序为98℃5min；98℃10s，60℃5s，68℃5s，35cycles；72℃7min。PCR产物跑胶两对引物对应均有条带的筛选为阳性，测序正确(Pcb301-F/R扩增片段与SEQ ID NO.6所述Pcb301部分序列比对，CABYV-pf/pr扩增片段与SEQ ID NO.1所述片段比对)，提取质粒即为Pcb301-CABYV，如图3所示。
Pcb301-F:GGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAACGT
Pcb301-R:ggggttcagccagcAAGGATCTGGCGTAATAGC
CABYV-pf:aagtcgaggagtcctcaaaactggaatt
CABYV-pr:tcctgtggaactgcccgtgagattgtcct。
实施例6、Pcb301-CABYV侵染性克隆接种
(1)取出于-80℃保存的GV3101，于掌心融化，1ul Pcb301-CABYV的质粒(实施例5所得)加入50ul GV3101；
(2)置于冰上10min，再放入液氮中速冻5min，拿出于37℃金属浴中温热5min，再于冰上静置2min；在超净工作台中加入500ul LB液体培养基(不含抗生素)，于28℃、200rpm摇床中复苏3-4h；
(3)离心后在超净台中操作，倾倒部分上清液，将沉淀再次吸打混匀，取200ul涂布在LB固体培养基(25ng/ul Kana、25ng/ul Rif)上；
(4)倒置放于28℃培养24h后，挑单克隆摇菌后利用引物对Pcb301-F/R进行PCR检测筛选阳性克隆(PCR产物跑胶条带大小正确即为阳性)，加入50％甘油保留菌液于-80℃。
实施例7、侵染性克隆重组载体的接种
(1)将实施例6所得的含有Pcb301-CABYV的农杆菌菌液吸取150ul于50ml LB液体培养基(50ng/ul Kana、50ng/ul Rif)中培养过夜；
(2)经5000g离心10min后收集菌体，用接种缓冲液(10mM MgCl2、10mM MES、100uMMAS)悬浮至OD200＝0.6，静置2h；
(3)用1ml注射器将其接种至三种甜瓜植株的子叶，分别为西周密、东方蜜、中科蜜，每种甜瓜五次重复(编号为XZM1～5、DFM1～5、ZKM1～5)，接种后将植株置于温室中继续培养两至三周。
实施例8、侵染性克隆重组载体侵染性检测
1)、接种培养10天后，接种部位子叶相继开始退绿、黄化，之后上部相邻叶片也相继出现黄化症状；接种培养20天后，系统下部成熟叶片基本黄化，叶脉仍呈绿色，叶片明显增厚，而未接种植株均未出现黄化症状，如图4所示。
2)、接种培养20天后，采集显症植株的顶端叶片提取RNA反转录cDNA后进行RT-PCR检测，发现瓜类蚜传黄瓜病毒检测呈阳性，如图5所示。
3)、利用ELISA-CABYV试剂盒进行检测，利用多功能取样器每株各取0.1g发病系统叶片，研磨碎后加样，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准孔制定标准曲线计算样品中CABYV浓度，标曲为y＝-0.3067+30.2397x(表1)，用空白孔(表2)调零。实验结果判定的临界值(cut off)＝0.58ng/g，换算得OD450超过0.485即为阳性(表3)。
表1 ELISA-CABYV标准孔数据
表2 ELISA-CABYV空白孔测定数据
表3 ELISA-CABYV甜瓜叶片测定数据
上述结果表明，构建的Pcb301-CABYV侵染性克隆可成功侵染甜瓜，本发明为研究瓜类蚜传黄化病毒病抗性基因定位提供了侵染性克隆载体。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建法所涉及的引物，其特征在于：
一、CABYV全序列扩增的七对引物：
CABYV-a-insertF：5’-acaaaagatacgagcgggtgatgc-3’
CABYV-a-insertR：5’-gcaaagactttgggcatcttggaaatg-3’
CABYV-b-insertF：5’-catgccgggtatgctacctg-3’
CABYV-b-insertR：5’-ggatccgaccttgtcgaatcctg-3’
CABYV-c-insertF：5’-gatgtccattcgatagagaagcaggt-3’
CABYV-c-insertR：5’-aggcggtttcggacttccatatc-3’
CABYV-d-insertF：5’-GAGATAGCGTTGTGGAGAGTGGTTC-3’
CABYV-d-insertR：5’-atagagcgctgatttcttcgcct-3’
CABYV-e-insertF：5’-acacacgagttgcaagcattg-3’
CABYV-e-insertR：5’-tgtttgacgacgaactcaccatcag-3’
CABYV-f-insertF：5’-tactcacggcagaaaattcgaggaaca-3’
CABYV-f-insertR：5’-gttgggattgaaattggttatagtccggg-3’
CABYV-g-insertF：5’-tgaagacatttggaaggGtatttcccg-3’
CABYV-g-insertR：5’-GAAACAGGGGGATTCCCCCTGG-3’；
二、二次扩增的三对引物：
CABYV-zju1-F：5’-atggccatggaggccgaattcAAAAGATACGAGCGGGTGATGC
CABYV-zju1-R：5’-ttagctgcTTGATATGCCCGACAGCATCT
CABYV-zju2-F：5’-cgggcatatcaaGCAGCTAAAACAAATGGCCC
CABYV-zju2-R：5’-GTCGTGCCATTCCATCCCGTTGAT
CABYV-zju3-F：5’-ATCAACGGGATGGAATGGCACGA
CABYV-zjut3-R：5’-ccgctgcaggtcgacggatccACACCGAAACGCCAGGGG。
2.一种瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法，其特征在于：由CABYV全基因组序列，融合的载体Pcb301制备得到Pcb301-CABYV，所述载体Pcb301-CABYV带2x35S启动子、Nos终止子。
3.根据权利要求2所述的瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)用Sal I和Sac I双酶切处理Pcb301，获得Pcb301-cut_SalI_SacI；
(2)以无缝连接技术将全长扩增片段CABYV-insert与Pcb301-cut_SalI_SacI连接，得到载体Pcb301-CABYV；
(3)将步骤(2)所得的Pcb301-CABYV采用液氮冻融法转化到农杆菌中获得Pcb301-CABYV重组载体的农杆菌菌株。
4.根据权利要求3所述的瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法，其特征在于：全长扩增片段CABYV-insert的获取方法为包括以下步骤：
①、采集带有瓜类蚜传黄化病毒的甜瓜叶片研磨过滤后，利用提纯后的病毒液，提取病毒液中的RNA，并反转录成cDNA，从而获得CABYV-cDNA；
②、根据CABYV保守序列设计七对测序引物，将扩增片段组装获得基因组；
具体如下：
根据CABYV保守序列设计具有200bp重叠区域的七对测序引物CABYV-a-insertF/CABYV-a-insertR，CABYV-b-insertF/CABYV-b-insertR，CABYV-c-insertF/CABYV-c-insertR，CABYV-d-insertF/CABYV-d-insertR，CABYV-e-insertF/CABYV-e-insertR，CABYV-f-insertF/CABYV-f-insertR，CABYV-g-insertF/CABYV-g-insertR，以CABYV-cDNA为模板分段扩增，扩增获得的片段为CABYV-a，CABYV-b，CABYV-c，CABYV-d，CABYV-e，CABYV-f，CABYV-g，将7个扩增片段组装获得基因组；
③、利用EcoR I和Bam HI双酶切处理pGBKT7，过夜酶切获得pGBKT7-cut_EcoRI_BamHI；
④、分析CABYV-zju全长序列，避开局部区域GC含量高的序列设计三对二次扩增引物CABYV-zju1-F/CABYV-zju1-R，CABYV-zju2-F/CABYV-zju2-R，以CABYV-cDNA为模板扩增，分别对应获得扩增片段CABYV-zju1，CABYV-zju2，CABYV-zju3；
⑤、利用同源重组策略将步骤④所得的扩增片段CABYV-zju1，CABYV-zju2，CABYV-zju3与pGBKT7-cut_EcoRI_BamHI无缝连接，得到重组载体pGBKT7-CABYV；
⑥、以pGBKT7-CABYV为模板，设计全长扩增引物获得CABYV全长扩增片段CABYV-insert；全长扩增片段CABYV-insert的序列如SEQ ID NO.5所示；
全长扩增引物为：
Pcb301-CA-F：5’-aggcctgacctgcaggtcgacACAAAAGATACGAGCGGGTGAT-3’
Pcb301-CA-R：5’-cgatcggggaaattcgagctcACACCGAAACGCCAGGGG-3’。
5.根据权利要求4所述的瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法，其特征在于所述步骤②中：
以cDNA为模板，以所述七对引物进行PCR扩增，获得重叠200bp的三个片段；
PCR扩增体系为：Kod one PCR Master Mix 25ul，正向引物1.5ul，反向引物1.5ul，加入cDNA模板1ul，加灭菌水定容至50ul；反应程序为：98℃5min；98℃10s，60℃5s，68℃5s，35cycles；72℃7min。
6.根据权利要求5所述的瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的构建方法，其特征在于所述步骤④中：
以pGBKT7-CABYV为模板，以三对二次扩增引物进行PCR扩增，获得CABYV全长片段CABYV-insert；
PCR扩增体系为：Kod one PCR Master Mix25ul，正向引物1.5ul，反向引物1.5ul，加入cDNA模板1ul，DMSO(5％)1ul，甘油1ul，加灭菌水定容至50ul；
反应程序为：98℃15min；98℃10s，60℃5s，68℃15s，35cycles；72℃7min。
7.瓜类蚜传黄化病毒侵染性克隆表达载体Pcb301-CABYV的用途，其特征在于：将所述Pcb301-CABYV注射入瓜类作物的子叶中，实现侵染瓜类作物，从而大量产生瓜类蚜传黄化病毒的侵染性克隆。
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