CN107828816A

CN107828816A - 一种酵母‑农杆菌穿梭载体及构建方法和应用

Info

Publication number: CN107828816A
Application number: CN201710987317.2A
Authority: CN
Inventors: 黄昌军; 李正和; 刘勇; 孙凯; 赵丹阳; 于海芹
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2018-03-23

Abstract

本发明公开了一种酵母‑农杆菌穿梭载体及构建方法和应用，属于植物病毒领域。该穿梭载体同时包含能在农杆菌和酵母中稳定复制和表达的元件和选择标记，因此既可以利用酵母高效的同源重组系统进行病毒侵染性克隆构建，又可以利用农杆菌双元载体含有对于在农杆菌属中维持并转化植物细胞、插入植物中所必需的元件完成植物侵染。通过本发明提供的载体和构建方法，在两周时间内即可完成一个大基因组或者复杂基因组病毒侵染性克隆的构建。该载体能迅速、准确的进行病毒侵染性克隆的构建，表明用于快速构建病毒侵染性克隆的酵母‑农杆菌穿梭载体及其使用方法具有十分重要的应用价值。

Description

一种酵母-农杆菌穿梭载体及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种穿梭载体，尤其是一种酵母-农杆菌穿梭载体，还涉及其构建方法和应用，属于植物病毒领域。

背景技术

自从Ahlquist及其同事发现雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus，BMV)的cDNA体外转录本能侵染植物以来，已经有几十种不同的植物RNA病毒利用细菌的RNA聚合酶启动子(如T7，T3和SP6等)进行体外转录构建了侵染性克隆。但这种方法需要有成熟的技巧，良好的分子生物学基础，试验成本较高不适合进行大规模基因突变和遗传操作，及其自身所具备的局限性，如该方法只适用于部分正链(Positive-strand)RNA病毒，对于负链(negative-strand)RNA病毒和部分韧皮部特异的正链RNA并不适用等缺点，一直未被大范围推广应用。随后利用真核生物启动子如花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子驱动病毒基因组，通过质粒线性化之后直接摩擦接种植株叶片或通过基因枪轰击的办法得到具有侵染性的病毒基因组。该方法解决了体外转录RNA不稳定易降解的问题，但质粒线性化的病毒基因组接种效率不高，基因枪轰击成本较高，操作复杂等缺点，限制了该方法的大范围应用。最近通过农杆菌介导的植物表达载体将T-DNA整合到植物细胞中实现插入DNA的转录，为病毒的侵染性克隆开辟了新的途径。将病毒的全长基因组置于植物表达载体的35S启动子下游，通过农杆菌介导的T-DNA插入在植物体内产生有侵染性的病毒基因组很快被应用于一些结构比较简单，基因组较小的正链RNA病毒，如烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)等的病毒侵染性克隆构建。

但对于基因组比较大，结构比较复杂的正链RNA病毒和负链RNA病毒的侵染性克隆构建，仍然面对较多挑战。主要原因是：

1、难以一次性获得完整准确的大片段病毒基因组。因此需要分段扩增通过利用不同的限制性内切酶位点分步连接或者体外装配的策略来构建大片段的病毒基因组，最终将构建好的含有病毒基因组中的连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，进行单克隆鉴定、提取正确连接的重组DNA转化农杆菌。耗时耗力且克隆效率差，成功率低。此外，由于比较大的植物病毒基因组中常常包含多种酶切位点，因此能否选择到合适的用于克隆的限制性内切酶成为制约这种技术发展的最大障碍，而使用体外装配技术需要使用极其昂贵的重组酶来完成基因克隆，无法满足高通量克隆需求。

2、某些病毒序列中存在一些类似原核启动子序列(TTGACA和TATAAT)往往会导致病毒基因组中对大肠杆菌有毒性的蛋白表达，如马铃薯Y病毒属的病毒。一般解决毒性蛋白表达的策略是在潜在的类似原核启动子区域插入内含子序列，干扰病毒中存在的类似原核启动子活性。但由于不同病毒需要的内含子数量和插入的位置不同，同一病毒的不同株系在插入的位置或内含子数量上也可能存在差异，造成构建此类病毒侵染性克隆面临很大困难。

新型的基于酵母同源重组原理的克隆方法可以有效消除酶切位点对克隆策略的限制，具有适用性广、通量高等诸多潜在优点。目前己有报道利用酵母重组原理的克隆方法构建植物病毒的侵染性克隆(参考文献见：1.赵光远等.,利用酵母同源重组系统快速构建Potyvirus病毒侵染性克隆方法.《生命科学研究》，2015：19(6)；2.Yous sef,F.；Marais,A.；Faure,C.；Gentit,P.；Candresse,T.Strategies to facilitate the development ofuncloned or cloned infectious full-length vira l cDNAs:Apple chlorotic leafspot virus as a case study.《Virol.J》.2011,8(488))。基于酵母同源重组原理的克隆系统可以完成病毒基因组片段在酵母中的无缝重组连接和农杆菌之间的穿梭，且操作流程具有通用性，在一定程度上可以满足多样化、高通量的克隆需求。然而令人遗憾的是，已经报道的基于酵母同源重组原理的克隆系统都存在着一些自身无法避免的缺陷。首先，两篇文献中都利用了将植物表达双元载体和酵母表达载体上的不同元件线性化扩增，然后转染酵母细胞进行同源重组，因此每次克隆均需要多个PCR反应扩增不同的元件，不仅增加了PCR扩增过程中引入突变造成元件失活的风险，也提高了克隆成本，降低了克隆的成功率。其次，报道的克隆系统所利用的植物双元表达载体和和酵母表达载体上的元件序列较大，在未有病毒基因组插入时已经超过14Kb。片段越大造成T-DNA整合到植物的难度越大，降低了植物病毒侵染性克隆的侵染效率。第三，报道的克隆系统仅报道适用于正链RNA病毒，是否适用于需要完全忠实于病毒基因组，精确切割起始与终止位点，不能含有任何多余核酸序列的负链RNA病毒的侵染行克隆构建不得而知。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明第一目的在于提供一种酵母-农杆菌穿梭载体；第二目的在于提供一种酵母-农杆菌穿梭载体的构建方法；第三目的在于提供上述酵母-农杆菌穿梭载体在植物病毒的侵染性克隆构建的应用。该载体可以用于快速高效地构建植物病毒的侵染性克隆，为构建基因组较大的正链RNA病毒或负链RNA病毒的病毒侵染性克隆提供了一个新的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种酵母-农杆菌穿梭载体pCB301-2_μ-HDV，该穿梭载体用于快速构建植物病毒侵染性克隆，该穿梭载体包括同时能在农杆菌和酵母中稳定复制和表达的核酸元件和选择标记。

进一步地，包括编码选择标记农杆菌属物种的核苷酸序列的第一核酸元件、带有第一复制起点的核苷酸序列的第二核酸元件、带有编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第三核酸元件、带有第二复制起点的核苷酸序列的第四核酸元件、驱动真核植物中DNA转录的启动子的第五核酸元件、特异切割真核生物中_mRNA序列的核酶的第六核酸元件、终止转录的第七核酸元件、T-DNA区域的核苷酸序列的第八核酸元件、带有编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第九核酸元件和编码选择标记酵母属物种的核苷酸序列的第十核酸元件，上述核酸元件在环状多核苷酸分子上提供并且由不在复制、维持或核酸转移中发挥作用的间隔核苷酸序列分隔。

进一步地，第三核酸元件的复制启动蛋白作用于农杆菌属物种，第九核酸元件的复制启动蛋白作用于酵母属物种，所述第二复制起点与第一复制起点不同并且作用于农杆菌属物种。

进一步地，所述T-DNA区域包含瘤诱导型根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)质粒或根诱生性发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)质粒的T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列。

本发明涉及的一种酵母-农杆菌穿梭载体，该载体含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明涉及的一种酵母-农杆菌穿梭载体的构建方法，包括如下步骤：

步骤(1)、以pGBK-T7载体为模板，用特异性引物2μ ori/F和TRP/R进行高保真DNA聚合酶扩增2μori-TRP DNA片段，PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；

步骤(2)、利用限制性内切酶AfeI消化pCB301-HDV载体，经电泳检测为单一条带，得到线性化载体pCB301-HDV，纯化后备用；

步骤(3)、利用In-Fusion HD Cloning Kit将纯化的DNA片段快速定向克隆到线性化载体pCB301-HDV中，得到阳性克隆pCB301-2μ-HDV。

进一步地，步骤(1)之前还包括：

设计引物2μori/F和TRP/R，两个引物的5’端包含有15个碱基的序列与pCB301-HDV载体AfeI位点的序列同源，其中，2μori/F：agatctcagtaaagcGAAAAGTGCC ACCTGAACGA；TRP/R：gggggttcagccagcAAGGATCTGGCGTAATAGCG。

本发明涉及的上述酵母-农杆菌穿梭载体的构建方法构建得到的酵母-农杆菌穿梭载体。

本发明涉及的上述酵母-农杆菌穿梭载体在植物病毒的侵染性克隆构建的应用，包括如下步骤：

步骤(1)、根据目的病毒基因组的特点设计引物进行病毒基因组PCR扩增，其特征在于，优选的是病毒基因组可以单个PCR一次扩增，也可以多个PCR分段扩增；

步骤(2)、酶切线性化载体pCB301-2μ-HDV；

步骤(3)、酵母同源重组构建病毒侵染性克隆；

将步骤(1)和步骤(2)中得到的线性化片段转染酵母细胞，通过选择性培养基筛选重组质粒，通过酶切验证和序列测定确定重组质粒构建的正确性；优选的是步骤(1)和步骤(2)中得到的所有线性化片段之间至少需要15bp的序列同源；

步骤(4)、病毒侵染性克隆的农杆菌转化和接种；

将步骤(3)中得到的含有病毒侵染性克隆的阳性质粒导入农杆菌，注射接种4-6叶充分展开的苗龄期的植株；

步骤(5)、病毒侵染性克隆的侵染性测定；

接种后连续每天观察植株是否表现出症状。待植株出现症状后，挑选接种的供试植株病毒侵染性克隆侵染性测定；病毒侵染性克隆侵染性测定方法为血清学检测、分子生物学检测或者蛋白质免疫印迹；

血清学检测时，采集系统叶，利用目的病毒试纸条或者病毒抗体进行ELISA检测，呈阳性则表明为病毒已经成功侵染；

分子生物学检测时，利用目的病毒基因组特异引物，通过RT-PCR检测样品是否感染病毒：Trizol法提取系统叶的总RNA，反转录合成第一链cDNA。以cDNA为模板，用病毒基因组特异引物进行PCR扩增，以构建的病毒侵染性克隆质粒作为阳性对照，健康普通烟作为阴性对照。若获得和阳性对照大小一致的特异性条带，而阴性对照无条带，表明为病毒已经成功侵染；

蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测时，采集目的病毒侵染性克隆接种并产生系统性病毒症状的叶片，提取叶片总蛋白，用目的病毒的特异性抗体进行Western Blot分析，若能检测到目的病毒特导的结构蛋白条带，而阴性对照无条带，表明为病毒已经成功侵染。

进一步地，步骤(1)中，

单个PCR一次扩增病毒基因组的全长(单个供体DNA)克隆：对于病毒基因组比较小，一次性可以得到全长病毒基因组的植物病毒，以反转录得到的cDNA作为模板，使用特异引物进行PCR扩增。病毒基因组正向引物：5'-pCB301-2μ-HDV酶切后3’末端35bp同源序列+病毒基因组特异性正向扩增引物-3'，病毒基因组反向引物：5'-pCB301-2μ-HDV酶切后5’末端35bp同源序列+病毒基因组特异性反向扩增引物-3'。扩增结束后，将PCR产物电泳检测后切胶回收目的片段，纯化后备用

多个PCR分段扩增病毒基因组的分段PCR(多个供体DNA)克隆：对于病毒基因组比较大，一次性难以获得全长病毒基因组的的植物病毒，可以设计引物分段扩增病毒的基因组进行克隆。本发明优选的用于多供体DNA克隆的PCR扩增引物设计原则为：以三供体病毒DNA片段拼接克隆为例，分别为病毒片段A、病毒片段B、病毒片段C，设定拼接顺序由5'至3'，方向分别为:病毒片段A、病毒片段B、病毒片段C时:病毒片段A正向引物:5'-pCB301-2μ-HDV酶切后3’末端35bp同源序列+病毒片段A特异性正向扩增引物-3'，病毒片段A反向引物:5'-至少包含16bp病毒片段B 5’端同源序列的位置设计病毒片段A特异性反向扩增引物-3'，病毒片段B正向引物:5'–至少包含16bp病毒片段A 3'端同源序列的位置设计病毒片段B特异性正向扩增引物-3'，病毒片段B反向引物:5'-至少包含16bp病毒片段C 5’端同源序列的位置设计病毒片段B特异性反向扩增引物-3'，病毒片段C正向引物:5'-至少包含16bp病毒片段B 3'端同源序列的位置设计病毒片段C特异性正向扩增引物-3'，病毒片段C反向引物:5'-pCB301-2μ-HDV酶切后5’末端35bp同源序列+病毒片段C特异性反向扩增引物-3'。

所述pCB301-2μ-HDV酶切后3’末端35bp同源序列为本发明得到的pCB301-2μ-HDV载体中酶切位点3'端正义链末端最后35bp DNA序列，方向为5'至3'；所述p CB301-2μ-HDV酶切后5’末端35bp同源序列为本发明得到的pCB301-2μ-HDV载体中酶切位点5'端反义链末端最后35bp DNA序列，方向为5'至3'；所述至少16bp病毒片段5’端同源序列指相应病毒片段5'端反义链末端最后16bp DNA序列，方向为5'至3'；所述至少16bp病毒片段3’端同源序列相应病毒片段3'端正义链最后16b p DNA序列，方向5'至3'。

步骤(2)中、利用限制性内切酶消化pCB301-2μ-HDV载体，经电泳检测为单一条带，得到线性化载体pCB301-2μ-HDV，纯化后备用；

步骤(3)中，将酶切线性化载体pCB301-2μ-HDV和步骤(1)中得到的病毒基因组片段利用LiA_c法转入酵母感受态细胞，方法如下：

1)酵母菌株的活化：取-80℃保存的Y2H Gold酵母菌株在YPDA平板上划线，30℃倒置培养3～5天。

2)挑取在YPDA平板上的酵母菌Y2H Gold单菌落到加入5mL YPDA液体培养基的试管中，30℃摇床300rpm/min振荡培养至稳定期OD₆₀₀>1.5(约12～16h)。

3)将上步培养液转移至适量的YPDA培养基中(每个转化所用的感受态细胞约需1～1.5mL的酵母培养液)，使初始OD₆₀₀＝0.2～0.3。于30℃摇床(250rpm/min)培养4～6h，至OD₆₀₀约为0.7～1.5。

4)将酵母培养液4000rpm/min室温离心5min，弃上清液。

5)以每个转化加入0.1mL无菌ddH2O的比例，加入无菌ddH2O重悬细胞，4000rpm/min室温离心5min，弃上清液。

6)以每个转化加入0.5mL 100mM LiAc的比例，加入100mM LiAc重悬细胞，4000rpm/min室温离心5min，弃上清液。

7)以每个转化加入0.5mL 100mM LiAc的比例，加入100mM LiAc重悬细胞，30℃水浴5min。

8)42℃热击15min后，室温下以4000rpm/min离心5min，收集酵母细胞。

9)在沉淀中按顺序加入以下溶液(一个转化)：240μL PEG(50％,w/v)，36μL 1MLiAc，50μL ssDNA(2mg/mL，需提前煮沸变性10min，置于冰上)，20μL无菌ddH2O，5μL DNA(可同时转化多种质粒，每种100ng-5μg)。

10)室温下以8000rpm/min离心2min沉淀酵母细胞，去上清；在沉淀中加入200μLddH2O，轻柔吹打悬浮。

11)取l00μL细胞悬浮液涂布于缺少Trp的培养基上(SD/-Trp)，30℃倒置培养3-5天，直至菌落出现。

挑取单菌落，利用病毒基因组特异引物进行菌液PCR鉴定，筛选出阳性克隆后进行摇菌，利用酵母质粒小量提取试剂盒提取酵母质粒，步骤如下：

1)柱平衡步骤：向吸附柱CP2中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取l-5mL酵母培养液，12000rpm离心1min，尽量吸尽上清。

3)利用Lyticase破除酵母细胞壁：向已收集的菌体中加入300μL山梨醇buffer，再加入50U Lyticase，充分混匀，并在摇床上30℃，200rpm培养1h。

4)4000rpm离心10min，尽量吸尽上清，加入250μL YPl，重悬沉淀。

5)向吸附柱CP2中加入600μL PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6)重复步骤5。

7)空离：12000rpm离心2min。

8)将吸附柱CP2放置于一个干净的离心管中，并向吸附膜中间滴加50～100μL洗脱缓冲液。室温静置2min后，12000rpm离心2min洗脱DNA。

获得酵母质粒后，为验证构建的重组质粒的正确性，可以选取来源于病毒基因组序列的酶切位点和来源于载体pCB301-2μ-HDV的酶切位点，进行酶切验证或者进行质粒测序验证。

优选的是，所述ssDNA为将经过变性处理的酶切线性化载体pCB301-2μ-HDV和步骤1中得到的病毒基因组片段的DNA混合物，线性化载体pCB301-2μ-HDV与病毒基因组片段的DNA的分子量比例为1:1；

步骤(4)中，将酵母质粒验证无误后，电击转入到农杆菌EHA105中，涂布于YEP平板(25μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)，28℃培养3天。PCR筛选出阳性克隆接种于含有相应抗生素的液体YEP培养基(下同)，28℃振荡培养，过夜培养的农杆菌以一定的比例转接至含MES(10mM,PH 5.6)和乙酰丁香酮(AS,20μM)的YEP液体培养基，振荡培养至对数生长期。当农杆菌菌液培养至OD₆₀₀≈1.0时，4000rpm离心10min收集菌体，用接种缓冲液重悬菌体，测量其OD值并使OD₆₀₀≈0.8。室温静置3h后，将处理好的农杆菌悬液浸润4～5叶期的供试植株。浸润后将植株置于25℃，光照16h的温室中继续培养。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

相对于已有的用于植物病毒侵染性克隆构建的载体和方法有以下优点：

1、作量小，构建简易，周期性短，无需对多片段供体DNA片段进行体外装配，可以进行大规模基因突变和遗传操作；

2、不仅可以用作基因组较小的植物病毒单次PCR扩增产生的单个供体DNA片段的快速克隆，而且可用于基因组较大的植物病毒分段PCR扩增产生的多个供体DNA片段的无缝拼接和一步式克隆；

3、通过非连接酶依赖型的酵母同源重组方法构建植物病毒的侵染性克隆，供体DNA片段不需要限制性内切酶处理，因此彻底消除了病毒基因组内在酶切位点对于克隆策略选择的限制，可用于几乎所有植物病毒的侵染性克隆构建；

4、提供的载体克隆效率高，克隆数目多且克隆的阳性率和准确率高；

5、提供的载体同时在酵母和农杆菌中复制，从酵母中获得的重组质粒可直接转入农杆菌，省去了转化大肠杆菌步骤，避免了某些病毒基因组容易产生对大肠杆菌有害的毒性蛋白，需要插入内含子以维持病毒的稳定复制的难题；

6、产生的穿梭载体pCB301-2μ-HDV序列小，有利于遗传操作和携带较大的供体DNA片段；

7、产生的穿梭载体pCB301-2μ-HDV在使用过程中可以直接酶切产生线性化载体，不需要将植物表达双元载体和酵母表达载体上的不同元件线性化PCR扩增，方便、高效并降低了PCR可能引入突变的可能。

8、提供的载体上含有丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus，HDV)的核酶序列，以便在体内转录产生完全忠实于病毒末端的全长RNA，因此该载体不仅适用于正链RNA病毒侵染性克隆的构建，特别适用于需要精确切割不含有多余核苷酸的负链RNA病毒侵染性克隆的构建。

附图说明

图1为本发明的酵母-农杆菌穿梭载体pCB301-2μ-HDV的质粒图谱；

图2为构建本发明的酵母-农杆菌穿梭载体pCB301-2μ-HDV的示意图；

图中：2μ-ori/F和TRP/R为引物2μ ori/F(SEQ ID No.2)和TRP/R(SEQ ID No.3)；p35S²为双35s启动子；TRP1为色氨酸选择标记基因；OriV为RK2复制起始位点；TrfA为复制起始蛋白；HDRz为丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus，HDV)的核酶序列；tNos为Nos终止子；2μ ori为酵母2μ复制起始位点；Kan^R为卡那霉素抗性基因；LB为T-DNA左臂序列；RB为T-DNA右臂序列。

图3为利用酵母同源重组一步法构建马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY)cDNA侵染性克隆及其侵染性克隆侵染性检测；

图3中，3(a)为PVY的基因组结构。病毒基因组的各个功能基因、5'病毒基因组连接蛋白(VPg)和3’poly(A)尾结构((A)n)的位置如图中显示；

3(b)为酵母同源重组构建PVY侵染性克隆策略的示意图。通过将3个序列部分重叠(灰色阴影框所示)的PVY cDNA片段(病毒片段A，3311个碱基对；病毒片段B,3359个碱基对；病毒片段C，3259个碱基对)和线性化的pCB301-2μ-HDV载体共转化酵母重组构建PVY侵染性克隆pCB-2μ-PVY；

3(c)为利用BamHI和PstI对5个pCB-2μ-PVY重组质粒的双酶切验证。标记为“M”的点样孔代表分子量标尺(DNA size marker)，10000、6000、3000、1500bp的位置标记在图片左侧；

3(d)为利用酵母同源重组构建的PVY侵染性克隆接种15天后的症状(图中标记为PVY)，Mock为未受PVY感染的健康植物；

3(e)为利用PVY外壳蛋白(图中标记为CP)的特异性抗体对进Western Blot检测，图中PVY泳道为PVY系统感染的叶片组织中提取的总蛋白，Mock泳道为未受PV Y感染的健康植物的总蛋白。考马斯蓝色染色的Rubisco大亚基(图中标记为Rub L)用于校正蛋白质上样量一致的内参。

图4为利用酵母同源重组构建苦苣菜黄网病毒(Sonchus yellow net virus，SYNV)cDNA侵染性克隆及其侵染性克隆侵染性检测；

图4中，4(a)显示SYNV反义基因组的示意图；6个病毒基因(N,P,SC4,M,G,L)位于5’端引导序列(le)和3’端拖尾序列(tr)之间；

4(b)为基于酵母同源重组克隆策略的示意图；四个有部分重叠序列的SYNV cDNA片段(病毒片段A,3,584个碱基对；病毒片段B,3637个碱基对；病毒片段C,3370个碱基对；病毒片段D,3439个碱基对)和线性化的pCB301-2μ-HDV载体。组装后病毒cDNA精确定位于35S启动子(35S²)和HDV核酶(HDRz)之间；

4(c)为利用SalI和NotI对10个重组质粒的双酶切验证。标记为“M”的点样孔代表分子量标尺(DNA size marker)，10000、6000、3000、1500bp的位置标记在图片左侧；

4(d)为利用酵母同源重组构建的SYNV侵染性克隆接种35天后的症状(图中标记为SYNV)，Mock为未受SYNV感染的健康植物；

4(e)为利用SYNV的特异性抗体对进行Western Blot检测，图中SYNV泳道为SYNV系统感染的叶片组织中提取的总蛋白，Mock泳道为未受SYNV感染的健康植物的总蛋白；考马斯蓝色染色的Rubisco大亚基(图中标记为Rub L)用于校正蛋白质上样量一致的内参。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明提供的一种用于快速构建植物病毒侵染性克隆的酵母-农杆菌穿梭载体及其构建和使用方法。其发明构思是，将农杆菌双元表达载体和酵母中稳定复制和表达的元件和选择标记整合到一个载体中，使其同时包含能在农杆菌和酵母中稳定复制和表达的元件和选择标记，因此既可以利用酵母高效的同源重组系统进行病毒侵染性克隆构建，又可以利用农杆菌双元载体含有对于在农杆菌属中维持并转化植物细胞、插入植物中所必需的元件完成植物侵染，因此可以快速、高效的构建植物病毒的侵染性克隆。

下面结合实例和附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。

如无特殊说明，下述各实施例使用的均为常规方法；如无特殊说明，所用的试验材料均为自常规生化试剂公司购买得到的。植物材料为本氏烟(N.benthamiana)、栽培烟草(N.tabacum)均来自云南省烟草农业科学研究院。病毒材料PVY和SYNV病毒来自云南省烟草农业科学研究院。PVY和SYNV的cDNA通过常规方法提取病毒侵染的栽培烟草(N.tabacum)和本氏烟(N.benthamiana)叶片总RNA并利用反转录试剂盒获得。

酵母载体pGBK-T7，酵母菌株Y2H Gold和In-Fusion HD Cloning Kit购自Clontech公司，酵母质粒小量提取试剂盒购自Tiangen公司，农杆菌EHA105，RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司；大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5α、限制性内切酶、M-MuLVReverse Transcriptase Kit反转录试剂盒、DNA size Marker、T4DNA聚合酶及T4DNA连接酶、卡拉霉素、壮观霉素均购自大连宝生物公司和R oche公司；KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶购自Toyobo公司。

实施例1

1、酵母-农杆菌穿梭载体pCB301-2μ-HDV载体的结构

本实施例的酵母-农杆菌穿梭载体pCB301-2μ-HDV载体，如图1所示，该穿梭载体同时包含能在农杆菌和酵母中稳定复制和表达的元件和选择标记，因此既可以利用酵母高效的同源重组系统进行病毒侵染性克隆构建，又可以利用农杆菌双元载体含有对于在农杆菌属中维持并转化植物细胞、插入植物中所必需的元件完成植物侵染。

含以下核酸元件：a)包含编码选择标记的核苷酸序列的第一核酸元件，所述选择标记农杆菌属物种中有功能；b)包含第一复制起点的核苷酸序列的第二核酸元件，所述第一复制起点在大肠杆菌和农杆菌属物种中有功能；c)包含编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第三核酸元件，所述复制启动蛋白在农杆菌属物种中有功能；d)包含第二复制起点的核苷酸序列的第四核酸元件，所述第二复制起点与第一复制起点不同并且在农杆菌属中有功能；e)包含能在真核植物中驱动DNA转录的启动子的第五核酸元件；f)包含能在真核生物中特异切割mRNA序列的核酶的第六核酸元件；g)包含能在真核植物中终止转录的第七核酸元件；h)T-DNA区域的核苷酸序列的第八核酸元件，所述T-DNA区域包含瘤诱导型根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)质粒或根诱生性发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)质粒的T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列；i)包含编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第九核酸元件，所述复制启动蛋白在酵母属物种中有功能；j)包含编码选择标记的核苷酸序列的第十核酸元件，所述选择标记在酵母属物种中有功能；k)和其中将上述核酸元件在环状多核苷酸分子上提供并且由不在复制、维持或核酸转移中发挥作用的间隔核苷酸序列分隔；

2、酵母-农杆菌穿梭载体pCB301-2μ-HDV的构建

pCB301-HDV载体(为GenBank:JN029690.1)在文献“姚敏，张天奇，田志超，王源超，陶小荣；农杆菌介导的CMV侵染性克隆及2b缺失突变体构建；中国农业科学2011,44(14):3060-3068”中公开过，公众可从云南省烟草农业科学研究院获得。

如图2所示，本实施例的酵母-农杆菌穿梭载体pCB301-2μ-HDV的构建过程包括如下步骤：

(1)设计引物2μori/F agatctcagtaaagcGAAAAGTGCCACCTGAACGA(SEQ ID No.2)和TRP/R gggggttcagccagcAAGGATCTGGCGTAATAGCG(SEQ ID No.3)，其引物特征包括引物的5’端包含有15bp的序列与pCB301-HDV载体AfeI酶切后5’末端和3’末端的15bp序列同源，可用于重组克隆；

(2)以pGBK-T7载体为模板，用特异性引物2μ ori/F和TRP/R进行高保真DNA聚合酶扩增2μori-TRP DNA片段，PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；

(3)利用限制性内切酶AfeI消化pCB301-HDV载体，经电泳检测为单一条带，得到线性化载体pCB301-HDV，纯化后备用；

(4)利用In-Fusion HD Cloning Kit将纯化的2μori-TRP DNA片段快速定向克隆到线性化载体pCB301-HDV中，得到阳性克隆pCB301-2μ-HDV并进行酶切鉴定，对酶切鉴定无误的克隆进行测序，确定pCB301-2μ-HDV正确装配。

图2中，左上角表示利用限制性内切酶AfeI消化pCB301-HDV载体，得到线性化载体pCB301-HDV；图中右上角表示利用特异性引物2μ ori/F和TRP/R进行高保真D NA聚合酶扩增得到线性化2μori-TRP DNA片段；图中左下角表示利用In-Fusion HD Cloning Kit将线性化2μori/-TRP DNA片段快速定向克隆到线性化载体pCB301-HD V中，得到阳性克隆pCB301-2μ-HDV。

3、利用pCB301-2μ-HDV载体在酵母中同源重组一步法构建马铃薯Y病毒(potatovirus Y，PVY)cDNA侵染性克隆

利用上述pCB301-2μ-HDV载体在酵母中同源重组一步法构建马铃薯Y病毒(potatovirus Y，PVY)cDNA侵染性克隆，如图3所示。

PVY基因组为单链正义RNA病毒，长约9.7kb，如图3(a)所示。由于病毒序列中存在一些类似原核启动子序列(TTGACA和TATAAT)会导致病毒基因组中对大肠杆菌有毒性的蛋白表达，常规的利用大肠杆菌亚克隆来进行病毒侵染性克隆构建方法面临较大挑战。一般解决毒性蛋白表达的策略是在潜在的类似原核启动子区域插入内含子序列，干扰病毒中存在的类似原核启动子活性。这种方法费时费力，并有影响病毒侵染性克隆侵染效率的风险。PVY基因组中3’poly(A)尾结构对于病毒基因组的稳定性至关重要，因此为了保证有完整功能3’poly(A)，利用去除HDV元件的pCB301-2μ-HDV载体构建完全忠实于野生型PVY病毒基因组的侵染性克隆。

利用pCB301-2μ-HDV载体一步法构建PVY侵染性克隆包括如下步骤：

步骤(1)、酶切线性化载体pCB301-2μ-HDV：利用限制性内切酶StuI和SacI消化pCB301-2μ-HDV载体，去除HDV元件，经电泳检测为两条特异条带，回收纯化得到片段较大的DNA得到线性化载体，纯化后备用；

步骤(2)、提取的感染PVY的普通烟总RNA，使用Oligo dT-Adapter作为反转录引物，合成cDNA。以反转录得到的cDNA作为模板，使用3对特异引物

PVY-A-2U/F 5’-cctctatataaggaagttcatttcatttggagaggGAAATTAAAACAACTCAATACAACA-3’(SEQ ID No.4)

PVY-A/R 5’-TATTGCCTGACACACTGCCA-3’(SEQ ID No.5)

PVY-B/F 5’-ATCTTTAGGCGTTTGCCAAC-3’(SEQ ID No.6)

PVY-B/R 5’-ACAGGGAAATCCTTTGGCATC-3’(SEQ ID No.7)

PVY-C/F 5’-TTTTACCGATCAAAGGCAGAGAC-3’(SEQ ID No.8)

PVY-C-2U/R 5’-tcttaagaaactttattgccaaatgtttgaacgatcTCTCCTGATTGAAGTTTACAGTCAC-3’(SEQ ID No.9)

对全长cDNA分成三段3000bp左右的片段分别进行PCR扩增，其序列分别命名为PVY-A-2U、PVY-B、PVY-C-2U，如图3(b)所示。

步骤(3)、将切线性化载体pCB301-2μ-HDV和片段PVY-A-2U、PVY-B以及PVY-C-2U利用LiAc法转入酵母感受态细胞，方法如下：

3)将上步培养液转移至适量的YPDA培养基中(每个转化所用的感受态细胞约需1～1.5mL的酵母培养液)，使初始OD₆₀₀＝0.2～0.3。于30℃摇床(250rpm/min)培养4^～6h，至OD₆₀₀约为0.7～1.5。

4)将酵母培养液4000rpm/min室温离心5min，弃上清液。

步骤(4)、挑取单菌落，利用PVY特异引物

PVY-VPg/F 5’-GGGAAAAATA AATCCAAAAG-3’(SEQ ID No.10)

PVY-VPg/R 5’-TTCATGCTCC ACTTCCTGTT TTG-3’(SEQ ID No.11)

为引物进行进行菌液PCR鉴定，筛选出阳性克隆后进行摇菌，利用酵母质粒小量提取试剂盒提取酵母质粒，步骤如下：

2)取l-5mL酵母培养液，12000rpm离心1min，尽量吸尽上清。

3)利用Lyticase破除酵母细胞壁：向已收集的菌体中加入300μL山梨醇buffer，再加入50ULyticase，充分混匀，并在摇床上30℃，200rpm培养1h。

4)4000rpm离心10min，尽量吸尽上清，加入250μLYPl，重悬沉淀。

6)重复步骤5)。

7)空离：12000rpm离心2min。

提取的酵母质粒命名为pCB-2μ-PVY。为验证构建的重组质粒的正确性，随机选取5个质粒利用BamHI和PstI进行酶切验证。结果表明，5个重组质粒经过酶切得到四条符合预期的特异条带，说明重组质粒构建正确，如图3(c)所示。为更一步确定重组质粒的正确性，挑选一个克隆送样测序，测序结果表明：所构建的PVY侵染性克隆全长为9703bp(不含polyA)，而polyA长度为23bp，NCBI Blast和DNASTAR MegAlign软件分析显示，该序列与GenBank所收录的其它PVY全长序列的核苷酸完全一致，可以确认本研究获得了精确的PVY全长cDNA克隆。

4、PVY侵染性克隆的农杆菌转化、培养及浸润接种植物

将酵母质粒pCB-2μ-PVY经酶切鉴定无误后，电击转入到农杆菌EHA105中，涂布于YEP平板(25μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)，28℃培养3天。PCR筛选出阳性克隆接种于含有相应抗生素的液体YEP培养基(下同)，28℃振荡培养，过夜培养的农杆菌以一定的比例转接至含MES(10mM,PH 5.6)和乙酰丁香酮(AS,20μM)的YEP液体培养基，振荡培养至对数生长期。当农杆菌菌液培养至OD₆₀₀≈1.0时，4000rpm离心10min收集菌体，用接种缓冲液重悬菌体，测量其OD值并使OD₆₀₀≈0.8。室温静置3h后，将处理好的农杆菌悬液浸润4～5叶期的普通烟。浸润后将植株置于25℃，光照16h的温室中继续培养。

5、PVY病毒侵染性克隆的侵染性测定

为了确定构建的PVY侵染性克隆具有侵染性，利用农杆菌浸润的方法接种普通烟，每次接种10株，重复3次。在接种14天后，植株均表现出明显的花叶、皱缩、畸形的病毒症状，如图3(d)所示。随机挑选5株接种的普通烟，Trizol法提取系统叶的总RNA，反转录合成第一链cDNA。以cDNA为模板，用PVY-VPg/F和PVY-VPg/R为引物进行常规PCR扩增大小为564bp的病毒VPg，以PVY侵染性克隆质粒pPVY作为阳性对照，健康普通烟作为阴性对照。RT-PCR检测结果表明，5株接种的普通烟样品均能扩增出与VPg大小一致的特异条带，说明本研究成功构建了PVY全长cDNA侵染性克隆，且PVY侵染性克隆接种普通烟的发病率为100％。我们进一步利用Western blot检测了接种普通烟系统叶上的病毒CP蛋白的含量。结果表明，PVY在普通烟上有大量的病毒积累，说明重组pCB-2μ-PVY具有很高的侵染效率，如图3(e)所示。

实施例2

1、利用实施例1的pCB301-2μ-HDV载体在酵母中同源重组一步法构建苦苣菜黄网病毒(Sonchus yellow net virus，SYNV)_cDNA侵染性克隆

如图4(a)所示，SYNV基因组为单链负义RNA，长约13.7kb。单链负义RNA的侵染性克隆需要在植物体内转录产生完全忠实于病毒基因组，精确切割起始与终止位点，不能含有任何多余核酸序列的RNA序列，而且相对较大的基因组对于一次性构建完全忠实于野生型病毒基因组的侵染性克隆和对病毒基因组进行大规模的缺失、突变等遗传操是较大挑战。利用丁型肝炎病毒(hepatitis delta virus，HDV)的核酶序列可以在真核细胞体内精确切割转录体产生完全忠实于病毒末端全长RNA。以下实例显示利用pCB301-2μ-HDV载体构建具有良好侵染效率的SYNV病毒基因组的侵染性克隆。

如图4(b)所示，利用pCB301-2μ-HDV载体一步法构建PVY侵染性克隆包括如下步骤：

(1)酶切线性化载体pCB301-2μ-HDV：利用限制性内切酶StuI和SmaI消化pCB301-2μ-HDV载体，经电泳检测为单一条带，得到线性化载体pCB301-2μ-HDV，纯化后备用；

(2)提取的感染SYNV的本氏烟总RNA，使用Oligo dT-Adapter作为反转录引物，合成cDNA。以反转录得到的cDNA作为模板，使用4对特异引物

SYNV-A-2U/F 5’-cctctatataaggaagttcatttcatttggagaggAGAGACAGAAACTCAGAAAATACAAT-3’(SEQ ID No.12)

SYNV-A/R 5’-CACATCCTCAAGAAACATGCT-3’(SEQ ID No.13)

SYNV-B/F 5’-CCATTTGCCATGATCAGACG-3’(SEQ ID No.14)

SYNV-B/R 5’-GATGGGTCGTTTGATCGATG-3’(SEQ ID No.15)

SYNV-C/F 5’-GCTTCTGAACGACATCTGAATC-3’(SEQ ID No.16)

SYNV-C/R 5’-CCGATAGATCTCGCAAATATTGAT-3’(SEQ ID No.17)

SYNV-D/F 5’-CAAAGCAGAGGCCGTAATGAG-3’(SEQ ID No.18)

SYNV-D-2U/R 5’-cggaccgcgaggaggtggagatgccatgccgacccAGAGACAAAAGCTCAGAACAAT-3’(SEQ ID No.19)

对全长cDNA分成四段3000bp左右的片段分别进行PCR扩增，其序列分别命名为SYNV-A-2U、SYNV-B、SYNV-C和SYNV-D-2U；

(3)将切线性化载体pCB301-2μ-HDV和片段SYNV-A-2U、SYNV-B、SYNV-C和SYNV-D-2U利用LiAc法转入酵母感受态细胞，方法同实施例1中步骤(3)；

(4)挑取单菌落，利用SYNV特异引物

SYNV-SC4/F 5’-ATGGAAGGATTATCATCCAAAGCGC-3’(SEQ ID No.20)

SYNV-SC4/R 5’-TCAATAGCTAATGTCGCTCAACATA-3’(SEQ ID No.21)

进行菌液PCR鉴定，筛选出阳性克隆后进行摇菌，利用酵母质粒小量提取试剂盒提取酵母质粒，方法同实施例(1)中步骤(4)；

提取的酵母质粒命名为pCB301-2μ-SYNV。为验证构建的重组质粒的正确性，随机选取10个克隆利用酶切位点SalI和NotI进行酶切验证。结果表明，重组质粒经过酶切得到三条符合预期的特异条带，说明重组质粒构建正确(如图4(c)所示)。为更一步确定重组质粒的正确性，挑选一个克隆送样测序，测序结果表明：所构建的S YNV侵染性克隆全长序列与GenBank所收录的SYNV全长序列的核苷酸完全一致，可以确认本研究获得了精确的SYNV全长cDNA克隆。

2、SYNV侵染性克隆的农杆菌转化、培养及浸润接种植物

为了避免植物的基因沉默系统对SYNV病毒基因组的切割和降解，在SYNV侵染性克隆接种过程中需要同时浸润基因沉默抑止子。SYNV的核糖核蛋白RNP核心包括N、P和L三种蛋白，为病毒衣壳包装、转录和复制所必需的反式作用蛋白，在SYNV侵染性克隆接种过程中需要同时表达N、P和L三种蛋白。三个来自其他病毒所编码的R NA沉默抑制子：Hc-Pro基因、p19基因和γb基因的表达载体：pGD-Hc-Pro、pGD-p19、GD-γb和N、P和L同时位于同一个表达载体的质粒pGD-NPL在文献“Wang,Q.；Ma,X.；Qian,S.；Zhou,X.；Sun,K.；Chen,X.；Zhou,X.；Jackson,A.O.；Li,Z.Rescue of a plant negative-strand RNA virus from clonedcDNA:Ins ights into enveloped plant virus movement and morphogenesis.PLoSPathog.2015,11,e1005223.doi:10.1371/journal.ppat.1005223”中公开过，公众可从云南省烟草农业科学研究院获得。

取验证正确的pCB301-2μ-SYNV和pGD-Hc-Pro、pGD-p19、GD-γb和pGD-NPL质粒各1μL，分别加入到200μL农杆菌EHA105株系感受态细胞中，轻轻混匀，转入2mm电击杯中；选择电击仪(Bio-Rad)用于农杆菌电击转化的程序，电击杯厚度参数手动调成2mm，电击；室温静置2min后加入800μL YEP恢复培养基，28℃静置1h，然后在28℃，200rpm振荡培养1.5h；8,000rpm离心2min，弃上清，用200μL去离子水悬浮后涂布于YEP平板培养基(25μg/mL Rif+50μg/mL Kan+50μg/mL Gent)；在培养箱中28℃倒置培养2天。包含上述cDNA转录载体质粒或蛋白表达载体的农杆菌分别接种3mL YEP液体培养基(含25μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素+25μg/mL庆大霉素)，28℃220rpm摇菌培养过夜至OD₆₀₀为0.8-1.2；经12000rpm 1分钟离心，弃上清，用含10mM MgCl2，10mM MES，200mM乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整OD₆₀₀为1.0左右，静置2-3小时；将农杆菌按终浓度OD₆₀₀比例为pCB301-2μ-SYNV：pGD-NPL：pGD-Hc-Pro：pGD-p19；GD-γb＝0.1:0.2:0.025:0.025:0.025进行混合。混合液分别浸润接种本氏烟，接种植株选用4-6叶期为宜。浸润接种使用不带针头的1ml一次性注射器在4-6叶期植物叶片进行叶背浸润，每株植物浸润3-4片叶片，接种后植株置于25℃隔离温室培养。

3、SYNV病毒侵染性克隆的侵染性测定

农杆菌接种的本氏烟在20天左右表现出典型的病毒症状，症状包括心叶严重下卷，网状的叶脉黄化症状(如图4(d)所示)。采集侵染性克隆接种并产生系统性病毒症状的本氏烟叶片，提取叶片总蛋白，用SYNV多克隆抗体进行Western Blot分析，结果显示农杆菌接种并产生症状的本氏烟叶片均可以检测到SYNV特导的结构蛋白条带，如图4(e)所示。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种酵母-农杆菌穿梭载体及构建方法和应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7537

<212> DNA

<213> 酵母-农杆菌穿梭载体pCB301-2μ-HDV()

<400> 1

aagcttgcat gcctgcagtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 60

tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag 180

aaaaggaaga tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaaa 240

gaatgcctct accgacagtg gtcccaaaga tggacccccc acccacgagg aacatcgtgg 300

aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg 360

agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg 420

ctattgagac tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 480

tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaagat ggcttctaca aatgccatca 540

ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga atgcctctac cgacagtggt cccaaagatg 600

gacccccacc cacgaggaac atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 660

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 720

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggcct gacctgcagg 780

tcgactctag aggatccccg ggtcggcatg gcatctccac ctcctcgcgg tccgacctgg 840

gcatccgaag gaggacgtcg tccactcgga tggctaaggg agagctcgaa tttccccgat 900

cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 960

attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 1020

acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 1080

atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 1140

ttactagatc ggaattcaga ttgtcgtttc ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga 1200

caggatatat tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt tattagaata atcggatatt 1260

taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgtgcatgcc aaccacagga 1320

gatctcagta aagcgaaaag tgccacctga acgaagcatc tgtgcttcat tttgtagaac 1380

aaaaatgcaa cgcgagagcg ctaatttttc aaacaaagaa tctgagctgc atttttacag 1440

aacagaaatg caacgcgaaa gcgctatttt accaacgaag aatctgtgct tcatttttgt 1500

aaaacaaaaa tgcaacgcga gagcgctaat ttttcaaaca aagaatctga gctgcatttt 1560

tacagaacag aaatgcaacg cgagagcgct attttaccaa caaagaatct atacttcttt 1620

tttgttctac aaaaatgcat cccgagagcg ctatttttct aacaaagcat cttagattac 1680

tttttttctc ctttgtgcgc tctataatgc agtctcttga taactttttg cactgtaggt 1740

ccgttaaggt tagaagaagg ctactttggt gtctattttc tcttccataa aaaaagcctg 1800

actccacttc ccgcgtttac tgattactag cgaagctgcg ggtgcatttt ttcaagataa 1860

aggcatcccc gattatattc tataccgatg tggattgcgc atactttgtg aacagaaagt 1920

gatagcgttg atgattcttc attggtcaga aaattatgaa cggtttcttc tattttgtct 1980

ctatatacta cgtataggaa atgtttacat tttcgtattg ttttcgattc actctatgaa 2040

tagttcttac tacaattttt ttgtctaaag agtaatacta gagataaaca taaaaaatgt 2100

agaggtcgag tttagatgca agttcaagga gcgaaaggtg gatgggtagg ttatataggg 2160

atatagcaca gagatatata gcaaagagat acttttgagc aatgtttgtg gaagcggtat 2220

tcgcaatatt ttagtagctc gttacagtcc ggtgcgtttt tggttttttg aaagtgcgtc 2280

ttcagagcgc ttttggtttt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct agagaatagg 2340

aacttcggaa taggaacttc aaagcgtttc cgaaaacgag cgcttccgaa aatgcaacgc 2400

gagctgcgca catacagctc actgttcacg tcgcacctat atctgcgtgt tgcctgtata 2460

tatatataca tgagaagaac ggcatagtgc gtgtttatgc ttaaatgcgt acttatatgc 2520

gtctatttat gtaggatgaa aggtagtcta gtacctcctg tgatattatc ccattccatg 2580

cggggtatcg tatgcttcct tcagcactac cctttagctg ttctatatgc tgccactcct 2640

caattggatt agtctcatcc ttcaatgcta tcatttcctt tgatattgga tcatattaag 2700

aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 2760

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2820

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2880

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 2940

accatagatc aacgacatta ctatatatat aatataggaa gcatttaata gaacagcatc 3000

gtaatatatg tgtactttgc agttatgacg ccagatggca gtagtggaag atattcttta 3060

ttgaaaaata gcttgtcacc ttacgtacaa tcttgatccg gagcttttct ttttttgccg 3120

attaagaatt aattcggtcg aaaaaagaaa aggagagggc caagagggag ggcattggtg 3180

actattgagc acgtgagtat acgtgattaa gcacacaaag gcagcttgga gtatgtctgt 3240

tattaatttc acaggtagtt ctggtccatt ggtgaaagtt tgcggcttgc agagcacaga 3300

ggccgcagaa tgtgctctag attccgatgc tgacttgctg ggtattatat gtgtgcccaa 3360

tagaaagaga acaattgacc cggttattgc aaggaaaatt tcaagtcttg taaaagcata 3420

taaaaatagt tcaggcactc cgaaatactt ggttggcgtg tttcgtaatc aacctaagga 3480

ggatgttttg gctctggtca atgattacgg cattgatatc gtccaactgc atggagatga 3540

gtcgtggcaa gaataccaag agttcctcgg tttgccagtt attaaaagac tcgtatttcc 3600

aaaagactgc aacatactac tcagtgcagc ttcacagaaa cctcattcgt ttattccctt 3660

gtttgattca gaagcaggtg ggacaggtga acttttggat tggaactcga tttctgactg 3720

ggttggaagg caagagagcc ccgaaagctt acattttatg ttagctggtg gactgacgcc 3780

agaaaatgtt ggtgatgcgc ttagattaaa tggcgttatt ggtgttgatg taagcggagg 3840

tgtggagaca aatggtgtaa aagactctaa caaaatagca aatttcgtca aaaatgctaa 3900

gaaataggtt attactgagt agtatttatt taagtattgt ttgtgcactt gccgatctat 3960

gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcagga aattgtaaac 4020

gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 4080

taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt 4140

gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg 4200

cgaaaaaccg tctcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agatccttgc tggctgaacc 4260

cccagccgga actgacccca caaggcccta gcgtttgcaa tgcaccaggt catcattgac 4320

ccaggcgtgt tccaccaggc cgctgcctcg caactcttcg caggcttcgc cgacctgctc 4380

gcgccacttc ttcacgcggg tggaatccga tccgcacatg aggcggaagg tttccagctt 4440

gagcgggtac ggctcccggt gcgagctgaa atagtcgaac atccgtcggg ccgtcggcga 4500

cagcttgcgg tacttctccc atatgaattt cgtgtagtgg tcgccagcaa acagcacgac 4560

gatttcctcg tcgatcagga cctggcaacg ggacgttttc ttgccacggt ccaggacgcg 4620

gaagcggtgc agcagcgaca ccgattccag gtgcccaacg cggtcggacg tgaagcccat 4680

cgccgtcgcc tgtaggcgcg acaggcattc ctcggccttc gtgtaatacc ggccattgat 4740

cgaccagccc aggtcctggc aaagctcgta gaacgtgaag gtgatcggct cgccgatagg 4800

ggtgcgcttc gcgtactcca acacctgctg ccacaccagt tcgtcatcgt cggcccgcag 4860

ctcgacgccg gtgtaggtga tcttcacgtc cttgttgacg tggaaaatga ccttgttttg 4920

cagcgcctcg cgcgggattt tcttgttgcg cgtggtgaac agggcagagc gggccgtgtc 4980

gtttggcatc gctcgcatcg tgtccggcca cggcgcaata tcgaacaagg aaagctgcat 5040

ttccttgatc tgctgcttcg tgtgtttcag caacgcggcc tgcttggcct cgctgacctg 5100

ttttgccagg tcctcgccgg cggtttttcg cttcttggtc gtcatagttc ctcgcgtgtc 5160

gatggtcatc gacttcgcca aacctgccgc ctcctgttcg agacgacgcg aacgctccac 5220

ggcggccgat ggcgcgggca gggcaggggg agccagttgc acgctgtcgc gctcgatctt 5280

ggccgtagct tgctggacca tcgagccgac ggactggaag gtttcgcggg gcgcacgcat 5340

gacggtgcgg cttgcgatgg tttcggcatc ctcggcggaa aaccccgcgt cgatcagttc 5400

ttgcctgtat gccttccggt caaacgtccg attcattcac cctccttgcg ggattgcccc 5460

gactcacgcc ggggcaatgt gcccttattc ctgatttgac ccgcctggtg ccttggtgtc 5520

cagataatcc accttatcgg caatgaagtc ggtcccgtag accgtctggc cgtccttctc 5580

gtacttggta ttccgaatct tgccctgcac gaataccagc gaccccttgc ccaaatactt 5640

gccgtgggcc tcggcctgag agccaaaaca cttgatgcgg aagaagtcgg tgcgctcctg 5700

cttgtcgccg gcatcgttgc gccacatcta ggtactaaaa caattcatcc agtaaaatat 5760

aatattttat tttctcccaa tcaggcttga tccccagtaa gtcaaaaaat agctcgacat 5820

actgttcttc cccgatatcc tccctgatcg accggacgca gaaggcaatg tcataccact 5880

tgtccgccct gccgcttctc ccaagatcaa taaagccact tactttgcca tctttcacaa 5940

agatgttgct gtctcccagg tcgccgtggg aaaagacaag ttcctcttcg ggcttttccg 6000

tctttaaaaa atcatacagc tcgcgcggat ctttaaatgg agtgtcttct tcccagtttt 6060

cgcaatccac atcggccaga tcgttattca gtaagtaatc caattcggct aagcggctgt 6120

ctaagctatt cgtataggga caatccgata tgtcgatgga gtgaaagagc ctgatgcact 6180

ccgcatacag ctcgataatc ttttcagggc tttgttcatc ttcatactct tccgagcaaa 6240

ggacgccatc ggcctcactc atgagcagat tgctccagcc atcatgccgt tcaaagtgca 6300

ggacctttgg aacaggcagc tttccttcca gccatagcat catgtccttt tcccgttcca 6360

catcataggt ggtcccttta taccggctgt ccgtcatttt taaatatagg ttttcatttt 6420

ctcccaccag cttatatacc ttagcaggag acattccttc cgtatctttt acgcagcggt 6480

atttttcgat cagttttttc aattccggtg atattctcat tttagccatt tattatttcc 6540

ttcctctttt ctacagtatt taaagatacc ccaagaagct aattataaca agacgaactc 6600

caattcactg ttccttgcat tctaaaacct taaataccag aaaacagctt tttcaaagtt 6660

gttttcaaag ttggcgtata acatagtatc gacggagccg attttgaaac cacaattatg 6720

ggtgatgctg ccaactcgag agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg cacccccctt 6780

cggcgtgcgc ggtcacgcgc acagggcgca gccctggtta aaaacaaggt ttataaatat 6840

tggtttaaaa gcaggttaaa agacaggtta gcggtggccg aaaaacgggc ggaaaccctt 6900

gcaaatgctg gattttctgc ctgtggacag cccctcaaat gtcaataggt gcgcccctca 6960

tctgtcagca ctctgcccct caagtgtcaa ggatcgcgcc cctcatctgt cagtagtcgc 7020

gcccctcaag tgtcaatacc gcagggcact tatccccagg cttgtccaca tcatctgtgg 7080

gaaactcgcg taaaatcagg cgttttcgcc gatttgcgag gctggccagc tccacgtcgc 7140

cggccgaaat cgagcctgcc cctcatctgt caacgccgcg ccgggtgagt cggcccctca 7200

agtgtcaacg tccgcccctc atctgtcagt gagggccaag ttttccgcga ggtatccaca 7260

acgccggcgg ccgcggtgtc tcgcacacgg cttcgacggc gtttctggcg cgtttgcagg 7320

gccatagacg gccgccagcc cagcggcgag ggcaaccagc ccggtgagcg tctagtggac 7380

tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg 7440

gctggctggt ggcaggatat attgtggtgt aaacaaattg acgcttagac aacttaataa 7500

cacattgcgg acgtttttaa tgtactgggg tggtttt 7537

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

agatctcagt aaagcgaaaa gtgccacctg aacga 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gggggttcag ccagcaagga tctggcgtaa tagcg 35

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cctctatata aggaagttca tttcatttgg agagggaaat taaaacaact caatacaaca 60

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tattgcctga cacactgcca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

atctttaggc gtttgccaac 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

acagggaaat cctttggcat c 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ttttaccgat caaaggcaga gac 23

<210> 9

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatctctc ctgattgaag tttacagtca 60

c 61

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gggaaaaata aatccaaaag 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ttcatgctcc acttcctgtt ttg 23

<210> 12

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cctctatata aggaagttca tttcatttgg agaggagaga cagaaactca gaaaatacaa 60

t 61

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

cacatcctca agaaacatgc t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ccatttgcca tgatcagacg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

gatgggtcgt ttgatcgatg 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

gcttctgaac gacatctgaa tc 22

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

ccgatagatc tcgcaaatat tgat 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

caaagcagag gccgtaatga g 21

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

cggaccgcga ggaggtggag atgccatgcc gacccagaga caaaagctca gaacaat 57

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

atggaaggat tatcatccaa agcgc 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

tcaatagcta atgtcgctca acata 25

Claims

1.一种酵母-农杆菌穿梭载体，其特征在于：该穿梭载体用于快速构建植物病毒侵染性克隆，该穿梭载体包括同时能在农杆菌和酵母中稳定复制和表达的核酸元件和选择标记。

2.根据权利要求1所述的酵母-农杆菌穿梭载体，其特征在于：包括编码选择标记农杆菌属物种的核苷酸序列的第一核酸元件、带有第一复制起点的核苷酸序列的第二核酸元件、带有编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第三核酸元件、带有第二复制起点的核苷酸序列的第四核酸元件、驱动真核植物中DNA转录的启动子的第五核酸元件、特异切割真核生物中mRNA序列的核酶的第六核酸元件、终止转录的第七核酸元件、T-DNA区域的核苷酸序列的第八核酸元件、带有编码复制启动蛋白的核苷酸序列的第九核酸元件和编码选择标记酵母属物种的核苷酸序列的第十核酸元件，上述核酸元件在环状多核苷酸分子上提供并且由不在复制、维持或核酸转移中发挥作用的间隔核苷酸序列分隔。

3.根据权利要求2所述的酵母-农杆菌穿梭载体，其特征在于：第三核酸元件的复制启动蛋白作用于农杆菌属物种，第九核酸元件的复制启动蛋白作用于酵母属物种，所述第二复制起点与第一复制起点不同并且作用于农杆菌属物种。

4.根据权利要求2所述的酵母-农杆菌穿梭载体，其特征在于：所述T-DNA区域包含瘤诱导型根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)质粒或根诱生性发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes)质粒的T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列。

5.一种酵母-农杆菌穿梭载体，其特征在于：该载体含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

6.一种酵母-农杆菌穿梭载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）、以pGBK-T7载体为模板，用特异性引物2μ ori/F和TRP/R进行高保真DNA聚合酶扩增2μori-TRP DNA片段，PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；

步骤（2）、利用限制性内切酶AfeI消化pCB301-HDV载体，经电泳检测为单一条带，得到线性化载体pCB301-HDV，纯化后备用；

步骤（3）、利用In-Fusion HD Cloning Kit将纯化的DNA片段快速定向克隆到线性化载体pCB301-HDV中，得到阳性克隆pCB301-2μ-HDV。

7.根据权利要求6所述的酵母-农杆菌穿梭载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）之前还包括：

设计引物2μ ori/F和TRP/R，两个引物的5’端包含有15个碱基的序列与pCB301-HDV载体AfeI位点的序列同源，其中，2μ ori/F：agatctcagtaaagcGAAAAGTGCCACCTGAACGA；TRP/R：gggggttcagccagcAAGGATCTGGCGTAATAGCG。

8.如权利要求6酵母-农杆菌穿梭载体的构建方法构建得到的酵母-农杆菌穿梭载体。

9.如权利要求1-8之一的酵母-农杆菌穿梭载体在植物病毒的侵染性克隆构建的应用。

10.如权利要求1-8之一的酵母-农杆菌穿梭载体在苦苣菜黄网病毒或马铃薯Y病毒的侵染性克隆构建的应用。