CN111705075B

CN111705075B - 一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法

Info

Publication number: CN111705075B
Application number: CN202010461785.8A
Authority: CN
Inventors: 程晓非; 武晓云; 车欣洋; 刘佳慧
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2040-05-27
Also published as: CN111705075A

Abstract

一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法，属于植物基因工程技术领域。为了提高侵染性克隆侵染效率，本发明提供了一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆，所述侵染性克隆载体由苜蓿花叶病毒全基因组与含有CaMV 35S启动子和HDV核酶Rz的植物表达载体pCB301‑2μ‑HDV重组后获得的。所述侵染性克隆由下述三个载体组成：携带苜蓿花叶病毒基因组RNA1的重组载体pCB301‑AMVRNA1、携带苜蓿花叶病毒基因组RNA2的重组载体pCB301‑AMVRNA2和携带苜蓿花叶病毒基因组RNA3的重组载体pCB301‑AMVRNA3。本发明能够节省病毒侵染时间，提高的侵染的成功率。

Description

一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法。

背景技术

植物病毒侵染性克隆是植物病毒学研究领域的基础研究工具。克隆后的病毒基因组易于进行突变、重组等分子操作，在植物病毒的基因功能，侵染机制，植物抗病毒机制等方面具有重要的作用。此外，植物病毒的侵染性克隆也可作为基因表达或沉默的载体，进行植物基因功能的研究，或者进行外源蛋白的表达。目前有许多植物病毒的侵染性克隆被构建，例如：燕飞，郑红英，肖彩利，韩科雷，鲁宇文，林林，陈剑平，黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用(CN104498521A)；宋震，崔甜甜，宾羽，晏建红，李中安，周常勇，三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法(CN108559759A)；余乃通，刘志昕，刘锋，瞿玲，笈小龙，郑贤欣，一种香蕉束顶病毒侵染性克隆及构建方法(CN107488673A)；田延平，王健，李向东，耿超，马铃薯卷叶病毒侵染性克隆及其构建方法(CN109797162A)，等。

苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AMV)属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)，是该属的代表种。该病毒寄主范围广，能侵染51个科的430种双子叶植物，常见的包括苜蓿、三叶草、马铃薯、菜豆、豇豆、赤豆、大豆、绿豆、豌豆、蚕豆、菜豆、烟草、辣椒等。该病毒通过20多种蚜虫以非持久方式进行传播，也可通过汁液摩擦、嫁接和种子传播；其中，带毒种子是远距离传播的主要途径。该病毒主要引起植物叶片黄化或花叶、偶见皱缩和植株矮化的症状，侵染后可严重影响作物的光合作用，造成严重的经济损失。AMV的基因组是3条正义单链RNA(positive-sense，single-strandedRNA，ssRNA)，分别命名为RNA1、RNA2和RNA3。RNA1、RNA2和RNA3的5′端都含有甲基化的帽子(m7G5′ppp5′Gp)，但3′端没有细胞信使RNA(mRNA)类似的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)，而存在一个转运RNA(tRNA)类似的结构。RNA1和RNA2含有一个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，分别编码约126kDa的1a蛋白和约90kDa的2a蛋白；1a蛋白和2a蛋白组成病毒的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，参与病毒基因组的复制以及亚基因组的转录。RNA3含有2个ORF，分别编码约32kDa的运动蛋白(Movement protein，MP)和约24kDa的外壳蛋白(Coat protein，CP)。MP通过RNA3直接翻译，而CP通过亚基因组RNA4表达。该病毒的侵染性克隆没有相关专利，但是已有文献报道：Sanchez-Navarro J,Miglino R,Ragozzino A,Bol JF.Engineering of Alfalfa mosaic virus RNA3 into anexpression vector,Archives of Virology,2001,146:923-939；Volt AC,Neeleman L,Linthorst HJM,Bol JF.Role of the3′-Untranslated Regions of Alfalfa MosaicVirus RNAs in the Formation of a Transiently Expressed Replicase in Plantsand in the Assembly of Virions,Journal of Virology,2001,75:6440-6449.其中，Sanchez-Navarro等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆将该病毒的RNA1、RNA2和RNA3分别插入到原核生物T7启动子下游，通过体外转录的方法获得病毒的基因组RNA，再通过机械摩擦接种植物或者PEG法转染植物原生质体，而Volt等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆将该病毒的RNA1、RNA2和RNA3分别插入到植物双元表达载体的花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaic virus，CaMV)的35S启动子和胭脂氨酸合成酶(NOS)的终止子之间，通过农杆菌介导法侵染植物。

但上述研究存在如下缺陷：Sanchez-Navarro等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆接种植物不方便，而且RNA植物摩擦植物的成功率低，而Volt等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆虽然跳过了体外转录的过程，但是该侵染性克隆在植物细胞内转录后在病毒RNA后会增加一段额外的NOS序列以及多聚A尾巴(PolyA)，造成侵染率下降。此外，Volt等人构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆的构建过程需要有一个体外的DNA连接反应和大肠杆菌繁殖的过程，增加了时间成本，同时由于一些病毒的基因组对大肠杆菌具有毒性作用，可能引进插入的病毒基因组中出现片段的缺失或突变，造成构建失败。

发明内容

为了提高侵染性克隆侵染效率，本发明提供了一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆，所述侵染性克隆由苜蓿花叶病毒全基因组与含有CaMV35S启动子和HDV核酶Rz的植物表达载体pCB301-2μ-HDV重组后获得的；所述苜蓿花叶病毒全基因组由RNA1、RNA2和RNA3组成，所述RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述RNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述侵染性克隆由下述三个载体组成：携带苜蓿花叶病毒基因组RNA1的重组载体pCB301-AMVRNA1、携带苜蓿花叶病毒基因组RNA2的重组载体pCB301-AMVRNA2和携带苜蓿花叶病毒基因组RNA3的重组载体pCB301-AMVRNA3。

本发明还提供了含有上述的侵染性克隆载体的侵染性重组农杆菌。

本发明还提供了上述侵染性克隆的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取含有苜蓿花叶病毒的大豆叶片总RNA，反转录得到苜蓿花叶病毒的cDNA；以所述cDNA为模板，通过PCR方法分段扩增，分别获得苜蓿花叶病毒基因组的RNA1、RNA2和RNA3；

(2)将植物表达载体pCB301-2μ-HDV线性化处理，得到线性化pCB301-2μ-HDV载体；

(3)同源重组：将所述线性化pCB301-2μ-HDV载体分别与步骤1)获得的RNA1、RNA2和RNA3等质量浓度比例混合，转化酵母菌得到重组酵母菌，筛选后提取质粒，分别获得含有RNA1的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、含有RNA2的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和含有RNA3的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA3；质粒pCB301-AMVRNA1、质粒pCB301-AMVRNA2和质粒pCB301-AMVRNA3的组合即为苜蓿花叶病毒侵染性克隆。

本发明还提供了上述侵染性克隆的侵染性重组农杆菌的构建方法，将上述获得的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和重组酵母质粒pCB301-AMVRNA3分别转入农杆菌感受态细胞中，经筛选分别获得含有pCB301-AMVRNA1的重组农杆菌、含有pCB301-AMVRNA2的重组农杆菌和含有pCB301-AMVRNA3的重组农杆菌，上述3种重组农杆菌的组合即为侵染性重组农杆菌。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中所述反转录所用的引物为AMV-Rz-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中RNA1的PCR扩增引物为AMV-R1-35SF和AMV-Rz-R；RNA2的PCR扩增引物为AMV-R2-35SF和AMV-Rz-R；RNA3的PCR扩增引物为AMV-R3-35SF和AMV-Rz-R；所述AMV-Rz-R核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述AMV-R1-35SF核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述AMV-R2-35SF核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述AMV-R3-35SF核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

在本发明的一个实施例中，步骤(2)所述的植物表达载体pCB301-2μ-HDV线性化处理的方法为：以pCB301-2μ-HDV为模板，使用引物pCB301-RZ-F和pCB301-35S-R引物扩增pCB301-2μ-HDV载体，得到pCB301-2μ-HDV线性化的载体；所述引物pCB301-RZ-F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述引物pCB301-35S-R核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)中所述酵母菌为酵母菌Y2H Gold。

在本发明的一个实施例中，所述农杆菌为农杆菌GV3101。

为方便描述，本发明中所述的侵染性克隆、侵染性重组农杆菌及相应的制备方法中，RNA1、RNA2或RNA3并非严格代表RNA序列，具体指苜蓿花叶病毒中的3条正义RNA序列分别经反转录，后获得的cDNA序列或反转录后经PCR扩增得到的DNA序列。

有益效果

本技术采用酵母菌自有的重组机制，省略体外DNA连接过程和大肠杆菌的繁殖过程，不仅节省了时间，而且提高了侵染性克隆构建的成功率。此外，本技术构建的苜蓿花叶病毒侵染性克隆通过农杆菌进入植物细胞进行转录后，由于3′末端的HDV核酶Rz的作用，产生的病毒RNA没有多余的序列，提高的侵染的成功率。本发明制备的苜蓿花叶病毒侵染性克隆具有能同时侵染本氏烟和大豆的能力。其中，大豆可以通过用侵染性农杆菌接种并发病的本氏烟为材料进行机械接种，避免了侵染性克隆接种大豆必须采用基因枪法的问题。

附图说明

图1苜蓿花叶病毒RNA1(A)、RNA2和RNA3(B)的扩增；其中，泳道M为诺维赞公司的DL5000 DNA marker(货号：MD102)，泳道1和2为RNA1扩增产物，泳道3和4为RNA2扩增产物，泳道5和6为RNA2扩增产物；

图2载体pCB301-2μ-HDV的扩增；其中，泳道M为诺维赞公司的DL15000 DNA marker(货号：MD103)，泳道1至4为载体pCB301-2μ-HDV的扩增产物；

图3酵母菌的PCR筛选；其中，泳道M为诺维赞公司的DL5000 DNA marker(货号：MD102)，AMV RNA1表示15个酵母菌单菌落的RNA1扩增产物，AMV RNA2表示17个酵母菌单菌落的RNA2的检测结果，AMV RNA3表示16个酵母菌单菌落的RNA3的检测结果；

图4苜蓿花叶病毒侵染性克隆pCB301-AMVRNA1的质粒图；其中，LB和RB分别是农杆菌T-DNA的左边界和右边界，35S是CaMV 35S启动子，RZ是HDV核酶Rz，NOS是和胭脂氨酸合成酶(NOS)的终止子,AMV RNA1是苜蓿花叶病毒RNA1；

图5苜蓿花叶病毒侵染性克隆pCB301-AMVRNA2的质粒图；其中，LB和RB分别是农杆菌T-DNA的左边界和右边界，35S是CaMV 35S启动子，RZ是HDV核酶Rz，NOS是和胭脂氨酸合成酶(NOS)的终止子,AMV RNA2是苜蓿花叶病毒RNA2；

图6苜蓿花叶病毒侵染性克隆pCB301-AMVRNA3的质粒图；其中，LB和RB分别是农杆菌T-DNA的左边界和右边界，35S是CaMV 35S启动子，RZ是HDV核酶Rz，NOS是和胭脂氨酸合成酶(NOS)的终止子,AMV RNA3是苜蓿花叶病毒RNA3；

图7本氏烟接种苜蓿花叶病毒侵染性克隆的症状与RT-PCR检测；本氏烟接种两周后的症状(A)，其中(B)显示上部非接种叶片的黄化症状；其中，Healthy，健康对照；AMV，接种苜蓿花叶病毒；RT-PCR检测上部非接种叶片(C)；其中，泳道M为诺维赞公司的DL2000Plus DNA marker(货号：MD101)，泳道H为健康本氏烟对照，泳道P为质粒对照，泳道1和2为2株接种苜蓿花叶病毒侵染性克隆的本氏烟上部非接种叶片的RT-PCR检测结果。本实验共接种了10株本氏烟，本图仅显示其中两株的结果；

图8大豆接种苜蓿花叶病毒侵染性克隆的症状(A)与RT-PCR检测(B)；其中，M为泳道M为诺维赞公司的DL2000 Plus DNA marker(货号：MD101)，泳道H为健康大豆对照，泳道1－7为1株接种苜蓿花叶病毒侵染性克隆的大豆上部非接种叶片的RT-PCR检测结果。

具体实施方式

苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AMV)，来源于含有苜蓿花叶病毒的大豆(Glycine Max)品种为东农50(DN50，为已知品种，黑审豆2007022)。

植物表达载体pCB301-2μ-HDV及其构建方法记载在已公开的专利CN107828816A中。

上述材料公众可通过东北农业大学获得。

本发明涉及到一种苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AMV)侵染性克隆载体及侵染性克隆的构建方法。所述AMV侵染性克隆载体包括pCB301-AMVRNA1、pCB301-AMVRNA2和pCB301-AMVRNA3三个载体，通过在植物表达载体pCB301-2μ-HDV的花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S启动子和丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus，HDV)核酶(ribozyme，Rz)之间分别插入苜蓿花叶病毒基因组RNA1、RNA2或RNA3获得。

本发明所用引物序列：

SEQ ID NO：4(引物：AMV-RZ-R，下划线部分为HDV核酶Rz部分序列)

TGGAGATGCCATGCCGACCCGCATCCCTTAGGGGCATTCATGCAG

SEQ ID NO：5(引物：AMV-R1-35SF，下划线部分为CaMV 35S启动子序列)

ATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTTTTTATCTTACACACGCTTGTGC

SEQ ID NO：6(引物：AMV-R2-35SF，下划线部分为CaMV 35S启动子序列)

ATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTTTTTATCTTTTCGCGATTGAAAAG

SEQ ID NO：7(引物：AMV-R3-35SF，下划线部分为CaMV 35S启动子序列)

ATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTCAACTCAATTAACGCTTTTACAG

SEQ ID NO：8(引物：pCB301-RZ-F)

GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTC

SEQ ID NO：9(引物：pCB301-35S-R)

CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC

SEQ ID NO：10(引物：AMV-CP-F)

ATGAGTTCTTCACAAAAGAAAGCTGGT

SEQ ID NO：11(引物：AMV-CP-R)

ATGACGATCAAGATCGTCAGCTTCGTC

下面举例描述本发明，下述实施例中所用的试验材料如酵母菌株、农杆菌、烟草，PCR试剂、琼脂糖等，均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中所采用的方法未做详细说明的均为本领域现有技术或参照相应试剂的产品说明书进行。

实施例1.苜蓿花叶病毒的侵染性克隆的制备。

步骤1：扩增苜蓿花叶病毒基因组RNA1、RNA2和RNA3：用诺维赞公司的FastPure植物总RNA提取试剂盒(货号：RC401)提取含有苜蓿花叶病毒的大豆(苜蓿花叶病毒经摩擦机械接种到东农50上获得的)叶片总RNA，用英潍捷基(上海)贸易有限公司的SuperScript IV(SSIV)反转录酶(货号：18090010)，以AMV-RZ-R为引物进行反转录，获得苜蓿花叶病毒RNA1、RNA2和RNA3的cDNA，再分别以引物AMV-RZ-R和AMV-R1-35SF、AMV-RZ-R和AMV-R2-35SF、AMV-RZ-R和AMV-R3-35SF与诺维赞公司的2×Phanta Max Master Mix(货号：P515)，分别扩增苜蓿花叶病毒基因组RNA1、RNA2和RNA3,扩增产物用1％琼脂粮凝胶电泳进行检测，回收目的片段，获得苜蓿花叶病毒基因组RNA1、RNA2和RNA3。所述RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述RNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

步骤2：植物表达载体pCB301-2μ-HDV线性化处理：以pCB301-2μ-HDV为模板，使用诺维赞公司的2×Phanta Max Master Mix(货号：P515)和引物pGRRZ-F和pGR35S-R进行PCR扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶回收目的片段。

步骤3：酵母转化伴随的同源重组：将步骤2制备得到的线性化的pCB301-2μ-HDV质粒与步骤1的苜蓿花叶病毒RNA1、RNA2或RNA3等摩尔比例混合后，用PEG法转化酵母(采用北京酷来搏(Coolaber)科技有限公司；货号：SK2400)，转化后均匀涂布于缺少色氨酸的SC培养基(Coolaber；货号：PM2253-5L)，通过PCR鉴定含有苜蓿花叶病毒RNA1、RNA2或RNA3的重组酵母菌，用北京酷来搏科技有限公司的酵母质粒提取试剂盒(货号：SK2410)合提取质粒，分别获得含有RNA1的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、含有RNA2的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和含有RNA3的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA3；质粒pCB301-AMVRNA1、质粒pCB301-AMVRNA2和质粒pCB301-AMVRNA3的组合即为苜蓿花叶病毒侵染性克隆。

实施例2.含有苜蓿花叶病毒的侵染性克隆的重组农杆菌的制备。

参照实施例1所述方法构建苜蓿花叶病毒的侵染性克隆载体，即质粒pCB301-AMVRNA1、质粒pCB301-AMVRNA2和质粒pCB301-AMVRNA3，将上述质粒通过电击法分别转入GV3101农杆菌感受态细胞中，通过PCR筛选分别带有pCB301-AMVRNA1、pCB301-AMVRNA2和pCB301-AMVRNA3的重组农杆菌，上述3种重组农杆菌的组合即为含有苜蓿花叶病毒侵染性重组农杆菌。

实施例3.侵染性克隆侵染实验。

通过农杆菌注射法，将实施例2制备的带有重组质粒pCB301-AMVRNA1、pCB301-AMVRNA2和pCB301-AMVRNA3的重组农杆菌等OD.600浓度比例混合后接种本生烟植株。接种2周后，提取上部非接种叶的总RNA，以AMV-RZ-R为引物进行反转录，用引物AMV-CP-F和AMV-CP-R进行RT-PCR扩增苜蓿花叶病毒的外壳蛋白基因(Coat protein，CP)，检测病毒的侵染。结果显示：本氏烟上接种苜蓿花叶病毒侵染性克隆后，植物的生长状态与健康对照基本一致，但是上部非接种叶片出现黄化症状；RT-PCR检测可从接种苜蓿花叶病毒侵染性克隆的本氏烟叶片中扩增一700bp左右大小条带，而健康对照不能扩增对应的条件，进一步说明苜蓿花叶病毒侵染性克隆成功侵染本氏烟。本实验共接种了10株本氏烟，全部都能检测到苜蓿花叶病毒CP基因，说明侵染率达到100％。

取苜蓿花叶病毒侵染的本氏烟叶片，用0.01mol/L的磷酸缓冲液(pH7.5)研磨后，用机械摩擦的方法接种大豆东农50(DN50，为已知品种，黑审豆2007022)，接种后置于植物生长室中观察症状。接种2周后，DN50的上部叶片出现斑块状黄化的症状。提取上部非接种叶的总RNA，以AMV-RZ-R为引物进行反转录，用引物AMV-CP-F和AMV-CP-R进行RT-PCR扩增苜蓿花叶病毒的外壳蛋白基因(Coat protein，CP)。结果显示可以在接种的7株大豆的上部非接种的叶片中检测到苜蓿花叶病毒的CP基因，说明DN50成功被侵染。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 一种苜蓿花叶病毒的侵染性克隆、重组农杆菌及构建方法

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3642

<212> DNA

<213> 苜蓿花叶病毒RNA1

<400> 1

tttttatctt acacacgctt gtgcaagata gttaatccat ttattttcct tgcgctttcc 60

acagcattac gttcattcaa tactgtgaag atttcactat gaatgctgac gcccaatcca 120

ccgatgccag ccttagtatg cgagaacctt tatctcatgc ctccattcag gagatgcttc 180

gacgtgtagt cgaaaagcaa gctgcagacg acacaactgc aatcggaaag gttttctccg 240

aagcaggtcg tgcctatgcc caggatgctc tcccttcaga caaaggtgaa gtcttgaaga 300

tatctttttc cctggacgcc acgcaacaaa acatactacg cgccaacttt cctggtcgac 360

gtattgtatt ttcaaacagt tcgagttcat ctcactgttt cgcggctgcc catcgtctac 420

tagaaaccga ttttgtttac cgatgcttcg gtaatacggt tgatagtatt atagaccttg 480

gaggaaattt cgtttcccat atgaaggtga agcggcataa tgtacattgc tgctgtccca 540

tattggatgc tagagacgga gctaggctca cggagagaat attgtctcta aagtcgtacg 600

tccgaaaaca cccggaaatt gtgggtgaag cagattactg catggacacg tttcagaaat 660

gctcaaggcg agctgactat gcttttgcca tccattctac tagcgatctc gacgtgggag 720

agttggcatg tagtttggac caaaaaggcg ttatgaaatt catttgcacc atgatggttg 780

atgcagatat gttaattcat aacgaggggg aaatccctaa ctttaatgtt agatgggaga 840

tcgatcataa gaacgatctc attcacttcg acttcatcga cgagcccaat ttgggatata 900

gtcatcggtt ttcattattg aaacactatt tgacttacaa tgccgttgat ttgggtcatg 960

ctgcttatcg aatcgaacgt aagcaagatt ttggtggtgt gatggttatt gacttaactt 1020

attcccttgg atttgtcccc aagatgccac actccaatgg gaggtcctgc gcctggtata 1080

atagagtcaa aggacaaatg gtagtgcaca ccgttaacga ggggtactat catcattcat 1140

accagacagc agtgaggcgg aaagtgcttg tcgataagaa agtgcttacc agagttactg 1200

aggttgcttt taggcaattc agacctaacg ctgatgttca ttccgcaatt cagtccatag 1260

cgactatgtt atcttcttca acgaatcata ccattatcgg tggtgtgact ctgatttcgg 1320

gcaaacctct cagcccggat gactatattc cagtggcaac aacgatttat tatagagtga 1380

aaaaactcta taacgccatt ccagagatgt tatccctcct agacaaggga gagagattat 1440

cgactgatgc tgttttaaaa gggtctgaag gtccaacgtg gtattctggt cctacctttt 1500

taagcgcgct ggataaggtc aatgttcctg gtgattttgt cgccaaagct ctgttgtcgt 1560

tgcctaagag agatttgaaa tctctatttt ctaggtcagc gacttctcat tctgaacgga 1620

caccggttca ggacgagagc cccgttcgat gtacagacgg tgtcttttac cctataagga 1680

tgttgttgaa atgcctagga agtgacaaat ttgagtcggt cactataact gatcctagaa 1740

gtaacacgga aactaccgtg gatttatacc aatcttttca aaagaaaatt gaaacggttt 1800

tctcatttat tcttggaaag attgatggtc cttcacctct aatttctgat ccagtatact 1860

tccaatcact tgaagatgta tactatgctg aatggcatca aggaaatgct attgatgcgt 1920

caagttacgc acgtgccctg ttagacgata tcaggaagca gaaagaagag agcttaagag 1980

ctaaagcgaa ggaagttgaa gatgctcaaa aattaaatag agcaattttg caggttcatg 2040

cctatttgga agctcatcca gatggaagaa aaatcgaagg actggggttg agttctcagt 2100

tcatcgcaaa aatccccgag cttgcaattc caacaccaaa accgttacct gaatttgaga 2160

agaacgcaga aactggcgaa attttgcgta tcaatcctca ttcagatgcc attcttgaag 2220

caattgatta cttgaaatcc acttcagcca attctatcat taccttgaat aaattgggtg 2280

atcattgtca gtggacgaca aaaggtcttg acgtagtatg ggccggtgac gataaacgtc 2340

gagctttcat cccaaagaag aatacttggg tcggacctac tgctagaagt tatccccttg 2400

caaaatatga aagagcaatg agcaaggatg gatatgtaac tctgagatgg gacggagaag 2460

ttctagatgc taattgcgtc aggagtttat ctcaatacga gattgtcttt gttgaccaat 2520

cttgcgtctt tgcctcagcg gagcgtatca ttccaagcct agagaaagcc ctaggtcttg 2580

aagcacactt ttcagttacg attgttgatg gagttgctgg ttgcgggaaa accaccaata 2640

tcaagcaaat agcccgttca tcgggtcagg atgtggattt gatccttacc agcaatcgta 2700

gctctgccga tgagttaaaa gaaaccatcg attgttcacc gttgacaaag ttgcattaca 2760

ttcgtacctg tgattcttac ttgatgtctg cctcggcggt aaaagcacag aggttaatct 2820

ttgatgaatg ttttttgcaa catgcaggtt tagtctatgc cgctgctact ttagctggtt 2880

gtagcgaagt cattggtttt ggtgacacgg agcaaattcc ttttgtctca aggaacccgt 2940

catttgtttt tcgtcatcat aagctaactg ggaaagtcga gagaaaatta attacctgga 3000

gatccccagc agatgccacc tattgccttg aaaagtattt ttacaagaac aagaagccgg 3060

tgaagacaaa ttccagagta ctaagatcta tcgaagttgt accgataaat tcccctgtaa 3120

gcgttgagag aaataccaac gctctttatt tgtgtcatac tcaagctgaa aaagcagttt 3180

tgaaagctca agcacactta aagggatgtg ataatatctt tactactcat gaagctcagg 3240

gtaagacttt cgacaatgtt tatttctgtc gtttaactcg tacctcaacg agtcttacta 3300

ctggtagaga tccaataaat ggcccatgcc atggattagt tgccttgtcg agacacaaga 3360

agacttttaa atattttacc atcgcccatg atagcgatga tgtgatctac aatgcttgta 3420

gagatgccgg taataccgac gatagtattt tagcgaggag ctataatact aatttctgaa 3480

ttagtcattg gtaattcaat gccaacctcc actgggtgga ttaaggttga ggtatagaat 3540

cctattcgct cctgatagga gaaattctat attgcttata tacgtgctta tgcacgtata 3600

taaatgctca tgctaaactg catgaatgcc cctaagggat gc 3642

<210> 2

<211> 2593

<212> DNA

<213> 苜蓿花叶病毒RNA2

<400> 2

tttttatctt ttcgcgattg aaaagataag ttttttcagt ttaatctttt caatatgttc 60

actcttttga gatgtcttgg atttggtgtt agtgagccta ctgacacttc ctcatcagag 120

tatgttccca agagttccgt tgaagagatt tccaacgaag tcgctgaact cgattcagtg 180

gatccatcat cccaatgtta caaacatgtt tttgtatcat tgatgctcgt aagaaagatg 240

acccaagctg ccgaagactt ccacaagagt tttgggggag aattcgatag cccttgttgt 300

agggtttacc gtctttatag acatttcgtt aatgaagacg atgcacccgc ttgggccata 360

ccgaatgtcg tgaatgaaga ttcttacgac gattatgcct acctccgaga ggagttagat 420

gccatagacg gctcatttga gttgctaaac gaagagcgtg agttatcgga atttacggac 480

agactcaatg ctttaagatt tttccctgtt tccaaaacag aagcgctacc agtggcgaat 540

gtccaagagg tcaaattcat ttctgagaac ataccagtta ttgatgacct ttattactac 600

tccgacgaga atattccgtc tgaaatgccc gcaccattac tggatgagtt ggggatgtta 660

ccagaggaac ttggacctct gaatgaaatc gaagacatta agccggtggc ggctccaatc 720

acattactat ctgagtttaa agtctcagat aatgctaagc cactcgacat agtcgaaatt 780

attccagacg taagtctgac gaaaccttat gaagccgtca tatcaggtaa tgattggatg 840

acgttgggga ggatgatacc taccactcct gttcctacca taagggatgt cttcttctct 900

ggtctttctc ggcatggatc gccggaagtg atccagaatg ctcttgatga atttcttccg 960

ctccatcatt caattgatga taagtatttt caagaatggg ttgaaacctc agataaatct 1020

ctcgatgtcg atccatgtcg aatcgatctg agcgttttca acaactggca gtcttcggga 1080

aactgctatg aacctcggtt taaaaccggt gcattatcca cacgtaaggg cactcaaact 1140

gaagccctat tagcgataaa gaaacgtaat atgaatgtgc ctaacctggg gcagatttat 1200

gacgtgaatt ctgttgctaa ttccgtggtt aataagctct taacaactgt tatagatcct 1260

gataagctat gtatgtttcc agattttata tctgagggtg aagtttcgta tttccaggac 1320

tatatagttg gaaagaatcc cgaccctgaa ttgtattcag atcctctagg tgttcgttcc 1380

atcgatagct ataaacacat gattaaatcc gtgttaaagc ccgttgaaga taattctctg 1440

cacctagaac ggccgatgcc agcaaccata acgtaccatg ataaagatat cgtgatgtca 1500

tcttcaccaa tttttttggc tgctgctgcc cgcttgatgt tagtcttaag agataagata 1560

actataccaa gcggaaaatt ccatcaattg ttttccatcg atgctgaagc ctttgatgca 1620

agtttccatt ttaaagagat agacttttcg aagttcgata aaagtcaaaa tgagttgcat 1680

cacttgatcc aggaaaggtt tctgaaatac ttaggtatac ccaacgaatt tctaacctta 1740

tggtttaatg cgcatagaaa atcccgaatc tcagattcga agaatggtgt tttctttaac 1800

gtcgatttcc aacgtcgtac tggagatgcg ctcacatact tgggaaacac aatagtgaca 1860

ttagcttgtc tgtgtcacgt gtatgatttg atggacccaa atgtgaaatt cgttgtcgct 1920

tccggtgatg attcattgat aggcactgtg gaggaattac caagagatca agagtttctt 1980

ttcacgactc tttttaatct tgaagcaaag tttcctcata accagccttt catatgcagt 2040

aagtttttga ttactatgcc cactataagt ggaggcaaag ttgtcctgcc tgtgccgaat 2100

ccattgaaac tcctcatacg cttgggttcg aagaaagtca atgccgatat attcgatgaa 2160

tggtatcaat cttggattga tataatcggt gtttttaacg atcaccatgt catccgatgc 2220

gttgccgcga tgacagcaca taggtatctc agaagaccga gtttatacct agaagctgct 2280

ttagaatccc taggtaagat cttcgctagt aagaccttgt gtaaggaatg cctctttaat 2340

gagaagcacg agtctaatgt aaaaattaag cctcgtagag tgaaaaaatc ccactcggat 2400

gccaggtcaa gggcacgccg agcttgatgt tttcttgaca taagtcaaat tgccaacctc 2460

cactgggtgg gtcaaggttg aggtatagaa tcctattcgc tcctgatagg agaaattcta 2520

tattgcttat atatgtgctt acgcacatat ataaatgctc atgcaaaact gcatgaatgc 2580

ccctaaggga tgc 2593

<210> 3

<211> 2007

<212> DNA

<213> 苜蓿花叶病毒RNA3

<400> 3

tcaactcaat taacgctttt acagtgtaat tcgtactttt cgtaagtaag tttctgtaaa 60

agcgtttctt gttttaattt ggtctaacac gtaattcgta ctcttcgtga gtaagttgtg 120

ttagccatac ctatccttta aatttctatc aatttagaaa gaaaatcatt cccattcgcg 180

taattcgtac tcttcgtgag taagttgcaa atggagaata caaaaacaaa tgcctcgagt 240

tctggaatgt cttcttcctc tagcttttca gtgtcttatg ctgaggaaat gttactagct 300

gatgaagttt caaaaataaa ctcaatgtcc attctgggtc ctaatcagct aaagctctgc 360

actcaattgg tgttgtctaa tggagcagcg ccagtagttt taagccttgt gtcaaaggaa 420

aagaagtcga ttttaaatcg tatgcttcct aagattggac agaggatgta cgtccatcac 480

tcggctattt acctccttta catgccaaac atactaaaaa gttcttcagg gagcatcacc 540

ttgaaacttt ttaacgaagc tacaggagag ttagtggatg ttgacaccga ccatgatgct 600

acccaggcat gtatatttgc tggacgttac ccccggagta ttctggcgaa agatgcagcg 660

aaaggacacg acttaaaatt agtcgtccac gctgttgctt cgaccaacat gaactctgct 720

gtcggtgttc tataccccat ctgggaagat gagttaagca gaaagcagat cctcgaaagg 780

ggtgccgatt tcctaaagtt tccaattgct gagaccgaac cagtccgcga tctcttaaat 840

gctgggaaat tgacgaattt tgttcttgat aggacaaggt taggtgtggg gtcgaagagt 900

gatcccagtc cggttctttt agaaccaaga gctaagattg ccgggaaggc aaagacactt 960

ttcattcccg aaggtcctag tgttcctagt accactataa atggtatggc accaacggtg 1020

cgtatagatg ccggttctcc aaagggtctt ggagtcccga aagggtttac atatgaaagt 1080

tttattaaag atgaaatatt acctgatcat tgatcggtaa tgggccgttt ttatttttaa 1140

ttttctttca aatacttcca tcatgagttc ttcacaaaag aaagctggtg ggaaagctgg 1200

taaacctact aaacgttctc agaactatgc tgctttacgc aaagctcaac tgccgaaacc 1260

tccggcgttg aaagtcccgg ttgtaaaacc gacgaatact atactgccac agacgggctg 1320

cgtgtggcaa agcctcggga cccctctgag tctgagctct tttaatgggc tcggcgcgag 1380

attcctctac agttttctga aggatttcgt gggacctcgg atcctcgaag aggatctgat 1440

ttacaggatg gtgttttcta taacaccgtc ccatgccggc accttttgtc tcactgatga 1500

cgtgacgact gaggatggta gggccgttgc gcatggtaat cccatgcaag aatttcctca 1560

aggcgtgttt cacgctaatg agaagttcgg gtttgagttg gtcttcacag ctcccaccca 1620

tgcgggaatg caaaaccaaa atttcaagca ttcctatgcc gtagccctct gtctggactt 1680

cgacgcgcag cctgagggat ccaaaaatcc ctcattccga ttcaacgaag tttgggtcga 1740

gagaaaggcg ttcccgcgag cagggcccct ccgcagttta attactgtgg ggctgctcga 1800

cgaagctgac gatcttgatc gtcattgatg taccccatta atttgggatg ctaaagtcat 1860

ttaatgctga cctccactgg gtggattaag gtcaaggtat gaagtcctat tcgctcctga 1920

taggatcgac ttcatattgc ttatatatgt gctaacgcac atatataaat gctcatgcaa 1980

aactgcatga atgcccctaa gggatgc 2007

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> AMV-RZ-R

<400> 4

tggagatgcc atgccgaccc gcatccctta ggggcattca tgcag 45

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> AMV-R1-35SF

<400> 5

atataaggaa gttcatttca tttggagagg tttttatctt acacacgctt gtgc 54

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> AMV-R2-35SF

<400> 6

atataaggaa gttcatttca tttggagagg tttttatctt ttcgcgattg aaaag 55

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> AMV-R3-35SF

<400> 7

atataaggaa gttcatttca tttggagagg tcaactcaat taacgctttt acag 54

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> pCB301-RZ-F

<400> 8

gggtcggcat ggcatctcca cctc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> pCB301-35S-R

<400> 9

cctctccaaa tgaaatgaac ttcc 24

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> AMV-CP-F

<400> 10

atgagttctt cacaaaagaa agctggt 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> AMV-CP-R

<400> 11

atgacgatca agatcgtcag cttcgtc 27

Claims

1.一种侵染性克隆的侵染性重组农杆菌，其特征在于，所述侵染性重组农杆菌是将重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和重组酵母质粒pCB301-AMVRNA3分别转入农杆菌感受态细胞中，经筛选分别获得含有pCB301-AMVRNA1的重组农杆菌、含有pCB301-AMVRNA2的重组农杆菌和含有pCB301-AMVRNA3的重组农杆菌，上述3种重组农杆菌的组合即为侵染性重组农杆菌；

所述重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和重组酵母质粒pCB301-AMVRNA3的制备方法如下：（1）提取含有苜蓿花叶病毒的大豆叶片总RNA，反转录得到苜蓿花叶病毒的cDNA；以所述cDNA为模板，通过PCR方法分段扩增，分别获得苜蓿花叶病毒基因组的RNA1、RNA2和RNA3；所述RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述RNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

（2）将植物表达载体pCB301-2μ-HDV线性化处理，得到线性化pCB301-2μ-HDV载体；

（3）同源重组：将所述线性化pCB301-2μ-HDV载体分别与步骤（1）获得的RNA1、RNA2和RNA3等摩尔比例混合，转化酵母菌得到重组酵母菌，筛选后提取质粒，分别获得含有RNA1的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA1、含有RNA2 的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA2和含有RNA3的重组酵母质粒pCB301-AMVRNA3；质粒pCB301-AMVRNA1、质粒pCB301-AMVRNA2和质粒pCB301-AMVRNA3的组合即为苜蓿花叶病毒侵染性克隆。

2.根据权利要求1所述的侵染性重组农杆菌，其特征在于，步骤（1）中所述反转录所用的引物为AMV-Rz-R，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1所述的侵染性重组农杆菌，其特征在于，步骤（1）中RNA1的 PCR扩增引物为AMV-R1-35SF和AMV-Rz-R；RNA2的 PCR扩增引物为AMV-R2-35SF和AMV-Rz-R；RNA3的PCR扩增引物为AMV-R3-35SF和AMV-Rz-R；所述AMV-Rz-R核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述AMV-R1-35SF核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述AMV-R2-35SF核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；所述AMV-R3-35SF核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

4.根据权利要求1所述的侵染性重组农杆菌，其特征在于，步骤（2）所述的植物表达载体pCB301-2μ-HDV线性化处理的方法为：以pCB301-2μ-HDV为模板，使用引物pCB301-RZ-F和pCB301-35S-R引物扩增pCB301-2μ-HDV载体，得到pCB301-2μ-HDV线性化的载体；所述引物pCB301-RZ-F核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，所述引物pCB301-35S-R核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。

5.根据权利要求1所述的侵染性重组农杆菌，其特征在于，步骤（3）中所述酵母菌为酵母菌Y2H Gold。

6.根据权利要求1所述的侵染性重组农杆菌，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌GV3101。