CN101775397B

CN101775397B - Gdu3基因的一种新用途

Info

Publication number: CN101775397B
Application number: CN2009100769018A
Authority: CN
Inventors: 谢旗; 陈浩; 吴耀荣
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2009-01-13
Filing date: 2009-01-13
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2029-01-13
Also published as: CN101775397A

Abstract

本发明公开了GDU3基因的一种新用途。本发明提供的GDU3基因的新用途是其在培育抗双生病毒植物中的应用；所述GDU3基因是编码如下(a)或(b)的蛋白质的基因：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。双生病毒的宿主范围很广，包括很多重要的经济作物，如甜菜、烟草、辣椒，对农业生产造成重大损失。应用本发明的方法，可提高农作物对双生病毒的耐性，从而减少由于双生病毒的侵染所造成的经济损失。本发明具有重大的经济价值和社会意义。

Description

GDU3基因的一种新用途

技术领域

本发明涉及GDU3基因的一种新用途。

背景技术

双生病毒科(Geminiviridae)的病毒是一类植物所特有的病毒，基因组是由单链环状DNA分子组成。病毒颗粒分子侵入植物细胞后，单链形式的基因组DNA先在细胞核中转换成双链形式的复制中间体和基因转录模板，中间体通过滚环复制(Rolling Circle)产生新的单链病毒分子。双生病毒一般存在于热带和亚热带地区，能感染很多经济作物，给农业生产带来较大损失。《Science》杂志1999年12月3日曾以“双生病毒正在成为作物的严重威胁”为标题专门报道了这类病毒。近年来，我国广西、云南、广东等地的烟草、番茄和南瓜等作物上，已先后发现有多种双生病毒。因此，研究双生病毒的致病机理与传播机制进而制订出相应的防治策略，对保障我国重要经济作物的生产具有重要的意义。双生病毒的基因组只能编码少数的蛋白，故其在植物宿主中的生命过程及感染途径几乎完全依赖植物宿主本身的组分。所以，分离植物中参与双生病毒侵染途径的基因，对于了解此类病毒在植物中的侵染途径，进而在遗传上改良植物以达到抗双生病毒侵染的效果，具有重大的理论和实践意义。

甜菜严重曲顶病毒(Beet severe curly top virus，BSCTV)(Lee S，StengerDC，Bisaro DM，Davis KR(1994)Identification of loci in Arabidopsis thatconfer resistance to geminivirus infection.Plant J 6(4)：525-535)(ParkSH，Hur J，Park J，Lee S，Lee TK，Chang M，Davi KR，Kim J，Lee S(2002)Identification of a tolerant locus on Arabidopsis thaliana to hypervirulentbeet curly top virus CFH strain.Mol Cells 13(2)：252-258)是双生病毒中的一种，宿主范围很广，包括很多重要的经济作物，如甜菜，烟草，辣椒，对农业生产造成重大损失。BSCTV基因组示意图见图1。感染BSCTV的植物见图2。

Glutamine Dumper 3(GDU3)，是一个尚未被报道的基因。它的命名是源于2004年Pilot等人报道的一个拟南芥中的同源基因Glutamine Dumper 1(GDU1)，Pilot等人将拟南芥中的其它5个GDU1的同源基因依次命名为GDU2-GDU6(Pilot G，Stransky H，Bushey DF，Pratelli R，Ludewig U，Wingate VP，Frommer WB(2004)Overexpression of GLUTAMINE DUMPER1 leads to hypersecretion of glutaminefrom Hydathodes of Arabidopsis leaves.Plant Cell 16(7)：1827-1840)，它们同属一个植物所特有的家族。

发明内容

本发明的目的是提供一种GDU3基因的一种新用途。

本发明提供的GDU3基因的新用途是GDU3基因在培育抗双生病毒植物中的应用；所述GDU3是如下(a)或(b)的蛋白质的基因：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。

所述GDU3基因的编码序列为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有65％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子；优选与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

所述双生病毒具体可为甜菜曲顶病毒，如甜菜严重曲顶病毒。

本发明还提供了一种培育抗双生病毒植物的方法，是在植物中表达或过量表达编码如下(a)或(b)的蛋白质的基因，获得抗双生病毒的植物：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述GDU3基因的编码序列为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

发明人通过一个高效的BSCTV接种系统，从拟南芥突变体库中分离了lsb1突变株，其对BSCTV的感病性约下降37％。通过原生质体瞬时DNA复制实验，发现BSCTV在lsb1突变株细胞中的复制明显减弱。通过“质粒拯救”(plasmid rescue)实验，定位了lsb1中T-DNA的插入位点，并发现该位点处于染色体上的非编码区。Northern blot及DNA芯片实验的结果表明lsb1中T-DNA插入位点旁侧GDU3基因的表达量均有着明显的上调。通过构建GDU3基因的高表达植物并对它们接种BSCTV，发现LSB1/GDU3(Glutamine Dumper 3)基因过量表达的转基因植物能现增强对BSCTV的抗性。该LSB1/GDU3基因的新用途可用于提高农作物对BSCTV的耐性，从而减少由于BSCTV的侵染所造成的经济损失，具有良好的应用前景。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为BSCTV基因组示意图。

图2为感染BSCTV的植物。A：烟草；B：甜菜；C：拟南芥；D：拟南芥花序；各图中左边为正常的植物，右边为受BSCTV侵染的植物。

图3为幼苗期lsb1突变株(lsb1)和野生型植株(WT)的形态。

图4为感染BSCTV后lsb1突变株和Col-7植株出现症状的植株所占的比率。

图5为lsb1突变株中BSCTV的积累量检测。

图6为EHA105(pCambia1305.1)接种后，lsb1突变株(lsb1)和野生型植株(WT)的GUS染色结果。

图7为lsb1突变株(lsb1)和野生型植株(WT)叶片单位面积上有GUS基因表达的位置的数目的比较。

图8为原生质体瞬时DNA复制实验中，BSCTV在lsb1突变株(lsb1)和野生型植株(WT)中的复制水平。

图9为lsb1突变株(lsb1)中T-DNA的插入位点。

图10为lsb1突变株(lsb1)和野生型植株(WT)中GDU3基因的表达量比较。

图11为GDU3基因高表达植株和对照植株的表达量鉴定结果。

图12为感染BSCTV后GDU3基因高表达植株和对照植株出现症状的植株所占的比率。

图13为原生质体瞬时DNA复制实验中，BSCTV在GDU3基因高表达植株和对照植株中的复制水平。

图14为幼苗期的GDU3基因高表达植株和对照植株。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中，所用到的pCambia BSCTV制备过程如下：

BSCTV(ATCC PVMC-6)，以前称为BCTV-CFH株。这个菌株将用EcoRI线性化的BSCTV的双链DNA保存在质粒pCFH上。为了将部分重复的BSCTV基因组DNA以头对尾的方式克隆到双元载体pCAMBIA1300(CAMBIA，Canberra，Australia)，先用BamHI和EcoRI一起从pCFH上切下一个2.4kb(约为0.8个拷贝的基因组DNA)的片段，再将这个片段连接到由BamHI和EcoRI酶切的pCAMBIA1300载体中，构成中间质粒pCAMBIA1300-BSCTV0.8。再用EcoRI从pCFH上切下3.0kb的完整的BSCTV基因组DNA片段，进而将这个片段插入到经过EcoRI酶切的pCAMBIA1300-BSCTV0.8中，最终获得pCAMBIA1300-BSCTV。这个质粒上含有以头对尾的方式连在一起的1.8个拷贝的BSCTV基因组DNA。

实施例1、GDU3基因新用途的发现

从拟南芥资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)购买带激活标签(Activation tag)的pSKI015系列的T-DNA突变体库(Weigel D，Ahn JH，BlazquezMA，Borevitz JO，Christensen SK，Fankhauser C，Ferrandiz C，Kardailsky I，Malancharuvil EJ，Neff MM，Nguyen JT，Sato S，Wang ZY，Xia Y，Dixon RA，Harrison MJ，Lamb CJ，Yanofsky MF，Chory J(2000)Activation tagging inArabidopsis.Plant Physiol 122(4)：1003-1013)。通过高效的表型筛选系统，从突变体库中分离出一个对BSCTV感病性下降约37％的突变体，将其命名为lsb1(less susceptible to BSCTV 1)。lsb1突变株有一个较为明显的形态学表型，即在幼苗期比野生型植物小，但其成体植物与野生型相比差别不大。为幼苗期lsb1突变株(lsb1)和野生型植株(WT)的形态见图3。

对该lsb1突变株进行以下鉴定：

一、lsb1突变株BSCTV感染率的鉴定

分别用BSCTV(美国典型培养物保藏中心，ATCC，American Type CultureCollection获得，收藏号：PVMC-6)(Lee S，Stenger DC，Bisaro DM，Davis KR(1994)Identification of loci in Arabidopsis that confer resistance to geminivirusinfection.Plant J 6(4)：525-535)(Park SH，Hur J，Park J，Lee S，Lee TK，Chang M，Davi KR，Kim J，Lee S(2002)Identification of a tolerant locuson Arabidopsis thaliana to hypervirulent beet curly top virus CFH strain.Mol Cells 13(2)：252-258)感染lsb1突变株(lsb1)和Col-7拟南芥植株(Col-7)各200株，每天观察植株的形态学表型，统计两组植株中，出现病毒感染症状的植株所占的比率。试验设置3次重复，结果取平均值。结果见图4。由图4可见，接种BSCTV之后，lsb1突变株出现病毒感染症状的比率远远低于Col-7植株。

在lsb1突变株接种了BSCTV 3周后，随机选1株出现病毒感染症状的植株和14株没有出现病毒感染症状的植株，提取植株(含接种部位)的总DNA，通过Southernblot实验检测BSCTV的积累。结果见图5。图5中，1：出现病毒感染症状的植株；2-15：没有出现病毒感染症状的植株。由图5可见，大多数没有出现病毒感染症状的植株检测不到病毒DNA的积累，只有两株植株(泳道9和泳道15)中可以检测得到少量开环双链病毒DNA(open circular dsDNA)。

将pCambia1305.1质粒(CAMBIA公司)转入EHA105，用与接种BSCTV一样的方式接种lsb1突变株(lsb1)和Col-7拟南芥植株(WT)各50株，培养植株。pCambia1305.1质粒含有一个带内含子的GUS基因，由于含有内含子，农杆菌由于无法对其进行正确剪接而不能表达GUS基因，所以该GUS基因只能在植物细胞中表达。每天检测植株中是否有GUS基因的表达。lsb1突变株和Col-7拟南芥植株接种EHA105(pCambiai305.1)后均可于第三天在叶片上检测到大量GUS基因的表达(见图6)。用ImageJ的图像软件(美国国立卫生研究院(NIH，National Institute of Health))对lsb1突变株和Col-7拟南芥植株叶片单位面积上有GUS基因表达的位置的数目进行统计和比较，发现两种植株没有明显的区别(见图7)。这表明农杆菌将T-DNA转运到lsb1突变株细胞核内的过程没有被明显地削弱。

以上结果表明：BSCTV对lsb1突变株的感染率确实降低了。

二、BSCTV原生质体瞬时DNA复制实验

用pCambia BSCTV质粒转染lsb1突变株(lsb1)和Col-7拟南芥植株(WT)的叶肉细胞的原生质体，使BSCTV在细胞内进行瞬时的DNA复制(transient DNAreplication)。接着通过Southern blot分析BSCTV在lsb1突变株和Col-7拟南芥植株细胞中复制水平是否存在差异。结果见图8。图8中，1：WT转染0天；2：WT转染2天；3：WT转染4天；4：lsb1转染0天；5：lsb1转染2天；6：lsb1转染4天。结果表明，与对照相比，BSCTV在lsb1中的复制明显减少。

三、T-DNA插入位点的确定及插入位点旁侧基因表达量的分析

由于插入到lsb1突变株中的双元载体pSKI015的T-DNA区域含有pUC19的序列，所以可以通过酶切把pUC19从插入的基因组DNA中“拯救”出来，并可带出部分插入位点旁侧的基因组DNA，通过测序即可确定插入位点，这称为“plasmid rescue”。用位于T-DNA内部靠近其右边界的SpeI及靠近其左边界的HindIII分别成功地把pUC19从lsb1的基因组DNA中“拯救”出来，确定T-DNA的插入位置的左右两端。根据美国J.Craig Venter研究所(JCVI，即以前的TIGR，The Institute for GenomicResearch)对拟南芥基因组序列的预测，这个T-DNA插入位点不在任何基因内部，在插入位点前后10kb的区域里共有三个基因(见图9)，其中，At5g57685(又名Glutamine Dumper 3，GDU3)在位点的上游，靠近T-DNA的左边界。

采用Northern blot鉴定lsb1突变株(lsb1)和Col-7拟南芥植株(WT)中GDU3基因的表达量，发现lsb1突变株中GDU3基因的表达量有明显的上调(见图10)。

实施例2、抗双生病毒植物的培育

一、GDU3基因的克隆

根据GDU3基因的序列(GenBank Accession Number：BT014818设计一对引物如下：

上游引物：5’-ATCGGATCC(BamHI)ATGGAAGGAAGACAATATTAC-3’；

下游引物：5’-CTGACTAGT(SalI)TCAATGTGTCTCACCGTTAC-3’。

以Col-7拟南芥(购自美国拟南芥资源中心，Arabidopsis Biological ResourceCenter)的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增GDU3基因的编码序列(CDS，codingsequence)，并在片段两端加上适当的酶切位点。对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0.45kb的条带，与预期结果相符。用溶液回收试剂盒(Axygen)回收该片段，并用两端的酶切位点(BamHI和SalI)对DNA片段进行酶切并连接到经过相同酶切处理的双元载体pCanHA(将CAMBIA公司的pCambia1300上的植物抗性基因hygromycin基因替换为kanamycin基因，并将植物中常用的35S花椰菜花叶病毒启动子序列克隆到载体的多克隆位点区)上，用35S启动子驱动GDU3基因的过量表达。对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的基因与数椐库中的数据相符，即由447个脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列2的自5′末端第1至447位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质。

二、GDU3基因高表达植物的培育

将上述构建好的质粒转入农杆菌EHA105中，通过花转化的方法转化Col-7拟南芥，具体步骤如下：

挑单克隆菌落接入5ml含抗生素(10μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素)的LB培养基，28℃摇菌过夜。培养得到的菌液倒入500ml含抗生素(10μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素)的LB培养基，28℃摇菌过夜。将菌液倒入400ml离心管，4000rpm离心20min，收集菌体。用转化液(5％蔗糖、0.05％Silwet L-77)悬浮菌体，花浸泡法转化Col-7拟南芥，每组植物浸泡约20秒。用塑料膜覆盖转化后的植物1d，保持湿润。转化后的植物在土壤中继续生长，待成熟后收集种子。在含有50μg/ml卡那霉素的MS固体培养基上筛选转基因植物，并通过Northern blot进行鉴定，得到若干GDU3基因高表达植株，从中挑选了6株进行具体的分析。

同样，用空载体转化Col-7拟南芥，随机选取2株转空载体植株作为对照植株。

GDU3基因高表达植株和转空载体对照植株的表达量鉴定结果见图11。

三、高表达植株抗双生病毒能力的鉴定

用GDU3基因高表达植株和转空载体对照植株的T₂代植株进行以下鉴定试验：

1、BSCTV感染率的鉴定

分别用BSCTV接种6个株系的GDU3基因高表达植株的T₂代植株和2个株系的转空载体对照植株的T₂代植株(每个株系40株)。每天观察植株的形态学表型，统计两组植株中，出现病毒感染症状的植株所占的比率。试验设置3次重复，结果取平均值。结果见图12。可见，接种BSCTV后GDU3基因高表达植株出现病症的比例明显低于对照植株。

2、BSCTV原生质体瞬时DNA复制实验

用pCambia BSCTV转染GDU3基因高表达植株的T₂代植株和转空载体对照植株的T₂代植株的叶肉细胞的原生质体，使BSCTV在细胞内进行瞬时的DNA复制(transientDNA replication)。接着通过Southern blot分析BSCTV在GDU3基因高表达植株和对照植株细胞中复制水平是否存在差异。结果表明，与对照相比，BSCTV在GDU3基因高表达植株中的复制明显减少。其中一个株系的GDU3基因高表达植株的T₂代植株和一个株系的转空载体对照植株的鉴定结果见图13。图13中，1：对照植株转染0天；2：对照植株转染2天；3：对照植株转染4天；4：GDU3基因高表达植株转染0天；5：GDU3基因高表达植株转染2天；6：GDU3基因高表达植株转染4天。

3、形态鉴定

GDU3基因高表达植株的T₂代植株的幼苗小于转空载体对照植株的T₂代植株的幼苗。图14为一个株系的GDU3基因高表达植株的T₂代植株的幼苗和一个株系的转空载体对照植株的T₂代植株的幼苗的照片。图14中，A为对照植株；B为GDU3基因高表达植株。表明正是GDU3基因表达量的上调导致了lsb1的表型。基于上述发现，将GDU3基因重新命名为LSB1/GDU3。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>GDU3基因的一种新用途

<130>CGGNARY92027

<160>2

<210>1

<211>148

<212>PRT

<213>鼠耳芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

Met Glu Gly Arg Gln Tyr Tyr Pro Pro Arg Glu Asn Val Glu Gly Asn

1 5 10 15

Arg Thr Thr Met Gly Gly Gly Pro His Ser Pro Trp His Ser Pro Val

20 25 30

Pro Tyr Leu Phe Gly Gly Leu Ala Ala Met Leu Gly Leu Ile Ala Phe

35 40 45

Ala Leu Leu Ile Leu Ala Cys Ser Tyr Trp Arg Leu Ser Gly Tyr Leu

50 55 60

Asp Gly Glu Glu Asn Gln Ser Arg Glu Arg Asp Leu Glu Val Gly Asp

65 70 75 80

Val Lys Pro Asp Lys Thr Ala Val Lys Pro Val Ala Leu Pro Glu Lys

85 90 95

Phe Leu Val Ile Met Ala Gly Asn Val Lys Pro Thr Tyr Leu Ala Thr

100 105 110

Pro Ser Val Lys Thr Cys Thr Cys Asp Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp

115 120 125

Asp Val Glu Gly Ser Asp Gln Val Val Pro Arg Ser Ser Glu Ser Asn

130 135 140

Gly Glu Thr His

145

<210>2

<211>447

<212>DNA

<213>鼠耳芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

atggaaggaa gacaatatta ccctccgaga gaaaacgttg aaggaaacag aaccaccatg 60

ggaggaggac ctcactcacc gtggcattca ccggttcctt atctctttgg tggtttagca 120

gcgatgcttg gtctcatagc ttttgctctt ctaatcctcg cttgctctta ctggcgtctc 180

tccggttatc tagacggcga ggaaaaccag agcagagaga gagatcttga agtcggagat 240

gtgaaacctg acaaaacggc ggtgaagcct gtagctttgc cggagaagtt cttggtgatt 300

atggccggaa atgtcaaacc tacttactta gcaacgccgt cggtaaaaac gtgtacttgt 360

gacgatgatg acgatgaaga tgatgacgtg gagggaagtg atcaggtggt gccgcggagt 420

agtgaaagta acggtgagac acattga 447

Claims

1.编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因在培育抗双生病毒植物中的应用；

所述双生病毒为甜菜严重曲顶病毒；

所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基因的编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子。

3.一种培育抗双生病毒植物的方法，是在植物中表达或过量表达编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因，获得抗双生病毒的植物；

所述双生病毒为甜菜严重曲顶病毒；

所述植物为拟南芥。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基因的编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子。