CN104611356A - 一种rna表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明是一种RNA表达载体及其用途，描述了一个基于诺达驱动大量表达在多种类型的细胞的外源基因的DNA载体的生产。最初由宿主细胞的RNA聚合酶产生的nodaviralRNA依赖的RNA聚合酶（RNA复制酶）被翻译的初级转录转录的DNA质粒。然后，这些初级转录的RNA复制酶扩增，以自治，细胞质RNA的复制。这种载体是一个有益补充，目前阿森纳的表达载体，非常适合实验室规模和较大规模的成绩单和/或蛋白质在真核细胞中的表达。

Description

一种RNA表达载体

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种RNA表达载体及其用途。

发明背景    nodaviruses单股正链RNA基因组的二十面体病毒。昆虫和鱼幼虫已分离出几种不同的病毒家族成员，然而，尽管病毒的自然宿主范围有限，许多诺达病毒RNA复制酶保留完整的昆虫，哺乳动物，植物，甚至是酵母细胞的活性，它们之间的最简单和最强大的真核生物RNA复制酶称为。诺达病毒RNA复制酶的复制产生大量皑皑的mRNA在细胞质，例如，放大后nodamura病毒（11）的RNA在幼仓鼠肾细胞（BHK21）24小时，正链RNA的复制产品之丰富的核糖体（约有10.sup.7每个细胞的分子）和主宰细胞的蛋白质合成能力。

分子生物学的Nodaviridae，病毒颗粒含有一个分子中的两个单链的基因组片段，基因组RNA1和RNA2，这两者都是需要的病毒感染。这些RNA的5'帽，但没有3'聚腺苷酸尾。相反，其3'末端被封锁由一个共价修饰或不寻常的二级结构。 RNA1，在良好的特点羊群房子病毒（FHV），含有3107个核苷酸，编码的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA复制酶），同时复制RNA1和RNA2基因组片段的整个病毒的贡献。 RNA1因此可以独立复制RNA2构成一个自主RNA复制子（3）。其核苷酸序列显示预测112千道尔顿（kDa）的多肽的开放阅读框（ORF）（蛋白A），对应的RNA复制酶的催化亚基。在复制过程中基因组RNA1，一个子基因组RNA（RNA3）表示的3'基因组RNA1 387个核苷酸，产生的部分的转录。 RNA3编码，在重叠的读码框，两个小，约11 kDa的非结构蛋白（B1和B2）。这些蛋白质的功能是未知的，既不似乎是必不可少的RNA复制。

nodaviruses，只有4.5 kb的基因组中，很显然，是最简单的，所有的动物病毒。然而，它们的RNA可以在从酵母到哺乳动物细胞中的细胞内环境中的各种各样的大量复制，这意味着所需的宿主细胞因子是保守的。不一定是细胞毒性的，长期的病毒RNA复制的事实，一些nodaviruses可以很容易地建立持续性感染的细胞的培养表示。此外，分段式结构简化了实验操作的nodaviral基因组复制酶基因，表明RNA复制酶功能自然在反供其使用的表达载体中方便的属性。

大多数表达载体使用的DNA模板的转录的RNA在细胞内的积累，一个过程，是线性的DNA模板的拷贝数，取决于实现。nodaviruses和他们的RNA复制酶表达载体的一种新型的发展创造一个有吸引力的机会。本发明的目标是提供最初由宿主细胞产生初级转录，翻译的RNA复制酶的RNA聚合酶转录的DNA质粒。这些初级转录自治区，细胞质，RNA的复制，然后放大。这些载体的性能取决于初级转录的效率比初级转录由nodaviral RNA复制的指数扩增。如上所述，这个过程在一个非常广泛的宿主细胞中大量存在，并且很大程度上独立于细胞代谢活性水平。因此，在这些质粒载体应该是适合用在昆虫，哺乳动物，植物和酵母细胞，静止细胞中的常规的表达载体中，通常情况下失败，他们也可能具有更多的优点。

现有技术的缺陷在放大在细胞中自主RNA复制的可用性的结病毒为基础的表达载体。本发明弥补了这个缺陷。

 

发明内容

本发明提供一种的结病毒为基础的DNA的表达载体，能够得到高水平的重组转录和/或蛋白质的细胞类型在很宽的频谱。该载体包含一个的阿德纳依赖性RNA聚合酶的启动子位点来驱动的初级转录合成。初级转录至少包含两个序列中的元素。初级RNA转录物的5'末端，包含从结病毒的RNA-依赖性RNA聚合酶（RNA复制酶）催化亚基的开放阅读框，优选涌向内部病毒（FHV），Nodamura病毒（NOV）或Pariacoto病毒（PAV）。5'开放读码框的嵌合体在细胞中的初级转录，转染的的结病毒为基础的DNA表达载体，使用宿主细胞的机械翻译产生活跃的结病毒RNA依赖的RNA聚合酶，随后识别和复制的初级转录。此外包括初级RNA转录nodaviral的顺式作用的信号识别所需的RNA复制。的顺式作用的信号侧翼，至少，异源基因，该基因编码一个理想的转录和/或蛋白质（例如，核酶，反义RNA，或蛋白质具有治疗潜力的），例如由异源基因编码的转录扩增RNA复制。优选地，顺式调控元件的位置，编码RNA复制酶的转录也被复制，并随后被放大。此策略产生大量水平的封端的，功能很容易被宿主细胞表达的mRNA在细胞质中。这种新型的表达载体吸引人的特点是它的高表达水平和广泛的宿主范围。

在本发明的一个目的是提供一种结病毒为基础的DNA表达载体。

在本发明的一个实施例，提供了一个分离的cDNA编码一个Nodamura病毒（NOV）RNA1基因组片段具有在序列号1中所示的序列，分离的cDNA编码一个Nodamura病毒（NOV）RNA2的基因组片段具有序列示于序列号2，分离的cDNA编码一个Pariacoto病毒（PAV）RNA1具有在序列号3中所示的序列的基因组片段，分离的cDNA编码一个Pariacoto病毒（PAV）RNA2的基因组片段具有序列示于序列号4。

在本发明的另一个实施例中，提供一个的结病毒为基础的DNA表达载体，其特征在于，包括：DNA依赖性RNA聚合酶启动子;的cDNA编码nodaviral的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA复制酶），其可操作地连接到RNA聚合酶侧翼RNA复制酶的cDNA和异源基因的cDNA编码的核酶裂解的表达载体的转录启动子，异源基因; nodaviral顺式元件，其特征在于，所述裂解产生3'端确认的总RNA的RNA复制酶复制的成绩单。

在又一个本发明的实施例，提供一个的结病毒为基础的DNA在细胞中的表达载体所编码的是转录的复制扩增的方法，包括以下步骤：引入细胞的表达载体或RNA转录物的矢量披露。

本发明的本发明的优选实施例的以下描述，本发明的其它和进一步的方面，特征和优点将是显而易见的。在这些实施例中给出的公开的目的。

具体实施方式

本发明的目的之一是提供一种的结病毒为基础的DNA表达载体，能够得到高浓度的异源转录和/或蛋白质的细胞类型在很宽的频谱。该载体含有启动子的宿主细胞的依赖于DNA的RNA聚合酶定位驱动的初级转录合成的网站。初级转录包含至少两个序列中的元素。的主要的RNA转录物的5'末端，包含的nodaviral RNA依赖的RNA聚合酶（RNA复制酶）催化亚基的开放阅读框。在转染细胞被宿主细胞翻译机械嵌合转录本翻译产生活动结病毒RNA复制，可以复制的酶的mRNA进行适当的顺式作用的信号在哺乳动物，鸟类，昆虫，植物，酵母细胞。因此，确认的复制酶的顺式作用信号和所需的复制侧翼的RNA复制酶基因和异源基因，该基因编码一个理想的转录和/或蛋白质。

两侧适当的顺式作用的信号时，异源RNA序列由结病毒的replicases的有效地复制，从而产生丰富的层次的封端的和功能性的mRNA在细胞质中直接。因此，这种强大的RNA扩增系统提供了一个有价值的真核表达载体。由于DNA是更容易和更便宜的制备，存储和传递到RNA细胞比，本文中利用本发明的DNA的质粒载体，其中，当导入细胞中，转录成RNA，推出细胞质RNA的复制，因此，扩增的转录和/或DNA载体上所含的外源基因编码的蛋白。

本发明是指向一个的结病毒为基础的DNA表达载体。

本发明是针对一个分离的cDNA编码一个Nodamura病毒（NOV）RNA1基因组片段具有在序列号1中所示的序列，分离的cDNA编码一个Nodamura病毒（NOV）RNA2的基因组片段具有序列表中SEQ ID第2号，分离的cDNA编码一个Pariacoto病毒RNA1（PAV）具有在序列号3中所示的序列的基因组片段，分离的cDNA编码一个Pariacoto病毒（PAV）RNA2的基因组片段具有序列表中SEQ ID否＃4。另外，本发明还指向包含的Nodamura病毒和Pariacoto的本发明中，与这些DNA载体转染的宿主细胞的病毒cDNA的DNA载体。

本发明进一步指向一个结病毒为基础的DNA表达载体，它包括：一个DNA依赖性RNA聚合酶启动子;的cDNA编码nodaviral的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA复制酶），RNA聚合酶启动子可操作地连接到一个异源基因; nodaviral顺式元件侧翼的RNA复制酶的cDNA和异源基因的cDNA编码的核酶裂解的表达载体中的转录，其特征在于，所述裂解生成3'端的RNA复制酶RNA复制的成绩单确认。

另外，本发明还指向基于诺达病毒DNA在细胞中的表达载体，其特征在于引入到一个单元格的步骤，本发明的一个的结病毒为基础的DNA的表达载体或RNA编码的成绩单复制扩增的方法的该表达载体编码的成绩单。

优选的是，所述表达载体包含基因组RNA1的nodaviral基因组片段，并且顺式作用的信号来自于基因组RNA1，RNA2或RNA3 RNA复制或转录。的表达载体可以进一步包括一个由噬菌体T7 RNA聚合酶的转录终止信号的序列，该序列或真核细胞的poly（A）和/或转录终止信号，其中，所述的聚（A）和/或转录终止信号的3'的顺式作用元件。

代表RNA聚合酶启动子诱导的启动子，组成型启动子，组织特异性启动子和合成发起人。代表性的可诱导启动子是激素反应的热休克蛋白70启动子，金属硫蛋白启动子，醇脱氢酶启动子，半乳糖启动子，有代表性的组成型启动子的劳斯肉瘤病毒（RSV）LTR启动子，人巨细胞病毒（CMV）的主要立即早期基因启动子和SV40早期启动子和有代表性的组织特异性启动子是α-珠蛋白启动子和β-珠蛋白启动子。

通常情况下，nodaviral RNA复制酶和nodaviral的顺式作用元件是从结病毒，如鸡群内部病毒，Nodamura病毒和病毒Pariacoto的的的。代表性的装置引入的的结病毒为基础的DNA表达载体包括，但不限于，注射（通过`基因枪）（有或无脂或其他载体），转染或感染的DNA基因组中的生物体到其中的已被插入合适的载体序列（例如，以下病毒家族的成员：腺病毒，疱疹病毒，细小病毒，杆状病毒，乳多空病毒等）。在一般情况下，异源基因可以是一个理想的转录和/或如核酶，反义RNA，具有治疗潜力的蛋白质，或编码基因的囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的编码基因，编码基因疱疹单纯病毒胸苷激酶编码基因的多核苷酸磷酸化酶的基因编码的α-珠蛋白或基因编码的β-珠蛋白。

一个本领域的技术人员在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本文所公开的，可向本发明的各种替换和修改，这将是明显的。

“DNA分子”指的是其可以是单链形式或双链螺旋形式的脱氧核糖核苷酸的碱基的聚合物。这个术语是指只到小学和中学的分子结构，并没有把它限制在任何特定的三级形式。因此，该术语包括双链DNA，其中包括线性DNA分子（如限制性片段），病毒，质粒和染色体。的DNA和/或RNA的结构，本文所讨论的，根据惯例，只有序列的DNA或RNA的非转录链（即，具有与mRNA同源序列的链）的5'到3'方向上沿正常。

“载体”是一种DNA的复制子，如质粒，粘粒，噬菌体，病毒，可能会附着到另一个DNA片段，以实现连接的段的复制。 “复制子”是指任何遗传元件（如质粒，染色体，病毒基因组或组件），为DNA或RNA在体内复制的自主单位，即，能够在适当的细胞内环境中它自己的复制功能。如本文所用，自治区装置，通常是在一个单一的共价键接的分子，所有的遗传信息的顺式作用的调控序列要实现它自己的复制时，该分子被引入到合适的细胞内环境。 “复制起点”，是指那些DNA或RNA序列，指导和调节DNA或RNA合成的起始。 “表达控制序列”是控制和调节另一DNA或RNA序列的转录和/或翻译的DNA或RNA序列。甲编码序列“可操作地连接”和“的控制下，在细胞中的转录和翻译控制序列的RNA聚合酶转录成mRNA，然后翻译成由编码序列编码的蛋白质的编码序列。

在一般情况下，含有促进有效率地转录和翻译所插入的DNA片段的启动子序列的表达载体中使用的连接与一个特定的宿主细胞。的表达载体典型地含有复制起点，启动子（次），终止子（次），以及特定的基因，能够提供携带表达载体的宿主细胞的表型选择。此外，表达载体可以被引入一个以上的宿主细胞，这需要合适的启动子序列和/或为每个主机的复制起点，使得所需的基因（s）被表达或复制的载体，适当的宿主细胞（次）。转化的细胞可以根据本领域中已知的装置，以达到最佳的细胞生长，发酵和培养。一般来说，大肠杆菌是用于准备和获得足够量的一个向量，如质粒的宿主细胞。这些类型的`宿主细胞中可能是不同的等宿主细胞中，该载体被使用（例如，哺乳动物细胞，人体组织等）。

DNA“编码序列”是一个被转录成RNA，RNA翻译成多肽置于适当的调控序列的控制下时，在体内的双链DNA序列。的编码序列的边界由一个起始密码子的5'（氨基）末端的翻译终止密码子的3'末端（羧基）。编码序列可包括但不限于，原核序列，从病毒感染原核细胞或真核细胞，真核mRNA的cDNA的，从真核细胞（如哺乳动物）DNA的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列的基因组的序列。阿多聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3'端。复制DNA或互补DNA的“基因”被定义为，是从mRNA转录逆转录反应的产物。 “外显子”是从被表达为蛋白质的基因位点，转录的序列，而“内含子”是一个非表达序列的基因位点。

转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子，增强子，多聚腺苷酸化信号，终止子等的，即提供了在宿主细胞中的编码序列的表达。甲“的顺式元件”是与蛋白（次）可上调或下调表达一个特定的基因位点的核苷酸序列。这里所用的“nodaviral顺式作用元件”是由nodaviral RNA复制和直接复制谈话确认的核苷酸序列。 “信号序列”也可以包括与编码序列。该序列编码信号肽的N-末端的多肽，对宿主细胞进行通信，并引导到适当的细胞中的位置多肽。信号的序列，可以发现与原产原核生物和真核生物的各种蛋白质。

“启动子序列”是能够在编码序列的下游（3'非转录链的方向上）的一个单元格并启动转录的RNA聚合酶结合的DNA调节区。为了定义本发明的目的，启动子序列在其3'末端的转录起始位点为界延伸的上游（5'非转录链的方向上）包括最低限度的必要的核苷酸数，起始转录水平检测到上述背景。

“重组DNA技术”指的是技术团结两个异源DNA分子，通常是由于在不同的生物体的DNA体外连接。通常所生产的基因工程实验的重组DNA分子。同义术语包括“基因拼接”，“分子克隆”和“基因工程”。这些操作的结果，在“重组”或“重组分子”的商品。

一个细胞已“转化”或“转”外源性或异源DNA，这种DNA在细胞内被引入。转化DNA可能会或可能不会被整合（共价连接）入细胞的基因组中。在原核生物，酵母和哺乳动物细胞，例如，转化DNA可被保持，如载体或质粒上的一个附加元件。对于真核细胞，稳定转化的细胞为转化DNA整合入染色体已成为，以便它继承通过染色体的复制子细胞。这种稳定性的真核细胞建立人口含有转化DNA的子代细胞组成的细胞系或克隆的能力证明。一个“克隆”是从一个单细胞有丝分裂或祖先细胞人口。一个“细胞”，能够在体外稳定增长为许多世代的主要或其他细胞的克隆。一个生物体，如植物或动物，已转化的外源DNA被称为“转基因”。

如本文所用，术语“主机”是指包括不仅是原核生物，真核生物，如酵母，植物和动物细胞。可以使用的重组DNA分子或基因，使用任何通常已知在本技术领域的普通技术人员的技术转化宿主。原核宿主可包括大肠埃希氏菌，伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。真核宿主包括酵母，例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），巴斯德毕赤酵母，哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，如拟南芥和以烟草烟草。

DNA构建体的“异源”区域或基因的DNA片段是可识别的，在一个较大的DNA分子被发现，但在本质上具有较大的分子相关联。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，基因通常不侧翼源有机体的基因组中的哺乳动物基因组DNA的DNA两侧。在另一个例子中，编码序列本身可能不能在自然界中发现（如，其中的基因组编码序列含有内含子，或具有不同的天然基因的密码子的合成序列的cDNA）。等位变异或天然发生的突变事件不产生如本文所定义的DNA异源区域。

可以使用一个标准的Northern印迹测定，以确定在获得从植物或其他转基因组织，在根据现有的Northern杂交技术在本技术领域的普通技术人员已知的那些人的细胞或组织的mRNA的相对量。另外，一个标准的可用于进行Southern blot分析，确认存在，并在转基因系统的基因的拷贝数，按照与常规Southern杂交技术在本领域的普通技术人员公知的。 Northern印迹和Southern印迹中使用的杂交探针，例如，放射性标记的cDNA或RNA，或者含有全长，单链DNA或RNA或其片段的序列至少20个（优选至少30，更优选至少50，最优选至少100个连续核苷酸的长度）。由任何本领域的技术人员已知的许多不同的方法可以被标记的DNA杂交探针。

如本文所用，术语“的结病毒为基础的DNA表达载体”是指一个或多个DNA表达载体表达一个nodaviral的RNA依赖性RNA聚合酶进行复制，从而扩增DNA表达载体产生成绩单依靠。

如本文所用，术语“复制扩增”是指由于RNA复制的转录的数目增加。在本发明中，复制的初级RNA转录物产生的最初的转录的DNA载体，或其中所含的碱基序列。

实施例1

诺达的cDNA表达和复制

植绒房子病毒的基因组片段的功能性cDNA克隆全长感染性的RNA噬菌体的RNA聚合酶在体外或体内，或由RNA聚合酶的牛痘病毒的转录成在体内。使用这种方法来研究羊群房子病毒RNA的复制，我们发现，在任一端的初级转录的cDNA模板的端子扩展严重抑制后续的复制。 5'的扩展的依赖于DNA的RNA聚合酶启动子的精确定位，避免使用和来自丁型肝炎病毒（HDV）的顺式作用核酶的自我切割的初级转录。这种方法允许重建羊群房子病毒RNA的复制效率接近原生病毒DNA质粒。

Claims (8)

1.一种RNA表达载体及其用途,其特征在于一个孤立的cDNA的Nodamura的RNA2的病毒基因组片段和具有序列示于序列号2，包括Nodamura病毒cDNA权利要求1的DNA载体。

2.根据权利要求1所述的包括的Pariacoto病毒cDNA的权利要求4的DNA载体。

3.根据权利要求1所述的DNA载体转染的宿主细胞。

4.根据权利要求1所述的一个孤立的cDNA的Pariacoto的RNA2的病毒基因组片段和具有序列示于SEQ ID号4。

5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的核酶是来自丁型肝炎病毒。

6.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述DNA依赖性RNA聚合酶启动子，诱导型启动子的组成型启动子，组织特异性启动子，一种人工合成的启动子组成的组中选择。

7.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述结病毒RNA复制酶编码的cDNA序列的SED ID NO：1或3。

8.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述nodaviruis RNA2的转录物编码的cDNA序列的SEQ ID NO：2或4。