JPH09505474A

JPH09505474A - 翻訳エンハンサーｄｎａ

Info

Publication number: JPH09505474A
Application number: JP7514922A
Authority: JP
Inventors: チヤーナジヨブスキー，ユーテイ・ルイス・アルバート
Original assignee: ブリテイツシユ・テクノロジー・グループ・リミテツド
Priority date: 1993-11-26
Filing date: 1994-11-25
Publication date: 1997-06-03
Also published as: CA2174863A1; EP0730645A1; AU1074495A; AU692196B2; GB9424130D0; US5723332A; GB2284210B; GB2284210A; WO1995014775A1

Abstract

(57)【要約】キネシンの（β−）軽鎖を発現する遺伝子は、強力な翻訳エンハンサーとなる高二次構造のＤＮＡ領域を５’末端に含んでいる。ヒトキネシン遺伝子では、これが二重ヘアピンループを形成する。任意にフランキング配列を有するこの二次構造体は単離ＤＮＡとして記載されている。ＤＮＡが外来ＤＮＡの発現用エンハンサーとして機能する構築物も記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】翻訳エンハンサーＤＮＡ発明の背景１．発明の分野本発明はタンパク質の産生で核酸の翻訳エンハンサーとして有用なＤＮＡに関する。２．従来技術の説明キネシンは、脳細胞のオルガネラの細胞内運搬や細胞分裂中での染色体の微小管沿いの移動に関与する分子モータータンパク質である。ウニや哺乳動物細胞では、キネシンは四量体タンパク質として特徴付けられていた。２つのサブユニットは、相対分子量が約１２０ｋＤａである２つの重鎖（α鎖）、及び約７０ｋＤａの２つの軽鎖（β鎖）である。細胞内オルガネラは、四量体αα／ββキネシン分子モーターに結合することによって細胞内を微小管沿いに移動する。α鎖はチューブリン結合部位及びＡＴＰアーゼドメインとなり、β鎖はキネシン四量体によって移動させるべきオルガネラとの特異結合を担う。現在、３種のラット脳キネシンβ鎖ｃＤＮＡがクローニングされ（Ｊ．Ｌ．Ｃｙｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，１０１１４−１０１１８）、またＭ．Ｄ．Ａｄａｍｓ等によって報告されたヒトゲノムの配列決定研究の結果、ヒト由来の部分ｃＤＮＡ配列（ＥＳＴ００７６１と称する）がＥＭＢＬデータベースに入力された（Ｎａｔｕｒｅ３５５，６３２−６３４（１９９２））。３種のラットｃＤＮＡは、１個の遺伝子を３'末端で特異的にスプライシングしてタンパク質で異なるＣＯＯＨ末端を生じた生成物であって、β軽鎖には「Ａ」、「Ｂ」及び「Ｃ」と称する３つの異なるイソ形が予想される。この機構がキネシンにオルガネラとの結合特異性を付与するように思える。２３０９ｂｐ長のヒトβ−キネシンｃＤＮＡ配列はＬ．Ｂ．Ｌａｃｈｍａｎ等によって受託番号ＬＯ４７３３でＥＭＢＬデータベースに入力され、Ｃａｂｅｚａ−Ａｒｖｅｌｉｚ等（ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２，８８１−８９２，１９９３）によって公表されている。発明の要約今回、β鎖キネシンゲノムＤＮＡが、強力な翻訳エンハンサー（プロモーションのエンハンサーと混同しないこと）となる高二次構造のＤＮＡ領域を含んでいることが知見された。ヒトキネシンでは、二次構造は遺伝子の第１エキソン内にあって、ｍＲＮＡの５'非翻訳末端となる。二次構造は二重ヘアピンループの形態をとり、このヘアピンループは図面の図４ではｍＲＮＡで図示され、配列表では配列番号６として記載されている。本発明はキネシンのβ軽鎖遺伝子の部分からの単離ＤＮＡ、及びＤＮＡが翻訳エンハンサーとして機能する様々な構築物を包含する。従って、本発明は一態様により、翻訳エンハンサーであって、ヘアピンループとして表され得る高二次構造領域又は翻訳を促進するその置換もしくは欠失突然変異体を含んでなる、キネシンのβ軽鎖を発現する対立遺伝子の５'末端からの単離ＤＮＡを包含する。単離ＤＮＡはこのように、二次構造領域を含み、任意に付加的なＤＮＡをその５’又は３’末端に含んでいる。このＤＮＡは同一のキネシン遺伝子に由来するＤＮＡであってもよい。従って、単離ＤＮＡはβ軽鎖遺伝子の５’末端に向かって５’方向に位置する上記ＤＮＡのいずれか又は全てを含み得る。従って、単離ＤＮＡはｍＲＮＡ出発部位の上流に位置するプロモーター領域の一部又は全てを含み得る。単離ＤＮＡは（非翻訳ｍＲＮＡをコードする第１エキソンとβ−キネシンタンパク質のＮ末端領域をコードする第２エキソンとの間に位置する）第１イントロンの一部又は全てを含み得る。 β−キネシンプロモーターは特に強力というわけではないので、本発明は、翻訳エンハンサーＤＮＡを強力な真核細胞プロモーターに結合することによってより良く使用され得る。従って、本発明は他の態様により、（１）真核細胞プロモーター、好ましくは天然β−キネシン遺伝子よりも強力な外来プロモーター、（２）その下流にある本発明の翻訳エンハンサーＤＮＡ、及び（３）エンハンサーの下流にあって、β−キネシン以外のタンパク質をコードする外来ＤＮＡを含んでなる、タンパク質をコードする非β−キネシンＤＮＡの発現を促進するための構築物を提供する。 β−キネシン遺伝子は更に第１エキソン内の二次構造の上流に、小さなタンパク質（１２ａａ長）をコードする領域を含んでいる。この領域は、幾分下流でのリボソームのｍＲＮＡとの結合を容易にするように設計されているように思える。従って、β−キネシン遺伝子の第１エキソンは内部エントリーリボソーム部位（ＩＲＥＳ）を提供するように思える。このような部位によって、ｍＲＮＡは翻訳開始部位とは関係なく翻訳され得る。実際、この部位によって１個のプロモーターを用いて２個の遺伝子を転写させ得る方法が得られ得る。従って、本発明は他の態様により、（１）真核細胞プロモーター、（２）プロモーターの下流にある第１外来ＤＮＡ、即ちβ−キネシン以外の第１タンパク質をコードし、転写シグナルの終結が欠如したＤＮＡ、（３）第１外来ＤＮＡの下流にあって、小さなタンパク質をコードする領域を更に含み、かくして内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）として、また翻訳促進のために機能する本発明のＤＮＡ、及び（４）ＩＲＥＳ翻訳エンハンサーＤＮＡの下流にある第２外来ＤＮＡ、即ちβ−キネシン以外の第２タンパク質をコードし、ｍＲＮＡをＩＲＥＳから翻訳させることができるようにＩＲＥＳ翻訳エンハンサーＤＮＡから下流に離れて位置するＤＮＡを含んでなる、２つのタンパク質コード化ＤＮＡの発現用構築物を提供する。図面の簡単な説明ヒトβ−キネシンのゲノムＤＮＡから単離されたファージ２．１Ｂ及びプラスミドＥ／Ｓに挿入されたそのクローン化断片の制限酵素マップである。図２はヒトβ−キネシン遺伝子の５’末端の８３８ｋｂ長ＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。これは配列番号１と同一の配列であるが、特徴をグラフィックで表している。図３は、１２ａａペプチドをコードするヒトゲノムＤＮＡの第１エキソンの部分に対応する配列（これらの配列は配列番号２、配列番号３（ヒト配列）、及び配列番号４、配列番号５（ラット配列）と同一配列である）を含み、更にコード配列の開始を含むヒトキネシン及びラットｃＤＮＡのＤＮＡ配列比較を示す。図４は、配列番号６に対応するゲノムＤＮＡの第１エキソンの他の部分に対応するヒトキネシンｍＲＮＡ内の高二次構造領域（翻訳エンハンサー）を示す。図５はエンハンサーを含む図２の配列部分の、ＣＡＴリポーター遺伝子を含むプラスミド内への挿入を示す。図６及び図７は本発明の翻訳エンハンサーＤＮＡを含む２種のＤＮＡ構築物を概略的に示す。図８はウサギ網状赤血球溶解物アッセイでヒトβ−キネシンｃＲＮＡからｉｎｖｉｔｒｏ翻訳した放射性標識タンパク質のプロットを示す。図９は、一方がプロモーターとＣＡＴ遺伝子との間にヒトβ−キネシンヘアピンループフラグメントを有する点だけが異なる２種のプラスミドからＣＡＴ遺伝子を発現させるときの、ＣＯＳ細胞内にトランスフェクトしたＤＮＡの量に対するＣＡＴ活性のプロットを示す。好ましい実施態様の説明配列番号１に対応する図２は、ヒトβ−キネシン遺伝子の５’フランキング、エキソン及びイントロンのＤＮＡ配列（８３８ヌクレオチド）を示す。番号はｍＲＮＡの転写開始部位（＋１）以後又はその上流（負数）のヌクレオチドの位置を示す。第１エキソン（１〜２５３）はイタリック体で下線を引く。制限酵素部位には下線を引いて酵素を明記する。推定上のＴＡＴＡボックス、ＳＰ１及びｃＡＭＰ調節転写因子（ＣＲＥＢ）結合部位は斜線区域内にある。図示するように、プロモーター領域は、通常真核細胞プロモーターに存在する同定された転写因子結合部位によって示されるようなヌクレオチド−１〜少なくとも−１２１である。配列の他端では、ヌクレオチド２５４以降が９ｋｂ長以上であると考えられる第１イントロン領域の部分である。配列番号６に対応する図４は、ヒトβ−キネシン遺伝子由来の本発明のＤＮＡのエンハンサー機能を担う高度の二次構造を示す。この図面はｍＲＮＡ塩基で記載しているが、ウラシル（Ｕ）を全てチミン（Ｔ）に代えることによって簡単にゲノム又はｃＤＮＡに置換することができる。従って、ＣＵＧＣＵＧ．．．で始まるｍＲＮＡの左端は図２の１３２〜１３７のヌクレオチドＣＴＧＣＴＧとなり、．．．ＡＧＧＣＧ（Ａ）で終わるｍＲＮＡの右端は図２のヌクレオチド２４９−２５３に存在する。ＲＮＡ末端のＡヌクレオチドは、第２エキソン開始時の推定上の開始コドンのヌクレオチドであるため、図２には示さない。図示する翻訳エンハンサー領域は潜在的な二重ヘアピンループを有し、一方は５’末端からヌクレオチド１３２〜１７６に及ぶ直鎖状ループであり、他方はヌクレオチド１７７〜２５３の分枝状ループである。従って、この第２ループは７６ヌクレオチド長である。しかしながらラットβ−キネシンｃＤＮＡ配列はこの第２ループの領域内でヒトよりも６７ヌクレオチド短いので、ラットＤＮＡには７６長の第２ループの大半が欠けていると考えるのが妥当であり得る。更にはβ −キネシン遺伝子はラットで十分に発現されるので、恐らく翻訳促進には第１ループだけが必要であろう。従って、翻訳エンハンサーに必要な高二次構造のコア区域は第１ループのコア区域であると考えられる。 β−キネシンの高二次構造区域が生物によって幾分異なり、本発明は、区域がどんな哺乳動物、動物もしくは他の生物に由来しようと、又はどれに類似していようとも翻訳エンハンサーとして作用するのに十分な区域を含んでいると考えられよう。所望とあれば、例えばＢａｌ３１酵素を用いて過剰長のエンハンサーを切り取ることができるし、又はポリメラーゼ連鎖反応を用いて所望されるより短い長さを作ることができる。β−キネシンに由来するものであろうとなかろうと、付加長のＤＮＡを３’末端又は５’末端に加えることができる。天然ＤＮＡが５’又は３’フランキングゲノムＤＮＡを１〜１００塩基対含んでいることが好ましい。特にセルフペアリングしない領域で、また特に第１ヘアピンループの下流（３ ’部分）及び第２ヘアピンループ内の場所でＤＮＡ塩基を置換することによって二次構造の些細な点を変えることができると考えられよう。特にループ内でＤＮＡ塩基を１０％まで変えることができ、またその代わりに又はこれに加えて通常４つ以下と僅かな欠失をもたらしてもよい。このような突然変異はエンハンサー機能に影響するほどドラスチックであってはならない。 β−キネシンｍＲＮＡは、ラットとヒトとの間に保持される短い読み取り枠を含んでいる：図３を参照されたい。この読み取り枠は上流にコンセンサスリボソーム結合部位を含んでいない。第１ＡＵＧコドンは開始するには好ましくない状況内にあるので、このような短い読み取り枠はリボソームのより強力な内部コンセンサスリボソーム部位へのスライドを助けるという利点があると考えられる。このＯＲＦは領域に内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）機能を付与するのに有用であると考えられる。ＩＲＥＳ機能は他の遺伝子、但し主にウイルス（例えばＨＩＶ、ＥＭＣＶ又はポリオウイルス）で知見されており、動物遺伝子では希有とみなされている。更には、図３のヒトβ−キネシン配列はＥＭＢＬデータベースの対応するｃＤＮＡ配列とは、１２４位にアデニン（Ａ）ではなく、シチジン（Ｃ）残基を有する点が異なる。本発明の構築物では、β−キネシンプロモーターをエプスタイン−バールウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルスの長い重複反復又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するようなより強力な真核細胞プロモーターで置換するかもしくはこれを先行させることが好ましいし、又はメタロチオネインのような誘発性プロモーターであってもよい。プロモーターとエンハンサーとの距離（エンハンサーの５’側）や、エンハンサーと外来遺伝子の開始コドンとの距離（エンハンサーの３’側）は本発明では重要でないと考えられる。本発明のＩＲＥＳ構築物の場合のプロモーターと第１外来遺伝子の開始コドンとの距離や、エンハンサーと第２外来遺伝子の開始コドンとの距離についても同様である。実際、エンハンサーの３’側では、β−キネシン遺伝子の第１イントロン領域が約９ｋｂ対の長さを有し、９ｋｂｐ以下の分離であれば少なくとも作動可能であろう。実施例では、距離は約１５０ｂｐである。正確な最小距離を測定するための別の簡単な実験が当業者によって容易に実施されよう。本発明の構築物はどんな外来遺伝子も使用できるが、１個のプロモーター及び１個のｍＲＮＡ分子からの発現が効果的であるために、２個のポリペプチドサブユニットからなるタンパク質（例えば抗体）がＩＲＥＳ構築物で使用するのに特に有利である。以下の実施例で本発明を説明する。関係する全てのプラスミドはクローニングして、良く知られた株であるＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ細胞内に維持した。ヌクレオチドの名称は図２に示す。実施例１Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーをλ ＥＭＢＬ３ファージベクターにクローニングした。３０個のプレート（直径１５ｃｍ）でそれぞれ２０，０００個のファージを平板培養した。ナイロン膜に移して、紫外線で架橋させた後に、仔ウシ胸腺ＤＮＡプライマーによるランダムプライミングで標識したヒトキネシン軽鎖の全長ｃＤＮＡ（２．４ｋｂ）でフィルターをプロービングした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションステップ中にサケ精子及びＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ（それぞれ５０ｍｇ／ｍｌ）を使用した。第１スクリーンでは、３３個（１１個が真陽性）のプラークを単離し、これを第３スクリーニング及び精製ステップに付した。これらのクローンを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより異なる制限フラグメントパターンに基づいて１０のグループに分けた。結果によれば、キネシン遺伝子のイントロンは大きく、遺伝子は９０ｋｂ以上に及ぶことが示唆される。ｐＧｅｍ３Ｚ中のβｉ−キネシン（ｉ＝免疫細胞に由来）と称するＴ細胞ライブラリー由来のヒトキネシンβ鎖ｃＤＮＡ（ＥＭＢＬデータベース受託番号：ＬＯ４７３３）をＤｒ．Ｌ．Ｂ．Ｌａｃｈｍａｎ（Ｄｅｐｔ．ｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｄ．ＡｎｄｅｒｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の好意で入手した。ｃＤＮＡの５’ＨｉｎｄIIIフラグメント（０．３ｋｂ）をプローブとして使用すると、３グループのクローンに対して強いハイブリダイゼーションを示した。更なる研究のためにこれらのクローンの一つ２．１Ｂを選択した。その制限マップを図１（上部）に示す。「Ｃｏｓ」はファージの付着端を示す。その制限マップを図１（下部）（矢印は図２の配列を示す）に示す４．６ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを更にプラスミドｐＵＣ１９内にサブクローニングした。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（「シークナーゼ」、ＵＳＢ）を用いたジデオキシシーケンシングにより、得られたプラスミド「Ｅ／Ｓ」の配列を決定した。ｃＤＮＡの０．３ｋｂ５’末端とハイブリダイズするより小さなフラグメントを更にサブクローニングした。これらは１．２ｋｂＰｓｔＩ及び０．６ｋｂＰｓｔＩ−ＳｍａＩフラグメントであった。ＰｓｔＩ−ＳｍａＩ（０．６ｋｂ）フラグメントの全ＤＮＡ配列及び５’ゲノムフランキング配列の付加的な配列を配列番号１及び図２に示す。これらの配列はβ−キネシン遺伝子のプロモーター区域、第１エキソン及び第１イントロンの部分を包含する。プロモーター配列は、図２に示すように、ヌクレオチド−１２１〜−１１５， −７５〜−６９及び−６５〜−５９のＳＰ１（ＧＧＣＧＧＧＧ）、ヌクレオチド −４６〜−３７のＣＲＥＢ（ＡＴＧＡＣＧＴＣＡ）、並びにヌクレオチド−３２〜−２７のＴＡＴＡボックス（ＣＡＴＴＴＣ）を含む幾つかの推定上の転写因子結合部位を含んでいる。第１エキソンは２５３ヌクレオチド長であり、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に対応する。このＤＮＡ領域を最近クローニングされたラットｃＤＮＡと比較したところ、予想通りこの区域で進化的分岐が判明したが、驚くべきことに、ヌクレオチド９３−１３１の区域で高度の相同性も判明し、この区域は、前方にコンセンサスリボソーム結合部位を持たない（図３）小さなペプチド（ヒト配列番号３の１２アミノ酸長及びラットキネシン軽鎖イソ形Ａ、Ｃ、配列番号５の１２アミノ酸長）をコードしているようである（注：ラットｃＤＮＡのこの部分では、Ａ及びＣと予想されるイソ形はＢと同一であると考えられる）。このコード化領域の直後には、図４に示すように、非常に安定な二次ｍＲＮＡ構造（ ΔＧ＝−５２．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を形成し得るＧＣに富んだ領域が来る。興味深いことに、ヒトｍＲＮＡだけが１２２ヌクレオチド（ＮＯ．１３２−２５３）を必要とする二重ヘアピン構造を形成することができ、ラットｍＲＮＡはキネシンタンパク質開始部位の前のこの領域に６７のヌクレオチドしか有さず、可能な一重ヘアピン構造の安定性もより低い（ΔＧ＝−２３．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。クローニングして配列を決定したゲノムＤＮＡの領域が機能的であることを示すために、β−キネシンプロモーターが細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の転写を駆動するリポータープラスミドを以下のように構築した。ＨｉｎｄIII及びＢｇｌIIを用いて、ＨＳＶ−ｔｋプロモーターをベクターｐＢＬＣＡＴ９＋から取り出し（Ｌ．Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓ等，ＮｕｃｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１６，６４７−６６３（１９８８））、これらの末端をＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントでブラント末端とし、ｄＮＹＰを充填した。キネシンプロモーター領域のＨｉｎｄ III−Ａｓｐ７１８３．６ｋｂフラグメントも同様にブラント末端として、充填し、ＣＡＴ遺伝子開始コドンの前に介在する配列がごく少量であるこのベクターでＣＡＴ遺伝子に連結した。ＢａｍＨＩ及びＢｇｌIIにより制限して、ＣＡＴ遺伝子に関するインサートの配向を評価した。ＣＡＴ遺伝子に関して右配向でプロモーターを含むプラスミドを「クローン６」と名付けた。図５は、ＣＡＴ遺伝子の後にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを有し、更にアンピシリン抵抗マーカー遺伝子（図示せず）を含む得られたプラスミドを示す。「クローン６」をＨｅＬａ細胞内に選択可能マーカープラスミドｐＳＶ２ｎｅｏと共にトランスフェクトした。対照としては、同一の細菌リポーター遺伝子を駆動するＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターを有するプラスミドｐＢＬＣＡＴ９＋を更にｐＳＶ２ｎｅｏと共にトランスフェクトした。２０ｍｇのリポーター（ＣＡＴ）遺伝子プラスミド及び１ｍｇの選択可能プラスミドを用いてリン酸カルシウム沈殿法により細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクトした後に、細胞をＤＭＥＭ中、１０％グリセロールで４分間の浸透ショックを与え、ＤＭＥＭ無血清培地で２度洗浄し、ＤＭＥＭ中１０％ＦＢＳで４８時間回収し、次いでトリプシン処理し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地中に１〜４倍に希釈した。２〜３週間後に、３０〜４０個のクローンをプールし、単一の細胞集団として増殖させた。文献（Ｙ．Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ等，ＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ９，１９９−２１２（１９９０）及びＣ．Ｍ．Ｇｏｒｍａｎ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２，１０４４−１０５１（１９８２））に記載の方法でＣＡＴアッセイを実施した。対照プラスミド中でのＨＳＶ−ｔｋプロモーターからの発現と同様に、リポーター遺伝子プラスミド中でのβ−キネシンｃＤＮＡフラグメント由来のＣＡＴ遺伝子の発現は構築的であった。転化率が酵素濃度に直線的に依存する条件下で、クロラムフェニコールからそのアセチル化誘導体への転化率を測定した。線形ＣＡＴアッセイを行うのに必要なタンパク質抽出物の量を検定すると、「クローン６」でトランスフェクトした細胞では、「クローン６」由来のＣＡＴ活性タンパク質０．２μｇから、対照プラスミドのタンパク質１５μｇからとほぼ同様の転化率が得られることが判明した。これはタンパク質抽出物単位重量当たり、ｐＢＬＣＡＴ９＋でトランスフェクトした細胞からの抽出物の７５倍のＣＡＴ活性に相当する。ｃＡＭＰキナーゼシグナル化経路の第２メッセンジャー同族体又はリポーター遺伝子の発現を誘発し得ないタンパク質キナーゼＣ．コレラ毒素、ホルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）及びＰＭＡでキネシンプロモーターをアップレギュレート（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）する試みがなされた。それどころか、これらはβ− キネシンプロモーターを僅かに阻害し、対照（ＨＳＶ−ｔｋプロモータ駆動）プラスミドを強く阻害した。実施例２ヒト肺線維芽細胞を用いて同様の実験を行い、β−キネシンｍＲＮＡの発現をノーザンブロットで測定した。ＰＭＡ、ジブチリルｃＡＭＰ又は二本鎖ＲＮＡによる処理後に発現に変化は見られなかった。実施例３ＤｒＡｕｄｒｅｙＥｖａｎｓ，ＤｉｒｅｃｔｏｒｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａＵＳＡから入手した神経芽腫細胞系ＮＢ１００を用いて実施例１を繰り返した。結果は実施例１と非常に類似しており、ＣＡＴ遺伝子発現は約７５倍に増加した。実施例４対照プラスミドのＨＳＶ−ｔｋプロモーターをＮＳＥ（ニューロン特異エノラーゼ）プロモーターに代えて、実施例３を繰り返した。ＮＳＥは神経芽腫細胞で非常に強力なプロモーターである。にもかかわらず、本発明の構築物ではＣＡＴ遺伝子の発現が７５〜１００倍に増加した。実施例５この実施例は、ヘアピンループ領域が本発明のキネシンＤＮＡの翻訳促進機能を担うことを示している。キネシンβｉのｃＤＮＡを、それぞれ図２の１１４−１１９位及び２３９−２４４位の単一制限部位であるＮａｒＩ（ＧＧＣＧＣＣを認識する）及びＳａｕＩ（ＣＴＣＡＧＧを認識し、ＡｏｃＩとしても知られている）で消化して、ヘアピンループ構造を除去した。（ヘアピン構造は１３３位と２５５位との間に位置するが、全てを除去してＲＮＡの自己アニーリングの可能性を損なう必要はない）。ヘアピンループ領域の欠失したフラグメントをゲル精製した。突出した末端にＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント及びｄＮＴＰを充填し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと再度連結した。個々にヘアピンループが切り出された全長βｉキネシンｃＤＮＡを保有するプラスミドｐＧＥＭ３ｚを調製し、翻訳終結コドンの３’に位置するＡｐａＩ部位で線状化した。キャップ同族体７−メチルＧｐｐｐＧの存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてキャップ構造のｃＲＮＡを合成した。供給業者が推奨する条件下でウサギ網状赤血球溶解調製物（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）及び³⁵［Ｓ］−メチオニンを用いて、このｃＲＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ翻訳した。翻訳後、Ｌａｅｍｍｌｉ法により生成物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲルを１Ｍサリチル酸ナトリウムで処理し、乾燥し、オートラジオグラフィーにかけてゲルを分析した。ｃＲＮＡの希釈液を用いて、ウサギ網状赤血球溶解物でのｃＤＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳の効率を比較した。図８では、Ｘ軸の２５μｌ容量の翻訳媒質中のｃＲＮＡ量（ｎｇ）に対する³⁵Ｓメチオニン（数／分）をｙ軸にプロットする。図８は、実線で示すヘアピンループ構造のないｃＲＮＡ（ＨＰ−）の翻訳が破線で示す全長元ｃＤＮＡ由来のｃＲＮＡ（ＦＬ）ほど効果がないことを示している。低いｍＲＮＡ濃度ではＦＬｃＲＮＡの方が翻訳速度が速かった。実施例６この実施例は、ヘアピンループ領域が真核細胞の過渡的発現系で遺伝子発現をアップレギュレートすることを示している。このプラスミドは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）ｍＲＮＡの５’非コード化領域の３ ’に直接ヘアピン配列を置き、ＣＡＴリポーター遺伝子を駆動するＨＳＶ−ｔｋプロモーターを含んでいる。ヘアピンループ構造がないことを除いて構築物が同一である対照プラスミドｐＢＬＣＡＴ９（実施例１を参照されたい）を比較に使用した。５’−ヒトβ−キネシンＵＴＲヘアピンループフラグメントをコードするプラスミドｐＳＶ２ＭＡＦから実施例５の方法で得られた１５０ｂｐ，ＮａｒＩ−ＳａｕＩゲル精製フラグメントをクレノーフラグメントでブラント末端とし、ＳｍａＩで線状化したｐＵＣ１８内に連結した。得られたプラスミドをｐＵＣ１８／ＨＰと名付けた。次のステップは、ｐＢＬＣＡＴ９プラスミドからＨＳＶｔｋプロモーターを取り出し、これをβ−キネシンヘアピンループフラグメントに連結し、次いでこの構築物をプロモーターだけではなくｐＢＬＣＡＴ９ベクター内に挿入することであった。使用するｔｋＤＮＡは２５０ｂｐ長で、２００塩基の５’非コード化領域のプロモーター、続いてｍＲＮＡ転写部位下流の５０塩基を含んでいる。（ＨＳＶｔｋは２００塩基長のプロモーター領域を有し、その後には、ｔｋ遺伝子の開始コドンに先行するＲＮＡ内に転写される１１０塩基のＤＮＡが存在する。この研究では、５’非コード化ＤＮＡの最後の６０塩基は使用しなかった。）ｔｋプロモーターをコードするプラスミドｐＢＬＣＡＴ９由来のゲル精製フラグメントである２５０ｂｐＢｇｌII−ＳａｌＩをクレノーフラグメントでブラント末端とし、Ａｓｐ７１８で線状化しクレノーフラグメントで処理したｐＵＣ１８／ＨＰ内に連結して、β−キネシンヘアピンループフラグメントを、ＨＳＶｔｋプロモーターＤＮＡの３’に直接導入した。この構築物をｐＵＣ１８／Ｔｋ／ＨＰと名付けた。ヘアピンループフラグメント及びｔｋプロモーターをコードするｐＵＣ１８／Ｔｋ／ＨＰ由来の３７５ｂｐゲル精製ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIで切断してゲル精製したｐＢＬＣＡＴ９内に連結した。この構築物はｐＢＬＣＡＴ／ＨＰと称し、以下の線状配置のＤＮＡ（５’→ ３’）：ｔｋプロモーター−キネシンＨＰループ−ＣＡＴ遺伝子−ＳＶ４０を含んでいる。対照プラスミドｐＢＬＣＡＴ９は線状配置：ｔｋプロモーター−ＣＡＴ−ＳＶ４０を有する。リン酸カルシウム沈殿法でＣＯＳ細胞（ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を発現するサル腎線維芽細胞：Ｐ．Ｍｅｌｌｏｎ等，Ｃｅｌｌ２７，２７９−２８８［１９８１］を参照されたい）を過渡的にトランスフェクトすると、５’キネシンＵＴＲヘアピンループフラグメント（黒四角）が、ヘアピンループインサートのない対照プラスミド（白四角）の４倍までＣＡＴリポーター遺伝子の発現をアップレギュレートすることが判明した。結果を図９に示す。この図では、ｘ軸のトランスフェクシヨンでのＤＮＡの使用量（μｇ）に対するＣＡＴ活性単位をｙ軸にプロットしている。ＣＡＴ活性の単位をＣＡＴ活性の標準的な薄層クロマトグラフィーアッセイのオートラジオグラムから計算し、トランスフェクシヨン毎に５μｇの一定量で使用したプラスミドｐＳＶ₂Ｌ（ｄｅＷｅｔ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，７，７２５−７３７［１９８７］）からのホタルルシフェラーゼ活性に正規化した。トランスフェクシヨン毎に１０μ ｇ及び１５μｇのｐＵＣ１８ＤＮＡを使用して、各トランスフェクシヨンに対する全ＤＮＡを２５μｇに維持した。実施例７この実施例では、ヒトキネシン遺伝子の５’ＵＴＲがＩＲＥＳとして作用することが確認される。ポリシストロニックレトロウイルスベクターＳＲ１０を以下に記載するように構築した：ヒトキネシン遺伝子のヘアピン領域を含む約１８５ｂｐのＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＳＶ₂ＭＡＦから増殖させた。２７量体の３’プライマーはＮｃｏＩ部位を含み、配列ＣＴＴＴＡＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴ（配列番号７）を有していた。２３量体５’キネシンプライマーの配列は一部、塩基１１４−１２７と相補的であり、ＥｃｏＲＩ部位を含んでいた。配列はＡＴＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＣＴＡＧＣＴＧ（配列番号８）であった。１８５ｂｐＰＣＲフラグメントをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで制限し、ＮｃｏＲＩ／ＮｃｏＩでゲル精製したｐＣＩＴＥＥＣＤＴＮＦＲに連結した。このプラスミドは、ヒトｐ７５ＴＮＦＲＥＣＤをコードする８００ｂｐフラグメントを有する。ＮｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ消化は５９２ｂｐＩＲＥＳ部位配列（Ｎｏｖａｇｅｎ）を除去する。得られたプラスミドはＳＲ９と名付けた。ヒトキネシンＨＰ及びヒトｐ７５ＴＮＦＥＣＤを含む９７０ｂｐＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩＳＲ９フラグメントを、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＢａｂｅＰＡＧＯＮｅｏ内に連結してプラスミドＳＲ１０を得た。ｐＢａｂｅＰＡＧＯＮｅｏはＢｇｌII／ＰｖｕII、ＭｕＬｖＬＴＲ下流の１．７ｋｂＨＳＶ−ＴＫフラグメント、次いでＳＶ４０初期プロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルスベクターである。ＳＲ１０では、ＨＳＶ−ＴＫとＳＶ４０初期プロモーター配列との間にＳＲ９由来の５’ヘアピンキネシンＵＴＲ／ｐ７５ＴＮＦＲＥＣＤハイブリッド配列を挿入する。従って、ＳＲ１０ではこれによって、ヒトｐ７５腫瘍壊死因子レセプター細胞外ドメイン（ｐ７５ＴＮＦＲＥＣＤ）の細胞外ドメインをコードするリポーター遺伝子のすぐ上流で、ＬＴＲＭｕＬｖプロモーターによって駆動されるチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列のすぐ下流に５’−キネシンＵＴＲを含む１７０ｂｐフラグメントが得られた。ｐ７５ＴＮＦＲリポーター遺伝子はプロモーターを持たないので、過渡的なトランスフェクションの実験で発現させると、ヘアピン構造はＩＲＥＳとして作用すると考えられ得る。ＨＰフラグメントが公知のＥＭＣＩＲＥＳによって置換されていることを除いて同一であるプラスミドｐＢａｂｅＰＡＧＯｎｅｏＥＣＤを対照として使用した。異なる量のＳＲ１０又はｐＢａｂｅＰａｇｏｎｅｏでトランスフェクトしてから２日後に、ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｍｅｌｍａｎｓ等，１９９３Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，２００７−２０１７）によって細胞上清中のｐ７５ＴＮＦＲの量を測定した。発現レベルをトランスフェクション効率について正規化できるように、（ルシフェラーゼリポーター遺伝子をコードする）プラスミドＰＳＶ₂ＬＵＣを試験プラスミド又は対照プラスミドと共にトランスフェクトした。更には、任意のＰＵＣ１８を全てのトランスフェクションに含ませて、トランスフェクトしたＤＮＡの量を標準化した。ＳＲ１０及びｐＢａｂｅＰＡＧＯｎｅｏＥＣＤプラスミドをＣＯＳ細胞中に過渡的に感染させた。これらのプラスミドのいずれか１０μｇを５μｇのＰＳＶ₂ＬＵＣ及びトランスフェクトしたプラスミドの総量を２５μｇ以下にするのに十分なＰＵＣ１８プラスミドと共にトランスフェクトした。トランスフェクションは過渡的で、トランスフェクトしてから４８時間後に、希釈度が１：１００の捕捉抗体としてのモノクローナル抗体４Ｃ８、及び希釈度が１：５０００の第２のビオチニル化ポリクローナルウサギＩｇＧ抗ＴＮＦ−Ｒ７５抗体、次いでストレプトアビジンペルオキシダーゼをベースとするＥＬＩＳＡによって組み換えタンパク質産生のレベルを測定した。トランスフェクトした細胞タンパク質抽出物中のルシフェラーゼの量を調べ、これを使用してトランスフェクション効率に関する発現値を正規化した。ＥＬＩＳＡ用抗体はＤｒＭＢｅｍｅｌｍａｎｓ（Ｂｅｍｅｌｍａｎｓ等、１９９３Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０２００７−２０１７）からの寄贈品であった。以上の結果から、ＳＲ１０プラスミドでは組み換えｐ７５ＴＮＦＲ−ＥＣＤタンパク質が高レベルで産生し、ヘアピンフラグメントが実際にはＩＲＥＳとして作用することが確認された。産生レベルは、同量（１０μｇ）でトランスフェクトしたときにｐＢａｂｅＰＡＧＯｎｅｏプラスミドのＥＭＣＩＲＥＳで開始される場合の１０倍までに達するように思えた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘアピンループとして表わすことができる高二次構造領域又は翻訳を促進するその置換もしくは欠失突然変異体を含みかつ翻訳エンハンサーである、キネシンのβ軽鎖を発現する遺伝子の５'末端由来の単離ＤＮＡ。２．遺伝子の５’末端と第１イントロンの３’末端との間に位置する前記軽鎖の部分に由来する請求項１に記載のＤＮＡ。３．二次構造が本質的に、ヒトキネシン遺伝子の第１エキソン内の二重ヘアピンループ全体又はその上流一重ヘアピンループのみからなる請求項１又は２に記載のＤＮＡ。４．二次構造が本質的に配列番号１又は図２のヌクレオチド１３２〜２５３からなる請求項３に記載のＤＮＡ。５．前記二次構造の他に、軽鎖の５’又は３’フランキングＤＮＡを１〜１００塩基対含んでいる請求項２に記載のＤＮＡ。６．二次構造の上流に約１２アミノ酸のタンパク質を予測する短い読み取り枠を更に含んでいる請求項１から５のいずれか一項に記載の単離ＤＮＡ。７．５’から３’の方向に、（１）真核細胞プロモーター、（２）翻訳を促進するための請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡ、及び（３）β−キネシン以外のタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる、タンパク質をコードする非β−キネシンＤＮＡの発現を促進するための構築物。８．５’から３’の方向に、（１）真核細胞プロモーター、（２）プロモーターの下流にあって、β−キネシン以外の第１タンパク質をコードし、転写終結シグナルの欠如したＤＮＡ、（３）内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）として、また翻訳促進のための請求項６に記載のＤＮＡ、及び（４）ＩＲＥＳＤＮＡの下流にあって、β−キネシン以外の第２タンパク質をコードし、ｍＲＮＡをＩＲＥＳから翻訳させることができるようにＩＲＥＳ翻訳エンハンサーＤＮＡから下流に離れて位置するＤＮＡを含んでなる２つのタンパク質コード化ＤＮＡの発現用構築物。９．プロモーターが天然β−キネシンよりも強い請求項７又は８に記載の構築物。１０．タンパク質をコードするＤＮＡ又は第２タンパク質をコードするＤＮＡが、９ｋｂｐ以下のＤＮＡ長だけエンハンサーの高二次構造領域から離れている請求項７から９のいずれか一項に記載の構築物。