JP2000513948A

JP2000513948A - ハムスターＥＦ―１α転写調節ＤＮＡ

Info

Publication number: JP2000513948A
Application number: JP10547444A
Authority: JP
Inventors: アリソン，ダニエル，エス．
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1997-05-01
Filing date: 1998-05-01
Publication date: 2000-10-24
Also published as: BR9804896A; HU225764B1; SK11899A3; ATE318900T1; NO990025L; EP1676916A1; DE69833649D1; DK0920498T3; HK1022719A1; PL195604B1; IL127897A; CN101570753A; NO990025D0; RU2004136574A; ES2263206T3; CZ28099A3; EP0920498A1; HUP0004137A2; WO1998049289A1; EP0920498B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ハムスターＥＦ−１α遺伝子に由来する調節ＤＮＡ配列に関する。本発明はさらに、本発明の調節ＤＮＡを含む発現構築体、当該調節ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、及び当該調節ＤＮＡを利用した遺伝子転写を増強する方法にも及ぶものである。特定の遺伝子配列に作動可能に連結された本発明の調節ＤＮＡを含む発現構築体もまた企図されるものである。

Description

【発明の詳細な説明】ハムスターＥＦ−１α 転写調節ＤＮＡ発明の背景特定の何らかの真核性遺伝子の転写は、３つのＲＮＡポリメラーゼ酵素のうちの１つによって行なわれ、この酵素の各々は、遺伝子の所定の下位集合に対して作用する。高分子のリボソームＲＮＡの転写がＲＮΛポリメラーゼＩによって行なわれ、そして低分子リボソームＲＮＡ及びｔＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼIII によって転写され、タンパク質をコードするＤＮＡ配列及びほとんどの低分子核ＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼIIによって転写される。遺伝子の各タイプにつき、遺伝子のプロモーター配列との適切なポリメラーゼの相互作用、そして安定な開始複合体の形成が、転写に必要とされる。一般に、３つのポリメラーゼのいずれかからの転写には、プロモーター配列と何らかの結合因子の相互作用、そして第２の因子による結合因子の認識（それによって遺伝子配列とのポリメラーゼの相互作用が許容される）も必要である。この機構が、ＲＮＡポリメラーゼＩ及びII Iでの転写に対する最小限の必要条件であるが、ＲＮＡポリメラーゼIIでの転写へと導くプロセスはさらに複雑なものである。ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写される遺伝子配列の莫大な配列と、これらの遺伝子に対する調節パターンが細胞内及び細胞間で高度なる多様性を有しているという事実におそらく起因して、ＲＮΛポリメラーゼIIによる転写は、プロモーター以外の調節ＤＮＡ配列への他の結合タンパク質の相互作用に加えて開始複合体内の数多くの転写因子の結合による影響を受けるのである。これらの他のタンパク質は、基底レベルを越えて転写を活性化するか、または全体として転写を抑制することができる。レプレッサーの結合は、高等真核生物における基底の転写が通常は極めて低いことに鑑み、活性化を阻止する手段と考えることもできる。他方、活性化は通常、何らかの生理学的シグナルへの最終的な応答であり、活性な転写開始複合体の形成を許容するための、レプレッサー結合タンパク質の排除かまたはクロマチン構造の変化のいずれかを必要とする。転写複合体形成の中核にて、基底レベルの遺伝子発現のために必須なのは、ポリメラーゼII転写開始部位から上流に位置する「ＴＡＴＡ」ボックスと称されるプロモーター配列である。ＴＡＴＡボックスは、ＴＦIIＤと称される偏在性の転写因子に対する結合部位であるが、前記したとおり、ほとんどの遺伝子でプロモーター配列からの転写は、遺伝子の転写を増強または抑制のいずれかを行うことができる、さらなる調節ＤＮＡ配列による影響を強く受けるのである。このタイプのＤＮＡエレメントは、遺伝子内のコーディング配列に対して、そしてＴＡＴＡボックスに対して、様々な位置にある。これらのさらなる転写調節エレメントは時として、組織特異的または細胞特異的に機能するものである。組換えタンパク質の発現において、プロモーターＴＡＴＡ配列と、宿主細胞の転写装置に適合可能なさらなる調節エレメントとを包含する調節ＤＮＡを選択することが特に重要である。この目的には、選択される宿主細胞に内在する調節ＤＮＡが、一般に好ましい。あるいは、一般的なウイルスの宿主が広範囲にわたること、そして異なる細胞型でウイルス調節ＤＮＡの活性が立証されていることに鑑み、ウイルスゲノム配列由来の調節ＤＮＡを用いてかなりの成功が修められている。よく知られていて通例的に利用されている、組換えタンパク質発現用のウイルス調節ＤＮＡには、例えば、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター／エンハンサー［Dijkemaら、EMBO J.、４巻、76 1頁（1985）］が包含される。ラウス・サルコーマ・ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）ＤＮＡ［Gormanら、Proc.Natl.Acad.Sci．(USA)、79巻、6777頁（1982b ）］、ウシ・パピローマウイルス断片［Sarverら、Mo.Cell.Biol.、１巻、486頁（1981）］及びヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター／エンハンサー・エレメント［Boshartら、Cell、41巻、521頁（1985）］が含まれる。ウイルス調節ＤＮＡが機能することが立証されている細胞型は広範囲に及ぶのであるが、宿主細胞の転写装置をもっと効率よく使用して特異的な細胞系での組換えタンパク質の転写を高めることを許容する、ウイルス以外のプロモーター／エンハンサーＤＮＡエレメントが存在する可能性がある。かくて、当該技術分野にあっては、同種性及び異種性の細胞型で組換えタンパク質発現を増強するように機能し、そして所望のタンパク質産物を高収率で提供する、プロモーター／エンハンサー調節ＤＮＡ配列を同定することが希求されているのである。特に重要なのは、イン・ビボでのタンパク質発現により生じるグリコシル化パターンに類似したようにイン・ビトロでグリコシル化された組換えタンパク質の生産を増大するため、哺乳動物細胞内で最も効率よく利用することができるようなプロモーター／エンハンサー調節ＤＮＡを同定することに対する要求である。このようにして発現され、治療または予防のために投与されたタンパク質は、抗原性がより低くなると考えられ、そして生理学的には活性が強いはずである。このタイプの調節ＤＮＡ配列は、宿主細胞に内在する遺伝子、または当該技術分野にて周知であり繁用されている技術によって宿主細胞のゲノム内に予め導入された発現を増強するために、宿主細胞内に挿入されることにも応じることができる。発明の要約本発明は、遺伝子転写を調節する、ハムスター細胞由来の、精製及び単離されたポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、チャイニーズハムスター卵巣ＥＦ−１α遺伝子の翻訳領域に対して５’側の、調節ＤＮＡ配列を含んでいる。本発明の好ましいＤＮＡはＣＨＥＦ１調節ＤＮＡと称され、SpeI制限酵素部位からＥＦ−１αタンパク質の開始メチオニン（ＡＴＧ）コドンまでに及ぶ、およそ3.7kbのＤＮＡを含んでいる。3.7kb未満のポリヌクレオチドも、小断片のポリヌクレオチドが作動可能に連結された遺伝子の転写を増強することができる限りにおいて、本発明で企図されるものである。本発明のＤＮＡの活性断片は、遺伝子の転写を調節する（すなわち、増強する）能力によって定義付けられるものであるが、当該技術分野においてよく知られ通例的に実施されている欠失実験によって容易に同定することが可能である。本発明の調節ＤＮＡには、培養細胞などの天然の供給源から単離したポリヌクレオチド、さらには酵素的にまたは純粋に化学合成により製造されたポリヌクレオチドも包含される。かくして、一つの実施態様において、本発明はゲノムライブラリーからＣＨＥＦ１ＤＮＡを調製するための方法を提供する。あるいは、本発明のＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した酵素的合成法によって、または単一のヌクレオチドが連続的に付加されるかもしくは重複するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされて連結される、純粋に化学的な合成法により構築されてもよい。最も好ましい実施態様にかかるＤＮＡ配列は、配列番号：１に示すものである。本発明はさらに、配列番号：１に示すＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ配列を包含する。ストリンジェントな条件には、約2 X ＳＳＣ及び約0.1％ＳＤＳを含有する緩衝液中で約６５℃にて洗浄するかまたはそれと同等の条件が含まれる。本発明はさらに、ＣＨＥＦ１ポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡを企図する。本発明のプラスミドは、ＣＨＥＦ１ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された、目的のタンパク質または目的のＲＮＡ産物をコードするＤＮＡ配列も含みうる。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはプラスミドで形質転換された、トランスフェクトされた、またはエレクトロポレーションされた宿主細胞を企図している。本発明のプラスミドＤＮＡは、宿主細胞のゲノム内へ一体化されても、または閉止環状プラスミド型にて細胞内に存在していてもよい。所望のＤＮＡ配列の挿入に対し特に応じることができる、本発明の好ましいプラスミドには、プラスミドpDEF14及びpDEF2が包含される。pDEF14及びpDEF2で形質転換された細菌の宿主はそれぞれ、1997年４月９日及び1997年３月４日に、2085 2 メリーランド州、ロックビル(Rockville)、パークロウンドライブ(Parklawn D rive)12301に所在のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、それぞれ９８３８９及び９８３４３の受託番号を与えられた。本発明はさらに、ＣＨＥＦ１ポリヌクレオチドを含む線状ベクターＤＮＡを企図する。本発明のベクターは、ウイルスの供給源から得られてもよいし、イン・ビトロで合成されてもよい。本発明はさらに、線状のベクター配列で形質転換またはエレクトロポレーションされた宿主細胞を企図している。このタイプのＤＮＡは特に、ＣＨＥＦ１ＤＮＡ配列と作動可能に連結された同種性遺伝子配列の発現のため、または作動可能に連結された配列の発現をモジュレートするべく宿主細胞のゲノムへとＣＨＥＦ１を挿入することができる部位特異的同種性組換えのために特に有用である。本発明はさらに、所望のタンパク質産物をコードする遺伝子配列に、ＣＨＥＦ１ＤＮＡが作動可能に（すなわち、当該遺伝子配列の転写を促進するように）連結されたキメラ組換えＤＮＡ分子を提供する。キメラ分子は概して、野生型の環境下には会合状態で通常見出さされることのないドメインを含むものであって、本発明においてキメラＤＮＡは、ハムスターＥＦ−１αタンパク質をコードする遺伝子以外のＤＮＡ配列と会合した、ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡの一部またはすべてを含みうる。キメラ分子によってコードされるタンパク質産物には、生理学的に活性なタンパク質、活性タンパク質の一部もしくはサブユニット、さらにはマーカー、またはレポータータンパク質が包含される。タンパク質産物をコードするポリヌクレオチド配列は、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらのタイプの分子の組合せに由来するＤＮＡから由来するものであるとよい。タンパク質産物は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に内在性の（すなわち、形質転換、トランスフェクション等によりＤＮＡを導入することなくＣＨＯゲノムに通常に認められる）ものであってよい。加うるに、タンパク質産物は、ＣＨＯ細胞のゲノム以外のものである外来性の供給源（１または複数の供給源）によってコードされてもよく、これには例えば、合成ＤＮＡが包含される。本発明の好ましいキメラ分子には、（i）抗ＩＣＡＭ３抗体ＩＣＭ３、（ii）ＩＣＭ３の軽鎖、（iii）抗ＣＤ１１／ＣＤ１８抗体ｈｕ２３Ｆ２Ｇの重鎖、（iv）ｈｕ２３Ｆ２Ｇの軽鎖、（v）キチナーゼ、（vi）血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、及び（vii）マクロファージ由来のケモカイン（ＭＤＣ）をコードするＤＮＡに作動可能に、ＣＨＥＦ１ＤＮＡが連結された分子が包含される。キメラ分子を含むプラスミドＤＮＡで形質転換された細菌の宿主細胞は1997年４月１日に、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、それぞれ（i）９８３８１、（ii）９８３８２、（iii）９８３８３、（iv）９８３８４、（v）９８３８５、（vi）９８３８６、及び（v ii）９８３８７の受託番号を与えられた。本発明はさらに、本発明のＣＨＥＦ１ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞に関するものである。本発明の好ましい宿主細胞は、チャイニーズハムスター（Cricetulus griseus）に由来するもので、ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡが高レベルのタンパク質発現を提供することが期待されるものである。しかしながら本発明は、例えば、アメリカンハムスター（Cricetulus migratoris）またはシリアン（ゴールデン）ハムスター（Mesocricetus auratus）を包含するその他の種に由来する他の細胞型や、さらには他の属の動物に由来する細胞型も包含するものである。細胞は、肺、卵巣、腹膜、筋肉、膵臓、腎臓、黒色腫、または体細胞性の供給源から、さらには胎児全体もしくは胚全体から得ることができる。前掲した本発明の宿主細胞は、他の細胞型例えば黒色腫細胞系も含めて、ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡによって高レベルの転写が提供されることが期待できるものであり、アメリカンタイプカルチャーコレクションより入手でき、あるいは動物の供給源から直接培養することもできる。ＣＨＥＦＩ調節ＤＮＡを含む本発明の組換え分子によって、作動可能に連結された異種性（すなわち、トランスフェクト、形質転換等によるポリヌクレオチドの導入が行われていない宿主ゲノム中に通常認められない）ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現のレベルが増大せしめられる。ＣＨＥＦ１ポリヌクレオチド配列に連結されたポリヌクレオチドの性質に依存して、転写の増大は最終的にポリペプチドのレベルの上昇を引き起こすか、または連結されたポリヌクレオチドが例えばトランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子核ＲＮＡ等をコードしている場合には様々なＲＮＡ種のレベルの増大を引き起こすはずである。ＲＮＡ種はまた、内在性または外来性遺伝子配列から転写されたｍＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡも含みうる。ポリペプチド翻訳の増大は、ｍＲＮＡに存在している適切な翻訳シグナルの存在に必ずや依存するはずである。本発明はさらに、内在性遺伝子配列の転写レベルを増大させるために、宿主細胞のゲノムＤＮＡ内の特定の部位へＣＨＥＦ１ＤＮＡが挿入されることに基づく方法を提供する。同種組換えを利用して、ＣＨＥＦ１ＤＮＡのすべてまたは一部を挿入することができる。このようにして修飾された宿主細胞において、ＣＨＥＦ１ＤＮＡがコーディングＤＮＡ配列に作動可能に連結される。例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／２０８０８号；及びＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／０９９５５号を参照されたい。本発明は、ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡが挿入されている、改変されたゲノムＤＮＡ配列を包含しているものである。あるいは、本発明はゲノム内に存在するＣＨＥＦ１ＤＮＡに対して隣接しており且つ作動可能な位置に外来性のＤＮＡが挿入された宿主細胞を包含するものである。このタイプの宿主細胞には、ＣＨＯ細胞が含まれ、挿入される配列はＥＦ−１αをコードするＤＮＡに置換されるかまたはＣＨＥＦ１調節ＤＮＡとＥＦ−１αをコードする配列との間に挿入されるのである。本発明はまた、ゲノムへ予めＣＨＥＦ１ＤＮＡが挿入されており、その後さらなるＤＮＡが作動可能に連結された位置に挿入されている、ＣＨＯ細胞以外の宿主細胞をも包含している。本発明はさらに、所望の遣伝子の転写を増大させるための方法であって、所望の遺伝子に対して作動可能に連結される位置に、宿主のゲノムＤＮＡへ調節配列が統合されるように、ハムスターＥＦ−１α調節配列を含むポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程を含む方法を提供する。本発明はさらに、所望の遺伝子の転写を増大させるための方法を企図し、この方法は、ハムスターＥＦ−１α調節配列及び標的配列を含むポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程を含み、当該標的配列は、ＥＦ−１α以外のタンパク質をコードする所望の遺伝子に作動可能に連結される位置にて調節配列の統合を許容するように構築されている。本発明の方法は、ＣＨＯ細胞に内在性の遺伝子の転写を増大させる手段と、さらにＣＨＯ細胞に外来性の遺伝しの転写を増大させる手段とを包含する。本発明の組換え分子は、トランスジェニック動物の製造のために使用することができ、ここでは、目的のＤＮＡ配列に作動可能に連結されたＣＨＥＦ１ＤＮＡを含むキメラ組換えＤＮＡが、動物の発育中の生殖細胞または体細胞へと導入される。キメラ組換え分子は、例えば、ミクロインジェクションにより導入されるとよく、生殖細胞を用いて行う場合には、得られる動物体内の細胞がすべて本発明の組換えＤＮＡを包含しうるのである。あるいは、本発明のキメラ組換えＤＮＡは、胚の細胞内に導入されてもよく、この場合その結果得られる動物体内の複数の細胞が本発明のＤＮＡを含含しうる。ＣＨＥＦ１ＤＮＡは、ＣＨＥＦ１が許容する遺伝子発現を凌ぐ遺伝子発現の増大をもたらしうる、密接に関連した調節ＤＮＡ配列の同定を同定のためにも有用である。同様に、ＣＨＥＦ１ＤＮＡ配列の知見によって、デノボ合成またはＣＨＥＦ１配列の単一もしくは複数箇所での修飾による、合成ＤＮＡの構築が許容され、その結果得られる合成ＤＮＡはＣＨＥＦ１と類似した配列を有しているが遺伝子の転写をより高く促進することができるものである。発明の詳細な説明本発明を、以下の実施例によって例証する。実施例１には、ハムスターＥＦ− １α遺伝子及び同族のＣＨＥＦＩ１調節ＤＮＡのクローニングを記載する。実施例２は、ＣＨＥＦ１調節配列のサブクローニング及び配列分析に関するものである。実施例３には、ＣＨＥＦ１プロモーター・ポリヌクレオチドの特徴を示し、そして実施例４にはＣＨＥＦ１ＤＮＡを含む様々な発現ベクターの構築法を記載する。実施例５には、ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡの有効性を判定するために利用されるトランスフェクション・アッセイを記載する。実施例６には、ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを使用した、組換えタンパク質発現レベルの比較を詳説する。実施例７は、異なる長さのＣＨＥＦ１ＤＮＡの調節能における相違を調べるものである。実施例１ＣＨＥＦ１のクローニングヒトＥＦ−１α遺伝子のハムスター相同体を単離する試みにおいて、ヒトＥＦ −１αをコードするｃＤＮＡを用いてチャイニーズハムスター卵巣ゲノムライブラリー（ＣＨＯ−Ｋ１）（Staratagene、La Jolla、カリホルニア州）をスクリーニングした。ＣＨＯ−Ｋ１ライブラリー（Lambda ＦＩＸ（商標名）IIクローニングベクター内のSau3A部分消化物）は、宿主細胞株のXL-1-Blue ＭＲＡ及びXL-1-Blue ＭＲＡ（Ｐ２）中にて、Starata gene（La Jolla、カリホルニア州）から得たものである。宿主細胞は以下の修正を加え、製造業者の示すプロトコルに従って調製した。概略説明すると、グリセロール保存液からの細胞を、抗生物質を含まないＬＢプレート上に画線塗布した。液体ＬＢ培地に接種すべく単一コロニーを選択し、終期対数増殖期にまで且つＯＤ₆₀₀がおよそ０．９になるまで生育させた。この時点で、細胞は製造業者が示したプロトコルに従って保存するか、または直ちに以下の通りに使用した。播種用の培養物中、前記の通りに調製したプレートから拾取した単一コロニーを接種のために使用し、細胞を0.5ml ＭｇＳＯ₄及び１mlの10％マルトース（脱イオン水溶液）を補充したＬＢ培地50mlにおいて生育した。30℃にて終夜生育させた後、細胞を卓上遠心分離装置で遠心分離（2000rpm、室温にて５分間）することによって回収し、10mM ＭｇＳＯ₄中に再懸濁させて0.5のＯＤ₆₀₀とした。製造業者によって供給されたラムダファージは、ＳＭ緩衝液（5.8g ＮａＣｌ、2.0g ＭｇＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、50mlの1Mトリス−塩酸、ｐＨ７．５、及び5mlの２％［重量／容量］ゼラチンを含有する１リットルの保存液に調製）にて１０〜１０⁵ 倍にわたって希釈し、各希釈液のそれぞれ２μ１を10mM ＭｇＳＯ₄中の宿主細胞400μｌに添加した（ＯＤ₆₀₀は約０．５）。得られた混合液を37℃にて１５分間インキュベートして細胞へのファージの接着を許容し、トップアガー（0.75％ＬＢＭアガロース、48℃で）を添加し、そして各混液をＬＢＭアガロースプレート上に二重検体となるよう播種した。その結果、3 x 10⁶プラーク形成単位（ｐｆｕ）／μｌファージ保存液のタイターであることが示された。ライブラリーをスクリーニングするのに先駆けて、新鮮な宿主細胞を調製した。およそ50,000のファージｐｆｕを6.5mlの0.75％ＬＢＭアガロースと共に48℃ で、600μｌの宿主細胞（ＯＤ₆₀₀はおよそ０．５）に添加した。混合液をアガロースプレート上に塗布し、次いでこれを37℃にておよそ８時間インキュベートした。次いで、ニトロセルロースの被覆層にトップアガロースが貼り付くのを防ぐためにプレートを４℃にて５時間冷却した。ＢＡ−８５、0.45μｍ孔径の膜（Ｓ＋Ｓ、Keene、ニューハンプシャー州）をプレートの上面を覆うように載置し、２分間転写を継続させた。膜をプレートから取り外し、転写されたＤＮＡを1.5M ＮａＣｌ／0.5M ＮａＯＨ中で２分間かけて変性した。フィルターを1.5M ＮａＣｌ／1.0Mトリス−塩酸（ｐＨ８．０）中で５分間中和し、Whatman３−ＭＭ紙上にブロッティングして、真空状態で80℃にておよそ１．５から２時間ベーキングを行った。ヒトＥＦ−１αのｃＤＮＡ配列［Uetsukiら、J.Bjol.Chem.、264巻、5791〜57 98頁（1989）］は、予めＣＨＯのＥＦ−１αのコーディング領域と95％同一であることが示されており［Hayashiら、J.Bjochem.、106巻、560〜263頁（1989）］、これをライブラリーのスクリーニング用のプローブとして用い、以下のごとくに調製した。1.4kbのヒトＥＦ−１αプローブは、プラスミドＭ０１０７（EcoRI 部位に挿入されたヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡインサートを含むpRc／ＣＭＶ（Invitrogen、San Diego、カリホルニア州）ベクター）より由来するものであった。先ず、プラスミドＭ０１０７が求められるヒトｃＤＮＡを含んでいることを確認するために、インサートＤＮＡを３’ 及び５’ベクタープライマーを用いて配列決定した。インサートの最初の２６３塩基対は、公開されたヒトＥＦ−１αコーディング配列と90％を越える同一性を示し、そして３’端の配列は正確に判定することが困難であったものの短い範囲は求められる配列と合わせることができた。この結果をまとめると、プラスミドが所望の配列をコードしていることを、これらのアラインメントが示唆するものであった。ヒトのインサート全体をEcoRI消化でプラスミドから切り出し、そしてQIAGEN QIAquickゲル抽出キットを用い、製造業者が示したプロトコルに従って、1.4kb のｃＤＮＡバンドをゲルで２回精製した。ＤＮＡを50μｌのＴＥへと抽出し、得られた溶液をMicrocon−１０（Amicon、Beverly、マサチューセッツ州）にて25 μｌにまで濃縮し、そしてBoehringer MannheimのRandom Primed ＤＮＡラベリングキットを用い、製造業者の示すプロトコルに従って³²Ｐ−α−ｄＴＴＰ及び³² Ｐ−α−ｄＣＴＰでアリコートをラベルした。ラベルしたプローブを、取り込まれなかったヌクレオチドを除去すべくＧ５０スピンカラムを用いて精製したところ、精製されたプローブとスピン前のアリコートとの比較により46％の放射ラベルの取り込みが示され、5 x 10⁵cpm/分/μｌのカウント数を有していた。前記の通りに調製したニトロセルロース膜を、以下のようにプローブ検索した。22.5mlの20 X ＳＳＣ、30.0mlの50 X デンハーツ溶液、3.0mlの1Mリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）（69mlの1M ＮａＨ₂ＰＯ₄、31mlの1M Ｎａ₂ＨＰＯ₄）、0.75ml の20％ＳＤＳ、及び78.75mlの蒸留水を含む、保存用プレ−ハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション緩衝液の溶液を調製した。プレ−ハイブリダイゼーション用に、1.4mlの10mg/mlサケ精子ＤＮＡ（Stratagene）を0.6mlの蒸留水と共に5分間煮沸し、次いで7mlの蒸留水及び72mlの保存用緩衝液の溶液に添加した。フィルターを最低２時間、プレ−ハイブリダイゼーション用緩衝液中、65℃ にてインキュベートした。ハイブリダイゼーション用に、30μｌのプローブ、200μｌの10mg/mlサケ精子ＤＮＡ及び770μｌの蒸留水を混合し、５分間煮沸して、次いで3mlの蒸留水と共に36mlの保存用緩衝液に加えた。プレ−ハイブリダイゼーション溶液をフィルターから除き、ハイブリダイゼーション用緩衝液を添加して、フィルターを65℃にて終夜インキュベートした。ハイブリダイゼーションの後、65℃にてフィルターを３時間、2 X ＳＳＣ及び0.1％ＳＤＳを含有する緩衝液を３回交換して洗浄し、次に４８時間のオートラジオグラフィーに付した。４７の陽性コロニーを同定し、20μｌのクロロホルムを含有するＳＭ緩衝液１ mlへと拾取した。１以上のイントロンを欠損した存在可能な疑似遺伝子を除外するために、各々２つのイントロンが側部に位置する（flank）ようＰＣＲプライマー対を設計した：イントロン２及び３にわたるプライマー９５−１３６（配列番号：４）及び９５−１３７（配列番号：５）；イントロン３及び４にわたるプライマー９５−１３８（配列番号：６）及びプライマー９５−１３９（配列番号：７）；イントロン４及び５にわたるプライマー９５−１４０（配列番号：８）及びプライマー９５− １４１（配列番号：９）；ならびにイントロン６及び７にわたるプライマー９５ −１４２（配列番号：１０）及びプライマー９５−１４３（配列番号：１１）。ＣＨＯＥＦ−１α鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ産物の予測サイズは、公開されたヒトＥＦ−１α配列におけるサイズ及びイントロンの部位に基づくものであった。各ＰＣＲ反応液には、２μｌのファージ、適切な対（100μｇ/ml）の各プライマー2.5μｌ、2mM ｄＮＴＰ混液2μｌ、10 X ＰＣＲ緩衝液(Roche Molecular Systems、Branchburg、ニュージャージー州）2.5μｌ、 1.5μｌの25mM ＭｇＣｌ₂、0.125μｌのTaqポリメラーゼ（５単位/μｌ）（Perkin Elmer）及び11.8μ ｌの蒸留水を含んでいた。増幅は94℃にて４分間、次いで90℃にて１分間、50℃ にて２分間、そして72℃にて４分間の３０サイクルで行った。増幅産物を、1 X ＴＡＥ中で展開した1.2％アガロースゲルにて分離した。４７の陽性プラークのうち３つが、全イントロンを含む真の遺伝子をコードしていることが判り（＃２、７及び４０）、その３つの陽性試料を以下のごとき第３次スクリーニングに付した。播種培養物は、上記３つの陽性プラークの各々に対して調製した保存液を前記の通りに10〜10⁵倍の希釈液として調製した。各保存液から、２０〜５０の単離プラークをＰＣＲによってスクリーニングしたところ、以下の結果が得られた。クローン＃２からスクリーニングした２０のうち２つの陽性物（２．１２及び２．１７と命名）が得られ、クローン＃７からはスクリーニングした５０のうち１つ（７．４４と命名）が得られ、そしてクローン＃４０からはスクリーニングした４０のうち１つの陽性物（４０．２４と命名）が得られた。以下の通りにして、４つの試料の各々からファージＤＮＡを単離した。ＸＬ−１Blue ＭＲＡ（Ｐ２）宿主細胞を、ＬＢアガロースプレート上に画線塗布し、そして3 7℃にて終夜インキュベートした。単一コロニーを選択し、50mlのＬＢ培地（0.2 ％マルトース及び10mM ＭｇＳＯ₄を含有）に接種して、培養物を30℃にて終夜生育させた。卓上遠心分離装置で室温にて2000rpmで５分間遠心分離することにより細胞を回収し、そして細胞は50mlの10mM ＭｇＳＯ₄中に再懸濁させた。この再懸濁された宿主細胞（50μｌ）を、各陽性ファージの100μｌ保存液と混合し、次いで37℃にて１５分間インキュベートして、細胞へのファージの接着を許容した。およそ500μｌのＬＢＭ培地を添加し、混合液を37℃にて２時間振盪した。さらに200μｌの宿主細胞を添加し、そして37℃にて１５分間インキュベーションを継続した。トップアガー（8mlの0.75％ＬＢＭアガロース、48℃で）を添加し、その後混液を播種して37℃にて終夜生育した。終夜の生育の後、12mlのラムダ希釈液（10mMトリス−塩酸、ｐＨ７．５、10mM ＭｇＳＯ₄）を各プレートに添加し、このプレートを２時間、穏やかに振盪した。希釈液を除去し、卓上遠心分離装置にて4000 x gで１０分間遠心分離した。上清に各々1mg/mlのＲ Nase Ａ及び1mg/mlのＤ Nase Ｉを1μｌ添加し、そして37℃にて１５分間インキュベーションを行った。等容量の沈降用緩衝液（20％ＰＥＧ８０００、2M ＮａＣｌ、20mMトリス−塩酸、ｐＨ７．５、10mM ＭｇＳＯ₄）を添加し、続いて氷上で１時間インキュベートして、その後混液を800 0 x gで２０分間遠心分離し、上清を除去してペレット室温にて１０分間を風乾した。このペレットを500μｌのＴＥ中に再懸濁し、微粒子を除去すべく軽く遠心分離して、次に上清を1.65mlのきれいなエピチューブに移した。およそ2.5μ ｌの20％ＳＤＳを添加し（65℃にて５分間インキュベート）、引き続き10mg/ml のプロテイナーゼＫを2.5μｌ（65℃にて１時間インキュベート）及び10μｌの5 M ＮａＣｌ添加した。混液を、等容量のフェノール：クロロホルムで１回、そして等容量のクロロホルムで１回、抽出した。等容量のイソプロパノールを添加し、次いで−70℃にて３時間インキュベートして、その後混液はエピフュージ（ep ifuge）で最高速度にて１５分間遠心分離した。この結果得られたペレットを70 ％エタノールで洗浄し、風乾して100μｌのＴＥ中に再懸濁した。実施例２ＥＦ−１α調節配列のサブクローニングインサートＥＦ−１α ＤＮＡのサイズを測るために、実施例１に記載の通りにして調製したファージＤＮＡをNotIで消化し、得られた制限断片を0.6％の1 X ＴＡＥアガロースゲルにて分離した。クローン２．１２及び２．１７は、19kb 及び10kbの予測されるフランキング・ラムダ断片に加え、11kb及び4.5kbのバンドを含んでおり、同様の消化パターンを示した。クローン７．４４及び４０．２４もまた、12kb及び7kbのインサートのバンドを含み、同様の消化パターンを示し、クローン２．１２及び２．１７の消化による情報とまとめ併せて、ＥＦ−１α ＤＮＡ内に内部N otI制限酵素部位が存在することが示唆された。クローン２．１２及び７．４４由来のインサート断片を、以下の通りにサブクローニングした。実施例１に記載の通りに調製したファージＤＮＡ（60μｌ）をNotIで消化し、その後、消化されたＤＮＡを20μｌの3M酢酸ナトリウム及び400μｌの100％エタノールを添加して沈降させた。沈降したＤＮＡを遠心分離によって集め、200μ ｌの70％エタノールで洗浄し、１５分間風乾して20μｌのＴＥ中に再懸濁し、そして電気泳動用の負荷用緩衝液2μｌを添加する前に１０分間、65℃に加熱した。アガロースゲル電気泳動を用いてＤＮＡを分離し、4.5kb、7kb、11kb及び12kb のバンドをアガロース切片として切り出した。各ゲル切片から、QIAGEN QIAquic kゲル抽出キットを用い、製造業者が示したプロトコルに従ってＤＮＡを抽出した。バンドの純度及び濃度は、0.6％の1 X ＴＡＥアガロースゲルにて、各々の単離された断片の５μｌアリコートを分離することによって推定した。個々の断片を、NotIで消化したpBluescript ＳＷ⁺に別々に連結した。11及び1 2kbの断片を用いた連結物中、線状化したベクターを断片インサートの導入に先駆けてウシアルカリホスファターゼで処理した。各連結物2μｌを用いて、40μ ｌのＸＬ−１Blueのエレクトロコンピテント細胞へのエレクトロポレーションを行った。形質転換された細胞を、ＬＢＭ／炭水化物（carb）アガロースプレート上に、プレート１枚当たり40μｌの5％Ｘ−gal、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液及び20μｌの0.1M ＩＰＴＧと共に播種した。細胞は37℃にて終夜インキュベートし、朝になったら青色の強度を増大させるためにプレートを４℃に移動させた。第２次スクリーニングにおいて、白色コロニーを前記のごとくＸ−gal及びＩＰＴＧを含有するＬＢＭ／炭水化物アガロースプレート上に線状塗布し、そして翌日、白色であったコロニーを3mlのＬＢＭ／炭水化物中で37℃にて終夜生育した。終夜の生育後の白色コロニー由来のプラスミドＤＮＡを、WIZARD Plus Mini preps ＤＮＡ Purif1cation System（Promega、Madison、ウイスコンシン州）を用い、製造業者の示すプロトコルに従って調製した。単離されたプラスミドＤＮＡに制限分析により、4.5kb、7kb及び12kbの断片が pBluescript ＳＷ⁺ベクターへとうまく連結されていることが示唆され、こうして得られたプラスミドをそれぞれ、pSK/EF1.4.5、pSK/EF1.7及びpSK/EF1.12と命名した。次いで、各プラスミドをQIAGENミニ・プレップ・キットを用い、製造業者の示すプロトコルに従って調製した。各々の新規ベクターにつき、鋳型ＤＮＡのタイターを算出し、そしてコーディング領域のプライマー（配列番号：４から１１、様々なイントロンの１以上を欠損した疑似遺伝子についてスクリーニングするための、前記の対で使用したもの）を使用して、ＰＣＲを行った。３つのプラスミド調製物の間に可能な交差混合体を示唆する完全なＥＦ−１αコーディング領域を、３つの断片すべてが含んでいることが高濃度にて示されることが認められた後に、タイター測定を実施した。タイター測定に際し、0.001、0.01、0.1、1または10ng/μｌの濃度の鋳型ＤＮＡを2.5μｌを含有し、そして、10 X ＰＣＲ緩衝液（Perkin Elmer）2.5μｌ、2mM ｄＮＴＰ混液2μｌ、1.5μｌの25mM ＭｇＣｌ₂、0.125μｌのTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer）及び11.4μｌの蒸留水を含む反応液中でＰＣＲを行った。増幅は以下の条件で行った：94℃ にて４分間、次いで90℃にて１分間、50℃にて２分間、そして72℃にて４分間の３０サイクル。この結果、完全なＥＦ−１αのコーディング領域が、4.5kb及び7 kb断片の中に位置していることが示唆された。 LambdaＦＩＸII（商標名）ベクターでの使用のために設計された、Stratagene FLASH Nonradioactive Gene Mapping Kitを用いて、各インサートに対する制限酵素地図を作製した。しかしながら、ファージＤＮＡを使用する代わりに、前記のｐＳＫベクターからNotI消化で切り出したプラスミドＤＮＡを使用した。マッピングのプロトコルは本質的に、製造業者によって示されたものに従った。概略説明すると、プラスミドはＭ１３（配列番号：１２）及びＭ１３逆方向（配列番号：１３）プライマー（pBluescript ＳＷ⁺複数クローニング領域内の領域に相補的なもの）で配列決定して、各インサートに対するNotI部位に内包されるＴ３（配列番号：１４）及びＴ７（配列番号：１５）プライマー配列の位置の同定を行った。遺伝子マッピングのプロトコルにおいて、Ｔ７及びＴ３プライマーを使用した。ＥＦ−１αインサートは内部NotI部位を含んでいることが示されたので、断片の対（4.5kb／11kb及び7kb／12kb）が、プライマー配列の１つまたはもう一方を含んでいることが予測され、しかして4.5kb及び12kbのインサートがＴ７プライマー配列を含み、7kbのインサートがＴ３配列を有していることが明らかになった。ＥＦ−１αコーティング領域を含む4.5kb及び7kbのインサートは、NotI消化によりベクターから切り出された。消化されたＤＮＡはアガロースゲルにて分離し、分離された断片をゲルから切り取って、QIAGEN QIAquickゲル抽出キットを用い、製造業者が示したプロトコルに従って各ゲル切片からＤＮＡを単離した。マッピングは、７つの異なる酵素を使用し、部分制限酵素消化物にて行った。反応産物はアガロースゲルにて分離し、ＤＮＡをDuralon−ＵＶナイロン膜に転写して、Ｔ３またはＴ７オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてプローブ探索を行ったバンドのサイズを測定し、制限地図を完成した。遺伝子配列が以前に同定されたタンパク質の配列であるかどうかを保証するべく、元々ＰＣＲスクリーニング用に設計された内部プライマー（配列番号：４から１１［前記したプライマー９５−１３６から９５−１４３に該当］）を用いて、プラスミドpSK/EF1.7を配列決定した。コーティング領域の方向を決定し、内部NotI部位に対する配列決定を可能ならしめるさらなるプライマーを設計した。コーティング領域全体の配列を決定し、次いでこれをHayashiら［前出］に記載の、予測されるｃＤＮＡ配列と比較した。配列分析により、単離されたＤＮＡは実際の所正しく、Hayashiら［前出］に報告されたものと同じＥＦ−１α配列をコードしていることが確認された。加えて、第１エクソンの配列は、５’端で以前に公開されたハムスターＥＦ−１αのｃＤＮＡ配列［Hayashi、前出］と同じであり、ヒト相同体について知られているのと類似の構造が導き出される、７つのイントロンが同定された。 7kbの断片から得られた配列及び制限地図より、５’フランキング・イントロンの一部及びプロモーターが、内部NotI部位の５’側の12kb断片に位置することが示唆された。内部NotI部位に対し５’側の SpeI／NotIの3kb断片を12kbのインサートから切り出し、そして同じ酵素で予め消化しておいたpBluescript ＳＫ⁺へとサブクローニングし、こうして得られたプラスミドをpSK/EF1.3と命名した。制限酵素部位を確認するためにXpnI及びCla Iを用いて前記の通りに3kbの断片をマッピングし、５’及び３’伸長部（extens ion）をそれぞれ作出するようにClaI及びKpnI部位を利用して、Erasa-a-Baseキット（Promega、Madison、ウイスコンシン州）を用いて配列決定した。配列決定の結果、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、及びヒト遺伝子における第１イントロン［Uetsuki、1989、前出］と同じ長さの５’非翻訳フランキング領域中の0.9 kbのイントロンが示された。ＣＨＥＦ１プロモーター及び５’イントロンに対する配列を配列番号：１に示すが、このイントロンはヌクレオチド第２６９９位から第３６４１位に含まれている。実施例３ＣＨＥＦ調節ＤＮＡの特徴付けハムスターＥＦ−１α遺伝子のＡＴＧ開始コドンの上流及びこれをを包含する配列を、配列番号：１に示す。ほとんどの同定可能な転写因子結合部位は、ＥＦ −１α遺伝子の開始ＡＴＧコドンに対して５’側1.56kbに位置する上流のSacI部位に対して３’側にあると思われる。しかしながら、下記のＣＨＥＦ１配列を含む発現ベクターの各々は、SacI部位に対して５’側にも2kbのＣＨＥＦ１配列を含んでいる。配列決定によって、開始のＡＴＧ開始コドンに対しておよそ1kb５’側に位置するコンセンサスＴＡＴＡボックスの存在が示唆され、そして上流のSacI部位とＴＡＴＡボックスとの間の領域に、Ｓｐ１部位（配列番号：１６または１７）、ＡＴＦ部位（配列番号：１８）、及びＮＦ−１部位（配列番号：１９）を含めた数多くの潜在性転写因子結合部位［Boulikas、Crit.Rev.Euk.Gene Exp.、4巻、117〜321頁（1994）］が含まれることが示唆された。ヒトＥＦ−１α遺伝子［Uetsukiら、前出］と同様に、スプライス・ドナー及びアクセプター配列の局在より明らかな、ハムスターＥＦ−１α遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中に943bpのイントロンが存在する。しかしながら、Geneworks ＤＮＡ分析プログラムを用いると、５’ＵＴＲにおけるイントロンの配列はヒト遺伝子におけるものとわずか62％の同一性しかないことが認められた。５’イントロンは数多くの潜在性転写因子結合部位を、SacI部位とＴＡＴＡボックスの間の結合部位の数とあらかた同じ数ほど包含しており、このことから５’イントロンがＥＦ−１αプロモーターからの至適な転写に対して重要であることが示唆されるものである。 GeneworksＤＮＡ分析プログラムを用いた、上流SacI制限部位から５’イントロン配列の下流に至るまでの（５’イントロン配列は含まない）ＣＨＥＦ１配列決定によって、ヒトＥＦ−１α配列との64％の同一性が見出された。ヒト及びハムスター調節配列の双方の中のＳｐ１転写因子結合部位の位置付けを表１に示す。完全なヒトＥＦ−１α遺伝子配列［Uetsukiら、前出］は、配列番号：２９に示す。表１ＴＡＴＡボックスからのＳｐ１部位の距離ハムスターヌクレオチド位置ヒトヌクレオチド位置 −４２４ −３３５ −３０４ −２２０ −１８３ −２０８ −１７１４３２ −１５１４７６ −１３５５７３ −２６５８１６３６９０１５６１６８２５７２６１４２５４９５５８９５９４６８８実施例４発現プラスミドの構築以下の手順に従って、後述の実施例にて利用される数多くのプラスミドを構築した。プラスミドpSV2-dhfr（ＡＴＣＣ受託番号第３７１４６号）を、SphI／BamHIで消化し、そしてジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする1.8kbの断片（断片１）を精製した。ＤＨＦＲをコードする断片は、dhfr遺伝子に関してそれぞれ５’及び３’側に位置する、ＳＶ４０プロモーター／オペレーター配列及びポリアデニル化配列も含んでいた。プラスミドpSL1190（Pharmacia）をHindII Iで消化し、突出している端部をクレノウで埋めて、さらに平滑末端とされたＤＮＡをHindIII部位を破壊すべく再連結してプラスミドpSL1190Hを得、次いでこれをSphI／BaHIで消化して3.4kbの断片（断片２）を精製した。pSV2-dhfrの1.8k b断片（断片１）を、pSL1190Hの3.4kb断片（断片２）に連結し、プラスミドpSL1 190H-dhfrを得た。プラスミドpSL1190H-dhfrには、以下のようにいくつかの制限部位を除くために修飾を施した。プラスミドは最初に、XbaI／NheIで消化し（相補性の突出端部を与える）、そして線状のプラスミドを再度連結して、XbaI及びNheI部位の双方を除去した。第２の手順において、pSL1190H-dhfrをHindIIIで消化し、突出している端部をクレノウで埋めて、そして線状のプラスミドを再度連結し、HindIII 部位を除いた。第３のプロセスでは、pSL1190H-dhfrをBgIIIで消化して、突出している端部をクレノウで埋めて、そして線状のプラスミドを再度連結し、BgIII 部位を除去した。これらの３つの工程による最終的な結果、プラスミドpSL1190H -dhfr／ＮＸＨＢが製造され、これはXbaI、NheI、HindIII、及びBgIII部位が破壊されていた。プラスミドpSL1190H-dhfr／ＮＸＨＢを、次いでEcoRI／BamHIで消化し、そしてＮＰＢＩ／ＮＰＢ２リンカー（アニーリングしたオリゴヌクレオチドＮＰＢＩ及びＮＰＢ２［配列番号：２０及び２１］より構築）を挿入して、独自のNotI制限部位を有するプラスミドpSL／dhfr／NotIが得られた。こうして得られたプラスミドpSL／dhfr／NotIを、Asp718／BamHIで消化し、ＤＨＦＲをコードする1.8kbの断片（断片３）を精製した。プラスミドpRc／ＣＭＶ（ Invitrogen、San Diego、カリホルニア州）を、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化ＤＮＡを除くために、Asp718／BglIIで消化し、そして3.7kbの断片（断片４）を精製した。ＳＶ４０プロモーター／オペレーター及びポリアデニル化配列と共にＤＨＦＥをコードする1.8kbのpSL／dhfr ／NotI断片（断片３）を、3.7kbのpRc／ＣＭＶ断片（断片４）に連結して、プラスミドpRc／ＤＨＦＲ／NotIを得た。プラスミドpRc／ＣＭＶは、Asp718／XbaIで消化して、ＢＧＨポリアデニル化ＤＮＡをコードする0.8kbの断片（断片５）を精製した。プラスミドpRc／ＤＨＦＲ／NotIは、BamHI／Asp718で消化して、ＤＨＦＲ、ＳＶ４０プロモーター／オペレーター及びポリアデニル化配列を含む4kbの断片（断片６）を精製した。プラスミドｐＣＥＰ４（Invitrogen、San Diego、カリホルニア州）をBglII／SacI で消化し、ＣＭＶプロモーターをコードする0.7kbの断片（断片７）を精製した。0.8kbのpRc／ＣＭＶ断片（断片５）、４kbのpRc／ＤＨＦＲ／NotI断片（断片６）、0.7kbのｐＣＥＰ４断片（断片７）及び合成SacI／XbaIアダプター断片を、４者の連結を行って組み合わせて、プラスミドｐＤＣ１を得た。アダプターは、オリゴヌクレオチドＳＰＸ１及びＳＰＸ２をアニーリングすることによって構築した。プラスミドｐＤＣ１は従って、ＣＭＶプロモーター、ポリリンカー領域、ＢＧＨ由来のポリアデニル化部位、及びdhfr遺伝子を、ＳＶ４０プロモーター及びＳＶ４０スプライス／ポリアデニル化配列の制御下に包含しているものである。プラスミドｐＤＣ１をXhoIで消化し、ＣＭＶプロモーター及びＢＨＧポリアデニル化ＤＮＡを欠損した4.5kbの断片を単離して連結し、プラスミドｐＤＣｉ１を得た。次いでプラスミドｐＤＣｉ１をBamHI／XhoIで消化し、4.5kbの断片（断片８）を精製した。この4.5kbのｐＤＣｉ１断片（断片８）を、プライマー９６ −１３及び９６−１４を用いて（鋳型としてプラスミドｐＤＣ１を使用）製造されたＣＭＶプロモーター配列の一部をコードしているBamHI／SalI消化ＰＣＲ断片に連結して、プラスミドｐＤＣｉ２を得た。プラスミドｐＤＣｉ２は、Asp718／SpeIで消化し、そしてＳＶ４０プロモーター／オペレーター及びポリアデニル化配列と共にＤＨＦＲをコードする4.2kbの断片（断片９）を精製して、ｐＤＣ１は、Asp718／SpeIで消化し、そしてＣＭＶプロモーターＤＮＡの一部分を精製されたＢＧＨポリアデニル化シグナルと共に含む1.5kbの断片（断片１０）を精製した。4.2kbのｐＤＣｉ２断片（断片９）を、1.5 kbのｐＤＣ１断片（断片１０）に連結し、プラスミドｐＤＣ３１を得た。プラスミドｐＤＣ３１は、ＣＭＶプロモーターの５’端部のSmaI及びAscIを含めいくつかの新しい制限部位が作製されているという点でｐＤＣ１と異なっていた。プラスミドｐＤＣ３１をNotIで消化し、突出しているＤＮＡをＴ４ポリメラーゼを用いて平滑末端となし、そしてこのプラスミドを再度連結してNotI部位を除き、プラスミドｐＤＣ３６を得た。プラスミドｐＤＣ３６は、NotI部位が破壊されたことを除きｐＤＣ３１と同じであった。プラスミドｐＤＣ３６を、ApaI／BamHIで消化し、突出している端部を埋めて、プラスミドを再度連結してｐＤＣ３８を得た。ｐＤＣ３８は、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列を含むApaI／BamHI断片が除去されていることを除きｐＤＣ３６と同じであった。プラスミドｐＤＣ３８をSmaI／HindIIIで消化し、そしてＣＭＶプロモーターＤＮＡを欠損している4.6kbの断片（断片１１）を精製した。プラスミドpSK/EF1.3は、EcoRV／NotI／PvuIで消化し、そしてＣＨＥＦ１プロモーター及び上流のＤＮＡ配列をコードする2.9bpの断片（断片１２）を精製した。Bluescript ＳＷ⁺II（ｐＳＫ⁺）をNotIで消化し、そして2.9kbの断片（断片１３）を精製した。ラムダファージ７．４由来の７kbのNotI断片を、2.9ｐＳＫ⁺断片（断片１３）に連結して、プラスミドpSK/EF1.7を得た。プラスミドｐＳＫ⁺は、HindIII／NotIで消化して、2.9kbの断片（断片１４）を精製した。プラスミドpSK/EF1.７をNotI／NcoIで消化し、ＣＨＥＦ１の５’非翻訳イントロンの一部をコードする620 bpの断片（断片１５）を精製した。プライマー９６−３６及び９６−４５を用い、そして鋳型としてpSK/EF1.12を用いて作製した、５’イントロンの残部をコードするHindIII／ＮcoIで消化された123 bpのＰＣＲ断片（断片１６）を精製した。2.9kbのpＳＫ⁺断片（断片１４）、620 bpのpSK/EF1.7断片（断片１５）、及び12 3 bpのHindIII／NcoI断片（断片１６）を連結し、完全なＣＨＥＦ１５’イントロン配列を有するプラスミドpSK/5'EF-１を得た。プラスミドpSK/5'EF-１を、HindIII／NotIで消化し、５’イントロンをコードする0.7kbの断片（断片１７）を精製した。ＣＭＶプロモーターを欠損している4 .6kbのｐＤＣ３８断片（断片１１）、ＣＨＥＦ１プロモーター及び上流配列を含む2.9kbのpSK/EF1.3断片（断片１２）、ならびに完全な５’イントロンをコードする0.7kbのpSK/5'EF-１断片（断片１７）を３者の連結を行って組み合わせてプラスミドｐＤＥＦ１を得、かくしてこれは完全な５’ ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡ、dhfr遺伝子、及びＳＶ４０Ｔ抗原で形質転換された細胞系において非常に多数のコピーに複製を許容するＳＶ４０の複製起点を含んでいた。プラスミドｐＤＥＦ１をHindIIIで消化し、突出している端部を埋め、次いで、このプラスミドをNotIで消化し、そして、ＣＨＥＦ１プロモーターと、部分５ ’イントロン配列に加えて上流ＤＮＡ配列を有する2.6kbの断片（断片１８）を精製した。プラスミドｐＤＥＦ１をNotI/Asp718で消化し、そして、５’イントロンの残部をコードする1.3kbの断片（断片１９）を精製した。プラスミドｐＤＣ３８をSmaI/Asp718で消化し、そして、ＤＨＦＲとＳＶ４０プロモーター／オペレーター、およびポリアデニル化ＤＮＡをコードしている４kbの断片（断片２０）を精製した。2.6kbのｐＤＥＦ１断片（断片１８）、1.3kbのｐＤＥＦ１断片（断片１９）、及び4 kbのｐＤＣ１８断片（断片２０）を三者の連結によって組合せて、プラスミドｐＤＥＦ２を得た。大腸菌株ＸＬ−１ B1ueによって保有されているプラスミドｐＤＥＦ２が、メリーランド州、２０８５２、ロックヴィル、１２３０１パークローンドライブに所在の、アメリカンタイプカルチャーコレクションに、１９９７年３月４日に寄託され、そして、受託番号９８３４３が付与された。プラスミドｐＤＥＦ２は、ＣＨＥＦ１のＴＡＴＡボックスの 2.3ｋｂ上流側にある0.3kbのHindIII/SpeI断片が除去されて、ポリリンカー領域にH1ndIII部位をただ一つ有する点においてプラスミドｐＤＥＦ１とは相違している。ｐＤＥＦ２は、例えば、発現される遺伝子が、独自のポリアデニレーション部位を含んでいる場合に使用される。プラスミドを線状化するために、プラスミドｐＤＥＦ２をAs p718/XbaIで消化し、これによって複製配列の開始点も消失し、そして、7.4kbの断片（断片２１）を精製した。プラスミドｐＤＣ１をAsp718/XbaIで消化し、そして、ＢＧＨポリアデニレーション化配列に加えて、代替の開始点または複製ＤＮＡを含む0.8kbの断片（断片２２）を精製した。7.4kbのｐＤＥＦ２断片（断片２１）と0.8kbのｐＤＣ２１断片（断片２２）を連結して、ｐＤＥＦ２と同様の点でｐＤＥＦ１と異なる、プラスミドｐＤＥＦ１０を生成させた。プラスミドｐＤＥＦ１０は、ｐＤＥＦ２とは、ｐＤＥＦ１０のポリリンカー領域の３’端にウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化部位がある点で異なっている。プラスミドを線状化するためにプラスミドｐＤＥＦ１０をHindIII/XbaIで消化し、そして8.2kbの断片（断片２３）を精製した。ヒトケモカインマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）をコードするプラスミドであるプラスミドｐＤＣ１／ＭＤＣをHindIII/XbaIで消化し、そして、ＭＤＣをコードする0.4kbの断片（断片２４）を精製した。8.2kbのｐＤＥＦ10断片（断片２３）と0.4kbのｐＤＣ１／ＭＤＣ断片（断片２４）を連結させて、プラスミドｐＤＥＦ１０／ＭＤＣ．１を得た。プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶをBamHIで消化して、突出している端部をクレノウで埋めて、次いで、このプラスミドをAsp718で消化し、そして、1.5kbの断片（断片２５）を精製した。プラスミドｐＤＣ１をNotIで消化し、突出している端部をクレノウで埋め、次いで、このプラスミドをAsp718で消化し、そして、3.9kb の断片（断片２６）を精製した。1.5kbのｐＲｃ／ＣＭＶ断片（断片２５）と3.9 kbのｐＤＣ１断片（断片２６）を連結し、プラスミドｐＮＣＸを得た。プラスミドｐＮＣＸは、dhfr遺伝子がネオマイシン耐性(Neo R)遺伝子に置き換わっていることを除きｐＤＣ１と同様である。プラスミドｐＮＣＸをAsp718/Pvu1で消化し、そして、2.1ｋbの断片（断片２７）を精製した。プラスミドｐＤＥＦ１をAsp718/Pvu1で消化し、そして、5.9kbの断片（断片２８）を精製した。2.1kbのｐＮＸＣ断片（断片２７）と5.9kbのｐＤＥＦ１断片（断片２８）を連結して、プラスミドｐＮＥＦ１が得られた。ｐＮＥＦ１は、このプラスミドがネオマイシンまたはＧ４１８に対する耐性をコードするネオマイシン耐性遺伝子（NeoR)を保有している点でｐＤＥＦ１と相違している。プラスミドが二つのHindIII部位を有しているので、ｐＮＥＦ１へ挿入される遺伝子は一般にHindIII/XbaI断片であり、HindIIIによる一部消化または３者の連結の後に挿入が行われる。実施例５ＤＧ４４細胞のトランスフェクションおよび生産性アッセイ単一プラスミドを用いて宿主ＤＧ４４細胞をトランスフェクションするために、通常、５０〜１００μｇのプラスミドを制限酵素PvuIまたはAscIで線状化した。ＣＨＯ細胞に二つのプラスミドが導入されるトランスフェクションでは、プラスミドを未消化のままとした。形質転換に先駆けて、プラスミドをエタノール沈降せしめ、そして、70％エタノールで２回洗浄を行った。ＤＮＡペレットを素早く乾燥せしめ、そして、４００μｌの滅菌済の蒸留水に再懸濁した。この再懸濁したＤＮＡに、４００μ，ｌの滅菌済の、２×HeBS（40mM HEPES-水酸化ナトリウム、pH 7.0；274mM塩化ナトリウム；10mM塩化カリウム；1.4mMリン酸水素二ナトリウム；12mMデキストロース）が添加された。トランスフェクションされていないＤＧ４４細胞は、「ＨＴ」とも称される、ヒポキサンチン（最終濃度：0.01 mM）とチミジン(最終濃度：0.0016mM)が補充されたDMEM/F-12培地で培養した。トランスフェクションされていないＤＧ４４細胞とトランスフェクションされたＤＧ４４細胞の双方の生育のために、透析したＦＢＳが、５〜10体積％の最終濃度になるように、この培地に添加された。トランスフェクション用のＤＧ４４細胞を、処理済の150cm²組織培養用ポリスチレン製フラスコ（Corning社）にて約５０％またはそれ以下の集密度に至るまで培養を行うことで調製した。まず、培地を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ；2.7mM塩化カリウム；1.5mMリン酸二水素カリウム；137mM塩化ナトリウム；8.1mMリン酸水素二ナトリウム）で細胞を一度洗浄し、ＣＭＦ−ＰＢＳに0.012 5％の照射したトリプシン（Worthington Biochemical社）を含む溶液の４mlを添加し、そして、37℃で、数分間にわたってインキュベーションすることによって、プラスチック製のフラスコから細胞が除去された。ウシ胎児血清(FBS)を含んだ培地(４m1)が添加され、細胞の濃度が決定され、そして、遠心分離によって２ ×10⁷個の細胞の画分がペレット化された。各細胞ペレットがＣＭＦ−ＰＢＳで一旦洗浄され、そして、HeBsと所望のプラスミドＤＮＡを含んだ溶液の0.8m1にて再懸濁された。この再懸濁された細胞は、室温下で、0.4cm Gene Pulserキュベット（Bio-Rad社）に移され、そして、Bio-Rad Gene-Pulserエレクトロポレーション装置内に置いた。室温下で、290V、960μFD（９〜11.5msecパルス）の放電を発するコンデンサーを用いて、細胞を、エレクトロポレーションした。５〜 10％の透析済FBSとＨＴが補充された10mlのDMEM/F-12を添加する以前に、約10分間にわたって、キュベット内に細胞を置いた。この時点にて殺傷率を決定し（トリパンブルー排除試験）、通常、約50％の数値が得られた。次に、これら細胞を、遠心分離によってペレット化し、５〜10％の透析済FBSとＨＴが補充された２mlのDMEM/F-12（「非選択培地」）にて再懸濁し、そして、10ｃｍのポリスチレン製の組織培養用プレートに播種した。細胞を２日間成長せしめて、通常、集密度に達するこの時点にて、上述したようにしてトリプシンを用いてプレートから細胞を除去し、そして、５〜10％の透析済FBSが補充され、ＨＴが省かれた様々な希釈度のDMEM/F-12（「選択培地」）が置かれた10cm²のプレートに細胞が播種された。５日後と９日後に、これら細胞を選択培地に送った。約２週間後に、トランスフェクト体のコロニー（通常、各トランスフェクションにつき1000個以上）を、上述したようにして、トリプシンを用いてプレートから除去し、そして、選択培地を添加した後に、細胞濃度を決定した。各トランスフェクションから、２×10⁶個の細胞の画分の少なくとも２つを、10m1の選択培地を含んだ1Ocmのプレートに添加した。これら細胞を、細胞の超過密化によってプレートから大方の細胞が離れる時点、すなわち、細胞の死滅に至るまで細胞の成長が継続された。死滅細胞の培養上清が、平均生産力価を決定するために、ELISA でアッセイされた。実施例６ＣＨＥＦ１を用いた組換えタンパク質生産実施例５に記載されたＤＧ４４細胞は、ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡに作動可能に連結された表３に記載の遺伝子を保有するプラスミドによってトランスフェクションされた。このアッセイで利用した各遺伝子をコードするプラスミドで形質転換した細菌株は、メリーランド州、２０８５２、ロックヴィル、１２３０１パークローンドライブに所在の、アメリカンタイプカルチャーコレクションに、１９９７年４月１日に寄託され、そして、表２に記載の受託番号が付与された。表２プラスミドの受託番号遺伝子コードプラスミドの名称受託番号抗体ＩＣＭ３重鎖 pDEF1/ICM3H.2 ９８３８１抗体ＩＣＭ３軽鎖 pNEF1/ICM3L.3 ９８３８２抗体２３Ｆ２Ｇ重鎖 pDEF1/F2GH.1 ９８３８３抗体２３Ｆ２Ｇ軽鎖 pNEF1/F2GL.1 ９８３８４キチナーゼ pDEF1/CTN.1 ９８３８５血小板活性因子アセチルヒロラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ） pDEF2/HPH.4 ９８３８６マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ） pDEF1O/MDC.1 ９８３８７トランスフェクト体の選択の後、各トランスフェクションから得た（200を超える）コロニーのプールを、トリプシンを用いて各プレートから除去し、そして、各トランスフェクションから得た同数の細胞を、再接種して死滅するまで成長せしめた。上清を除去し、そしてELISAまたは酵素アッセイのいずれかを利用してタンパク質の発現をアッセイした。その結果を、表３にまとめた。表３ＣＨＥＦ１とＣＭＶ調節配列を用いたタンパク質の発現タンパク質タイタートランスフェクされた遺伝子ＣＭＶＣＨＥＦ１ＩＣＭ３Ｈ＋Ｌ５５４１８６２ＩＣＭ３Ｈ＋Ｌ２８８２１５３Ｈｕ２３Ｆ２ＧＨ＋Ｌ３３７１８４８ＭＤＣ３６０２１００ＰＡＦ−ＡＨ５９０６５７４キチナーゼ−１３２００２３００キチナーゼ−２８９００１２８５０キチナーゼ発現（表３のキチナーゼ−１の項目）を調べる第一実験を除いて、ＣＨＥＦ１調節ＤＮＡの使用は、顕著な高さのタンパク質発現レベルと、ＣＭＶプロモーターによる発現より３〜８倍の高さの発現性が認められた。キチナーゼのアッセイにて認められた発現性の低下が、キチナーゼに特徴的および／または独特の例外的な結果または再現可能な結果によるものであるかどうかを決定するために、少数のトランスフェクト体しか通常得られない第一実験で用いた単数回のトランスフェクションに対して、二つの別個のトランスフェクションを用いる二回目の実験を行った。さらに、第一実験で用いた技術よりも高い精度が実証された、キチナーゼ活性に関する他のアッセイも利用した。二回目のトランスフェクションによって、ＣＭＶプラスミドを用いて得られるトランスフェクト体の数の１５０％を超える数のトランスフェクト体を他の実験で生産した、ｐＤＥＦ２プラスミドを用いた先の結果で認められた数と同様の数のトランスフェクト体が生産された。第二の実験から得られた結果（表３のキチナーゼ−２の項目）は、ＣＭＶプロモーターで認められた以上のタンパク質の発現性の増大（約1.4倍）が、先にアッセイした他のタンパク質について認められたタンパク質の発現性よりも小さくとも、これら結果に対して信頼性をさらに付与することものであることに他ならない。実施例７異なる長さのＣＨＥＦ１調節ＤＮＡを用いた組換えタンパク質生産ＥＦ−１α遺伝子由来の８ｋｂの５’フランキングＤＮＡをさらに含む発現ベクターも構築し、そして、ｐＤＥＦ１４と命名した。このプラスミドｐＤＥＦ１４は、ｐＤＥＦ２とは、ｐＤＥＦ１４が、約11.7kbのハムスターＥＦ−１αの５ ’フランキングＤＮＡを有しているのに対して、ｐＤＥＦ２が同じ配列の3.3kb しか有していない点で相違する。このｐＤＥＦ１４プラスミドは、ＤＨＦＲ発現カセットの３’に近接する４kbのハムスター３’フランキングＤＮＡも含んでいる。この大きなｐＤＥＦ１４プラスミドは、下記のようにして構築された。手短に言えば、ｐＤＥＦ２から2.6kbのAscI/NotIＣＨＥＦ１断片を除去し、そして、代わりに11kbのAscI/NotIＣＨＥＦ１断片をそこに挿入した。最初に必要とされた大きな断片の挿入は、ATGで始まる11.7kbのＥＦ−１αの５’に位置するXbaI部位を、AscI部位に修飾する。さらに、ＥＦ−１αのストップコドンの３ ’側のNsiI部位で始まる118bpのＣＨＥＦ１フランキング配列からなる、４kbの平滑末端化したNsiI/Sa1I断片を、発現される遺伝子が挿入されるポリリンカー領域の３’端に位置したＤＨＦＲ発現カセットの３’側のPmeI/SalI部位に挿入した。ＥＦ−１α遺伝子のストップコドンから始まる完全３’ＤＮＡ配列を、配列番号：２８に記した。このプラスミドで形質転換した細菌が、メリーランド州、２０８５２、ロックヴィル、１２３０１パークローンドライブに所在の、アメリカンタイプカルチャーコレクションに、１９９７年４月９日に寄託され、そして、受託番号９８３９８が付与された。得られたｐＤＥＦ１４プラスミドは、複数のHindIII部位に沿った独特のXbaI部位とNotI部位を有しており、これにより、発現のために遺伝子をプラスミドに挿入するための三者ライゲーシが必要となる。例えば、所望の遺伝子の他に、ｐＤＥＦ１４由来の737bpのNotI/Hi ndIII断片とｐＤＥＦ１４由来の19.7kbのXbaI/NotI断片を含んだHindIII/XbaI断片をライゲーションすることによって、ある遺伝子を、このプラスミドに挿入することができる。このベクターを用いたタンパク質発現を、ＥＦ−１αの5'フランキング領域の一部を含んだｐＤＥＦ２ベクターを用いた発現に対して比較を行った。予備的実験にて、抗体２３Ｆ２Ｇの重鎖と軽鎖の双方をコードするＤＮＡを、ｐＤＥＦ２ベクターとｐＤＥＦ１４の双方にサブクローニングし、そして、実施例５にて先述したようにして、発現レベルを決定し、次いで、ＤＧ４４細胞へのトランスフェクションを行った。双方の抗体鎖をコードする遺伝子をベクター内で線状に配置せしめ、そして、双方の遺伝子の発現は、各プラスミドが保有するＣＨＥＦ１配列によって駆動された。各プラスミドでの二つの鎖のコード領域は、３’非翻訳領域ヒトIgG4から誘導された同一の4.3kbのＤＮＡによって分離された。試験結果は、ｐＤＥＦ１４での大きなＣＨＥＦ１配列由来の２３Ｆ２Ｇ抗体発現は、小さなｐＤＥＦ２配列由来の抗体発現よりも４倍以上大きかった。同定可能なｐＤＥＦ１４転写結合因子部位のほとんどもまた、ｐＤＥＦ２のＤＮＡ配列中にあるという点で、この結果は驚くべきものであった。それ故、一つまたはそれ以上の他のおよび未同定の転写結合因子部位なたはエンハンサー配列が、ｐＤＥＦ１４プラスミドのＣＨＥＦ１のＤＮＡ内に位置せしめることも可能である。あるいは、３’ＤＮＡ配列の特性によって、大きなＣＨＥＦ１のＤＮＡは、増大した転写の恩恵を付与するであろう。上述の実施例に記載された本発明に関して、当業者にあっては無数の変更及び修飾を想起することが考えられる。従って、添付した請求の範囲に記載の限定のみが、本発明に付されるべきである。

Claims

【特許請求の範囲】１．ハムスターＥＦ−１α転写調節ＤＮＡを含む、精製及び単離されたＤＮＡ。２．前記調節ＤＮＡが配列番号：１に示される核酸配列を含む請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。３．前記調節ＤＮＡが、当該調節ＤＮＡに作動可能に連結された遺伝子の転写を促進することができる配列番号：１に示される核酸配列の一部分を含む請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。４．前記調節ＤＮＡが、配列番号：１に示されるヌクレオチド中、約２１１４位のヌクレオチドから約３６５６位のヌクレオチドまでを含む請求の範囲第３項記載のＤＮＡ。５．請求の範囲第１乃至４項のいずれかに記載のＤＮＡを含む宿主細胞であって、該ＤＮＡがＥＦ−１αをコードする配列に作動可能に連結されていない宿主細胞。６．請求の範囲第１乃至４項のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターであって、該ＤＮＡがＥＦ−１αをコードする配列に作動可能に連結されていないベクター。７．請求の範囲第６項記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。８．タンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたハムスターＥＦ−１α調節ＤＮＡを含み、該ＤＮＡ配列はハムスターＥＦ−１α以外のタンパク質をコードしているキメラポリヌクレオチド。９．前記調節ＤＮＡが、配列番号：１に示される核酸配列を含む請求の範囲第８項記載のキメラポリヌクレオチド。１０．前記調節ＤＮＡが、配列番号：１に示される核酸配列の一部分を含み、該一部分が当該調節ＤＮＡに作動可能に連結された遺伝子の転写を促進することができる請求の範囲第８項記載のキメラポリヌクレオチド。１１．前記調節ＤＮＡが、配列番号：１に示されるヌクレオチド中、約２１１４位のヌクレオチドから約３６５６位のヌクレオチドまでを含む請求の範囲第１０項記載のキメラポリヌクレオチド。１２．前記タンパク質をコードするＤＮＡ配列が、ＥＦ−１α以外のハムスター細胞の内在性タンパク質をコードする請求の範囲第８項記載のキメラポリヌクレオチド。１３．前記ＤＮＡ配列が、ハムスター細胞に異種性のタンパク質をコードする請求の範囲第８項記載のキメラポリヌクレオチド。１４．請求の範囲第８乃至１３項のいずれかに記載のキメラポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１５．請求の範囲第８乃至１３項のいずれかに記載のキメラポリヌクレオチドを含む発現プラスミド。１６．配列番号：２８に示される核酸配列をさらに含む請求の範囲第１５項記載の発現プラスミド。１７．配列番号：２８に示される前記核酸配列が、キメラポリヌクレオチドに対して３’側に位置する請求の範囲第１６項記載の発現プラスミド。１８．請求の範囲第１５項記載の発現プラスミドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１９．請求の範囲第１６または１７項のいずれかに記載の発現プラスミドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。２０．プラスミドpDEF2。２１．プラスミドpDEF14。２２．プラスミドpDEF1./ICM3H.2。２３．プラスミドpNEF1/ICM3L.3。２４．プラスミドpDEF1/F2GH.1。２５．プラスミドpNEF1/F2GL.1。２６．プラスミドpDEF1/CTN.1。２７．プラスミドpDEF2/HPH.4。２８．プラスミドpDEF10/MDC.1。２９．請求の範囲第２０乃至２８項のいずれかに記載の発現プラスミドで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。３０．宿主細胞において目的の遺伝子の転写を増大させるための方法であって、目的の遺伝子に作動可能に連結された位置にて、該宿主細胞のゲノム配列内にハムスターＥＦ−１α調節ＤＮＡを含むＤＮＡを統合させる工程を含む方法。３１．統合されるべき前記ＤＮＡがさらに、標的配列を含む請求の範囲第３０項記載の方法。３２．前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求の範囲第３０項記載の方法。３３．前記目的の遺伝子が、チャイニーズハムスター卵巣細胞の内在性遺伝子である請求の範囲第３２項記載の方法。３４．前記所望の遺伝子がチャイニーズハムスター卵巣細胞に異種性であり、チャイニーズハムスター卵巣細胞のゲノムＤＮＡに安定に統合される請求の範囲第３０項記載の方法。