CZ296544B6 - Purifikovaná a izolovaná transkripcní regulacní DNA kreccího EF-1alfa, hostitelské bunky, vektory, chimérické polynukleotidy, plasmidy a zpusob zvysování transkripce genu - Google Patents

Abstract

Purifikovaná a izolovaná transkripcní regulacní DNA kreccího EF-1.alfa. zvolená z a) DNA obsahujícísekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 1, b) DNA obsahující cást sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 1, která je schopna podporovat transkripci genu operativne pripojeného k regulacní DNA, c) DNA obsahující oblast od nukleotidu2114 do nukleotidu 3656 sekvence uvedené v SEQ IDNO: 1, d) 11,7 kb regulacní DNA sekvence kreccíhoEF-1.alfa. v plasmidu pDEF14, který je ulozen ve sbírce ATCC pod prírustkovým císlem 98 398, e) DNAobsahující sekvence nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 28, f) kreccí regulacní DNA sekvence, která hybridizuje s DNA popsanou v SEQ ID NO: 1 za podmínek zahrnujících konecné promytí v pufru obsahujícím 2X SSC a 0,1% SDS pri 65 .degree.C, g) DNAobsahující asi 1,56 kb od 5' do iniciacního ATG kodonu v SEQ ID NO: 1. Hostitelské bunky, vektory, chimérické polynukleotidy, plasmidy a zpusob zvysování transkripce genu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká regulačních sekvencí DNA pocházejících z křeččího genu EF-Ια. Dále se vynález týká expresních konstruktů obsahujících výše uvedenou regulační DNA, hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných touto regulační DNA a způsobů zvyšování transkripce genu za použití této regulační DNA. Vynález se rovněž týká expresních konstruktů obsahujících výše uvedenou regulační DNA operativně připojenou ke specifickým genovým sekvencím.

Dosavadní stav techniky

Transkripce jakéhokoliv daného eukaryontního genu se provádí pomocí jednoho ze tří enzymů, RNA polymeras, z nichž každý účinkuje na konkrétní podsoubor genů. Zatímco transkripce velkých ribosomálních RNA probíhá pomocí RNA polymerasy I a malá ribosomální RNA a tRNA se přepisují RNA polymerasou III, DNA sekvence kódující proteiny a většina malých jaderných RNA jsou transkribovány RNA polymerasou II. U každého typu genu transkripce vyžaduje interakci příslušné polymerasy s promotorovými sekvencemi genu a vznik stabilního transkripčního iniciačního komplexu. Obecně je možno uvést, že transkripce od kteréhokoliv ze tří polymeras také vyžaduje interakci určitého vazebného faktoru s promotorovou sekvencí a rozeznání vazebného faktoru pomocí druhého faktoru, který tak umožní interakci polymerasy se sekvencí genu. Zatímco tento mechanismus je minimálním požadavkem transkripce katalyzované RNA polymerasami I a III, proces vedoucí k transkripci katalyzované RNA polymerasou lije složitější.

Vzhledem k rozsáhlému množství genových sekvencí transkribovaných RNA polymerasou II a vzhledem ke skutečnosti, že regulační schéma pro tyto geny jsou vysoce proměnlivá ve stejné buňce a liší se také od jedné buňky ke druhé, je transkripce katalyzovaná RNA polymerasou lije kromě interakcí jiných vazebných proteinů k regulačním sekvencím DNA, jiným než je promotor, ovlivněna vazbou řady transkripčních faktorů v iniciačním komplexu. Tyto jiné vazebné proteiny mohou sloužit pro aktivaci transkripce nad bazální hladinou nebo zcela potlačují transkripci. Připojení represoru lze rovněž považovat za prostředek jak zabránit aktivaci, vzhledem k tomu, že bazální transkripční hladina u vyšších eukaryontů je normálně velmi nízká. Na druhé straně, aktivace je obvyklou konečnou odpovědí na určitý fyziologický signál a vyžaduje buď odstranění represorového vazebného proteinu, nebo alteraci v chromatinové struktuře, aby se umožnil vznik aktivního transkripčního iniciačního komplexu.

Jádrem vzniku transkripčního komplexu a nezbytnou podmínkou pro bazální hladinu exprese genu je promotorová sekvence, která je označována jako „TATA box“ a která je umístěna před transkripčním startovacím místem polymerasy II. TATA box je vazebným místem pro všudypřítomný transkripční faktor označovaný jako TFIID, avšak jak již bylo uvedeno, transkripce od promotorové sekvence je u většiny genů silně ovlivněna dalšími regulačními oblastmi DNA, které mohou zesilovat nebo potlačovat transkripci genu. Elementy DNA tohoto typu jsou v různých polohách vzhledem ke kódující sekvenci v genu a vzhledem k TATA boxu. Tyto další transkripční regulační elementy často pracují tkáňové nebo buněčně specificky.

Při expresi rekombinantních proteinů je zvláště důležité zvolit regulační DNA, která obsahuje sekvenci promotoru TATA a další regulační elementy kompatibilní s transkripčním aparátem hostitelské buňky. Z tohoto důvodu se obvykle dává přednost regulačním DNA, které jsou endogenní vzhledem ke zvolené hostitelské buňce. Značného úspěchu bylo také dosaženo za použití regulační DNA odvozené od sekvencí virového genomu, vzhledem k tomu, že rozmezí hostitelů je u virů široké a že bylo prokázáno aktivita virových regulačních DNA v různých typech buněk. Jako příklad virových regulačních DNA, jichž se běžně využívá pro expresi rekombinantního proteinu, je možno uvést promotor/zesilovač raného genu SVO [Dijkema et al., EMBO J. 4: 761 (1985)], koncovou dlouhou repetici DNA viru Rousova sarkomu [Gorman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 79: 6777 (1982b)], fragmenty hovězího papillomaviru [Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1: 486 (1981)] a elementy promotoru/zesilovače lidského cytomegaloviru [Boshart et al., 5 Cell. 41: 521 (1985)]. Přes široké rozmezí buněčných typů, na nichž byla demonstrována funkčnost virových regulačních DNA, je možné, že existují nevirové DNA elementy promotoru/zesilovače, které umožňují zvýšit transkripci rekombinantního proteinu ve specifických buněčných liniích prostřednictvím účinnějšího využití transkripčního aparátu hostitelské buňky.

ίο V tomto oboru tedy existuje potřeba identifikovat sekvence regulační DNA promotoru/zesilovače, které fungují v homologních a heterologních typech buněk, přičemž účelem je zvýšení exprese rekombinantních proteinů a vysoký výtěžek požadovaného proteinového produktu. Zvláště důležitou potřebou je identifikovat takové regulační DNA promotoru/zesilovače, které mohou být s vysokou účinností využity v savčích buňkách, za účelem zvýšení produkce rekombinantních 15 proteinů in vitro, které jsou glykosylovány podobným způsobem, jako je tomu u glykosylačních profilů, které jsou výsledkem exprese proteinu in vivo. U takto exprimovaných proteinů při terapeutickém nebo profylaktickém podávání existuje menší pravděpodobnost že budou antigenní a větší pravděpodobnost, že budou fyziologicky účinné. Regulační oblasti DNA tohoto typu jsou také snadno insertovatelné do hostitelských buněk za účelem zvýšení exprese genů, které jsou 20 endogenní vzhledem k hostitelským buňkám nebo genům dříve zavedeným do genomu hostitelské buňky, způsoby, které jsou v tomto oboru dobře známy a rutinně využívány.

Podstata vynálezu '

Předmětem vynálezu je v základním provedení purifíkovaná a izolovaná transkripční regulační DNA křeččího EF-Ια zvolená z

a) DNA obsahující sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 1,

b) DNA obsahující část sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 1, která je schopna podporovat transkripci genu operativně připojeného k regulační DNA,

c) DNA obsahující oblast od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvence uvedené v SEQ 35 ID NO: 1,

d) 1 l,7kb regulační DNA sekvence křeččího EF-Ια vplasmidu pDEF14, který je uložen ve sbírce ATCC pod přírůstkovým číslem 98 398,

e) DNA obsahující sekvence nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 28,

f) křeččí regulační DNA sekvence, která hybridizuje s DNA popsanou v SEQ FD NO: 1 za podmínek zahrnujících konečné promytí v pufřu obsahujícím 2X SSC a 0,1% SDS při 65 °C,

g) DNA obsahující asi 1,56 kg od 5' do iniciačního ATG kodonu v SEQ ID NO: 1.

Purifikované a izolované polynukleotidy odvozené z buněk křečka podle vynálezu regulují transkripci genu. Tyto polynukleotidy zahrnují regulační DNA sekvence od 5' konce od translatované oblasti genu EF-Ια vaječníků čínského křečka. Přednostní DNA podle vynálezu je označována 50 jako CHEF1 regulační DNA a obsahuje přibližně 3,7 kb DNA, která sahá od restrikčního místa Spěl do iniciačního methioninového kodonu (ATG) proteinu EF-Ια. Předmětem vynálezu jsou rovněž polynukleotidy o méně než 3,7 kb, pokud jsou tyto menší fragmenty polynukleotidů schopny zvyšovat transkripci operativně připojeného genu. Aktivní fragmenty DNA podle vynálezu, definované schopností regulovat (tj. zesilovat) transkripci genu, jsou snadno identifíkova

-2CZ 296544 B6 telné delečními studiemi, které jsou v tomto oboru dobře známé a běžně využívané. Regulační DNA podle vynálezu zahrnuje polynukleotidy izolované z přírodních zdrojů, jako buněčných kultur, jakož i polynukleotidy produkované enzymatickými nebo čistě chemickými syntetickými postupy. Podle jednoho provedení tedy vynález poskytuje způsob přípravy CHEF1 DNA z genomové knihovny. Alternativně může být DNA připravena enzymatickou syntézo, která například využívá polymerázové řetězové reakce (PCR), nebo čistě chemickou syntézou, při níž se postupně přidávají jednotlivé nukleotidy nebo se hybridizují a ligují překrývající se oligonukleotidy. Nejvýhodnější DNA sekvence je popsána v SEQ ID NO: 1. Předmětem vynálezu jsou dále DNA sekvence, které za stringentních podmínek hybridizují s DNA popsanou v SEQ ID NO: 1. Stringentní podmínky zahrnují promytí v pufru obsahujícím asi 2X SSC a asi 0,1% SDS při asi 65 °C nebo podmínky ekvivalentní.

Předmětem vynálezu je dále DNA plasmid obsahující regulační polynukleotidy CHEF1. Plasmidy podle vynálezu rovněž mohou obsahovat DNA sekvence kódující protein, kteiý je předmětem zájmu, nebo RNA produkt, který je předmětem zájmu, operativně připojené k polynukleotidové sekvenci CHEF1. Dále je předmětem vynálezu hostitelská buňka transformovaná, transfekovaná a/nebo elektroporovaná polynukleotidem nebo plasmidem podle vynálezu. Plasmidová DNA podle vynálezu může být zavedena do genomu hostitelské buňky nebo se v buňce může vyskytovat ve formě uzavřeného kružnicového plasmidu. Jako přednostní plasmidy podle vynálezu, které jsou zvláště přístupné pro zavedení požadované DNA sekvence, je možno uvést plasmidy pDEF14 a pDEF2. Bakteriální hostitelská buňka transformovaná pDEF14 byla uložena ve sbírce Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 9. dubna 1997 pod přírůstkovým číslem 98398 a bakteriální hostitelská buňka transformovanápDEF2 byla uložena ve sbírce Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 4. března 1997 pod přírůstkovým číslem 98343.

Předmětem vynálezu je také lineární DNA vektor obsahující polynukleotid CHEF1. Vektor podle vynálezu je možno získat z virového zdroje nebo ho lze syntetizovat in vitro. Předmětem vynálezu je dále hostitelská buňka transfekovaná nebo elektroporovaná se sekvencí lineárního vektoru. DNA tohoto typuje zvláště užitečná pro expresi sekvence heterologního genu operativně připojené kDNA sekvenci CHEF1 nebo pro místně cílenou homologní rekombinaci, při níž sekvence CHEF1 může být zavedena do genomu hostitelské buňky za účelem modulace exprese operativně připojené sekvence.

Dále je předmětem vynálezu molekula chimérické rekombinantní DNA, kde je CHEF1 DNA operativně připojena (tj. podněcuje transkripci) k sekvenci genu kódující požadovaný proteinový produkt. Chimérické molekuly jsou obecně molekulami, které obsahují domény, jež se normálně nevyskytují ve spojení s prostředím divokého typu. Chimérická DNA podle vynálezu může zahrnovat část nebo celou regulační DNA CHEF1 v asociaci sDNA sekvencí, která je odlišná od genu pro křeččí protein EF-Ια. Jako proteinové produkty kódované chimérickými molekulami je možno uvést fyziologicky aktivní proteiny, části nebo podjednotky aktivních proteinů, jakož i markerové nebo reportérové proteiny. Polynukleotidová sekvence kódující proteinový produkt může být odvozena od komplementární DNA (cDNA), genomové DNA, syntetické DNA nebo DNA odvozené kombinacemi molekul těchto typů. Proteinové produkty mohou být endogenní (tj. normálně se nalézají v genomu CHO bez transformačního, transfekčního nebo podobného zavedení DNA) vzhledem k buňkám vaječníků čínského křečka (CHO). Kromě toho proteinové produkty mohou být kódovány exogenními zdroji, přičemž exogenním zdrojem je zdroj odlišný od genomu buňky CHO, jako je například syntetická DNA. Jako přednostní chimérické molekuly podle vynálezu je možno uvést molekuly, v nichž je DNA CHEF1 operativně připojena k DNA kódující: (i) těžký řetězec anti-ICAM3 protilátky ICM3, (ii) lehký řetězec ICM3, (iii) těžký řetězec anti-CDl 1/CD18 protilátky Hu23F2G, (iv) lehký řetězec hu23F2G, (v) chitinasu, (vi) acetylhydrolasu faktoru aktivujícího destičky (PAF-AH) a(vii) chemokin odvozený od makrofágu (MDC). Bakteriální hostitelské buňky transformované plasmidovou DNA, které obsahují chimérické molekuly (i) až (vii), byly uloženy ve sbírce Američan Type Culture Collection 1. dubna

-3CZ 296544 B6

1997 pod přírůstkovými čísly: (i) 98381, (ii) 98328, (iii) 98383, (iv) 98384, (v) 98385, (vi) 98386 a (vii) 98387.

Předmětem vynálezu je dále hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná DNA CHEF1 podle vynálezu. Přednostní hostitelská buňka podle vynálezu je odvozena z buňky čínského křečka (Circetulus griseus), o jejíž regulační DNA CHEF by se předpokládalo, že poskytne vyšší úroveň exprese proteinu. Předmětem vynálezu jsou však také další typy buněk odvozených z jiných druhů, jako například z buněk arménského křečka (Cricetulus migratoris) nebo syrského (zlatého) křečka (Mesocricetus auratus), jakož i typy buněk odvozené od buněk jiných živočišných rodů. Buňky mohou být získány z plic, vaječníku, peritonea, svalů, sleziny, ledvin, melanomu nebo somatického zdroje, jakož i z celého zárodku nebo celého embrya. Hostitelské buňky podle vynálezu uvedené výše, jakož i další typy buněk, například myelomatické buněčné linie, o jejichž regulační DNA CHEF1 by se předpokládalo, že poskytnou vysokou úroveň transkripce, je možno získat ze sbírky Amaerican Type Culture Collection nebo je možno je napěstovat přímo z živočišného zdroje.

Rekombinantní molekuly podle vynálezu, které obsahují regulační DNA CHEF umožní zvýšenou úroveň exprese mRNA operativně připojených heterologních polynukleotidů (tj. těch které se bez transfekčního, transformačního nebo podobného zavedení v hostitelském genomu normálně nenacházejí). V závislosti na povaze polynukleotidu připojeného k sekvencím polynukleotidů CHEF1, by zvýšená transkripce vedla ke zvýšeným úrovním polypeptidů nebo zvýšeným úrovním různých druhů RNA v případech, kdy připojený polynukleotid kóduje například transferovou RNA, ribosomální RNA, malou jadernou RNA apod. Takovým druhem RNA také může být kódující RNA komplementární kmRNA získané transkripcí endogenní nebo exogenní genové sekvence. Zvýšená translace polypeptidů bude nezbytně záviset na přítomnosti vhodných translačních signálů přítomných v mRNA.

Předmětem vynálezu je dále způsob zavádění DNA CHEF do specifických míst genomové DNA hostitelských buněk za účelem zvýšení úrovně transkripce endogenní genové sekvence. Pro zavedení celé nebo části DNA CHEF1 je možno použít homologní rekombinaci. V hostitelských buňkách, které jsou modifikovány tímto způsobem, je DNA CHEF1 operativně připojena ke kódujícím sekvencím DAN (viz například mezinárodní přihlášky PCT WO/94/12650, WO 92/20808 a WO 91/09955). Předmětem vynálezu jsou tedy nezbytně také sekvence alterované genomové DNA se zavedenou regulační DNA CHEF1.

Alternativně je předmětem vynálezu hostitelská buňka, v níž je exogenní DNA insertována v sousedství a v operativní poloze vzhledem kDNA CHEF1 přítomné v genomu. Hostitelské buňky tohoto typu zahrnují CHO buňky a insertovaná sekvence bud’ nahrazuje DNA kódující EF-Ια, nebo je tato sekvence vložena mezi regulační DNA CHEF1 a DNA kódující EF-loc. Do rozsahu vynálezu také spadají i jiné hostitelské buňky než CHO, do jejichž genomu byla dříve insertována DNA CHEF1 a poté do operativně připojené polohy insertována další DNA.

Předmětem vynálezu je dále způsob zvyšování transkripce požadovaného genu, jehož podstata spočívá v tom, že se do hostitelské buňky zavede polynukleotid zahrnující křeččí regulační sekvenci EF-lcc tak, že se tato regulační sekvence začlení do genomové DNA hostitele v operativně připojené poloze vzhledem k požadovanému genu. Dále do rozsahu vynálezu spadá způsob zvyšování transkripce požadovaného genu, jehož podstata spočívá v tom, že se do hostitelské buňky zavede polynukleotid zahrnující křeččí regulační oblast EF-loc a zaměřovači oblast, přičemž tato zaměřovači oblast je sestavena tak, že umožňuje integrovat regulační oblast v místě operativně připojené k požadovanému genu kódujícímu proteinu odlišnému od EF-Ια. Do rozsahu vynálezu také spadá způsob zvyšování transkripce genů, které jsou endogenní vzhledem k CHO buňkám, jakož i způsob zvyšování transkripce genů, které jsou exogenní vzhledem kCHO buňkám.

Rekombinantních molekul podle vynálezu je možno využít pro produkci transgenních živočichů, při níž se do vyvíjejícího se zárodku nebo somatické buňky živočicha zavede chimérická rekom

-4CZ 296544 B6 binantní DNA obsahující DNA CHEF1 operativně připojenou k sekvenci DNA, která je předmětem zájmu. Chimérické rekombinantní molekuly je možno zavádět například mikroinjekcemi, a pokud se použije zárodečných buněk, mohou všechny buňky výsledného živočicha obsahovat rekombinantní DNA podle vynález. Alternativně lze chimérickou rekombinantní DNA podle vynálezu zavádět do buněk embrya, a v tomto případě DNA podle vynálezu může obsažena ve velkém počtu buněk výsledného živočicha.

DNA CHEF1 je rovněž užitečná při identifikaci blízce příbuzných regulačních oblastí DNA, které mohou poskytovat expresi genu vyšší a dlouhodobější, než jakou umožňuje CHEF1. Podobně, znalost sekvencí DNA CHEF1 umožní sestrojit syntetické DNA buď syntézou de novo, nebo jednoduchou nebo několikanásobnou modifikací sekvencí CHEF1, přičemž výsledné syntetické DNA budou mít sekvence podobné sekvenci CHEF1, avšak budou schopny poskytnout vyšší úrovně transkripce genu.

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. V příkladu 1 je popsáno klonování křeččího genu EF-Ία a příbuzné regulační DNA CHEF1. Příklad 2 se týká subklonování a sekvenční analýzy regulační oblasti CHEF1. V příkladu 3 je charakterizován polynukleotid promotoru CHEF1 a v příkladu 4 je popsán způsob sestrojení různých expresních vektorů obsahujících DNA CHE1. V příkladu 5 je popsáno transfekční stanovení pro zjištění účinnosti regulační DNA CHEF1. V příkladu 6 je podrobně popsáno porovnání úrovní exprese rekombinantního proteinu za použití buď regulační DNA CHEF1, nebo promotoru cytomegaloviru (CMV). V příkladu 7 jsou zkoumány rozdíly v regulační kapacitě DNA CHEF1 o různých délkách.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování CHEF1

Při pokusu izolovat křeččí homolog lidského genu EF-Ία se DNA genomová knihovna buněk vaječníku čínského křečka (CHO-K1) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) podrobí screeningu s cDNA pro lidský EF-la.

Knihovna CHO-K1, částečně štěpená Sau3A v klonovacím vektoru Lambda Fix^(R)II, byla získána od firmy Stratagene (La Jolla, CA, USA) v hostitelské buňce kmenů XL-l-Blue MRA aXLl-Blue MRA (P2). Hostitelské buňky se připraví podle protokolu doporučeného výrobcem s modifikacemi, které jsou stručně popsány dále.

Buňky z glycerolového zásobního roztoku se v proužcích nanesou na LB misky, které neobsahují žádné antibiotikum. Pro inokulační kapalné LB médium se vyberou jednotlivé kolonie a nechají růst do pozdní logaritmické fáze a optické hustoty OD₆₀o asi 0,9. Poté se buňky skladují podle protokolu navrženého výrobcem nebo se jich bezprostředně použije způsobem popsaným dále.

Při přípravě kultur pro další kultivaci se jednotlivé kolonie sejmou z misek připravených výše popsaným způsobem a použije se jich pro inokulaci. Buňky se pěstují v 50 ml LB média doplněného 0,5 ml 1M síranu horečnatého a 1 ml 10% maltosy v deionizované vodě. Buňky se pěstují přes noc při 30 °C a sklidí centrifugaci ve stolní centrifuze (2000 min¹ po dobu 5 minut při teplotě místnosti) a resuspendují v lOmM síranu hořečnatém při OD₆₀o 0,5.

-5CZ 296544 B6

Fág lambda dodaný výrobcem se zředí v SM pufru (1 litr zásobního roztoku obsahuje 5,8 g chloridu sodného, 2,0 g hydrátu síranu hořečnatého, 50 ml 1M Tris-HCl, pH 7,5 a 5 ml 2% (hmotnost/objem) želatiny) na 10 až 10⁵ násobné zředění. 2μ1 roztoku o každé koncentraci se přidají ke 400 μΐ hostitelských buněk v lOmM síranu hořečnatém (OD₆₀₀ asi 0,5). Výsledná směs se inkubuje 15 minut při 37 °C, aby se umožnilo připojení fágu k buňkám a přidá se k ní vrchní agar (0,75% LBM agarosa o teplotě 48 °C). Každá směs se dvojmo nanese na LBM agarosové misky. Z výsledků je zřejmý titr 3 x 10⁶ jednotek tvořících plak (pfuj/μΐ fágového zásobního roztoku.

Připraví se čerstvé hostitelské buňky za použití výše popsaného postupu před prohledáváním knihovny. Přibližně 50 000 fágových pfu se přidá k 600 μΐ hostitelských buněk (o OD₆oo přibližně 0,5) s 6,5 ml 0,75% LBM agarosy o teplotě 48 °C. Směs se rozprostře na agarosové misky, které se poté inkubují přibližně 8 hodin při 37 °C. Misky se poté 5 hodin chladí při 4 °C, aby se zabránilo přilepení vrchní agarosy ke krycí vrstvě nitrocelulosy. Na misky se umístí membrány B/V85 o velikosti pórů 0,45 μτη (S+S, Keene, NH) a v přenosu se pokračuje po dobu 2 minut. Membrány se z misek odstraní a přenesená DNA se denaturuje 2 minuty v 1,5M chloridu sodném/0,5M hydroxidu sodném. Filtry se neutralizují 5 minut v 1,5M chloridu sodném/l,0M Tris-HCl (pH 8,0) a blotují na papír Whatman 3-MM a zahřívají za sníženého tlaku při 80 °C po dobu asi 1,5 až 2 hodin.

Jako sondy pro prohledání knihovny se použije sekvence cDNA lidského EF-Ια [Uetsuki et al., J. Biol. Chem. 264: 5791 až 5798 (1989)], u níž se dříve ukázalo, že vykazuje 95% shodu škodující oblastí CHO EF-Ια [Hayashí et al., J. Biochem. 106: 560 až 563, 1989], která se připraví následujícím postupem. l,4kb sonda lidského EF-Ια se získá zplasmidu M0107, pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA, USA) vektoru obsahujícího cDNA lidského EF-Ια insertovaného v místě EcoRI. Za účelem prvního potvrzení, že plasmid M0107 obsahuje předpokládanou lidskou cDNA, se insert DNA sekvenuje s 3' a 5' vektorovými primery.

94-17 AGGCACAGTCGAGGCTGATC (SEQ ID NO: 2)

94-18 TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA (SEQ ID NO: 3)

Prvních 263 párů bází insertu vykazuje více než 90% shodu s publikovanou sekvencí kódující lidský EF-Ια, a zatímco u 3' konce je přesné stanovení obtížné, malé úseky by mohly být ve shodě s předpokládanou sekvencí. Souhrnně tato shoda ukazuje, že plasmid kóduje požadovanou sekvenci.

Celý humánní insert se odstraní zplasmidu štěpením EcoRI a pás cDNA o 1,4kb se dvakrát podrobí gelové purifíkaci za použití soupravy QIAGEn QIAquick Gel Extraction Kit podle pokynů výrobce. DNA se eluuje 50 μΐ TE, výsledný roztok se zkoncentruje v zařízení Microcon-10 (Amicon, Beverly, MA, USA) na 25 μΐ, alikvot se označí ³²P-a-dTTP a ³²P-a-dCTP za použití soupravy pro značení Boehringer Mannheim Random Primer DNA podle pokynů výrobce. Značená sonda se purifíkuje za použití rotující kolony G50, aby se odstranily nezačleněné nukleotidy. Při porovnání purifíkovaná sonda vzhledem k nepurifikovanému alikvotu vykazuje 46% zavedení radioaktivní značky a 5 x 10³ cpm/mm/μΙ (cpm - počet impulzů za minutu).

Nitrocelulosové membrány připravené výše popsaným způsobem se zkoušejí následujícím postupem. Připraví se zásobní roztok prehybridizačního/hybridizačního pufru, který obsahuje 22,5 ml 20X SSC, 30,0 ml 50X Denhardtova roztoku, 3,0 ml 1M fosfátového pufru (pH 6,8), (69 ml 1M dihydrogenfosforečnanu sodného, 31 ml 1M hydrogenfosforečnanu sodného), 0,75 ml 20% SDS a 78,75 ml destilované vody. Za účelem prehybridizace se 1,4 ml lOmg/ml DNA lososího sperma (Stratagene) vaří 5 minut s 0,6 ml destilované vody a poté přidá k 7 ml destilované vody a 72 ml zásobního roztoku pufru. Filtry se inkubují v prehybridizačním pufru minimálně 2 hodiny při 65 °C.

-6CZ 296544 B6

Za účelem hybridizace se spojí 30 μΐ sondy, 200 μΐ 10 mg/ml DNA z lososího spermatu a 770 μΐ destilované vody. Vzniklá směs se 5 minut vaří a přidá se 36 ml zásobního pufru se 3 ml destilované vody. Z filtrů se odstraní prehybridizační roztok a nahradí se hybridizačním pufrem. Filtry se inkubují přes noc při 65 °C, po hybridizaci se filtry 3 hodiny promývají při 65 °C se třemi výměnami pufru obsahujícího 2X SSC a 0,1% SCS, a poté na 48 hodin podrobí autoradiografii.

kolonií identifikovaných jako pozitivní se zachytí do 1 ml SM pufru obsahujícího 20 μΐ chloroformu. Za účelem vyřazení možných pseudogenů, kterým chybí jeden nebo více intronů, se vytvoří páry PCR primerů tak, aby lemovaly vždy dva introny: primery 95-136 (SEQ Π) NO: 4) a 95-137 (SEQ ID NO:5) lemující introny 2 a 3; primery 95-138 (SEQ ID NO: 6) a 95-139 (SEQ ID NO: 7) lemující introny 3 a 4; primery 95-140 (SEQ ID NO: 8) a 95-141 (SEQ ID NO: 9) lemují introny 4 a 5; a primery 95-142 (SEQ ID NO: 10) a 95-143 (SEQ ID NO: 11) lemující introny 6 a 7.

95-136 (SEQ ID NO: 4) GCCACCTGATCTACAAATGT

95-137 (SEQ ID NO: 5) GAGATACCAGCCTCAAATTC

95-138 (SEQ ID NO: 6) ATGTGACCATCATTGATGCC

95-140 (SEQ ID NO: 8) GTTGGAATGGTGACAACATG

95-141 (SEQ ID NO: 9) CAGGTTTTAAAACACCAGTC

95-142 (SEQ ID NO: 10) AATGACCCACCAATGGAAGC

95-143 (SEQ ID NO: 11) ACAGCAACTGTCTGCCTCAT

Předpokládaná velikost PCR produktů za použití CHO EF-Ια DNA templátu je založena na velikosti a umístění intronů v publikované sekvenci lidského EF-1 a. Každá PCR reakce zahrnuje 2 μΐ fágu, 2,5 μΐ každého vhodného páru primerů (100 pg/ml), 2 μΐ 2mM směsi dNTP, 2,5 μΐ 10X PCR pufru (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA), 1,5 μΐ 25mM chloridu hořečnatého, 0,125 μΐ Taq polymerasy (5 jednotek/μΐ) (Perkin Elmer) a 11,8 μΐ destilované vody. Amplifikace se provádí 4 minuty při 94 °C, načež následuje 30 cyklů zahrnujících 1 minutu při 90 °C, 2 minuty při 50 °C a 4 minuty při 72 °C. Amplifikační produkty se rozdělí na 1,2% agarosovém gelu za použití IX TAE. U tří ze 47 pozitivních plaků bylo zjištěno, že kódují pravé geny (č. 2, 7 a 40) obsahující vždy introny. Tyto tři pozitivní vzorky se podrobí třetímu pohledávání za použití následujícího postupu. Výše popsaným postupem se připraví miskové kultury a pro každý ze tří pozitivních plaků se připraví zásobní roztoky ve zředěních 10 až 10⁵. 20 až 50 izolovaných plaků z každého zásobního roztoku se podrobí prohledávání pomocí PCR s následujícími výsledky. Klon č. 2 vykazuje 2 pozitivní plaky (označené jako 2.12 a 2.17) z celkem 22 plaků podrobených screeningu, klon č. 7 vykazuje 1 pozitivní plak (označený jako 7.44) z 50 prohledaných plaků a klon 40 vykazuje jeden pozitivní lak (označený jako 40.24) ze 40 plaků podrobených creeningu. Z každého z těchto čtyř vzorků se dále popsaným způsobem izoluje fágová DNA.

Hostitelské buňky XL-1 Blue MRA (P2) se v proužcích navzorkují na LB agarosové misky a nechají růst přes noc při 37 °C. Vybere se jediná kolonie, kterou se zaočkuje 50 ml LB média (obsahujícího 0,2% maltosu a lOmM síran hořečnatý). Kultura se nechá růst přes noc při 30 °C. Buňky se sklidí pětiminutovou centrifugací při teplotě místnosti při 2000 min' na stolní centrifuze a resuspendují v 50 ml lOmM síranu hořečnatého. Resuspendované hostitelské buňky (50 μΐ) se smísí se 100 μΐ zásobního roztoku každého z pozitivních fágů a vzniklá směs se inkubuje 15 minut při 37 °C, aby se umožnil připojení fágu k buňkám. Ke směsi třepané 2 hodiny při 37 °C se přidá asi 500 μΐ LBM média a poté dalších 200 μΐ hostitelských buněk. Vzniklá směs se inkubuje dalších 15 minut při 37 °C. Přidá se vrchní agar (8 ml 0,75% LBM agarosy o 48 °C), načež se směs nanese na misky a nechá růst přes noc při 37 °C.

-7CZ 296544 B6

Poté se ke každé misce přidá 12 ml zřeďovacího roztoku lambda (lOmM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM síran hořečnatý) a miskami se mírně kývá po dobu 2 hodin. Zřeďovací roztok se odstraní a 10 minut centrifuguje při 4000 x g ve stolní centrifuze. K supernatantu se přidá vždy 1 μΐ RNasy A o koncentraci 1 mg/ml a DNasy I o koncentraci 1 mg/ml. Vzniklá směs se inkubuje 15 minut při 37 °C a přidá se k ní stejný objem srážecího pufru (20% polyethylenglykol 8000, 2M chlorid sodný, 20mM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM síran hořečnatý) a výsledná směs se 1 hodinu inkubuje na ledu a poté 20 minut centrifuguje při 8000 x g. Supematant se odstraní, peleta se 10 minut suší na vzduchu při teplotě místnosti, resuspenduje v 500 μΐ TE, krátce centrifuguje, aby se odstranily částice a supematant se převede do čisté l,65ml zkumavky epitube. Do zkumavky se přidá asi 2,5μ 20% SDS (smě se 5 minut inkubuje při 65 °C) a přidá se kní 2,5 μΐ proteinasy K o koncentraci 10 mg/ml (inkubace 1 hodinu při 65 °C) a 10 μΐ 5M chloridu sodného. Směs se extrahuje jednou stejným objemem směsi fenolu a chloroformu a jednou stejným objemem chloroformu. Po přídavku stejného objemu isopropylalkoholu a následné tříhodinové inkubaci při -70 °C se směs 15 minut centrifuguje v epifuze při nejvyšší rychlosti. Získaná peleta se promyje 70% ethanolem vysuší na vzduchu a resuspenduje ve 100 μΐ TE.

Příklad 2

Subklonování regulačního úseku EF-la

Za účelem stanovení velikosti insertu DNA EF-la se fágová DNA připravená způsobem popsaným v příkladu 1 štěpí Notl a výsledné restrikční fragmenty se rozdělí na 0,6% IX TAE agarosovém gelu. Kromě předpokládaných lemujících fragmentů lambda o délce 19 kb a 10 kb, klony 2.12 a 2.17 vykazují identické profily štěpení s pásy o 11 kb a 4,5 kb. Rovněž klony 7,44 a 40,24 vykazují profily štěpení shodné s pásy insertu o 12 kb a 7 kb, což spolu s údaji o štěpení klonů 2.12 a 2.17, dokazuje přítomnost vnitřního restrikčního místa Notl a v DNA EF-la. Fragmenty insertu z klonů 2.12 a 7.44 subklonují následujícím postupem.

Fágová DNA (60 μΐ) připravená způsobem popsaným v příkladu 1 se štěpí Notl a štěpená DNA se vysráží přídavkem 20 μΐ 3M octanu sodného a 400 μΐ 100% ethanolu. Vysrážená DNA se shromáždí centrifugám', promyje ve 200 μΐ 70% ethanolu, suší 15 minut na vzduchu a resuspenduje ve 20 μΐ TE. Suspenze se 10 minut zahřívá na 65 °C a přidají se k ní 2 μΐ pufru pro elektroforézu. DNA se rozdělí elektroforézou na agarosovém gelu a pásy o 4,5 kb, 7 kb, 11 kg a 12 kb se odříznou ve formě agarosových řezů. Z každého agarosového řezu se za použití soupravy pro extrakci QIAGEN QIAquick podle pokynů výrobce extrahuje DNA. Čistota pásů a koncentrace se ověří oddělením 5μ1 alikvotu z každého izolovaného fragmentu na 0,6% IX TAE agarosovém gelu.

Jednotlivé fragmenty se odděleně ligují k pBluescriptSW⁺ štěpenému Notl. Při ligacích 11 a 12kb fragmentů se před zavedením insertu fragmentu linearizovaný vektor ošetří telecí alkalickou fosfatasou. 2 μΐ každého ligátu se použije pro elektroporaci 40 μΐ elektrokompetentních buněk XL-1 Blue. Transformované buňky se nanesou na misky s LBM/carb agarosou se 40 μΐ 5% X-gal v dimethylformamidu (DMF) a 20 μΐ 0,lM IPTG na misku. Buňky se inkubují přes noc při 37 °C a ráno ochladí na 4 °C, aby se zvýšila intenzita modré barvy.

Při druhém výběru se bílé kolonie naproužkují na misky s agarosou LBM/carb obsahující X-gal a IPTG výše popsaným způsobem a kolonie, ktěréjsou následujícího dne bílé, se nechají růst ve 3 ml LBM/carb přes noc při 37 °C. Plasmidová DNA z bílých kolonií pěstovaných přes noc se připraví za použití WIZARD Plus Minipreps DNA Purification Systém (Promega, Madison, WI, USA) podle protokolu navrženého výrobcem.

-8CZ 296544 B6

Restrikční analýza izolované plasmidové DNA ukáže, že 4,5kb, 7kb a 12kb fragment se úspěšně ligoval k vektoru pBluescript SW⁺ a výsledné plasmidy se označí jako pSK/EF. 1.4.5, PSK/EF1.7 apSK/EF1.12.

Každý z plasmidů se připraví za použití soupravy QIAGEN midi prep kit podle protokolu navrženého výrobcem. PCR se podrobí každý z nových vektorů, vytitruje se templátová DNA a použije se primerů kódující oblasti (SEQ ID NO: 4 až 11, jejichž se používá v párech způsobem popsaným výše pro selekci pseudogenů postrádajících jeden nebo větší počet různých intronů). Titrace se provádí poté co se při vysokých koncentracích zjistí, že všechny tři fragmenty obsahují úplnou oblast pro EF-Ια, což naznačuje možnou křížovou kontaminaci tří plasmidových přípravků. Při titraci se PCR provádí v reakční směsi obsahující 2,5 μΐ templátové DNA o koncentraci 0,001, 0,01, 0,1, 1 nebo 10 ng/μΐ a zahrnující 2,5 μΐ 10X PCR pufru (Perkin Elmer), 2,0 μΐ 2mM směsi dNTP, 1,5 μΐ 25mM chloridu hořečnatého, 0,125 μΐ Taq polymerasy (Perkin Elmer) a 11,4 μΐ destilované vody. Amplifikace se provádí za následujících podmínek: 4 minuty při 94 °C a poté 30 cyklů, z nichž každý zahrnuje 1 minutu při 90 °C, 2 minuty při 50 °C a 4 minuty při 72 °C. Výsledky ukazují, že úplná oblast pro EF-Ια je umístěna v 4,5kb a 7kb fragmentu.

Pro každý insert se za použití soupravy Stratagene FLASH Nonradioactive Gene Mapping Kit určené pro použití s vektorem Lambda FIX II^(R) sestrojí restrikční mapa. Namísto fágové DNA se však použije plasmidové DNA vyštěpené Notl z vektorů pSK výše popsaným způsobem. Pro sestrojení mapy se v podstatě použije protokolu navrženého výrobcem. Tento postup lze stručně popsán takto: plasmidy se sekvenují za použití primeru M13 (SEQ ID NO: 12) a reverzního primeru Ml3 (SEQ ID NO: 13) (komplementárního k oblastem vmnohočetné klonovací oblasti pBluescript SW⁺), aby se lokalizovaly sekvence primerů T3 (SEQ ID NO: 14) a T7 (SEQ ID NO: 15) vnitřních vzhledem k místu Notl pro každý insert.

M13	GTAAAACGACGGCCAGT	(SEQ ID NO: 12)
Μ13rev	GGAAACAGCTATGACCATG	(SEQ ID NO: 13)
T3	AATTAACCCTCACTAAAGGG	(SEQ ID NO: 14)
T7	GTTAAT ACG ACTC ACTAT AG GGC	(SEQ ID NO: 15)

Primerů T7 a T3 se použije jako sond pro protokol sestavení genové mapy. Jelikož se ukázalo, že insert EF-Ια obsahuje vnitřní místo Notl, předpokládá se, že páry fragmentů (4,5kb/llkb a 7kb/12kb) zahrnují jednu nebo druhou sekvenci primerů, a tedy se stanovilo, že 4,5 a 12kb insert obsahuje sekvenci primeru T7, zatímco 7kb insert má sekvenci T3.

4,5 a 7kb inserty obsahující oblast pro EF-Ια se vyštěpí z vektoru štěpením Notl. Štěpená DNA se oddělí na agarosovém gelu a oddělené fragmenty se z gelu odříznou. Z každého agarosového řezu se za použití soupravy pro extrakci QIAGEN QIAquick podle pokynů výrobce izoluje DNA. Mapování se provádí za použití sedmi různých enzymů při částečném restrikčním štěpení. Reakční produkty se rozdělí na agarosovém gelu, DNA se převede na nylonovou membránu DuralonUV a zkouší za požití oligonukleotidů T3 a T7 jako sondy. Stanoví se velikost pásů a sestrojí se restrikční mapy.

Plasmid pSK/EF 1.7 se sekvenuje s vnitřními primery původně zkonstruovanými pro PCR prohledávání (SEQ ID NO: 4 až 11 (dříve popsané primery 95-136 až 95-143)), čímž se ověří, že sekvencí genu je sekvence dříve identifikovaného proteinu. Stanoví se orientace kódující oblasti a sestrojí se další primery, které umožňují sekvenování k vnitřnímu místu Notl. Stanoví se sekvence celé kódující oblasti, která se poté porovná s předpokládanou sekvencí cDNA popsanou v Hayashi et al. (viz výše). Analýza sekvence potvrdí, že izoIovanáDNA skutečně kóduje stejnou sekvenci EF-Ια, jako DNA popsaná Hayashim (viz výše). Kromě toho je oblast prvního exonu identická s dříve publikovanou oblastí sekvence křeččí cDNA EF-Ια u 5' konce (Hayashi,

-9CZ 296544 B6 viz výše) a bylo identifikováno sedm intronů, z čehož je zřejmé, že struktura se podobá struktuře známé pro lidský homolog.

Sekvence a restrikční mapa získaná ze 7kb fragmentu ukazuje, že část 5' lemujícího intronů a promotor jsou umístěny ve 12kb fragmentu od 5' do vnitřního místa Notl. Z 12kb insertu se vyštěpí Spel/Notl 3kb fragment od 5' do vnitřního místa Notl a subklonuje do pBluescriptSK⁺ předem štěpeného stejnými enzymy. Výsledný plasmid se označí jako pSK/EF1.3. 3kb fragment se mapuje výše popsaným způsobem za použití KpnI a Clal, čímž se potvrdí restrikční místa a sekvenuje za použití soupravy Erase-a-Base (Promega, Madison, WI, USA) za použití Clal a KpnI míst pro vytvoření prodloužení 5' a 3'. Sekvenční analýza ukáže oblasti obsahující promotor, TATA box a 0,9kb intron v 5' netranslatované lemující oblasti o stejné délce jako má první intron v lidském genu [Uetsuki, 1989, viz výše]. Sekvence CHEF1 promotoru a 5' intronů je uvedena v SEQ ID NO: 1, přičemž intron zahrnuje nukleotidy 2699 až 3641.

Příklad 3

Charakterizace regulační DNA CHEF

Sekvence před ATG start kodonem (včetně) křeččího genu EF-la je popsána v SEQ ID NO: 1. Většina identifikovaných vazebných míst transkripčního faktoru se pravděpodobně vyskytuje od 3' do (protisměrně) Sací místa umístěného 1,56 kb od 5' do iniciačního ATG kodonu genu EFla. Každý z expresních vektorů obsahuje sekvence CHEF1 popsané dále, avšak obsahuje také 2 kb CHEF1 sekvence od 5' k místu Sací.

Sekvenování ukáže přítomnost dokonale konsensuálního TATA boxu umístěného asi 1 kb od 5' směrem k iniciačnímu ATG start kodonu a oblast mezi protisměrně umístěním místem Sací a TATA boxem obsahuje řadu možných vazebných míst pro transkripční faktor [Boulikas, Crit. Rev. Euk. Gene Exp. 4: 117 až 321 (1994)], jako jsou míst Spi (SEQ ID NO: 16 nebo 17), místa ATF (SEQ ID NO: 18) a místa NF-1 (SEQ ID NO: 19).

GGCGGG

SEQ ID NO: 16

GGGCGG

SEQ ID NO: 17

SEQ ID NO: 18

TGACGY(C/A)R

TTGGCN₅.₆(T/G)CCR SEQ ID NO: 19

Podobně jako u lidského genu EF-la [Uetsuki et al., viz výšea se zde vyskytuje 943bp intron v 5' netranslatované oblasti (UTK) křeččího genu EF-la, což je zřejmé z umístění sestřihů donorní a akceptorní sekvence. Avšak za použití analytického programu Geneworks DNA bylo zjištěno, že sekvence intronů v 5' UTR je pouze ze 62 % identická se sekvencí v lidském genu. Intron 5' zahrnuje řadu možných vazebných míst pro transkripční faktory, který zhruba odpovídá počtu vazebných míst mezi místem Sací a TATA boxem, což ukazuje, že intron 5' byl mohl být důležitý pro optimální transkripci řízenou promotorem EF-la.

Za použití analytického programu Geneworks DNA bylo zjištěno, že sekvence CHEF1 od restrikčního místa Sací (v protisměru) až do (ale ne včetně) intronů 5' (po směru) je ze 64 % shodná se sekvencí lidského EF-la. Porovnání umístění vazebných míst transkripčního faktoru Apl lidské a křeččí regulační sekvence je uvedeno v tabulce 1. Úplná sekvence lidského genu EF-la [Uetsuki et al., viz výše] je uvedena v SEQ ID NO: 29.

-10CZ 296544 B6

Tabulka 1

Vzdálenost míst Spi od TATA boxu

Křeček Poloha nukleotidu -424

-304 -183 -171

-151

-135 -26

156

168

257

261

425

495

589

594

688

Člověk

Poloha nukleotidu

-335

-220

-208

432

476

573

581

690

Příklad 4

Konstrukce expresních plasmidů

Četné plasmidy, jichž se používá v následujících příkladech, byly získány dále popsanými postupy·

Plasmid pSV2-dhfr (přírůstkové číslo ATCC 37146) se rozštěpí SphI/BamHI a l,8kb fragment kódující dihydrofolát reduktasu (DHFR) se přečistí (fragment 1). Fragment kódující DHFR také obsahuje sekvenci promotoru/operátoru SV40 umístěnou směrem k 5' a polyadenylační sekvenci umístěnou směrem 3' vzhledem kdhfr genu. Plasmid pSL1190 (Pharmacia) se rozštěpí HindlII, posunuté konce se doplní Klenowem a tupě zakončená DNA se znovu liguje, aby se eliminovalo místo HindlII, za vzniku plasmidů pSLl 190H, který se poté štěpí SphI/BamHI a 3,4kb fragment se přečistí (fragment 2). l,8kb fragment pSV2-dhfr (fragment 1) se liguje k 3,4kb fragmentu pSLl 190H (fragmentu 2), čímž se získá plasmid pSLl 190H-dhfr.

Plasmid pSLl 190H-DHFR se modifikuje následujícím postupem, aby se z něj odstranilo několik restrikčních míst. Plasmid se nejprve štěpí Xbal/Nhel (čímž se získají komplementární posunuté konce) a lineární plasmid se znovu liguje, čímž se odstraní obě místa Xbal a Nhel. Při druhém postupu se pSL1190H-dhfr štěpí HindlII, posunuté konce se doplní Klenovovým fragmentem a lineární plasmid se znovu liguje, čímž se eliminuje HindlII místo. Při třetím postupu se pSL1990H-dhfr se štěpí BglII, posunuté konce se doplní Klenowem a lineární plasmid se znovu liguje, čímž se odstraní místo BglII. Výsledkem těchto tří stupňů je plasmid pSL1190Hdhfr/NXHB, z něhož byla odstraněna místa Xbal, Nhel, HindlII a BglII. Plasmid pSL1190Hdhfr/NXHB se štěpí ExoRI/BamHI, insertuje se do něj linker NPB1/NPB2 (získaný anelací oligonukleotidů NPB1 a NPB2 [SEQ ID NO: 20 a 21]) za vzniku plasmidů pSL/dhfr/Notl, který má jedinečné restrikční místo Notl.

- 11 CZ 296544 B6

NPB1 GATCGCGGCCGCGTTTAAACGGATCC (SEQ ID NO: 20)

NPB2 AATTGGATCCGTTTAAACGCGGCCGC (SEQ ID NO: 21)

Tento plasmid pSL/dhfr/Notl se štěpí Asp718/BamHI a 1,8kb fragment kódující DHFR se přečistí (fragment 3). Plasmid pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA, USA) se štěpí Asp718/BglII, čímž se odstraní promotor CMV a polyadenylační DNA hovězího růstového hormonu (BGH) a 3,7kb fragment se přečistí (fragment 4). 1,8kb fragment pSL/dhfr/Notl kódující DHFE obsahující sekvenci promotoru/operátoru SV40 a polyadenylační sekvenci (fragment 3) se liguje k 3,7kb fragmentu pRc/CMV (fragmentu 4) za vzniku plasmidu pRc/DHFR/notl.

Plasmid pRc/CMV se štěpí Asp718/Xbal a 0,8kb fragment kódující polyadenylační DNA BGH se přečistí (fragmentu 5). Plasmid pRc/DHFR/Notl se rozštěpí BamHI/Asp718 a 4kb fragment obsahující sekvence DHFR, promotoru/operátoru SV40 a polyadenylační sekvenci se přečistí (fragment 6). Plasmid pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) se štěpí BglII/SacI a 0,7kb fragment kódující promotor CMV se přečistí (fragment 7). 0,8kb fragment pRc/CMV (fragment 5), 4kb fragment pRc/DHFR/Notl (fragment 6), 0,7kb fragment pCEP4 (fragment 7) a fragment syntetického adaptoru Sacl/Xbal se spojí čtyřcestnou ligací, čímž se získá plasmid pDCl. Adaptor se vytvoří anelací oligonukleotidů SXP1 a SXP2.

SXP1 (SEQ ID NO: 22) '-CGTTTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTC CTCTAAAGAAGCCCCAAGCTTGATATCTGCAGAATTCT-3'

SXP (SEQ ID NO: 23)

5'-CTAGAGAATTCTGCAGATATCAAGCTTGGGGCTTCTTTAGAG GAGGAATGTTGTTATGTAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCT-3'

Plasmid pDCl tedy obsahuje promotor CMV, oblast polylinkeru, polyadenylační místo z BGH a gen dhfr řízený promotorem SV40 a sekvencí SV40 sestřihu/polyadenylačního místa.

Plasmid pDCl se štěpí Xhol a izoluje se 4,5kb fragment, který neobsahuje promotor CMV a polyadenylační DNA BHG, který se liguje k plasmidu pDCil. Plasmid pDCil se poté štěpí BAmHi/Xhol a 4,5kb fragment se přečistí (fragment 8). 4,5kb fragment pDCiL (fragment 8) se liguje k PCR fragmentu štěpenému BamHI/SalI kódujícímu částečnou sekvenci promotoru CMV získanou ze použití primerů 96-13 a 96-14 (plasmid pDCl, jako templát), čímž se získá plasmid pDCi2.

Primer 96-13 (SEQ ID NO: 24) '-AGITCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCC GGACGGGATCTATACATTGAATCAATATTGGCA-3'

Primer 96-14 (SEQ ID NO: 25)

ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT

Plasmid pDCi2 se štěpí Asp718/Spel a 4,2kb fragment kódující DHFR obsahující sekvenci promotoru/operátoru SV40 a polyadenylační sekvenci se purifíkuje (fragment 9) a pDCl se štěpí Asp718/Spel a l,5kb fragment obsahující částečnou DNA promotoru CMV sBGH polyadenylačními signály se purifíkuje (fragment 10). 4,2kb fragment pDCi2 (fragment 9) se liguje k l,5kb

-12CZ 296544 B6 fragmentu pDCl (fragmentu 10), čímž se získá plasmid pCD31. Plasmid pDC31 se od pDCl liší tím, že obsahuje několik nových restrikčních míst, jako Smál a AscI u 5' konce promotoru CMV, které byly vytvořeny. Plasmid pDC31 se štěpí Notl, posunutá DNA se otupí za použití polymerasy T4 a plasmid se znovu liguje, aby se vyloučilo místo Notl, čímž se plasmid pCD36. Plasmid pCD36 je stejný jako pDC31 s výjimkou místa Notl, které bylo zničeno.

Plasmid pDC36 se štěpí Apal/BamHI, posunuté konce se doplní a plasmid se znovu liguje za vzniku pDC38. pDC38 je stejný jako pDC36, až na fragment Apal/BamHI obsahující polyadenylační sekvenci hovězího růstového hormonu, která zněj byla odstraněna. Plasmid pDC38 se štěpí Smal/HindlII a 4,6kb fragment, který neobsahuje DNA promotor CMV, se purifíkuje (fragment 11).

Plasmid pSK/EF1.3 se štěpí EcoRV/Notl/PvuI a 2,9kb fragment kódující sekvenci promotoru CHEF1 a protisměrnou sekvenci DNA se purifíkuje (fragment 12). Bluescript SW⁺II (pSK⁺) se štěpí Notl a 2,9kb fragment se purifíkuje (fragment 13). 7kb Notl fragment z fágu lambda 7.4 se liguje k 2,9 pSK⁺ fragmentu (fragmentu 13), čímž se získá plasmid pSK/EFl .7.

Plasmid pSK⁺ se štěpí HindlII/Notl a 2,9kb fragmentu se purifíkuje (fragment 14). Plasmid pSK/EF1.7 se štěpí Notl/Ncol a 620bp fragment kódující část 5' netranslatovaného intronu CHEF1 se purifíkuje (fragment 15). 123bp PCR fragment štěpený HindlII/NcoI kódující zbývající 5' intron vytvořený za použití primerů 96-36 a 96-45 a pSK/EFl. 12 jako templátu se přečistí (fragment 16).

Primer 96-36 (SEQ ID NO: 26)

GGCTTAGCTCCGAGGAGGG

Primer 96-45 (SEQ ID NO: 27)

CGTGACAAGCTTGGnTTCACAACAC

2,9kb fragment pSK⁺ (fragment 14), 620bp fragment pSk/EFl (fragment 15) a 123bp fragment HindlII/NcoI (fragment 16) se ligují, čímž se získá plasmid pSK/5'EF-l obsahující úplnou sekvenci 5' intronu CHEF1.

Plasmid pSK/5'EF-l se štěpí HindlII/Notl a 0,7kb fragment kódující 5' intron se purifíkuje (fragment 17). 4,6kb fragment pDC38 neobsahující promotor CMV (fragment 11), 2,9kb fragment pSK/EF1.3 obsahující sekvenci promotoru CHEF1 a protisměrnou sekvenci (fragment 12) a 0,7kb pSK/5'EF-l fragment kódující úplný 5' intron (fragment 17) se spojí při třícestné ligaci, čímž se získá plasmid pDEFl, který tedy obsahuje kompletní 5' regulační DNA CHEF1, gen dhfr a počátek replikace SV40, který umožní replikaci za vzniku velmi vysokého počtu kopií v buňkách transformovaných antigenem SV40 T.

Plasmid pDEFl se štěpí HindlII, posunuté konce se doplní a plasmid se štěpí Notl. 2,6kb fragment obsahující kromě částečné sekvence 5' intronu sekvenci promotoru CHEF1 a protisměrnou sekvenci DNA se purifíkuje (fragment 18). Plasmid pDEFl se štěpí Notl/Asp718 a l,3kb fragment kódující zbytek 5' intronu se purifíkuje (fragment 19). Plasmid pDC38 se štěpí Smal/Asp718 a 4kb fragment kódující DHFR obsahující sekvenci promotoru/operátoru SV40 a polyadenylační DNA se purifíkuje (fragment 20). 2,6kb fragment pDEFl (fragment 18), l,3kb fragment pDEFl (fragment 19) a 4kb fragment pDC38 (fragment 20) se spojí třícestnou ligaci, čímž se získá plasmid pDEF2. Plasmid pDEF2 v E. coli kmene XL-1 Blue byl uložen 4. března 1997 ve sbírce Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA pod přírůstkovým číslem 98343. Plasmid pDEF2 se od pDEFl liší vtom, že zněj

- 13 CZ 296544 B6 byl odstraněn 0,3kb fragment HindlII/Spel umístěný 2,3 kb proti směru od TATA boxu CHEF1 a že obsahuje pouze jedno místo HindlII umístěné v oblasti polylinkeru. pDEF2 se použije v případech, kdy gen, který má být exprimován, obsahuje vlastní polyadenylační místo.

Za účelem linearizace se plasmid pDEF2 štěpí Asp718/Xbal, přičemž se však také odstraní počátek replikačních sekvencí a 7,4kb fragment se purifikuje (fragment 21). Plasmid pDCl se štěpí Asp718/Xbal a 0,8kb fragment, který kromě polyadenylačních sekvencí BGH obsahuje záměnu počátku nebo replikační DNA, se purifikuje (fragment 22). 7,4kb fragment pDEF2 (fragment 21) a 0,8kb fragment pDC21 (fragment 22) se spojí za vzniku plasmidu pDEFlO, který se liší od pDEFl stejným způsobem jako pDEF2. Plasmid pDEFlO se od pDEF2 liší vtom, že v pDEFlO u 3' konci oblasti polylinkeru je polyadenylační místo z genu hovězího růstového hormonu.

Plasmid pDEFlO se štěpí HindlII/Xbal za účelem linearizace a 8,2kb fragment se purifikuje (fragment 23). Plasmid pDCl/MDC, plasmid kódující chemokin odvozený od chemokinu lidského makrofágu (MDC) se štěpí HindlII/Xbal, a 0,4kb fragment kódující MDC se purifikuje (fragmentu 24). Ligací 8,2kb fragmentu pDEFlO (fragmentu 23) s0,4kb fragmentem pDCl/MDC (fragmentem 24) se vyrobí plasmid pDEFl0/MDC.1.

Plasmid pRc/PMV se štěpí BamHI, posunuté konce se doplní Klenowem, plasmid se štěpí Asp718, a l,5kb fragment se purifikuje (fragment 25). Plasmid pDCl se štěpí Notl, posunuté konce se doplní Klenowem, plasmid se štěpí Asp718, a 3,9 kb fragment se purifikuje (fragment 26). l,5kb fragment pRc/CMV (fragment 25) se liguje s 3,9kb fragmentem pDCl (fragmentem 26), čímž se získá plasmid pNCX.

Plasmid pNCX se podobá pDCl s tou výminkou, že dhfr gen je nahrazen genem resistence vůči neomycinu (NeoR). Plasmid pNCX se štěpí Asp718/Pvul, a 2,lkb fragment se purifikuje (fragment 27). Plasmid pDEFl se štěpí Asp718/Pvul, a 5,9kb fragment se purifikuje (fragment 28). 2,lkb fragment pNXC (fragment 27) se liguje do 5,9kb fragmentu pDEFl (fragmentu 28) za vzniku plasmidu pNEFl. pNEFl se liší od pDEFl tím, že nese bakteriální gen resistence vůči neomycinu (NeoR), který kóduje resistenci vůči neomycinu nebo G418. Geny, které mají být insertovány do pNEFl jsou obecně fragmenty HindlII/Xbal, které se insertují po částečném štěpení HindlII nebo třícestné ligaci, jelikož plasmid obsahují dvě místa HindlII.

Příklad 5

Transfekce buněk DG44 a zkouška produktivity

Za účelem transfekce hostitelských buněk DG44 jediným plasmidem se obvykle linearizuje 50 až 100 pg plasmidu štěpením restrikčním enzymem Pvul nebo AscI. Při transfekci, kde se mají do buněk CHO zavádět dva plasmidy, se plasmidy ponechají neštěpené. Před transformaci se plasmidy vysrážejí ethanolem a promyjí dvakrát 70% ethanolem. DNA pelety se krátce suší a resuspendují ve 400 pl sterilní destilované vody. K resuspendované DNA se přidá 400 pl sterilního 2X HeBS (40mM HEPES-hydroxid sodný, pH 7,0; 274mM chlorid sodný; lOmM chlorid draselný; l,4mM hydrogenfosforečnan sodný; 12mM dextrosa). Netransfekované buňky DG44 se kultivují v médiu DMEM/F-12 doplněném hypoxanthinem (na konečnou koncentraci 0,0 lmM) a thymidinem (na konečnou koncentraci 0,0016mM), také označovaným jako HT. Za účelem pěstování netransfekovaných i transfekovaných buněk DG44 se k médiu přidá dialyzované FBS do konečné koncentrace 5 až 10% objemových. Buňky DG44 se připraví na transfekci tak, že se kultury nechají růst do asi 50% nebo nižší konfluence v 150cm² ošetřených polystyrénových nádobách pro tkáňovou kultivaci (Corning). Buňky se z plastu odstraní tak, že se nejprve odsaje médium a ulpělé buňky se promyjí jednou solným fosfátovým pufrovacím roztokem bez vápníku a hořčíku (CMF-PBS: 2,7mM chlorid draselný; l,5mM dihydrogenfosforečnan draselný; 137mM chlorid sodný a 8,lmM hydrogenfosforečnan sodný), přidají se knim 4 ml roztoku obsahujícího

- 14CZ 296544 B6

0,0125% ozářený trypsin (Worthington Biochemical Corporation) vCMF-PBS a inkubují se několik minut při 37 °C. K buňkám se přidá médium (4 ml) obsahující hovězí fetální sérum (FBS), stanoví se koncentrace buněk a alikvoty 2 x 10⁷ buněk se peletizují centrifugací. Každá buněčná peleta se promyje jednou v DMF-PBS a resuspenduje v 0,8 ml roztoku obsahujícího HeBS s požadovanou plasmidovou DNA. Resuspendované buňky se při teplotě místnosti převedou do 0,4cm kyvety Gene Pulser (Bio-Rad) a umístí do elektroporačního zařízení BioRad GenePulser. Buňky se elektroporují při teplotě místnosti s vybíjením kondenzátoru 290 V a 960 pF (puls 9 až 11,5 ms). Buňky se asi 10 minut ponechají v kyvetě a poté přidají do 10 ml DMEM/F-12 doplněného 5 až 10% dialyzovaným FBS a HT. Poté se stanoví úmrtnost (vyloučení trypanové modři), která je obvykle asi 50 %. Buňky se peletizují centrifugací, pelety se resuspendují ve 2 ml DMEM/F-12 doplněném 5 až 10% dialyzovaným FBS a HT („neselektivní médium“) a zaočkují na lOcm polystyrénové misky pro tkáňovou kultivaci. Po dvoudenním růstu se buňky, v tuto dobu obvykle konfluentní, z misek odstraní za použití trypsinu, jak je popsáno výše a v různých zředěních v DMEM/F-12 doplněném 5 až 10% dialyzovaným FBS a bez NT („selektivní médium“) zaočkují na lOcm² misky. Pět a devět dní poté k buňkám přidá selektivní médium. Po asi 2 týdnech se kolonie transfektantu (obvykle více než 1000 na každou transfekci) z misek odstraní za použití trypsinu, výše popsaným způsobem a po přídavku selektivního média se stanoví koncentrace buněk. Alespoň dva alikvoty 2 x 10⁶ buněk na každou transfekci se přidají k lOcm miskám obsahujícím 10 ml selektivního média. Buňky se nechají růst až do zániku, kdy je většina buněk odpojena od desky vlivem přeplnění. Supematant ze zaniklých kultur se zkouší metodou ELISA, čímž se stanoví průměrný titr produktu.

Příklad 6

Produkce rekombinantního proteinu za použití CHEF1

Buňky DG44 popsané v příkladu 5 se transfekují plasmidy nesoucími geny uvedenými v tabulce 3 operativně připojenými regulační DNA CHEF1. Bakteriální kmeny transformované plasmidy kódujícími každý z genů, kterých bylo použito při zkoušce, byly uloženy ve sbírce Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA. 1. dubna 1997 pod přírůstkovými čísly uvedenými v tabulce 2.

Tabulka 2

Přírůstková čísla plasmidů

Kódovaný gen

Těžkého řetězce protilátky ICM3

Lehkého řetězce protilátky ICM3

Těžkého řetězce protilátky 23F2G

Lehkého řetězce protilátky 23F2G

Chitinasy

Acetylhydrolasy aktivačního faktoru destiček (PAF-AH)

Chemokinu odvozeného od makrofágů (MDC)

Označení plasmidů	Přírůstkové číslo
pDEFl/ICM3H.2	98381
pNEFl/ICM3L.3	98382
pDEFl/F2GH.l	98383
pNEFl/F2GL.l	98384
pDEFl/CTN.l	98385
pDEF2/HPH.4	98386
pDEFlO/MDC.l	98387

- 15 CZ 296544 B6

Po selekci na transfektanty se spojené kolonie (více než 200) z každé transfekce odstraní z misek za použití trypsinu a stejný počet buněk z každé transfekce se nanese na misky a nechá růst do úhynu. Supernatanty se odstraní a exprese proteinu se stanovuje za použití metody ELISA nebo enzymového stanovení. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

Exprese proteinu za použití regulačních sekvencí CHEF1 a CMV

Transfekovaný gen	CMV	Titr proteinu	CHEF1
ICM3 H+L	554		1862
ICM3 H+L	288		2153
Hu23F2G H+L	337		1848
MDC	360		2100
PAF-AH	590		6574
Chitinasy-1	3200		2300
Chitinasy-2	8900		12850

S výjimkou první zkoušky na expresi chitinasy (v tabulce 3 označena jako chitinasa-1) se za použití regulační DNA CHEF1 dosáhne významně vyšších úrovní produkce proteinu, které jsou třikrát až jedenáctkrát vyšší, než při expresi s promotorem CMV.

Za účelem stanovení, zde se u snížené exprese, která byla zjištěna u zkoušky na chitinasu, jedná o abnormální nebo o opakovatelný výsledek, který by byl charakteristický a/nebo jedinečný pro chitinasu, se zkouška zopakuje, avšak za použití dvou oddělených transfekcí, na rozdíl od jediné transfekce použité při první zkoušce, jejímž výsledkem byl neobvykle nízký počet získaných transfektantů. Kromě toho se použije jiné zkoušky na aktivitu chitinasy, u niž se prokázalo, že je přesnější než postupy použité při první zkoušce.

Výsledkem transfekcí při druhé zkoušce je počet transfektantů, který je konsistentnější s předchozími výsledky dosaženými za použití plasmidu pDEF2, který při dalších zkouškách produkuje více než 150 % počtu transfektantů dosaženého s plasmidem CMV. Výsledky z druhého pokusu (označeného v tabulce 3 jako chitinasa-2) jsou vnitřně konsistentní, což zvyšuje důvěryhodnost výsledků, přestože zjištěné zvýšení exprese proteinu (asi l,4x), ve srovnání s expresí za použití promotoru CMV, je nižší než zvýšení zjištěná u ostatních proteinů zkoušených dříve.

Příklad 7

Produkce rekombinantního proteinu za použití regulační DNA CHEF o různých délkách

Zkonstruuje se expresní vektor obsahující dalších 8 kb 5' lemující DNA z genu EF-Ια a označí se jako pDEF14. Plasmid pDEF14 se od pDEF2 liší vtom, že pDEF14 obsahuje přibližně 11,7 kb DNA lemující 5' křeččího EF-Ια, zatímco pDEF2 obsahuje pouze 3,3 kb této sekvence. Plasmid pDEF14 také obsahuje 4 kb křeččí 3' lemující DNA přiléhající k 3' konci DHFR expresní kazety. Větší plasmid PDEF14 se zkonstruuje způsobem, který je stručně popsán dále.

ZpDEF2 se odstraní 2,6kb AscI/Notl fragment CHEF1 a na jeho místo se insertuje llkb AscI/Notl fragment CHEF1. Inserce delší sekvence nejprve vyžaduje modifikace Xbal místa umístěného 11,7 kb od 5' směrem k iniciačnímu ATG EF-Ια na místo AscI. Kromě toho se

-16CZ 296544 B6 insertuje 4kb NsiFSalI fragment s tupými konci, který je tvořen lemující sekvencí CHEF1 s začínající u NSII místa 118 párů bází od 3' ke stop kodonu EF-Ια, do Pmeí/Sall místa 3' k DHFR expresní kazetě umístěné na 3' konci oblasti polylinkeru, do jíž jsou insertovány geny, které mají být exprimovány. Úplná 3' DNA sekvence s počátkem při stop kodonu genu EF-Ια je uvedena ve SEQ ID NO: 28. Bakterie transformovaná tímto plasmidem byla uložena ve sbírce Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 9. dubna 1997 pod přírůstkovým číslem 98398. Výsledný plasmid pDEF14 obsahuje jedinečná Xbal a Notl místa spolu s mnohačetnými HindlII místa a inserce genu do tohoto plasmidu za účelem exprese tedy vyžaduje třícestnou ligaci. Tak například gen může být insertován do plasmidu ligací HindlII/Xbal fragmentu obsahujícího požadovaný gen se 737bp Notl/HindlII fragmentem z pDEF14 a 19,7kb Xbal/Notl fragmentem z pDEF14.

Exprese proteinu za použití tohoto vektoru se porovná s expresí za použití vektoru pDEF2, který obsahuje menší část 5' lemující oblasti EF-Ια. Při předchozích zkouškách byla DNA kódující těžký i lehký řetězec protilátky 23F2G subklonována do vektorů PDEF2 a pDEF14 a úrovně exprese stanovené po transfekci do buněk DG44 jsou popsány výše v příkladu 5. Geny kódující oba řetězce protilátky se ve vektorech umístí lineárně a exprese obou genů se pohání sekvencí CHEF1 v jednotlivých plasmidech. Kódující oblasti pro dva řetězce v každém plasmidu se rozdělí identickou 4,3kb DNA odvozenou z 3' netranslatované oblasti lidského IgG4.

Výsledky ukazují, že exprese 23F2G zvětší CHEF1 sekvence je vpDEF14 čtyřnásobně větší, než exprese protilátky s menší sekvence pDEF2. Tento výsledek je překvapující vzhledem k tomu, že většina identifikovatelných vazebných míst transkripčního faktoru pDEF14 je také v sekvenci DNA vpDEF2. Je tedy možné, že v DNA CHEF1 v plasmidu pDEF14 je umístěno jedno nebo více dalších a neidentifikovaných vazebných míst transkripčního faktoru nebo sekvencí zesilovačů. Jinak řečeno, větší DNA CHEF1 může poskytovat výhodu zvýšené transkripce díky určité vlastnosti 3' DNA sekvence.

Odborníkům v tomto oboru budou zcela jistě zřejmé četné modifikace vynálezu, jak je popsán a ilustrován v předcházejícím textu. Takové modifikace a změny nepředstavují únik z roztoku tohoto vynálezu, který je dán pouze patentovými nároky.

- 17CZ 296544 B6

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Allison, Daniel S.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Transkripční regulační DNA křeččího EF-la (iii) POČET SEKVENCÍ: 29 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Marshall, 0'Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) ULICE: 233 South Hacker Drive, 6300 Sears Tower (C) MĚSTO: Chicago (D) STÁT: Illinois (E) ZEMĚ: USA (F) ZIP: 60606 (v) POČÍTAČOVÉ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC compatible (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.30 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:

(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: KAREL ČERMÁK, AKP ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, NÁRODNÍ 32, 110 01 PRAHA 1 (C) ČÍSLO SPISU: 01-11-99-ČE (ÍX) TELEKOMUNIKAČNÍ SPOJENÍ:

(A) TELEFON: 312-474-6300 (B) TELEFAX: 312-474-0448 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 3678 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

- 18 CZ 296544 B6

ACTAGTTCCA AAGATGAATT ACTAACCAGT GTTTCCAAGG AAATAAATGA AAGCAGAGAG60

ATTAGTTCTA TTGCTAGTGT TTCATTTTCG TATATTTCTT ACAATTTCTC TTGTTACAAA120

TAGGCACTAG GGTATCAAGA TAATTTTAAC GACTGGCTGA GAACCCTAGA AAATCTCTGT180

GAAAAAGGGA TTTGTGAAAT GAGAGAGGGT AATGTGGCCA TTATAGAAAA GGCTTTTGTG240

TGCCTTGCAT GCATAGACCC TGTGTTTGAT CTCTTAACAC CCTCCTTGAC CAGAAAAAGC300

TTCTGTGGAT AGAAAATGAT TAGTTATATA TACTTTTAGG GAAACGTAGT TCTGGATTCT360

TTGGTTACAA TTAACAGAAT TAAGTGCAAA CAAAGCCAGA AACCTCCTGA TAAATGAGAA420

AACCTGCTTG TAGAAGGTTG TAAGGCTCTG TAATATAGGA ATTAGGAGAA AAGAAACCTG480

TGTGGTGGGG CACGTCTGTA ATCCCAGCAT TGGGAAGTAG AGGTAGAAGA TTAGAAATCA540

AAGGCCAGCC TCAGCAACAC AGTGAGTTTG AGGCCACCCT GAACTACATC AGGTTCTGTC600

TCCTTTCTTT TTTTTTTTTT TTTCTTTTCT TTTTTTGGTT TCTCTGTGTA GTTTTGGAGC660

CTATCCTGGC ACTAGCTCTG AAGAGCAGGC TGGCCTCGAA CTCAGAGATC AGCCAGCCTC720

TGCTGGGATT AAAGGTATGC ACCACCAACG CCCCAGGTTT TGTCTCAAAC AAACAAAAAT780

AACATCAGGA GGTGGTGAGA GGGCTCAGTG GTCACAGGCA TTCTCTGCAA AGCCTGACTC840

TGAGTTGGAT CCTTTAGAGC TACATGGTTG AGGGAAGAGA ACTGACTCCT GGAAGGTGTC900

CTCTGGTCCC CACACATAGC TATACACAGC ATGTGCATTC ACACACACTA AATAATGCTA960

TTTTTAAAAA AATTAAAAAC AACAACAGTT TGGGTTGTGA AAACTAGAAC TAGATAATAG1020

GTAAGAATCA AGTATCATGT AAATTTGCTT TCAACTCATC CCAAAATTTG TTTTATATTT1080

CAGTTTTTTT CCTTCCTAGC TTGACTGTGG AGTCTTGTCC GGAAGCAAAT AGTTCCTTTG1140

CAGATCCCAC ATGTGGACAC CGGACAGTAG GTCCTCAAAT GCTCCTTATT AGGTTGGTTC1200

AATAATATCA ATTGTTTGTT ACTAGGCAGT GATGTTGTAC ATCTGGAGGA GATCTCTTGA1260

GCCCATAATC AGGTTATTAG GAATAAATAC TCTAAGGCTA AAAATGTAGC TTAGTGATAA1320

GAGTGCTTGC CTGGTGTGCT GAGACCCTCG GTTCCATCTC CACAACCCCA TATTCCATTA1380

CAAAATACCT TTTCACCGTC CCTAGCATTA AGAAACAAAA CAACAAAGAA GTTTTTCTTT1440

CŤTCTGAGAT CCTGCCCGGA GAGGCATTTA AAACTGGCCA GGGCCAAAAA AAAAAAAAAA1500

AAAAGAAAAA AAAGAAAAGA AAACAGGCTA GGGCCGGCAT GGTGGCGCAC GCCTTTAATC1560

- 19CZ 296544 B6

CCAGCACGCA	GGAGGCAGAG	GCAGGGCGGA	TCTCTGTGAG	TTTGAGGTCA	GCCTGGTCTA	1620
CCTAGTGAGT	TTCAGGGCAC	CCAGGGCTAA	AGAGACTGTC	TCAAAAACAA	AACAGCCACA	1680
CAATCAGAAC	CACAGCAAAA	CGCAGTTATG	ATCCTTGGAA	CTGTAGGAAT	GACAAGCATT	1740
TAAATAATAG	GACGAGCCAT	TTTTGAGAAG	CTCTGATTTC	ACAAGTGTCA	GGGATGGGCT	1800
CTGGGCGAGT	AAGATTGCTA	ATGCTGGCCT	CTAAATGAGA	CCACGTGGAG	TTGATTAGAT	1860
TCTTTTCATG	TTCCTCGTGC	TCTATCAAAT	AACTGTACCC	AAATACACAC	ACACACACAC	1920
ACACACACAA	TGCGCGCACA	GACAAAATCC	TTTTTTAGCT	TAAGAAGCCC	AGAATCAGAA	1980
GTAAAGCTAA	CTGTGGGACT	TAAGTATTAT	TCTGAACGGA	ACTCCCAGGG	CGTGAAGCGC	2040
GCTTCAGGCT	TCCAGAGAAG	GAGCTGGCGC	TGGATGGAAT	GAACCAAGAG	GCCAGCACAG	2100
GGGCAGATCC	GTCGAGCTCT	CGGCCACCGA	GCTGAGCCCT	TAGGTTCTGG	GGCTGGGAAG	2160
GGTCCCTAGG	ATTGTGCACC	TCTCCCGCGG	GGGACAAGCA	GGGGATGGCG	GGGCTGACGT	2220
CGGGAGGTGG	CCTCCACGGG	AAGGGACACC	CGGATCTCGA	CACAGCCTTG	GCAGTGGAGT	2280
CAGGAAGGGT	AGGACAGATT	CTGGACGCCC	TCTTGGCCAG	TCCTCACCGC	CCCACCCCCG	2340
ATGGAGCCGA	GAGTAATTCA	TACAAAAGGA	GGGATCGCCT	TCGCCCCTGG	GAATCCCAGG	2400
GACCGTCGCT	AAATTCTGGC	CGGCCTCCCA	GCCCGGAACC	GCTGTGCCCG	CCCAGCGCGG	2460
CGGGAGGAGC	CTGCGCCTAG	GGCGGATCGC	GGGTCGGCGG	GAGAGCACAA	GCCCACAGTC	2520
CCCGGCGGTG	GGGGAGGGGC	GCGCTGAGCG	GGGGCCCGGG	AGCCAGCGCG	GGGCAAACTG	2580
GGAAAGTGGT	GTCGTGTGCT	GGCTCCGCCC	TCTTCCCGAG	GGTGGGGGAG	AACGGTATAA	2640
AAGTGCGGTA	GTCGCGTTGG	ACGTTCTTTT	TCGCAACGGG	TTTGCCGTCA	GAACGCAGGT	2700
GAGTGGCGGG	TGTGGCCTCC	GCGGGCCCGG	GCTCCCTCCT	TTGAGCGGGG	TCGGACCGCC	2760
GTGCGGGTGT	CGTCGGCCGG	GCTTCTCTGC	GAGCGTTCCC	GCCCTGGATG	GCGGGCTGTG	2820
CGGGAGGGCG	AGGGGGGGAG	GCCTGGCGGC	GGGCCCGGAG	CCTCGCCTCG	TGTCGGGCGT	2880
GAGGCCTAGC	GTGGCTTCCG	CCCCGCCGCG	TGCCACCGCG	GCCGCGCTTT	GCTGTCTGCC	2940
CGGCTGCCCT	CGATTGCCTG	CCCGCGGCCC	GGGCCAACAA	AGGGAGGGCG	TGGAGCTGGC	3000
TGGTAGGGAG	CCCCGTAGTC	CGCATGTCGG	GCAGGGAGAG	CGGCAGCAGT	CGGGGGGGGG	3060
ACCGGGCCCG	CCCGTCCCGC	AGCACATGTC	CGACGCCGCC	TGGACGGGTA	GCGGCCTGTG	3120

-20CZ 296544 B6

TCCTGATAAG GCGGCCGGGC GGTGGGTTTT AGATGCCGGG TTCAGGTGGC CCCGGGTCCC 3180 GGCCCGGTCT GGCCAGTACC CCGTAGTGGC TTAGCTCCGA GGAGGGCGAG CCCGCCCGCC 3240 CGGCACCAGT TGCGTGCGCG GAAAGATGGC CGCTCCCGGG CCCTGTAGCA AGGAGCTCAA 3300 AATGGAGGAC GCGGCAGCCC GGCGGAGCGG GGCGGGTGAG TCACCCACAC AAAGGAAGAG 3360 GGCCTTGCCC CTCGCCGGCC GCTGCTTCCT GTGACCCCGT GGTGTACCGG CCGCACTTCA 3420 GTCACCCCGG GCGCTCTTTC GGAGCACCGC TGGCCTCCGC TGGGGGAGGG GATCTGTCTA 3480 ATGGCGTTGG AGTTTGCTCA CATTTGGTGG GTGGAGACTG TAGCCAGGCC AGCCTGGCCA 3540 TGGAAGTAAT TCTTGGAATT TGCCCATTTT GAGTTTGGAG CGAAGCTGAT TGACAAAGCT 3600 GCTTAGCCGT TCAAAGGTAT TCTTCGAACT TTTTTTTTAA GGTGTTGTGA AAACCACCGC 3660 TAATTCAAAT CCAACATG 3678 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

AGGCACAGTC GAGGCTGATC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

TTCCAGGGTC AAGGAAGGCA 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází

-21 CZ 296544 B6 (B) TYP: nukleové kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY! DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

GCCACCTGAT CTACAAATGT 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleové kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

GAGATACCAG CCTCAAATTC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleové kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

ATGTGACCAT CATTGATGCC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleové kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

GTGACTTTCC ATCCCTTGAA 20

-22CZ 296544 B6 (2} ÚDAJE K SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

GTTGGAATGG TGACAACATG 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

CAGGTTTTAA AACACCAGTC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

AATGACCCAC CAATGGAAGC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA

-23 CZ 296544 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

ACAGCAACTG TCTGCCTCAT 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE; jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

GGAAACAGCT ATGACCATG 19 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

AATTAACCCT CACTAAAGGG 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová

-24CZ 296544 B6 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

GTTAATACGA CTCACTATAG GGC 23 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

GGCGGG 6 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (0) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

GGGCGG 6 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

TGACGYMR 8 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:19:

-25CZ 296544 B6 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

TGGCNNNNNKCCR 13 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO-.20:

GATCGCGGCC GCGTTTAAAC GGATCC 26 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE; jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

AATTGGATCC GTTTAAACGC GGCCGC 26 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 77 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

-26CZ 296544 B6

CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CTACATAACA ACATTCCTCC TCTAAAGAAG CCCCAAGCTT 60

GATATCTGCA GAATTCT 77 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:23.’ (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23;

CTAGAGAATT CTGCAGATAT CAAGCTTGGG GCTTCTTTAG AGGAGGAATG TTGTTATGTA 60

GATCTGACGG TTCACTAAAC GAGCT 85 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 66 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

AGTTCAGTCG ACGGCGCGCC AACCCGGGAA TCCGGACGGG ATCTATACAT TGAATCAATA 60

TTGGCA 66 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:

ATGTCAGGAT CCACGCGGAA CTCCATATAT GGGCTATGAA CT 42 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:26:

-27CZ 296544 B6 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

GGCTTAGCTC CGAGGAGGG (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27;

CGTGACAAGC TTGGTTTTCA CAACAC (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4263 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28;

TGAATATTAC	CCCTAACACC TGCCACCCCA GTCTTAATCA GTGGTGGAAG AACGGTCTCA	60
GAACTGTTTG	TCTCAATTGG CCATTTAAGT TTAATAGTGA AAGACTGGTT AATGATAACA	120
ATGCATCGGA	AAACCTTCAG GAGGAAAGGA GAATGTTTTG TGGAACATTT TTGTGTGTGT	180
GGCAGTTTTA	AGTTATTAGT TTTCAAAATC AGTACTTTTT AATGGAAACA ACTTGACCAA	240
AAATCTGTCA	CAGAATTTTG AGACCCATTA AAATACAAGT TTAATGAGAA GTCTGTCTCT	300
GTTAATGCTG	AAGTCATTAC TAAGTGCTTA GCTTAGCAAG GTATGTGGAT GCCCATTTGT	360
GTTCCAAGGG	ATTGGACTGT TCATCAGGAC CCAGAGCTGA GTTTCAAGGG CTCAAGAGAT	420

-28CZ 296544 B6

GGCTTATTAC	CTGTGGGTGT	CTTGAAGGTT	CTGGTTGGGA	CAAATTAGGA	ATGTTTTTGG	480
CAGACATGGT	GACTACCTTC	ATCTGGGTGA	GTTCAGTTGA	TTTGTCTTGA	GCCTTTGGGG	540
TTTACACAAG	TAAATGACAT	CATACAGTTA	GTGTATTGTT	AGTGAATATT	AATATATGAG	600
GCAGGCTTTG	CTCTAGCAAT	TTTAGAACTA	GTTTTCAGGA	AAGGGTTCAT	CTTGTGCATT	660
GGATGTTTGA	TTCTATCACT	TAGAGTTTAA	ACTGAAAGTG	CTCAAGAGGT	TTTATTTAGG	720
CTGGGATATA	AATAAGCCTT	TCTGTAGCTT	GTAATGGTAT	CAGGAATTTA	AAAGGCCATC	780
TGGGGCACAA	AGATTAAGCA	GAAAAGGTAG	AAGGTGAGAT	TGGGGGACTT	TGAGTACTTC	840
ACACACTTTA	ATGTGTGAGT	GCTTTAGTGC	ATATAGTACA	ACTGCCAGAT	AAGGGCATCC	900
ACATCTGATT	GTTTGGAAGG	CACCTTGTGG	TTTCTGGGAA	TTCAGAATTG	GGAGAAAAAT	960
GCTCCCAACC	GCTGAAGCCC	TTGGTAATCT	GCAGGGTGTT	TATTTAGCAG	GAGATAAGGA	1020
CAAAAAGTTA	TAGTGTGGAG	TTGGTTGAGT	TGGTAGATGT	CATTACAACA	GGTGGTCTTA	1080
AATTGGGTTA	GGAGTCACTT	TGAAATACCT	GGGCCATAAG	CAAAGTGGCA	TTTTCACCTT	1140
TCAGGAGAAA	CTGGTACACT	TATCCATTCT	ATAGTGCATG	CTTGTTCAAT	TGGGCTGATG	1200
ACTAAACCGG	TGACTAAAGG	TTTGTCAGTA	TAAATGGATG	GGTTGTAGGC	AGACGGTGAG	1260
GAATTACTAT	ACCTGCAAGG	AGTCATTGCC	TGATCTGCCT	GGAAAGGGGC	AGGATTGAGT	1320
CTCAGAACGT	GTACACCATA	GGATATGGAA	AAATTTGTCA	CGCCTAGCAT	TCAACTTAGT	1380
GGTGTAGCGC	CACCTACTGG	CACTTTAAAA GCTTAGCATA	GAGGAGCATG	TGTGTTAGGA	1440
GCTCGGATGG	GATCCAGGGC	CTCAAGGTTT	GCATGTAAAT	AAAAGCCCTT	TACCAAATTA	1500
ACTACATACC	AGCATACATC	AGTCCTTTAG	TGTTGAAAAA	CAGAAGGGAA	AGCTAATATA	1560
TATAGTGCTT	GCTTTATTTA	AGTCTAGCTG	ATTACGTGTT	TGGTTGCCAG	TGTGACTAGT	1620
CTGGAGTTGÁ	ATTTGTCCTC	AGACACGTAA	AATGGAATTT	GGGATTCACA	ACACTCTAGT	1680
ATGAGGGACC	TAATGGCCTG	TACCAGGCAC	AAACGTGTCT	ATAAACTACA	CAAAACGAAG	1740
GAATTTACAG	GAATTAGGAA	GGTATTCTTA	ACATTAAAAC	ATTATGGGCA	TTTTAAAAAA	1800
AGCTTTGACA	GGATTTCTTT	GTCATGGCTG	TCCTGGAGCT	AGTTGTGTAG	ACCAGGCTGG	1860
GCTGAAATCT	TGTCTGCCTG	CCTGGCTTGG	ACACTTTTTT	ATTATGTATA	CAACATTCTG	1920
CTTCCATGTA	TATCTGCACA	TTAGAAGACG	GCACCAGATC	TCCTAATGGA	TGGTTGTGAG	1980

-29CZ 296544 B6

CCACCATGTG	GTTGCTGGGA	ATTGAACTCA	GGACCTCTGG	AAGAGCAGTG	CTCTTAACCT	2040
CTGAGCCATC	TCCAGCCCCA	GCTTGGGCAC	ATTTTTAATG	GCTGGGAAAT	CAAACCCCCT	2100
AGGCCTTCTG	TCAGTAATGA	AGGGCTTTTG	GCTACCGAGA	GTAGGATTTA	AGGTTATTCG	2160
GAGCTGCAGG	TCTGCCTCAG	TGCAGGTTTG	GGAGTCCAGC	ATCTTAGAAA	ATGCAGTGAA	2220
GCCAAGCTGA	GCTATATTTT	GTTTAAAAAA	AAAATAAGTG	GGTAAAGTGC	TGCTGAGCCT	2280
GATGACCAAG	CTGGGACACA	AGTAGAAGAA	CATAGGCCAA	TGCTCTATAT	TAAAAGCATG	2340
GGTCATTTTT	AATGCTCTTG	AGAAGGCTAT	GCCTACACTA	CTCTCAGCCA	CCGCAGCGTG	2400
TTTAAATTAA	ACTAGTTTGG	AAATTTTCTT	TGGGGGTAAG	CTATTTAACC	TAGTGCCTTG	2460
GCAGGTATAC	TACTGAACTC	TCCTCCTCAT	TCCTTTTTGT	TTTTTAAGAA	TTTCAGTCAG	2520
GCTCAGGCAG	CCCTTAAACT	TGTGATTAAG	CCTGAGAACA	GTTACGATTA	TGAGCCTATT	2580
AGTATACCGA	TCAATATGTG	AATTTTTTTG	GGATGGGGGT	CAGGCCTCCC	TGCCTCCCAA	2640
ATACTGGGAC	TAAAGGCTGC	ACCACCACAA	CCTGGCTCTT	GAAATACTTT	TCTACATTTT	2700
TTGGGGGGCA	TGGGTGGGAG	AGCAGGGTTT	CTCTGTATTA	GCCCTGGCTC	TCCTGGAACT	2760
CTGTAGACCA	GGCTATTCTT	GAGCTCAGAT	TAGCCTGTCT	CTGCCTCCTA	AATTCTGGGA	2820
TTAAAGGTGT	GTGCTACTGC	TGCCTGGCTA	CAAAGACATT	TTTTTTTTTC	TTAAATTTAA	2880
AAACAAAAGT	GGTTCTTTTA	GAAGGGTGGT	TGGTGTTGGC	ACATACTCCA	AGCACTCAGG	2940
TTTTGAGTTT	GTCCCAGGAA	TGAAGACTGC ATTACTGCCG	CCCCTCCCTG	GTAAGGGCTA	3000
CACAGAGAAA	TCCTATTTGG	AGCCTATCCT	GGTAACTCGC	TCTGTAGACC	AGGCTGGCCT	3060
CGAACTCAAG	AGAACCACCT	GCCTCTGAAT	GCTGGTATTA	AGGGCAGGCA	CCACCAACAC	3120
CCAGCCTAAA	AAATGTCTTT	TTTTTAAAGA	TTTTTTTTTT	TTTTTTTACA	GAATAAACAT	3180
TCTGTTTACA	ATATTCTGCT	TCTATGTATA	TCTGCACACT	AGAAGAGGGC	ACCCGATCTC	3240
ATAATGGATG	GTTGTGAGCC	ACCAAGTGGT	TGCTGGGAAT	TGAACTCAGA	ACCTCTGGAA	3300
GAGCAGTCAG	TGCTCTTAAC	CTCTGAGCCA	TCTCTCCAGC	CCCTAAAAAT	GGCTCTTGAG	3360
ATAGGGTCTC	AAGTAGTTTG	AGACTGAGTT	GGCTATATAA	ACAAGGCTGG	CACATAGCAC	3420
CATGTACAGC	TGGGTTTAGT	TTACATGGGG	TGTTTTTGTC	TCTGGAGGCA	GGAGGATCAT	3480
TTGAGCATAG	GGAGTTAATA	GTGAGGTCAT	GTTTTATCTA	CTCTTCTGAA	TTGAGAACTA	3540

-30CZ 296544 B6

AGCTGATGCA AAGCAAGTTT GACTGAAGAA GTCCAGTTTA TGAGAACAAG GGTGGAAACT3600

AATGTGTCAA AGATGGCCTT GCATGTGTTT TAGATGATGA CCCAGTCACT TGGGAATTAC3660

TGGATGTGTA AGACCTATAT CTTGACAGGA GTGAACAGTG TCTTATAGGT CCTATATGAA3720

AGAAATGAGA CATACCCATT TTGTTTCCCC TAAGAATTCA CTTTTCCTAA CCTGGTTCAT3780

GCTATTTAGG TTATTTTACT TGCAAATCCT AGGTGCTCCC TTACCCAGTA TTGCTTATGT3840

GGCACCAAAG TCACTCACTC CCATGATTTG CAAGTCTCTG GGAACTTCCA TGACAACCTA3900

GAATAGCAAC TCAAATACAT TTTCTCAGTA CCAATTTTGA AGAAAAAATA TTTTGCAAAA3960

TAGCTGTATG GATGGGTACT AAATAGTGAG GTTATCTCCA GAAGGCCTAT GAAGAATTAA4020

GGTTGAGTTC AGTTGAGTTC AGCAGCAAGT TTAAGGTTCA TCCATTTTTG TACAGTGTTT4080

TCCTATTACG GTAAGTGTTT TGCCTGCAGG AATATCTGTA CCACATGCTT GCCTGGTACC4140

TATATCGGCC AGAAGAGGGC TTTGGATCCT CTGGACTTGA ATTACAGATG GGTATTAGCC4200

ACCATTTAGG TGCTGGGAAT TGAAACCAAG TCCTCTGGAA GAAČAGCAAG TGATCGAGTC4260

GAC4263 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4695 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ ID NO:29:

CCCGGGCTGG GCTGAGACCC GCAGAGGAAG ACGCTCTAGG GATTTGTCCC GGACTAGCGA60

GATGGCAAGG CTGAGGACGG GAGGCTGATT GAGAGGCGAA GGTACACCCT AATCTCAATA120

CAACCTTTGG AGCTAAGCCA GCAATGGTAG AGGGAAGATT CTGCACGTCC CTTCCAGGCG180

GCCTCCCCGT CACCACCCCC CCCAACCCGC CCCGACCGGA GCTGAGAGTA ATTCATACAA240

AAGGACTCGC CCCTGCCTTG GGGAATCCCA GGGACCGTCG TTAAACTCCC ACTAACGTAG300

AACCCAGAGA TCGCTGCGTT CCCGCCCCCT CACCCGCCCG CTCTCGTCAT CACTGAGGTG360

-31 CZ 296544 B6

GAGAAGAGCA TGCGTGAGGC TCCGGTGCCC GTCAGTGGGC AGAGCGCACA TCGCCCACAG	420
TCCCCGAGAA GTTGGGGGGA GGGGTCGGCA ATTGAACCGG TGCCTAGAGA AGGTGGCGCG	480
GGGTAAACTG GGAAAGTGAT GTCGTGTACT GGCTCCGCCT TTTTCCCGAG GGTGGGGGAG	540
AACCGTATAT AAGTGCAGTA GTCGCCGTGA ACGTTCTTTT TCGCAACGGG TTTGCCGCCA	600
GAACACAGGT AAGTGCCGTG TGTGGTTCCC GCGGGCCTGG CCTCTTTACG GGTTATGGCC	660
CTTGCGTGCC TTGAATTACT TCCACGCCCC TGGCTGCAGT ACGTGATTCT TGATCCCGAG	720
CTTCGGGTTG GAAGTGGGTG GGAGAGTTCG AGGCCTTGCG CTTAAGGAGC CCCTTCGCCT	780
CGTGCTTGAG TTGAGGCCTG GCCTGGGCGC TGGGGCCGCC GCGTGCGAAT CTGGTGGCAC	840
CTTCGCGCCT GTCTCGCTGC TTTCGATAAG TCTCTAGCCA TTTAAAATTT TTGATGACCT	900
GCTGCGACGC TTTTTTTCTG GCAAGATAGT CTTGTAAATG CGGGCCAAGA TCTGCACACT	960
GGTATTTCGG TTTTTGGGGC CGCGGGCGGC GACGGGGCCC GTGCGTCCCA GCGCACATGT	1020
TCGGCGAGGC GGGGCCTGCG AGCGCGGCCA CCGAGAATCG GACGGGGGTA GTCTCAAGCT	1080
GGCCGGCCTG CTCTGGTGCC TGGCCTCGCG CCGCCGTGTA TCGCCCCGCC CTGGGCGGCA	1140
AGGCTGGCCC GGTCGGCACC AGTTGCGTGA GCGGAAAGAT GGCCGCTTCC CGGCCCTGCT	1200
GCAGGGAGCT CAAAATGGAG GACGCGGCGC TCGGGAGAGC GGGCGGGTGA GTCACCCACA	1260
CAAAGGAAAA GGGCCTTTCC GTCCTCAGCC GTCGCTTCAT GTGACTCCAC GGAGTACCGG	1320
GCGCCGTCCA GGCACCTCGA TTAGTTCTCG AGCTTTTGGA GTACGTCGTC TTTAGGTTGG	1380
GGGGAGGGGT TTTATGCGAT GGAGTTTCCC CACACTGAGT GGGTGGAGAC TGAAGTTAGG	1440
CCAGCTTGGC ACTTGATGTA ATTCTCCTTG GAATTTGCCC TTTTTGAGTT TGGATCTTGG	1500
TTCATTCTCA agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga	1560
AAACTACCCC TAAAAGCCAA AATGGGAAAG GAAAAGACTC ATATCAACAT TGTCGTCATT	1620
GGACACGTAG attcgggcaa gtccaccact actggccatc tgatctataa ATGCGGTGGC	1680
ATCGACAAAA GAACCATTGA AAAATTTGAG AAGGAGGCTG CTGAGGTATG TTTAATAGCA	1740
gaaagggaaa gatcaactaa aatgagtttt accagcagaa tcattaggtg atttccccag	1800
AACTAGTGAG TGGTTTAGAT CTGAATGCTA ATAGTTAAGA CCTTACTTAT GAAATAATTT	1860
TGCTTTTGGT gacttctgta ATCGTATTGC TAGTGAGTAG atttggatgt taatagttaa	1920

-32CZ 296544 B6

GATCCTACTT ATAAAAGTTT GATTTTTGGT TGCTTCTGTA ACCCAAAGTG ACCAAAATCA	1980
CTTTGGACTT GGAGTTGTAA AGTGGAAACT GCCAATTAAG GGCTGGGGAC AAGGAAATTG	2040
AAGCTGGAGT TTGTGTTTTA GTAACCAAGT AACGACTCTT AATCCTTACA GATGGGAAAG	2100
GGCTCCTTCA AGTATGCCTG GGTCTTGGAT AAACTGAAAG CTGAGCGTGA ACGTGGTATC	2160
ACCATTGATA TCTCCTTGTG GAAATTTGAG ACCAGCAAGT ACTATGTGAC TATCATTGAT	2220
GCCCCAGGAC ACAGAGACTT TATCAAAAAC ATGATTACAG GGACATCTCA GGTTGGGATT	2280
AATAATTCTA GGTTTCTTTA TCCCAAAAGG CTTGCTTTGT ACACTGGTTT TGTCATTTGG	2340
AGAGTTGACA GGGATATGTC TTTGCTTTCT TTAAAGGCTG ACTGTGCTGT CCTGATTGTT	2400
GCTGCTGGTG TTGGTGAATT TGAAGCTGGT ATCTCCAAGA ATGGGCAGAC CCGAGAGCAT	2460
GCCCTTCTGG CTTACACACT GGGTGTGAAA CAACTAATTG TCGGTGTTAA CAAAATGGAT	2520
TCCACTGAGC CACCCTACAG CCAGAAGAGA TATGAGGAAA TTGTTAAGGA AGTCAGCACT	2580
TACATTAAGA AAATTGGCTA CAACCCCGAC ACAGTAGCAT TTGTGCCAAT TTCTGGTTGG	2640
AATGGTGACA ACATGCTGGA GCCAAGTGCT AACGTAAGTG GCTTTCAAGA CCATTGTTAA	2700
AAAGCTCTGG GAATGGCGAT TTCATGCTTA CACAAATTGG CATGCTTGTG TTTCAGATGC	2760
CTTGGTTCAA GGGATGGAAA GTCACCCGTA AGGATGGCAA TGCCAGTGGA ACCACGCTGC	2820
TTGAGGCTCT GGACTGCATC CTACCACCAA CTCGTCCAAC TGACAAGCCC TTGCGCCTGC	2880
CTCTCCAGGA TGTCTACAAA ATTGGTGGTA AGTTGGCTGT AAACAAAGTT GAATTTGAGT	2940
TGATAGAGTA CTGTCTGCCT TCATAGGTAT TTAGTATGCT GTAAATATTT TTAGGTATTG	3000
GTACTGTTCC TGTTGGCCGA GTGGAGACTG GTGTTCTCAA ACCCGGTATG GTGGTCACCT	3060
TTGCTCCAGT CAACGTTACA ACGGAAGTAA AATCTGTCGA AATGCACCAT GAAGCTTTGA	3120
GTGAAGCTCT TCCTGGGGAC AATGTGGGCT TCAATGTCAA GAATGTGTCT GTCAAGGATG	3180
TTCGTCGTGG CAACGTTGCT GGTGACAGCA AAAATGACCC ACCAATGGAA GCAGCTGGCT	3240
TCACTGCTCA GGTAACAATT TAAAGTAACA TTAACTTATT GCAGAGGCTA AAGTCATTTG	3300
AGACTTTGGA TTTGCACTGA ATGCAAATCT TTTTTCCAAG GTGATTATCC TGAACCATCC	3360
AGGCCAAATA AGCGCCGGCT ATGCCCCTGT ATTGGATTGC CACACGGCTC ACATTGCATG	3420
CAAGTTTGCT GAGCTGAAGG AAAAGATTGA TCGCCGTTCT GGTAAAAAGC TGGAAGATGG	3480

-33 CZ 296544 B6

CCCTAAATTC	TTGAAGTCTG	GTGATGCTGC	CATTGTTGAT	ATGGTTCCTG	GCAAGCCCAT	3540
GTG-TGTTGAG	AGCTTCTCAG	ACTATCCACC	TTTGGGTAAG	GATGACTACT	TAAATGTAAA	3600
AAAGTTGTGT	TAAAGATGAA	AAATACAACT	GAACAGTACT	TTGGGTAATA	ATTAACTTTT	3660
TTTTTAATAG	GTCGCTTTGC	TGTTCGTGAT	ATGAGACAGA	CAGTTGCGGT	GGGTGTCATC	3720
AAAGCAGTGG	ACAAGAAGGC	TGCTGGAGCT	GGCAAGGTCA	CCAAGTCTGC	CCAGAAAGCT	3780
CAGAAGGCTA	AATGAATATT	ATCCCTAATA	CCTGCCACCC	CACTCTTAAT	CAGTGGTGGA	3840
AGAACGGTCT	CAGAACTGTT	TGTTTCAATT	GGCCATTTAA	GTTTAGTAGT	AAAAGACTGG	3900
TTAATGATAA	CAATGCATCG	TAAAACCTTC	AGAAGGAAAG	GAGAATGTTT	TGTGGACCAC	3960
TTTGGTTTTC	TTTTTTGCGT	GTGGCAGTTT	TAAGTTATTA	GTTTTTAAAA	TCAGTACTTT	4020
TTAATGGAAA	CAACTTGACC	AAAAATTTGT	CACAGAATTT	TGAGACCCAT	TAAAAAAGTT	4080
AAATGAGAAA	CCTGTGTGTT	CCTTTGGTCA	ACACCGAGAC	ATTTAGGTGA	AAGACATCTA	4140
ATTCTGGTTT	TACGAATCTG	GAAACTTCTT	GAAAATGTAA	TTCTTGAGTT	AACACTTCTG	4200
GGTGGAGAAT	AGGGTTGTTT	TCCCCCCACA	TAATTGGAAG	GGGAAGGAAT	ATCATTTAAA	4260
GCTATGGGAG	GGTTTCTTTG	ATTACAACAC	TGGAGAGAAA	TGCAGCATGT	TGCTGATTGC	4320
CTGTCACTAA	AACAGGCCAA	AAACTGAGTC	CTTGGGTTGC	ATAGAAAGCT	TCATGTTGCT	4380
AAACCAATGT	TAAGTGAATC	TTTGGAAACA	AAATGTTTCC	AAATTACTGG	GATGTGCATG	4440
TTGAAACGTG	GGTTAAAATG	ACTGGGCAGT	GAAAGTTGAC	TATTTGCCAT	GACATAAGAA	4500
ATAAGTGTAG	TGGCTAGTGT	ACACCCTATG	AGTGGAAGGG	TCCATTTTGA	AGTCAGTGGA	4560
GTAAGCTTTA	TGCCATTTTG	ATGGTTTCAC	AAGTTCTATT	GAGTGCTATT	CAGAATAGGA	4620
ACAAGGTTCT	AATAGAAAAA	GATGGCAATT	TGAAGTAGCT	ATAAAATTAG	ACTAATTACA	4680
TTGCTTTTCT	CCGAC					4695

Claims (35)

1. Purifikovaná a izolovaná transkripční regulační DNA křeččího EF-Ια zvolená z

a) DNA obsahující sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 1,

b) DNA obsahující část sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 1, která je schopna podporovat transkripci genu operativně připojeného k regulační DNA,

c) DNA obsahující oblast od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1,

d) 1 l,7kb regulační DNA sekvence křeččího EF-Ια vplasmidu pDEF14, který je uložen ve sbírce ATCC pod přírůstkovým číslem 98 398,

e) DNA obsahující sekvence nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 28,

f) křeččí regulační DNA sekvence, která hybridizuje s DNA popsanou v SEQ ID NO: 1 za podmínek zahrnujících konečné promytí v pufru obsahujícím 2X SSC a 0,1% SDS při 65 °C,

g) DNA obsahující asi 1,56 kg od 5' do iniciačního ATG kodonu v SEQ ID NO: 1.

2. DNA podle nároku 1, kde uvedená regulační DNA obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 1.

3. DNA podle nároku 1, kde regulační DNA obsahuje část sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 1, která je schopna podporovat transkripci genu operativně připojeného k regulační DNA.

4. DNA podle nároku 3, kde regulační DNA obsahuje oblast od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvence polynukleotidu uvedeného v SEQ ID NO: 1.

5. Hostitelská buňka obsahující DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde DNA není operativně připojena k EF-1 oc kódujícím sekvencím.

6. Vektor obsahující DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde DNA není operativně připojena k EF-Ια kódujícím sekvencím.

7. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná vektorem podle nároku 6.

8. Chimérický polynukleotid zahrnující regulační DNA křeččího EF-Ια podle nároku 1 operativně připojenou k DNA sekvenci kódující protein, přičemž tato sekvence DNA kóduje protein odlišný od křeččího EF-la.

9. Chimérický polynukleotid podle nároku 8, kde regulační DNA obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 1.

10. Chimérický polynukleotid podle nároku 8, kde regulační DNA obsahuje část sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 1, přičemž tato část je schopna podporovat transkripci genu operativně připojeného k regulační DNA.

11. Chimérický polynukleotid podle nároku 10, kde regulační DNA obsahuje oblast od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 v polynukleotidu uvedeném v SEQ ID NO:1.

-35CZ 296544 B6

12. Chimérický polynukleotid podle nároku 8, kde sekvence DNA kódující protein kóduje protein endogenní vzhledem ke křeččím buňkám, který je odlišný od EIMa.

13. Chimérický polynukleotid podle nároku 8, kde sekvence DNA kóduje protein heterologní vzhledem ke křeččím buňkám.

14. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná chimérickým polynukleotidem podle kteréhokoliv z nároků 8 až 13.

15. Expresní plasmid obsahující chimérický polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 8 až 13.

16. Expresní plasmid podle nároku 15, který dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO:28.

17. Expresní plasmid podle nároku 16, kde sekvence nukleové kyseliny uvedená v SEQ ID NO:28 je umístěna 3' vzhledem k chimérickému polynukleotidu.

18. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná expresním plasmidem podle nároku 15.

19. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná expresním plasmidem podle nároku 16 nebo 17.

20. Plasmid pDEF2 vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98343.

21. Plasmid pDEF14 vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98398.

22. Plasmid pDEFl./ICM3H.2 vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98381.

23. Plasmid pNEFl/ICM3L.3 vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98382.

24. Plasmid pDEFl/F2GH.l vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98383.

25. Plasmid pNEFl/F2GL.l vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98384.

26. Plasmid pDEFl/CTN.l vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98385.

27. Plasmid pDEF2/HPH.4 vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98386.

28. Plasmid pDEFlO/MDC.l vykazující přírůstkové číslo sbírky ATCC 98387.

29. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná expresním plasmidem podle kteréhokoliv z nároků 20 až 28.

30. Způsob zvyšování transkripce genu, který je předmětem zájmu, v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že se DNA obsahující křeččí EF-Ια regulační DNA podle nároku 1 integruje do genomové DNA hostitelské buňky v poloze operativně připojené ke genu, který je předmětem zájmu, s výjimkou způsobů terapeutického ošetřování lidského nebo zvířecího těla a diagnostických metod používaných na lidském nebo zvířecím těle.

31. Způsob podle nároku 30, vy z n a č uj í c í se t í m , že DNA, která má být integrována, dále zahrnuje zaměřovači sekvenci.

-36CZ 296544 B6

32. Způsob podle nároku 30, v y z n a č u j í c í se t í m, že hostitelskou buňkou je buňka vaječníku čínského křečka.

33. Způsob podle nároku 32, v y z n a č u j í c í se tím, že gen, který je předmětem zájmu, je endogenní vzhledem k hostitelské buňce vaječníku čínského křečka a odlišný od EF-loc.

34. Způsob podle nároku 30, v y z n a č u j í c í se tím, že požadovaný gen je heterologní vzhledem k buňkám vaječníku čínského křečka a je stabilně integrován do genomové DNA buněk vaječníku čínského křečka.

35. DNA obsahující regulační DNA křeččího EF-Ια podle nároku 1 pro použití při způsobu zvyšování transkripce genu, který je předmětem zájmu, v hostitelské buňce integrací této DNA do genomové DNA hostitelské buňky.