KR102166824B1 - 발현 벡터 구성원 조합, 신규한 제조 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합적 제조를 위한 그의 용도 - Google Patents

발현 벡터 구성원 조합, 신규한 제조 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합적 제조를 위한 그의 용도 Download PDF

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Abstract

일시적 트렌스펙션에 대해 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 (Intron A 있음) 의 이용이 강화된 생산성 (LC-HC-SM 구성에서) 을 제공하고, 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열의 이용이 SV40 polyA 신호 서열의 이용에 비해 강화된 생산성을 제공하고, HGT 의 bGH PolyA 신호 서열에 대한 첨가는 hCMV 프로모터를 포함하는 벡터에서 증대된 생산성을 결과로서 제공하며, 벡터 구성 LC(3'-5')-HC-SM 은 개선된 발현을 제공한다는 것이 본원에 보고된다. 안정한 모음에 대해서는, hEF1α 프로모터를 포함하는 벡터를 이용해 생성된 모음은 회분식 분석에서 강화된 생산성을 나타내고, hEF1α 프로모터를 포함하는 벡터를 이용해 생성된 클론은 줄어든 수의 저 생산 클론을 나타내며, hEF1α 프로모터를 포함하는 벡터를 이용해 생성된 클론은 IgG 발현의 더 높은 안정성을 나타낸다는 것이 본원에 보고된다. 단일 클론에 대해서는, 선별 마커 (LC-HC-SM) 가 하류에 위치한 벡터 구성이 단일 클론의 생산성에 긍정적인 영향을 주며, bGH polyA 신호 서열 및 hGT 을 포함하는 벡터를 이용해 생성된 클론은 더 높은 생산성을 갖는다는 것이 보고된다.

Description

발현 벡터 구성원 조합, 신규한 제조 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합적 제조를 위한 그의 용도 {EXPRESSION VECTOR ELEMENT COMBINATIONS, NOVEL PRODUCTION CELL GENERATION METHODS AND THEIR USE FOR THE RECOMBINANT PRODUCTION OF POLYPEPTIDES}
본원에는 프로모터, polyA 신호 서열, 및 전사 인자와 같은 발현 벡터 구성원의 신규한 조합, 그의 발현 벡터 구성, 그의 조합 뿐만 아니라 제조 세포주 생성을 위한 신규한 방법, 예컨대 트렌스펙션 또는 선별 방법 뿐만 아니라 관심대상의 폴리펩티드의 재조합적 생산을 위한 그러한 발현 벡터 및 제조 세포주의 용도가 제공된다.
유전자의 전사 수준은 유전자의 발현 수준에 큰 영향을 미칠 수 있고, 그러므로 세포의 생산성을 결정한다. 유전자의 전사 수준은 주로 하기 3 가지 벡터 구성원의 영향을 받는다: 프로모터, polyA 신호 서열 및 (존재하는 경우) 전사 종결자.
항체 중쇄 인코딩 핵산은 일반적으로 리더 서열 (신호 서열) (약 57 bp/19 aa) (이는 단백질의 성숙시 제거됨), 가변 영역, VH (약 350 bp/115 aa), 및 불변 영역, CH (약 990 bp/330 aa) 를 포함한다. 항체 경쇄 인코딩 핵산은 일반적으로 리더 서열 (약 66 bp/22 aa) (이는 단백질의 성숙시 제거됨), 가변 영역, VK 또는 VL (약 350 bp/115 aa), 및 불변 영역, CK 또는 CL (약 321 bp/107 aa) 로 구성된다.
진핵 세포에서의 항체의 재조합 생산은 발현 시스템의 창조를 수반한다 (McCafferty, J. 등, (eds.), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1997) 참조). 항체 발현 시스템의 개발을 위해 측면에 프로모터 및 폴리-아데닐화 (polyA) 영역이 있는 경쇄 인코딩 핵산을 포함하는 발현 카세트가 창조된다. 또한, 측면에 프로모터 및 polyA 영역이 있는 중쇄 인코딩 핵산을 포함하는 중쇄 발현 카세트가 창조된다. 중쇄 발현 카세트는 경쇄 발현 카세트와 조합되어 중쇄 및 경쇄 발현 카세트 둘다를 함유하는 단일 벡터로 통합되거나 또는 2 개의 별개의 벡터로 통합될 수 있다.
면역글로불린 DNA 카세트 분자, 모노바디 구축물 (monobody constructs), 생산 방법, 및 그의 사용 방법이 US 7,053,202 에서 보고된다. US 5,168,062 에서 인간 사이토메갈로바이러스 조기 발현 (immediate-early) 프로모터-조절성 DNA 서열을 함유하는 트랜스퍼 벡터 (transfer vector) 및 미생물이 보고된다. 인간 폴리펩티드 사슬 신장 인자-1α (human polypeptide chain elongation factor-1α) 에 대한 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편, 그것의 염기 서열, 및 광범위한 고발현능 숙주 세포에 적용가능한 상기 DNA 단편을 함유하는 발현 플라스미드가 US 5,225,348 에서 보고된다. US 5,266,491 에서 SV40 복제 기점 및 인간 폴리펩티드 사슬 신장 인자-1α 유전자에 대한 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편을 함유하는 발현 플라스미드가 보고된다. 재조합 DNA 화합물 및 폴리펩티드 예컨대 tPA 의 발현이 US 5,122,458 에서 보고된다. US 7,422,874 에서 동물 세포용 발현 벡터가 보고된다.
Sanna Pietro, P. 는 포유류 세포에서의 항체 Fab 단편 및 전체 면역글로불린의 발현을 보고한다 (Meth. Mol. Biol. 178 (2002) 389-395). B 형 간염 표면 항원에 대한 인간 항체 가변 영역의 유전자 클로닝을 위한 세포 표시 라이브러리를 Higuchi, K. 등이 보고한다 (J. Immunol. Meth. 202 (1997) 193-204). Kim, D. 등은 전사 종결 영역이 조작된 개선된 포유류 세포 발현 시스템을 보고한다 (Biotechnol. Progress 19 (2003) 1620-1622). 모노클로날 항체 생산을 위한 세포 조작에 대한 가이드라인을 Costa, R.A. 등이 보고한다 (Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 74 (2010) 127-138). Kim, D.W. 등은 다용도의 효율적 발현 시스템으로서의 인간 신장 인자 1 알파 프로모터의 사용을 보고한다 (Gene 91 (1990) 217-223). 인트론 의존성 및 인트론 비의존성 유전자 발현의 비교를 Buchman, A.R. 등이 보고한다 (Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 4395-4405). Wang, F. 등은 포유류 세포에서의 항체 발현을 보고한다 (in Therapeutic monoclonal antibodies - From bench to clinic, Wiley (2009) 페이지 557-572). 재조합 IgG 항체의 포유류 발현을 위한 상이한 벡터 디자인의 비교 연구를 Li 등이 보고한다 (J. Immunol. Meth. 318 (2007) 113-124). Ho, S.C.L. 등은 "모노클로날 항체 고발현 CHO 세포주의 생성을 향상시키기 위한 IRES-매개 3 시스트론 벡터" 를 보고한다 (J. Biotechnol. 157 (2011) 130-139). 재조합 동물 세포에 의한 항-CD2 키메라 항체의 생산을 Hotta, A. 등이 보고한다 (J. Biosci. Bioeng. 98 (2004) 298-303). Lee, J-C. 등은 "엔테로바이러스 71 내부 리보솜 진입으로 매개되는 고효율 단백질 발현" 을 보고한다 (Biotechnol. Bioeng. 90 (2005) 656-662). WO 2008/142124 에서 Avian EBX® 세포에서의 재조합 단백질 생산이 보고된다.
발명의 개요
발현 벡터의 성능은 대개 그의 의도하는 용도에 따라 좌우되며, 일시적 트렌스펙션, 안정한 모음 (stable pools) 및 단일 클론 선별을 위한 최선의 벡터는 상이하다는 것을 알게 되었다.
주요한 발견사실을 조명해 보면: 일시적 트렌스펙션을 위해서는, 항체 경쇄 및 중쇄의 양방향성 발현 및 Intron A 를 포함하는 전장 hCMV 프로모터의 이용이 유리했다. 그러나, 안정한 트렌스펙션을 위해서는, 1) 항체 경쇄, 2) 항체 중쇄 및 3) 선별 마커의 순서의 배열이 유리한 것으로 나타났다.
hEFlα 프로모터가 안정한 모음에서는 hCMV 프로모터에 비해 명백히 월등한 반면, 단일 클론 수준에 대한 명백한 상반된 유효성이 발견된 바 있다. 여기서, 인간 싸이토메갈로바이러스 급초기 프로모터/인핸서 (hCMV) 클론이 최고의 생산성으로 수득되었다.
나아가, hCMV 프로모터 성능은 그것을 bGH polyA 신호 및 인간 가스트린 유전자 (hGT) 의 종결자 서열과 조합하여 추가로 개선될 수 있는데, 이는 발현의 생산성 및 안정성을 모두 증대시킨다.
프로모터, 구조 유전자 및 polyA 신호 서열 및 임의로 종결자 서열을 각각 포함하는 항체 중쇄 발현 카세트 및 항체 경쇄 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터의 사용으로, 1) 프로모터가 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 (hCMV) 이고, polyA 신호 서열이 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열 (bGH polyA) 이고, 종결자 서열이 인간 가스트린 유전자 전사 종결자 서열 (hGT) 인 경우, 또는 2) 프로모터가 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 (EF1alpha) 이고, polyA 신호 서열이 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열 (bGH polyA) 이고, 종결자 서열이 부재하는 경우, 트랜스펙션 후에 더 많은 수의 항체 생산/분비 세포 클론이 초래됨이 밝혀졌다.
위에 개설된 발현 벡터를 사용함으로써 트랜스펙션 후에 더 많은 수의 항체 생산/분비 세포가 수득될 수 있고, 이에 따라 대규모 재조합 항체 생산에 적합한 고 생산자 세포를 식별하는데 필요한 노력이 감소된다.
따라서, 본원에 보고된 한 국면은 하기 단계를 포함하는 재조합체 포유류 세포의 선별 방법이다:
a) 포유류 세포를 하기를 포함하는 발현 벡터로 트렌스펙션하는 단계
- 5' 에서 3' 방향으로 hCMV 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, bGH polyA 신호 서열, 및 hGT 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 hCMV 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, bGH polyA 신호 서열, 및 hGT 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
이로써 다수의 재조합체 포유류 세포를 수득하게 됨, 및
b) 다수의 재조합체 포유류 세포로부터 (단일) 재조합체 포유류 세포를 선별하는 단계.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 안정한 트렌스펙션 세포 선별을 위해 단일방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 일시적 트렌스펙션 세포 선별을 위해 양방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 발현 플라스미드가 선별 마커를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 발현 카셋트 및 선별 마커가 단일방향성으로 배열되어 있다. 한 구현예에서, 발현 카셋트가 순서 LC-HC-SM 로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 포유류 세포가 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NSO 세포, 및 SP2/0 세포로부터 선택된다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 안정한 트렌스펙션 세포 선별을 위한 CHO 세포이다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 일시적 트렌스펙션 세포 선별을 위한 HEK 세포이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기 단계를 포함하는 항체 제조 방법이다:
a) 하기를 포함하는 포유류 세포를 배양하는 단계
- 5' 에서 3' 방향으로 hCMV 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, bGH polyA 신호 서열, 및 hGT 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 hCMV 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, bGH polyA 신호 서열, 및 hGT 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
b) 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 항체의 안정한 제조를 위해 단일방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 항체의 일시적 제조를 위해 양방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 발현 플라스미드가 선별 마커를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 발현 카셋트 및 선별 마커가 단일방향성으로 배열되어 있다. 한 구현예에서, 발현 카셋트가 순서 LC-HC-SM 로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 포유류 세포가 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NSO 세포, 및 SP2/0 세포로부터 선택된다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 항체의 안정한 생산을 위한 CHO 세포이다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 항체의 일시적 생산을 위한 HEK 세포이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기를 포함하는 발현 벡터이다:
- 5' 에서 3' 방향으로 hCMV 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, bGH polyA 신호 서열, 및 hGT 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 hCMV 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, bGH polyA 신호 서열, 및 hGT 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 안정한 트렌스펙션 세포 선별을 위해 단일방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 일시적 트렌스펙션 세포 선별을 위해 양방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 발현 플라스미드가 선별 마커를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 발현 카셋트 및 선별 마커가 단일방향성으로 배열되어 있다. 한 구현예에서, 발현 카셋트가 순서 LC-HC-SM 로 배열되어 있다.
안정한 재조합체 생성을 위해서는, hGT 종결자 서열의 존재 하에 인간 인장 인자 1 알파 프로모터 (hEFl 알파) 를 bGH polyA 신호 서열와 조합하여 사용시 항체 발현/분비 세포주가 수득가능한 발현 수율을 감소시키는 것을 발견하게 되었다.
본원에 보고된 한 국면은 하기 단계를 포함하는 재조합체 포유류 세포의 선별 방법이다:
a) 포유류 세포를 하기를 포함하는 발현 벡터로 트렌스펙션하는 단계
- 5' 에서 3' 방향으로 hEF1알파 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 bGH polyA 신호 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 hEF1알파 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, bGH polyA 신호 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
이로써 다수의 재조합체 포유류 세포를 수득하게 됨, 및
b) 다수의 재조합체 포유류 세포로부터 (단일) 재조합체 포유류 세포를 선별하는 단계.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 안정한 트렌스펙션 세포 선별을 위해 단일방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 일시적 트렌스펙션 세포 선별을 위해 양방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 발현 플라스미드가 선별 마커를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 발현 카셋트 및 선별 마커가 단일방향성으로 배열되어 있다. 한 구현예에서, 발현 카셋트가 순서 LC-HC-SM 로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터가 Intron A 을 포함한다.
한 구현예에서, 발현 벡터에 임의의 전사 종결자 서열이 없다. 한 구현예에서, 종결자 서열이 hGT 서열이다.
한 구현예에서, 포유류 세포가 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NSO 세포, 및 SP2/0 세포로부터 선택된다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 안정한 트렌스펙션 세포 선별을 위한 CHO 세포이다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 일시적 트렌스펙션 세포 선별을 위한 HEK 세포이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기 단계를 포함하는 항체의 제조 방법이다:
a) 하기를 포함하는 포유류 세포의 배양 단계
- 5' 에서 3' 방향으로 hEF1알파 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 bGH polyA 신호 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 hEF1알파 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 및 bGH polyA 신호 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
b) 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 안정한 트렌스펙션 세포 선별을 위해 단일방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 일시적 트렌스펙션 세포 선별을 위해 양방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 발현 플라스미드는 추가로 선별 마커를 포함한다. 한 구현예에서, 발현 카셋트 및 선별 마커가 단일방향성으로 배열되어 있다. 한 구현예에서, 발현 카셋트 순서 LC-HC-SM 로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터가 Intron A 를 포함한다.
한 구현예에서, 발현 벡터에 임의의 전사 종결자 서열이 없다. 한 구현예에서, 종결자 서열이 hGT 서열이다.
한 구현예에서, 포유류 세포가 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NSO 세포, 및 SP2/0 세포로부터 선택된다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 항체의 안정한 제조를 위한 CHO 세포이다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 항체의 일시적 제조를 위한 HEK 세포이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기를 포함하는 발현 벡터이다:
- 5' 에서 3' 방향으로 hEF1알파 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 bGH polyA 신호 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 hEF1알파 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 및 bGH polyA 신호 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 안정한 트렌스펙션 세포 선별을 위해 단일방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 일시적 트렌스펙션 세포 선별을 위해 양방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 발현 플라스미드가 선별 마커를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 발현 카셋트 및 선별 마커가 단일방향성으로 배열되어 있다. 한 구현예에서, 발현 카셋트가 순서 LC-HC-SM 로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터가 Intron A 를 포함한다.
한 구현예에서, 발현 벡터에 임의의 전사 종결자 서열이 없다. 한 구현예에서, 종결자 서열이 hGT 서열이다.
항체의 안정한 재조합체 제조를 위해서는 하기를 포함하는 발현 벡터를 이용하는 것이 안정하게 트렌스펙션된 재조합체 포유류 세포에서 개선된 발현 수율을 제공하는 것으로 나타났다:
- 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 제 1 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 1 전사 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 제 2 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 2 전사 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 제 3 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 제 3 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 3 전사 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
이로써, 3 개의 발현 카셋트는 단일방향성으로 제 1 발현 카셋트-제 2 발현 카셋트-제 3 발현 카셋트 순서로 구성되어 있게 됨.
상기와는 대조적으로, 항체의 일시적 재조합체 제조를 위해서는 하기를 포함하는 발현 벡터를 이용하는 것이 일시적으로 트렌스펙션된 재조합체 포유류 세포에서 개선된 발현 수율을 제공하는 것으로 나타났다:
- 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 제 1 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 1 전사 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 제 2 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 2 전사 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 제 3 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 제 3 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 3 전사 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
이로써, 발현 카셋트는 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 반대 방향으로 배열되어 양방향으로 구성됨.
용어 반대 방향이란, 1 개의 발현 카셋트가 5' -> 3' 방향으로 전사되고, 다른 한 발현 카셋트는 3'-> 5' 방향으로 전사됨을 가리킨다.
따라서, 본원에 보고된 한 국면은 포유류 세포에서의 항체의 안정한 재조합체 제조를 위한 하기를 포함하는 발현 벡터의 용도이다:
- 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 제 1 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 1 전사 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 제 2 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 2 전사 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 제 3 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 제 3 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 3 전사 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터가 hCMV 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 bGH polyA 신호 서열이고, 전사 종결자 서열이 존재하며, hGT 종결자 서열이다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터는 hEFl 알파 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열은 bGH polyA 신호 서열이며, 발현 카셋트에는 전사 종결자 서열이 없다.
한 구현예에서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NSO 세포, 및 SP2/0 세포로부터 선택된다. 한 구현예에서, 포유류 세포는 CHO 세포이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기를 포함하는 발현 벡터이다:
- 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 제 1 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 1 전사 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 제 2 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 2 전사 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 제 3 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 제 3 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 3 전사 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
이로써, 발현 카셋트는 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 반대 방향으로 배열되는 양방향성으로 구성됨.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터가 hCMV 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 bGH polyA 신호 서열이고, 전사 종결자 서열이 존재하며, hGT 종결자 서열이다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터가 hEFl 알파 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 bGH polyA 신호 서열이고, 발현 카셋트에 전사 종결자 서열이 없다.
본원에 보고된 한 국면은 포유류 세포에서의 항체의 일시적 재조합체 제조를 위한 하기를 포함하는 발현 벡터의 용도이다:
- 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 제 1 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 1 전사 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 제 2 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 2 전사 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 제 3 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 제 3 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 3 전사 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
이로써, 발현 카셋트는 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 반대 방향으로 배열되는 양방향성으로 구성됨.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터는 hCMV 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열은 bGH polyA 신호 서열이며, 전사 종결자 서열이 존재하고, hGT 종결자 서열이다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터가 hEFl 알파 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 bGH polyA 신호 서열이고, 발현 카셋트에는 전사 종결자 서열이 없다.
한 구현예에서, 포유류 세포가 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NSO 세포, 및 SP2/0 세포로부터 선택된다. 한 구현예에서, 포유류 세포가 HEK 세포이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기를 포함하는 발현 벡터이다:
- 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 제 1 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 1 전사 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 제 2 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 2 전사 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 제 3 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 제 3 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 3 전사 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
이로써, 발현 카셋트는 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 반대 방향으로 배열되는 양방향성으로 구성됨.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터가 hCMV 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 bGH polyA 신호 서열이고, 전사 종결자 서열이 존재하고, hGT 종결자 서열이다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터가 hEFl 알파 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 bGH polyA 신호 서열이고, 발현 카셋트에 전사 종결자 서열이 없다.
나아가, hCMV 프로모터 및 인간 EFlα 프로모터를, Intron A 이 없는 짧은 인간 CMV 프로모터 대신 Intron A 와 함께 포함하는 발현 벡터가 일시적 및 모음 유전자 발현 (pool gene expression) 을 강화하는 것으로 나타났다.
본원에 보고된 한 국면은 하기를 포함하는 발현 플라스미드이다:
- 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 제 1 polyA 신호 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 및 제 2 polyA 신호 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
여기서, 발현 카셋트 중 하나 또는 두가지 모두가 polyA 신호 서열 다음에 부가적으로 인간 가스트린 종결자 서열을 포함함.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열은 서로 독립적으로 SV40 polyA 신호 서열 및 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열로부터 선택된다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터는 서로 독립적으로 인간 CMV 프로모터, SV40 프로모터 및 인간 신장 인자 1 알파 프로모터로부터 선택된다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트는 단일방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 발현 플라스미드는 선별 마커를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 발현 카셋트 및 선별 마커는 양방향성으로 배열되어 있다.
본원에 보고된 한 국면은 항체의 일시적 발현 또는 항체의 안정한 발현을 위한 발현 플라스미드의 용도이다.
본원에 보고된 한 국면은 본원에 보고된 발현 플라스미드를 포함하는 진핵 세포이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기 단계를 포함하는 항체의 제조 방법이다:
- 본원에 보고된 발현 플라스미드를 포함하는 진핵 세포 또는 본원에 보고된 세포를 배양하는 단계,
- 진핵 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계.
한 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다. 한 구현예에서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NSO 세포, 및 SP2/0 세포로부터 선택된다.
본원에 보고된 한 국면은 하기를 포함하는 발현 플라스미드이다:
- 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 및 제 1 polyA 신호 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 및 제 2 polyA 신호 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
여기서, 제 1 및/또는 제 2 프로모터는 인간 신장 인자 1 알파 프로모터임.
한 구현예에서, 발현 카셋트 중 하나 또는 두가지 모두가 polyA 신호 서열 이후에 추가로 인간 가스트린 종결자 서열을 포함하지 않는다.
한 구현예에서, 발현 카셋트 중 하나 또는 두가지 모두에 인간 가스트린 종결자 서열이 없다.
한 구현예에서, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터가 Intron A 를 포함한다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 서로 독립적으로 SV40 polyA 신호 서열 및 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열로부터 선택된다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 프로모터가 서로 독립적으로 인간 CMV 프로모터, SV40 프로모터 및 인간 신장 인자 1 알파 프로모터로부터 선택된다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 하나 이상의 인트론을 포함한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산은 cDNA 이다.
한 구현예에서, 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 단일방향성으로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 발현 플라스미드가 선별 마커를 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 발현 카셋트 및 선별 마커가 양방향성으로 배열되어 있다.
본원에 보고된 한 국면은 항체의 일시적 발현 또는 항체의 안정한 발현을 위한 본원에 보고된 발현 플라스미드의 용도이다.
본원에 보고된 한 국면은 본원에 보고된 발현 플라스미드를 포함하는 진핵 세포이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기 단계를 포함하는 항체의 제조 방법이다:
- 본원에 보고된 발현 플라스미드를 포함하는 진핵 세포 또는 본원에 보고된 세포를 배양하는 단계,
- 진핵 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계.
한 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이다. 한 구현예에서, 포유류 세포는 CHO 세포, HEK 세포, BHK 세포, NSO 세포, 및 SP2/0 세포로부터 선택된다.
본원에 보고된 한 국면은 5' 에서 3' 방향으로 프로모터 서열, 중쇄를 인코딩하는 핵산 또는 항체 경쇄, IRES 구성원, 선별 마커를 인코딩하는 핵산 서열, 및 polyA 신호 서열을 포함하는 발현플라스미드이고, 여기서 IRES 구성원은 EMCV-IRES 구성원이다.
한 구현예에서, 핵산은 항체 중쇄를 인코딩한다.
한 구현예에서, 선별 마커는 식 A-C-S 의 융합 단백질이고, 여기서 A 는 검출가능한 폴리펩티드이고, C 는 단백질가수분해 신호 서열이고, S 는 선별가능한 마커이다.
한 구현예에서, 단백질가수분해 신호 서열은 오르니틴 데카르복실라아제의 PEST 서열이다.
한 구현예에서, 검출가능한 폴리펩티드는 녹색 형광 단백질이다.
한 구현예에서, 선별가능한 마커는 네오마이신이다.
본원에 보고된 한 국면은 N-말단에서 C-말단 방향으로 녹색 형광 단백질,오르니틴 데카르복실라아제의 PEST 서열 및 네오마이인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이다.
본원에 보고된 한 국면은 N-말단에서 C-말단 방향으로 녹색 형광 단백질, 오르니틴 데카르복실라아제의 PEST 서열, 및 항체 분비 세포의 선별을 위한 네오마이신을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 용도이다.
본원에 보고된 한 국면은 5 ' 에서 3' 방향으로 프로모터 서열, 항체 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 핵산, IRES 구성원, 선별 마커를 인코딩하는 핵산, 및 항체 제조 세포의 선별을 위한 polyA 신호 서열을 포함하는 발현 카셋트의 용도로, 여기서 IRES 구성원이 EMCV-IRES 구성원이다.
한 구현예에서, 핵산이 항체 중쇄를 인코딩한다.
한 구현예에서, 선별 마커가 식 A-C-S 의 융합 단백질이며, 여기서 A 가 검출가능한 폴리펩티드이고, C 가 단백질가수분해 신호 서열이며, S 가 선별가능한 마커이다.
한 구현예에서, 단백질가수분해 신호 서열이 오르니틴 데카르복실라아제의 PEST 서열이다.
한 구현예에서, 검출가능한 폴리펩티드가 녹색 형광 단백질이다.
한 구현예에서, 선별가능한 마커가 네오마이신이다.
본원에 보고된 한 국면은 하기 단계를 포함하는 항체를 발현하는 진핵 세포의 선별 방법이다:
- i) 본 국면에서 보고되는 발현 플라스미드 및 ii) 본 국면에서 보고되는 발현현 플라스미드에 의해 인코딩되지 않는 각 여타 항체 사슬을 인코딩하는 핵산을 포함하는 진핵 세포의 배양 단계,
- 검출가능한 폴리펩티드를 발현하는 세포의 선별 단계.
본원에 보고된 한 국면은 5' 에서 3' 방향으로 프로모터 서열, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, IRES 구성원, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열, 및 polyA 신호 서열을 포함하는 발현 플라스미드로, 여기서 IRES 구성원이 EV71-IRES 구성원이다.
한 구현예에서, 프로모터 서열은 Intron A 이 있거나 또는 없는 인간 CMV 프로모터 서열, SV40 프로모터 및, Intro A 가 있거나 또는 없는 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 서열로부터 선택된다.
한 구현예에서, polyA 신호 서열이 소 생장 호르몬 polyA 신호 서열 및 SV40 polyA 신호 서열로부터 선택된다.
한 구현예에서, 플라스미드는 3' 에서 polyA 신호 서열로로 인간 가스트린 종결자 서열을 포함한다.
본원에 보고된 한 국면은 항체 발현을 위한, 5' 에서 3' 방향으로 프로모터 서열, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, IRES 구성원, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열, 및 polyA 신호 서열을 포함하는 발현 플라스미드의 용도로, 여기서 IRES 구성원은 EV71-IRES 구성원이다.
한 구현예에서, 프로모터 서열은 Intron A 이 있거나 또는 없는 인간 CMV 프로모터 서열, SV40 프로모터 및, Intro A 가 있거나 또는 없는 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 서열로부터 선택된다.
한 구현예에서, polyA 신호 서열은 소 생장 호르몬 polyA 신호 서열 및 SV40 polyA 신호 서열로부터 선택된다.
한 구현예에서, 플라스미드는 3' 에서 polyA 신호 서열로 인간 가스트린 종결자 서열을 포함한다.
본원에 보고된 한 국면은 하기 단계를 포함하는 항체의 제조 방법이다:
- 본원에 보고된 발현 플라스미드를 포함하는 진핵 세포를 배양하는 단계,
- 세포 또는 배양 배지로부터 항체를 회수함으로써, 항체를 제공하게 되는 단계.
한 구현예에서, hCMV 프로모터는 SEQ ID NO: 01 의 서열을 갖는다. 이는 Intron A 이 없고, 5'UTR 이 있는 hCMV 프로모터이다.
한 구현예에서, hCMV 프로모터는 SEQ ID NO: 02 의 서열을 갖는다. 이는 ntron A 이 없고, 5'UTR 이 있는 hCMV 프로모터이다.
한 구현예에서, hCMV 프로모터는 SEQ ID NO: 03 의 서열을 갖는다. 이는 IntronA 가 있는 전장 hCMV 프로모터이다.
한 구현예에서, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터는 SEQ ID NO: 04 의 서열을 갖는다. 이는 IntronA 가 없는 hEFl알파 프로모터이다.
한 구현예에서, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터는 SEQ ID NO: 05 의 서열을 갖는다. 이는 Intron A 가 있는 hEFl알파 프로모터이다.
한 구현예에서, 인간 신장 인자 1 알파 프로모터는 SEQ ID NO: 06 의 서열을 갖는다. 이는 IntronA 가 있고 5'UTR 가 있는 짧은 hEFl알파 프로모터이다.
한 구현예에서, 랫트 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 07 의 서열을 갖는다.
한 구현예에서, SV40 polyA 신호 서열은 SEQ ID NO: 08 의 서열이다.
한 구현예에서, 소 생장 호르몬 polyA 신호 서열을 SEQ ID NO: 09 의 서열을 갖고 있다.
한 구현예에서, 인간 가스트린 종결자는 SEQ ID NO: 10 의 서열을 갖고 있다.
한 구현예에서, SV40 프로모터는 SEQ ID NO: 11 의 서열을 갖고 있다.
한 구현예에서, 오르니틴 데카르복실라아제의 PEST 서열은 SEQ ID NO: 12 의 서열에 의해 인코딩된다.
한 구현예에서, GFP 서열은 SEQ ID NO: 13 의 서열에 의해 인코딩된다.
한 구현예에서, 네오마이신 선별 마커는 SEQ ID NO: 14 의 서열을 갖는다.
한 구현예에서, GFP-PEST-NEO 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 15 의 서열에 의해 인코딩된다.
한 구현예에서, EMCV-IRES 는 SEQ ID NO: 16 의 서열을 갖고 있다.
한 구현예에서, EV71-IRES 는 SEQ ID NO: 17 의 서열을 갖고 있다.
본원에 보고된 모든 국면들 중 한 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
한 구현예에서, 이중특이적 항체는 제 1 항원 또는 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 특이성 또는 결합 부위를 갖고 있으며, 상기 이중특이적 항체는 제 2 항원 또는 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 특이성 또는 결합 부위를 갖고 있다.
한 구현예에서, 발현 벡터는
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 4 발현 카셋트를 포함하거나,
또는
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
- 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트를 포함하며,
여기서, 항체 경쇄는 두 항체 중쇄에 대해 공통인 경쇄이다.
본원에 보고된 모든 국면들 중 한 구현예에서, 발현 벡터는 하기를 포함한다:
- 항체 경쇄 발현 카셋트,
- 제 1 항체 중쇄 발현 카셋트,
- 제 2 항체 중쇄 발현 카셋트, 및
- 선별 마커 발현 카셋트,
여기서, 하나 이상의 항체 중쇄 발현 카셋트, 항체 경쇄 발현 카셋트, 및 선별 마커 발현 카셋트가 단일방향성으로 배열되어 있고,
여기서, 단일방향성 발현 카셋트는 항체 중쇄 발현 카셋트, 항체 경쇄 발현 카셋트 및 선별 마커 발현 카셋트 또는 단일방향성 발현 카셋트의 5' 에서 3' 순서로 배열되어 있거나, 또는 단일방향성발현 카셋트가 항체 경쇄 발현 카셋트, 항체 중쇄 발현 카셋트 및 선별 마커 발현 카셋트의 5' 에서 3' 서열로 배열되어 있다.
본원에 보고된 모든 구현예의 한 구현예에서, 발현 벡터는 하기를 포함한다:
- 제 1 항체 경쇄 발현 카셋트,
- 제 2 항체 경쇄 발현 카셋트,
- 제 1 항체 중쇄 발현 카셋트,
- 제 2 항체 중쇄 발현 카셋트, 및
- 선별 마커 발현 카셋트,
여기서 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나, 항체 경쇄 발현 카셋트 중 하나, 및 선별 마커 발현 카셋트가 단일방향성으로 배열되어 있고,
단일방향성 발현 카셋트는 항체 중쇄 발현 카셋트, 항체 경쇄 발현 카셋트 및 선별 마커 발현 카셋트의 5' 에서 3' 순서로 배열되어 있거나, 또는 단일방향성 발현 카셋트가 항체 경쇄 발현 카셋트, 항체 중쇄 발현 카셋트 및 선별 마커 발현 카셋트의 5' 에서 3' 순서로 배열되어 있다.
한 구현예에서, 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나는 홀 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄를 포함하는 발현 카셋트 중 하나를 인코딩한다.
한 구현예에서, 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나는 놉 돌연변이를 포함하는 항체 중쇄 발현 카셋트를 인코딩한다.
한 구현예에서, 항체 경쇄 발현 카셋트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 CH1 도메인을 불변 도메인으로서 포함하는 항체 경쇄 변이체를 인코딩하고/하거나 항체 경쇄 발현 카셋트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 CL 도메인을 불변 도메인으로서 포함하는 항체 경쇄를 인코딩한다.
한 구현예에서, 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 항체 중쇄 변이체를 인코딩하고/하거나 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩한다.
발명의 상세한 설명
I. 일반적 양상
당업자에게 알려진 바와 같이 재조합 DNA 기술의 사용은 핵산 및/또는 폴리펩티드의 수많은 유도체의 생성을 가능케 한다. 그러한 유도체는, 예를 들어, 하나의 개별 또는 여러 위치에서 치환, 변경, 교환, 결실, 또는 삽입에 의해 수식될 수 있다. 수식 또는 유도체화는, 예를 들어, 자리 지정 돌연변이유발을 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 수식은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다 (예를 들어 Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (1999) 참조). 재조합 기술의 사용은 당업자가 다양한 숙주 세포를 이종 핵산(들)로 형질전환하는 것을 가능케 한다. 상이한 세포의 전사 및 번역, 즉 발현, 기구는 동일한 구성원을 사용하지만, 상이한 종에 속하는 세포는 특히 소위 코돈 사용법이 상이할 수 있다. 그에 따라 동일한 폴리펩티드 (아미노산 서열에 관하여) 가 상이한 핵산(들)에 의해 인코딩될 수 있다. 또한, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 상이한 핵산이 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
재조합 DNA 기술의 사용은 핵산 및/또는 폴리펩티드의 수많은 유도체의 생성을 가능케 한다. 그러한 유도체는, 예를 들어, 하나의 개별 또는 여러 위치에서 치환, 변경, 교환, 결실, 또는 삽입에 의해 수식될 수 있다. 수식 또는 유도체화는, 예를 들어, 자리 지정 돌연변이유발을 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 수식은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다 (예를 들어 Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA (1999); Hames, B.D., and Higgins, S.J., Nucleic acid hybridization - a practical approach, IRL Press, Oxford, England (1985) 참조).
재조합 기술의 사용은 당업자가 다양한 숙주 세포를 이종 핵산(들)로 형질전환하는 것을 가능케 한다. 상이한 세포의 전사 및 번역, 즉 발현, 기구는 동일한 구성원을 사용하지만, 상이한 종에 속하는 세포는 특히 소위 코돈 사용법이 상이할 수 있다. 그에 따라 동일한 폴리펩티드 (아미노산 서열에 관하여) 가 상이한 핵산(들)에 의해 인코딩될 수 있다. 또한, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 상이한 핵산이 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
정의
"친화도 성숙된" 항체는, 변경을 보유하지 않는 부모 항체와 비교되게, 하나 이상의 과가변 영역 (HVR) 내에 항원에 대한 항체의 친화도에 개선을 초래하는 하나 이상의 변경을 보유하는 항체를 언급한다.
본원에서 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편" 은 온전한 (intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 다른 분자를 언급한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디 (diabody); 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 출처 또는 종에서 유래하지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종에서 유래하는 항체를 언급한다.
항체의 "클래스" 는 그것의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 언급한다. 항체의 5 개의 주요 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 이 존재하고, 이들 중 여럿은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 호칭된다.
본원에서 사용되는 용어 "발현" 은 세포 내에서 일어나는 전사 및/또는 번역 과정을 언급한다. 세포 내에서 관심의 핵산 서열의 전사의 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA 의 양에 기초하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 관심의 서열로부터 전사된 mRNA 는 RT-PCR 에 의해 또는 노던 혼성화 (Northern hybridization) 에 의해 정량화될 수 있다 (상기 Sambrook 등, 1999 참조). 관심의 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 다양한 방법에 의해, 예를 들어 ELISA 에 의해, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 대해 검정함으로써, 또는 그러한 활성으로부터 독립적인 검정, 예컨대 폴리펩티드를 인식하고 결합하는 면역글로불린을 사용하는 웨스턴 블롯팅 (Western blotting) 또는 방사선면역검정법을 이용함으로써 정량화될 수 있다 (상기 Sambrook 등, 1999 참조).
"발현 카세트" 는, 세포 내에서 적어도 함유된 핵산의 발현을 위한, 필수적 조절 구성원, 예컨대 프로모터 및 폴리아데닐화 자리를 함유하는 구축물을 언급한다.
"발현 벡터" 는 숙주 세포 내에서 포함된 구조 유전자(들)의 발현을 위한 모든 요구되는 구성원을 제공하는 핵산이다. 전형적으로, 발현 플라스미드는, 복제 기점, 및 선별 마커를 포함하는, 예를 들어 대장균 (E. coli) 에 대한, 원핵생물 플라스미드 증식 유닛, 진핵생물 선별 마커, 및 프로모터, 구조 유전자, 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 전사 종결자를 각각 포함하는 관심의 구조 유전자(들)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어 하에 놓여지고, 그러한 구조 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결되어 있다" 고 말해진다. 유사하게, 조절 구성원이 코어 프로모터의 활성을 조정하는 경우 조절 구성원 및 코어 프로모터는 작동가능하게 연결되어 있다.
본원에서 용어 "Fc-영역" 은 불변 영역의 일부 이상을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 그 용어는 천연 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 에서부터, 또는 Pro230 에서부터, 중쇄의 카르복시-말단까지 이른다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않으면, Fc-영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호지정은 Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에 기재된, EU 인덱스로도 호칭되는, EU 번호지정 시스템에 따른다.
"Fc-영역" 은 잘 알려져 있는 용어이고, 항체 중쇄의 파파인 절단에 기초하여 정의된다. 본원에서 보고되는 복합체는 하나의 구현예에서 항체 중쇄 힌지 영역 폴리펩티드로서 인간 Fc-영역 또는 인간 기원의 Fc-영역을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서 Fc-영역은 Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγRIIIa) 결합 및/또는 C1q 결합이 탐지될 수 없게 하는 방식으로 수식되는, 서브클래스 IgG4 의 인간 항체의 Fc-영역 또는 서브클래스 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 의 인간 항체의 Fc-영역이다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 인간 Fc-영역, 특히 인간 IgG4 서브클래스에서 유래하는 또는 인간 IgG1 서브클래스에서 유래하는 돌연변이된 Fc-영역이다. 하나의 구현예에서 Fc-영역은 인간 IgG1 서브클래스에서 유래하며, 돌연변이 L234A 및 L235A 를 포함한다. IgG4 는 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 보이지만, 다른 IgG 서브클래스의 항체는 강한 결합을 보인다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물의 소실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 또는/및 His435 는 변경되는 경우 또한 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L. 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J. 등, FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A. 등, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). 하나의 구현예에서 본원에서 보고되는 하나의 양상에서 발현되는 항체는 L234, L235, 및/또는 D265 에서 돌연변이를 갖고/거나 PVA236 돌연변이를 함유하는, IgG4 서브클래스의 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의 Fcγ 수용체 결합에 관한 것이다. 하나의 구현예에서 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E, 및/또는 PVA236 이다 (PVA236 은 IgG1 의 아미노산 위치 233 에서 236 까지의 아미노산 서열 ELLG (1 글자 아미노산 코드로 제공됨) 또는 IgG4 의 EFLG 가 PVA 로 대체된 것을 나타냄). 하나의 구현예에서 돌연변이는 IgG4 의 S228P, 및 IgG1 의 L234A 및 L235A 이다. 항체의 Fc-영역은 ADCC (항체-의존성 세포-매개 세포독성) 및 CDC (보체-의존성 세포독성) 에 직접 관여한다. Fcγ 수용체 및/또는 보체 인자 C1q 에 결합하지 않는 복합체는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 유발하지 않는다. 놉 수식은 항체의 CH3 도메인 내의 돌연변이 T366W 를 나타낸다 (Kabat 에 따른 번호지정). 홀-수식은 항체의 CH3 도메인 내의 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 나타낸다. 놉 및 홀 수식에 더하여 하나의 CH3 도메인 내에 돌연변이 S354C 및 다른 CH3 도메인 내에 돌연변이 Y349C 가 존재할 수 있다.
용어 "골격 (framework)" 또는 "FR" 은 과가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 언급한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 에서 다음 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체" 는 본원에서 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 언급할 때 호환되게 사용된다.
"유전자" 는 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 염색체 또는 플라스미드의 분절인 핵산을 나타낸다. 코딩 영역, 즉 구조 유전자 외에, 유전자는 기타 기능적 구성원 예를 들어 신호 서열, 프로모터(들), 인트론, 및/또는 종결자를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물" 은 호환되게 사용되고, 외인성 핵산이 내부에 도입된 세포를 언급하며, 그러한 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 를 포함하며, 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 내용에서 완전히 일치하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.
"인간 항체" 는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 언급한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2 개의, 가변 도메인을 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 HVR 에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 FR 에 해당한다. 인간화 항체는 인간 항체에서 유래하는 항체 불변 영역의 일부 이상을 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열에서 과가변이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("과가변 루프") 를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 각각 언급한다. 일반적으로, 천연 4-사슬 항체는 6 개의 HVR 을 포함한다; VH 에 3 개 (H1, H2, H3), 및 VL 에 3 개 (L1, L2, L3). HVR 은 일반적으로 과가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역 영역" (CDR) 으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 최고 서열 가변성을 갖고/거나 항원 인식에 관여한다. 예시적 과가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생한다 (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). 예시적 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 24-34, L2 의 50-56, L3 의 89-97, H1 의 31-35B, H2 의 50-65, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (Kabat, E.A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). VH 에서의 CDR1 을 제외하고, CDR 은 과가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 일반적으로 포함한다. CDR 은 항원과 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기", 또는 "SDR" 을 또한 포함한다. SDR 은 단축된-CDR, 또는 a-CDR 로 호칭되는 CDR 의 영역 내에 함유되어 있다. 예시적 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3) 은 L1 의 아미노산 잔기 31-34, L2 의 50-55, L3 의 89-96, H1 의 31-35B, H2 의 50-58, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다 (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). 다르게 언급되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본원에서 상기 Kabat 등에 따라 번호지정된다.
"내부 리보솜 진입 부위" 또는 "IRES" 는 IRES 의 5' 에 있는 유전자로부터 독립적인 번역 개시를 기능적으로 촉진하고 동물 세포 내에서 단일 전사물로부터 2 개의 시스트론 (오픈 리딩 프레임) 이 번역되는 것을 허용하는 서열을 기술한다. IRES 는 그것의 바로 하류 (하류는 본원에서 3' 와 호환되게 사용됨) 에 있는 오픈 리딩 프레임의 번역을 위한 독립적 리보솜 진입 자리를 제공한다. 다시스트론성, 즉 mRNA 로부터 순차적으로 번역되는 여러 개의 상이한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있는 박테리아 mRNA 와는 달리, 동물 세포의 대부분의 mRNA 는 단일시스트론성이고 오직 하나의 단백질의 합성에 대해 코딩한다. 진핵 세포 내의 다시스트론성 전사물의 경우, 번역은 5' 끝 번역 개시 자리로부터 개시하여 제 1 종결 코돈에서 종결할 것이고, 전사물은 리보솜으로부터 방출되어, mRNA 내의 첫번째 인코딩된 폴리펩티드만의 번역을 초래할 것이다. 진핵 세포에서, 전사물 내의 두번째 또는 후속 오픈 리딩 프레임에 작동가능하게 연결된 IRES 를 갖는 다시스트론성 전사물은 하류 오픈 리딩 프레임의 순차적 번역을 허용하여 동일한 전사물에 의해 인코딩되는 둘 이상의 폴리펩티드를 생성한다. 벡터 구축에서 IRES 구성원의 사용은 이전에 기재된 바 있으며, 예를 들어, Pelletier, J. 등, Nature 334 (1988) 320-325; Jang, S.K. 등, J. Virol. 63 (1989) 1651-1660; Davies, M.V. 등, J. Virol. 66 (1992) 1924-1932; Adam, M.A. 등, J. Virol. 65 (1991) 4985-4990; Morgan, R.A. 등 Nucl. Acids Res. 20 (1992) 1293-1299; Sugimoto, Y. 등, Biotechnology 12 (1994) 694-698; Ramesh, N. 등, Nucl. Acids Res. 24 (1996) 2697-2700; 및 Mosser, D.D. 등, BioTechniques 22 (1997) 150-152) 을 참조한다.
본원에 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체들은 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하며, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생성 동안 발생하는 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체는 제외한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프) 를 향하는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자를 향한다. 따라서, "모노클로날" 이란 수식어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-표시 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 (transgenic) 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 기타 예시적 방법들은 본원에 기재되어 있다.
"본래 항체 (native antibody)" 는 구조를 다변화하며 자연적으로 발생한 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본래 IgG 항체는 디설파이드 결합으로 결합되어 있는 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N- 에서 C-말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 영역 (VH) 을 갖고 있으며, 후속하여 3 개의 불변 도메인 (CHI, CH2, 및 CH3) 을 갖고 있다. 유사하게, N- 에서 C-말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭되는 가변 영역 (VL) 을 갖고 있으며, 후속하여 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖고 있다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파 (κ) 및 람다 (λ) 로 지칭되는 두가지 유형 중 한가지로 지정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "핵산" 은 개별 뉴클레오티드 (또한 염기로 호칭됨) a, c, g, 및 t (또는 RNA 에서 u) 로 이루어지는 중합체성 분자, 예를 들어 DNA, RNA, 또는 그의 변형물을 언급한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자 또는 합성 폴리뉴클레오티드 분자 또는 하나 이상의 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자와 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드 분자의 조합일 수 있다. 또한 이러한 정의에 포함되는 것은 하나 이상의 뉴클레오티드가 변화된 (예를 들어 돌연변이유발에 의해), 결실된, 또는 부가된 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자이다. 핵산은 단리되거나, 또다른 핵산 내에, 예를 들어 발현 카세트, 플라스미드, 또는 숙주 세포의 염색체 내에 편입될 수 있다. 핵산은 마찬가지로 개별 뉴클레오티드로 이루어지는 그것의 핵산 서열에 의해 특징지어진다.
예를 들어 폴리펩티드의, 아미노산 서열을 이러한 아미노산 서열을 인코딩하는 상응하는 핵산 서열로 전환하는 절차 및 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러므로, 핵산은 개별 뉴클레오티드로 이루어지는 그것의 핵산 서열에 의해 그리고 마찬가지로 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특징지어진다.
본원에서 사용되는 "핵산" 은 또한 재조합 생산될 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 발생적 또는 일부 또는 완전 비-자연 발생적 핵산을 언급한다. 핵산은 화학적 방법에 의해 단리 또는 합성되는 DNA-단편으로 구성될 수 있다. 핵산은 또다른 핵산 내에, 예를 들어 발현 플라스미드 또는 진핵생물 숙주 세포의 게놈/염색체 내에 편입될 수 있다. 플라스미드는 셔틀 및 발현 플라스미드를 포함한다. 전형적으로, 플라스미드는 각각 원핵생물 내에서 플라스미드의 복제 및 선별을 위한, 복제 기점 (예를 들어 ColE1 복제 기점) 및 선별 마커 (예를 들어 암피실린 또는 테트라사이클린 저항성 유전자) 를 포함하는 원핵생물 증식 유닛을 또한 포함할 것이다.
"작동가능하게 연결된" 은 둘 이상의 구성요소의 병렬배치를 언급하며, 여기서 그렇게 기술된 성분들은 그들이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서가 시스 위치에서 연결된 서열의 전사를 제어 또는 조정하는 작용을 하는 경우 프로모터 및/또는 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 그러나 비필수적으로, "작동가능하게 연결된" DNA 서열은 인접해 있고, 2 개의 단백질 인코딩 영역 예컨대 분비형 리더 및 폴리펩티드를 연결할 필요가 있는 경우, 인접해 있고 (리딩) 프레임 내에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 상류에 위치하지만, 그것과 반드시 인접해 있을 필요는 없다. 인핸서는 인접해 있을 필요가 없다. 인핸서가 코딩 서열을 전사를 증가시키는 경우 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 상류에, 내부에 또는 하류에 그리고 프로모터로부터 상당히 먼 곳에 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 자리가 코딩 서열의 하류 말단에 위치하여 코딩 서열을 통해 폴리아데닐화 서열까지 진행하는 경우 폴리아데닐화 자리는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 번역 종결 코돈이 코딩 서열의 하류 말단 (3' 말단) 에 위치하여 번역이 코딩 서열을 통해 종결 코돈까지 진행하고 거기에서 종결하는 경우 번역 종결 코돈은 엑손 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 연결은 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해, 예를 들어, PCR 기법을 사용하여 및/또는 편리한 제한효소 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 편리한 제한효소 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 관습에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다.
"다시스트론성 전사 유닛" 은 1 개 초과의 구조 유전자가 동일한 프로모터의 제어 하에 놓인 전사 유닛이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리아데닐화 신호" (polyA 신호) 는 특정 핵산 서열 분절의 일차 전사물의 절단 및 폴리아데닐화를 유도하는데 사용되는 핵산 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3' 비번역 영역은 SV40 에서 유래하는 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3' 비번역 영역, 소 성장 호르몬 (bGH) 에 대한 유전자, 면역글로불린 유전자, 및 티미딘 키나제 유전자 (tk, 예를 들어 단순 포진 티미딘 키나제 폴리아데닐화 신호) 로 이루어지는 군으로부터 선별될 수 있다.
"프로모터" 는 그것이 작동가능하게 연결되어 있는 유전자/구조 유전자 또는 핵산 서열의 전사를 제어하는 폴리뉴클레오티드 서열을 언급한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제 결합 및 전사 개시를 위한 신호를 포함한다. 사용되는 프로모터는 선택된 서열의 발현이 고려되는 숙주 세포의 세포 유형에서 기능을 발휘할 것이다. 여러가지 상이한 출처로부터의 구성성 (constitutive), 유도성 (inducible) 및 억제성 (repressible) 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터가 당업계에 잘 공지되어 있고 (진뱅크 (BenBank) 와 같은 데이터베이스에서 확인할 수 있고), 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 클로닝된 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 구성원로서 입수가능하다 (예를 들어, ATCC 와 같은 기탁기관 뿐만 아니라 다른 상업적 또는 개별 공급처로부터).
"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 유도하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 자리에 인접한, 유전자의 5' 비-코딩 또는 비번역 영역에 위치한다. 전사의 개시에서 기능을 발휘하는 프로모터 내의 서열 구성원은 종종 공통 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 구성원은 RNA 폴리머라제 결합 자리, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 구성원 (DSE; McGehee, R.E. 등, Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551), 시클릭 AMP 응답 구성원 (CRE), 혈청 응답 구성원 (SRE; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47), 글루코코티코이드 응답 구성원 (GRE), 및 기타 전사 인자, 예컨대 CRE/ATF (O'Reilly, M.A. 등, J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938), AP2 (Ye, J. 등, J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728), SP1, cAMP 응답 구성원 결합 단백질 (CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253) 및 옥타머 인자 (일반적으로, Watson et al., (eds.), Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1987)), 및 Lemaigre, F.P. and Rousseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14 참조) 에 대한 결합 자리를 포함한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 응답하여 증가한다. 대조적으로, 프로모터가 구성성 프로모터인 경우 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다. 억제성 프로모터도 공지되어 있다. 예를 들어, c-fos 프로모터는 성장 호르몬이 세포 표면 위의 그것의 수용체에 결합되었을 때 특이적으로 활성화된다. 테트라사이클린 (tet) 에 의해 조절되는 발현은 예를 들어, CMV 프로모터에 이어서 2 개의 Tet-오퍼레이터 (operator) 자리로 이루어지는 인공 하이브리드 프로모터에 의해 달성될 수 있다. Tet-리프레서는 2 개의 Tet-오퍼레이터 자리에 결합하여 전사를 차단한다. 유도제인 테트라사이클린을 첨가하였을 때, Tet-리프레서가 Tet-오퍼레이터 자리로부터 방출되고 전사가 진행된다 (Gossen, M. and Bujard, H., PNAS 89 (1992) 5547-5551). 메탈로티오네인 및 열 충격 프로모터를 포함하는 다른 유도성 프로모터에 대해서는 예를 들어, 상기 Sambrook 등의 문헌 및 Gossen 등, Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520 을 참조한다. 진핵생물 프로모터 중에서 고도 발현을 위한 강력한 프로모터로서 확인된 진핵생물 프로모터는 SV40 조기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스 장말단 반복부, 차이니스 햄스터 연장 인자 1 알파 (CHEF-1, 예를 들어, US 5,888,809 참조), 인간 EF-1 알파, 유비퀴틴 및 인간 사이토메갈로바이러스 즉시 조기 프로모터 (CMV IE) 이다.
"프로모터" 는 구성성 또는 유도성일 수 있다. 프로모터만을 사용하였을 때 얻어지는 발현 수준을 증가시키기 위해 프로모터와 함께 인핸서 (enhancer) (즉, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는 시스-작용 DNA 구성원) 가 작용할 필요가 있을 수 있고, 상기 인핸서는 전사 조절 구성원로서 포함될 수 있다. 종종, 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분절은 인핸서 서열도 포함할 것이다 (예를 들어, CMV 또는 SV40).
본 출원에서 사용되는 용어 "안정적으로 형질전환된", "안정적으로 트랜스펙션된", 또는 "안정적" 은 외인성 핵산이 숙주 세포 게놈/염색체 내로 유전가능하게 안정적으로 편입됨을 나타낸다. 안정적으로 트랜스펙션된 세포는 선별적 성장 조건 하의, 즉 하나 이상의 선별 마커의 존재 하의 세포 선별 과정 후에 수득된다.
"구조 유전자" 는 신호 서열이 없는 유전자의 영역, 즉 코딩 영역을 나타낸다.
용어 "전사 종결자" 는 RNA 폴리머라제에게 mRNA 합성 종결 신호를 제공하는 50-750 염기쌍 길이의 DNA 서열을 나타낸다. 특히 강력한 프로모터를 사용하는 경우 RNA 폴리머라제가 통과해서 해독 (read-through) 하는 것을 방지하기 위해 발현 카세트의 3' 말단에 매우 효율적인 (강력한) 종결자가 권장된다. 비효율적인 전사 종결자는 오페론-유사 mRNA 의 형성을 초래할 수 있으며, 이는 원치 않는, 예를 들어 플라스미드-코딩된, 유전자 발현의 원인이 될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, 트랜스펙션된 세포는 당업계에 공지된 실질적으로 임의의 종류의 트랜스펙션 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 전기천공법 또는 미세주입법을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 리포펙션 시약 예컨대 FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Germany), X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH, Germany), 및 LipofectAmine (Invitrogen Corp., USA) 이 사용될 수 있다. 더욱 대안적으로, 핵산은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스에 기초하는 적당한 바이러스 벡터 시스템에 의해 세포 내로 도입될 수 있다 (Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314).
본 출원에서 사용되는 용어 "일시적 트랜스펙션" 은 세포 내에 도입된 핵산이 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 편입되지 않는 과정을 나타낸다. 그것은 실제로 세포 내에서 염색체외 구성원로서, 예를 들어 에피솜으로서 유지된다. 에피솜의 핵산의 전사 과정은 영향을 받지 않고, 예를 들어 에피솜의 핵산에 의해 인코딩되는 단백질이 생산된다. 일시적 트랜스펙션은 "일시적 트랜스펙션된" 세포를 초래한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 언급한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. 등, Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y.(2007), 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 게다가, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 특정 항원에 결합하는 항체가 단리될 수 있다 (예를 들어, Portolano, S. 등, J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. 등, Nature 352 (1991) 624-628 참조).
본원에서 사용되는 용어 "벡터" 는 그것이 연결되는 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 작동가능하게 연결되어 있는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로 언급된다.
항체
재조합 모노클로날 항체의 생산을 위한 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다. 항체는 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 조작, 1 가 항체, 다가 항체 (예를 들어 2 가 항체) 와 같은 다양한 구조를 가질 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
특정 구현예에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 기타 하기 단편들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 리뷰에 대해, Hudson, P.J. 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134 를 참조한다. scFv 단편의 리뷰에 대해, 예를 들어 Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315 를 참조한다; 또한 WO　1993/16185; 및 US　5,571,894 및 US　5,587,458 을 참조한다. 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해 US　5,869,046 을 참조한다.
다이아바디는 2 가 또는 이중특이성일 수 있는 2 개의 항원-결합 자리를 갖는 항체 단편이다 (예를 들어, EP　0　404　097; WO　1993/01161; Hudson, P.J. 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조). 트리아바디 (triabody) 및 테트라바디 (tetrabody) 가 또한 Hudson, P.J. 등, Nat. Med. 9 (2003) 129-134) 에서 기재된다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, US　6,248,516 참조).
항체 단편은 본원에서 기술된 온전한 항체의 단백질가수분해 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어 대장균 또는 파지) 에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
특정 구현예에서, 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체가, 예를 들어, US 4,816,567; 및 Morrison, S.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유래하는 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성은 감소되지만, 여전히 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 내부의 HVR, 예를 들어, CDR (또는 그의 일부) 은 비-인간 항체에서 유래하고, FR (또는 그의 일부) 은 인간 항체 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로 인간 불변 영역의 일부 이상을 또한 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선하도록, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기가 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법이, 예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 에서 리뷰되어 있고, 또한 예를 들어, Riechmann, I. 등, Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, 및 US 7,087,409; Kashmiri, S.V. 등, Methods 36 (2005) 25-34 (SDR (a-CDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("재포장 (resurfacing)" 을 기재함); Dall'Acqua, W.F. 등, Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 Osbourn, J. 등, Methods 36 (2005) 61-68 및 Klimka, A. 등, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "인도되는 선별 (guided selection)" 접근을 기재함) 에 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: "최적-적합 (best-fit)" 방법을 사용하여 선별된 골격 영역 (예를 들어, Sims, M.J. 등, J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Carter, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G. 등, J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식선 골격 영역 (예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Baca, M. 등, J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J. 등, J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618 참조).
특정 구현예에서 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 및 Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459 에 일반적으로 기술되어 있다.
인간 항체는 항원 공격에 응답하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하며, 이러한 인간 면역글로불린 유전자좌는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대신하거나, 염색체외에 존재하거나, 동물의 염색체 내로 무작위로 편입되어 있다. 그러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰에 대해, Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125 및 또한, 예를 들어, US 6,075,181 및 US 6,150,584 (XENOMOUSE™ 기술을 기재함); US 5,770,429 (HuMab® 기술을 기재함); US 7,041,870 (K-M MOUSE® 기술을 기재함), 및 US 2007/0061900 (VelociMouse® 기술을 기재함) 을 참조한다. 그러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 추가로 수식될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주가 기재된 바 있다 (예를 들어, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; 및 Boerner, P. 등, J. Immunol. 147 (1991) 86-95 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체도 또한 Li, J. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562 에 기술되어 있다. 부가적 방법은, 예를 들어, US 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (인간-인간 하이브리도마를 기재함) 에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology) 은 또한 Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 및 Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191 에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 표시 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그러한 가변 도메인 서열은 그 후 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술이 아래 기재되어 있다.
항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 표시 라이브러리를 생성하고 상기 라이브러리를 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들어, Hoogenboom, H.R. 등, Methods Mol. Biol. 178 (2002) 1-37 에서 리뷰되어 있고, 또한 예를 들어, McCafferty, J. 등, Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. 등, Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. 등, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. 등, J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. 등, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; 및 Lee, C.V. 등, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132 에 기재되어 있다.
특정 파지 표시 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 별도로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이것이 그 후 Winter, G. 등, Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455 에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 표시한다. 면역화된 공급원으로부터 얻은 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, Griffiths, A.D. 등, EMBO J. 12 (1993) 725-734 에 기재된 바와 같이 나이브 (naive) 레퍼토리를 클로닝하여 (예를 들어, 인간으로부터) 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 에 기재된 바와 같이 나이브 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개공보는, 예를 들어, US 5,750,373, 및 US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936, 및 US 2009/0002360 을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 자리에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나는 제 1 항원에 대한 것이고, 다른 하나는 상이한 제 2 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 동일한 항원의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 항원을 발현하는 세포로 세포독성제를 국소화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현 (Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A. 등, EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조) 을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이합체 분자를 제조하기 위한 정전 스티어링 (steering) 효과를 조작하고 (WO 2009/089004); 2 개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시키고 (예를 들어, US 4,676,980, 및 Brennan, M. 등, Science 229 (1985) 81-83 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 생성하고 (예를 들어, Kostelny, S.A. 등, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술을 사용하고 (예를 들어, Holliger, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조); 단일-사슬 Fv (sFv) 이합체를 사용하고 (예를 들어 Gruber, M. 등, J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참조); 예를 들어, Tutt, A. 등, J. Immunol. 147 (1991) 60-69 에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 (Octopus) 항체" 를 포함하여, 3 개 이상의 기능성 항원 결합 자리를 갖는 조작된 항체도 또한 본원에 포함된다 (예를 들어 US 2006/0025576 참조).
항체는 제 1 항원 뿐만 아니라 또다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 자리를 포함하는 "이중 작용 Fab (Dual Acting Fab)" 또는 "DAF" 일 수 있다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
항체 또는 단편은 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 또는 WO 2010/145793 에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체일 수 있다.
방법
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 항체가 글리코실화되는 정도를 변경, 즉 증가 또는 감소시키는데 사용된다.
항체가 Fc-영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로, 일반적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 N-연결에 의해 부착되어 있는 분지형 바이안테너리 (biantennary) 올리고당을 포함한다 (예를 들어, Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32 참조). 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라, 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc 에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발명의 항체 중 올리고당의 수식은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 창조하기 위해 수행될 수 있다
하나의 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 Fc-영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 항체의 생산을 초래한다. 예를 들어, 그러한 항체 중 푸코스의 양은 1% ~ 80%, 1% ~ 65%, 5% ~ 65% 또는 20% ~ 40% 일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546 에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정되는 Asn 297 에 부착된 모든 당구조 (예를 들어 복합, 하이브리드 및 하이 만노스 구조) 의 합계에 대한 Asn297 에서의 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297 은 Fc-영역 내의 위치 297 (Fc-영역 잔기의 Kabat 에 따른 EU 번호지정) 주위에 위치하는 아스파라긴 잔기를 나타낸다; 그러나, Asn297 은 또한 항체 내의 작은 서열 변이로 인해 위치 297 의 상류 또는 하류의 약 ±3 아미노산, 즉, 위치 294 와 300 사이에 위치할 수도 있다. 그러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다 (예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조). "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki, A. 등, J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. 등, Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. 탈푸코실화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka, J. 등, Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11 에서), 및 넉아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki, N. 등, Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. 등, Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; 및 WO 2003/085107 참조) 를 포함한다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은, 예를 들어, 항체의 Fc-영역에 부착된 바이안테너리 올리고당이 GlcNAc 에 의해 이등분되어 있는, 이등분된 올리고당을 갖는 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 그러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546 에 기재되어 있다. Fc-영역에 부착된 올리고당 내에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 포함하는 항체 변이체가 또한 생산될 수 있다. 그러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764 에 기재되어 있다.
항체는, 예를 들어, US 4,816,567 에 기재된 바와 같은, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 핵산은 항체의 VL 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄) 을 인코딩할 수 있다. 추가의 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가의 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 그러한 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어, 하기로 형질전환되었다): (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프양 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0) 또는 인간 배아 신장 세포 (HEK293) 이다. 하나의 구현예에서, 위에 제공된 바와 같은, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는 항체 제조 방법이 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서의 후속 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 그러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc-영역 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 조각 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523 참조; 또한 대장균에서의 항체 조각의 발현을 기재하는 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 참조. 발현 후, 항체는 가용성 분획 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 외에도, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어 일부 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함한다 (Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. 등, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참조).
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다 (예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서의 항체 생성을 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함) 참조).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응시킨 포유류 세포주가 유용할 것이다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 기타 예는 SV40 (COS-7) 로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인; 인간 배아 신장 라인 (예를 들어, Graham, F.L. 등, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방암 (MMT 060562); 예를 들어, Mather, J.P. 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유류 숙주 세포주는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR 음성 (DHFR(-)) CHO 세포 (Urlaub, G. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰에 대해, 예를 들어, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268 을 참조한다.
II. 본 발명의 구체적 국면
발현 벡터의 벡터 구성에 따라 발현 벡터의 성능이 (1) 벡터 디자인에 있어서 상이하며, (2) 동일한 벡터에 대해서는 일시적 및 안정한 트렌스펙션 사이에서 상이하다는 것이 발견되었다.
일시적 및 안정한 트렌스펙션을 위한 최적의 벡터 구성은 명백하게 상이할 수 있다는 것을 발견했다. 이론에 구애됨이 없이, 그러한 차이점에 기여할 몇가지 사항이 고려될 수 있다: 1) 각 벡터 디자인에 좌우되며, 그에 대해 특이적인 숙주 유전체 내 통합되는 벡터 카피들 사이의 전사 간섭 현상으로서, 일시적 시스템에는 존재하지 않는 현상, 2) 각 벡터 구성에 좌우되며, 일시적 시스템이 아닌 안정한 시스템에서 중요한 역할을 하게 되는 선별 프로세스 및 선별 엄격성의 영향, 및 3) 모노클로날 항체의 일시적 및 안정한 발현에 대해 분명히 상이하며, 안정한 트렌스펙션보다는 일시적 트렌스펙션에서 더 낮은 최적의 LC 대 HC 폴리펩티드 비율.
일시적 트렌스펙션에 대해, LC 및 HC 의 양방향성 발현은 모든 시험한 벡터 구성의 최고 생산 역가에 도달한다는 것을 발견했다. 이론에 구애됨 없이, 그러한 벡터 디자인은 최적의 IgG 발현을 위한 두 기준인 A) LC 및 HC 폴리펩티드의 높은 발현 수준 및 B) 최적의 "일시적" LC 대 HC 폴리펩티드 비율을 충족하며, 그리고 C) LC 및 HC 의 양방향성 발현이 RNA 폴리머라아제의 번역초과 유효성 (read through effects) 으로서 전사 간섭 메커니즘을 최소화하는 것으로 추정된다.
그러나, 안정적 트랜스펙션의 경우, LC 및 HC 의 양방향 발현은 열 구성 HC-LC-SM 에서보다 나빴다는 것이 밝혀졌다. 하기 이론에 구속되지 않으면서 1) LC, HC 및 SM 에 대한 발현 카세트의 수렴 구성은 편입된 벡터 카피 사이의 전사 간섭 현상을 감소시킬 수 있고, 2) LC 의 상류에 있는 HC 는 안정적 트랜스펙션에 (더욱) 최적인 LC 대 HC 폴리펩티드 비율을 명백히 용이하게 하고, 3) 선별 마커의 하류 위치는 선별 엄격성 (stringency) 을 명백히 증가시킨다. 더욱이, IgG 생산 세포의 백분율 및 세포주의 생산성이 증가하는 것으로 밝혀졌다. 항체 발현 카세트의 상류에 양방향으로 선별 마커를 함유하는 벡터에 대한 선별압의 농도를 증가시켜도 안정한 모음 또는 클론의 생산성은 증가하지 않았지만 선별 엄격성은 명백히 증가했다 (데이타는 제시되지 않음).
hCMV 프로모터 및 SV40 다중 신호 (poly signal) 의 hEFlα 프로모터 및 bGH polyA 신호에 의한 부수적 교환이, 항체 발현 카셋트를 단일방향성으로 구성한 경우에는 일시적 생산 역가를 현저히 증대시키나, LC 및 HC 발현 카셋트가 양방향성으로 위치하는 경우에는 생산 역가를 감소시키는 것으로 나타났다.
hEF1α 프로모터는 많은 수의 고-생산 및 매우 적은 수의 비- 또는 저-생산 클론을 생성한다고 밝혀졌다. 그러나, 유가식 (fed-batch) 분석에서 hEF1α 프로모터의 최선 개별 클론에 대한 생산 역가는 hCMV 프로모터의 클론에 대한 생산 역가보다 낮았다. 그러나 hCMV 프로모터에 대한 탑 (top) 클론의 전체 수는 비교적 적고, 그들의 식별은 통상적으로 큰 스크리닝 노력을 요구한다.
hGT 의 사용은 일시적이나 안정한 트랜스펙션에서 SV40 또는 bGH polyA 신호와 조합될 때 hCMV 프로모터를 함유하는 벡터에 대한 생산성을 유의하게 증가시켰음이 밝혀졌다. 그러나, hEf1α 프로모터를 함유하는 벡터의 경우, bGH polyA 신호와 조합될 때 생산 역가에 대한 그것의 효과는 미미했다. 따라서, 벡터 성능에 대한 hGT 의 영향은 사용되는 프로모터에 의존적임이 밝혀졌다.
완전히 제어되는 대규모 발효에서 최종 평가에 적절한 클론의 선택은 통상적으로 셰이크 (shake) 플라스크 내에서의 회분식 (batch) 또는 유가식 (fed-batch) 분석에 기초한다. 회분식 및 유가식 분석 사이에 일부 발현 벡터 또는 구성원의 성능 및 순위 차이가 존재함이 밝혀졌다. SV40 polyA 를 bGH polyA 신호로 대체하는 경우 hCMV 프로모터를 함유하는 벡터에 대한 생산성은 회분식 분석에서는 증가했지만 유가식 분석에서는 증가하지 않았다. hGT 는 클론의 생산 역가에 대해 회분식 분석에서는 유의한 영향을 미치지 않았지만 유가식 분석에서는 유의한 영향을 미쳤다. 회분식 및 유가식 사이의 벡터 성능의 절대 차이는 부분적으로 달랐다. 선별 마커의 위치 또는 프로모터 (hEf1α 또는 hCMV 프로모터) 가 상이한 벡터 사이의 차이는 회분식 분석에서는 다소 현저했으나 유가식 분석에서는 매우 명백했다. 발현 수준 및 구체적 생산율은 회분식에서보다 유가식에서 더 높다.
절대 생산 역가의 수준 뿐만 아니라, 상이한 벡터 및 클론 사이의 순위에서, 대부분의 클론에 대해 2L 발효와 유가식 분석의 성능에서 양호한 상관관계가 밝혀졌다.
선별 마커의 하류 위치는 항체 발현 카세트 상류의 선별 마커의 양방향 위치에 비해 생산성 손실을 약간 감소시킴이 밝혀졌다. 이론에 구속되지 않으면서, 이는 증가된 선별 엄격성 및 이에 따른 더 높은 mRNA 수준으로 인한 것이거나, 개선된 LC 대 HC mRNA 또는 폴리펩티드 비율에 의한 것일 수 있다. 2 가지 인자 모두 생산성 변화에 대한 더 높은 톨러런스 (tolerance) 를 초래할 수 있다.
bGH polyA 신호는 SV40 polyA 신호에 비해 클론에서 항체 발현의 안정성을 유의하게 감소시켰다. 그러나, bGH polyA 신호의 하류에 hGT 를 삽입하는 경우 발현 안정성이 명백히 증가했다. 안정성에 대한 hGT 의 양성 효과는 선별압의 부재시에 가장 명백했다.
안정한 모음의 안정성 분석으로 세포가 hCMV 로 생성된 경우에는 생산성을 신속히 상실했으나 hEf1α 프로모터로 생성된 경우에는 그렇지 않음이 밝혀졌다. 명백히, hGT 는 hEf1α 프로모터 함유 벡터에 대한 클론의 생산성은 감소시켰지만 그것의 안정성은 약간 증가시켰다.
선별 과정 후에 클론의 적은 일부만이 항체를 유의하게 생산했다. 그러나, 구성 및/또는 구성원에서의 벡터 개질은 IgG 생산 대 비-생산 클론 비율을 유의하게 증가시켰다. 상이한 벡터 구성 및 이에 따른 선별 엄격성을 결정하는 선별 마커의 상이한 발현 수준도 IgG 생산 세포의 백분율에 명백한 영향을 미친다. 스크리닝 과정의 데이타에 기초하는 통계 시뮬레이션으로 일부 발현 벡터가 스크리닝 과정 동안 작업 부하를 상당히 감소시킬 수 있는 잠재력을 또한 보유함이 입증되었다. 이 사실은 생물약제 회사의 비용에 큰 영향을 미친다.
전사 프로세스의 개선
프로모터에 의한 전사 개시
프로모터는 유전자의 전사 수준을 결정하며, 따라서 세포주의 생산성 및 안정성에 강력한 영향력을 갖는다:
- 프로모터에 의해 중재되는 전사 개시는 재조합 단백질로 번역될 수 있는 mRNA 의 양을 결정함;
- 안정한 통합에도 불구하고, 클론의 장기간 생산성은 신속히 감소될 수 있음 ((예를 들어, 프로모터 메틸화에 의한) 유전자의 유전자 침묵화의 결과임);
- 프로모터 활성이 세포 유형에 따라 좌우됨.
다양한 세포주에서 강력한 프로모터로 나타난 프로모터들이 기재되어 있다. 인트론이 인핸서형 구성원들을 포함할 수 있는 것으로 공지되었다. 종종, 제 1 인트론 (Intron A) 은 대부분의 조절 구성원들을 포함한다. 그 Intron A 는 전장 자연 프로모터 서열/구성에서 최초로 나타나는 인트론이다.
poly A 신호에 의해 중재되는 mRNA 의 폴리아데닐화
mRNA 의 폴리아데닐화는 다양한 기능을 갖는다. 이는 핵 밖으로의 mRNA 이출, 번역 개시 및 mRNA 안정성에 강력히 영향을 준다. 따라서, 폴리아데닐화 프로세스의 효율은 유전자의 발현 수준에 강력한 영향을 주고, 그에 따라 생산성에 강력한 영향을 준다.
여러 간행물에서는 폴리아데닐화 신호가 단백질 발현에 강력한 영향력을 가질 수 있다는 점을 제시한 바 있다. 소 생장 호르몬에 의해 유도되는 polyA 신호 (bGH polyA 신호) 는 SV40 polyA 신호를 대체했을 때 강화된 단백질 발현을 결과로서 제공할 수 있다.
소 생장 호르몬 polyA 신호는 항체 사슬의 재조합적 제조에서 개선된 특성을 가질 수 있는 것으로 나타났다.
전사 종결자에 의해 뒷받침되는 전사 종결
발현 벡터에 포함되어 있는 구성원들은 서로 강력하게 간섭할 수 있다 (전사 간섭). 이는 전사 프로세스 동안의 경쟁으로 인한 것이다. 예를 들어, 입체장애 및 전사 기계류 (transcription machinery) 의 공급원의 줄어든 이용가능성으로 인한 전사 인자 및/또는 RNA 폴리머라아제에 대한 차선의 프로모터 접근. 간섭은 또한 발현 카셋트에 이웃하고 있는 상이한 것들 사이에 일어날 수 있다. 예를 들어, 불충분한 전사 종결로 인한 제 1 발현 단위체로부터 제 2 발현 단위체까지의 RNA 폴리머라아제의 해독 (read through) 이 일어날 수 있다.
불충분한 전사 종결이 전사 간섭을 유도하여, 유전자의 불충분한 발현을 제공할 수도 있음이 보고된 바 있다. 인간 가스트린 유전자 전사 종결자 (hGT) 의 이용은 전사 종결을 개선할 수 있으며, 따라서 재조합 단백질의 강화된 발현에 기여하게 된다. 그러한 유효성은 hGT 가 조합되어 있는 프로모터에 좌우된다. 나아가, 유효한 전사 종결자가 공지되어 있다.
항체 발현 카셋트의 초기 SV40 polyA 신호 다음의 인간 가스트린 전사 종결자의 서열 삽입에 의해, 강화된 전사 종결 및, 예를 들어 항체 경쇄 및 항체 중쇄 사이의, 전사 간섭 방지가 달성될 수 있다는 것을 발견했다.
결과
본원에는 예를 들어 항체 사슬을 인코딩하는 구조 유전자의 하나 이상의 코딩 핵산의 강화된 발현을 위한 발현 벡터가 보고되어 있다.
구조 유전자를 발현하는 재조합 세포의 생산성은 전사에 필요한 유전자 구성원들이 적절히 선택되어 배열되는 경우에 개선된다는 것이 발견되었다.
- polyA 신호 서열 및 전사 종결자 서열
벡터 p5068 에서, 발현 카셋트는 SV40 polyA 신호에 의해 종결된다.
벡터 px6001 에서, 발현 카셋트는 SV40 PolyA 신호의 하류방향에 위치된 인간 가스트린 전사 종결자를 추가적으로 포함했다.
벡터 px6007 에서, 발현 카셋트는 bGH polyA 신호 및 hGT 전사 종결자에 의해 종결되었다.
벡터 px6008 에서, 발현 카셋트는 추가적인 전사 종결자 없이 bGH polyA 신호에 의해 종결되었다.
그러한 벡터들은 CHO-Kl 세포에 일시적으로 트렌스펙션되고, 트렌스펙션 6 일 후 세포 배양 상청액을 수합하고, 배양 상청액 내 생산된 항체의 양을 ELISA 로 결정했다.
SV40 polyA 신호의 bGH polyA 신호에 의한 치환 및 SV40 polyA 신호 다음의 인간 가스트린 종결자 (hGT) 의 부가/삽입 (벡터 px6001) 은 대조군 벡터 p5068 에 비해 약 45% 내지 30% 의 일시적 발현의 생산성에서의 증가를 초래했다. bGH polyA 신호 및 인간 가스트린 종결자 (hGT) 의 조합은 대조군 벡터 p5068 에 비해 최대의 역가 증가 (+58%) 를 제공했다.
Figure 112019118901262-pat00001
따라서, 일시적 발현 시스템에서, bGH polyA 신호에 의한 폴리아데닐화 및 인간 가스트린 전사 종결자의 부가에 의한 개선된 전사 종결이 항체 분비를 강화하는 것으로 나타났다.
벡터 p5068, px6001, px6007 및 px6008 이 안정한 항체 발현 세포주 생성에 이용되었다.
Figure 112019118901262-pat00002
회분식 항체 제조에서 벡터 p5068 를 이용해 생성된 최선의 15 개 단일 클론의 평균 생산성은 624 ㎍/ml 였다. 벡터 px6001 (인간 가스트린 종결자 (hGT) 포함) 또는 벡터 px6007 (bGH polyA 신호 및 hGT 의 조합 포함) 을 이용해 생성된 클론들은 벡터 p5068 에 비해 각각 23% 및 40% 만큼 증대된 생산성을 지녔다 (벡터 px6001 에 대해서는 770 ㎍/ml, 벡터 px6007 에 대해서는 872 ㎍/ml) (도 1 참조). 생산성에서의 그러한 증가는 또한 탑 클론 수준 (벡터 px6001 에 대해서는 +23% (939 ㎍/ml) 그리고, 벡터 px6007 에 대해서는 +31% (1001 ㎍/ml) 에 반영되며; 값은 각 벡터에 대해 수득되는 3 개의 최선의 클론에 대해 산출되었다).
벡터 px6008 를 이용해 생성되는 클론은 15 개의 최선의 클론의 평균 생산성인 576 ㎍/ml 을 가졌다.
벡터 px6008 에 대한 3 개의 최선 클론의 평균 생산성은 760 ㎍/ml 였다.
- 프로모터 서열
벡터 px6051 에서, 발현 카셋트는 Intron A 및 SV40 polyA 신호가 있는 전장 CMV 프로모터를 포함하여 이루어진다.
벡터 px6052 에서, 발현 카셋트는 인간 EFlα 프로모터 및 SV40 polyA 신호를 포함하여 이루어졌다.
벡터 px6062 에서 발현 카셋트는 Intron A 및 bGH polyA 신호가 있는 전장 인간 CMV 프로모터 및 인간 가스트린 종결자를 포함하여 이루어졌다.
벡터 px6063 에서 발현 카셋트는 인간 EFlα 프로모터 및 bGH polyA 신호 및 인간 가스트린 종결자를 포함하여 이루어졌다.
Figure 112019118901262-pat00003
각 벡터에 대해 수득된 최선의 18 개의 안정한 클론들을 식별해 내고, 클론의 생산성은 회분식 분석으로 시험했다.
bGH polyA 신호 및 hGT 의 조합에 의한 교환은 평균 생산성을 강화한다: hEFlα 프로모터의 경우 약 19% (벡터 px6063 에 대해서는 505 ㎍/ml 대 벡터 6052 에 대해서는 426 ㎍/ml), 전장 hCMV 프로모터의 경우에는 약 71% (벡터 px6062 에 대해서는 333 ㎍/ml 대 벡터 px6051 에 대해서는 195 ㎍/ml).
생산성에서의 증대는 또한 탑 클론 수준에서 나타날 수 있다 (벡터 px6063 에 대해서는 벡터 px6052 (511 ㎍/ml) 대비 +36% (693 ㎍/ml), 및 벡터 px6062 에 대해서는 벡터 px6051 (262 ㎍/ml) 대비 +102% (529 ㎍/ml), 값은 각 벡터에 대해 3 개의 최선 클론에 대해 산출됨) (도 2 참조).
따라서, hEFl 알파 프로모터의 bGH polyA 신호 및 hGT 와의 조합이 각 여타 전사 방향에서 중쇄에 대한 발현 카셋트의 상류에 1 개의 전사 방향에서의 선별 마커에 대한 발현 카셋트 및 경쇄에 대한 발현 카셋트가 있는 양방향성 벡터 구성을 이용한 안정한 트렌스펙션에서 생산성을 강화하는 것으로 나타났다 (참조 px6052).
나아가, bGH polyA 신호 및 hGT 의 조합이 후속하여 선별 마커의 발현 카셋트의 상류에 위치되는 중쇄에 대한 발현 카셋트의 상류의 경쇄에 대한 발현 카셋트가 있는 단일방향성 벡터 구성 (LC-HC-SM 발현 카셋트의 5'->3' 방향) (참조 px9005), 또는 각 여타 전사 방향에서 1 개의 전사 방향에서의 선별 마커에 대한 발현 카셋트 및 중쇄에 대한 발현 카셋트의 상류에 경쇄에 대한 발현 카셋트가 있는 양방향성 벡터 구성 (참조 px6007) 을 이용하여 hCMV 프로모터에 대한 안정한 트렌스펙션에서 생산성을 강화하는 것으로 나타났다.
bGH polyA 신호 및 hGT 의 조합이 또한 일시적 트렌스펙션 접근법에 채용되었다. 벡터 px6062 및 px6063 (전장 hCMV 프로모터 또는, bGH polyA 신호 및 hGT 의 조합이 있는 hEFlα 프로모터 포함) 을 벡터 px6051 및 px6052 (전장 hCMV 프로모터 또는 SV40 polyA 신호가 있는 hEFlα 프로모터 포함) 과 직접 비교했다.
안정한 트렌스펙션과는 대조적으로, bGH polyA 신호 및 인간 가스트린 종결자 (hGT) 의 조합은 Intron A 가 있는 전장 인간 CMV 프로모터의 경우에도, Intron A 가 있는 인간 EFlα 프로모터의 경우에도 일시적 트렌스펙션에서 생산성을 증가시키지 않았다 (벡터 px6052 에 대해 2.38 ㎍/ml 대 벡터 px6063 에 대해 2.32 ㎍/ml). Intron A 가 있는 전장 인간 CMV 프로모터의 경우, bGH polyA 신호 및 인간 가스트린 종결자 (hGT) 의 조합이 벡터 px6062A 에 대해서는 2.74 ㎍/ml 의 생산성을, 벡터 px6051 에 대해서는 3.64 ㎍/ml 의 생산성을 제공했다.
일시적 트렌스펙션으로 수득되는 세포에서, 짧은 hCMV 프로모터의 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열 및 인간 가스트린 종결자와의 조합이 개선된 항체 발현 수준을 제공하는 결과를 가져왔다.
안정한 세포 클론의 트렌스펙션 및 선별에 의해 수득되는 세포주에서, 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열 및 인간 가스트린 종결자의 조합이 사용된 프로모터와는 독립적으로 개선된 하에 발현 수율을 제공한다는 것을 발견했다.
벡터 p5068 에서, 항체의 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 의 두가지 모두를 인코딩하는 유전자의 발현은 짧은 인간 CMV 프로모터 (hCMV) 에 의해 구동된다. 상기 프로모터는 광범위한 세포 유형에서 활성이며, 포유류 발현 플라스미드에서 통상적으로 이용된다. 프로모터 활성은 세포 유형에 강력하게 좌우되며, hCMV 프로모터가 프로모터 메틸화와 같은 유전자 침묵화 효과에 대해 민감하다는 것이 공지되어 있으므로, CHO-Kl 세포에서 더욱 강력 및/또는 더욱 내성인 프로모터가 존재한다.
하기 상이한 프로모터를 포함하는 발현 벡터가 구축되었다: i) Intron A 가 없는 짧은 길이 hCMV, ii) Intron A 가 있는 전장 hCMV 프로모터, iii) Intron A 가 있는 전장 ratCMV, 및 iv) Intron A 가 있는 hEFl 알파 프로모터.
전장 hCMV 프로모터 (px6051), hEFlα 프로모터 (px6052) 및 랫트 CMV 프로모터 (px6053) 를 포함하는 벡터를 구축하고, 일시적 및 안정한 트렌스펙션에 이용했다.
Figure 112019118901262-pat00004
발현 벡터 p5068, px6051, px6052, 및 px6053 를 뉴클레오펙션을 이용해 CHO-Kl 세포로 일시적으로 트렌스펙션하고, 트렌스펙션 4 일 후 세포 배양 상청액을 수합하고, 생산성을 ELISA 로 결정했다.
Intron A 가 있는 hEFlα 프로모터를 포함하는 벡터 (px6052) 또는 Intron A 가 있는 전장 hCMV 프로모터를 포함하는 벡터 (px6051) 는 발현 벡터 p5068 에 비해 각각 53% 및 134% 만큼 증대된 생산성을 가졌다 (벡터 px6051 에 대해서는 3.64 ㎍/ml, 벡터 px6052 에 대해서는 2.38 ㎍/ml, 벡터 p5068 에 대해서는 1.56 ㎍/ml). 그러나, 랫트 CMV 프로모터를 포함하는 벡터 px6053 는 약 50% 감소된 생산성을 나타냈다 (p5068 에 대해 0.8 ㎍/ml) (도 3 참조).
전장 인간 CMV 프로모터를 포함하는 벡터 (벡터 px6051 및 px6062) 또는 Intron A 가 있는 hEFl 알파 프로모터를 포함하는 벡터 (벡터 px6052 및 px6063) 가 또한 안정한 트렌스펙션에 사용되었다.
발현 벡터 p5068, px6051, px6052, 및 px6053 를 뉴클레오펙션으로 CHO-K1 세포에 트렌스펙션하고, 안정한 모음을 선별했다. 모음의 생산성을 회분식 분석으로 분석했다.
안정한 모음의 회분식 분석은 Intron A 가 있는 hEFl 알파 프로모터를 포함하는 벡터 (벡터 px6052) 로 트렌스펙션한 세포로부터의 항체 역가가 짧은 길이 hCMV 프로모터를 포함하는 벡터 (벡터 p5068) 또는 Intron A 가 있는 전장 hCMV 프로모터를 포함하는 벡터 (벡터 px6051) 로 트렌스펙션한 세포의 것에 비해 4 배 초과하여 더 높음을 보여줬다 (벡터 px6052 에 대해서는 78 ㎍/ml, 벡터 p5068 에 대해서는 14 ㎍/ml, 벡터 px6051 에 대해서는 17 ㎍/ml, 벡터 px6053 에 대해서는 8.46 ㎍/ml) (도 4).
발현 벡터 p5068, px6051, 및 px6052 을 이용하여 안정한 클론을 생성했다. 추가적으로, 벡터 px6062 및 px6063 (두가지 모두 SV40 polyA 신호 대신 bGH polyA 신호 및 인간 가스트린 종결자의 조합을 포함함) 을 이용했다.
Figure 112019118901262-pat00005
각 벡터에 대해 수득된 최선의 54 클론의 회분 분석은 벡터 px6052 를 이용해 트렌스펙션된 세포의 평균 생산성이 316 ㎍/ml 이며, 벡터 p5068 에 대해서는 341 ㎍/ml 임을 보여줬다. 전장 hCMV 프로모터를 포함하는 벡터 px6051 및 px6062 를 이용해 생성된 클론들은, 벡터 px6051 에 대해서는 141 ㎍/ml, 벡터 px6062 에 대해서는 220 ㎍/ml 의 평균 생산성을 가졌다.
벡터 px6063 (bGH polyA 신호 및 hGT 와 조합하여 hEFl 알파 프로모터를 포함) 로 트렌스펙션된 54 개의 시험한 클론들의 회분식 분석에서의 평균 생산성은 생산성 367 ㎍/ml 였다. 최고 역가를 가진 최선의 클론들은 벡터 px6063 로부터 유도되었다 (각각 748 및 731 ㎍/ml).
인간 EFlα 프로모터 (px6052 및 px6063) 을 포함하는 벡터를 이용해 생성된 클론들은 감소된 갯수의 저생산성 클론을 나타냄을 발견했다.
클론들을 항체 제조의 안정성에 대해 시험했다. 벡터 p5068 및 px6052 를 이용해 수득된 12 개의 클론들을 3 회 계대 동안 Hygromycin B 의 존재 및 부재 하에 배양했다.
3 회 계대의 선별압 (Hygromycin B) 의 부재 하에서는, 12 개의 시험한 클론들의 평균 생산성에서의 35% 감소가 intron A 가 결핍된 짧은 길이 hCMV 프로모터에 대해 관찰되었다 (p5068; 410 ㎍/ml 대비 264 ㎍/ml). 대조적으로, intron A 가 있는 hEFl-알파 프로모터에 대해서는 평균 생산성에서 오직 18% 감소가 관찰되었다 (px6052; 312 ㎍/ml 대비 256 ㎍/ml 대비).
선별압의 존재 하에, 벡터 p5068 를 이용해 수득된 클론들은 평균 생산성에서 27% 만큼 감소 (410 ㎍/ml 대비 298 ㎍/ml) 를 나타냈으며, intron A 가 있는 hEFl-알파 프로모터를 포함하는 벡터 px6052 를 이용해 수득된 클로으로부터의 역가는 15% 만큼 감소했다 (312 ㎍/ml 대비 266 ㎍/ml).
선별압의 존재 또는 부재 하에 3 회 계대 후 intron A 가 결핍된 짧은 길이 hCMV 프로모터를 포함하는 벡터 p5068 또는 intron A 가 있는 hEFl-알파 프로모터를 포함하는 벡터 px6052 를 이용해 트렌스펙션된 안정한 클론들의 갯수를 결정했다. 3 회 계대 후 클론이 "안정"한지 여부를 결정하기 위해, 0 회 계대일 때의 IgG 역가를 100% 로 설정하고, 임계값 80% 를 결정했다. 선별압의 존재 또는 부재 하의 3 회 계대 후 0 회 계대시 (계대 0) 80% 의 IgG 역가보다 더 낮은 상대적인 IgG 역가를 보여주는 클론을 불안정한 것으로 정의했다.
p5068 를 이용해 트렌스펙션한 모든 클론들로부터의 선별압의 존재 또는 부재 하의 3 회 계대 후 상대적인 항체 역가는 0 회 계대시 항체 역가에 비해 80% 미만으로 떨어졌다. 안정한 세포 클론은 선별압의 존재 시 뿐만 아니라 선별압의 부재시 0 회 계대시 항체 역가에 비해 80% 이상인 항체 역가를 제공하는 클론성 세포 집단이다.
px6052 로 트렌스펙션된 클로들로부터의, 선별압의 존재 또는 부재 하의 3 회 계대 후 상대적 역가는 12 가지 경우 중 8 가지에서 0 회 계대의 IgG 역가에 비해 80% 미만으로 떨어졌으나, 4 개의 클론은 "안정" 한 것으로 정해졌다. 벡터 p5068 를 이용해 생성된 클론들과는 대조적으로, 벡터 px6052 를 이용해 생성된 12 개의 클론들 중 8 개가 선별압의 존재 하에 "안정" 했다. 대조적으로, 벡터 p5068 에 의해 유도된 것 중 오직 1 개의 클론만 선별압의 존재 하에 안정했다.
벡터 px6014, px6014A 및 px6014B 은 항체의 경쇄 앞에 hEFlα 프로모터를, 중쇄 앞에 짧은 hCMV 프로모터를 포함한다. 그러한 벡터들은 경쇄의 5' UTR 에서 가변적이다 (px6014: Pmel 제한효소 부위를 포함하는 hEFlα 프로모터의 5' UTR; px6014A: Pmel 제한효소 부위가 없는 hEFlα 프로모터의 5' UTR; px6014B: hEFlα 프로모터의 5' UTR + 벡터 p5068 의 5' UTR). 벡터는 뉴클레오펙션을 이용해 CHO-K1 세포에 일시적으로 트렌스펙션되었다.
벡터 px6014A 및 px6014B 는 벡터 px6014 에 비해 각각 20% 및 40% 강화된 생산성을 나타냈다 (벡터 px6014B 에 대해 2.01 ㎍/ml, 벡터 px6014A 에 대해 1.71 ㎍/ml, 벡터 px6014 에 대해 1.41 ㎍/ml).
일시적 트렌스펙션에서 인간 EFlα 프로모터 또는 전장 인간 CMV 프로모터 (두가지 모두 Intron A 가 있음) 를 포함하는 벡터가 벡터 p5068 에 비해 개선된 생산성을 보이는 것으로 나타났다.
인간 EFlα 프로모터를 포함하는 벡터를 이용해 생성된 안정한 모음은 벡터 p5068 에 비해 회분식 분석에서 개선된 생산성을 나타내는 것을 알게 되었다.
Intron A 가 있는 인간 EFlα 프로모터를 포함하는 벡터를 이용한 안정한 트렌스펙션에 의해 수득되는 세포 클론들은 감소된 갯수의 저 생산성 클론을 나타내는 것을 알게 되었다.
Intron A 가 있는 전장 인간 CMV 프로모터를 포함하는 벡터를 이용한 안정한 트렌스펙션에 의해 수득되는 세포 클론들이 평균 및 탑 클론 수준에서 모두 강력하게 감소된 생산성을 나타내는 것을 알게 되었다.
따라서, bGH polyA 신호 및 hGT 의 조합은, 1 개의 전사 방향에서 선별 마커에 대한 발현 카셋트 및 각 여타 전사 방향에서의 중쇄에 대한 발현 카셋트의 경쇄 상류에 대한 발현 카셋트를 이용한 양방향성 벡터 구성 (px6052 참조) 을 이용한, 사용된 프로모터와는 독립적으로 안정한 트렌스펙션에서 SV40 polyA 에 비해 생산성을 강화하는 것으로 나타났다.
나아가, 후속하여 선별 마커의 발현 카셋트의 상류에 위치하게 될 중쇄에 대한 발현 카셋트의 경쇄 상류에 대한 발현 카셋트를 이용한 단일방향성 벡터 구성을 이용하여 hCMV 프로모터에 대한 안정한 트렌스펙션에서 bGH polyA 신호 및 hGT 의 조합이 생산성을 강화하는 것으로 나타났다 (LC-HC-SM 발현 카셋트의 5'-> 3' 배향).
선별 프로세스의 개선
생산성이 없거나 낮은 클론 및 유전자 발현의 낮은 안정성 때문에, 세포주 개발은 현재 시간이 많이 걸리며 비용도 많이 든다. 수천개의 클론들 중, 보충 몇 개의 안정한 "고 생산자" 를 찾을 수 있다.
이론에 구애됨이 없이, 낮은 선택성 및 선별 전략의 엄격함의 이유로는 항체 발현시 선별압을 실행하지 않고 사용되는 벡터 시스템에서의 항체 및 선별 마커의 분리 발현을 생각할 수 있다 (예를 들어, 벡터 p5069 참조).
IRES 구성원을 이용함으로써, 상기 문제가 극복될 수 있다는 것을 발견했다.
IRES 구성원은 내부 리보솜 진입 부위로서 - mRNA 수준에서" 기능하는 DNA 구성원이므로, 1 개 mRNA 유래의 2 개의 유전자의 발현을 가능케 한다.
선별 마커 및 항체 사슬의 IRES-연계 발현은 전체 항체 발현 (즉, 선별 마커 및 항체 사슬 두가지 모두를 코딩하는 1 개의 mRNA) 에 대해 선별압을 집행하는데, 이에 따라 선별의 선별성을 보장한다. 유전자 발현의 안정성은 증대될 수 있다.
약한 IRES 활성이 있는 IRES 구성원의 이용하면 선별 마커의 약한 발현을 제공하게 된다. 선별 마커의 그러한 약한 발현은 선별의 엄격성을 증대시킬 수 있다.
선별 마커 및 항체 사슬의 IRES-연계 공동발현에 의해, 선별 프로세스는 다음과 같은 점에 의해 개선될 수 있다:
- 생산하는 세포 수의 증대,
- 유전자 발현의 안정성 강화, 및
- 선별 프로세스의 엄격성 강화.
항체 및 선별 마커의 IRES-연계 공동발현을 위해 사용되는 IRES 구성원은 두가지 필요조건을 충족해야 한다:
- IRES 구성원은 mRNA 안정성/항체 발현에 영향을 미치지 않거나 또는 오직 최소한의 영향을 줄 수 있다,
- IRES 구성원은 약한 IRES 활성을 나타내, 선별 마커가 오직 약하게만 발현되도록 한다.
경쇄 및 중쇄 인코딩 핵산은 여러개의 IRES 구성원, EV71-IRES, ELF4G-IRES 및 EMCV-IRES 구성원에 의해 연결되어 있다 (벡터 px6015A, px6015B, 및 px6015C). 발현 카셋트는 5' 에서 3' 방향으로 인간 CMV 프로모터, 경쇄 인코딩 핵산, IRES, 중쇄 인코딩 핵산 및 polyA 부위를 포함하고 있다.
표준으로서의 IRES 구성원이 없는 벡터 p5068 및 벡터 px6015A, px6015B, 및 px6015C 을 CHO-K1 세포에 일시적으로 트렌스펙션하고, 생산성을 ELISA 로 결정했다.
벡터 px6015B 및 px6015C (각각 ELF4G 및 EMCV-IRES 포함) 는 0.1 ㎍/ml 내지 0.15 ㎍/ml 의 IgG 발현을 나타낸다. 벡터 p5068 은 2 ㎍/ml 의 IgG 발현을 나타낸다. EV71-IRES 을 포함하는 벡터 px6015A 는 1.7 ㎍/ml 의 생산성을 나타낸다.
대안적으로, 선별 마커 Neomycin 은 IRES 구성원에 의해 항체의 중쇄에 직접 연결될 수 있다. 벡터는 5' 에서 3' 방향으로 구성원들 인간 CMV 프로모터, 경쇄 인코딩 핵산, polyA 부위, 인간 CMV 프로모터, 중쇄 인코딩 핵산, IRES 구성원, 네오마이신 선별 마커 핵산 및 polyA 부위를 포함한다.
벡터 px6010A, px6010B 및 px6010C 은 기재된 바와 같이 CHO-K1 세포에 일시적으로 트렌스펙션하고, 생산성을 ELISA 로 결정했다.
EMCV-IRES 을 포함하는 벡터 px6010C 는 13 ㎍/ml 의 생산성을 나타낸다. 벡터 p5069 는 14 ㎍/ml 의 생산성을 나타낸다. EV71-IRES 을 포함하는 벡터 (벡터 px6010A) 또는 ELF4G-IRES 을 포함하는 벡터 (벡터 px6010B) 는 각각 4.3 ㎍/ml 및 2.4 ㎍/ml 의 생산성을 나타낸다.
따라서, EMCV-IRES 구성원은 선별 마커의 IRES-연계 발현에 필요한 필수조건을 만족시키는 것으로 나타났다:
- 약한 IRES 활성 (따라서, 선별 마커는 오직 약하게 발현됨)
- 항체 발현 -각각 선별 마커의 IRES-연계 발현- 에 대한 가능한 최소한의 영향력.
따라서, 선별 마커 Neomycin (G418 에 대한 내성 중재) 은 EMCV-IRES 에 의해 중쇄 인코딩 핵산에 연결될 수 있다.
벡터 p5069 및 px6010C 는 모음 및 단독 클론 수준에서 모두 안정한 트렌스펙션에서 생산성 및 안정성에 대해 시험했다.
벡터를 뉴클레오펙션 기법에 의해 CHO-K1 세포에 트렌스펙션했다. 안정한 모음을 선별하고, 모음의 생산성을 회분식 분석으로 분석했다.
벡터 px6010C 를 이용해 생성된 모음은 회분식 분석에서 14 ㎍/ml 의 생산성을 나타냈다. 벡터 p5069 를 이용해 생성된 모음은 회분식 분석에서 5.4 ㎍/ml 의 생산성을 나타냈다 (도 5).
벡터 px6010C 를 이용해 생성된 모음은 더 많은 생산 세포 (또는 더 많은 우수한 생산 세포) 로 이루어지고/지거나 IgG 발현의 안정성이 (벡터 p5069 에 비해) 강화된다는 것을 발견했다.
벡터 px6010C 에서 선별 마커 Neomycin 의 IRES-연계 발현은 모음의 강화된 안정성을 유도하는 것으로 나타났다. 안정한 모음을 30 세대에 대한 선별압의 존재 또는 부재 하에 배양했다. 안정성 시험의 시작 (= 제 0 세대) 및 종결 (= 제 30 세대) 시, 모음의 생산성을 회분식 분석에서 분석했다.
벡터 px6010C 를 이용해 생성된 모음은 벡터 p5069 를 이용해 생성된 모음에 비해 회분식 분석에서 IgG 발현의 강화된 안정성을 나타낸다. 회분식 분석에서 벡터 p5069 를 이용해 수득되는 모음의 생산성은 선별압의 존재 및 부재 하에 모두 30 세대 후에는 강력하게 감소되었다 (> 80%; 검출 한계 미만의 값). 벡터 px6010C 을 이용해 생성된 모음의 생산성은 또한 선별압의 부재 하에 약 70% 감소된다. 그러나, 선별압의 존재 하에, 벡터 px6010C 를 이용해 생성된 모음의 생산성은 10% 만 감소되었다 (도 6).
벡터 p5069 및 벡터 px6010C 는 뉴클레오펙션에 의해 CHO-K1 세포로 트렌스펙션하고, 안정한 클론들은 상기 기재된 바와 같이 생성되었다. 클론들을 스크리닝하고, 각 트렌스펙션에서 최선의 15 개 클론들의 생산성을 회분식 분석에서 분석했다. 각 벡터에 대해 2 가지 독립적 트렌스펙션을 실시했다.
벡터 px6010C 을 이용해 생성된 클론들은 348 ㎍/ml 의 평균 생산성을 나타낸다. 벡터 p5069 를 이용해 생성된 클론들은 239 ㎍/ml 의 평균 생산성을 나타낸다. 벡터 px6010C 를 이용해 생성된 클론들의 증가된 평균 생산성은 더 나은 탑클론 때문이 아니라, 명백하게 감소된 갯수의 저생산 클론 때문이다. 벡터 p5069 와는 대조적으로, 벡터 px6010C 를 이용해 생성된 클론들은 회분식 분석에서 200 ㎍/ml 보다 더 낮은 생산성을 나타냈다 (도 7).
항체 발현의 안정성은 45 세대 동안의 선별압의 존재 및 부재 하에서의 배양에 의해 각각 17 개 클론 (p5069) 및 14 개 클론 (px6010C) 에 대해 시험했다. 클론의 생산성은 회분식 분석에서 안정성 시험 시작시 (제 0 세대) 및 제 45 세대에서 측정했다. 제 45 세대의 IgG 역가는 안정성 시험 시작시 클론의 생산성과 비교했다.
벡터 p5069 를 이용해 생성된 17 개 클론의 평균 생산성은 선별압의 존재 및 부재시 모두 45 세대 후 감소했다 (생산성에서 약 43% 손실). 벡터 px6010C 를 이용해 생성된 14 개 클론의 평균 생산성은 선별압의 부재시 약 45% 감소했다. 그러나, 선별 마커의 존재 시 상기 클론들에 대한 생산성의 감소는 4% 이다.
선별압의 존재시, 17 개의 시험한 클론들 중 오직 6 개만이 제 0 세대일 때 생산성의 80% 를 상회하는 생산성을 나타낸다. 대조적으로, 벡터 px6010C 를 이용해 생성된 14 개의 시험한 클론들 중 10 개가 제 0 세대일 때 생산성의 80% 를 상회한다.
선별압의 부재시, 벡터 p5069 및 벡터 px6010C 를 각각 이용해 생성된 클론들 사이에서 안정성에 있어서의 현저한 차이는 없었다.
선별 및 스크리닝 프로세스의 개선
집중적인 스크리닝이 필요하기에 현재 세포주 개발은 시간과 비용이 많이 드는 작업이다. 수천개의 클론들 중, 일반적으로 몇개의 안정한 고 생산자를 수득할 뿐이다.
현재 고 생산자 클론을 식별해 내기 위한 몇가지 전략이 존재한다:
- 생산된 단백질의 직접적인 검출을 위한 ELISA 기반의 스크리닝 전략 (시간 및 비용이 많이 든다);
- 생산된 단백질의 직접적인 검출을 위한 형광 기반의 스크리닝 전략 (시간 및 비용이 많이 든다);
- 생산된 단백질의 간접적 검출/정량을 위한 정량적 스크리닝 마커 (표면 단백질 또는 GFP 와 같은 형광 마커) 를 공동발현하는 세포의 FACS 기반의 세포 분류법이다.
대부분의 경우, 형광 마커의 발현은 항체의 발현과 연계되어 있지 않다. 이는 형광 강도 및 생산성의 의존성을 제한하며, 따라서 종종 형광 강도와 생산성 사이에는 적절한 상관관계가 없기도 하다.
GFP-단백질 (형광 마커의 예시) 은 안정하며, 축적되는 경향이 있다. (거의 모든 경우에서) 세포 내 형광 마커의 발현 수준 (형광 강도) 와 그의 생산성 사이에는 적절한 상관관계가 없다.
항체 발현과 형광 마커 발현을 연계하면 강화된 안정성 및 생산성을 지니는 동시에 단순하게 세포 클론들을 식별할 조합된 선별 및 스크리닝 전략이 수득되어 고 생산자들의 빠르고 용이한 식별이 가능하게 된다.
융합 단백질의 IRES-연계 발현은 선별로서 및 정량적 스크리닝 마커로서 기능하게 된다는 것을 발견했다.
IRES 구성원에 의해 항체의 중쇄에 직접 연결되는 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 선별 마커 네오마이신의 융합 단백질이 구축되었다. 융합 단백질 내 녹색 형광 단백질 및 선별 마커 네오마이신은 PEST 서열 (마우스 오르니틴 데카르복실라아제 유전자 (mODC) 의 코돈 423 내지 449 에 해당하는 서열) 에 의해 분리된다. 상기 PEST 서열은 단백질 수준에서는 강력한 단백질가수분해 신호 서열로 제공되어, 단백질의 반감기를 분명하게 감소시킨다.
GFP-PEST-Neo 융합 단백질은 선별 마커로서 뿐만 아니라 정량적 스크리닝 마커로서 작용한다.
PEST 서열을 이용함으로써, PEST 가 융합 단백질의 반감기 감소를 매개하게 되어, 클론의 선별 개선이 제공된다 (강화된 선별 엄격성).
PEST 서열의 이용으로, 융합 단백질의 GFP 형광 강도와 항체 및 선별 마커의 IRES-연계 공동발현으로 인한 항체 발현 사이에는 적절한 상관관계가 제공된다.
PEST 서열을 이용하게 되면 단백질의 반감기가 감소되어 융합 단백질의 축적이 줄어든다.
안정한 단일 클론의 GFP 발현 수준은 FACS 로 분석하고, 회분식 분석에서 생산성과 상관관계를 구했다. 안정한 모음과 상이한 GFP 발현 수준이 있는 집단을 FACS 로 분류하고, 분류된 집단의 생산성을 분석했다.
그러한 접근법에 대한 필요조건을 만족시키는 IRES 구성원은 다음과 같다:
- 약한 IRES 활성을 제공하여 융합 단백질이 약하게만 발현되어야 하며;
- 항체 발현 수준에는 영향을 주어선 안된다.
IRES 활성 또는 강도는 여러 IRES 구성원, EV71-IRES, ELF4G-IRES 및 EMCV-IRES 구성원 (벡터 px6015A, px6015B, 및 px6015C 참조) 에 의한 경쇄 및 중쇄 발현을 연계하여 결정했다. 기준으로서의 벡터 p5068 (IRES 구성원 없음) 및 벡터 px6015A, px6015B, 및 px6015C 를 CHO-K1 세포에 일시적으로 트렌스펙션하고, 생산성을 ELISA 로 측정했다.
벡터 px6015B 및 px6015C (각각 ELF4G 및 EMCV-IRES 포함) 은 0.1 내지 0.15 ㎍/ml 의 IgG 발현을 나타낸다. 벡터 p5068 에 대해서는 2 ㎍/ml 의 IgG 발현이 있었다. EV71-IRES 를 포함하는 벡터 px6015A 는 1.7 ㎍/ml 의 생산성을 나타내어, EV71-IRES 구성원이 CHO-K1 세포에서 강력한 IRES 활성을 갖는다는 것을 나타냈다.
GFP-PEST-Neo 융합 단백질은 IRES 구성원에 의해 항체의 중쇄 인코딩 핵산에 직접 연결되어 있다 (도 8 참조).
IRES 구성원이 벡터 px6011A, px6011B 및 px6011C 에 포함되어 있는 항체의 중쇄에 대한 선별 마커를 연결하는 구축물을 상기 기재된 바와 같이 CHO-K1 세포에 일시적으로 트렌스펙션하고, 생산성을 ELISA 로 결정했다.
EMCV-IRES 를 포함하는 벡터 px6011C 는 8.7 ㎍/ml 의 IgG 생산성을 나타내고, 벡터 p5059 는 10.8 ㎍/ml 의 IgG 생산성을 나타냈다. EV71-IRES 를 포함하는 벡터 px6011A 는 3.9 ㎍/ml 의 IgG 생산성을 나타냈다. ELF4G-IRES 를 포함하는 벡터 px601 IB 는 상관있는 생산성을 나타내지 않았다.
IRES-연결 GFP-PEST-Neo 융합 단백질이 있는 벡터 px6011C, 벡터 p5069, 및 벡터 px6010C 를 안정한 모듬 및 안정한 클론에서 회분식 분석에서 시험했다.
벡터 p5069, px6010C, 및 px6011C 를 뉴클레오펙션에 의해 CHO-K1 세포로 트렌스펙션했다. 안정한 모음을 상기 기재된 바와 같이 선별하고, 안정한 모음의 생산성을 회분식 분석에서 분석했다.
IRES-연결 선별 마커를 포함하는 벡터 px6010C 를 이용해 생성된 안정한 모음은 9.5 ㎍/ml 의 IgG 생산성을 나타냈다. 벡터 p5069 를 이용해 생성된 안정한 모음은 5.4 ㎍/ml 의 IgG 생산성을 나타냈다. IRES-연결 융합 단백질을 포함하는 벡터 px6011C 를 이용해 생성되는 모음은 36.3 ㎍/ml 의 생산성을 나타냈다 (도 9).
이들 데이터는 벡터 px6010C 및 px6011C 를 이용해 생성된 모음이 (벡터 p5069 를 이용해 생성된) 모음에 비해 훨씬 더 많은 생산 세포 또는 더욱더 우수한 생산 세포로 이루어진 것이 분명하다는 점을 시사한다. px6010C 및 px6011C 모음의/에서 IgG 발현의 강화된 안정성이 또한 생산성 증대에 기여할 수 있다.
안정한 클론에서 발현 벡터 p5068 과 벡터 px6010C 및 px6011C 의 생산성을 비교하기 위해, 벡터를 뉴클레오펙션에 의해 CHO-K1 세포에 트렌스펙션했다. 안정한 클론들을 상기 기재된 바와 같이 선별하고, 클론들을 스크리닝했다. 각 벡터의 최선ㄴ의 15 개 클론의 생산성을 회분식 분석에서 분석했다.
벡터 p5068 에 대해, 384 웰 플레이트에서 전체 3072 웰 중 95 개가 2 ㎍/ml (배경) 을 상회하는 IgG 생산을 나타냈다. 선별 마커 (px6010C) 의 IRES-연계 발현은 웰 당 생산 클론의 갯수는 195 개로 2 배가 되었고, IRES-연결 융합 단백질 (px6011C) 의 경우, 웰 당 제조 생산 갯수는 280 개 넘게 증가되었다.
나아가, 생산 클론의 갯수 뿐만 아니라 (벡터 px6010C 및 px6011C 에 의해 생성된) IRES 포함 클론의 평균 생산성이 더 높다 (각 벡터의 최선의 100 개 클론에 대해 벡터 p5069 에 대해서는 3.4 ㎍/ml, 벡터 px6010C 에 대해서는 4.2 ㎍/ml, 벡터 px6011C 에 대해서는 8.1 ㎍/ml; 각 벡터의 최선의 250 개 클론에 대해 벡터 p5069 에 대해서는 2.2 mg/ml, 벡터 px6010C 에 대해서는 3.0 ㎍/ml, 벡터 px6011C 에 대해서는 5.1 ㎍/ml).
IRES 벡터 px6010C 및 px6011C 및 p5059 을 이용해 생성된 클론들은 24 웰 스크리닝에서 벡터 px6011C 에 대해서는 212 ㎍/ml, 벡터 px6010C 에 대해서는 178 ㎍/ml, 벡터 p5069 에 대해서는 118 ㎍/ml 의 평균 생산성을 나타냈다 (세포 분열 후 4 일째에 비규정 세포 계수로 24 웰 배양에서 결정). 벡터 px6010C 및 px6011C 에 대해, 감소된 갯수의 비생산 클론 또는 저생산 클론 및 증가된 갯수의 우수한 생산 세포가 발견되었다 (도 10).
단일 클론들의 회분식 분석은 벡터 px6010C 을 이용해 생성된 15 개의 최선의 클론들의 평균 생산성은 348 ㎍/ml 이고, 벡터 p5069 에 대해서는 239 ㎍/ml 임으 보여줬다. 벡터 px6010C 를 이용해 생성된 15 개의 최선의 클론들의 평균 생산성은 404 ㎍/ml 였다. 최대의 전체 역가를 가진 클론들은 벡터 px6011C 를 이용한 트렌스펙션체로부터 유도된다. 벡터 px6010C 및 벡터 px6011C 을 이용해 생성된 클론들은 회분식 분석에서 200 ㎍/ml 보다 더 낮은 생산성을 나타내지 않는다.
항체 발현의 안정성에 대해 클론들을 시험하기 위해서, 각 벡터를 이용해 수득된 14 내지 19 개의 클론들을 45 세대 동안 선별압 (G418) 의 존재 및 부재 하에 배양했다. 클론들의 생산성은 회분식 분석에서 안정성 시험의 시작시 (제 0 세대) 및 제 45 세대에 측정했다. 제 45 세대의 IgG 역가는 제 0 세대의 안정성 시험 시작시 클론의 생산성 (100% 로 설정한 값) 과 비교했다.
벡터 p5069 를 이용해 생성된 17 개 클론의 평균 생산성은 선별압의 존재 및 부재 하에 모두 45 세대 후 감소했다 (생산성에서 약 43% 손실). 각각 벡터 px6010C 및 px6011C 을 이용해 생성된 14 내지 19 개의 클론의 평균 생산성은 또한 선별압의 부재 하에 감소되었지만 (생산성에 있어서 약 45 내지 35% 손실), 선별 마커 G418 의 존재 하에서는 그들 클론에 대한 평균 생산성에서의 감소는 45 세대 후 오직 0 내지 4% 에 불과했다.
선별압 G418 의 존재 하에, 벡터 p5069 에 의해 형성된 17 개의 시험 클론들 중 6 개는 제 0 세대의 생산성의 80% 를 상회하는 생산성을 나타냈다. 대조적으로, 벡터 px6010C 를 이용해 생성된 14 개의 시험 클론들 중 10 개 및 벡터 px6011C 를 이용해 생성된 19 개의 시험 클론들 중 17 개는 제 0 세대에서의 생산성의 약 80% 를 상회하는 생산성을 나타낸다.
선별압의 부재시, 벡터 p5069, px6010C, 및 px6011C 을 이용해 생성된 클론들은 필적할만한 거동을 나타낸다.
IRES 포함 벡터 및 이에 따라 그로부터 수득된 클론들은 선별 마커의 존재 하에 강화된 안정상을 갖는 것으로 나타났다.
그러나, 선별 마커의 부재 하에, IRES 포함 벡터 또는 IRES 가 없는 벡터로 수득된 클론들 사이에는 안정성 차이가 없다.
GFP-PEST-Neo 융합 단백질은 정량적 스크리닝 마커로서 유용하다. 벡터 px6011C 를 이용해 생성된 클론들의 GFP 형광 수준은 그들의 생산성에 대해 예측적이다.
단일 클론의 GFP 발현 수준/형광 강도를 결정하고, 결과는 회분식 분석에서 클론들의 생산성과 상관관계를 구했고, 상이한 GFP 발현 수준/형광 강도를 가진 집단을 안정한 모음으로부터 FACS 에 의해 분류했고 (1,000 세포 각 벡터), 이어서 그러한 상이한 집단의 생산성을 회분식 분석으로 분석했다. 세가지 상이한 집단으로 분류되었다:
집단 1: GFP 발현 없음, FL1-H (=GFP) 의 기하 평균 (GM) 은 0 내지 4
집단 2: 낮은 GFP 발현 수준, GM 4 내지 5.5
집단 3: 높은 GFP 발현, GM 5.5 내지 7.
회분식 및 FACS 분석은 단일 클론 및 모음 수준에서 모두 클론/모음의 GFP 형광 및 그의 생산성 사이에 타당한 상관관계가 있음을 보여준다. 높은 수준의 GFP 형광이 있는 클론 또는 모음은 낮은 GFP 형광을 나타내는 세포보다 더 높은 생산성을 보여준다. 일반적으로, 클론/모음의 생산성은 그의 형광 광도대로 증가한다 (도 11 및 12).
고 생산자 클론은 안정한 모음으로부터 고 GFP 형광발광 단일 클론의 FACS 기반 분석에 의해 직접 식별해 낼 수 있다. GFP 발현을 전혀 나타내지 않거나 또는 많이 나타내는 단일 클론들을 FACS 로 분류했다. 클론들을 진탕 중인 6-웰 플레이트에서 증량시키고, 클론의 생산성은 회분식 분석으로 결정했다.
선별 마커 또는 GFP-PEST-Neo 융합 단백질의 EMCV-IRES 연계 발현은 선별의 선택성을 명백히 강화하며 (더 많은 생산 클론을 제공하게 됨), 이는 또한 선별의 엄격성을 강화하는 것으로 나타났다 (생산 클론의 평균 생산성이 더 높음). 따라서, 스크리닝에 드는 수고가 명백하게 줄어든다.
IRES-연계 선별 마커 (px6010C) 과 비교시 IRES-연계 융합 단백질 (px6011C) 의 더욱 강력한 유효성은 아마도 융합 단백질의 줄어든 반감기 및/또는 융합 단백질의 선별제에 대한 더 적은 친화성 - 두 요인 모두 선별의 엄격성을 명백히 강화함 - 을 중재하는 융합 단백질 내 PEST 서열 때문일 것이다.
벡터 구성과 조합된 벡터 구성원
하기 벡터가 CHO-K1 숙주 세포주 내에서 일시적 트랜스펙션에서, 안정한 모음에서 및 단일 클론 수준에서 시험되었다.
Figure 112019118901262-pat00006
CHO-K1 세포로의 뉴클레오펙션 후에 일시적 트랜스펙션에서 상이한 벡터의 성능이 시험되었다.
인간 신장 인자 1 알파 프로모터 (hEF1α) 함유 벡터 (벡터 구성 LC-HC-SM 에 기초함) 는 hCMV 프로모터의 사용에 비해, 사용된 polyA 신호 서열에 따라, 각각, 약 + 34% (px9003 대 px9002; SV40 polyA 신호 서열) 및 + 30% (px9006 대 px9004; bGH polyA 신호 서열) 의 증가된 생산성을 갖는다.
bGH polyA 신호 서열에 대한 인간 가스트린 종결자 (hGT) 의 부가는 hCMV- 함유 벡터의 생산성에 양성 효과를 갖는다 (px9005 대 px9004; + 13%).
항체의 경쇄 및 중쇄의 양방향 발현에 기초하는 발현 벡터는 개선된 성능을 보인다. 생산 역가는 사용된 프로모터 (hEF1α 또는 hCMV) 및 사용된 polyA 신호 서열 (SV40 또는 bGH polyA 신호 서열) 에 따라 대조군 벡터 px9001 에 비해 약 2.7 내지 3.4 배 증가된다.
인간 신장 인자 1 알파 프로모터 및 bGH polyA 신호 서열의 사용은 벡터 구성 LC-HC-SM (+ 50% ; px9006 및 px9002 를 비교한다) 에서는 생산성에 양성 효과를 갖지만, 벡터 구성 LC(3'-5')-HC-SM (- 28%; px9010 및 px9011 을 비교한다) 에서는 그렇지 않음이 밝혀졌다.
발현 벡터 px9002 와 벡터 px9003 내지 9007 의 생산성을 비교하기 위해 벡터가 뉴클레오펙션에 의해 CHO-K1 세포 내로 트랜스펙션되고, 안정한 모음이 선별되었다. 회분식 분석에서 모음의 생산성이 분석되었다 (도 10 참조).
안정한 모음의 회분식 분석으로 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 함유 벡터 (px9003, px9006, px9007) 로 트랜스펙션된 모음로부터의 항체 역가가 짧은 길이 hCMV 프로모터 함유 기준 벡터 (벡터 px9002) 로 트랜스펙션된 세포의 경우보다 약 7-8 배 더 높았음이 밝혀졌다 (벡터 px9003, px9006 및 px9007 에 대한 97.5 ㎍/ml, 112.5 ㎍/ml 및 95.6 ㎍/ml 와 벡터 px9002 에 대한 14.0 ㎍/ml 를 비교한다).
벡터 px9001, px9002 및 px9004 내지 px9007 이 CHO-K1 세포 내로 뉴클레오펙션에 의해 트랜스펙션되고, 최선 단일 클론이 고전적 스크리닝 과정에 의해 식별되었다. 각각의 벡터로 생성된 최선 36 클론의 생산성이 회분식 분석에서 분석되었고, 회분식 분석에서 최선 15 개의 클론이 유가식 분석에서 시험되었다.
회분식 분석에서 벡터 px9001 로 생성된 최선 36 단일 클론의 평균 생산성은 356 ㎍/ml 이다. 벡터 px9002 또는 벡터 px9004 및 9005 (SV40 PolyA 신호 대신 BGH PolyA 신호 (단독으로 또는 HGT 와의 조합으로) 를 부가적으로 함유함) 로 생성된 클론은 대조군 벡터 px9001 에 비해 각각 37% (px9002), 61% (px9004) ~ 53% (px9005) 의 생산성 증가를 보인다. 벡터 px9006 및 px9007 의 클론은 각각 약 19% 및 7% 의 생산성 증가를 보인다.
유가식 실험에서 회분식 분석에서 각각의 벡터로 수득된 최선 15 클론이 유가식 분석에서 14 일에 걸쳐 시험되었다.
유가식 분석에서 최선 15 개의 인 하우스 (in house) 단일 클론 (벡터 px9001 로 생성됨) 의 평균 생산성은 1345 ㎍/ml 이다. 벡터 px9002 또는 벡터 px9004 및 9005 (SV40 polyA 신호 서열 대신 bGH polyA 신호 서열 (단독으로 또는 hGT 와의 조합으로) 를 부가적으로 함유함) 로 생성된 클론은 대조군 벡터 px9001 에 비해 각각 80% (px9002), 58% (px9004) 내지 92% (px9005) 의 생산성 증가를 보인다.
증가된 평균 생산성 (상기 참조) 외에도 또한 탑 클론의 성능이 크게 개선된다. 벡터 px9002, px9004 및 px9005 는 - 탑 5 클론의 생산성과 관련하여 - 대조군 벡터 px9001 에 비해 약 64% (px9002), 50% (px9004) 및 88% (px9005) 의 증가를 보인다.
하기에서 각각의 상이한 벡터에 대한 각각의 생산 및 비-생산 세포의 백분율이 직접 비교되었다. 벡터 px9001 로 생성된 클론의 14.2% 가 항체를 생산하고, 나머지 저항성 클론에서 항체 발현이 침묵되거나 클론이 다른 결함을 갖는다.
벡터 px9002 의 벡터 구성은 생산 세포의 백분율을 거의 2 배로 만들었다 (26.0% 까지). 단독으로 (벡터 px9004) 또는 hGT 와의 조합으로 (벡터 px9005) SV40 polyA 신호 서열 대신 bGH PolyA 신호 서열을 단독으로 부가적으로 함유하는 벡터는 생산 세포의 백분율의 약 3 배 증가를 보인다 (각각 39% 및 43%).
hCMV 프로모터 대신 인간 신장 인자 1 알파 프로모터의 사용은 생산 세포의 수를 5 배까지 증가시켰다 (선별 과정 후 수득된 클론의 70% 초과가 실제로 항체를 생산한다).
벡터 px9001 내지 9007 로 트랜스펙션하여 수득된 15 개의 최선 클론 (유가식 결과에 기초하여) 이 히그로마이신 B 의 존재 및 부재 하에 15 계대 (= 약 60 생성) 동안 배양되었다. 15 계대 후 회분식 분석에서의 클론의 생산 역가가 안정성 시험의 시작시 회분식에서의 클론의 생산 역가와 비교되었다.
선별압의 존재 하에 각각의 벡터의 15 클론 사이의 생산 역가의 변화는 15 계대 후 벡터 px9007 에 대해서는 -14.7%, 벡터 px9002 에 대해서는 + 0.2% 로 다양하다.
선별압의 부재 하에 생산 역가의 감소는 벡터 px9004 는 25.5%, 벡터 px9005 는 5.9% 이하로 다양하다.
선별 마커의 존재 및 부재시에 둘다 출발점 (G0) 에서의 값에 비해 회분식 분석에서 생산 역가 80% 초과와 같은 규정된 안정성 기준을 만족시키는 클론의 수는 4 내지 10 개로 다양하다. 마찬가지로 선별압/선별 마커의 존재 및 부재시에 벡터 px9005, px9007 및 px9002 는 최고수의 안정적 클론을 초래한다 (px9005: 10; px9007: 7; px9002:6)).
이와 같이, 벡터 px9005 의 구성은 안정성에 양성 효과를 보이고, 특히 선별압의 부재시에, 안정적 클론의 수를 증가시킨다는 것이 밝혀졌다.
전사 종결자 (hGT) 를 포함하지 않는 SV40 polyA 에 비해 bGH polyA 와 hGT 의 조합은 사용된 프로모터와 무관하게 안정적 클론의 생산성을 명백히 증가시킴이 밝혀졌다.
일시적 트랜스펙션:
- 인간 신장 인자 1 알파 프로모터 (인트론 A 를 포함함) 의 사용은 강화된 생산성을 제공한다 (LC-HC-SM 구성에서)
- 소 성장 호르몬 polyA 신호 서열의 사용은 SV40 polyA 신호 서열의 사용에 비해 강화된 생산성을 제공한다
- bGH PolyA 신호 서열에 HGT 의 부가는 hCMV 프로모터 함유 벡터에서 증가된 생산성을 초래한다
- 벡터 구성 LC(3'-5')-HC-SM 은 개선된 발현을 초래한다
안정한 모음 (stable pool)
- hEF1α 프로모터 함유 벡터로 생성된 모음은 회분식 분석에서 강화된 생산성을 보인다
- hEF1α 프로모터 함유 벡터로 생성된 클론은 감소된 수의 저 생산 클론을 보인다
- hEF1α 프로모터 함유 벡터로 생성된 클론은 IgG 발현의 더 높은 안정성을 보인다
단일 클론
- 선별 마커가 하류에 위치하는 벡터 구성 (LC-HC-SM) 은 단일 클론의 생산성에 양성 효과를 갖는다
- bGH polyA 신호 서열 및 hGT 함유 벡터로 생성된 클론은 더 높은 생산성 및 안정성을 갖는다
요약
몇가지 상이한 전사 관련 유전자 구성원들 및 그들의 조합을 기준 유전자 구성원 조합과 비교했다. 비교하는 일시적 실험을 바탕으로, 경쇄 및 중쇄의 발현 카셋트와 반대 방향이로 선별 마커에 대한 발현 카셋트가 있는 양방향성 벡터 구성에 대해 하기 결과를 수득했다 (중쇄 발현 카셋트의 상류에 경쇄 발현 카셋트) (하기 표 참조).
Figure 112019118901262-pat00007
상이한 프로모터가 bGH polyA 신호 및 hGT 전사 종결자와 조합되었다 (하기 표 참조).
Figure 112019118901262-pat00008
여러 전사 관련 유전 구성원 및 그들의 조합이 기준 벡터 (px9001, 벡터 구성 SM (3'-5' 배향)-LC-HC (5'-3' 배향)) 와 비교되었다. 비교 실험에 기초하여 기준 벡터 (px9001, 양방향 벡터 구성 SM (3'-5')-LC-HC (5'-3')) 에 비해 동일한 방향의 경쇄 및 중쇄 (중쇄 발현 카세트의 상류에 경쇄 발현 카세트가 있음) 및 선별 마커에 대한 발현 카세트를 포함하는 단방향 벡터 구성에 대해 하기 결과가 수득되었다.
Figure 112019118901262-pat00009
Figure 112019118901262-pat00010
Figure 112019118901262-pat00011
사용한 벡터:
Figure 112019118901262-pat00012
본원에서 보고되는 벡터 구성원들/요소 조합을 사용하여 증가된 발현 (생산성) 이 달성될 수 있음이 밝혀졌다:
- 인트론 A 를 포함하지 않는 인간 CMV: 100% (기준)
- 인트론 A 를 포함하는 인간 CMV: 일시적 234%,
안정한 모음 123%,
안정한 클론 38%
- 인트론 A 를 포함하는 랫트 CMV: 일시적 50%,
안정한 모음 60%
- 인트론 A 를 포함하는 인간 EF1α: 일시적 153%,
모음 564%,
안정한 클론:
84% (SV40 polyA)
약 100% (bGH 및 hGT)
- 인트론 A 및 최적화된 5'UTR 을 포함하는 인간 EF1α:
+ 40% (인간 EF1α 에 비해)
- MPSV: 29%
- bGH polyA: 일시적 146%,
안정한 92%
- hGT: 일시적 131%,
안정한 모음 138%,
단일 클론 123%
- bGH polyA 및 hGT: 일시적 158%,
안정한 모음 163%,
단일 클론 140%
인간 CMV 프로모터:
Xu et al., J. Control. Release, 81 (2002) 155-163.
Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124.
랫트 CMV 프로모터:
Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124.
인간 EF1a 프로모터:
Teschendorf et al., Anticancer Res. 22 (2002) 3325-3330.
Li et al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 113-124.
MPSV 프로모터:
Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124.
Artelt et al., Gene 68 (1988) 213-219.
Stocking et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 5746-5750.
Lin et al., Gene 147 (1994) 287-292.
MPSV-CMV 하이브리드 프로모터:
Liu et al., Anal. Biochem. 246 (1996) 150-152.
선별 마커의 발현을 위한 IRES-연결된 발현 카세트를 사용함으로써 높은 선별성 및 높은 엄격성 선별 과정이 제공될 수 있다:
- 항체 발현에 대한 선별압은 높은 선별성을 초래한다
- 항체 및 선별 마커의 연결된 발현은 높은 선별성을 초래한다
- 약한 활성을 갖는 IRES 구성원의 사용은 높은 엄격성, 즉 고 항체 생산 및 저 선별 마커 생산을 초래함이 밝혀졌다
- IRES 구성원에 의해 항체 및 선별 마커의 발현을 연결시킴
- IgG 발현을 아주 조금 변경시키는 약한 활성을 갖는 IRES 구성원 (EMCV/Gtx) 의 식별
- 선별 및 스크리닝 마커로서 작용하는 융합 단백질의 사용
- 양쪽기능성 GFP-네오마이신 융합 단백질
- 오르니틴 데카르복실라제의 PEST 서열은 강 단백질가수분해 신호 서열이고, 단백질의 감소된 반감기를 부여한다
- 융합 단백질의 IRES 연결된 발현은 높은 선별성을 초래한다
- 단백질가수분해 신호 서열에 의한 짧은 반감기는 높은 엄격성을 초래한다
- 융합 단백질의 약 발현 및 짧은 반감기로 인해 강한 발현이 요구된다
- FACS 에 의한 고 생산자의 신속한 식별 (고 GFP 발현 클론의 소팅은 고 생산자의 선별을 제공한다)
상이한 IRES 구성원에 의해 항체 중쇄에 연결된 선별 마커
- px5068 (IRES 를 포함하지 않는): 100% 항체 발현 (기준)
- Gtx-IRES: 20-27%
- EMCV-IRES 81-94%
- EV71-IRES 20-36%
- ELF4G-IRES 3-17%
- Gtx-IRES (합성) 88%
상이한 IRES 구성원에 의해 항체 중쇄에 연결된 GFP-Neo 융합 단백질
Gtx EV71 ELF4G EMCV
GFP 발현: + +++ - +
항체 발현: - - - +
Gtx-IRES:
Komuro et al., EMBO J. 12 (1993) 1387-1401.
EMCV-IRES:
Mountford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1991) 4303-4307.
EV71-IRES:
Lee et al., Biotechnol. Bioeng. 90 (2005) 656-662.
ELF4G-IRES:
Wong et al., Gene Ther. 9 (2002) 337-344.
Gtx (합성)-IRES:
Chappell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA97 (2000) 1536-1541.
EV71-IRES 구성원에 의해 경쇄 발현 카세트를 중쇄 발현 카세트에 연결시킴으로써 증가된 발현 (생산성) 이 달성될 수 있음이 밝혀졌다:
- IRES 를 포함하지 않는 px5068: 100% 항체 발현 (기준)
- Gtx-IRES (합성): 3%
- EV71-IRES: 82%
- ELF4G-IRES: 5%
- EMCV-IRES: 7%
본원에 보고된 한 국면은 SEQ ID NO:　06 의 서열을 가진 최적화된 5' UTR 을 포함하는 최적화된 인간 신장 인자 1 알파 프로모터이다.
하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에서 제시된다. 발명의 의미에서 벗어나지 않으면서 제시된 절차에 변형이 가해질 수 있다고 이해된다.
서열
SEQ ID NO: 01 Intron A 이 없는 짧은 인간 CMV 프로모터
SEQ ID NO: 02 Intron A 이 없고 5'UTR 이 있는 짧은 인간 CMV 프로모터
SEQ ID NO: 03 Intron A 이 있는 전장 인간 CMV 프로모터
SEQ ID NO: 04 Intron A 이 없는 전장 인간 EF1 알파 프로모터
SEQ ID NO: 05 Intron A 이 있는 전장 인간 EF1 알파 프로모터
SEQ ID NO: 06 Intron A 도 있고 5'UTR 도 있는 짧은 인간 EF1 알파 프로모터
SEQ ID NO: 07 Intron A 이 있는 전장 랫트 CMV 프로모터
SEQ ID NO: 08 SV40 polyA 신호 서열
SEQ ID NO: 09 bGH polyA 신호 서열
SEQ ID NO: 10 hGT 종결자 서열
SEQ ID NO: 11 SV40 프로모터
SEQ ID NO: 12 오르니틴 데카르복실라아제의 PEST 서열
SEQ ID NO: 13 GFP 를 인코딩하는 핵산 서열
SEQ ID NO: 14 네오마이신 선별 마커
SEQ ID NO: 15 GFP-PEST-NEO 융합 폴리펩티드 인코딩 핵산
SEQ ID NO: 16 EMCV-IRES
SEQ ID NO: 17 EV71-IRES
도면
도 1 벡터 p5068, px6001, px6008 및 px6007 을 이용해 생성된 안정한 클론들의 생산성. 총 3 회의 독립적 트렌스펙션의 회분식 분석에서 각 벡터를 이용해 수득된 최선의 15 개 클론의 평균 생산성이 제시됨.
도 2 벡터 px6051, px6062, px6052, 및 px6063 을 이용해 생성된 안정한 클론의 생산성. 총 3 회의 독립적 트렌스펙션의 회분식 분석에서 각 벡터를 이용해 수득된 최선의 18 개 클론의 평균 생산성이 제시됨.
도 3 Amaxa 사의 96 웰 셔틀 시스템을 이용한 일시적 트렌스펙션에서의 벡터 p5068, px6051, px6052 및 px6053 의 생산성. 트렌스펙션 4 일 후 각 벡터를 이용한 8 개의 독립적 트렌스펙션의 ELISA 에 의해 측정된 평균 생산성이 제시됨.
도 4 회분식 분석에서 벡터 p5068, px6051, px6052, 및 px6053 을 이용해 생성된 상이한 안정한 모음의 생산성. 7 일째 각 벡터의 3 개의 모음의 평균 생산성이 제시됨.
도 5 벡터 p5069 및 px6010C 을 이용해 생성된 안정한 모음의 생산성. 7 일째 회분식 분석에서 각 벡터를 이용한 각각 2 개 (px5069) 및 3 개 (px6010C) 의 상이한 모음의 평균 생산성이 제시됨.
도 6 벡터 p5069 및 px6010C 을 이용해 생성된 안정한 모음의 유전자 발현의 안정성. 제 0 계대 (100% 로 설정, 흑색 컬럼) 및 제 30 계대 (백색 컬럼) 에서 그리고 선별압 (G418) 없이 (패턴을 넣은 컬럼) 7 일째 회분식 분석에서 각 벡터를 이용한 2 개의 상이한 모음의 평균 생산성이 제시됨.
도 7 벡터 p5069 및 px6010C 을 이용해 생성된 최선의 15 개 클론의 생산성. 총 2 회의 독립적 형질주입의 회분식 분석에서 각 벡터를 이용한 최선의 15 개 클론의 평균 생산성.
도 8 GFP-PEST-NEO 융합 단백질의 IRES 중재 발현을 중재하는 벡터 px6011C 의 벡터 디자인에 대한 도식적 개요. GFP-PEST-Neo 융합 단백질은 EMCV-IRES 에 의해 항체의 중쇄에 연결된다. 항체 중쇄 및 융합 단백질의 코딩 서열은 1 개 mRNA 중의 짧은 인간 CMV 프로모터에 의해 전사된다. 상기 mRNA 의 번역은 항체의 중쇄 및 GFP-PEST-NEO 융합 단백질을 유도한다.
도 9 회분식 분석에서 벡터 p5069, px6011C 및 px6010C 를 이용해 생성된 상이한 안정한 모음의 생산성. 7 일재 각 벡터의 두가지 상이한 모음의 평균 생산성이 제시됨.
도 10 벡터 p5069, px6010C (항체의 중쇄에 연결된 EMCV-IRES 구성원에 의해 선별 마커 Neomycin 을 발현하는 벡터) 및 px6011C (항체의 중쇄에 연결된 EMCV-IRES 구성원에 의해 GFP-PEST-Neomycin 의 융합 단백질을 발현하는 벡터) 에 의해 생성된 최선의 15 개 클론의 생산성. (A) 총 2 회의 독립적 트렌스펙션의 회분식 분석에서의 각 벡터의 최선의 15 개 클론의 생산성 분포. (B) 총 2 회의 독립적 트렌스펙션의 회분식 분석에서의 각 벡터의 최선의 15 개 클론의 평균 생산성.
도 11 벡터 px6011C 를 이용해 생성된 11 개 클론에 대한 회분식 분석에서 GFP 발현 수준/형광 강도 및 생산성의 의존성을 제시함. 클론들은 24 웰 스크리닝 포맷으로 무작위로 찍어낸 후, 증량시키고, 최종적으로는 회분식 분석에서 분석했다. GFP 형광 강도의 기하 평균 (GM) 및 각 클론의 GFP-양성 세포의 백분율은 FACS 로 결정했다. (A) 11 개 단일 클론에 대한 회분식 분석에서의 GFP 형광 강도 및 생산서의 의존성. (B) 11 개 단일 클론에 대한 회분식 분석에서의 GFP-양성 세포 각 클론의 백분율 및 생산성의 의존성.
도 12 회분식 분석에서 상이한 GFP 형광 강도를 지닌 안정한 모음의 생산성. 상이한 GFP 발현 수준/형광 강도 (저 (1), 중 (2) 및 고 (3)) 는 FACS 로 분류됨. 모음을 증식시키고, 모음의 생산성을 7 일째에 회분식 분석으로 결정했다.
도 13 px6007 의 플라스미드 지도.
도 14 px6053 의 플라스미드 지도.
도 15 px6062 의 플라스미드 지도.
실시예
발현 벡터 p5068 및 p5069
발현 플라스미드 p5068 및 p5069 는 WO 2005/100402 에서 보고된 바와 같은 항-P-셀렉틴 항체의 발현을 위한 발현 카세트 (엑손-인트론 구성이 유지된 게놈 구성된 발현 카세트) 를 포함한다.
항-P-셀렉틴 HuMab 경쇄 및 중쇄 인코딩 유전자가 포유류 세포 발현 벡터 내에서 분리되어 조립되었다.
그에 의해 항-P-셀렉틴 HuMab 경쇄 가변 영역 (VL) 및 인간 κ-경쇄 불변 영역 (CL) 을 인코딩하는 유전자 분절이 항-P-셀렉틴 HuMab 중쇄 가변 영역 (VH) 및 인간 γl-중쇄 불변 영역 또는 인간 γ4-중쇄 불변 영역 (CH1-힌지-CH2-CH3) 에 대한 유전자 분절과 같이 연결되었다.
코돈 사용법이 추론될 수 있는 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보가: Kabat, E. A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242 에 제공되어 있다.
항-P-셀렉틴 HuMab κ-경쇄의 전사 유닛은 하기 구성원로 구성된다:
- 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- Kozak 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥐과동물 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 말단의 독특한 BsmI 제한효소 부위 및 스플라이스 공여자 자리 및 3' 말단의 독특한 NotI 제한효소 부위로 배열된 클로닝된 항-P-셀렉틴 HuMab 가변 경쇄 cDNA,
- 인트론 2 마우스 Ig-κ 인핸서를 포함하는 게놈 인간 κ-유전자 불변 영역 (Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), 및
- 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화 ("poly A") 신호 서열.
항-P-셀렉틴 HuMab γl-중쇄의 전사 유닛은 하기 구성원로 구성된다:
- 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 로부터의 조기 발현 인핸서 및 프로모터,
- Kozak 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 수식된 쥐과동물 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 말단의 독특한 BsmI 제한효소 부위 및 스플라이스 공여자 자리 및 3' 말단의 독특한 NotI 제한효소 부위로 배열된 클로닝된 항-P-셀렉틴 HuMab 가변 중쇄 cDNA,
- 마우스 Ig μ-인핸서를 포함하는 게놈 인간 γl-중 유전자 불변 영역 (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), 및
- 인간 γl-면역글로불린 폴리아데닐화 ("poly A") 신호 서열.
항-P-셀렉틴 HuMab κ-경쇄 또는 γl-중쇄 발현 카세트 외에 이들 플라스미드는 하기를 함유한다:
- 히그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 의 복제 기점, oriP,
- 이러한 플라스미드의 대장균 내에서의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기점, 및
- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자.
재조합 DNA 기술
Sambrook et al., 1999 (상기) 에 기재된 표준 클로닝 기술을 사용하여 클로닝을 실시했다. 모든 분자 생물 시약은 상업적으로 입수가능했고 (다르게 명시되지 않는 경우), 제조사의 지침에 따라 사용했다.
핵산 합성
상이한 유전 구성원의 DNA 가 Geneart AG, Regensburg 에 의해 합성되었다.
핵산 서열 확인
SequiServe (SequiServe GmbH, Germany) 에서 실시한 이중 가닥 시퀀싱에 의해 DNA 서열을 확인했다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이타 관리
Vector NTI Advance suite version 9.0 을 서열 제작, 맵핑, 분석, 주해 (annotation), 및 도해에 사용했다.
세포 배양 기술
1x HT 보충제 (Invitrogen Corp., Gibco®, Cat. No. 11067-030) 를 보충한 CD-CHO 배지 (Invitrogen Corp., Gibco®, Cat. No. 10743-011) 에서 CHO-K1 세포를 성장시켰다.
안정적으로 트랜스펙션된 CHO-K1 모음/세포주의 선별을 위해 400 내지 800 ㎍/ml G418 또는 200 내지 400 ㎍/ml 히그로마이신을 첨가했다 (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Sciences, Germany, Cat. No.: 843555).
모든 세포주를 가습 인큐베이터 내에서 37 ℃ 에서 5% CO2 로 120 내지 140 rpm/min 의 일정한 진탕 하에 유지했다. 매 3 내지 4 일 마다 세포를 새로운 배지에 분주했다. 배양물의 밀도 및 생활력을 Casey TT 또는 Cedex Hires 세포 계수기 (Roche innovates AG, Bielefeld) 를 사용하여 측정했다. 세포의 트랜스펙션을 Amaxa 뉴클레오펙션 기술 (Lonza GmbH, Germany) 에 의해 실시했다.
게다가 예를 들어 Bonifacino, J.S. 등, (eds.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2000) 에 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 기술을 적용했다.
세포 계수 및 세포 생활력의 측정
a) 전계 세포 계수 시스템 (CASY)
CASY® Technology Cell Counter, Model TT (Roche Innovatis AG, Bielefeld) 는 세포 계수에 전류를 사용한다. 펄스 면적 분석 (Pulse Area Analysis) 을 사용하여 세포가 저전압장에서 측정 세공을 통과할 때 생성되는 신호로부터 정보를 얻었다. 세포막의 구조 무결성은 세포 생활력의 정도이다. 그러므로 생활력 측정에 트립판 블루와 같은 염료가 필요하지 않다.
b) 자동화 트립판 블루 배제 방법 (Cedex)
모음 선별 동안 및 자동화 세포 계수 동안 Cedex HiRes 시스템 (Roche Innovatis AG, Bielefeld) 을 사용하여 세포 생활력을 측정했다.
트립판 블루는 온전한 세포막을 통해 세포 내로 진입할 수 없는 염료이다. 오직 손상된 세포막을 갖는 세포만 염색되고, 사멸한 것으로 표지된다. 염색 과정, 세포 계수 및 결과의 그래프 분석이 Cedex 시스템으로 디지탈 영상 인식에 의해 자동으로 수행되었다. 기타 측정 매개변수는 세포 크기, 형태 및 응집률이다. 멀티 샘플러로, 20 개 이하의 샘플을 연이어 측정했다.
플라스미드 제조 및 트랜스펙션에서 플라스미드의 정확한 비교를 위한 품질 체크
트랜스펙션 효능 및 그에 따라 생산성이 여러 인자 예컨대 DNA 양 및 품질에 의해 크게 영향을 받는다. 각각의 벡터에 동등한 출발 조건을 보장하기 위해 모든 벡터의 DNA 양 및 품질을 트랜스펙션 전에 집중 체크했다.
- 발현 벡터의 동시 제조
High Speed Maxi 플라스미드 단리 키트 (Qiagen GMBH, Hilden) 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 모든 벡터를 동시에 제조했다.
- 페놀/클로로포름 정제 및 에탄올 침전
모든 벡터를 페놀/클로로포름 정제에 의해 동시에 정제했다. 500 ㎍ 의 각각의 선형화된 플라스미드 DNA 를 200 ㎕ Tris-완충 50% (v/v) 페놀, 48% (v/v) 클로로포름, 2% (v/v) 이소아밀 알코올 용액과 혼합하고 1 분 동안 13,000 rpm 에서 원심분리했다. 그 후 상부 수성 상을 새로운 튜브 내로 옮기고, 200 ㎕ 96% (v/v) 클로로포름, 4% (v/v) 이소아밀 알코올과 혼합하고, 1 분 동안 13,000 rpm 에서 원심분리했다. 상부 상을 다시 새로운 튜브 내로 옮기고, 1/10 (총 부피) 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2) 및 2.5 배 (총 부피) 100% 에탄올과 혼합했다. 혼합하고 반응물을 5 분 동안 실온에서 인큐베이팅한 후, DNA 를 펠렛화하기 위해 혼합물을 5 분 동안 13,000 rpm 에서 원심분리했다. 상청액을 폐기하고, 펠렛을 900 ㎕ 70% (v/v) 에탄올로 세정하고, 5 분 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 최대 속도에서 5 분 동안의 최종 원심분리 단계 후에, 상청액을 폐기하고, 펠렛을 건조시키고, 멸균 H2O 로 재현탁시켰다.
- DNA 측정
각각의 벡터의 DNA 양을 BioPhotometer (Eppendorf; Hamburg) 를 사용하여 측정했다. DNA 측정은 항상 Tris pH 8.0 에서 1:20 희석률을 사용하여 3 차례 실시했다.
- 아가로스 겔
각각의 플라스미드의 DNA 품질을 0.8% 아가로스 겔 상에서 체크했다. DNA 분해, 벡터 입체구조 및 DNA 농도를 확인했다. 비슷한 양 및 품질 (DNA 분해 없음, 유사한 수퍼코일 (ccc) 형태, 겔 상의 유사한 DNA 양) 을 보이는 벡터를 일시적 및 안정적 트랜스펙션에 사용했다.
일시적 트랜스펙션
모든 벡터를 CHO-K1 세포 내에 Amaxa 96 웰 셔틀 시스템 (Lonza GmbH, Germany) 을 제조사의 지침에 따라 사용하여 트랜스펙션했다. 각각의 벡터를 8 회 반복 트랜스펙션했다. 트랜스펙션된 벡터의 DNA 양을 1 ㎍ 의 기준 발현 플라스미드 (p5068 또는 p5069) 에 따른 등몰량/카피수로 정규화시켰다. 생산성을 측정하기 위해 무세포 세포 배양 상청액을 트랜스펙션 후 제 4 일 ~ 제 7 일에 원-스텝 유니버설 (one-step universal) ELISA (Dianova) 에 의해 IgG 역가에 대해 분석했다.
Amaxa 96 웰 셔틀 시스템:
스피너 플라스크에서 성장하는 CHO-K1 세포를 850 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 배양 배지에 재현탁시켰다. 환형 플라스미드를 96-웰 뉴클레오펙션 플레이트 내에서 1 ㎍ 의 기준 발현 벡터 p5068 또는 p5069 에 따른 등몰 농도에서 플레이팅했다. 그 후 세포를 플레이트 내에 4 x 105 세포/웰 의 농도로 첨가했다. 트랜스펙션을 Amaxa 프로그램 DN-137 에 의해 실시했다. 트랜스펙션 후 10 분 동안 세포를 인큐베이팅한 후, 200 ㎕ 배양 배지를 함유하는 96 웰 넓적 바닥 인큐베이션 플레이트 내로 옮겼다. 그 후 세포를 정적으로 배양했다. 트랜스펙션 후 제 4 일 내지 제 6 일에 원-스텝 유니버설 ELISA 를 사용하여 IgG 수준을 측정했다.
안정적 트랜스펙션 및 재조합 CHO 세포주의 생성
안정적 트랜스펙션을 뉴클레오펙션 기술 (Amaxa Biosystems, Lonza cologne AG) 을 제조사의 지침에 따라 사용하여 실시했다. 트랜스펙션 전에 플라스미드를 제한 효소 SgrA I 에 의해 선형화했다. 각각의 플라스미드를 2 회 또는 3 회 반복 트랜스펙션했다. 1 회의 트랜스펙션마다 5 x 106 세포 및 1.2 pmol 선형화된 플라스미드를 사용했다. (Nucleofector Kit T, Amaxa 프로그램 A33).
트랜스펙션을 위해 세포를 Nucleofector solution T 에 재현탁시키고, 2 ml 튜브 내로 분배했다. 플라스미드를 첨가한 후, 펄스를 가하여 트랜스펙션을 실시했다. 그 후 미리 데운 4 ml 프레쉬 배지 및 4 ml 조정 배지를 함유하는 T25 조직 배양 플라스크 내로 세포를 옮겼다. 트랜스펙션 후 24 시간에 250 ㎍/ml 히그로마이신 B 를 첨가하여 선별압을 가했다.
안정한 모음의 생성
Amaxa 뉴클레오펙션 기술에 의해 벡터를 CHO-K1 세포 내로 트랜스펙션하고, 히그로마이신 B 또는 G418 을 선별제로서 사용하여 안정한 모음을 선별했다. 각각의 트랜스펙션을 3 회 반복 실시했다. 안정한 모음의 생성을 위해, 모든 플라스미드를 SgrA I 에 의한 제한 소화로 균일하게 선형화했다. Nucleofector Kit T (Amaxa) 를 사용하여 안정적 트랜스펙션을 실시하고, 각각의 플라스미드를 3 회 반복 트랜스펙션했다.
안정한 모음을 다음과 같이 확립했다: 5 x 106 세포 및 1.2 pmol 선형화된 플라스미드를 각각의 트랜스펙션에 사용했다. 세포를 Solution T 에 재현탁시키고, 2 ml 튜브 내로 분배했다. 플라스미드를 첨가한 후, 펄스를 가하여 트랜스펙션을 실시했다 (Amaxa program A33). 트랜스펙션된 세포 모음을 미리 데운 4 ml 프레쉬 배지 및 4 ml 조정 배지를 함유하는 T25 조직 배양 플라스크에서 정적으로 배양했다.
트랜스펙션 후 24 시간에 선별압을 가했다: 세포를 5 분 동안 800 rpm 에서 원심분리하고, 300 ㎍/ml 히그로마이신 B 를 함유하는 3 ml 배양 배지에 재현탁시켰다. 트랜스펙션 후 3 일에 세포를 넓적 바닥 6-웰 플레이트 내로 옮겼다. 그 후 세포 생활력이 최소로 하락하고 다시 99% 위로 상승할 때까지 2 주 동안 세포를 배양했다. 세포 수 및 생활력이 Cedex HiRes 시스템 (Innovatis, Bielefeld) 으로 일정하게 확인되었다. 배양 동안, 세포 데브리스 (debris) 를 원심분리로 제거하고, 세포를 항상 3 ml 프레쉬 배지에 재현탁시켰다.
Caliper 로봇 시스템을 사용하는 안정적 클론의 생성
상기와 같이 벡터를 CHO-K1 세포 내로 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 후 48 시간에 선별압을 가하고 (히그로마이신 B 또는 G418), 세포를 자동 고처리 클론 단리 시스템 (Sciclone ALH 3000 workstation, Caliper Life Sciences GmbH, Mainz) 을 사용하여 384 웰 넓적 바닥 플레이트 위로 350 ~ 700 세포/웰 의 농도로 파종했다.
10 내지 14 일 후 384 웰 플레이트를 ELISA 기반 초고처리 스크리닝 (ELSIA uHTS) 을 사용하여 IgG 수준에 대해 스크리닝했다. 1 차 스크리닝으로부터 최선 생산 클론을 선택하고, 넓적 바닥 96 웰 플레이트 내로 옮겼다. 3 내지 6 일 후에 세포를 IgG 수준에 대해 두번째 스크리닝했다. 다시 최선 생산 클론을 선택하고, 넓적 바닥 24 웰 플레이트 내로 수동으로 옮겼다. 추가의 ELISA 기반 스크리닝 단계 후에 최선 클론을 선택하고, 넓적 바닥 6 웰 플레이트 내로 옮겼다. 6-웰 플레이트 내의 IgG 수준을 ProtA 측정에 의해 측정하여, 진탕 6 웰 플레이트 내에서의 회분식 배양을 위한 최종 최선 클론을 식별했다.
모음/단일 클론의 회분식 분석
생산성 및 안정성의 차이를 탐지하기 위해, 클론/모음의 세포수를 Casey 세포 계수기를 사용하여 계수하고, 넓적 바닥 6 웰 플레이트 내로 농도 3 x 105 세포/ml 및 총 부피 3.0 ml 로 균일하게 파종했다. 모든 회분식 배양물을 12 일 동안 배양하고, 제 4 일, 제 7 일, 제 9 일, 제 11 일 또는 제 12 일에 세포 배양 상청액을 인간 IgG 수준에 대해 스크리닝했다.
IgG 정량화
일시적 실험에서 및 스크리닝 포맷 (384 웰 ~ 24-웰) 에서의 IgG 역가를 원-스텝 유니버설 ELISA 를 사용하여 측정했다. 회분식 실험에서 안정한 모음 및 안정적 단일 클론의 생산성을 Protein A HPLC 에 의해 측정했다.
원-스텝 유니버설 ELISA
원-스텝 유니버설 ELISA (Dianova) 를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 인간 IgG 수준을 측정했다. 희석 완충액 (PBS + 5% (w/v) RPLA1) 을 사용하여 0.3125-20 ng/ml 의 범위에서 항-P-셀렉틴 항체 (F. Hoffmann-La Roche AG, Basle, Switzerland) 의 계단 희석물을 사용하여 표준 곡선을 준비했다. 0.5 ㎍/ml 비오티닐화 F(ab')2-항-인간 Fc 항체 (Jackson laboratories) 및 0.1 ㎍/ml 퍼옥시다제 접합 F(ab')2-항-인간 Fc 항체 (Jackson laboratories; Suffolk) 를 함유하는 95 ㎕ 항체-믹스를 스트렙타비딘-코팅된 96-웰 MTP (StreptaWell, Roche Diagnostics GmbH) 에 첨가했다. 5 ㎕ 의 1:20.000 희석된 세포 배양 상청액을 플레이트에 첨가하고, 1 시간 동안 인큐베이션했다. 항체 코팅된 플레이트를 200 ㎕ 세정 완충액 (PBS + 0.05% (v/v) Tween20) 으로 3 회 세정했다. 100 ㎕ ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 를 플레이트에 첨가하고, 흡광도를 405 nm 에서 기준 파장 492 nm 로 측정했다.
ProtA-측정
HPLC 기반 크로마토그래피를 원-스텝 유니버설 ELISA 와 조합하여 사용하여 Protein A 에 의해 회분식 분석의 IgG 역가를 측정했다.
FACS
안정적 또는 일시적 트랜스펙션된 세포의 트랜스펙션 효율 (GFP 발현 세포에 기초함) 또는 GFP 발현 수준을 형광-활성화 세포 소팅을 사용하여 측정했다. 일반적으로 각각의 클론 또는 모음의 5 x 106 세포를 FACSCalibur Flow Cytometer (BD Biosciences, San Diego, CA) 를 사용하여 측정했다. 정방향 및 측방향 산란 데이타 (forward and sideward scatter data) 를 사용하여 세포 크기, 생활력 및 세포 형태를 측정했다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides <130> 30789 WO <150> EP11195361 <151> 2011-12-22 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 608 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 1 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 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gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 15 <211> 1677 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-PEST-NEO fusion polypeptide encoding nucleic acid <400> 15 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720 ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780 tccaccggat ctagacatgg cttcccgccg gaggtggagg agcaggatga tggcacgctg 840 cccatgtctt gtgcccagga gagcgggatg gaccgtagtt taaacattga acaagatgga 900 ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 960 cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 1020 ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg 1080 ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 1140 gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 1200 cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 1260 gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 1320 cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 1380 ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 1440 acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 1500 atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 1560 gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 1620 gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctga 1677 <210> 16 <211> 583 <212> DNA <213> Encephalomyocarditis virus <400> 16 ggcgcgcccc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg cttggaataa 60 ggccggtgtg cgtttgtcta tatgtgattt tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg 120 agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc 180 gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct 240 tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac 300 aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc 360 cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta 420 ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg 480 cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg 540 aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgga tcc 583 <210> 17 <211> 655 <212> DNA <213> Enterovirus 71 <400> 17 ggcgcgcccc cgaagtaact tagaagctgt aaatcaacga tcaatagcag gtgtggcaca 60 ccagtcatac cttgatcaag cacttctgtt tccccggact gagtatcaat aggctgctcg 120 cgcggctgaa ggagaaaacg ttcgttaccc gaccaactac ttcgagaagc ttagtaccac 180 catgaacgag gcagggtgtt tcgctcagca caaccccagt gtagatcagg ctgatgagtc 240 actgcaaccc ccatgggcga ccatggcagt ggctgcgttg gcggcctgcc catggagaaa 300 tccatgggac gctctaattc tgacatggtg tgaagagcct attgagctag ctggtagtcc 360 tccggcccct gaatgcggct aatcctaact gcggagcaca tgctcacaaa ccagtgggtg 420 gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt 480 ttattcctat attggctgct tatggtgaca atcaaaaagt tgttaccata tagctattgg 540 attggccatc cggtgtgcaa cagggcaatt gtttacctat ttattggttt tgtaccatta 600 tcactgaagt ctgtgatcac tctcaaattc attttgaccc tcaacacaat caaac 655

Claims (63)

  1. 하기를 포함하는 발현 벡터로서:
    - 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 제 1 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 1 전사 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 제 2 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 2 전사 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
    - 5' 에서 3' 방향으로 제 3 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 및 제 3 polyA 신호 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
    이로써, 3 개의 발현 카셋트가 단일방향성으로 제 1 발현 카셋트-제 2 발현 카셋트-제 3 발현 카셋트 순서로 구성되어 있게 되고,
    제 1 및 제 2 프로모터가 hCMV 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 bGH polyA 신호 서열이고, 전사 종결자 서열이 존재하며 hGT 종결자 서열인 발현 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 하나 이상의 인트론을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  3. 제 1 항에 있어서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 cDNA 인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  4. 하기를 포함하는 발현 벡터로서:
    - 5' 에서 3' 방향으로 제 1 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, 제 1 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 1 전사 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 제 2 프로모터, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, 제 2 polyA 신호 서열, 및 임의의 제 2 전사 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트, 및
    - 5' 에서 3' 방향으로 제 3 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, 및 제 3 polyA 신호 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
    이로써, 발현 카셋트는 제 1 발현 카셋트 및 제 2 발현 카셋트가 반대 방향으로 배열되는 양방향성으로 구성되고,
    제 1 및 제 2 프로모터가 hCMV 프로모터이고, 제 1 및 제 2 polyA 신호 서열이 bGH polyA 신호 서열이고, 전사 종결자 서열이 존재하고 hGT 종결자 서열인 발현 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 하나 이상의 인트론을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제 4 항에 있어서, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 및/또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산이 cDNA 인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  7. 제 1 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 4 발현 카셋트, 및
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의의 전사 종결자 서열을 포함하는 제 5 발현 카셋트,
    또는
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트, 및
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의의 전사 종결자 서열을 포함하는 제 4 발현 카셋트,
    이로써, 항체 경쇄는 두 항체 중쇄에 대한 공통 경쇄임.
  8. 제 4 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 4 발현 카셋트, 및
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의의 전사 종결자 서열을 포함하는 제 5 발현 카셋트,
    또는
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 1 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 1 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 2 발현 카셋트,
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 제 2 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의로는 종결자 서열을 포함하는 제 3 발현 카셋트, 및
    - 5' 에서 3' 방향으로 프로모터, 선별제에 대한 내성을 부여하는 핵산, polyA 신호 서열, 및 임의의 전사 종결자 서열을 포함하는 제 4 발현 카셋트,
    이로써, 항체 경쇄는 두 항체 중쇄에 대한 공통 경쇄임.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 이중특이적 항체를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서, 이중특이적 항체가 제 1 결합 특이성 또는 제 1 항원 또는 항원 상의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 갖고 있으며, 이중특이적 항체가 제 2 결합 특이성 또는 제 2 항원 또는 항원 상의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 갖고 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  11. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
    - 항체 경쇄 발현 카셋트,
    - 제 1 항체 중쇄 발현 카셋트,
    - 제 2 항체 중쇄 발현 카셋트, 및
    - 선별 마커 발현 카셋트.
  12. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터:
    - 제 1 항체 경쇄 발현 카셋트,
    - 제 2 항체 경쇄 발현 카셋트,
    - 제 1 항체 중쇄 발현 카셋트,
    - 제 2 항체 중쇄 발현 카셋트, 및
    - 선별 마커 발현 카셋트.
  13. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나가 홀 돌연변이 (hole mutation) 를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  14. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나가 놉 돌연변이 (knob mutation) 를 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  15. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 항체 경쇄 발현 카셋트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 CH1 도메인을 불변 도메인으로서 포함하는 항체 경쇄 변이체를 인코딩하고/하거나 항체 경쇄 발현 카셋트 중 하나가 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 CL 도메인을 불변 도메인으로서 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 을 포함하는 항체 중쇄 변이체를 인코딩하고/하거나 항체 중쇄 발현 카셋트 중 하나가 제 1 불변 도메인으로서 항체 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
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