BR112014014239B1 - Método para selecionar uma célula recombinante de mamífero transfectada estável, método para produzir um anticorpo e vetor de expressão - Google Patents
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Abstract
método para selecionar uma célula recombinante de mamífero transfectada estável, método pára produzir um anticorpo e vetor de expressão. no presente pedido é relatado que para as transfecções temporárias o uso do promotor do fator de alongamento humano 1 alfa (com íntron a) fornece uma produtividade aumentada (na organização lc-hc-sm), o uso da sequência sinal polia do hormônio de crescimento bovino fornece uma produtividade aumentada em comparação ao uso da sequência sinal polia de sv40, a adição de hgt à sequência sinal polia de bgh resulta em uma produtividade aumentada em vetores contendo o promotor de hcmv e a organização do vetor lc(3'-5)-hc-sm resulta em expressão melhorada. para pools estáveis é relatado que pools gerados com vetores contendo o promotor de hef1(alfa) mostraram uma produtividade melhorada em análise de batelada, clones gerados com vetores contendo o promotor de hef1(alfa) mostraram um número reduzido de clones com baixa produção, e clones gerados com vetores contendo o promotor de hef1(alfa) mostraram uma estabilidade mais alta de expressão de igg. para clones únicos é relatado que a organização do vetor com a posição a jusante de marcador de seleção (lc-hc-sm) tem um efeito positivo na produtividade de clones únicos e que clones gerados com vetores contendo a sequência sinal polia de bgh e de hgt tiveram produtividades mais altas.
Description
[001] No presente pedido são relatadas novas combinações de elementos de vetores de expressão, como promotor, sequência sinal poliA e terminador da transcrição, organizações de vetores de expressão, combinações dos mesmos, bem como novos métodos para a geração de linhagens celulares de produção, como novos métodos de transfecção ou seleção, bem como o uso desses vetores de expressão e linhagens celulares de produção para a produção recombinante de polipeptídeos de interesse.
[002] O nível de transcrição de um gene pode ter uma influência forte em seu nível de expressão e, portanto, determinar a produtividade de uma célula. Este é influenciado principalmente por três elementos de vetor: pelo promotor, pela sequência sinal poliA e (se presente) por um terminador da transcrição.
[003] O ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo geralmente compreende uma sequência líder (uma sequência sinal) (aproximadamente 57 bp/19 aa), que é removida sob maturação da proteína, uma região variável, VH (aproximadamente 350 bp/115 aa), e a região constante, CH (aproximadamente 990 bp/330 aa). O ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo geralmente é composto de uma sequência líder (aproximadamente 66 bp/22 aa), que é removida sob maturação da proteína, uma região variável, VK ou VL (aproximadamente 350 bp/115 aa), e uma região constante, CK ou CL (aproximadamente 321 bp/107 aa).
[004] A produção recombinante de anticorpos em células eucariontes envolve a criação de sistemas de expressão (consulte, McCafferty, J., et al., Antibody Engineering, A Practical Approach., IRL Press (1997)). Para desenvolvimento de sistemas de expressão de anticorpo é criado um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica cadeia leve, ladeado por um promotor e uma região de poliadenilação (poliA) região. Também, é criado um cassete de expressão de cadeia pesada que compreende um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada, ladeado por um promotor e uma região de poliA. O cassete de expressão da cadeia pesada pode ser combinado no cassete de expressão da cadeia leve em um único vetor contendo ambos os cassetes de expressão, da cadeia pesada e leve, ou pode ser integrado em dois vetores separados.
[005] As moléculas de cassete de DNA de imunoglobulina, constructos de monobody, métodos de produção e métodos de uso para esse fim são relatados na patente US 7.053.202. Na patente US 5.168.062, são relatados vetores de transferência e microrganismos contendo sequência de DNA reguladora de promotor inicial imediato de citomegalovírus humano. Um fragmento de DNA contendo uma região de promotor para fator-lα de alongamento de cadeia de polipeptídeo humana, sua sequência de base e plasmídeos de expressão contendo o fragmento de DNA que tem alta aplicabilidade para uma ampla faixa de células hospedeiras com alta capacidade de expressão é relatado na patente US 5.225.348. Na patente US 5.266.491, são relatados plasmídeos de expressão contendo origem de replicação de SV40 e um fragmento de DNA tendo uma região de promotor para um gene de fator factor-lα de alongamento de cadeia de polipeptídeo humano. Compostos de DNA recombinante e a expressão de polipeptídeos como tPA são relatados na patente EUA 5.122.458. Na patente US 7.422.874 é relatado um vetor de expressão para célula animal.
[006] Sanna Pietro, P., relata a expressão de fragmentos Fab de anticorpo e imunoglobulina inteira em células de mamífero (Meth. Mol. Biol. 178 (2002) 389-395). Uma biblioteca de exibição em célula para clonagem de genes de regiões variáveis de anticorpos humanos para antígeno de superfície de célula B da hepatite é relatada por Higuchi, K., et al. (J. Immunol. Meth. 202 (1997) 193-204). Kim, D., et al., relatam sistemas de expressão em mamíferos melhorados, por manipulação de regiões de terminação de transcrição (Biotechnol. Progress 19 (2003) 1620-1622). Orientações para elaboração genética de células para produção de anticorpo monoclonal são relatadas por Costa, R.A., et al. (Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 74 (2010) 127-138). Kim, D.W., et al., relatam o uso do promotor do fator de alongamento 1 alfa humano como um sistema de expressão versátil e eficiente (Gene 91 (1990) 217-223). A comparação de expressão gênica dependente de íntron e independente de íntron é relatada por Buchman, A.R., et al., (Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 4395-4405). Wang, F., et al., relatam expressão de anticorpo em células de mamífero (em Therapeutic monoclonal antibodies - From bench to clinic, Wiley (2009) páginas 557-572). Um estudo comparativo de projetos diferentes de vetores para a expressão de anticorpos lgG recombinantes em mamíferos é relatado por Li et al. (J. Immunol. Meth. 318 (2007) 113-124). Ho, S.C.L., et al. relatam “IRES-mediated tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines” (J. Biotechnol. 157 (2011) 130139). A produção de anticorpo quimérico anti-CD2 por células animais recombinantes é relatada por Hotta, A., et al. (J. Biosci. Bioeng. 98 (2004) 298303). Lee, J-C., et al. relatam “High-efficiency protein expression mediated by enterovirus 71 internal ribosome entry” (Biotechnol. Bioeng. 90 (2005) 656662). No documento WO 2008/142124 é relatada a produção de proteína recombinante em células Avian EBX®.
[007] Foi descoberto que o desempenho de um vetor de expressão depende em grande parte de seu uso pretendido e que os melhores vetores para transfecções temporárias, pools estáveis e seleção única de clone diferem.
[008] Para destacar os resultados principais: Para transfecção temporária a expressão bidirecional da cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo e o uso do promotor de hCMV inteiro incluindo Intron UM foram vantajosos. Para transfecção estável, no entanto, o arranjo em fileira de 1) cadeia leve de anticorpo, 2) cadeia leve de anticorpo e 3) marcador de seleção, mostrou ser vantajoso.
[009] Mas enquanto que o promotor hEF1α é claramente superior ao promotor de hCMV em pools estáveis, foi descoberto o claro efeito oposto em único nível de clone. Aqui, com o promotor inicial imediato/enhancer de citomegalovírus humano (hCMV) foram obtidos clones com produtividade mais alta.
[010] Além disso, o desempenho do promotor de hCMV pode ainda ser melhorado por combinação com o sinal de poliA de bGH e a sequência de terminação do gene de gastrina humano (hGT), que aumenta tanto a produtividade como a estabilidade de expressão.
[011] Foi descoberto que o uso de um vetor de expressão que compreende um cassete de expressão para uma cadeia pesada de anticorpo e um cassete de expressão para uma cadeia leve de anticorpo, cada uma compreendendo um promotor, um gene estrutural e uma sequência sinal poliA e, opcionalmente, uma sequência de terminação, resulta em um número maior de clones de células que produzem/secretam anticorpo após transfecção se i) o promotor for o promotor de citomegalovírus (hCMV), a sequência sinal poliA for a sequência sinal poliA de hormônio de crescimento bovino (poliA de bGH) e a sequência de terminação for a sequência de terminador da transcrição do gene da gastrina (hGT), ou 2) o promotor for o promotor do fator de alongamento humano 1 alfa (hEF1alfa), a sequência sinal poliA for a sequência sinal poliA de hormônio de crescimento bovino (poliA de bGH) e a sequência de terminação estiver ausente.
[012] Com o uso de um vetor de expressão, conforme esboçado acima, um número maior de células que produzem/secretam anticorpo pode ser obtido após a transfecção e, dessa forma, os esforços necessários para identificar uma célula de alta produção adequada para produção de anticorpo recombinante em grande escala são reduzidos.
[013] Portanto, um aspecto conforme relatado no presente pedido é um método para selecionar uma célula de mamífero recombinante, que compreende as seguintes etapas: a) transfectar uma célula de mamífero com um vetor de expressão, que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT, e e) através disso, obter uma grande quantidade de células recombinantes de mamífero, b) selecionar, a partir da grande quantidade de células recombinantes de mamífero, uma (única) célula recombinante de mamífero.
[014] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[015] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[016] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional para a seleção de uma célula transfectada estável.
[017] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma bidirecional para a seleção de uma célula transfectada temporária.
[018] Em uma realização, o plasmídeo de expressão ainda compreende um marcador de seleção. Em uma realização, os cassetes de expressão e o marcador de seleção são dispostos de forma unidirecional. Em uma realização, os cassetes de expressão são dispostos na sequência LC-HC- SM.
[019] Em uma realização, a célula de mamífero é selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula CHO para a seleção de uma célula transfectada estável. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula HEK para a seleção de uma célula transfectada temporária.
[020] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para produzir um anticorpo, que compreende as seguintes etapas: g) cultivar uma célula de mamífero, que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT, e h) recuperar o anticorpo a partir da célula ou do meio de cultura.
[021] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[022] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[023] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional para a produção estável de um anticorpo.
[024] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma bidirecional para a produção temporária de um anticorpo.
[025] Em uma realização, o plasmídeo de expressão ainda compreende um marcador de seleção. Em uma realização, os cassetes de expressão e o marcador de seleção são dispostos de forma unidirecional. Em uma realização, os cassetes de expressão são dispostos na sequência LC-HC- SM.
[026] Em uma realização, a célula de mamífero é selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0.
[027] Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula CHO para a produção estável de um anticorpo. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula HEK para a produção temporária de um anticorpo.
[028] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um vetor de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT.
[029] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[030] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[031] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional para a seleção de uma célula transfectada estável.
[032] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma bidirecional para a seleção de uma célula transfectada temporária.
[033] Em uma realização, o plasmídeo de expressão ainda compreende um marcador de seleção.
[034] Em uma realização, os cassetes de expressão e o marcador de seleção são dispostos de forma unidirecional.
[035] Em uma realização, os cassetes de expressão são dispostos na sequência LC-HC-SM.
[036] Foi descoberto que para a geração de linhagens celulares que expressam/secretam anticorpo recombinante estável com o uso de promotor do fator de alongamento alfa 1 (hEF1alpha) em combinação com a sequência sinal poliA de bGH, a presença de uma sequência de terminação de hGT reduz a produção de expressão que pode ser obtida.
[037] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para selecionar uma célula de mamífero recombinante, que compreende as seguintes etapas: a) transfectar uma célula de mamífero com um vetor de expressão, que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hEF1 alfa, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo e uma sequência sinal poliA de bGH, - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hEF1 alfa, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH, e e) através disso, obter uma grande quantidade de células recombinantes de mamífero, b) selecionar, a partir da grande quantidade de células recombinantes de mamífero, uma (única) célula recombinante de mamífero.
[038] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[039] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[040] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são disposto de forma unidirecional para a seleção de uma célula transfectada estável.
[041] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma bidirecional para a seleção de uma célula transfectada temporária.
[042] Em uma realização, o plasmídeo de expressão ainda compreende um marcador de seleção.
[043] Em uma realização, os cassetes de expressão e o marcador de seleção são dispostos de forma unidirecional. Em uma realização, os cassetes de expressão são dispostos na sequência LC-HC-SM.
[044] Em uma realização, o promotor do fator de alongamento humano 1 alfa compreende um Íntron A.
[045] Em uma realização, o vetor de expressão é livre de qualquer sequência de terminador da transcrição. Em uma realização, a sequência de terminação é a sequência de hGT.
[046] Em uma realização, a célula de mamífero é selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula CHO para a seleção de uma célula transfectada estável. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula HEK para a seleção de uma célula transfectada temporária.
[047] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para produzir um anticorpo, que compreende as seguintes etapas: g) cultivar uma célula de mamífero, que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hEF1 alfa, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo e uma sequência sinal poliA de bGH, - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hEF1 alfa, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo e uma sequência sinal poliA de bGH, e h) recuperar o anticorpo a partir da célula ou do meio de cultura.
[048] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[049] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[050] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional para a seleção de uma célula transfectada estável.
[051] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma bidirecional para a seleção de uma célula transfectada temporária.
[052] Em uma realização, o plasmídeo de expressão ainda compreende um marcador de seleção. Em uma realização, os cassetes de expressão e o marcador de seleção são dispostos de forma unidirecional. Em uma realização, os cassetes de expressão são dispostos na sequência LC-HC-SM.
[053] Em uma realização, o promotor do fator de alongamento humano 1 alfa compreende um Íntron A.
[054] Em uma realização, o vetor de expressão é livre de qualquer sequência de terminador da transcrição. Em uma realização, a sequência de terminação é a sequência de hGT.
[055] Em uma realização, a célula de mamífero é selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula CHO para a produção estável de um anticorpo. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula HEK para a produção temporária de um anticorpo.
[056] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um vetor de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hEF1 alfa, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo e uma sequência sinal poliA de bGH, e - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor de hEF1 alfa, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo e uma sequência sinal poliA de bGH.
[057] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[058] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[059] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional para a seleção de uma célula transfectada estável.
[060] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma bidirecional para a seleção de uma célula transfectada temporária.
[061] Em uma realização, o plasmídeo de expressão ainda compreende um marcador de seleção.
[062] Em uma realização, os cassetes de expressão e o marcador de seleção são dispostos de forma unidirecional. Em uma realização, os cassetes de expressão são dispostos na sequência LC-HC-SM.
[063] Em uma realização, o promotor do fator de alongamento humano 1 alfa compreende um Íntron A.
[064] Em uma realização, o vetor de expressão é livre de qualquer sequência de terminador da transcrição. Em uma realização, a sequência de terminação é a sequência de hGT.
[065] Foi descoberto que para a produção recombinante estável de um anticorpo, o uso de um vetor de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um primeiro promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma primeira sequência sinal poliA e uma primeira sequência de terminador da transcrição opcional. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um segundo promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma segunda sequência sinal poliA e uma segunda sequência de terminador da transcrição opcional, e - um terceiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um terceiro promotor, um ácido nucleico que confere resistência a um agente de seleção, uma terceira sequência sinal poliA e uma terceira sequência de terminador da transcrição opcional. através do qual os três cassetes de expressão são organizadas de forma unidirecional e na sequência, primeiro cassete de expressão-segundo cassete de expressão-terceiro cassete de expressão, resulta em uma produção de expressão melhorada em uma célula de mamífero recombinante transfectada de maneira estável.
[066] Ao contrário com o exposto acima, foi descoberto que para a produção recombinante temporária de um anticorpo, o uso de um vetor de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um primeiro promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma primeira sequência sinal poliA e uma primeira sequência de terminador da transcrição opcional. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um segundo promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma segunda sequência sinal poliA e uma segunda sequência de terminador da transcrição opcional, e - um terceiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um terceiro promotor, um ácido nucleico que confere resistência a um agente de seleção, uma terceira sequência sinal poliA e uma terceira sequência de terminador da transcrição opcional. através do qual os cassetes de expressão são organizados de forma bidirecional, de modo que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são organizados em direção oposta, resulta em uma produção de expressão melhorada em uma célula de mamífero recombinante transfectada de maneira temporária.
[067] O termo em direção oposta denota que um cassete de expressão é transcrito na direção 5’ -> 3’ e um cassete de expressão é transcrito na direção 3’ -> 5’.
[068] Dessa forma, um aspecto conforme relatado no presente pedido é o uso de um vetor de expressão, que compreende - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um primeiro promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma primeira sequência sinal poliA e uma primeira sequência de terminador da transcrição opcional. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um segundo promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma segunda sequência sinal poliA e uma segunda sequência de terminador da transcrição opcional, e - um terceiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um terceiro promotor, um ácido nucleico que confere resistência a um agente de seleção, uma terceira sequência sinal poliA e uma terceira sequência de terminador da transcrição opcional. através do qual os três cassetes de expressão são organizadas de forma unidirecional e na sequência, primeiro cassete de expressão-segundo cassete de expressão-terceiro cassete de expressão, para a produção recombinante estável de um anticorpo em uma célula de mamífero.
[069] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[070] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[071] Em uma realização, o primeiro e o segundo promotor são o promotor de hCMV, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são a sequência sinal poliA de bGH, e a sequência de terminador da transcrição está presente e é a sequência de terminação de hGT.
[072] Em uma realização, o primeiro e o segundo promotor são o promotor de hEF1 alfa, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são a sequência sinal poliA de bGH, e os cassetes de expressão são isentos de uma sequência de terminador da transcrição.
[073] Em uma realização, a célula de mamífero é selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula CHO.
[074] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um vetor de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um primeiro promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma primeira sequência sinal poliA e uma primeira sequência de terminador da transcrição opcional. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um segundo promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma segunda sequência sinal poliA e uma segunda sequência de terminador da transcrição opcional, e - um terceiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um terceiro promotor, um ácido nucleico que confere resistência a um agente de seleção, uma terceira sequência sinal poliA e uma terceira sequência de terminador da transcrição opcional. através do qual os três cassetes de expressão são organizadas de forma unidirecional e na sequência, primeiro cassete de expressão-segundo cassete de expressão-terceiro cassete de expressão.
[075] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[076] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[077] Em uma realização, o primeiro e o segundo promotor são o promotor de hCMV, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são a sequência sinal poliA de bGH, e a sequência de terminador da transcrição está presente e é a sequência de terminação de hGT.
[078] Em uma realização, o primeiro e o segundo promotor são o promotor de hEF1 alfa, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são a sequência sinal poliA de bGH, e os cassetes de expressão são isentos de uma sequência de terminador da transcrição.
[079] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é o uso de um vetor de expressão, que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um primeiro promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma primeira sequência sinal poliA e uma primeira sequência de terminador da transcrição opcional. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um segundo promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma segunda sequência sinal poliA e uma segunda sequência de terminador da transcrição opcional, e - um terceiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um terceiro promotor, um ácido nucleico que confere resistência a um agente de seleção, uma terceira sequência sinal poliA e uma terceira sequência de terminador da transcrição opcional. através do qual os cassetes de expressão são organizados de forma bidirecional, de modo que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são organizados em direção oposta, para a produção recombinante temporária de um anticorpo em uma célula de mamífero.
[080] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[081] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[082] Em uma realização, o primeiro e o segundo promotor são o promotor de hCMV, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são a sequência sinal poliA de bGH, e a sequência de terminador da transcrição está presente e é a sequência de terminação de hGT.
[083] Em uma realização, o primeiro e o segundo promotor são o promotor de hEF1 alfa, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são a sequência sinal poliA de bGH, e os cassetes de expressão são isentos de uma sequência de terminador da transcrição.
[084] Em uma realização, a célula de mamífero é selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0. Em uma realização, a célula de mamífero é uma célula HEK.
[085] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um vetor de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um primeiro promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma primeira sequência sinal poliA e uma primeira sequência de terminador da transcrição opcional. - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um segundo promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma segunda sequência sinal poliA e uma segunda sequência de terminador da transcrição opcional, e - um terceiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um terceiro promotor, um ácido nucleico que confere resistência a um agente de seleção, uma terceira sequência sinal poliA e uma terceira sequência de terminador da transcrição opcional. através do qual os cassetes de expressão são organizados de forma bidirecional, de modo que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são organizados em direção oposta.
[086] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[087] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[088] Em uma realização, o primeiro e o segundo promotor são o promotor de hCMV, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são a sequência sinal poliA de bGH, e a sequência de terminador da transcrição está presente e é a sequência de terminação de hGT.
[089] Em uma realização, o primeiro e o segundo promotor são o promotor de hEF1 alfa, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são a sequência sinal poliA de bGH, e os cassetes de expressão são isentos de uma sequência de terminador da transcrição.
[090] Além disso, foi descoberto entre outras coisas que vetores de expressão que compreendem o promotor de hCMV e o promotor de Ef1α humano com Íntron A ao invés do promotor curto de CMV humano sem Íntron A melhora a expressão temporária de gene em pool.
[091] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um plasmídeo de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um primeiro promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo e uma primeira sequência sinal poliA, - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um segundo promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo e uma segunda sequência sinal poliA. em que um ou ambos os cassetes de expressão compreendem, além disso, após a sequência sinal poliA, a sequência de terminação de gastrina humana.
[092] Em uma realização, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são selecionadas independentemente entre si a partir da sequência sinal poliA de SV40 e da sequência sinal poliA de hormônio de crescimento bovino.
[093] Em uma realização o primeiro e o segundo promotor são selecionados independentemente entre si a partir do promotor de CMV humano, do promotor de SV40, e do promotor do fator de alongamento humano 1 alfa.
[094] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[095] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[096] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional.
[097] Em uma realização, o plasmídeo de expressão ainda compreende um marcador de seleção. Em uma realização, os cassetes de expressão e o marcador de seleção são dispostos de forma bidirecional.
[098] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é o uso de um plasmídeo de expressão conforme relatado no presente pedido para a expressão temporária de um anticorpo ou para a expressão estável de um anticorpo.
[099] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é uma célula eucarionte que compreende um plasmídeo de expressão conforme relatado no presente pedido.
[0100] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para a produção de um anticorpo que compreende as etapas de: - cultivar uma célula eucarionte que compreende um plasmídeo de expressão, conforme relatado no presente pedido, ou a célula, conforme relatado no presente pedido. - recuperar o anticorpo a partir da célula eucarionte ou do meio de cultura.
[0101] Em uma realização, a célula eucarionte é uma célula de mamífero. Em uma realização, a célula de mamífero é selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0.
[0102] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um plasmídeo de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um primeiro promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo e uma primeira sequência sinal poliA, - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um segundo promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo e uma segunda sequência sinal poliA.
[0103] Em que o primeiro e/ou que o segundo promotor é o fator humano de alongamento 1 promotor de alfa.
[0104] Em uma realização, um ou ambos os cassetes de expressão não compreendem, além disso, após a sequência sinal poliA, a sequência de terminação de gastrina humana.
[0105] Em uma realização, um ou ambos os cassetes de expressão são isentos da sequência de terminação de gastrina humana.
[0106] Em uma realização, o promotor do fator de alongamento humano 1 alfa compreende um Íntron A.
[0107] Em uma realização, a primeira e a segunda sequência sinal poliA são selecionadas independentemente uma da outra a partir da sequência sinal poliA de SV40 e da sequência sinal poliA de hormônio de crescimento bovino.
[0108] Em uma realização o primeiro e o segundo promotor são selecionados independentemente entre si a partir do promotor de CMV humano, do promotor de SV40, e do promotor do fator de alongamento humano 1 alfa.
[0109] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreendem pelo menos um íntron.
[0110] Em uma realização, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo é cDNA.
[0111] Em uma realização, o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional.
[0112] Em uma realização, o plasmídeo de expressão ainda compreende um marcador de seleção.
[0113] Em uma realização, os cassetes de expressão e o marcador de seleção são dispostos de forma bidirecional.
[0114] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é o uso de um plasmídeo de expressão conforme relatado no presente pedido para a expressão temporária de um anticorpo ou para a expressão estável de um anticorpo.
[0115] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é uma célula eucarionte que compreende um plasmídeo de expressão conforme relatado no presente pedido.
[0116] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para a produção de um anticorpo que compreende as etapas de: - cultivar uma célula eucarionte que compreende um plasmídeo de expressão, conforme relatado no presente pedido, ou a célula, conforme relatado no presente pedido. - recuperar o anticorpo a partir da célula eucarionte ou do meio de cultura.
[0117] Em uma realização, a célula eucarionte é uma célula de mamífero. Em uma realização, a célula de mamífero é selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0.
[0118] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um plasmídeo que compreende na direção 5’ a 3’ uma sequência promotora, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo ou uma cadeia leve de anticorpo, um elemento IRES, uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador de seleção e uma sequência sinal poliA, de modo que o elemento IRES seja o elemento EMCV-IRES.
[0119] Em uma realização, o ácido nucleico codifica uma cadeia pesada de anticorpo.
[0120] Em uma realização, o marcador de seleção é uma proteína de fusão da fórmula A-C-S, de modo que A seja um polipeptídeo detectável, C seja uma sequência sinal proteolítica e S seja um marcador selecionável.
[0121] Em uma realização, a sequência sinal proteolítica é a sequência PEST da ornitina descarboxilase.
[0122] Em uma realização, o polipeptídeo detectável é proteína fluorescente verde.
[0123] Em uma realização, o marcador selecionável é neomicina.
[0124] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende, na direção N- terminal a C-terminal, uma proteína fluorescente verde, a sequência PEST de ornitina descarboxilase, e neomicina.
[0125] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é o uso de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende, na direção N-terminal a C-terminal, uma proteína fluorescente verde, a sequência PEST de ornitina descarboxilase, e neomicina para a seleção de células que secretam anticorpo.
[0126] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é o uso de um cassete de expressão que compreende na direção 5’ a 3’ uma sequência promotora, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo ou uma cadeia leve de anticorpo, um elemento IRES, uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador de seleção e uma sequência sinal poliA para a seleção de células que produzem anticorpo, de modo que o elemento IRES seja o elemento EMCV-IRES.
[0127] Em uma realização, o ácido nucleico codifica uma cadeia pesada de anticorpo.
[0128] Em uma realização, o marcador de seleção é uma proteína de fusão da fórmula A-C-S, de modo que A seja um polipeptídeo detectável, C seja uma sequência sinal proteolítica e S seja um marcador selecionável.
[0129] Em uma realização, a sequência sinal proteolítica é a sequência PEST da ornitina descarboxilase.
[0130] Em uma realização, o polipeptídeo detectável é proteína fluorescente verde.
[0131] Em uma realização, o marcador selecionável é neomicina.
[0132] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para a seleção de célula eucarionte que secreta um anticorpo, que compreende as seguintes etapas: - cultivar uma célula eucarionte que compreende i) um plasmídeo de expressão, conforme relatado neste aspecto e ii) um ácido nucleico que codifica a outra respectiva cadeia do anticorpo não codificada pelo plasmídeo de expressão, conforme relatado neste aspecto, - selecionar uma célula que expressa o polipeptídeo detectável.
[0133] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um plasmídeo de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, uma sequência promotora, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, um elemento IRES, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo e uma sequência sinal poliA, de modo que o elemento IRES seja o elemento EV71-IRES.
[0134] Em uma realização, a sequência promotora é selecionada a partir da sequência promotora de CMV humano com ou sem Íntron A, da sequência promotora de SV40 e do fator humano de alongamento humano 1 alfa com ou sem Íntron A.
[0135] Em uma realização, a sequência sinal poliA é selecionada a partir da sequência sinal poliA de hormônio de crescimento bovino e da sequência sinal poliA de SV40.
[0136] Em uma realização, o plasmídeo compreende 3’ para a sequência sinal poliA da sequência de terminação de gastrina humana.
[0137] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é o uso de um plasmídeo de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, uma sequência promotora, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, um elemento IRES, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo e uma sequência sinal poliA, para a expressão de um anticorpo, de modo que o elemento IRES seja o elemento EV71-IRES.
[0138] Em uma realização, a sequência promotora é selecionada a partir da sequência promotora de CMV humano com ou sem Íntron A, da sequência promotora de SV40 e do fator humano de alongamento humano 1 alfa com ou sem Íntron A.
[0139] Em uma realização, a sequência sinal poliA é selecionada a partir da sequência sinal poliA de hormônio de crescimento bovino e da sequência sinal poliA de SV40.
[0140] Em uma realização, o plasmídeo compreende 3’ para a sequência sinal poliA da sequência de terminação de gastrina humana.
[0141] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um método para a produção de um anticorpo que compreende as seguintes etapas: - cultivar uma célula eucarionte que compreende um plasmídeo, conforme relatado no presente pedido, - recuperar o anticorpo a partir da célula ou do meio de cultura e produzir assim um anticorpo.
[0142] Em uma realização, o promotor de hCMV tem a sequência de SEQ ID NO: 01. Este é o promotor de hCMV sem Íntron A e sem 5’ UTR.
[0143] Em uma realização, o promotor de hCMV tem a sequência de SEQ ID NO: 02. Este é o promotor de hCMV sem Íntron A e com 5’ UTR.
[0144] Em uma realização, o promotor de hCMV tem a sequência de SEQ ID NO: 03. Este é o promotor hCMV inteiro com Íntron A.
[0145] Em uma realização, o promotor do fator de alongamento humano 1 alfa tem a sequência de SEQ ID NO: 04. Este é o promotor de hEF1 alfa sem Íntron A.
[0146] Em uma realização, o promotor do fator de alongamento humano 1 alfa tem a sequência de SEQ ID NO: 05. Este é o promotor de hEF1 alfa com Íntron A.
[0147] Em uma realização, o promotor do fator de alongamento humano 1 alfa tem a sequência de SEQ ID NO: 06. Este é um promotor curto de hEF1 alfa com Íntron A e com 5’ UTR.
[0148] Em uma realização, o promotor de CMV tem a sequência de SEQ ID NO: 07.
[0149] Em uma realização, a sequência sinal poliA de SV40 tem a sequência de SEQ ID NO: 08.
[0150] Em uma realização, a sequência sinal poliA de hormônio de crescimento bovino tem a sequência de SEQ ID NO: 09.
[0151] Em uma realização, o terminador de gastrina humana tem a sequência de SEQ ID NO: 10.
[0152] Em uma realização, o promotor de SV40 tem a sequência de SEQ ID NO: 11.
[0153] Em uma realização, a sequência de PEST de ornitina descarboxilase é codificada pela sequência de SEQ ID NO: 12.
[0154] Em uma realização, a sequência de GFP é codificada pela sequência de SEQ ID NO: 13.
[0155] Em uma realização, o marcador de seleção de neomicina tem a sequência de SEQ ID NO: 14.
[0156] Em uma realização, o polipeptídeo de fusão GFP-PEST- NEO é codificado pela sequência de SEQ ID NO: 15.
[0157] Em uma realização, o EMCV-IRES tem a sequência de SEQ ID NO: 16.
[0158] Em uma realização, o EV71-IRES tem a sequência de SEQ ID NO: 17.
[0159] Em uma realização de todos os aspectos, conforme relatado no presente pedido, o anticorpo é biespecífico.
[0160] Em uma realização, o anticorpo biespecífico tem uma primeira especificidade de ligação ou sítio de ligação que se liga especificamente a um primeiro antígeno ou a um primeiro epítopo em um antígeno, e o anticorpo biespecífico tem uma segunda especificidade de ligação ou sítio de ligação que se liga especificamente a um segundo antígeno ou segundo epítopo no antígeno.
[0161]Se uma realização do vetor de expressão compreender tanto: - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor, um ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA e opcionalmente uma sequência de terminação, - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor, um ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA e opcionalmente uma sequência de terminação, - um terceiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor, um ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA e opcionalmente uma sequência de terminação, - um quarto cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor, um ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA e opcionalmente uma sequência de terminação, ou - um primeiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA e opcionalmente uma sequência de terminação, - um segundo cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor, um ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA e opcionalmente uma sequência de terminação, e - um terceiro cassete de expressão, que compreende na direção 5’ a 3’, um promotor, um ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA e opcionalmente uma sequência de terminação, de modo que a cadeia leve de anticorpo seja uma cadeia leve comum para ambas as cadeias pesadas do anticorpo.
[0162] Em uma realização de todos os aspectos, conforme relatado no presente pedido, o vetor de expressão compreende: - um cassete de expressão da cadeia leve de anticorpo, - um primeiro cassete de expressão da cadeia pesada de anticorpo, - um segundo cassete de expressão da cadeia pesada de anticorpo, e - um cassete de expressão de marcador de seleção, em que pelo menos um dos cassetes de expressão da cadeia pesada de anticorpo, o cassete de expressão da cadeia leve de anticorpo e o cassete de expressão do marcador de seleção são dispostos de forma unidirecional, e em que os cassetes de expressão unidirecionais são dispostos na sequência 5’ a 3’ do cassete de expressão da cadeia pesada de anticorpo, cassete de expressão da cadeia leve de anticorpo e cassete de expressão do marcador de seleção, ou os cassetes de expressão unidirecionais são dispostos na sequência 5’ a 3’ do cassete de expressão da cadeia pesada de anticorpo, cassete de expressão da cadeia leve de anticorpo e cassete de expressão do marcador de seleção.
[0163] Em uma realização de todos os aspectos, conforme relatado no presente pedido, o vetor de expressão compreende: - um primeiro cassete de expressão da cadeia leve de anticorpo, - um segundo cassete de expressão da cadeia leve de anticorpo, - um primeiro cassete de expressão da cadeia pesada de anticorpo, - um segundo cassete de expressão da cadeia pesada de anticorpo, e - um cassete de expressão de marcador de seleção, em que pelo menos um dos cassetes de expressão da cadeia pesada de anticorpo, um dos cassetes de expressão da cadeia leve de anticorpo e o cassete de expressão do marcador de seleção são dispostos de forma unidirecional, e em que os cassetes de expressão unidirecionais são dispostos na sequência 5’ a 3’ do cassete de expressão da cadeia pesada de anticorpo, cassete de expressão da cadeia leve de anticorpo e cassete de expressão do marcador de seleção, ou os cassetes de expressão unidirecionais são dispostos na sequência 5’ a 3’ do cassete de expressão da cadeia pesada de anticorpo, cassete de expressão da cadeia leve de anticorpo e cassete de expressão do marcador de seleção.
[0164] Em uma realização um dos cassetes de expressão da cadeia pesada de anticorpo codifica uma cadeia pesada de anticorpo que compreende uma mutação de orifício.
[0165] Em uma realização um dos cassetes de expressão da cadeia pesada de anticorpo codifica uma cadeia pesada de anticorpo que compreende uma mutação de protuberância.
[0166] Em uma realização um dos cassetes de expressão da cadeia leve de anticorpo codifica uma cadeia leve de anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio CH1 da cadeia pesada de anticorpo como domínio constante e/ou um dos cassetes de expressão da cadeia leve de anticorpo, uma cadeia leve de anticorpo que compreende um domínio variável da cadeia leve de anticorpo e um domínio CL da cadeia leve de anticorpo como domínio constante.
[0167] Em uma realização codifica um dos cassetes de expressão da cadeia pesada de anticorpo codifica uma cadeia pesada de anticorpo que compreende um domínio constante de um domínio constante da cadeia leve de anticorpo (CL), e/ou um dos cassetes de expressão da cadeia leve de anticorpo codifica uma cadeia pesada de anticorpo que compreende como primeiro domínio constante um domínio CH1 da cadeia pesada de anticorpo.
[0168] Como conhecido por um técnico no assunto, o uso da tecnologia de DNA recombinante permite a produção de diversos derivados de um ácido nucleico e/ou polipeptídeo. Esses derivados podem, por exemplo, ser modificados em posições individuais ou diversas por substituição, alteração, troca, deleção ou inserção. A modificação ou derivatização pode, por exemplo, ser realizada por meio de mutagênese sítio-dirigida. Essas modificações podem ser facilmente realizadas por um técnico no assunto (consulte, por exemplo, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York, EUA (1999)). O uso de tecnologia recombinante permite que um técnico no assunto transforme várias células hospedeiras com ácido(s) nucleico(s) heterólogo(s). Embora a transcrição e tradução, isto é, expressão, maquinaria de diferentes células use os mesmos elementos, as células pertencentes a diferentes espécies podem ter, entre outras coisas, um uso diferente do, assim chamado, códon. Através disso, polipeptídeos idênticos (em relação à sequência de aminoácidos) podem ser codificados por diferentes ácidos nucleicos. Também, devido à degeneração do código genético, diferentes ácidos nucleicos podem codificar o mesmo polipeptídeo.
[0169] O uso da tecnologia de DNA recombinante permite a produção de diversos derivados de um ácido nucleico e/ou polipeptídeo.
[0170] Esses derivados podem, por exemplo, ser modificados em posições individuais ou diversas por substituição, alteração, troca, deleção ou inserção.
[0171] A modificação ou derivatização pode, por exemplo, ser realizada por meio de mutagênese sítio-dirigida. Essas modificações podem ser facilmente realizadas por um técnico no assunto (consulte, por exemplo, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, EUA (1999); Hames, B.D. e Higgins, S.J., Nucleic acid hybridization - a practical approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra (1985)).
[0172] O uso de tecnologia recombinante permite a transformação de várias células hospedeiras com ácidos nucleicos heterólogos. Embora a transcrição e tradução, isto é, expressão, maquinaria de diferentes células use os mesmos elementos, as células pertencentes a diferentes espécies podem ter, entre outras coisas, um uso diferente do, assim chamado, códon. Através disso, polipeptídeos idênticos (em relação à sequência de aminoácidos) podem ser codificados por diferentes ácidos nucleicos. Também, devido à degeneração do código genético, diferentes ácidos nucleicos podem codificar o mesmo polipeptídeo.
[0173] Um anticorpo de “afinidade madura” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis do mesmo, em comparação a um anticorpo parental que não possui essas alterações, como alterações que resultam em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno.
[0174] O termo “anticorpo” no presente pedido é usado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpos, que incluem, mas não se limitam a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.
[0175] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0176] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[0177] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem, ainda, ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, Y e μ, respectivamente.
[0178] O termo “expressão”, como usado no presente pedido, refere-se aos processos de transcrição e/ou tradução que ocorrem dentro de uma célula. O nível de transcrição de uma sequência de ácido nucleico de interesse em uma célula pode ser determinado com base na quantidade de mRNA correspondente que está presente na célula. Por exemplo, o mRNA transcrito a partir de uma sequência de interesse pode ser quantificado por RT- PCR ou por hibridização Northern (consulte, Sambrook et al., 1999, acima). Polipeptídeos codificados por um ácido nucleico de interesse podem ser quantificados por vários métodos, por exemplo, por ELISA, por avaliação da atividade biológica do polipeptídeo, ou empregando ensaios que são independentes dessa atividade, como Western blotting ou radioimunoensaio, com o uso de imunoglobulinas que reconhecem e se ligam ao polipeptídeo (comsulte, Sambrook et al., 1999, acima).
[0179] Um “cassete de expressão” refere-se a um constructo que contém os elementos reguladores necessários, como promotor e sítio de poliadenilação, pelo menos para expressão do ácido nucleico contido em uma célula.
[0180] Um “vetor de expressão” é um ácido nucleico que fornece todos os elementos necessários para a expressão dos genes estruturais compreendidos em uma célula hospedeira. Tipicamente, um plasmídeo de expressão compreende uma unidade de propagação de plasmidial de procarionte, por exemplo, para E. coli, que compreende uma origem de replicação e um marcador selecionável, um marcador de seleção de eucarionte, e um ou mais cassetes de expressão para a expressão dos genes estruturais de interesse, cada um compreendendo um promotor, um gene estrutural e um sinal de poliadenilação (sequência sinal poliA). A expressão gênica é geralmente colocada sob o controle de um promotor, e esse gene estrutural é conhecido por ser “ligado de maneira funcional” ao promotor. De maneira similar, um elemento regulador e um promotor central são ligados de maneira funcional se o elemento regulador modular a atividade do promotor central.
[0181] O termo “região Fc” no presente pedido é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma realização, uma região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina humana se estende a partir de Cys226 ou de Pro230 até a terminação carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C- terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma no presente pedido, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) NIH Publication 91-3242.
[0182] Uma “região Fc” é um termo bem conhecido e definido com base na clivagem de papaína de uma cadeia pesada de anticorpo. Os complexos, conforme relatado no presente pedido, podem compreender em uma realização como polipeptídeo da região de dobradiça da cadeia pesada de anticorpo uma região Fc humana ou uma região Fc derivada de origem humana. Em uma realização adicional, a região Fc é tanto uma região Fc de um anticorpo humano da subclasse IgG4 como uma região Fc de um anticorpo humano da subclasse IgG1, IgG2 ou IgG3, que é modificada de modo que nenhuma ligação de receptor FCY (por exemplo, FcYRIIIa) e/ou nenhuma ligação de C1q possa ser detectada. Em uma realização, a região Fc é uma região Fc humana e especialmente tanto da subclasse IgG4 humana como uma região Fc mutada da subclasse IgG1 humana. Em uma realização, a região Fc é da subclasse IgG1 humana com mutações L234A e L235A. Embora IgG4 mostre ligação de receptor FCY reduzida (FcYRIIIa), anticorpos de outras subclasses IgG mostram ligação forte. No entanto, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (perda de carboidrato de Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e/ou His435 são resíduos que, se alterados, também fornecem ligação de receptor Fc reduzida (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; patente EP 0 307 434). Em uma realização, o anticorpo a ser expresso em um aspecto conforme relatado no presente pedido em relação à ligação de receptor FCY de subclasse IgG4 ou de subclasse IgG1 ou IgG2, com uma mutação em L234, L235 e/ou D265, e/ou contém a mutação PVA236. Em uma realização, as mutações são S228P, L234A, L235A, L235E e/ou PVA236 (PVA236 denota que a sequência de aminoácidos ELLG (fornecida em código de aminoácido de uma letra) da posição de aminoácido 233 a 236 de IgG1 ou EFLG de IgG4 é substituída por PVA). Em uma realização, as mutações são S228P de IgG4, e L234A e L235A de IgG1. A região Fc de um anticorpo está diretamente envolvida em ADCC (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo) e CDC (citotoxicidade dependente de complemento). Um complexo que não se liga ao receptor FCY e/ou fator de complemento C1q não produz citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). A modificação de protuberância denota a mutação T366W no domínio CH3 de um anticorpo (numeração de acordo com Kabat). A modificação de protuberância denota as mutações T366S, L368A e Y407V no domínio CH3 de um anticorpo. Além da modificação de protuberância e orifício, a mutação S354C em um domínio CH3 e a mutação Y349C no outro domínio CH3 podem estar presentes.
[0183] “Estrutura” ou “FR” refere-se a resíduos de domínio variável, exceto resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0184] Os termos “anticorpo inteiro,” “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são usados de forma intercambiável no presente pedido para se referir a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que tem cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente pedido.
[0185] Um “gene” denota um ácido nucleico que é um segmento, por exemplo, em um cromossomo ou em um plasmídeo que pode afetar a expressão de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Além da região codificadora, isto é, o gene estrutural, um gene compreende outros elementos funcionais, por exemplo, uma sequência sinal, promotores, íntrons e/ou terminadores.
[0186] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem celular hospedeira” e “cultura celular hospedeira” são usados de forma intercambiável e referem-se às células em que o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas células. Células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir das mesmas sem consideração ao número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica a uma célula parental no conteúdo de ácido nucleico, mas pode conter mutações. Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica como as triadas ou selecionadas para a célula originalmente transformada são incluídas no presente pedido.
[0187] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou uma célula humana derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.
[0188] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas realizações, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs correspondem àquelas de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivada a partir de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.
[0189] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, como usado no presente pedido, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formas estruturalmente definidas como alças (“alças hipervariáveis”). Geralmente, anticorpos de quatro cadeias nativas compreendem seis HVRs, três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs geralmente compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ou das “regiões determinantes de complementaridade” (CDRs), sendo essa última de variabilidade de sequência mais alta e/ou envolvida no reconhecimento de antígeno. Alças hipervariáveis exemplares ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) (Chothia, C., e Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). CDRs exemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 de L1, 50 a 56 de L2, 89 a 97 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 65 de H2, e 95 a 102 de H3 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). Com exceção de CDR1 na VH, CDRs geralmente compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. CDRs também compreendem “resíduos determinantes de especificidade,” ou “SDRs,” que são resíduos que entram em contato com o antígeno. Os SDRs são incluídos nas regiões das CDRs chamadas CDRs abreviadas ou a-CDRs. As a-CDRs exemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR- L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31 a 34 de L1, 50 a 55 de L2, 89 a 96 de L3, 31 a 35B de H1, 50 a 58 de H2, e 95 a 102 de H3 (Almagro, J.C., e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 16191633). A menos que indicado de outra forma, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados no presente pedido de acordo com Kabat et al., acima.
[0190] Um “sítio interno de entrada de ribossomo” ou “IRES” descreve uma sequência que funcionalmente promove iniciação de tradução independente do gene 5’ do IRES e permite que dois cístrons (quadro aberto de leitura) sejam traduzidos a partir de uma único transcrito em uma célula animal. O IRES fornece um sítio de entrada de ribossomo independente para tradução do quadro aberto de leitura imediatamente a jusante (a jusante é usado de forma intercambiável no presente pedido com 3’) do mesmo. Diferente do mRNA bacteriano que pode ser policistrônico, isto é, codifica vários polipeptídeos diferentes que são traduzidos sequencialmente a partir dos mRNAs, a maioria dos mRNAs de células animais é monocistrônico e codifica a síntese de apenas uma proteína. Com um transcrito policistrônico em uma célula eucarionte, a tradução iniciaria a partir do sítio de iniciação de tradução mais a 5’, terminaria no primeiro códon de parada e o transcrito seria liberado a partir do ribossomo, resultando apenas na tradução do primeiro polipeptídeo codificado no mRNA. Em uma célula eucarionte, um transcrito policistrônico que tem um IRES ligado de maneira funcional ao segundo ou subsequente quadro de leitura no transcrito permite a tradução sequencial do quadro aberto de leitura a jusante, para produzir dois ou mais polipeptídeos codificados pelo mesmo transcrito. O uso de elementos IRES na construção do vetor foi anteriormente descrito, consulte, por exemplo, Pelletier, J., et al., Nature 334 (1988) 320-325; Jang, S.K., et al., J. Virol. 63 (1989) 1651-1660; Davies, M.V., et al., J. Virol. 66 (1992) 1924-1932; Adam, M.A., et al., J. Virol. 65 (1991) 4985-4990; Morgan, R.A., et al. Nucl. Acids Res. 20 (1992) 1293-1299; Sugimoto, Y, et al., Biotechnology 12 (1994) 694-698; Ramesh, N., et al., Nucl. Acids Res. 24 (1996) 2697-2700; e Mosser, D.D., et al., BioTechniques 22 (1997) 150-152).
[0191] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente pedido, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos variantes, por exemplo, que contêm mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigida contra um único determinante em um antígeno. Dessa forma, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas incluindo, mas não se limitando ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo tudo ou parte dos loci da imunoglobulina humana, esses métodos e outros métodos exemplares para produção de anticorpos monoclonais são descritos no presente pedido.
[0192] “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente com estruturas variáveis. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por bissulfeto. A partir da terminação N até C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou um domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). De maneira similar, a partir da terminação N a C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser designada para um dos dois tipos, chamados kappa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante.
[0193] Um “ácido nucleico”, como usado no presente pedido, refere-se a uma molécula polimérica que consiste em nucleotídeos individuais (também chamado bases) a, c, g e t (ou u no RNA), por exemplo, para DNA, RNA, ou modificações dos mesmos. Essa molécula de polinucleotídeo pode ser uma molécula de polinucleotídeo que ocorre naturalmente ou uma molécula sintética de polinucleotídeo, ou uma combinação de uma ou mais moléculas de polinucleotídeo que ocorrem naturalmente com uma ou mais moléculas de polinucleotídeo sintéticas. Também são englobadas por esta definição as moléculas de polinucleotídeo que ocorrem naturalmente, nas quais um ou mais nucleotídeos são alterados (por exemplo, por mutagênese), deletados ou adicionados. Um ácido nucleico pode ser tanto isolado como integrado em outro ácido nucleico, por exemplo, em um cassete de expressão, em um plasmídeo ou no cromossomo de uma célula hospedeira. Um ácido nucleico, da mesma maneira, é caracterizado por sua sequência de ácido nucleico que consiste em nucleotídeos individuais.
[0194] Para um técnico no assunto os procedimentos e métodos são bem conhecidos para converter uma sequência de aminoácidos, por exemplo, de um polipeptídeo, em uma sequência de ácido nucleico correspondente que codifica essa sequência de aminoácidos. Portanto, um ácido nucleico que é caracterizado por sua sequência de ácido nucleico que consiste em nucleotídeos individuais e do mesmo modo pela sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado através disso.
[0195] Um “ácido nucleico”, como usado no presente pedido, refere-se a um ácido nucleico que ocorre naturalmente ou de ocorrência parcialmente ou completamente não natural que codifica um polipeptídeo que pode ser produzido de forma recombinante. O ácido nucleico pode ser construído de fragmentos de DNA que podem ser tanto isolados como sintetizados por meios químicos. O ácido nucleico pode ser integrado em outro ácido nucleico, por exemplo, em um plasmídeo de expressão ou no genoma/cromossomo de uma célula eucarionte. “Plasmídeos” incluem plasmídeos de transferência e de expressão. Tipicamente, o plasmídeo também compreenderá uma unidade de propagação procarionte que compreende uma origem de replicação (por exemplo, a origem de replicação CoIE1) e um marcador selecionável (por exemplo, gene de resistência à ampicilina ou tetraciclina) para replicação e seleção, respectivamente, dos plasmídeos em procariontes.
[0196] “Ligado de maneira funcional” refere-se a uma justaposição de dois ou mais componentes, em que os componentes então descritos estão em uma relação que permite que os mesmos funcionem de sua maneira pretendida. Por exemplo, um promotor e/ou enhancer são ligados de maneira funcional a uma sequência codificadora, se age em cis para controle ou modulação da sequência ligada. Geralmente, mas não necessariamente, as sequências de DNA que são “ligadas de maneira funcional” são contíguas e, quando necessário para união a regiões codificadoras de proteínas como líder secretório e um polipeptídeo, contíguas e no quadro (de leitura). No entanto, embora um promotor ligado de maneira funcional esteja geralmente localizado a montante da sequência codificadora, ele não é necessariamente contíguo a ela. Enhancers não precisam ser contíguos. Um enhancer é ligado de maneira funcional a uma sequência codificadora se os enhancers aumentarem a sequência codificadora. Enhancers ligados de maneira funcional podem estar localizados a montante, dentro ou a jusante das sequências codificadoras e a uma distância considerável do promotor. Um sítio de poliadenilação é ligado de maneira funcional a uma sequência codificadora se este estiver localizado na extremidade a jusante da sequência codificadora, de modo que prossiga através da sequência codificadora na sequência de poliadenilação. Um códon de parada de tradução é ligado de maneira funcional a uma sequência de ácido nucleico exônica, se esta estiver localizada na extremidade a jusante (extremidade 3’) da sequência codificadora, de modo que a tradução prossiga através da sequência codificadora até o códon de parada e é finalizada lá. A ligação é realizada por métodos recombinantes conhecidos na técnica, por exemplo, com o uso da metodologia de PCR e/ou por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios de restrição convenientes não existem, então os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes são usados de acordo com as práticas convencionais.
[0197] Uma “unidade de transcrição policistrônica” é uma unidade de transcrição na qual mais de um gene estrutural está sob o controle do mesmo promotor.
[0198] O termo “sinal de poliadenilação”, como usado dentro deste pedido, denota uma sequência de ácido nucleico que é usada para induzir clivagem e poliadenilação de transcritos primários de um segmento de sequência de ácido nucleico específico. A região não traduzida 3’ que compreende um sinal de poliadenilação pode ser selecionada a partir do grupo que consiste na região não traduzida 3’ que compreende sinais de poliadenilação derivados de SV40, o gene para hormônio de crescimento bovino (bGH), genes da imunoglobulina, e o gene de timidina quinase (tk, por exemplo , sinal de poliadenilação timidina quinase de Herpes Simplex).
[0199] Um “promotor” refere-se a uma sequência de polinucleotídeo que controla um gene/gene estrutural ou sequência de ácido nucleico ao qual ele é ligado de maneira funcional. Um promotor inclui sinais para ligação e iniciação de RNA polimerase. Os promotores usados serão funcionais no tipo celular da célula hospedeira em que a expressão da sequência selecionada é contemplada. Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, induzíveis e repressíveis de uma variedade de fontes diferentes, são bem conhecidos na técnica (e identificados no banco de dados como GenBank) e estão disponíveis como, ou dentro de polinucleotídeos clonados (por exemplo, de depósitos como ATCC, bem como outras fontes comerciais ou individuais).
[0200] Um “promotor” compreende uma sequência de nucleotídeos que direciona a transcrição de um gene Tipicamente, um promotor está localizado na região codificadora ou não traduzida 5’ de um gene , próximo ao sítio de iniciação da transcrição de um gene estrutural. Elementos de sequência dentro de promotores que funcionam na iniciação da transcrição são muitas vezes caracterizados por sequências de nucleotídeos consenso. Esses elementos promotores incluem sítios de ligação de RNA polimerase, sequências TATA, sequências CAAT, elementos específicos de diferenciação (DSEs; McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551), elementos de resposta de AMP cíclicos (CREs), elementos de resposta no soro (SREs; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47), elementos de resposta a glicocorticoides (GREs), e sítios de ligação para outros fatores de transcrição, como CRE/ATF (O’Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938), AP2 (Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728), SP1, proteína de ligação ao elemento de resposta cAMP (CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253) e fatores octâmeros (consulte, em geral, Watson, et al., (eds.), Molecular Biology of the Gene, 4a ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1987)), e Lemaigre, F.P. and Rousseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14). Se um promotor é um promotor induzível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Ao contrário, a taxa de transcrição não é regulada por um agente de indução se o promotor for um promotor constuitutivo. Promotores repressíveis também são conhecidos. Por exemplo, o promotor c-fos é especificamente ativado por ligação do hormônio de crescimento a seu receptor na superfície celular. A expressão ativada por tetraciclina (tet) pode ser alcançada por promotores híbridos artificiais que consistem, por exemplo, em um promotor CMV seguido pelos dois sítios operadores de Tet. O repressor de Tet se liga aos dois sítios operadores de Tet e bloqueia a transcrição. Após adição do indutor de tetraciclina, o repressor de Tet é liberado a partir dos sítios operadores de Tet e a transcrição prossegue (Gossen, M. e Bujard, H., PNAS 89 (1992) 5547-5551). Para outros promotores induzíveis incluindo metalotioneína e promotores de choque térmico, consulte, por exemplo, Sambrook et al. (acima) e Gossen et al., Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520. Entre os promotores de eucariontes que foram identificados como promotores fortes para expressão de alto nível, estão o promotor inicial de SV40, promotor final principal de adenovírus, promotor I de metalotioneína de camundongo, a repetição terminal longa do vírus de sarcoma de Rous, fator de alongamento 1 alfa de hamster chinês (CHEF-1, consultem por exemplo, patente US 5.888.809), EF-1 alfa humano, ubiquitina, e promotor inicial imediato de citomegalovírus humano (CMV IE).
[0201] O “promotor” pode ser constitutivo ou induzível. Um enhancer (isto é, um elemento de DNA que age em cis que atua sobre um promotor para aumentar a transcrição) pode ser necessário para funcionar em conjunto com o promotor para aumentar o nível de expressão obtido com um promotor sozinho, e pode ser incluído como um elemento regulador da transcrição. Com frequência, o segmento de polinucleotídeo contendo o promotor também incluirá sequências enhancer (por exemplo, CMV ou SV40).
[0202] Os termos “estavelmente transformada”, “transfectada estável” ou “estável”, como usado neste pedido, denota uma integração hereditária e estável de ácido nucleico exógeno em um genoma/cromossomo de célula hospedeira. Uma célula transfectada estável é obtida após um processo de seleção celular sob condições seletivas de crescimento, isto é, na presença de um ou mais marcadores de seleção.
[0203] Um “gene estrutural” denota a região de um gene sem uma sequência sinal, isto é, a região codificadora.
[0204] O termo “terminador da transcrição” denota uma sequência de DNA de 50 a 750 pares de bases de comprimento que fornece à RNA polimerase o sinal para terminação da síntese de mRNA. Terminadores muito eficientes (fortes) na terminação 3’ de um cassete de expressão são aconselháveis para prevenir que a RNA polimerase leia, particularmente com o uso de promotores fortes. Terminadores de transcrição ineficientes podem levar à formação de um mRNA ligado ao operon que pode ser a razão para uma expressão gênica indesejada, por exemplo, codificada por plasmídeo.
[0205] Dentro do escopo da presente invenção, células transfectadas podem ser obtidas substancialmente com qualquer tipo de método de transfecção conhecido na técnica. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser introduzido nas células por meio de eletroporação ou microinjeção. De maneira alternativa, reagentes de lipofecção como FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha), X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha) e LipofectAmine (Invitrogen Corp., USA) podem ser usados. Ainda de maneira alternativa, o ácido nucleico pode ser introduzido na célula por sistemas de vetores virais apropriados com base em retrovírus, lentivírus, adenovírus ou vírus adeno-associados (Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314).
[0206] O termo “transfecção temporária”, como usado neste pedido, denota um processo no qual o ácido nucleico introduzido em uma célula não se integra no genoma nem no DNA cromossômico dessa célula. É de fato mantido como um elemento extracromossomal, por exemplo, como um epissomo na célula. Os processos de transcrição do ácido nucleico do epissomo não são afetados e, por exemplo, é produzida uma proteína codificada pelo ácido nucleico do epissomo. Um transfecção temporária resulta em uma célula “transfectada temporária”.
[0207] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs) (consulte, por exemplo, Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), página 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados, com o uso de um domínio VH ou VL, de um anticorpo que se liga ao antígeno para selecionar uma biblioteca dos domínios VL ou VH complementares, respectivamente (consulte, por exemplo, Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628).
[0208] O termo “vetor”, como usado no presente pedido, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de reproduzir outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual este foi introduzido. Certos vetores são capazes de dirigir a expressão de ácidos nucleicos para os quais eles são ligados de maneira funcional. Esses vetores são citados no presente pedido como “vetores de expressão”.
[0209] Os métodos e composições fornecidos no presente pedido são para a produção de anticorpos monoclonais recombinantes. Um anticorpo pode ser de várias estruturas como, mas não se limitando a, anticorpos monoespecífico, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), fragmentos de anticorpo, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes (por exemplo, anticorpos bivalentes).
[0210] Em certas realizações, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv e scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de determinados fragmentos de anticorpos, consulte Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para uma revisão de scFv, consulte, por exemplo, Plueckthun, A., em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore (eds.), Springer-Verlag, Nova York (1994), páginas 269-315; consulte também documento WO 1993/16185; e patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopo que se ligam a receptores de resgate e têm meia vida aumentada in vivo, consulte patente US 5.869.046.
[0211] Diacorpos são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos (consulte, por exemplo, patente EP 0404097; documento WO 1993/01161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; e Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson P. J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134.
[0212] Anticorpos com domínio único são fragmentos que compreendem todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo com domínio único é um anticorpo com domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, patente US 6.248.516).
[0213] Fragmentos de anticorpos podem ser fabricados por várias técnicas incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no presente pedido.
[0214] Em certas realizações, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 68516855. Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “mudança de classe” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.
[0215] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, embora mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, em que, por exemplo, HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[0216] Anticorpos humanizados e métodos para produzir os mesmos são revisados, por exemplo, em Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, e são ainda descritos, por exemplo, em Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; patentes US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 e US 7.087.409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (descrevendo enxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (descrevendo “resurfacing”); Dall’Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 (descrevendo “embaralhamento de FR”); e Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68 e Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (descrevendo “seleção guiada” abordagem para embaralhamento de FR).
[0217] Regiões de estrutura humana que podem ser usadas para humanização incluem, mas não se limitam a: regiões de estrutura selecionadas com o uso do método de “melhor ajuste” (consulte, por exemplo, Sims, M.J., et al. J. Immunol. (1993) 2296-2308); regiões de estrutura derivadas da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis da cadeia pesada (consulte, por exemplo, Carter. P., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 4285-4289; e Presta, L.G., et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 2623-2632); regiões de estrutura maduras humanas (mutadas somaticamente) ou regiões de estrutura de linhagem germinativa humana (consulte, por exemplo, Almagro. J.C., e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); e regiões de estrutura derivadas de seleção de bibliotecas de FR (consulte, por exemplo, Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 (19969) e Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618).
[0218] Em certas realizações, o anticorpo é um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas. Anticorpos humanos são geralmente descritos em van Dijk, M.A. e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 and Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.
[0219] Os anticorpos humanos podem ser preparados por administração de um imunógeno para um animal transgênico, que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta à estimulação antigênica. Esses animais tipicamente contêm toda ou uma porção dos loci da imunoglobulina humana, que substitui os loci da imunoglobulina endógena, ou que estão presentes fora do cromossomo ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Nesses camundongos transgênicos, os loci da imunoglobulina endógena geralmente foram inativados. Para revisão de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, consulte Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125 e também, por exemplo, patentes US 6.075.181 e US 6,150,584 que descreve tecnologia XENOMOUSETM; patente US 5,770,429 que descreve tecnologia HUMAB®; patente US 7.041.870 que descreve tecnologia K-M MOUSE®, e patente US 2007/0061900, que descreve tecnologia VELOCIMOUSE®. Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ainda ser modificadas, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.
[0220] Anticorpos humanos também podem ser fabricados por métodos baseados em hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano-camundongo também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (consulte, por exemplo, Kozbor, D., J. Immunol., 133 (1984) 3001-3005; Brodeur B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nova York (1987), páginas. 51-63; e Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Anticorpos humanos gerados através de tecnologia de hibridoma de células B também são descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (2006) 3557-3562. Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na patente US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM monoclonais humanos de linhagens celulares de hibridomas) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (2006) 265-268 (que descrevem hibridomas humanos-humanos). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers, H.P., e Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927937, e Vollmers, H.P., e Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.
[0221] Anticorpos humanos também podem ser gerados por isolamento de sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição por fago derivadas de humanos. Essas sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. Técnicas para seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.
[0222] Os anticorpos podem ser isolados por seleção de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para geração de bibliotecas de exibição por fago e seleção dessas bibliotecas para anticorpos que possuem as características de ligação desejadas. Esses métodos são revisados, por exemplo, em Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 e ainda descritos, por exemplo, em McCafferty, J., et al., Nature 348, 552-554; Clackson, T., et al., Nature 352 (1990) 624-628; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597; Marks, J.D., and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S., et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V., et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; e Lee, C.V., et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.
[0223] Em certos métodos de exibição por fago, repertórios de genes de VH e VL são clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem ser então selecionados para fago de ligação de antígeno, conforme descrito em Winter, G., et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455 O fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpos, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade para o imunógeno sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório virgem pode ser clonado (por exemplo, humano) para fornecer uma fonte única de anticorpos humanos para uma grande variedade de antígenos não próprios e também próprios sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, bibliotecas virgens também podem ser produzidas sinteticamente por clonagem dos segmentos do gene V não rearranjados a partir de células-tronco e com o uso de primers de PCR que contém sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom, H.R., e Winter, G., J. Mol. Biol., 227 (1992) 381-388. Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fago de anticorpo humano incluem, por exemplo, patentes US 5.750.373, e US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 e US 2009/0002360.
[0224] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos descritos no presente pedido.
[0225] Em certas realizações, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para um primeiro antígeno e a outra é para um segundo antígeno diferente. Em certas realizações, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes do mesmo antígeno. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam o antígeno. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos.
[0226]As técnicas para fabricação de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não se limitam a, coexpressão recombinante de dois pares da cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina que têm especificidades diferentes (consulte, Milstein, C. e Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, documento WO 93/08829, e Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), e “protuberância em orifício” elaborada geneticamente (consulte, por exemplo, patente US 5.731.168). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por realização de direcionamento de engenharia eletrostática para fabricação de moléculas heterodiméricas Fc de anticorpo (documento WO 2009/089004); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, patente US 4.676.980, e Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); com o uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; com o uso de tecnologia “diacorpo” para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); e com o uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) (consulte, por exemplo, Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
[0227] Anticorpos elaborados geneticamente com três ou mais sítios de ligação de antígeno funcionais, incluindo “anticorpos polvo”, também são incluídos no presente pedido (consulte, por exemplo, patente US 2006/0025576).
[0228] O anticorpo pode ser um “Fab de Ação Dupla” ou “DAF” que compreende um sítio de ligação de antígeno que se liga a um primeiro antígeno bem como a um outro antígeno diferente (consulte, patente US 2008/0069820, por exemplo).
[0229] O anticorpo ou fragmento também pode ser um anticorpo multiespecífico, conforme descrito nos documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 ou WO 2010/145793.
[0230] Em certas realizações, os métodos fornecidos no presente pedido são usados para alterar, isto é, para aumentar ou diminuir a quantidade que o anticorpo é glicosilado.
[0231] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato ligado ao mesmo pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos tipicamente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado, que geralmente é ligado por uma ligação N ao Asn297 do domínio CH2 da região Fc. O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a uma GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas realizações, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar anticorpos variantes com certas propriedades aprimoradas.
[0232] Em uma realização, o método fornecido resulta na produção de anticorpos que têm uma estrutura de carboidrato desprovida de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose nesse anticorpo pode ser de 1 % a 80 %, de 1 % a 65 %, de 5 % a 65 % ou de 20 % a 40 %. A quantidade de fucose é determinada pelo cálculo da quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas do tipo complexo, alta manose e híbridas) conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração EU de acordo com Kabat de resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de mais ou menos 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a menores variações de sequência em anticorpos. Essas variantes de fucosilação podem ter função ADCC melhorada (consulte, por exemplo, patentes US 2003/0157108, US 2004/0093621). Exemplos de publicações relacionadas a anticorpos variantes “defucosilados” ou “deficientes em fucose” incluem: patente US 2003/0157108, documento WO 2000/61739, documento WO 2001/29246, patente US 2003/0115614, patente US 2002/0164328, patente US 2004/0093621, patente US 2004/0132140, patente US 2004/0110704, patente US 2004/0110282, patente US 2004/0109865, documento WO 2003/085119, documento WO 2003/084570, documento WO 2005/035586, documento WO 2005/035778, documento WO2005/053742, documento WO2002/031140; Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos desfucosilados incluem células CHO Lec13 deficientes em proteína de fucosilação (Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; patente US 2003/0157108 e documento WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, como gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (consulte, por exemplo, Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; e documento WO 2003/085107).
[0233] Em certas realizações, os métodos fornecidos podem ser usados para produzir anticorpos com oligossacarídeos bifurcados, por exemplo, nos quais um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bifurcado por GlcNAc. Esses anticorpos variantes podem ter fucosilação reduzida e/ou função de ADCC melhorada. Exemplos desses anticorpos variantes são descritos, por exemplo, no documento WO 2003/011878, patentes US 6.602.684 e US 2005/0123546. Também podem ser produzidos anticorpos variantes com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Esses anticorpos variantes podem ter função de CDC melhorada. Esses anticorpos variantes são descritos, por exemplo, nos documentos WO 1997/30087, WO 1998/58964 e WO 1999/22764.
[0234] Anticorpos podem ser produzidos com o uso de métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descritos na patente US 4.816.567. O ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em uma realização adicional, são fornecidos um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem esse ácido nucleico. Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Nessa realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em uma realização, a célula hospedeira é eucarionte, por exemplo, célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp2/0). Em uma realização, é fornecido um método de produção de um anticorpo, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condições adequadas para expressão do anticorpo e opcionalmente recuperação do anticorpo a partir das células hospedeiras (ou meio de cultura de célula hospedeira).
[0235] Para produção recombinante de um anticorpo, o ácido nucleico que codifica um anticorpo é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).
[0236] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procariontes ou eucariontes descritas na presente invenção. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, patentes US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523; consulte também Charlton, K.A., em: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), páginas 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli. Após expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e ainda pode ser purificado.
[0237] Além de procariontes, micróbios eucariontes como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão para vetores que codificam anticorpos, incluindo fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano (consulte Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; e Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215).
[0238] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados também são derivadas a partir de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas linhagens de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[0239] Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas (consulte, por exemplo, patentes US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978, e US 6.417.429 (que descrevem a tecnologia de PLANTIBODIESTM para produção de anticorpos em plantas transgênicas)).
[0240] Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7), linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de rim de filhotes de hamster (BHK), células de Sertoli de camundongo (células TM4, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252), células de rim de macaco (CV1), células de rim de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HELA), células de rim canino (MDCK), células de fígado de rato búfalo (BRL 3A), células de pulmão humano (W138), células de fígado humano (Hep G2), tumor mamário de camundongo (MMT 060562), células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68, células MRC 5 e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR negativas (DHFR-) (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220 e linhagens celulares de mieloma como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para produção de anticorpo, consulte, por exemplo, Yazaki, P. e Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), páginas 255-268.
[0241] Foi descoberto que dependendo da organização do vetor, o desempenho do vetor de expressão difere no (1) projeto de vetor, e (2) vetores idênticos entre transfecções temporária e estável.
[0242] Foi descoberto que a organização ideal do vetor para transfecções temporária e estável podem diferir claramente. Sem estar vinculado a esta teoria, vários pontos podem contribuir para estas diferenças: 1) fenômenos de interferência transcricional entre cópias de vetores integrados no genoma hospedeiro que dependem e são específicos para o respectivo projeto do vetor e que não existem no sistema temporário, 2) a influência do processo de seleção e estringência da seleção que depende da respectiva organização do vetor e que desempenham um papel importante no sistema estável, mas não temporário e 3) o LC ideal para razão de polipeptídeo HC que evidentemente difere na expressão temporária e estável de anticorpos monoclonais e que é menor na transfecção temporária do que estável.
[0243] Foi descoberto que para transfecções temporárias, a expressão bidirecional de LC e HC alcançaram títulos de produto mais altos de todas organizações de vetor testadas. Sem estar vinculado à teoria, é suposto que este projeto de vetor cumpra ambos os critérios para uma expressão ideal de IgG A) altos níveis de expressão dos polipeptídeos LC e HC e B) uma razão de polipeptídeo LC para HC temporária ideal, e C) a expressão bidirecional do LC e HC talvez também minimizem os mecanismos de interferência transcricional conforme interpretado por efeitos da RNA polimerase.
[0244] Foi descoberto que para transfecções estáveis, no entanto, a expressão bidirecional de LC e HC foi pior que a organização LC-HC-SM em fileira. Sem estar vinculado a esta teoria 1) a organização convergente dos cassetes de expressão para LC, HC e SM talvez reduzam fenômenos de interferência transcricional entre cópias de vetores integrados, 2) o LC a montante do HC evidentemente facilita uma razão de polipeptídeo LC para HC que é (mais) ideal para transfecções estáveis, e 3) a posição a jusante do marcador de seleção obviamente aumenta a estringência da seleção. Além disso, foi descoberto que a porcentagem de células que produzem IgG e a produtividade das linhagens celulares aumentaram. O aumento da concentração de pressão de seleção para vetores contendo o marcador de seleção bidirecionalmente a montante dos cassetes de expressão do anticorpo não aumentou a produtividade de pools estáveis nem de clones, no entanto a estringência de seleção claramente aumentou (dados não mostrados).
[0245] Foi descoberto que a troca concomitante do promotor de hCMV e do sinal poli de SV40 pelo promotor hEF1α e o sinal de poliA de bGH aumentou significativamente os títulos de produto temporário quando os cassetes de expressão do anticorpo foram organizados unidirecionalmente, mas diminuíram os títulos de produtos quando os cassetes de expressão de LC e HC foram posicionados bidirecionalmente.
[0246] Foi descoberto que o promotor hEF1α gera um número alto de produção em poços e um número muito baixo de clones que não produzem ou de baixa produção. No entanto, títulos de produtos para os melhores clones individuais do promotor hEF1α na análise de batelada alimentada foram mais baixos que para clones do promotor de hCMV. Mas o número total de clones superiores para o promotor de hCMV é relativamente baixo e sua identificação geralmente necessita de altos esforços de triagem.
[0247] Foi descoberto que o uso de hGT significativamente aumentou a produtividade para vetores contendo o promotor de hCMV quando combinado com o sinal poliA de SV40 ou bGH nas transfecções temporárias, mas também nas estáveis. Para vetores contendo o promotor hEf1α, no entanto, seu efeito no título de produto foi insignificante quando combinado com o sinal de poliA de bGH. Assim, foi descoberto que a influência do hGT no desempenho do vetor é dependente do promotor usado.
[0248] A escolha de clones apropriados para a avaliação final em fermentações em larga escala completamente controladas geralmente é baseada na análise de batelada ou batelada alimentada em frascos agitados. Foi descoberto que diferenças no desempenho e classificação de alguns vetores de expressão ou elementos entre análise de batelada ou batelada alimentada estão presentes. A substituição de poliA de SV40 pelo sinal poliA de bGH aumentou a produtividade para vetores contendo o promotor de hCMV na análise de batelada, mas não na análise de batelada alimentada. O hGT não tem nenhuma influência significativa no título de produto de clones na análise de batelada, mas não na análise de batelada alimentada. As diferenças entre vetores que diferem na posição de marcador de seleção ou no promotor (promotor de hEf1α ou hCMV) foram moderadamente pronunciadas na análise de batelada, mas fortemente evidente na análise de batelada alimentada. Níveis de expressão e razões específicas de produção são mais altas em um modo de batelada alimentada do que em batelada.
[0249] Foi descoberta uma boa correlação no desempenho de análise de batelada alimentada e fermentações de 2L para a maioria de clones, não apenas em nível de títulos de produto absoluto, mas também na classificação entre vetores e clones diferentes.
[0250] Foi descoberto que a posição a jusante do marcador de seleção reduziu levemente reduziu a perda na produtividade, em comparação à posição bidirecional do marcador de seleção a montante dos cassetes de expressão de anticorpo. Sem estar vinculado à teoria, isto talvez seja devido ao aumento de estringência de seleção e assim um nível mais alto de mRNA ou por uma razão malhorada de mRNA de LC para HC ou de polipeptídeo. Ambos os fatores talvez levem a uma tolerância mais alta para alterações na produtividade.
[0251]O sinal poliA de bGH significativamente diminuiu a estabilidade de expressão do anticorpo nos clones, em comparação com o sinal poliA de SV40. No entanto, a inserção do hGT a jusante do sinal poliA de bGH claramente aumentou a estabilidade de expressão. O efeito positivo do hGT na estabilidade foi mais aparente na ausência de pressão de seleção.
[0252] A análise de estabilidade de pools estáveis revelou que células rapidamente perderam a produtividade quando geradas com o hCMV, mas não quando geradas com o promotor de hEf1α. Visivelmente, embora a hGT produtividade diminuída de clones para vetores contendo o promotor de hEf1α, este aumentou levemente sua estabilidade.
[0253]Apenas uma pequena porção dos clones significativamente produz anticorpo depois do processo de seleção. No entanto, modificações na organização e/ou elementos do vetor significativamente aumentaram a razão de produção de IgG para clones não produtores. Organizações diferentes de vetor e assim níveis de expressão diferentes do marcador de seleção que determina a estringência de seleção também afetam claramente a porcentagem de células que produzem IgG. Simulações estatísticas com base nos dados do processo de triagem demonstraram que alguns vetores de expressão também produzem o potencial para diminuir a carga de trabalho consideravelmente durante o processo de triagem. Este fato tem um impacto importante nos custos para as empresas biofarmacêuticas.
[0254] O promotor determina o nível de transcrição de um gene e, dessa forma, tem uma forte influência na produtividade e estabilidade das linhagens celulares: - o início da transcrição mediada pelo promotor determina a quantidade de mRNA que pode ser traduzida em proteína recombinante; - apesar da integração estável, a produtividade em longo prazo de clones pode diminuir rapidamente (em consequência do silenciamento gênico (por exemplo, por metilação do promotor)); - a atividade do promotor é dependente de tipo celular.
[0255] Os promotores tidos como fortes em uma série de linhagens celulares são descritos. Sabe-se que íntrons podem conter elementos semelhantes a enhancers. Com frequência, o primeiro íntron (Íntron A) contém a maioria dos elementos reguladores. Esse Íntron A é o primeiro íntron existente dentro da sequência/organização do promotor natural inteiro.
[0256] A PoliAdenilação do mRNA tem várias funções. Ela influencia fortemente o transporte do mRNA para fora do núcleo, o início da tradução e a estabilidade do mRNA. A eficiência do processo de PoliAdenilação, dessa forma, tem uma forte influência sobre o nível de expressão de um gene e, assim, sobre a produtividade.
[0257] Várias publicações mostraram que o sinal de PoliAdenilação pode ter uma forte influência na expressão proteica. Relatou-se que o sinal PoliA derivado do hormônio de crescimento bovino (sinal PoliA de bGH) pode provocar expressão proteica aumentada quando substituído pelo sinal PoliA de SV40.
[0258] Descobriu-se que o sinal PoliA do hormônio de crescimento bovino pode ter propriedades melhoradas na produção de cadeias de anticorpos recombinantes.
[0259] Os elementos contidos em um vetor de expressão podem interferir fortemente um no outro (interferência transcricional). Isso é devido à competição durante o processo de transcrição. Por exemplo, acesso subótimo do promotor para os fatores de transcrição e/ou RNA polimerase devido a restrições estéricas e disponibilidade reduzida de recursos da maquinaria de transcrição. A interferência também pode ocorrer entre diferentes cassetes de expressão vizinhos. Por exemplo, pode ocorrer uma leitura por meio da RNA polimerase de uma primeira unidade de expressão para uma segunda devido a um término de transcrição ineficiente.
[0260] Relatou-se que um término de transcrição ineficiente pode levar a uma interferência transcricional, podendo provocar expressão ineficiente de um gene. O uso do terminador da transcrição do gene da gastrina humana (hGT) pode melhorar o término da transcrição e, dessa forma, contribuir para uma expressão melhorada de proteínas recombinantes. Esse efeito depende do promotor com o qual o hGT é combinado. Terminadores de transcrição adicionais são conhecidos.
[0261] Descobriu-se que, por inserção da sequência do terminador do gene da gastrina humana após o sinal PoliA inicial de SV40 dos cassetes de expressão do anticorpo, um término de transcrição e prevenção de interferência transcricional entre os cassetes de expressão, por exemplo, de uma cadeia leve de anticorpo e uma cadeia pesada de anticorpo, podem ser atingidos.
[0262] Vetores de expressão são relatados no presente pedido para a expressão aprimorada de um ou mais ácidos nucleicos codificadores, por exemplo, de genes estruturais que codificam cadeias de anticorpos.
[0263] Descobriu-se que a produtividade de uma célula recombinante que expressa o gene estrutural é melhorada quando os elementos gênicos necessários para a transcrição são escolhidos e arranjados adequadamente.
[0264] No vetor p5068, os cassetes de expressão foram terminados pelo sinal PoliA de SV40.
[0265] No vetor px6001, os cassetes de expressão continham adicionalmente o terminador da transcrição da gastrina humana (hGT) que foi colocada a jusante do sinal PoliA de SV40.
[0266] No vetor px6007, os cassetes de expressão foram terminados pelo sinal PoliA de bGH e pelo terminador da transcrição de hGT.
[0267] No vetor px6008, os cassetes de expressão foram terminados pelo sinal PoliA de bGH sem um terminador da transcrição adicional.
[0268] Esses vetores foram transitoriamente transfectados em células CHO-K1 e, seis dias após a transfecção, os sobrenadantes da cultura celular foram coletados e a quantidade de anticorpo produzido no sobrenadante de cultivo foi determinada por ELISA.
[0269] A substituição do sinal PoliA de SV40 pelo sinal PoliA de bGH e a adição/inserção do terminador da gastrina humana (hGT) após o sinal PoliA de SV40 (vetor px6001) provocou um aumento de produtividade na expressão temporária de cerca de 45% a 30% em comparação ao vetor controle p5068. A combinação do sinal PoliA de bGH e do terminador da gastrina humana (hGT) provocou o maior aumento de titulação (+ 58%) em comparação ao vetor controle p5068.
[0270] Dessa forma, descobriu-se que, nos sistemas de expressão temporária, uma poliadenilação pelo sinal PoliA de bGH e um término de transcrição melhorado pela adição do terminador da transcrição da gastrina humana aumentam a secreção do anticorpo.
[0271] Os vetores p5068, px6001, px6007 e px6008 foram usados para gerar linhagens celulares estáveis de expressão do anticorpo.
[0272]A produtividade média dos 15 melhores clones únicos gerados com o vetor p5068 no lote de produção do anticorpo foi de 624 μg/mL. Os clones gerados com o vetor px6001 (contendo o terminador da gastrina humana (hGT)) ou o vetor px6007 (contendo uma combinação do sinal PoliA de bGH e do hGT) tiveram uma produtividade que foi aumentada em 23% e 40%, respectivamente (770 μg/mL para o vetor px6001 e 872 μg/mL para o vetor px6007) em comparação ao vetor p5068 (consulte Figura 1). Esse aumento de produtividade também é refletido no nível do clone principal (+ 23% para o vetor px6001 (939 μg/mL) e + 31% para o vetor px6007 (1001 μg/mL); os valores foram calculados para os três melhores clones obtidos com cada vetor).
[0273]Os clones gerados com o vetor px6008 tiveram uma produtividade média de 576 μg/mL entre os 15 melhores clones.
[0274]A produtividade média dos três melhores clones para o vetor px6008 é de 760 μg/mL.
[0275] No vetor px6051, os cassetes de expressão continham o promotor inteiro de CMV humano com o Íntron A e um sinal PoliA de SV40.
[0276] No vetor px6052, os cassetes de expressão continham o promotor de EF1α humano e um sinal PoliA de SV40.
[0277] No vetor px6062, os cassetes de expressão continham o promotor inteiro de CMV humano com o Íntron A e o sinal PoliA de bGH e o terminador da gastrina humana.
[0278] No vetor px6063, os cassetes de expressão continham o promotor de EF1α humano e o sinal PoliA de bGH e o terminador da gastrina humana.
[0279] Os 18 melhores clones estáveis obtidos com cada vetor foram identificados e a produtividade dos clones foi testada na análise de lote.
[0280] A substituição do sinal PoliA de SV40 pela combinação do sinal PoliA de bGH e hGT aumenta a produtividade média; no caso do promotor de hEF1α em cerca de 19% (505 μg/mL para o vetor px6063 vs. 426 μg/mL para o vetor 6052) e no caso do promotor inteiro de hCMV em cerca de 71% (333 μg/mL para o vetor px6062 vs. 195 μg/mL para o vetor px6051).
[0281] O aumento de produtividade também pode ser visto no nível do clone principal (+ 36% para o vetor px6063 (693 μg/mL) vs. vetor px6052 (511 μg/mL) a + 102% para o vetor px6062 (529 μg/mL) vs. vetor px6051 (262 μg/mL), os valores são calculados para os três melhores clones de cada vetor) (consulte Figura 2).
[0282] Dessa forma, descobriu-se que a combinação do promotor de hEF1α com o sinal PoliA de bGH e hGT aumenta a produtividade na transfecção estável com o uso de uma organização vetorial bidirecional com o cassete de expressão para o marcador seletivo em uma direção de transcrição e os cassetes de expressão para a cadeia leve a montante do cassete de expressão para a cadeia pesada na respectiva direção oposta de transcrição (consulte px6052).
[0283]Além disso, descobriu-se que a combinação do sinal PoliA de bGH e de hGT aumenta a produtividade na transfecção estável para o promotor de hCMV com o uso tanto de uma organização vetorial unidirecional com o cassete de expressão para a cadeia leve a montante do cassete de expressão para a cadeia pesada que, por sua vez, está localizada a montante do cassete de expressão do marcador seletivo (orientação 5’^3’ dos cassetes de expressão LC-HC-SM) (consulte px9005), ou uma organização vetorial bidirecional com o cassete de expressão para o marcador seletivo em uma direção de transcrição e os cassetes de expressão para a cadeia leve a montante do cassete de expressão para a cadeia pesada na respectiva direção oposta de transcrição (consulte px6007).
[0284] A combinação do sinal PoliA de bGH e de hGT também foi usada em uma abordagem de transfecções temporárias. Os vetores px6062 e px6063 (contendo o promotor inteiro de hCMV ou o promotor de hEF1α com a combinação do sinal PoliA de hGH e de hGT) foram diretamente comparados a vetores px6051 e px6052 (contendo o promotor inteiro de hCMV ou o promotor de hEF1α com o sinal PoliA de SV40).
[0285] Ao contrário das transfecções estáveis, a combinação do sinal PoliA de hGH e do terminador da gastrina humana (hGT) não aumenta a produtividade em transfecções temporárias, nem no caso do promotor inteiro de CMV humano com o Íntron A, nem no caso do promotor de EF1α humano com o Íntron A (2,38 μg/mL para o vetor px6052 vs. 2,32 μg/mL para o vetor px6063). No caso do promotor inteiro de CMV humano com o Íntron A, a combinação do sinal PoliA de hGH e do terminador da gastrina humana (hGT) provocou uma produtividade de 2,74 μg/mL para o vetor px6062A e de 3,64 μg/mL para o vetor px6051.
[0286] Em células obtidas por transfecção temporária, descobriu- se que a combinação do promotor curto de CMV com a sequência do sinal PoliA do hormônio de crescimento bovino e do terminador da gastrina humana provoca um rendimento aumentado da expressão do anticorpo.
[0287] Em linhagens celulares obtidas por transfecção e seleção de clones de células estáveis, descobriu-se que a combinação da sequência do sinal PoliA do hormônio de crescimento bovino e do terminador da gastrina humana, independentemente do promotor usado, provoca um rendimento aumentado da expressão do anticorpo.
[0288] No vetor p5068, a expressão dos genes que codificam ambas as cadeias leve (LC) e pesada (HC) do anticorpo é dirigida pelo promotor curto do CMV humano (hCMV). Esse promotor é ativo em uma ampla faixa de tipos celulares e é comumente usado em plasmídeos de expressão de mamíferos. Como a atividade do promotor é fortemente dependente do tipo celular e sabe-se que o promotor de hCMV é sensível aos efeitos do silenciamento gênico, uma vez que a metilação do promotor é possivelmente mais forte e/ou existem promotores mais resistentes em células CHO-K1 .
[0289] Os vetores de expressão que compreendem diferentes promotores foram construídos: i) compreendendo o promotor curto de hCMV sem Íntron A, ii) promotor inteiro de hCMV com Íntron A, iii) promotor inteiro de CMV de rato com Íntron A e iv) o promotor de hEF1α com Íntron A.
[0290] Os vetores contendo o promotor inteiro de hCMV (px6051), o promotor de hEF1α (px6052) e o promotor de CMV de rato (px6053) foram construídos e usados para transfecções temporárias e estáveis.
[0291] Os vetores de expressão p5068, px6051, px6052 e px6053 foram transitoriamente transfectados em células CHO-K1 por nucleofecção e, quatro dias após a transfecção, o sobrenadante da cultura celular foi coletado e a produtividade foi determinada por ELISA.
[0292] Os vetores contendo o promotor de hEF1α com Íntron A (px6052) ou o promotor inteiro de hCMV com Íntron A (px6051) tiveram uma produtividade aumentada em 53% e 134%, respectivamente, em comparação ao vetor de expressão p5068 (3,64 μg/mL para o vetor px6051; 2,38 μg/mL para o vetor px6052; 1,56 μg/mL para o vetor p5068). O vetor px6053 contendo o promotor de CMV de rato, no entanto, mostrou uma produtividade reduzida em aproximadamente 50% (0,8 μg/mL para p5068) (consulte Figura 3).
[0293] Os vetores contendo o promotor inteiro de CMV (vetores px6051 e px6062) ou o promotor de hEF1α com Íntron A (vetores px6052 e px6063) também foram usados para transfecções estáveis.
[0294] Os vetores de expressão p5068, px6051, px6052 e px6053 foram transfectados em células CHO-K1 por nucleofecção e as misturas estáveis foram selecionadas. A produtividade das misturas foi determinada na análise de lote.
[0295] A análise de lote de misturas estáveis mostrou que as titulações do anticorpo das células transfectadas com o vetor que continha o promotor de hEF1α com Íntron A (vetor px6052) foram mais de 4 vezes maior do que aquelas de células transfectadas com o vetor contendo o promotor curto de hCMV (vetor p5068) ou com o vetor contendo o promotor inteiro de hCMV com Íntron A (vetor px6051) (78 μg/mL para o vetor px6052; 14 μg/mL para o vetor p5068; 17 μg/mL para o vetor px6051; 8,46 μg/mL para o px6053) (Figura 4).
[0296] Com o uso do vetor de expressão p5068, px6051 e px6052, clones estáveis foram gerados. Adicionalmente, os vetores px6062 e px6063 (ambos contendo a combinação do sinal PoliA de bGH e o terminador da gastrina humana ao invés do sinal PoliA de Sv40) foram usados.
[0297] A análise de lote dos 54 melhores clones obtidos com cada vetor mostrou que a produtividade média das células transfectadas com o vetor px6052 foi de 316 μg/mL e, para o vetor p5068, de 341 μg/mL. Os clones gerados com os vetores px6051 e px6062 contendo o promotor inteiro de hCMV tiveram uma produtividade média de 141 μg/mL para o vetor px6051 e de 220 μg/mL para o vetor px6062.
[0298] A produtividade média dos 54 clones testados transfectados com o vetor px6063 (contendo o promotor de hEF1α em combinação com o sinal PoliA de bGH e hGT) na análise de lote foi de 367 μg/mL. Os melhores clones com a titulação mais alta são derivados do vetor px6063 (748 e 731 μg/mL, respectivamente).
[0299] Descobriu-se que clones gerados com o vetor contendo o promotor de EF1α humano (px6052 e px6063) mostram um número reduzido de clones baixo produtores.
[0300] Os clones foram testados para a estabilidade da produção de anticorpos. Doze clones obtidos com os vetores p5068 e px6052 foram cultivados na presença ou na ausência de Higromicina B para as três passagens.
[0301] Na ausência de pressão seletiva (Higromicina B) para as três passagens, uma redução de 35% na produtividade média dos 12 clones testados foi observada para o promotor curto de hCMV desprovido de Íntron A (p5068; 264 μg/mL vs. 410 μg/mL). Por outro lado, somente uma redução de 18% na produtividade média foi observada para o promotor de hEF1 α com o Íntron A (px6052, 256 μg/mL vs. 312 μg/mL).
[0302] Na presença de pressão seletiva, os clones obtidos com o vetor p5068 mostraram uma redução na produtividade média de 27% (298 μg/mL vs. 410 μg/mL) e as titulações dos clones obtidos com o vetor px6052 contendo o promotor de hEF1α com o Íntron A diminuíram em 15% (266 μg/mL vs. 312 μg/mL).
[0303]O número de clones estáveis, transfectados com o vetor p5068 contendo o promotor curto de hCMV desprovido de Íntron A ou com o vetor px6052 contendo o promotor de hEF1α com o Íntron A, após três passagens com ou sem pressão seletiva foi determinado. Para determinar se um clone é “estável” após três passagens, as titulações de IgG da passagem zero foram estabelecidas como 100% e um limiar de 80% foi definido. Os clones que mostravam titulações relativas de IgG após três passagens com ou sem pressão seletiva menores do que 80% da titulação de IgG na passagem zero (passagem 0) foram definidas como instáveis.
[0304] As titulações relativas após três passagens, tanto com como sem pressão seletiva, de todos os clones transfectados com p5068 caíram abaixo de 80% em comparação com a titulação do anticorpo da passagem zero. Um clone celular estável é uma população de células clonais que produz uma titulação do anticorpo de 80% ou mais em comparação à titulação do anticorpo da passagem zero na presença de pressão seletiva, assim como na ausência de pressão seletiva.
[0305] As titulações relativas após três passagens, tanto com como sem pressão seletiva, dos clones transfectados com px6052 caíram abaixo de 80% em comparação com a titulação de IgG da passagem zero em 8 dos 12 clones, mas 4 clones foram definidos como “estáveis”. Ao contrário de clones gerados com o vetor p5068, 8 dos 12 clones gerados com o vetor px6052 são “estáveis” na presença de pressão seletiva. Por outro lado, somente um clone derivado pelo vetor p5068 é estável na presença de pressão seletiva.
[0306] Os vetores px6014, px6014A e px6014B contêm o promotor de hEF1α na frente da cadeia leve de anticorpo e o promotor curto de hCMV na frente da cadeia pesada. Esses vetores variam na UTR 5’ da cadeia leve (px6014: UTR 5’ do promotor de hEF1α contendo o sítio de restrição Pmel; px6014A: UTR 5’ do promotor de hEF1α sem o sítio de restrição Pmel; px6014B: UTR 5’ do promotor de hEF1α mais o UTR 5’ do vetor p5068). Os vetores foram transitoriamente transfectados em células CHO-K1 com o uso de nucleofecção.
[0307] Os vetores px6014A e px6014B mostram uma produtividade aumentada em 20% e 40%, respectivamente, em comparação ao vetor px6014 (2,01 μg/mL para o vetor px6014B; 1,71 μg/mL para o vetor px6014A; 1,41 μg/mL para o vetor px6014).
[0308] Descobriu-se que em vetores de transfecções temporárias contendo o promotor de EF1α humano ou o promotor inteiro de CMV humano (ambos com o Íntron A) mostram uma produtividade melhorada em comparação ao vetor p5068.
[0309] Descobriu-se que as misturas estáveis geradas com vetores contendo o promotor de EF1α humano mostram uma produtividade melhorada na análise de lote em comparação ao vetor p5068.
[0310] Descobriu-se que os clones celulares obtidos por transfecções estáveis com vetores contendo o promotor de EF1α humano com o Íntron A mostram um número reduzido de clones baixo produtores.
[0311] Descobriu-se que os clones celulares obtidos por transfecção estável com vetores contendo o promotor inteiro de CMV humano com o Íntron A mostram uma produtividade fortemente reduzida, tanto em relação ao nível médio como ao nível do clone principal.
[0312] Dessa forma, descobriu-se que a combinação do sinal PoliA de bGH e do hGT aumenta a produtividade em comparação ao PoliA de SV40 em transfecção estável, independentemente do promotor usado, com o uso de uma organização vetorial bidirecional com o cassete de expressão para o marcador seletivo em uma direção de transcrição e os cassetes de expressão para a cadeia leve a montante do cassete de expressão para a cadeia pesada na respectiva direção de transcrição oposta (consulte px6052).
[0313] Além disso, descobriu-se que a combinação do sinal PoliA de bGH e do hGT aumenta a produtividade na transfecção estável para o promotor de hCMV com o uso de uma organização vetorial unidirecional com o cassete de expressão para a cadeia leve a montante do cassete de expressão para a cadeia pesada que, por sua vez, está localizado a montante do cassete do marcador seletivo (orientação 5’^3’ dos cassetes de expressão LC-HC-SM).
[0314] Devido ao elevado número de clones não produtores ou de baixa produção e a baixa estabilidade da expressão gênica, o desenvolvimento da linhagem celular é simultaneamente muito demorado e dispendioso. Em milhares de clones normalmente são encontrados somente poucos “altos produtores” estáveis.
[0315] Sem limitar-se à teoria, uma possível razão para a baixa seletividade e rigor de uma estratégia de seleção pode ser a expressão separada do anticorpo e do marcador seletivo no sistema vetorial usado que não exerça a pressão seletiva na expressão do anticorpo (consulte, por exemplo, vetor p5069).
[0316] Descobriu-se que pelo uso de um elemento IRES esse problema pode ser superado.
[0317] Os elementos IRES são elementos de DNA que atuam - no nível do mRNA - como um sítio interno de entrada no ribossomo e, dessa forma, permitem a expressão de dois genes a partir de um mRNA.
[0318] A expressão ligada a IRES do marcador seletivo e da cadeia do anticorpo exerce a pressão seletiva na expressão total do anticorpo (isto é, um mRNA que codifica tanto o marcador seletivo como a cadeia do anticorpo) e, dessa forma, garante a seletividade da seleção. A estabilidade da expressão gênica pode ser aumentada.
[0319] O uso de um elemento IRES com baixa atividade de IRES permite uma expressão fraca do marcador seletivo. Essa expressão fraca do marcador seletivo pode aumentar o rigor da seleção.
[0320] Pela coexpressão ligada a IRES do marcador seletivo e da cadeia do anticorpo, o processo de seleção pode ser melhorado por: - aumentar o número de células produtoras, - aprimorar a estabilidade da expressão gênica, e - aprimorar estringência do processo seletivo.
[0321] Para a coexpressão ligada a IRES do anticorpo e do marcador seletivo, o elemento IRES usado tem que preencher dois requisitos: - o elemento IRES pode não interferir ou somente interferer minimamente na estabilidade do mRNA/expressão do anticorpo, e - o elemento IRES tem que mostrar fraca atividade IRES de modo que o marcador seletivo é somente sutilmente expresso.
[0322] Os ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada foram ligados por vários elementos IRES, o EV71-IRES, o ELF4G- IRES e o elemento EMCV-IRES (vetores px6015A, px6015B e px6015C). O cassete de expressão compreende na direção 5’ para 3’, o promotor de CMV humano, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve, o IRES, o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada e o sítio PoliA.
[0323] O vetor p5068 sem o elemento IRES como referência e os vetores px6015A, px6015B e px6015C foram transitoriamente transfectados em células CHO-K1 e a produtividade foi determinada por ELISA.
[0324] Os vetores px6015B e px6015C (contendo o ELF4G e o EMCV-IRES, respectivamente) mostram uma expressão de IgG de 0,1 μg/mL a 0,15 μg/mL. O vetor p5068 mostra uma expressão de IgG de 2 μg/mL. O vetor px6015A contendo o EV71-IRES mostra uma produtividade de 1,7 μg/mL.
[0325] Alternativamente, o marcador seletivo Neomicina pode ser ligado pelo elemento IRES diretamente à cadeia pesada de anticorpo. O vetor compreende na direção 5’ para 3’ os elementos promotor de CMV humano, o ácido nucleico que codifica a cadeia leve, sítio PoliA, promotor de CMV humano, ácido nucleico que codifica a cadeia pesada, elemento IRES, marcador seletivo neomicina e sítio PoliA.
[0326] Os vetores px6010A, px6010B e px6010C foram transitoriamente transfectados em células CHO-K1, conforme descrito, e a produtividade foi determinada por ELISA.
[0327] O vetor px6010C contendo o EMCV-IRES mostra uma produtividade de 13 μg/mL. O vetor p5069 mostra uma produtividade de 14 μg/mL. Os vetores contendo o EV71-IRES (vetor px6010A) ou o ELF4G-IRES (vetor px6010B) mostram uma produtividade de 4,3 μg/mL e 2,4 μg/mL, respectivamente.
[0328] Dessa forma, descobriu-se que o elemento EMCV-IRES preenche os requisitos necessários para a expressão ligada a IRES de um marcador seletivo: - uma fraca atividade IRES (de modo que o marcador seletivo é somente sutilmente expresso), - no máximo, uma influência mínima do elemento IRES - respectivamente a expressão ligada a IRES do marcador seletivo - na expressão do anticorpo.
[0329] Dessa forma, o marcador seletivo Neomicina (medeia a resistência a G148) pode ser ligada ao ácido nucleico que codifica a cadeia pesada pelo EMCV-IRES.
[0330] Os vetores p5069 e px6010C foram testados para a produtividade e a estabilidade em transfecções estáveis, tanto na mistura como ao nível de clone único.
[0331] Os vetores foram transfectados em células CHO-K1 pela tecnologia de nucleofecção. As misturas estáveis foram selecionadas e a produtividade das misturas foi analisada pela análise de lote.
[0332] As misturas geradas com o vetor px6010C mostram uma produtividade na análise de lote de 14 μg/mL. As misturas geradas com o vetor p5069 mostram uma produtividade na análise de lote de 5,4 μg/mL (Figura 5).
[0333] Descobriu-se que as misturas geradas com o vetor px6010C consistem de mais células produtoras (ou mais células produtoras boas) e/ou a estabilidade da expressão de IgG é aumentada (em comparação ao vetor p5069).
[0334] Descobriu-se que a expressão ligada a IRES do marcador seletivo Neomicina no vetor px6010C também leva a uma estabilidade aumentada da mistura. As misturas estáveis foram cultivadas na presença e na ausência da pressão seletiva por 30 gerações. No começo (= geração 0) e no final (= geração 30) do teste de estabilidade, a produtividade das misturas foi determinada na análise de lote.
[0335] As misturas geradas com o vetor px6010C mostram uma estabilidade aumentada da expressão de IgG na análise de lote em comparação às misturas geradas com o vetor p5069. A produtividade das misturas obtidas com o vetor p5069 na análise de lote diminuiu fortemente (> 80%; os valores abaixo do limite de detecção) após 30 gerações tanto na presença como na ausência de pressão seletiva. A produtividade das misturas geradas com o vetor px6010C também diminuiu cerca de 70% na ausência de pressão seletiva. Na presença de pressão seletiva, no entanto, a produtividade de misturas geradas com o vetor px6010C diminuiu somente em 10% (Figura 6).
[0336] O vetor p5069 e o vetor px6010C foram transfectados em células CHO-K1 por nucleofecção e os clones estáveis foram gerados, conforme descrito acima. Os clones foram triados e a produtividade dos 15 melhores clones de cada transfecção foi analisada. Duas transfecções independentes de cada vetor foram realizadas.
[0337] Os clones gerados com o vetor px6010C mostra uma produtividade média de 348 μg/mL. Os clones gerados com o vetor p5069 mostram uma produtividade média de 239 μg/mL. A produtividade média aumentada de clones gerados com o vetor px6010C não é devido a clones principais melhores, mas a um número claramente reduzido de clones baixo produtores. Ao contrário do vetor p5069, os clones gerados com o vetor px6010C não mostram produtividades mais baixas do que 200 μg/mL na análise de lote (Figura 7).
[0338] A estabilidade da expressão do anticorpo foi testada para 17 clones (p5069) e 14 clones (px6010C), respectivamente, pelo cultivo na presença e na ausência de pressão seletiva por 45 gerações. A produtividade de clones foi medida no começo do teste de estabilidade (geração 0) e na geração 45 na análise de lote. A titulação de IgG da geração 45 foi comparada à produtividade dos clones no começo do teste de estabilidade.
[0339] A produtividade média dos 17 clones gerados com o vetor p5069 diminuiu após 45 gerações tanto na presença como na ausência de pressão seletiva (aproximadamente 43% de perda na produtividade). A produtividade média dos 14 clones gerados com o vetor px6010C diminuiu na ausência de pressão seletiva para aproximadamente 45%. No entanto, na presença de marcador seletivo, a redução da produtividade para esses clones é de 4%.
[0340] Na presença de pressão seletiva somente 6 dos 17 clones testados gerados pelo vetor p5069 mostram uma produtividade que está ainda acima de 80% da produtividade na geração 0. Por outro lado, 10 dos 14 clones testados gerados com o vetor px6010C mostram uma produtividade acima de 80% da produtividade na geração 0.
[0341] Na ausência de pressão seletiva, não há diferença significativa na estabilidade entre os clones gerados com o vetor p5069 e com o vetor px6010C, respectivamente.
[0342] Devido a intensos esforços de triagem, o desenvolvimento da linhagem celular é simultaneamente muito demorado e dispendioso. Em milhares de clones, encontra-se geralmente somente poucos altos produtores estáveis.
[0343] Simultaneamente existem várias estratégias de triagem para a identificação de clones de alta produção: - estratégias de triagem baseadas em ELISA para a detecção direta da proteína produzida (demoradas e caras); - estratégias de triagem baseadas em fluorescência para a detecção direta da proteína produzida (demoradas e caras); - triagem baseada em FACS de células que co-expressam um marcador seletivo quantitativo (proteínas de superfície ou marcador fluorescente como GFP) para a detecção/quantificação indireta da proteína produzida.
[0344] Na maioria dos casos, a expressão do marcador fluorescente não está ligada à expressão do anticorpo. Isso limita a dependência da intensidade de fluorescência e da produtividade, de modo que não há com frequência uma boa correlação entre a intensidade de fluorescência e a produtividade.
[0345] A proteína-GFP (como exemplo de um marcador fluorescente) é estável e tende a acumular. Não há (na maioria dos casos) uma boa correlação entre o nível de expressão do marcador fluorescente nas células (intensidade de fluorescência) e sua produtivdade.
[0346] Descobriu-se, pela ligação da expressão do anticorpo e da expressão do marcador fluorescente, uma estratégia combinada de seleção e triagem para identificar os clones celulares que têm uma estabilidade e produtividade aumentadas, mas ao mesmo tempo simples e, dessa forma, permite uma identificação rápida e fácil de altos produtores.
[0347] Descobriu-se que a expressão ligada a IRES de uma proteína de fusão atua tanto como marcador seletivo quanto como um marcador de triagem quantitativo.
[0348] Uma proteína de fusão da proteína fluorescente verde (GFP) e o marcador seletivo neomicina que está diretamente ligado à cadeia pesada de anticorpo por um elemento IRES foi construído. A proteína fluorescente verde e o marcador seletivo neomicina na proteína de fusão são separados pela sequência PEST (sequência que corresponde aos códons 423 a 449 do gene da ornitina descarboxilase de camundongo (mODC)). Essa sequência PEST atua no nível proteico como uma sequência sinal proteolítica forte, dessa forma, reduzindo claramente a meia-vda da proteína.
[0349] A proteína GFP-PEST-Neo atua não somente como marcador seletivo, mas adicionalmente como marcador de triagem quantitativo.
[0350] O uso da sequência PEST fornece uma seleção melhorada de clones devido à meia vida reduzida, mediada por PEST, da proteína de fusão (rigor aprimorado de seleção).
[0351] O uso da sequência PEST fornece uma boa correlação entre a intensidade de fluorescência de GFP da proteína de fusão e o nível de expressão do anticorpo devido à co-expressão ligada a IRES do anticorpo e do marcador seletivo.
[0352] O uso da sequência PEST reduz o acúmulo da proteína de fusão devido à meia vida reduzida da proteína.
[0353] O nível de expressão de GFP de clones estáveis únicos foi analisado por FACS e correlacionado à produtividade na análise de lote. As populações com diferentes níveis de expressão de GFP de misturas estáveis foram triadas por FACS e a produtividade das populações triadas foi analisada.
[0354] Os elementos IRES que preenchem os requisitos para essa abordagem: - deve fornecer fraca atividade IRES, de modo que a proteína de fusão seja somente sutilmente expressa; - não deve influenciar o nível de expressão do anticorpo.
[0355] A atividade ou força de IRES foi determinada pela ligacão da expressão da cadeia leve e da cadeia pesada por vários elementos IRES, o EV71- IRES, o ELF4G-IRES e o elemento EMCV-IRES (consulte os vetores px6015A, px6015B e px6015C). O vetor p5068 (sem o elemento IRES) como referência e os vetores px6015A, px6015B e px6015C foram transitoriamente transfectados em células CHO-K1 e a produtividade foi medida por ELISA.
[0356] Os vetores px6015B e px6015C (contendo o ELF4G e o EMCV-IRES, respectivamente) mostram uma expressão de IgG de 0,1 a 0,15 μg/mL. Uma expressão de IgG de 2 μg/mL foi mostrada para o vetor p5068. O vetor px6015A contendo o EV71-IRES mostrou uma produtividade de 1,7 μg/mL indicando que o elemento EV71-IRES tem uma forte atividade IRES em células CHO-K1.
[0357] A proteína de fusão GFP-PEST-Neo está ligada pelo elemento IRES diretamente ao ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo (consulte Figura 8).
[0358] Um constructo no qual o elemento IRES ligava o marcador seletivo à cadeia pesada de anticorpo compreendidos nos vetores px6011A, px6011B e px6011C foi transitoriamente transfectado em células CHO-K1, conforme descrito, e a produtividade foi determinada por ELISA.
[0359] O vetor px6011C contendo o EMCV-IRES mostra uma produtividade de IgG de 8,7 μg/mL e o vetor p5059 mostrou uma produtividade de IgG de 10,8 μg/mL. O vetor px6011A contendo o EV71-IRES mostrou uma produtividade de 3,9 μg/mL. O vetor px6011B contendo o ELF4G-IRES não mostrou produtividade relevante.
[0360] O vetor px6011C com a proteína de fusão GFP-PEST-Neo ligada a IRES, o vetor p5069 e o vetor px6010C foram testados na análise de lote de misturas estáveis e clones estáveis.
[0361] Os vetores p5069, px6010C e px6011C foram transfectados em células CHO-K1 por nucleofecção. As misturas estáveis foram selecionadas, conforme descrito, e a produtividade das misturas estáveis foi analisada pela análise de lote.
[0362] As misturas estáveis geradas com o vetor px6010C contendo o marcador seletivo ligado a IRES mostraram uma produtividade de IgG de 9,5 μg/mL. As misturas estáveis geradas com o vetor p5069 mostraram uma produtividade de 5,4 μg/mL. As misturas geradas com o vetor px6011C contendo a proteína de fusão ligada a IRES mostraram uma produtividade de 36,3 μg/mL (Figura 9).
[0363] Esses dados sugerem que as misturas geradas com os vetores px6010C e px6011C, aparentemente, consistem de muito mais células produtoras ou mesmo células produtoras boas do que as misturas (geradas com o vetor p5069). Uma estabilidade aprimorada da expressão de IgG da/nas misturas de px6010C e px6011C também pode contribuir para a produtividade aumentada.
[0364] Para comparar a produtividade do vetor de expressão p5068 com os vetores px6010C e px6011C nos clones estáveis, os vetores foram transfectados em células CHO-K1 por nucleofecção. Os clones estáveis foram selecionados, conforme descrito, e os clones foram triados. A produtividade dos 15 melhores clones com cada vetor foi analisada pela análise de lote.
[0365] Para o vetor p5068, 95 dos 3072 poços em 384 placas mostraram uma produção de IgG acima de 2 μg/mL (fundo). A expressão ligada a IRES do marcador seletivo (px6010C) duplicou o número de clones/poços produtores para 195, e no caso da proteína de fusão ligada a IRES (px6011C), o número de células/poços produtores foi ainda aumentada para mais de 280.
[0366] Além disso, não somente o número de clones produtores, mas também a produtividade média dos clones contendo IRES (gerados pelos vetores px6010C e px6011C é maior (3,4 μg/mL para o vetor p5069; 4,2 μg/mL para o vetor px6010C; 8,1 μg/mL para o vetor px6011C para os 100 melhores clones de cada vetor; 2,2 μg/mL para o vetor p5069; 3,0 μg/mL para o vetor px6010C; 5,1 μg/mL para o vetor px6011C para os 250 melhores clones de cada vetor).
[0367]Os clones gerados com os vetores IRES px6010C e px6011C e p5059 mostraram uma produtividade média na triagem de 24 poços de 212 μg/mL para o vetor px6011C, 178 μg/mL para o vetor px6010C e 118 μg/mL para o vetor p5069 (determinada em 24 culturas de poços com uma contagem celular indefinida no dia 4 após a separação celular). Para os vetores px6010C e px6011C, um número reduzido de clones não ou baixo produtores e um número aumentado de células produtoras boas podem ser vistos (Figura 10).
[0368] A análise de lote de clones únicos mostrou que a produtividade média dos 15 melhores clones gerados com o vetor px6010C é de 348 μg/mL e 239 μg/mL para o vetor p5069. A produtividade média dos 15 melhores clones gerados com o vetor px6010C é de 404 μg/mL. Os clones com a mais alta titulação total derivam de transfectantes com o vetor px6011C. Os clones gerados com o vetor px6010C e com o vetor px6011C não mostram produtividades mais baixas do que 200 μg/mL na análise de lote.
[0369] Para testar os clones quanto à estabilidade da expressão de anticorpos, 14 dos 19 clones obtidos com cada vetor foram cultivados na presença ou na ausência de pressão seletiva (G418) por 45 gerações. A produtividade de clones foi medida no começo do teste de estabilidade (geração 0) e na geração 45 na análise de lote. A titulação de IgG da geração 45 foi comparada à produtividade dos clones no começo do teste de estabilidade na geração 0 (valores estabelecidos em 100%).
[0370] A produtividade média dos 17 clones gerados com o vetor p5069 diminuiu após 45 gerações na presença e na ausência de pressão seletiva (aproximadamente 43% de perda em produtividade). A produtividade média dos 14 a 19 clones gerados com os vetores px6010A e px6011C, respectivamente, também diminuiu na ausência de pressão seletiva (aproximadamente 45 a 35% de perda em produtividade), mas na presença do marcador seletivo G418, a redução da produtividade média para esses clones é de somente 0 a 4% após 45 gerações.
[0371] Na presença de pressão seletiva G418, 6 dos 17 clones testados gerados pelo vetor p5069 mostraram uma produtividade acima de 80% da produtividade na geração 0. Por outro lado, 10 dos 14 clones testados gerados com o vetor px6010C e 17 dos 19 clones testados gerados com o vetor px6011C mostraram uma produtividade acima de 80% da produtividade na geração 0.
[0372] Na ausência de pressão seletiva, os clones gerados com os vetores p5069, px6010C e px6011C mostram comportamento semelhante.
[0373] Descobriu-se que os vetores compreendendo IRES e, dessa forma, os clones obtidos a partir deles têm uma estabilidade aprimorada na presença de marcador seletivo.
[0374] Na ausência de marcador seletivo, no entanto, não há diferença na estabilidade entre os clones obtidos com um vetor contendo IRES ou com um vetor sem IRES.
[0375] A proteína de fusão GFP-PEST-Neo é útil como um marcador de triagem quantitativo. O nível fluorescente de GFP dos clones gerados com o vetor px6011C é preditivo de sua produtividade.
[0376] O nivel de expressão de GFP/intensidade de fluorescência de clones únicos foi determinado e os resultados foram correlacionados à produtividade dos clones na análise lote, as populações com diferentes níveis de expressão de GFP/intensidades de fluorescência foram triadas a partir de misturas estáveis por FACS (1.000 células de cada vetor) e, então, a produtividade dessas diferentes populações foi analisada pela análise de lote. Três diferentes populações foram triadas: População 1: nenhuma média geométrica de expressão de GFP (GM) de FL1-H (=GFP) 0 - 4 População 2: baixo nível de expressão de GFP, GM 4 - 5.5 População 3: alto nível de expressão de GFP, GM 5.5 - 7.
[0377] As análises de lote e FACS mostram que há, tanto ao nível dos clones únicos como das misturas, uma boa correlação entre a fluorescência de GFP dos clones/misturas e sua produtividade. Os clones ou misturas com uma alta fluorescência de GFP, geralmente, mostram uma produtividade maior do que células que mostram uma baixa fluorescência de GFP. Em geral, a produtividade de um clone/mistura aumenta com sua intensidade de fluorescência (Figuras 11 e 12).
[0378]Clones altos produtores podem ser identificados diretamente por uma triagem baseada em FACS de clones únicos de alta fluorescência de GFP a partir de misturas estáveis. Os clones únicos que mostram nenhuma ou alta expressão de GFP foram triados por FACS. Os clones foram expandidos em placas de 6 poços sob agitação e a produtividade dos clones foi determinada na análise de lote.
[0379] Descobriu-se que a expressão ligada a EMCV-IRES do marcador seletivo ou da proteína de fusão GFP-PEST-Neo claramente aprimora a seletividade do marcador seletivo (resultando em mais clones produtores) e ela também aumenta estringência da seleção (produtividade média dos clones produtores é maior). Dessa forma, os esforços de triagem são claramente reduzidos.
[0380] O efeito mais forte da proteína de fusão ligada a IRES (px6011C) em comparação ao marcador seletivo ligado a IRES (px6010C) é provavelmente devido à sequência PEST na proteína de fusão que medeia uma meia vida reduzida da proteína de fusão e/ou uma afinidade menor da proteína de fusão para o agente seletivo - ambos os fatores que aparentemente aprimoram estringência de seleção.
[0381] Os vetores a seguir foram testados em uma linhagem celular hospedeira CHO-K1 em transfecções temporárias, em misturas estáveis e algumas ao nível de clone único.
[0382] Os desempenhos de diferentes vetores em transfecções temporárias foram testados após nucleofecção em células CHO-K1.
[0383]Os vetores contendo o promotor do fator de elongação 1 alfa humano (hEF1α) (com base na organização vetorial LC-HC-SM) têm uma produtividade aumentada em cerca de + 34% (px9003 vs. px9002; sinal PoliA de SV40) e + 30% (px9006 vs. px9004; sequência sinal PoliA de bGH), dependendo da sequência sinal PoliA usada, respectivamente, em comparação ao uso do promotor de hCMV.
[0384]A adição do terminador da gastrina humana (hGT) à sequência sinal PoliA de bGH tem um efeito positivo na produtividade de vetores contendo o hCMV (px9005 vs. px9004; + 13%).
[0385] Os vetores de expressão baseados na expressão bidirecional da cadeia leve e cadeia pesada de anticorpo mostram desempenho melhorado. As titulações do produto estão cerca de 2,7 a 3,4 vezes aumentadas em comparação ao vetor controle px9001 dependendo do promotor usado (hEF1α ou hCMV) e da sequência sinal PoliA usada (sequência sinal PoliA de SV40 ou de bGH).
[0386] Descobriu-se que o uso do promotor do fator de elongação 1 alfa humano e da sequência sinal PoliA de bGH tem um efeito positivo na produtividade na organização vetorial LC-HC-SM (+ 50%; compare px9006 e px9002), mas não na organização vetorial LC(3'-5')-HC-SM (- 28%; compare px9010 e px9011).
[0387] Para comparar a produtividade do vetor de expressão px9002 com os vetores px9003, vetores 9007 foram transfectados em células CHO-K1 por nucleofecção e as misturas estáveis foram selecionadas. A produtividade das misturas foi analisada na análise de lote (consulte Figura 10).
[0388] A análise de lote de misturas estáveis mostrou que as titulações de anticorpos a partir de misturas transfectadas com o vetor contendo o promotor do fator de elongação 1 alfa humano (px9003, px9006, px9007) foram aproximadamente 7 a 8 vezes maiores do que aquelas de células transfectadas com o vetor de referência contendo o promotor curto de hCMV (vetor px9002) (compare 97,5 μg/mL, 112,5 μg/mL e 95,6 μg/mL e para os vetores px9003, px9006 e px9007 vs. 14,0 μg/mL para o vetor px9002).
[0389] Os vetores px9001, px9002 e px9004 a px9007 foram transfectados em células CHO-K1 por nucleofecção e os melhores clones foram identificados por processo de triagem clássico. A produtividade dos 36 melhores clones com cada vetor foi analisada pela análise de lote e os 15 melhores clones na análise de lote foram testados pela análise de lote alimentado.
[0390]A produtividade média dos 36 melhores clones gerados com o vetor px9001 na análise de lote é de 356 μg/mL. Os clones gerados com o vetor px9002 ou com os vetores px9004 e 9005 (adicionalmente contendo o sinal PoliA de bGH (sozinho ou em combinação com o hGT) ao invés do sinal PoliA de SV40) mostram um aumento de 37% (px9002), respectivamente, 61% (px9004) a 53% (px9005) na produtividade em comparação com o vetor controle px9001. Os clones dos vetores px9006 e px9007 mostram um aumento da produtividade em cerca de 19% e 7%, respectivamente.
[0391] Nos experimentos de lote alimentado, os 15 melhores clones obtidos com cada vetor na análise de lote foram testados na análise lote alimentado ao longo de 14 d.
[0392] A produtividade média dos 15 melhores clones únicos (gerados com o vetor px9001) na análise de lote alimentado é de 1345 μg/mL. Os clones gerados com o vetor px9002 ou com os vetores px9004 e px9005 (adicionalmente contendo a sequência sinal PoliA de bGH (sozinha ou em combinação com hGT) ao invés da sequência sinal PoliA de SV40) mostram um aumento de 80% (px9002), respectivamente, 58% (px9004) a 92% (px9005) da produtividade em comparação ao vetor controle px9001.
[0393]Além da produtividade média aumentada (consulte acima) também o desempenho dos clones principais está fortemente melhorado. Os vetores px9002, px9004 e px9005 mostram - com respeito à produtividade dos 5 clones principais - um aumento de cerca de 64% (px9002), 50% (px9004) e 88% (px9005) em comparação ao vetor controle px9001.
[0394]A seguir, a porcentagem de células produtoras e não produtoras, respectivamente, para cada um dos vetores diferentes foi comparada diretamente. 14,2% de clones gerados com o vetor px9001 produzem anticorpo e, no resto dos clones resistentes, a expressão do anticorpo é tanto silenciada como os clones têm outros defeitos.
[0395]A organização vetorial do vetor px9002 quase dobrou a porcetagem de células produtoras (para 26,0%). O vetor contendo adicionalmente a sequência sinal PoliA de bGH sozinha, ao invés da sequência sinal PoliA de SV40, tanto sozinha (vetor px9004) como em combinação com o hGT (vetor px9005), mostra um aumento de aproximadamente 3 vezes da porcentagem de células produtoras (39% e 43%, respectivamente).
[0396]O uso do promotor do fator de elongação 1 alfa humano, ao invés do promotor de hCMV, aumentou o número de células produtoras em até 5 vezes (mais do que 70% de clones obtidos após o processo de seleção produzem de fato anticorpo).
[0397]Os 15 melhores clones obtidos por transfecção com os vetores px9001 a px9007 (com base nos resultados do lote alimentado) foram cultivados na presença e na ausência de Higromicina B por 15 passagens (= aproximadamente 60 gerações). As titulações do produto de clones na análise de lote após 15 passagens foram comparadas com a titulação do produto de clones na análise de lote no começo do teste de estabilidade.
[0398] Na presença de pressão seletiva, a alteração na titulação do produto entre 15 clones com cada vetor varia de - 14,7% para o vetor px9007 a + 0,2% para o vetor px9002 após 15 passagens.
[0399] Na ausência de pressão seletiva, a redução da titulação do produto varia de 25,5% para o vetor px9004 até 5,9% para o vetor px9005.
[0400]O número de clones que preenchem os critérios de estabilidade definidos como, por exemplo, > 80% da titulação do produto na análise de lote em comparação aos valores no ponto inicial (G0), tanto na presença como na ausência de marcador seletivo, varia de 4 a 10. Os vetores px9005, px9007 e px9002 levam ao número mais alto de clones estáveis, de forma semelhante na presença e na ausência de pressão seletiva/marcador seletivo (px9005: 10; px9007: 7; px9002: 6)).
[0401] Dessa forma, descobriu-se que a organização de vetores px9005 mostra efeitos positivos na estabilidade e número aumentado de clones estáveis, especialmente na ausência de pressão seletiva.
[0402] Descobriu-se que a combinação do PoliA de bGH e do hGT em comparação ao PoliA de SV40 sem o terminador da transcrição (hGT) claramente aumenta a produtividade de clones estáveis independentemente do promotor usado. TRANSFECÇÕES TEMPORÁRIAS - o uso do promotor do fator de elongação 1 alfa humano (com o Íntron A) fornece uma produtividade melhorada (na organização LC-HC- SM) - o uso da sequência sinal PoliA do hormônio de crescimento bovino fornece uma produtividade aumentada em comparação ao uso da sequência sinal PoliA de SV40 - a adição do hGT à sequência sinal PoliA de bGH provoca uma produtividade aumentada nos vetores contendo o promotor de hCMV - a organização vetorial LC(3'-5')-HC-SM provoca expressão aprimorada MISTURAS ESTÁVEIS - as misturas geradas com os vetores contendo o promotor de EF1α mostram uma produtividade aumentada na análise de lote - clones gerados com vetores contendo o promotor de hEF1α mostram um número reduzido de clones baixo produtores - clones gerados com vetores contendo o promotor de hEF1α mostram uma maior estabilidade da expressão de IgG CLONES ÚNICOS - organização vetorial com posição a jusante do marcador seletivo (LC-HC-SM) tem um efeito positivo sobre a produtividade de clones únicos estáveis - clones gerados com vetores contendo a sequência sinal PoliA de bGH e o hGT têm produtividades e estabilidades maiores
[0403] Vários diferentes elementos genéticos transcricionais relevantes e combinações dos mesmos foram comparados a uma combinação de elementos genéticos de referência. Com base em experimentos temporários comparativos, os resultados a seguir foram obtidos para a organização vetorial bidirecional com o cassete de expressão para o marcador seletivo em direção oposta aos cassetes de expressão da cadeia leve e pesada (cassete de expressão da cadeia leve a montante do cassete de expressão da cadeia pesada) (consulte a tabela abaixo).
[0404] Diferentes promotores foram combinados com o sinal PoliA de bGH e o terminador da transcrição de hGT (consulte a tabela abaixo).
[0405]Vários elementos genéticos de transcrição relacionados e combinações dos mesmos foram comparados a um vetor de referência (px9001, organização vetorial SM (orientação 3’^5’)-LC-HC (orientação 5’^3’)). Com base em experimentos comparativos, os resultados a seguir foram obtidos para a organização vetorial unidirecional com o cassete de expressão para a cadeia leve e pesada (cassete de expressão da cadeia leve a montante do cassete de expressão da cadeia pesada) e para o marcador seletivo na mesma direção (consulte tabela abaixo) em comparação a um vetor de referência (px9001, organização vetorial bidirecional SM (3’^5’)’LC-HC (5’^3’)).
[0406] Vetores usados:
[0407] Descobriu-se que uma expressão aumentada (produtividade) com o uso dos elementos vetoriais/combinação de elementos, conforme relatado no presente pedido, pode ser atingida: - CMV humano sem Íntron A: 100 % (referência) - CMV humano com Íntron A: temporário 234%, mistura estável 123%, clones estáveis 38% - CMV de rato com Íntron A: temporário 50% mistura 60% - EF1α humano com Íntron A: temporário 153%, mistura 564%, clones estáveis: 84% (PoliA de SV40) aprox. 100% (bGH e hGT) - EF1α humano com Íntron A e: + 40% (para EF1α humano) 5’UTR otimizado - MPSV: 29% - PoliA de bGH: temporário 146%, estável 92 % - hGT: temporário 131%, misturas estáveis 138%, clones únicos 123% - PoliA de bGH e hGT: temporário 158%, misturas estáveis 163%, clones únicos 140% promtor de CMV humano: Xu et al., J. Control. Release, 81 (2002) 155-163. Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124. promotor de CMV de rato: Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124. promotor de EF1α humano: Teschendorf et al., Anticancer Res. 22 (2002) 3325-3330. Li et al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 113-124. promotor de MPSV: Xia et al., Prot. Expr. Purif. 45 (2006) 115-124. Artelt et al., Gene 68 (1988) 213-219. Stocking et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 57465750. Lin et al., Gene 147 (1994) 287-292. promotor híbrido MPSV-CMV: Liu et al., Anal. Biochem. 246 (1996) 150-152.
[0408] Um processo de seleção de alta seletividade e alta estringência pode ser fornecido pelo uso de um cassete de expressão ligado a IRES para a expressão do marcador seletivo: - pressão seletiva sobre a expressão do anticorpo provoca alta seletividade - expressão ligada do anticorpo e do marcador seletivo provoca alta seletividade - descobriu-se que o uso de um elemento IRES com fraca atividade provoca alta estringência, isto é, alta produção de anticorpos e baixa produção de marcador seletivo - ligação da expressão do anticorpo e do marcador seletivo por elementos IRES - identificação de elementos IRES (EMCV/Gtx) com fraca atividade que altere a expressão de IgG marginalmente - uso de uma proteína de fusão que atue como marcador seletivo e como marcador de triagem - proteína de fusão GFP-Neomicina bifuncional - a sequência PEST da ornitina descarboxilase é uma sequência sinal proteolítica forte e confere uma meia vida reduzida à proteína - expressão ligada a IRES da proteína de fusão provoca alta seletividade - meia vida curta pela sequência sinal proteolítica provoca alta estringência - devido às fraca expressão e meia vida curta da proteína de fusão, uma expressão forte é requerida - identificação rápida de altos produtores por FACS (a triagem de clones que expressam muito GFP fornece a seleção de altos produtores)
[0409] Marcador seletivo ligado à cadeia pesada de anticorpo por diferentes elementos IRES - px5068 (sem IRES): 100% expressão do anticorpo (referência) - Gtx-IRES: 20-27% - EMCV-IRES 81-94% - EV71-IRES 20-36% - ELF4G-IRES 3-17% - Gtx-IRES (sintético) 88%
[0410] Proteína de fusão GFP-Neo ligada à cadeia pesada de anticorpo por diferentes elementos IRES Gtx EV71 ELF4G EMCV expressão de GFP: + +++ - + expressão do anticorpo: - - - + Gtx-IRES: Komuro et al., EMBO J. 12 (1993) 1387-1401. EMCV-IRES: Mountford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1991) 4303-4307. EV71-IRES: Lee et al., Biotechnol. Bioeng. 90 (2005) 656-662. ELF4G-IRES: Wong et al., Gene Ther. 9 (2002) 337-344. Gtx (sintético)-IRES: Chappell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 15361541.
[0411] Descobriu-se que uma expressão (produtividade) aumentada com o uso da ligação do cassete de expressão da cadeia leve ao cassete de expressão da cadeia pesada pode ser atingida pelo elemento EV71-IRES: - px5068 sem IRES: 100% expressão do anticorpo (referência) - Gtx-IRES (sintético): 3% - EV71-IRES: 82% - ELF4G-IRES: 5% - EMCV-IRES: 7%.
[0412] Um aspecto, conforme relatado no presente pedido, é um promotor do fator de elongação humano 1 alfa otimizado que compreende um UTR 5’ otimizado que tem uma sequência de SEQ ID NO: 06.
[0413] Os exemplos, figuras e sequência a seguir são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, o verdadeiro escopo da mesma é apresentado em reivindicações anexas. Entende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos apresentados sem que ocorra distanciamento do espírito da invenção.
[0414] SEQ ID NO: 01 promotor curto de CMV humano semÍntron A
[0415] SEQ ID NO: 02 promotor curto de CMV humano semÍntron A com 5’UTR
[0416] SEQ ID NO: 03 promotor longo de CMV humano semÍntron A
[0417] SEQ ID NO: 04 promotor inteiro do EF1α humano sem Íntron A
[0418] SEQ ID NO: 05 promotor inteiro do EF1α humano com Íntron A
[0419] SEQ ID NO: 06 promotor inteiro do EF1α humano com Íntron A com 5’UTR
[0420] SEQ ID NO: 07 promotor inteiro do CMV do rato com Íntron A
[0421] SEQ ID NO: 08 sequência sinal PoliA de SV40
[0422] SEQ ID NO: 09 sequência sinal PoliA de bGH
[0423] SEQ ID NO: 10 sequência de terminador de hGT
[0424] SEQ ID NO: 11 promotor de SV40
[0425] SEQ ID NO: 12 sequência PEST de ornitina descarboxilase
[0426] SEQ ID NO: 13 sequência de ácido nucleico que codifica GFP
[0427] SEQ ID NO: 14 marcador seletivo de neomicina
[0428] SEQ ID NO: 15 ácido nucleico que codifica polipeptídeo de fusão GFP-PEST-NEO
[0429] SEQ ID NO: 16 EMCV-IRES
[0430] SEQ ID NO: 17 EV71-IRES
[0431] Figura 1 Produtividade de clones estáveis com os vetores p5068, px6001, px6008 e px6007. A produtividade média dos 15 melhores clones obtidos com cada vetor na análise de lote de um total de três transfecções independentes é mostrada.
[0432] Figura 2 Produtividade de clones estáveis gerados com os vetores px6051, px6062, px6052 e px6063. A produtividade média dos 18 melhores clones com cada vetor na análise de lote de um total de três transfecções é mostrada.
[0433] Figura 3 Produtividade dos vetores p5068, px6051, px6052 e px6053 em transfecções temporárias com o uso de um sistema de ponte de 96 poços da Amaxa. A produtividade média de oito transfecções independentes com cada vetor no dia 4 após a transfecção, medida por ELISA, é mostrada.
[0434] Figura 4 Produtividade de diferentes misturas estáveis geradas com os vetores p5068, px6051, px6052 e px6053 na análise de lote. A produtividade média de três misturas com cada vetor no dia 7 é mostrada.
[0435] Figura 5 Produtividade de misturas estáveis geradas com os vetores p5069 e px6010C. A produtividade média de dois (px5069), respectivamente, três (px6010C) diferentes misturas na análise de lote no dia 7 é mostrada.
[0436] Figura 6 Estabilidade da expressão gênica em misturas estáveis geradas com os vetores p5069 e px6010C. A produtividade média de duas diferentes misturas com cada vetor na análise de lote no dia 7 na passagem 0 (estabelecida como 100%, coluna branca) e na geração 30 com (coluna branca) e sem (coluna hachurada) pressão seletiva (G418) é mostrada.
[0437] Figura 7 Produtividade dos 15 melhores clones gerados pelos vetores p5069 e px6010C. A produtividade média dos 15 melhores clones com cada vetor na análise de lote de um total de duas transfecções individuais é mostrada.
[0438] Figura 8 Visão geral esquemática do projeto vetorial do vetor px6011C que medeia a expressão mediada por IRES da proteína de fusão GFP-PEST-Neo. A proteína de fusão GFP-PEST-Neo é ligada pelo EMCV-IRES à cadeia pesada de anticorpo. As sequências codificadoras da cadeia pesada de anticorpo e da proteína de fusão são transcritas pelo promotor curto de CMV humano em um mRNA. A tradução desse mRNA leva à síntese da cadeia pesada de anticorpo e da proteína de fusão GFP-PEST-Neo.
[0439] Figura 9 Produtividade de diferentes misturas estáveis geradas pelos vetores p5069, px6011C e px6010C na análise de lote. A produtividade média de duas diferentes misturas com cada vetor no dia 7 é mostrada.
[0440] Figura 10 Produtividade dos 15 melhores clones gerados pelos vetores p5069, px6010C (vetor que expressa o marcador seletivo Neomicina pelo elemento EMCV-IRES ligado à cadeia pesada de anticorpo) e px6011C (vetor que expressa a proteína de fusão de GFP-PEST- Neomicina pelo elemento EMCV-IRES ligada à cadeia pesada de anticorpo. (A) Distribuição da produtividade dos 15 melhores clones com cada vetor na análise de lote de um total de duas diferentes transfecções. (B) Produtividade média dos 15 melhores clones com cada vetor na análise de lote de um total de duas diferentes transfecções.
[0441] Figura 11 A dependência do nível de expressão/intensidade de fluorescência de GFP e da produtividade na análise de lote para 11 clones gerados com cada vetor px6011C é mostrada. Os clones foram escolhidos aleatoriamente no formato de triagem de 24 poços, então expandidos e finalmente analisados na análise de lote. A média geométrica (GM) da intensidade de fluorescência de GFP e a porcentagem de células GFP-positivas de cada clone foram determinadas por FACS. (A) Dependência da intensidade de fluorescência de GFP e da produtividade na análise de lote para 11 clones únicos. (B) Dependência da porcentagem de células GFP- positivas de cada clone e da produtividade na análise de lote para 11 clones únicos.
[0442] Figura 12 Produtividade de misturas estáveis com diferentes intensidades de fluorescência de GFP na análise lote. As células com diferentes níveis de expressão/intensidades de fluorescência de GFP (baixo (1), médio (2) e alto (3)) foram triadas por FACS. As misturas foram expandidas e a produtividade das misturas foi determinada na análise lote no dia 7.
[0443] Figura 13 Mapa plasmideal de px6007.
[0444] Figura 14 Mapa plasmideal de px6053.
[0445] Figura 15 Mapa plasmideal de px6062.
[0446]Os plasmídeos de expressão p5068 e p5069 compreendem os cassetes de expressão para a expressão de um anticorpo anti-P-selectina (cassete de expressão genomicamente organizado com organização éxon-íntron conservada), conforme relatado no documento WO2005/100402.
[0447]Os genes que codificam a cadeia leve e pesada de HuMab anti-P-selectina foram separadamente montados nos vetores de expressão de células de mamíferos.
[0448]Através disso, os segmentos gênicos que codificam a região variável da cadeia leve (VL) de HuMab anti-P-selectina e da região constante da cadeia leve-K humana (CL) foram unidas como se fossem segmentos gênicos da região variável da cadeia pesada (VH) de HuMab anti-P-selectina e da região constante da cadeia pesada-Yl humana ou da região constante da cadeia pesada-Y4 humana (CH1-Dobradiça-CH2-CH3).
[0449]A informação geral acerca das sequências de nucleotídeos das cadeias leve e pesada humanas a partir das quais o uso do códon pode ser deduzido é fornecida em: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Publicação NIH No 91- 3242.
[0450]A unidade de transcrição da cadeia leve-K de HuMab anti-P-selectina é composta dos elementos a seguir: - o enhancer inicial imediato e o promotor do citomegalovírus humano (hCMV), - um 5’-UT sintético incluindo uma sequência Kozak, - uma sequência sinal da cadeia pesada da imunoglobulina de murino incluindo o íntron da sequência sinal, - cDNA da cadeia leve variável de HuMab anti-P-selectina clonado arranjado com um sítio de restrição Bsml único na extremidade 5’ e um sítio doador de splice e um sítio de restrição Notl único na extremidade 3’, - região genômica constante do gene-K humano, incluindo o íntron 2 do enhancer do Ig-K de camundongo (Picard, D., e Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), e - a sequência sinal de PoliAdenilação-K da imunoglobulina humana (“poliA”).
[0451] A unidade de transcrição da cadeia pesada-Yl de HuMab anti-P-selectina é composta dos elementos a seguir: - o enhancer inicial imediato e o promotor do citomegalovírus humano (hCMV), - um 5’-UT sintético incluindo uma sequência Kozak, - uma sequência sinal da cadeia pesada da imunoglobulina de murinos modificada incluindo o íntron da sequência sinal, - cDNA da cadeia pesada variável de HuMab anti-P-selectina clonado arranjado com um sítio de restrição Bsml único na extremidade 5’ e um sítio doador de splice e um sítio de restrição Notl único na extremidade 3’, - a região genômica constante do gene pesado-Yl humano, incluindo o enhancer-μ da Ig de camundongo, (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378), e - sequência sinal de PoliAdenilação (“PoliA”) da imunoglobulina-Yl.
[0452] Além do cassete de expressão da cadeia leve-K ou da cadeia pesada-Y1 do HuMab anti-P-selectina, esses plasmídeos contêm: - um gene de resistência a higromicina, - uma origem de replicação, oriP, do vírus Epstein-Barr (EBV), - uma origem de replicação do vetor pUC18 que permite a replicação desse plasmídeo em E. coli, e - um gene de β-lactamase que confere resistência a ampicilina em E. coli.
[0453] A clonagem foi realizada com o uso de técnicas padrões de clonagem, conforme descrito em Sambrook et al., 1999 (supracitado). Todos os reagentes biológicos moleculares eram comercialmente disponíveis (se não indicado de outra forma) e foram usados de acordo com as instruções do fabricante.
[0454] O DNA de diferentes elementos genéticos foi sintetizado por Geneart AG, Regensburg.
[0455] As sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento da dupla-fita realizado na SequiServe (SequiServe GmbH, Alemanha).
[0456] O programa de computação Vector NTI Advance, versão 9.0, foi usado para a criação, mapeamento, análise, anotação e ilustração da sequência.
[0457] As células CHO-K1 foram cultivadas em meio CD-CHO (Invitrogen Corp., Gibco®, Cat. No. 10743-011) suplementado com suplemento HT 1X (Invitrogen Corp., Gibco®, Cat. No. 11067-030).
[0458] Para a seleção de misturas/linhagens celulares CHO-K1 estavelmente transfectadas, 400 a 800 μg/mL de G418 ou 200 a 400 μg/mL de Higromicina foram adicionados (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Sciences, Alemanha, Cat. No.: 843555).
[0459] Todas as linhagens celulares foram mantidas em incubadoras umidificadas a 37°C com CO2 5% sob agitação constante a 120 a 140 rpm/min. A cada 3 a 4 dias, as células foram separadas em meio fresco. A densidade e viabilidade das culturas foram determinadas com o uso do contador de células Casey TT ou Cedex Hires (Roche innovates AG, Bielefeld). A transfecção de células foi realizada pela tecnologia de nucleofecção Amaxa (Lonza GmbH, Alemanha).
[0460] Além disso, as técnicas padrões de cultura celular foram aplicadas conforme descrito, por exemplo, em Bonifacino, J.S., et al., (eds.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2000).
[0461] O contador celular CASY® Technology, modelo TT (Roche Innovatis AG, Bielefeld) usa a corrente elétrica para a contagem celular. A Análise de Área de Pulso foi usada para obter-se informação a partir de sinais criados quando uma célula passa através do poro de medição em um campo de baixa voltagem. A integridade estrutural da membrana celular é uma medida da viabilidade celular. Os corantes, como azul de tripano, não são portanto necessários para a determinação da viabilidade. b) Método automatizado de exclusão do azul de tripano (Cedex)
[0462] Um sistema Cedex HiRes (Roche Innovatis AG, Bielefeld) foi usado para determinar as viabilidades celulares durante as seleções da mistura e para a contagem celular automatizada.
[0463]Azul de tripano é um corante que não pode entrar nas células através das membranas celulares. Somente aquelas células mortas são coradas e marcadas, as quais têm uma membrana celular danificada. O processo de coloração, a contagem celular e a análise gráfica dos resultados foram realizados automaticamente pelo sistema Cedex por reconhecimento de imagem digital. Outros parâmetros de medida são o tamanho celular, morfologia e taxa de agregação. Com o multiamostrador, até 20 amostras foram medidas consecutivamente.
[0464] A eficácia de transfecção e, portanto, a produtividade é fortemente influenciada por vários fatores, como quantidade e qualidade do DNA. Para garantir condições iniciais iguais para cada vetor, a quantidade e qualidade do DNA de todos os vetores foram intensivamente checadas antes da transfecção. - Preparação simultaneamente dos vetores de expressão
[0465] Todos os vetores foram simultaneamente preparados pelo kit de isolamento de plasmídeos High Speed Maxi (Qiagen GMBH, Hilden), de acordo com as instruções do fabricante. - Purificação com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol
[0466] Todos os vetores foram simultaneamente purificados por uma purificação com fenol/clorofórmio. 500 μg de cada DNA plasmideal linearizado foram misturados com 200 μL de fenol Tris-tamponado 50% (v/v), clorofórmio 48% (v/v), solução isoamil álcool 2% (v/v) e centrifugados por 1 min a 13.000 rpm. A fase aquosa superior foi, então, transferida para um novo tubo e misturada com 200 μL de clorofórmio 96% (v/v), isoamil álcool 4% (v/v) e centrifugada por 1 min a 13.000 rpm. A fase superior foi novamente transferida para um novo tubo e misturada com 1/10 (volume total) de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2,5 vezes (volume total) de etanol 100%. Após mistura e incubação da reação por 5 min em temperatura ambiente, a mistura foi centrifugada por 5 min a 13.000 rpm para peletizar o DNA. O sobrenadante foi descartado e o pélete foi lavado com 900 μL de etanol 70% (v/v) e incubado por 5 min em temperatura ambiente. Após uma etapa de centrifugação final a velocidade máxima por 5 min, os sobrenadantes foram descartados e os péletes foram secos e resuspendidos em H20 estéril. - determinação do DNA
[0467] A quantidade de DNA de cada vetor foi determinada com o uso do BioPhotometer (Eppendorf; Hamburg). A medição do DNA foi sempre realizada em triplicatas com o uso de uma diluição 1:20 em Tris (pH 8,0). - gel de agarose
[0468] A qualidade do DNA de cada plasmídeo foi checada em um gel de agarose 8%. A degradação de DNA, conformações vetoriais e concentrações do DNA foram determinados. Os vetores que mostram quantidades e qualidades semelhantes (nenhuma degradação de DNA, formas supercondensadas (ccc) similares, quantidades similares de DNA em gel) foram usados para transfecções temporárias e estáveis.
[0469] Todos os vetores foram transferidos em células CHO-K1 pelo sistema de ponte de 96 poços Amaxa (Lonza GmbH, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Cada vetor foi transferido em 8 réplicas. As quantidades de DNA do vetor transfectado foram normalizadas para quantidades molares/números de cópias iguais, de acordo com 1 μg do plasmídeo de expressão de referência (p5068 ou p5069). Para determinar a produtividade, o sobrenadante da cultura celular livre de células foi analisado quanto à titulação de IgG nos dias 4 a 7 após transfecção por um ELISA universal de etapa única (Dianova).
[0470] Células CHO-K1 cultivadas em frascos giratórios foram peletizadas por centrifugação a 850 rpm por 5 min e resuspendidas em meio de cultura. Os plasmídeos circulares foram plaqueados em placas de nucleofecção de 96 poços a concentrações equimolares de acordo com 1 μg do vetor de referência p5068 ou p5069. As células foram então adicionadas às placas a uma concentração de 4 x 105 células por poço. A transfecção foi realizada pelo programa Amaxa DN-137. As células foram incubadas por 10 min após a transfecção e, então, transferidas para placas de incubação de fundo chato contendo 200 μL de meio de cultura. As células foram então cultivadas estaticamente. No dia 4 a 6 após a transfecção, os níveis de IgG foram determinados com o uso do ELISA universal de etapa única.
[0471] As transfecções estáveis foram realizadas pela tecnologia de nucleofecção (Amaxa Biosystems, colônia Lonza AG) de acordo com as instruções do fabricante. Antes da transfecção, os plasmídeos foram linearizados pela enzima de restrição SgrA I. Cada plasmídeo foi transfectado em duplicatas ou triplicatas. 5 x 106 células e 1,2 pmol de plasmídeo linearizado foram usados em cada transfecção (kit T da Nucleofector, programa Amaxa A33).
[0472] Para a transfecção, as células foram resuspendidas na solução T da Nucleofector e aliquotadas em tubos de 2 mL. Após a adição do plasmídeo, a transfecção foi realizada pela aplicação de pulso. As células foram então transferidas para frascos de cultura de tecido T25 contendo 4 mL de meio fresco pré-aquecido e 4 mL de meio condicionado. A pressão seletiva foi aplicada 24 h pós-transfecção pela adição de 250 μg/mL de Higromicina.
[0473]Os vetores foram transferidos em células CHO-K1 pela tecnologia de nucleofecção Amaxa e as misturas estáveis foram selecionadas com o uso de Higromicina ou G418 como agente seletivo. Cada transfecção foi realizada em triplicatas. Para geração de misturas estáveis, todos os plasmídeos foram uniformemente linearizados por digestão de restrição com SgrA I. O kit T da Nucleofector da Amaxa foi usado para realizar as transfecções estáveis e cada plasmídeo foi transfectado em triplicatas.
[0474] As misturas estáveis foram estabelecidas como a seguir: 5 x 106 células e 1,2 pmol de plasmídeo linearizado foram usados para cada transfecção. As células foram resuspendidas em Solução T e aliquotadas em tubos de 2 mL. Após a adição do plasmídeo, a transfecção foi realizada pela aplicação do pulso (programa A33 da Amaxa). As misturas celulares transfectadas foram cultivadas estaticamente em frascos de cultura de tecido T25 contendo 4 mL de meio fresco pré-aquecido e 4 mL de meio condicionado.
[0475]Após 24 h pós-transfecção, a pressão seletiva foi aplicada: as células foram centrifugadas por 5 min a 800 rpm, resuspendidas em 3 mL de meio de cultura contendo 300 μg/mL de Higromicina B. As células foram transferidas para placas de 6 poços de fundo chato 3 dias pós-transfecção. As células foram então cultivadas por duas semanas até as viabilidades celulares caírem para um mínimo e aumentaram de novo acima de 99%. Os números celulares e viabilidades foram constantemente determinados com um sistema Cedex HiRes (Innovatis, Bielefeld). Durante o cultivo, os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação e as células foram sempre resuspendidas em 3 mL de meio fresco.
[0476] Os vetores foram transferidos em células CHO-K1 conforme descrito acima. 48 h após a transfecção, a pressão seletiva foi aplicada (Higromicina ou G418) e as células foram semeadas em placas de fundo chato de 384 poços a uma concentração de 350 a 700 células por poço com o uso de um sistema automatizado de isolamento de clones de alta produtividade (Sciclone ALH 3000 workstation, Caliper Life Sciences GmbH, Mainz).
[0477]Após 10 a 14 dias, as placas de 384 poços foram triadas pelos níveis de IgG com o uso de um ELISA baseado em triagem de alta produtividade (ELISA uHTS). A partir de uma triagem primária, os melhores clones produtores foram escolhidos e transferidos para placas de 96 poços de fundo chato. Após 3 a 6 dias, as células foram triadas pelos níveis de IgG em uma segunda rodada. Os melhores clones produtores foram de novo escolhidos e manualmente transferidos para placas de 24 poços de fundo chato. Após um ELISA adicional baseado na etapa de triagem, os melhores clones foram escolhidos e transferidos para placas de 6 poços de fundo chato. Os níveis de IgG nas placas de 6 poços foram determinados por medição de ProtA para identificar os melhores clones finais para cultura de lote em placas de 6 poços sob agitação.
[0478] Para determinar as diferenças de produtividade e estabilidade, os números celulares dos clones/misturas foram contados com o uso de um contador celular Casey e uniformemente semeados em placas de 6 poços de fundo chato a uma concentração de 3 x 105 células/mL e um volume total de 3,0 mL. Todas as culturas de lote foram cultivadas por 12 d e os sobrenadantes das culturas celulares foram triados pelos níveis de IgG humana nos dias 4, 7, 9, 11 ou 12.
[0479] A titulação de IgG em experimentos temporários e nos formatos de triagem (384 a 24 poços) foi determinada pelo uso do ELISA universal de etapa única. A produtividade das misturas estáveis e os clones únicos estáveis em experimentos de lote foi determinada por HPLC de Proteína A.
[0480] Um ELISA universal de etapa única (Dianova) foi usado para determinar os níveis de IgG humana dos sobrenadantes das culturas celulares. Uma curva padrão foi preparada com o uso de diluições seriais de um anticorpo anti-P-selectina (F. Hoffmann-La Roche AG, Basle, Suíça) com uma faixa de 0,3125 a 20 ng/mL com o uso de tampão de diluição (PBS + RPLA1 5% (p/v)). 95 μL de mistura de anticorpo contendo 0,5 μg/mL de anticorpo anti-Fc humano F(ab’)2-biotinilado (Jackson laboratories) e 0,1 μg/mL de anticorpo anti-FcY humano F(ab’)2-conjugado a peroxidase (Jackson laboratories; Suffolk) foram adicionados a placas MTP de 96 poços revestidas com estreptavidina (StreptaWell, Roche Diagnostics GmbH). 5 μL de sobrenadante da cultura celular diluído a 1:20.000 foram adicionados às placas e incubados por 1 h. As placas revestidas com anticorpo foram lavadas três vezes com 200 μL de tampão de lavagem (PBS + Tween20 0,05 % (v/v)). 100 μL de ABTS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) foram adicionados às placas e a absorbância foi medida a 405 nm com um comprimento de onda de referência de 492 nm.
[0481] A titulação de IgG da análise de lote foi determinada pela Proteína A com o uso de uma cromatografia baseada em HPLC em combinação com o ELISA universal de etapa única.
[0482] A triagem celular ativada por fluorescência foi usada para determinar as eficiências de transfecção (com base nas células que expressam GFP) ou os níveis de expressão de GFP de células transfectadas estável ou transitoriamente. Em geral, 5 x 106 células de cada clone ou mistura foram medidas com o uso do Citômetro de Fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Diego, CA). Os dados de dispersão a frente e laterais foram usados para determinar o tamanho celular, a viabilidade e a morfologia celular.
Claims (23)
1. MÉTODO PARA SELECIONAR UMA CÉLULA RECOMBINANTE DE MAMÍFERO TRANSFECTADA ESTÁVEL, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) transfectar uma célula de mamífero com um vetor de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão que compreende na direção 5’ a 3’ um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT; - um segundo cassete de expressão que compreende na direção 5’ a 3’ um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT; em que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional, e, através disso, obter uma grande quantidade de células recombinantes de mamífero; b) selecionar a partir da grande quantidade de células recombinantes de mamífero uma ou mais células recombinantes de mamífero transfectada estáveis com base em um rendimento de expressão do anticorpo.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreenderem pelo menos um íntron.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo serem cDNA.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo vetor de expressão adicionalmente compreender um marcador de seleção.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos cassetes de expressão e o marcador de seleção serem dispostos de forma unidirecional.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelos cassetes de expressão serem dispostos na sequência cadeia leve-cadeia pesada-marcador de seleção.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela célula de mamífero ser selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela célula de mamífero ser uma célula CHO para a seleção de uma célula transfectada estável.
9. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) cultivar uma célula de mamífero que produz o anticorpo, que é transfectada de forma estável com um vetor de expressão que compreende: - um primeiro cassete de expressão que compreende na direção 5’ a 3’ um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT; - um segundo cassete de expressão que compreende na direção 5’ a 3’ um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT; e b) recuperar o anticorpo a partir da célula ou do meio de cultura, em que o primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão são dispostos de forma unidirecional para a produção estável do anticorpo.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreenderem pelo menos um íntron.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo serem cDNA.
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo vetor de expressão adicionalmente compreender um marcador de seleção.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelos cassetes de expressão e o marcador de seleção serem dispostos de forma unidirecional.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelos cassetes de expressão serem dispostos na sequência cadeia leve-cadeia pesada-marcador de seleção.
15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pela célula de mamífero ser selecionada a partir de célula CHO, célula HEK, célula BHK, célula NS0 e célula SP2/0.
16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado pela célula de mamífero ser uma célula CHO para a produção estável de um anticorpo.
17. VETOR DE EXPRESSÃO para selecionar uma célula de mamífero transfectada estável, caracterizado por compreender: - um primeiro cassete de expressão que compreende na direção 5’ a 3’ um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT; - um segundo cassete de expressão que compreende na direção 5’ a 3’ um promotor de hCMV, um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo, uma sequência sinal poliA de bGH e uma sequência de terminação de hGT.
18. VETOR, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo compreenderem pelo menos um íntron.
19. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 18, caracterizado pelo ácido nucleico que codifica a cadeia leve de anticorpo e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de anticorpo serem cDNA.
20. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo primeiro cassete de expressão e o segundo cassete de expressão serem dispostos de forma unidirecional para a seleção de uma célula transfectada estável.
21. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo vetor de expressão adicionalmente compreender um marcador de seleção.
22. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelos cassetes de expressão e o marcador de seleção serem dispostos de forma unidirecional.
23. VETOR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelos cassetes de expressão serem dispostos na sequência cadeia leve-cadeia pesada-marcador de seleção.
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