CN105255867A - 一种防止启动子在传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学，具体公开了一种防止启动子在传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用。所述基因序列的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。本发明利用所述基因序列构建载体和CHO细胞株，能够防止启动子在CHO细胞传代培养中逐渐灭活的功能，可用于CHO细胞株生产单克隆抗体，提高单抗产量。

Description

一种防止启动子在传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种防止启动子在传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用。

背景技术

生物制药是近年来医药行业中增长速度最快的行业，单克隆抗体作为生物药中最受瞩目的产品类别，近15年来的增长率高达41％。单抗类药物的适应症主要集中在肿瘤和自身免疫类疾病，除此之外还有抗感染、眼科、骨质疏松、心梗、血液系统疾病等。同时因其靶向性强副作用小越来越受患者的青睐。2013年，其中6个单克隆抗体药排名位于全球处方药销售额排行榜的前8名。

与第一、第二代生物技术医药产品相比，新一代产品不是天然物质的仿制，而是对细胞内和细胞表面的各个功能单位包括基因表达的各个环节进行加工。由此可见新一代产品的技术难度更大、研发周期更长、生产成本更高，这也导致了新一代生物医药产品(不管是原研药还是仿制药)的价格居高不下。

但是从疗效方面来看，新一代产品即生物药尤其是单抗靶向性强、半衰期长、疗效持续显著、副作用小等特点，所以越来越多的患者渴望接受单抗药物的治疗，但苦于负担不起高昂的医疗费用。同时越来越多的企业投资大量人力物力致力于单抗药物的研发。

目前已经批准上市的大部分单抗药物其推荐成人临床用药剂量均较大，若要满足广大患者的需求，除去价格方面的因素，产能也是最重要的影响患者使用单抗药物的因素之一。同时，产能的提高也能反过来影响价格的走势，因为产能提高在某种意义上来说是节约了成本，利润空间也有所扩增，降价才能最终实现，价格平民化和产能扩大才能使越来越多的患者使用单抗药物治疗疾病。

通常，细胞基因包含一系列调控元件，调控元件是指具有调节功能的特异DNA序列。大多数真核基因调控以正性调节为主，这些调节机制普遍涉及编码序列两侧的、具有调节功能的DNA序列，称为顺式作用元件。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核基因的这些机能元件区分为启动子、增强子及抑制子。

其中启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动。启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。

在一般的CHO细胞的传代培养中启动子会逐渐灭活，继而影响单克隆抗体的产率，不能实现单抗生产上的高产量低成本。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种防止启动子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

本发明还提供了含有所述基因序列的载体。

本发明还提供了含有所述基因序列的CHO细胞株。

本发明还提供了所述细胞株的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

1)将CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将质粒DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育后，将二者混匀，室温孵育；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育；

6)观察转入基因表达情况：取培养液上清，WesternBlot检测蛋白量，能检测到蛋白的为成功转入；

7)稳定转染；

8)优化：将稳定转染的细胞挑出来，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，选出蛋白量较高且三次蛋白量之间相差比较小的细胞；

9)建立稳定细胞株。

进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

1)将0.5×10⁵～2×10⁵(个)CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将质粒DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育5分钟后，将二者混合，混匀，室温孵育20分钟；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育4～6h；

6)24～48h后观察转入基因表达情况：取培养液上清，WesternBlot检测蛋白量，能检测到蛋白的为成功转入；

7)稳定转染：每3天以1：10传代1次，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，若第三次的蛋白量是第一次的80％，则表明已稳定转染；

8)优化：将上一步选出的稳定转染的细胞挑出来，每3天以1：10传代1次，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，选出蛋白量较高且三次蛋白量之间相差比较小的细胞；

9)建立稳定细胞株。

本发明还提供了所述基因序列在防止CHO细胞传代培养中启动子逐渐灭活上的应用。

本发明还提供了所述基因序列在制备单克隆抗体、提高单克隆抗体产量上的应用。

具体为，将含有所述基因序列的CHO细胞株加入到培养基中，置于37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下培养，收集上清，取单抗。

作为优选，所述培养基为加血清的Opti-MEM培养基。

更进一步地，所述应用具体包括如下步骤：

1)将CHO细胞株扩大为工作细胞库，将工作细胞库中的CHO细胞加入到培养基中，混匀后离心，弃上清；

2)将细胞重悬于培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm条件下培养，培养至第三天补糖、补培养基；

3)在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下继续培养，隔天补糖、补培养基直至培养的第11天，继续培养至第14天停止；

4)收集上清，离心3分钟，之后收集上清，取单抗；

5)将工作细胞库中的CHO细胞传代培养，培养过程中，取单抗。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种防止启动子在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)传代培养中逐渐灭活的基因序列及其应用。用含有该段基因序列的CHO细胞在经过多次传代之后其启动子不会灭活，CHO细胞生产蛋白的能力不会减弱，即CHO细胞的产率不降低。

本发明所提供的基因用于防止CHO细胞启动子在传代培养中逐渐灭活的功能适用于生产单抗的CHO细胞，导入前述基因序列的CHO细胞，其传代培养之后的单克隆抗体产量高于现有技术，并能有效降低生产成本。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

用EcoRI内切酶不完全酶切CHO细胞的基因组DNA，将所得片段随机连入表达载体，进行筛选：

所述筛选方法为：

1)将0.5×10⁵～2×10⁵(个)CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将不完全酶切CHO细胞得到的各个DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育5分钟后，将二者混合，混匀，室温孵育20分钟；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育4～6h；

6)24～48h后观察转入基因表达情况：取培养液上清，WesternBlot检测蛋白量，能检测到蛋白的为成功转入，同时记录每一段DNA对应的蛋白量以作比较；

7)稳定转染：将成功转染的样本每3天以1：10传代1次，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，若第三次的蛋白量是第一次的80％，则表明已稳定转染；选取其中三次蛋白量平均值较高且差异最小的样本，测定其DNA序列,如序列1所示。

实施例2

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×10⁵生产阿达木单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从工作细胞库中取出一支稳定生产阿达木单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产阿达木单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为5.56g/L，第60代CHO细胞的产量为5.48g/L。

实施例3

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×10⁵生产阿达木单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从工作细胞库中取出一支稳定生产阿达木单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产阿达木单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为5.19g/L，第60代CHO细胞的产量为5.27g/L。

实施例4

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×10⁵生产阿达木单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从工作细胞库中取出一支稳定生产阿达木单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产阿达木单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为4.83g/L，第60代CHO细胞的产量为4.69g/L。

实施例5

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×10⁵生产利妥昔单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从工作细胞库中取出一支稳定生产利妥昔单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产利妥昔单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为4.72g/L，第60代CHO细胞的产量为4.88g/L。

实施例6

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×105生产利妥昔单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从工作细胞库中取出一支稳定生产利妥昔单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产利妥昔单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为4.51g/L，第60代CHO细胞的产量为4.37g/L。

实施例7

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×105生产利妥昔单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从工作细胞库中取出一支稳定生产利妥昔单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产利妥昔单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为4.40g/L，第60代CHO细胞的产量为4.36g/L。

对比例1

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×105生产阿达木单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从取出一支稳定生产阿达木单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产阿达木单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为5.35g/L，第60代CHO细胞的产量为2.78g/L。

对比例2

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×105生产阿达木单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从取出一支稳定生产阿达木单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产阿达木单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为5.04g/L，第60代CHO细胞的产量为2.60g/L。

对比例3

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×105生产利妥昔单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从取出一支稳定生产利妥昔单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产利妥昔单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为4.64g/L，第60代CHO细胞的产量为2.15g/L。

对比例4

将前述序列插入到载体(pCOCKCMVwt，公司自己合成，序列来源于addgene)：转染前1天将0.5～2×105生产利妥昔单抗的CHO细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达90～95％。将0.8μg质粒DNA(pCOCKCMVwt，自己公司合成，序列来源于addgene)稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中轻轻混匀；将2μlLipofectamine2000稀释于50μl无血清无抗生素的培养液中，轻轻混匀，室温孵育5分钟。注意：必须在25分钟内进行；5分钟后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分钟。吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞2次。将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。将细胞放入培养箱孵育4～6h后。24～48h后观察转入基因表达情况。换含血清培养基24h后将细胞以1：10传代，1天后更换筛选培养基筛选。要保证细胞汇合率达90～95％；DNA/Lipofectamine2000比率1:0.5～1:5，一般细胞1:2～3。建立稳定细胞株，建立工作细胞库；并传代60次，获得第60代CHO细胞。

取Gibco的CDOptiCHO培养基1个包装(配1L培养基用)，加1L纯化水，搅拌均匀。用前再加入1461mgL-谷氨酰胺，搅拌均匀。

从取出一支稳定生产利妥昔单抗的工作细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)和一支第60代的生产利妥昔单抗的CHO细胞(来自北京益生合生物科技有限公司)(1mL)，分别进行以下操作：复苏，加入9mL培养基，混匀后离心，弃去上清，将细胞重悬于30mL培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养。培养至第三天补料、补糖。补料是称取适量(根据每天的培养数据会调整和变化)购自KEERY的SHEFF-CHOPLUSPFACF，用1：1的CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEffcientFeedB(CHOCDEfficientFeedA和CHOCDEfficientFeedB均购自Bibco)溶解。在临使用前加入L-谷氨酰胺搅拌均匀。之后继续在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下进行培养，隔天补培养基加糖直至培养的第11天，接着培养至第14天，停止培养。

收集上清，离心3分钟，取上清，用ELISA测产量，工作细胞库中细胞的产量为4.57g/L，第60代CHO细胞的产量为1.87g/L。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

2.含有权利要求1所述基因序列的载体。

3.含有权利要求1所述基因序列的CHO细胞株。

4.权利要求3所述细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

1)将CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将质粒DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育后，将二者混匀，室温孵育；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育；

6)观察转入基因表达情况：取培养液上清，WesternBlot检测蛋白量，能检测到蛋白的为成功转入；

7)稳定转染；

8)优化：将稳定转染的细胞挑出来，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，选出蛋白量较高且三次蛋白量之间相差比较小的细胞；

9)建立稳定细胞株。

5.根据权利要求4所述细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

1)将0.5×10⁵～2×10⁵(个)CHO细胞接种于培养板，并加入不含抗生素的完全培养基；

2)准备复合物：将质粒DNA和Lipofectamine2000分别稀释于无血清无抗生素的培养液中，混匀，室温孵育5分钟后，将二者混合，混匀，室温孵育20分钟；

3)吸去培养板的培养基，用无血清培养基清洗细胞；

4)将复合物均匀加入培养板中；

5)将培养板放入培养箱孵育4～6h；

6)24～48h后观察转入基因表达情况：取培养液上清，WesternBlot检测蛋白量，能检测到蛋白的为成功转入；

7)稳定转染：每3天以1：10传代1次，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，若第三次的蛋白量是第一次的80％，则表明已稳定转染；

8)优化：将上一步选出的稳定转染的细胞挑出来，每3天以1：10传代1次，持续传代3个月，每月月底取培养液上清做WesternBlot检测蛋白量，比较三次蛋白量，选出蛋白量较高且三次蛋白量之间相差比较小的细胞；

9)建立稳定细胞株。

6.权利要求1所述的基因序列在防止CHO细胞传代培养中启动子逐渐灭活上的应用。

7.权利要求1所述的基因序列在制备单克隆抗体、提高单克隆抗体产量上的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将权利要求3所述的CHO细胞株加入到培养基中，置于37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下培养，收集上清，取单抗。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述培养基为加血清的Opti-MEM培养基。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)将CHO细胞株扩大为工作细胞库，将工作细胞库中的CHO细胞加入到培养基中，混匀后离心，弃上清；

2)将细胞重悬于培养基中，在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm条件下培养，培养至第三天补糖、补培养基；

3)在37℃、5％CO₂、85％湿度、120rpm的条件下继续培养，隔天补糖、补培养基直至培养的第11天，继续培养至第14天停止；

4)收集上清，离心3分钟，之后收集上清，取单抗；

5)将工作细胞库中的CHO细胞传代培养，培养过程中，取单抗。