CN101715487A - 血凝素多肽中有变化的b型流感病毒 - Google Patents

血凝素多肽中有变化的b型流感病毒 Download PDF

Info

Publication number
CN101715487A
CN101715487A CN200880020720A CN200880020720A CN101715487A CN 101715487 A CN101715487 A CN 101715487A CN 200880020720 A CN200880020720 A CN 200880020720A CN 200880020720 A CN200880020720 A CN 200880020720A CN 101715487 A CN101715487 A CN 101715487A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
cell
type
influenza virus
influenza
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880020720A
Other languages
English (en)
Inventor
H·金
陈忠英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune LLC
MedImmune Vaccines Inc
Original Assignee
MedImmune Vaccines Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MedImmune Vaccines Inc filed Critical MedImmune Vaccines Inc
Publication of CN101715487A publication Critical patent/CN101715487A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Abstract

本发明包括在细胞培养物中产生B型流感病毒的方法。B型流感病毒可具有所需特征，例如在鸡蛋中复制增强，可用在例如疫苗和防止B型流感病毒感染的治疗方法中。

Description

血凝素多肽中有变化的B型流感病毒
发明背景
流感病毒由包含分区段的单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心和具有基质蛋白衬里的外层脂蛋白包膜组成。A型流感病毒和B型流感病毒各含有8个区段的负极性单链RNA。B型流感病毒的8个基因座区段编码11种蛋白。最大的3种基因编码RNA聚合酶的诸组分，PB1、PB2和PA。区段4编码HA蛋白。区段5编码NP。区段6编码NA蛋白和NB蛋白。NA和NB这两种蛋白均从双顺反mRNA的重叠读框翻译。B型流感病毒的区段7还编码两种蛋白：M1和BM2。最小的区段编码两种产物：NS1从全长RNA翻译，而NS2从剪接的mRNA变体翻译。
能产生流感病毒的特异性保护免疫应答的疫苗已经生产了50年以上。这些疫苗可表征为全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和减毒的活病毒疫苗。虽然这些疫苗类型中任何一种的合适制剂均能产生全身性免疫反应，但减毒的活病毒疫苗还能在呼吸道内刺激局部粘膜免疫力。
FluMistTM是一种减毒活疫苗，可保护儿童和成人不患流感(Belshe等，(1998)，“冷适应的三价鼻内减毒活流感疫苗对儿童的效应”(The efficacy oflive attenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine inchildren)，N Engl J Med 338：1405-12；Nichol等，(1999)，“鼻内减毒活流感疫苗对健康的、工作的成年人的效应：随机对照临床试验”(Effectiveness oflive，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adults：arandomized controlled trial)，JAMA 282：137-44)。FluMistTM疫苗株含有来源于当前流行的野生型病毒株的HA和NA基因区段及来源于共同主供体病毒(common master donor virus)(MDV)的六个基因区段。
到目前为止，美国所有商品化流感疫苗都在含胚鸡蛋内繁殖。B型流感病毒的许多毒株在鸡蛋中生长不良，必须变得“适应鸡蛋”。然而，B型流感病毒对鸡蛋的适应性导致HA多肽的氨基酸残基196或197处丧失N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点丧失影响病毒的抗原性以及相应的疫苗效力。稳定鸡蛋中生长的B型流感病毒中的N-连接糖基化位点对于B型流感病毒生产等意义重大。
发明概述
本发明的一个实施方式包括制备B型流感病毒的方法。在B型流感病毒基因组中引入造成HA 141位的氨基酸取代成精氨酸的突变。突变的B型流感病毒基因组在产生B型流感病毒的条件下复制。
本发明的另一实施方式包括制备B型流感病毒的方法。将多个载体引入一群宿主细胞。所述载体包含对应于以下的核苷酸序列：(a)第一B型流感病毒株的至少6个内部基因组区段，和(b)至少第二B型流感病毒株中编码HA和NA多肽的一个或多个基因组区段。HA多肽在氨基酸141处包含精氨酸。该宿主细胞群在不超过35℃的温度培养。回收流感病毒。
附图简述
图1：pAD3000质粒的示意图。
图2：产生B型流感病毒的8个质粒系统的示意图。
图3A-D：A和B，通过RT-PCR表征重组MDV-B病毒；C和D，通过RT-PCR表征重组B/Yamanashi/166/98病毒。
图4A和B：GeneBank格式的pAD3000的序列(SEQ ID NO：3)。
图5A-AE：MDV-B和8种质粒的序列比对，A-E，PB1区段(SEQ IDNO：4)；F-J，PB2区段(SEQ ID NO：5)；K-O，PA区段(SEQ ID NO：6)；P-S，HA区段(SEQ ID NO：7)；T-W，NP区段(SEQ ID NO：8)；X-Z，NA区段(SEQ ID NO：9)；AA-AC，M区段(SEQ ID NO：10)；AD-AE，NS区段(SEQ ID NO：11)。
图6：同时扩增B型流感病毒株的HA和NA区段得到的RT-PCR产物。
图7：描述重组和重配病毒的相对滴度的柱状图。
图8：在PA、NP和M1蛋白中含有野生型残基的三-基因重组体的示意图。
图9：单-基因和双-基因重组病毒的生长列表。
图10：核蛋白中对应于非-ts表型的氨基酸残基的列表。
图11：描述重配病毒的差别复制的柱状图。灰框表示野生型氨基酸残基。虚线表示截断温度(shut-off temperature)(ts)为2.0log10。
图12：几种鸡蛋扩增B型流感病毒株的196/197糖基化位点附近的HA序列的比对。Victoria谱系病毒与参比毒株B/Victoria/2/87(SEQ ID NO：12)比对。Yamagata谱系病毒与B/Yamagata/16/88(SEQ ID NO：13)病毒。比对中只显示不同于参比毒株的残基。下划线和箭头标出了196/197位可能的N-糖基化位点(N-X-T/S)。“.”表示B/Yamagata谱系中的氨基酸缺失。“x”表示混合氨基酸(mixed amino acid)。
图13：通过蛋白质印迹验证HA糖基化。用10％SDS-PAGE对具有所示196-199序列的B/Shanghai/361/02(B/SH)、6∶2 B/Jilin/20/03(B/JL)和6∶2B/Jiangsu/10/03(B/JS)进行电泳。利用多克隆抗HA抗体，通过蛋白质印迹检测HA1和HA2蛋白。下划线表示病毒鸡蛋分离物中存在的原始序列。
图14：在HA残基141处含精氨酸的鸡蛋培养的病毒保留残基196-197处的糖基化(位点)。在141和196/197处具有所示残基的6∶2 B/Shanghai/361/02(B/SH)、6∶2 B/Ohio/1/05(B/Ohio)和6∶2B/Jiangsu/10/03(B/JS)在鸡蛋中培养，用10％SDS-PAGE对病毒进行电泳。利用多克隆抗HA抗体，通过蛋白质印迹检测HA1和HA2蛋白。迁移较慢的HA1表明196/197位点被糖基化，如*所示。下划线表示病毒鸡蛋分离物中存在的原始序列。
详述
本发明包括通过将载体引入培养细胞而产生B型流感病毒的系统。该方法产生的B型流感病毒在特定位置可具有影响病毒在鸡蛋中复制能力，或可影响病毒在鸡蛋中复制后的特征的氨基酸残基。
除非另有定义，所有科学和技术术语应理解为具有与本发明所属技术领域常规使用的相同含义。出于本发明的目的，定义了以下术语。
“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”可以是单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，或其嵌合体或类似物。这些术语还可以包括天然核苷酸类似物的聚合物，其具有天然核苷酸的本质属性，能够以与天然产生核苷酸(如肽核酸)类似的方式杂交单链核酸(例如肽核酸)。
“基因”指有生物功能的任何核酸。基因包括编码序列和/或其表达所需的调节序列。“基因”可以指具体的基因组序列，也指基因组序列所编码的cDNA或mRNA。
基因还包括非表达的核酸区段，如形成其他蛋白的识别序列。非表达的调节序列包括“启动子”和“增强子”，调节蛋白如转录因子可与之结合从而转录毗邻或附近的序列。“组织特异性”的启动子或增强子是在某特定组织类型或细胞类型，或多种类型中调节转录的启动子或增强子。
“载体”可以是用于在微生物、细胞或细胞组分之间增殖和/或转移核酸的工具。载体包括质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等，载体可自主复制或整合到宿主细胞的染色体内。载体还可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由位于同一条链内的DNA和RNA组成的多核苷酸、多聚赖氨酸偶联的DNA或RNA、肽偶联的DNA或RNA、脂质体偶联的DNA等，这些载体不能自主复制。
“表达载体”可以是能启动表达以及复制掺入其中的核酸的载体，如质粒。所表达的核酸可以“操作性连接”于启动子和/或增强子，并受到启动子和/或增强子的转录调控。
“双向表达载体”通常表征为相对于位于两个启动子之间的核酸，在方向上相反的两个备选启动子，从而可在任一方向开始表达以转录出正(+)或正义链和负(-)或反义链RNA。另外，双向表达载体可以是双义载体，病毒mRNA和病毒基因组RNA(例如，cRNA)从同一条链上表达。
当“分离的”指生物学材料，例如核酸或蛋白质时，其可以是基本上不含在其天然环境中与其正常相伴或相互作用的组分的生物材料。分离的材料还可以任选包含其天然环境，如细胞中不存在的材料。
“重组体”可表示经人工或合成(非天然)改变的材料(如核酸或蛋白)。这种改变可以对处于其天然环境或状态，或从其天然环境或状态中取出的材料进行。
重配病毒包括含有源自一种以上亲本病毒株或来源的遗传和/或多肽组分的病毒。例如，7∶1重配株包含源于第一亲本病毒的7个病毒基因组区段(或基因区段)和第二亲本病毒的一个病毒基因组区段，如，编码血凝素或神经氨酸酶的区段。6∶2重配株包含第一亲本病毒的6个基因组区段，最常见的是6个内部基因以及第二亲本病毒的两个基因组区段，例如血凝素和神经氨酸酶(的编码区段)。6∶1∶1重配株包含第一亲本病毒的6个基因组区段(最常见的是6个内部基因)、编码血凝素的第二亲本病毒的1个基因组区段和编码神经氨酸酶的第三亲本病毒的1个基因组区段。所述6个内部基因也可以是多个亲本病毒的那些基因。
引入载体或核酸可以指将核酸掺入真核或原核细胞中。载体或核酸可以通过掺入其基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)而掺入细胞，可以转化成自主复制子或者可以瞬时表达(例如，转染mRNA)。引入包括诸如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”等方法。可通过电穿孔、磷酸钙沉淀或脂质介导的转染(脂转染)(lipofection)将核酸引入细胞。
宿主细胞可以是含有异源核酸，如载体，并支持核酸复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫细胞、两栖类动物细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞，包括人细胞。宿主细胞包括Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、Per.C6细胞(人胚胎视黄醛细胞)、BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)、原代鸡肾细胞(PCK)、马-达二氏(Madin-Darby)犬肾(MDCK)细胞、马-达二氏牛肾(MDBK)细胞、293细胞(如293T细胞)和COS细胞(如COS1、COS7细胞)。术语宿主细胞还包括细胞的组合或混合物，如不同细胞类型或细胞系的混合培养物(例如，Vero和CEK细胞)。例如，2004年12月22日提交的PCT/US04/42669描述了电穿孔Vero细胞的共同培养。
与33℃相比，B型流感病毒株的温度敏感的(ts)病毒在37℃的滴度下降100倍或更多。冷适应(ca)的病毒通常显示25℃的生长在其33℃生长的100倍以内。减毒的(att)病毒通常在雪貂的上呼吸道内复制但在肺组织内检测不到，也不能引起动物出现流感样疾病。生长是通过滴度、噬斑大小或形态、颗粒密度或本领域技术人员熟知的其他量度来表示的病毒量。
人工改造的病毒、病毒核酸或病毒编码产物，如多肽、疫苗是含有通过重组方法，如定向诱变、PCR诱变等引入至少一个突变的病毒、核酸或产物。含有一个或多个核苷酸突变和/或氨基酸取代的人工改造的病毒(或病毒成分或产物)指编码病毒(或病毒成分或产物)的病毒基因组或基因组区段不是源自天然来源，如天然产生的或通过非重组方法(如在25℃下累进传代)制备的已有实验室病毒株，例如野生型的或冷适应A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66毒株。
载体
在本发明包括的一些方法中，可以将对应于B型流感病毒的8个区段的每一个的病毒基因组区段插入多种载体以供操作和产生流感病毒。该多种载体可包括8种载体；包含对应于一种或多种B型流感病毒的8个基因组区段的核酸序列的8种载体。该多种载体可包括更多或更少的载体。例如，该多种载体可包括11种载体；包含对应于11种B型流感病毒蛋白编码序列的核酸序列的11种载体。或者，该多种载体可包括一种载体；包含一种或多种B型流感病毒的8个基因组区段的每一个的一种载体。该多种载体还可包括2、3、4、5、6、7、9或10种载体。
载体可以是病毒载体、质粒、粘粒、噬菌体或人工染色体。如果载体是质粒，质粒可以提供能够在细菌和真核细胞中发挥功能的一个或多个复制起点，以及任选的标记以便筛选或选择掺入该质粒序列的细胞。示例性的载体是图1所示的pAD3000。
如果载体是质粒，该质粒可以是双向表达载体，该载体可以在任一方向上启动病毒基因组区段的转录，从而产生(+)链RNA和(-)链病毒RNA分子。为实现双向转录，每个病毒基因组区段都插入到含有至少两个独立启动子的载体内，这样第一RNA聚合酶启动子(即Pol I)可从一条链上转录病毒基因组RNA的拷贝，而第二RNA聚合酶启动子(即Pol II)合成病毒mRNA。因此，两个启动子以相反方向排列，侧接至少一个适合插入病毒基因组RNA区段的克隆位点(即限制性内切酶识别序列)，优选独特的克隆位点。或者，可使用“双义”载体，其中(+)链mRNA和(-)病毒RNA(例如，cRNA)从该载体的同一条链上转录。
表达载体
待表达的流感病毒基因组区段操作性连接于合适的转录控制序列(启动子)以介导mRNA合成。各种启动子都适用于表达载体中以调控流感病毒基因组区段的转录。在某些实施方式中，例如载体是质粒pAD3000时，所用的启动子是巨细胞病毒(CMV)DNA依赖性RNA聚合酶II(PolII)启动子。如果需要，例如为了调控条件性表达，也可以用其他的启动子替换以诱导RNA在特定的条件下转录，或者在特定的组织或细胞内转录。许多病毒和哺乳动物，如人的启动子都可以使用，或者可根据特定的用途来分离。例如，从动物和人病毒的基因组获得的其它启动子包括腺病毒(如腺病毒2)、乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、多瘤病毒和猿病毒40(SV40)的启动子以及各种逆转录病毒启动子。哺乳动物启动子包括肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热激启动子等。另外，噬菌体启动子也可与同源的RNA聚合酶联用，如T7启动子。
任选通过包含增强子序列来增强转录。增强子一般较短，约10-500bp，是一种顺式作用DNA元件，可与启动子一起增强转录。已从哺乳动物基因(血红蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)和真核细胞病毒中分离了许多增强子序列。增强子可连接到载体中异源编码序列的5’或3’位置，但是一般都插入到启动子的5’位。通常，选择启动子和转录增强序列(如果需要的话)来优化异源DNA在其所引入的宿主细胞类型中的表达(Scharf等，(1994)“热应激启动子和转录因子”(Heat stress promoters andtranscription factors)Results Probl Cell Differ 20：125-62；Kriegler等，(1990)“增强子、启动子和剪接位点的装配以控制转移基因的表达”(Assembly ofenhancers，promoters，and splice signals to control expression of transferredgenes)Methods in Enzymol 185：512-27)。扩增子还任选含有核糖体结合位点或内部核糖体进入位点(IRES)以便于开始翻译。
本发明的载体还可包含转录终止以及稳定mRNA所需的序列，如多聚腺苷酸位点或终止子序列。这种序列通常置于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻译区，有时也置于3’非翻译区。在一个实施方式中，例如涉及质粒pAD3000的实施方式中，SV40多聚腺苷酸序列提供多聚腺苷酸信号。
此外，如上所述，表达载体任选包含一个或多个可选择的标记基因以提供筛选转化宿主细胞所需的表型性状，除了前面所列基因外，标记物如二氢叶酸还原酶或新霉素耐药性都适于选择真核细胞培养物。
含上述合适DNA序列以及合适启动子或控制序列的载体可用于转化允许蛋白表达的宿主细胞。
其它表达元件
编码流感病毒蛋白的基因组区段可包括该区段表达所需的任何额外的序列。例如，可以包含特异性的起始信号以帮助有效翻译异源编码序列。这些信号包括，例如ATG起始密码子及毗邻序列。为了确保翻译该基因组区段编码的整个蛋白质，起始密码子插入相对于病毒蛋白的正确读框内。外源性转录元件和起始密码子可以是各种来源，可以是天然的，也可以是合成的。可以通过纳入适于所用细胞系统的增强子来提高表达效率。
编码附加表达元件如信号序列、分泌或定位序列等额外的多核苷酸序列可以掺入载体，通常与感兴趣的多核苷酸序列同框，从而，例如使多肽表达靶向所需的细胞隔室、膜或细胞器，或者分泌到细胞培养基中。这些序列是本领域技术人员已知的，包括分泌前导肽、细胞器靶向性序列(如细胞核定位序列、ER滞留信号、线粒体转运序列)、膜定位/锚定序列(如停止运送序列、GPI锚定序列)等。
内部基因组区段
B型流感病毒株的内部基因组区段可以是一种或多种主供体B型流感病毒的内部基因组区段。可以根据疫苗给药相关的所需特性选择所述一种或多种主(供体)B型流感病毒。例如，可根据减毒表型、冷适应性和/或温度敏感性选择主供体B型流感病毒株。就此而言，ca B/Ann Arbor/1/66或掺入表17所列一种或多种氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒株可以是主供体B型流感病毒株。这些氨基酸取代可以包括位于以下一处或多处的取代：PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP509；M1159和M1183。所述氨基酸取代可以包括以下一个或多个：PB2630(S630R)；PA431(V431M)；PA497(Y497H)；NP55(T55A)；NP114(V114A)；NP410(P410H)；NP509(A509T)；M1159(H159Q)和M1183(M183V)。氨基酸取代可以包括位于以下全部位置的取代：PB2630；PA431；PA497；NP55；NP114；NP410；NP509；M1159和M1183。取代可以是以下全部：PB2630(S630R)；PA431(V431M)；PA497(Y497H)；NP55(T55A)；NP114(V114A)；NP410(P410H)；NP509(A509T)；M1159(H159Q)和M1183(M183V)。
可将一种或多种主供体B型流感病毒株(即，PB1、PB2、PA、NP、NB、M1、BM2、NS1和NS2)的6个内部基因组区段与在抗原性上理想的毒株，例如预期会导致明显的局部或整体流感感染的毒株的血凝素和神经氨酸酶区段联合转染入合适的宿主细胞。重配病毒在有效回收的合适温度，例如等于或小于35℃，如约30℃-35℃、如约32℃-35℃、如约32℃-34℃，或约30℃、或约31℃、或约32℃、、或约33℃、或约34℃或约35℃下，在细胞培养物中复制后，回收重配病毒。回收的病毒可在含胚鸡蛋中复制。回收的病毒可以在培养的细胞中复制。可利用变性剂，例如甲醛或β-丙内酯灭活在含胚鸡蛋或培养细胞中复制的回收病毒。
属性改变的B型流感病毒
本发明方法还包括引入突变从而在HA位置141处形成氨基酸取代。与HA未取代的流感病毒相比，该突变可增强B型流感病毒在含胚鸡蛋中复制的能力。HA位置141处的取代还允许流感病毒保留HA氨基酸残基196/197处的糖基化。HA位置141处的取代还不会明显改变HA的抗原性。HA位置141处的取代可以是取代精氨酸、组氨酸或半胱氨酸。
与未修饰的流感病毒相比，在HA中引入氨基酸取代可将B型流感病毒在鸡蛋中复制的能力增强至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％、或至少300％、或至少400％、或至少500％。在鸡蛋中复制能力增强的病毒的滴度可以是至少5.0log10PFU/ml、至少6.0log10PFU/ml、至少6.5log10PFU/ml、至少7.0log10PFU/ml、至少7.25log10PFU/ml、至少7.5log10PFU/ml、至少7.75log10PFU/ml、至少8.0log10PFU/ml、至少8.25log10PFU/ml、至少8.5log10PFU/ml、至少8.75log10PFU/ml、至少9.0log10PFU/ml或至少9.5log10PFU/ml。与未修饰的流感病毒相比，在鸡蛋中复制能力增强的B型流感病毒还保留了氨基酸残基位置196/197处的HA糖基化。
与未修饰的病毒相比，引入氨基酸取代还不会明显改变取代的流感病毒的抗原性。取代的流感病毒的抗原性与未修饰病毒的差别小于5％、10％、20％、25％、30％、40％或50％。测定病毒抗原性的方法是本领域熟知的。
引入导致HA残基位置141处发生氨基酸取代的突变可调节HA的受体结合活性。HA的受体结合活性包括但不限于HA与存在于细胞表面糖蛋白或糖脂上的唾液酸残基(例如，2，6-连接的唾液酸-半乳糖基部分[Siaα(2，6)Gal]和2，3-连接的唾液酸-半乳糖基部分[Siaα(2，3)Gal])结合。检验HA结合的方法是本领域熟知的。引入导致HA残基141处发生氨基酸取代的突变可增强HA与[Siaα(2，3)Gal]部分结合。在本领域技术人员熟知的(例如)血细胞凝集试验(hemaagglutination assay)中，与[Siaα(2，3)Gal]部分的结合增强至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少200％。
B型流感病毒变体还可具有以下一种或多种属性，包括减毒、冷适应、温度敏感或它们的任何组合。B型流感病毒变体可以因掺入了主供体B型流感病毒，例如流感B/Ann Arbor/1/66的内部基因组区段而具有这些属性中的一种或多种。
所述B型流感病毒变体可以是包含在141位具有甘氨酸残基的HA多肽的任何B型流感病毒。所述B型流感病毒HA多肽可以是以下流感病毒株的HA多肽：B/Victoria/2/87、B/Hong Kong/330/01、B/Brisbane/32/02、B/Malaysia/2506/04、B/Hawaii/13/04、B/Ohio/1/05、B/Yamagata/16/88、B/Yamanashi/166/98、B/Johannesburg/5/99、B/Vicotria/504/00、B/Shanghai/361/02、B/Jilin/20/03或B/Florida/7/04。
细胞培养
在本发明包括的一些方法中，将多个载体引入宿主细胞。这些宿主细胞包括，例如Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞和COS细胞，包括293T细胞、COS7细胞。或者，可采用包括以上细胞系中两种，例如MDCK细胞和293T或COS细胞的联合培养，例如比例为1∶1。可在适合维持中性缓冲pH(例如，pH介于7.0-7.2之间)的受控湿度和CO2浓度下，将细胞维持在合适的商品化培养基中，例如补加了血清(如，10％胎牛血清)的Dulbecco改进的Eagle培养基，或维持在无血清培养基中。培养基任选含有抗生素(例如，青霉素、链霉素等)以防止细菌生长，和/或额外的营养物，例如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸，额外的添加剂以促进生长特征，例如胰蛋白酶、β-巯基乙醇等。
培养哺乳动物细胞的方法已广为报道，本领域技术人员知道这些方法。通用方法见，例如Freshney(1983)《动物细胞培养：基本技术手册》(Culture of Animal Cells：Manual of Basic Technique)，ARL公司(Alan R.Liss)，纽约；Paul(1975)《细胞与组织培养》(Cell and Tissue Culture)，第5版，利文斯顿公司(Livingston)，爱丁堡；Adams(1980)《生物化学家用于细胞培养的生物化学和分子生物学实验室技术》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists)，Work和Burdon(编)Elsevier，阿姆斯特丹。体外生产流感病毒的特别感兴趣的组织培养方法的细节见，例如Merten等，(1996)“在细胞培养物中产生用于疫苗制备的流感病毒”(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation).刊于Cohen和Shafferman(编)《疫苗设计和生产的新方案》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)，其通过引用全文纳入本文。此外，通过常规实验不难确定适用于本发明的这些方法的改变形式。
可在含血清或无血清培养基中培养生产B型流感病毒的细胞。在一些情况中，例如为制备纯化的病毒，在无血清条件下培养宿主细胞是理想的。
可以任何规模培养细胞。细胞可采用小规模，例如25ml以下培养基，在培养管或培养瓶或大培养瓶中振荡培养，在转瓶中，或在培养瓶、瓶或反应器中的微载体珠(如DEAE-Dextran微载体珠，如多姆赛尔公司(Dormacell)、PL公司(Pfeifer & Langen)；超级珠(Superbead)，FL公司(FlowLaboratories)；苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，如喜力公司(Hillex)，索赫尔公司(Solohill)，AA公司(Ann Arbor))上培养。微载体珠是一种小球(直径为100-200微米)，为单位体积细胞培养液中的粘附细胞生长提供大的表面积。例如，1升培养基可包含2千万以上的微载体珠，提供超过8000mm2的生长表面。对于病毒的商品化生产，如疫苗生产，在生物反应器或发酵罐内培养细胞是理想的。可用的生物反应器的体积可自1升以下到100升以上，如明尼苏达州明内通卡的奥斯莫尼克公司(Osmonics，Minnetonka，MN)的Cyto3生物反应器；新泽西州埃迪逊NBS公司(New Brunswick Scientific，Edison，N.J.)的NBS生物反应器；德国梅尔苏根BBBI公司(B.Braun BiotechInternational，B.Braun Biotech，Melsungen，Germany)的实验室和商品化规模的生物反应器。
不论培养体积的大小，培养可维持在小于或等于35℃、小于或等于34℃、小于或等于33℃、小于或等于32℃、小于或等于31℃、或小于或等于30℃的温度下。可将细胞培养约30℃-35℃、约32℃-35℃、约32℃-约34℃、或约32℃-33℃的温度下。
将载体引入宿主细胞
可按照本领域熟知的方法将包含对应于流感病毒基因组区段的核苷酸序列的载体引入(如转染)宿主细胞，这些方法包括，例如钙磷酸盐共沉淀法、电穿孔、微注射、脂质转染和利用多胺转染试剂转染。例如，可按照厂家的使用说明书，利用多胺转染试剂TransIT-LT1(麦乐斯公司(Mirus))将载体如质粒引入宿主细胞，如COS细胞、293T细胞或者COS或293T细胞与MDCK细胞的组合。可用在160μl培养基中稀释的约2μl TransIT-LT1将约1μg的各载体引入宿主细胞群，总体积为200μl。DNA：转染试剂混合物在室温下温育45分钟，然后加入800μl培养基。将转染混合物加入宿主细胞，如上所述培养。
或者，也可采用电穿孔将包含对应于流感病毒基因组区段的核苷酸序列的载体引入宿主细胞。例如，可根据以下流程，采用电穿孔将包含对应于B型流感病毒基因组区段的核苷酸序列的质粒载体引入Vero细胞。将在添加了10％胎牛血清(FBS)的改进Eagle培养基(MEM)中培养的5×106个Vero细胞重悬于0.4ml OptiMEM中，置于电穿孔杯内。将体积最多为25μl的20微克DNA加入到含细胞的杯中，然后轻叩以轻柔地混合。按照厂家的使用说明书(例如，连接有加强型电容增量器的BR基因脉冲仪II(BioRadGene Pulser II with Capacitance Extender Plus connected))进行电穿孔，300伏、950微法，时间常数为28-33毫秒。通过温和敲打再混合细胞，电穿孔后约1-2分钟将0.7ml含10％FBS的MEM直接加入小杯内。然后将细胞转移到标准6孔组织培养板的2个孔内，孔内含2ml MEM+10％FBS或无血清的OPTI-MEM。洗涤小杯以回收任何剩余的细胞，洗涤悬液分成两孔。终体积约为3.5ml。然后在适合病毒生长的条件下温育细胞。
回收病毒
可从已引入多个载体的细胞的培养液中回收病毒。先得到粗制的培养液并进行澄清，再浓缩澄清的培养液中的流感病毒。常用的浓缩方法包括过滤、超滤、硫酸钡吸附和洗脱以及离心。例如，首先可在例如1000-2000×g离心足够时间，如10到30分钟来澄清受感染培养物的粗制培养液以去除细胞碎片和其它大颗粒物质。或者，培养液可经0.8μm的醋酸纤维素滤器过滤以除去完整的细胞和其它大颗粒物质。然后任选离心澄清的培养液上清以沉淀流感病毒，如以15,000×g离心约3-5小时。将病毒团重悬浮在合适的缓冲液中，如STE(0.01M Tris-HCl；0.15M NaCl；0.0001M EDTA)或pH7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)中后，利用蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)密度梯度离心浓缩病毒。持续或分步离心都合适，如12％-60％的蔗糖梯度，4步，每步12％。梯度离心时要有足够的转速和时间以使病毒浓缩成可见的条带以供回收。或者，对于大规模商品化应用，可利用持续模式操作的区带离心机从密度梯度淘选病毒。以下文献提供了足以指导技术人员从组织培养物中制备流感病毒的其它细节：例如，Furminger，“疫苗制备”(Vaccine Production)，刊于Nicholson等(编)，《流感病毒教科书》(Textbook of Influenza)，第324-332页；Merten等，(1996)“在细胞培养物中制备流感病毒用于疫苗的制备”(Production of influenza virus in cellcultures for vaccine preparation)，刊于Cohen和Shafferman(编)，《疫苗设计和制备的新方案》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)，141-151页；以及美国专利5,690,937号。如果需要，回收的病毒还可以在有作为稳定剂的蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐(SPG)存在下保存于-80℃。
预防性给予疫苗的方法和组合物
本发明的重组和重配病毒可以用合适的运载体或赋形剂预防性给予以刺激一种或多种流感病毒株的特异性免疫反应。所述运载体或赋形剂可以是药学上可接受的运载体或赋形剂，如无菌水、水性盐溶液、水性缓冲盐溶液、水性葡萄糖溶液、水性甘油溶液、乙醇、未感染鸡蛋的尿囊液(即正常的尿囊液“NAF”)或它们的组合。可按照本领域已知的方法制备确保无菌、pH、等渗性和稳定性的这种溶液。运载体或赋形剂的选择通常应尽可能降低变态反应或其它不良反应，并且适合特定的给药途径，如皮下、肌肉、鼻内等。
本发明的流感病毒的给予量通常足以刺激一种或多种流感病毒株的特异性免疫反应。本领域技术人员熟知激发抵御一种或多种流感病毒株的保护性免疫反应的剂量和方法。例如，灭活的流感病毒的给药剂量约为1-1000HID50(人感染剂量)，即每个剂量给予约105-108pfu(噬斑形成单位)。或者，约10-50μg，如约15μg HA不添加佐剂给予，而更低的剂量要用佐剂给予。一般可在该范围内根据年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药时间以及其它临床因素调整剂量。预防性疫苗制剂可以用针头和注射器，或者无针注射装置通过例如皮下或肌肉注射而全身性给予。或者，疫苗制剂还可通过滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)鼻内给予，或者可喷入上呼吸道。对于鼻内给药，可利用减毒的活病毒疫苗，例如减毒的、冷适应的和/或温度敏感的重组或重配流感病毒。虽然优选利用单剂量来刺激保护性免疫反应，但是通过相同或不同给药途径给予额外剂量也可以实现所需的保护效果。
或者，可用流感病毒离体或体内靶向树突状细胞来刺激免疫反应。例如，可使增殖的树突状细胞以足够的用量和足够的时间与病毒接触以使树突状细胞捕获流感病毒抗原。然后通过标准静脉内移植方法将细胞转移到经免疫的对象体内。
预防性或治疗性治疗流感的制剂中可存在一种或多种B型流感病毒。一种制剂可包含一种B型流感病毒。一种制剂可包含一种B型流感病毒和一种A型流感病毒。一种制剂可包含一种B型流感病毒和两种A型流感病毒。一种制剂中可包含两种B型流感病毒和两种A型流感病毒。一种制剂中可包含两种B型流感病毒。制剂中的至少一种B型流感病毒可在氨基酸残基141处包含精氨酸。
保护性给予流感病毒或其亚单位的制剂还可以包含一种或多种佐剂以增强针对流感病毒抗原的免疫反应。合适的佐剂包括：皂甙、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、杆菌卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)以及合成的佐剂QS-21和MF59。
预防性给予流感病毒的制剂可以与一种或多种免疫刺激分子联用。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增强和促炎活性的各种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，例如，白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生长因子(如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；和其它免疫刺激分子，如巨噬细胞炎症因子、Flt3配体、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可以和流感病毒在同一种制剂内给予，也可以分别给予。可以给予蛋白质或编码蛋白质的表达载体以产生免疫刺激效应。
在另一个实施方式中，可以联用上述合适的药物运载体或赋形剂与包含对应于流感病毒基因组区段的核苷酸序列的本发明载体将异源核酸引入宿主生物或宿主细胞，例如哺乳动物细胞，如来源于人对象的细胞。可将异源核酸插入基因或基因区段的非必需区。异源多核苷酸序列可编码多肽或肽，或者RNA，如反义RNA或核酶。然后通过制备掺入了异源核酸的重组病毒而将该异源核酸引入宿主或宿主细胞，如上所述给予病毒。
或者，可通过将载体共转染入感染了流感病毒的细胞而将包含异源核酸的本发明载体引入宿主细胞并在其中表达。然后任选将细胞回输或递送给该对象，一般是递送到获得细胞的部位。在一些应用中，可采用已有的细胞转移或移植方法将这些细胞移植到感兴趣的组织、器官或系统部位(如上所述)上。例如，可采用标准递送或输注技术将造血细胞系的干细胞，如骨髓、脐带血或外周血来源的造血干细胞递送至对象。
或者，可将含异源核酸的病毒递送至对象体内的细胞内。这种方法可包括将载体颗粒给予靶细胞群(例如，血细胞、皮肤细胞、肝细胞、神经(包括脑)细胞、肾细胞、子宫细胞、肌肉细胞、肠细胞、宫颈细胞、阴道细胞、前列腺细胞等；以及源自各种细胞、组织、器官的肿瘤细胞)。可通过例如静脉给予病毒颗粒，也可以通过各种方法，包括注射(利用针头或注射器)、无针疫苗递送、局部给药或推入组织、器官或皮肤部位而病毒颗粒直接递送到一个或多个感兴趣的部位。例如，病毒载体颗粒可通过吸入、口服、静脉内、皮下、真皮下、真皮内、肌肉内、腹膜内、气管内、经阴道或直肠给药，或者在例如手术过程中将病毒颗粒置于身体的腔隙或其它部位而递送。
本发明的方法和病毒可用于治疗性或预防性治疗多种疾病，包括遗传性和获得性疾病，例如作为病毒、细菌等所致疾病的疫苗。
试剂盒
为了便于使用本发明的载体和流感病毒，可为实验或治疗目的而将任何这些载体和病毒，以及用于包装和感染的其它组分，例如缓冲液、细胞、培养基包装成试剂盒的形式。除上述组分外，试剂盒可包含其它材料，例如实施本发明方法的使用说明书、包装材料和容器。
病毒核酸和蛋白质的操作
就本发明而言，可根据已知的分子生物学技术操作流感病毒核酸和/或蛋白质。许多这种方法，包括扩增、克隆、诱变、转化等的详细方案描述于以下文献：Ausubel等，《最新分子生物学技术》(Current Protocols inMolecular Biology)(2000年增补)，约翰威利父子公司(John Wiley & Sons)，纽约(″Ausubel″)；Sambrook等，《分子克隆-实验室手册》(MolecularCloning-A Laboratory Manual)(第二版)，1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989(″Sambrook″)；以及Berger和Kimmel《分子克隆技术指导，酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)，152卷，学术出版社(Academic Press，Inc.)，圣迭戈，加利福尼亚州(″Berger″)。
除了上述文献外，其它可用于扩增本发明的cDNA探针的体外扩增技术方案，例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增以及其它RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)可见：Mullis等，(1987)美国专利4,683,202号；《PCR方案-方法和应用指导》(PCR Protocols A Guideto Methods and Applications)(Innis等编)，学术出版社，圣迭戈，加利福尼亚州(1990)(″Innis″)；Arnheim和Levinson(1990)C & EN 36；The Journal OfNIH Research(1991)3：81；Kwoh等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86，1173；Guatelli等，(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87：1874；Lomell等，(1989)J ClinChem 35：1826；Landegren等，(1988)Science 241：1077；VanBrunt(1990)Biotechnology 8：291；Wu和Wallace(1989)Gene 4：560；Barringer等，(1990)Gene 89：117以及Sooknanan和Malek，(1995)Biotechnology13：563。可用于克隆本发明核酸的其它方法包括Wallace等的美国专利第5,426,039号。通过PCR扩增大核酸的改进方法总结于Cheng等，(1994)Nature 369：684及其参考文献。
可利用各种固相技术合成某些本发明的多核苷酸，例如寡核苷酸，包括基于单核苷酸-和/或三核苷酸-的亚磷酰胺耦合化学方法。例如，可通过将活化的单体和/或三聚体顺序添加到延伸的多核苷酸链上来合成核酸序列。参见Caruthers，M.H.等，(1992)Meth Enzymol 211：3。
除了合成所需序列外，还可以从各种商业来源定制基本上任何核酸序列，如MCRC公司(Midland Certified Reagent Company，mcrc@oligos.com)，GAGC公司(The Great American Gene Company，www.genco.com)，EG公司(ExpressGen，Inc.，www.expressgen.com)，OT公司(Operon Technologies，Inc.，www.operon.com)和许多其它公司。
此外，可通过例如定点诱变来取代病毒多肽上指定的氨基酸。例如，可通过将特异性突变引入编码病毒多肽的病毒核酸片段来制备含有在功能上与表型特征，如减毒表型、冷适应、温度敏感性相关的氨基酸取代的病毒多肽。定点诱变的方法是本领域熟知的，参见例如Ausubel、Sambrook和Berger，同上。执行定点诱变的许多试剂盒可商品化购得，如拉霍亚斯特拉塔基因公司的卡梅隆定点诱变试剂盒(Chameleon Site DirectedMutagenesis Kit，Stratagene，La Jolla)，可按照厂家的使用说明书将表6或表17中所述的一个或多个氨基酸取代分别引入编码A或B型流感病毒多肽的基因组区段。
具体实施方式
1.一种制备在鸡蛋中复制增强的HA糖基化B型流感病毒的方法，包括：
(a)将导致HA位置141处的氨基酸取代为精氨酸的突变引入B型流感病毒基因组；和
(b)在产生B型流感病毒的条件下复制该突变的流感病毒基因组。
2.如实施方式2的方法，其中通过定点诱变实施引入步骤。
3.一种制备在鸡蛋中复制增强的HA糖基化B型流感病毒的方法，包括：
(a)将多个载体引入一群宿主细胞，所述载体包含对应于以下的核苷酸序列：
(i)第一B型流感病毒株的至少6个内部基因组区段；和
(ii)至少第二B型流感病毒株的编码HA和NA多肽的一个或多个基因组区段，其中所述HA多肽在氨基酸残基141处包含精氨酸；
(b)在不超过35℃的温度下培养该群宿主细胞；和
(c)回收流感病毒。
4.如实施方式3的方法，还包括在步骤(i)之前：
在所述多个载体的一个载体中引入突变；
其中该一个载体包含对应于编码HA的基因组区段的核苷酸序列，和
其中该突变导致氨基酸残基141处为精氨酸。
5.如实施方式3或4的方法，其中所述第一B型流感病毒具有以下属性之一：温度敏感性、减毒或冷适应性。
6.如实施方式3-5中任一项的方法，其中，所述第一B型流感病毒包含以下氨基酸残基：PB2630(630R)；PA431(431M)；PA497(497H)；NP55(55A)；NP114(114A)；NP410(410H)；NP510(510T)；M1159(159Q)和M1183(183V)。
7.如实施方式6的方法，还包括以下步骤：
在所述多个载体的载体中引入突变；
其中所述载体包含对应于所述第一B型流感病毒株的6个内部基因组区段的核苷酸序列，和
其中该突变导致存在以下氨基酸残基：PB2630(630R)；PA431(431M)；PA497(497H)；NP55(55A)；NP114(114A)；NP410(410H)；NP510(510T)；M1159(159Q)和M1183(183V)。
8.如实施方式3-7中任一项的方法，其中所述第一B型流感病毒是病毒株B/Ann Arbor/1/66。
9.如实施方式3-8中任一项的方法，其中所述细胞是以下一种：Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、PCK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、293细胞或COS细胞。
10.如实施方式3-9中任一项的方法，其中所述载体是质粒。
11.如实施方式3-10中任一项的方法，其中所述多个载体包含8质粒组，其中该8质粒各自包含对应于所述第一或第二B型流感病毒株的不同基因组区段的核苷酸序列。
12.如实施方式3-11中任一项的方法，其中所述多个载体中各质粒包含所有的核苷酸序列。
13.如实施方式3-12中任一项的方法，其中该方法不包括利用辅助病毒。
14.如实施方式3-13中任一项的方法，其中通过脂质介导的转染或电穿孔实施所述引入步骤。
15.如实施方式3-14中任一项的方法，其中所述温度介于30-35℃之间。
16.如实施方式3-15中任一项的方法，其中所述温度介于32-35℃之间。
17.如实施方式3-16中任一项的方法，还包括利用鸡蛋复制回收的流感病毒；
其中利用鸡蛋复制的流感病毒保留HA氨基酸残基位置196/197糖基化位点；和
其中所述流感病毒用鸡蛋复制到至少7.0log10PFU/ml的峰值滴度。
18.通过实施方式1-17中任一项的方法制备的B型流感病毒。
19.一种免疫原性组合物，其包含实施方式18的B型流感病毒。
20.一种疫苗，其包含实施方式19的B型流感病毒。
21.如实施方式20的疫苗，其适合于鼻内给药。
22.如实施方式3-17中任一项的方法，还包括：
杀伤所述回收的病毒。
23.如实施方式1或2所述的方法，还包括：
a)回收流感病毒；和
b)杀伤回收的病毒。
24.一种减毒的活B型流感病毒疫苗，其包含通过实施方式1-17中任一项的方法制备的病毒。
24.一种治疗对象的病毒感染的方法，包括：
给予该对象通过实施方式1-17中任一项的方法制备的病毒，其给予量足以产生抵御该病毒感染的免疫反应。
实施例
实施例1：构建pAD3000
修饰质粒pHW2000(Hoffmann等(2000)“从8个质粒产生A型流感病毒的DNA转染系统”(A DNA transfection system for generation of influenza Avirus from eight plasmids)Proc Natl Acad Sci USA 97：6108-6113)，用猿病毒40(SV40)来源的多聚腺苷酸信号序列替代牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸信号。
利用下列寡核苷酸，以Taq MasterMix(快而精公司(Qiagen))扩增SV40来源的序列，方向指定为5’到3’：polyA.1：AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT(SEQ ID NO：1)；polyA.2：TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA(SEQ ID NO：2)。
质粒pSV2His用作模板。按照厂家的使用说明书，用英杰公司(Invitrogen)的Topo TA克隆载体扩增与预期的175bp产物一致的片段并克隆入pcDNA3.1。用EcoRV和BstEII将含有SV40多聚腺苷酸信号的所需138bp片段从所得到的质粒上切下，琼脂糖凝胶电泳分离，然后利用常规技术(参见，例如Ausubel、Berger、Sambrook)克隆到pHW2000的独特PvuII和BstEII位点之间。所得质粒，pAD3000(图1)经测序发现含有方向正确的SV40多聚腺苷酸位点。pAD3000的核苷酸295-423分别对应于SV40毒株777(AF332562)的核苷酸2466-2594。
实施例2：制备MDV-B的8质粒系统
利用加利福尼亚州瓦伦西亚快而精公司的Rneasy试剂盒(RNeasy Kit，Qiagen，Valencia，CA)从受感染含胚鸡蛋的100μl尿囊液中提取流感B/AnnArbor/1/66(ca/Master Ann Arbor/1/66 P1 Aviron 10/2/97)的冷适应变体的病毒RNA，该病毒株是示例性的B型流感病毒主供体病毒株(MDV-B)，将该RNA洗入40μl H2O中。利用加利福尼亚州瓦伦西亚快而精公司的RT-PCR试剂盒进行基因组区段的RT-PCR，每次反应使用1μl提取的RNA。RT-反应在50℃进行50分钟，然后在94℃进行15分钟。PCR进行25轮：94℃进行1分钟，54℃进行1分钟，和72℃进行3分钟。利用含BsmBI位点的区段特异性引物扩增P-基因，从而产生两个片段(表1)。
表1.扩增流感ca B/Ann Arbor/1/66的8个vRNA的RT-PCR引物
Figure G2008800207207D00211
这些流感序列的互补序列以黑体显示。5’-端具有限制性核酸内切酶BsmBI(Bm)或BsaI(Ba)的识别序列。
克隆质粒
分离PCR片段，用BsmBI(或对于NP用BsaI)消化，插入上述pAD3000(pHW2000的衍生物，其能转录负有义vRNA和正mRNA)的BsmBI位点。2-4个所得质粒各自测序并根据对RT-PCR片段直接测序与MDV-B的共有序列比较。通过克隆质粒或者利用加利福尼亚州拉霍亚斯特拉塔基因公司的快速改变试剂盒(Quikchange kit)“修复”具有导致氨基酸与共有序列不同的核苷酸取代的质粒。得到的B/Ann Arbor/1/66质粒指定为pAB121-PB1、pAB122-PB2、pAB123-PA、pAB124-HA、pAB125-NP、pAB126-NA、pAB127-M和pAB128-NS。利用该双向转录系统，在胞内产生所有病毒RNA和蛋白质，从而产生感染性B型流感病毒(图2)。
应注意，与共有序列相比，pAB121-PB1和pAB124-HA具有2个，pAB128-NS具有1个沉默核苷酸取代(表2)。这些核苷酸改变不导致氨基酸改变，预计不会影响病毒生长和拯救。保留这些沉默取代从而有利于重组病毒的基因分型。
表2.表示B/ANN ARBOR/1/66(MDV-B)的8个区段的质粒组
Figure G2008800207207D00221
为构建在PA、NP和M1基因中具有核苷酸取代的质粒，质粒pAB123-PA、pAB125-NP、pAB127-M用作模板。利用加利福尼亚州拉霍亚斯特拉塔基因公司的快速改变试剂盒改变核苷酸。或者，利用含有所需突变的引物，通过PCR扩增两个片段，用BsmBI消化并采用三片段连接反应插入pAD3000-BsmBI。测序产生的质粒以确保cDNA不含不需要的突变。
利用罗丹明或d罗丹明染料-终止子循环测序简易反应试剂盒(Rhodamineor dRhodamine dye-terminator cycle sequencing ready reaction kit)与加利福尼亚州福斯特城PEAB公司(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc，Foster City，CA)的
Figure G2008800207207D00231
DNA聚合酶FS测定模板DNA的序列。通过电泳分离样品，用373型PE/ABI、373型Stretch或377型DNA测序仪分析。
在另一实验中，如以上MDV-B毒株所述，扩增流感B/Yamanshi/166/98的病毒RNA并克隆入pAD3000，例外之处是扩增进行25轮：94℃进行30秒，54℃进行30秒和72℃进行3分钟。利用相同引物扩增B/Yamanashi/166/98毒株区段，分别换用以下引物来扩增NP和NA区段：MDV-B 5′BsmBI-NP：TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG(SEQ ID NO：36)和MDV-B 3′BsmBI-NP：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTTAC(SEQ ID NO：37)以及Bm-NAb-1：TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA(SEQ ID NO：38)和Bm-NAb-1557R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT(SEQ ID NO：39)。B/Yamanashi/166/98质粒指定为pAB251-PB1、pAB252-PB2、pAB253-PA、pAB254-HA、pAB255-NP、pAB256-NA、pAB257-M和pAB258-NS。在PA中鉴定到有利于重组和重配B/Yamanashi/166/98病毒的基因分型的3处沉默核苷酸差异。
实施例3：制备感染性重组B型流感病毒和重配流感病毒
通过共同培养293T或COS-7细胞(具有高感染效率和polI活性的灵长类细胞)与MDCK细胞(允许流感病毒生长)来制备感染性重组B流感病毒。293T细胞维持在含5％FBS的Opti-MEM I-AB培养基中，COS-7细胞维持在含10％FBS的DMEM I-AB培养基中。MDCK细胞维持在加入了抗生素和抗真菌剂的1xMEM，10％FBS中。用病毒基因组载体转染前，先用5mlPBS或不含FBS的培养基洗涤细胞一次。将10ml胰蛋白酶-EDTA加到75cm2培养瓶的汇合细胞上(MDCK细胞温育20-45分钟，293T细胞温育1分钟)。离心细胞，重悬在10ml OptiMEM I-AB中。然后每种细胞取1ml稀释到18ml OptiMEM I-AB中，混匀。随后将细胞等份加入6孔板，每孔3ml。6-24小时后，每种质粒取1μg加到含OptiMEM I-AB的1.5ml离心管(Eppendorf tube)中(xμl质粒+xμl OptiMEM I-AB+xμl TransIT-LT1＝200μl)；每微克质粒DNA用2μl TransIT-LT1。混合物在室温下温育45分钟。然后加入800μl OptiMEM I-AB。除去细胞培养基，将转染混合物加入细胞(t＝0)，33℃温育6-15小时。从细胞中缓慢除去转染混合物，加入1mlOptiMEM I-AB，细胞在33℃温育24小时。转染后48小时，将1ml含有1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的OptiMEM I-AB加入细胞。转染后96小时，将1ml含有1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的OptiMEM I-AB加入细胞。
转染后4天和7天之间，取出1ml细胞培养上清液，通过HA或噬斑试验监测。简言之，将1ml上清液等份加入离心管，5000rpm离心5分钟。将900μl上清液转移至新管中，进行连续稀释，以500μl/孔加入MDCK细胞(例如，在12孔板中)。上清液与细胞温育1小时后除去并替换以含有1μg/ml TPCK-胰蛋白酶的感染培养基(1xMEM)。然后进行HA试验或噬斑试验。例如，对于噬斑试验，用在33℃与0.8％琼脂糖叠加物温育3天的MDCK细胞滴定上清液。对于感染鸡蛋，转染后6或7周收集转染细胞的上清液，33℃，将Opti-MEM I配制的100μl病毒稀释液注射入11日龄的含胚鸡蛋。接种3天后通过MDCK细胞的TCID50试验测定滴度。
为产生MDV-B，用1μg的各质粒转染共同培养的293T-MDCK或COS-7-MDCK细胞。在转染后5-7天检测时，共同培养的MDCK细胞显示细胞病变效应(CPF)，表明从克隆的cDNA产生了感染性MDV-B病毒。在用7个质粒转染的细胞中未观察到CPE(表3)。为测定DNA转染体系产生病毒的效率，转染7天后用MDCK细胞滴定细胞的上清液，通过噬斑试验测定病毒滴度。共同培养293T-MDCK的上清液的病毒滴度是5.0x106pfu/ml，在COS7-MDCK细胞中是7.6x106pfu/ml。
表3.从8个质粒产生感染性B型流感病毒
Figure G2008800207207D00241
Figure G2008800207207D00251
用7或8个质粒瞬时转染共同培养的293T-MDCK(1，2)或共同培养的COS7-MDCK细胞(3，4)。转染7天后监测共同培养的MDCK细胞中的细胞病变效应(CPE)。转染7天后，用MDCK滴定转染细胞的上清液。pfu/ml的数据表示多次(例如，3次或4次)转染实验的平均值。
利用B/Yamanashi/166/98质粒载体在转染实验中获得可比较的结果。这些结果显示转染体系能从8个质粒可再现地从头产生B型流感病毒。
重组B型流感病毒的基因分型
用MDCK细胞作后续传代后，对感染细胞的上清液采用RT-PCR来证实所产生病毒的真实性。用所有8个区段的区段特异性引物(表1)进行RT-PCR。如图3A所示，所有区段均产生PCR产物。直接测序PB1、HA和NS区段的PCR产物揭示分析的4个核苷酸与质粒pAB121-PB1、pAB124-HA和pAB128-NS中发现的相同。这些结果证实所产生的病毒是由所设计的质粒产生的，并排除了(除了阴性对照外)任何可能的亲代病毒的实验室污染(图3B)。
类似地，用B/Yamanashi/166/98质粒载体转染后，回收病毒，扩增包含PA区段的核苷酸1280-1290的区域。测序证实回收的病毒对应于质粒来源的重组B/Yamanashi/166/98(图3C和D)。
rMDV-B的表型分型
MDV-B病毒显示两种特征性表型：温度敏感性(ts)和冷适应性(ca)。与33℃相比37℃时病毒滴度差异为2log(或更高)被定义为ts，与33℃相比25℃时病毒滴度差异小于2log被定义为ca。用亲代病毒MDV-B和质粒来源的转染病毒感染原代鸡肾(PCK)细胞以测定三种温度下的病毒生长。
用6孔板中汇合的MDCK细胞(ECACC)进行噬斑试验。病毒稀释液在33℃温育30-60分钟。在细胞上覆盖0.8％琼脂糖叠加物。在33℃或37℃温育感染的细胞。感染3天后，用0.1％结晶紫溶液染色细胞并测定噬斑数目。
在25、33和37℃，通过病毒样品的TCID50滴定进行ca-ts表型试验。该试验形式通过不同温度下(25℃、33℃和37℃)，在96-孔细胞培养板中检测流感病毒对原代鸡肾细胞单层的细胞病变效应(CPE)来检测TCID50滴度。该试验不依赖于随温度和病毒株而变的噬斑形态；而是只依赖于流感病毒复制和导致CPE的能力。将通过胰蛋白酶处理原代组织制备的原代鸡肾(PCK)细胞悬液悬浮在含有5％FCS的MEM(Earl)培养基中。
将PCK细胞接种在96孔细胞培养板中培养48小时，以制备汇合度＞90％的单层。48小时后，用含5mM L-谷氨酰胺、抗生素、非必需氨基酸的无血清MEM培养基(称为表型分析培养基(PAM))洗涤PCK细胞单层1小时。在含PAM的96孔板制备病毒样品的10倍连续稀释液。然后将稀释的病毒样品涂布到96孔板中经洗涤的PCK单层上。在病毒样品的每个稀释度，用稀释的病毒感染六复孔。每份样品包括六复孔的未感染细胞作为细胞对照。各病毒样品取2-4复孔滴定。各试验包括在25℃、33℃和37℃预先测定滴度的表型对照病毒。为测定病毒样品的ts表型，33℃和37℃，在5％CO2细胞培养孵育箱中温育诸平板6天。对于ca-表型表征，25℃温育诸平板10天。通过Karber方法计算病毒滴度，用Log10TCID50滴度平均值(n＝4)/ml±标准差表示。图1-3中所示的病毒滴度的标准差在0.1到0.3之间。33℃和37℃的病毒滴度差异用于测定ts表型，25℃和33℃的病毒滴度差异用于测定ca表型。
源自质粒的MDV-B(recMDV-B)病毒如预期的那样在细胞培养物中表现出两种特征性表型，ca和ts。ca表型在25℃有效复制，用PCK细胞检验时病毒例如在25℃和33℃之间的滴度差异小于或等于2log10。亲代MDV-B和recMDV-B均表现出ca；25℃和33℃之间的差异分别为0.3和0.4log10(表4)。还通过观察两种不同温度下PCK细胞的滴度检测了ts表型；然而，对于该表型，37℃的滴度应比33℃的滴度小2log10或更多。对于亲代MDV-B和recMDV-B，33℃和37℃之间的差异分别是3.4和3.7log10(表4)。因此，源自重组质粒的MDV-B病毒表现出ca和ts两种表型。
33℃，重组病毒的滴度为7.0log10TCID50/ml，37℃时的为3.3TCID50/ml，25℃时为8.8log10TCID50/ml(表4)。因此，用8个流感MDV-B基因组区段质粒转染得到的重组病毒同时具有ca和ts表型。
表4.从质粒产生的MDV-B和rMDV-B的表型分析
Figure G2008800207207D00261
Figure G2008800207207D00271
用亲代病毒MDV-B和质粒来源的重组病毒(recMDV-B)感染原代鸡肾细胞。测定3种不同温度下的病毒滴度。
实施例7：重配B/Yamanashi/166/98病毒的产生
扩增代表B型流感病毒主要谱系的几种不同毒株的HA和NA区段并克隆入pAD3000，基本上如上所述。优化引物以同时RT-PCR扩增HA和NA区段。比较代表区段4(HA)和区段6(NB/NA)的非编码区的vRNA末端区域显示B型流感病毒的HA和NA基因之间5’末端的20核苷酸和3’末端的15个核苷酸是一致的。合成RT-PCR所用的引物对(斜体序列是B型流感病毒特异性的)：Bm-NAb-1：TAT TCG TCT CAG GG
Figure G2008800207207D00272
(SEQ IDNO：38)；Bm-NAb-1557R：ATA TCG TCT CGT ATT
Figure G2008800207207D00273
Figure G2008800207207D00274
(SEQ ID NO：39)，并用于同时扩增各种B型流感病毒株的HA和NA基因(图6)。分离B/Victoria/504/2000、B/Hawaii/10/2001和B/Hong Kong/330/2001的HA和NA PCR区段，用BsmBI消化，插入pAD3000。这些结果表明这些引物适用于有效扩增含有几种不同野生型病毒来源的B型流感病毒HA和NA基因的质粒，所述野生型病毒代表了B型流感病毒的主要谱系。RT-PCR产物用于测序和/或克隆入表达质粒。
为了证明利用B/Yamanashi/166/98(一种B/Yamagata/16/88样病毒)能有效表达各种B型流感病毒谱系来源的抗原，制备含B/Yamanashi/166/98的PB1、PB2、PA、NP、M、NS和代表Victoria及Yamagata谱系的HA和NA的重配病毒(6+2重配病毒)。按照上述方法，用代表B/Yamanashi/166/98的6个质粒和含有B/Victoria/2/87谱系的两个病毒株(B/Hong Kong/330/2001和B/Hawaii/10/2001)，以及B/Yamagata/16/88谱系的一个病毒株(B/Victoria/504/2000)的HA和NA区段的cDNA的质粒共转染瞬时共培养的COS7-MDCK细胞。转染后6到7天，用新鲜MDCK细胞滴定上清液。所有6+2重配病毒的滴度在4-9×106pfu/ml之间(表5)。这些数据证明B/Yamanashi/166/98的6个内部基因能与两种B型流感病谱系的HA和NA基因区段有效形成感染性病毒。
转染后6或7天，滴定共培养COS7-MDCK细胞的上清液，利用MDCK细胞通过噬斑试验测定病毒滴度。
表5：用于产生B/Yamanashi/166/98和6+2重配病毒的质粒组
野生型B/Yamanashi/166/98在鸡蛋内复制可得到较高滴度。进行实验来测定这种特性是否是该病毒的6个“内部”基因的固有表型。为了评价这种特性，将在鸡蛋内只能中等程度复制的野生型B/Victoria/504/2000的产量与表达B/Victoria/504/2000HA和NA的6+2重配病毒的产量作比较。除了野生型和重组的B/Yamanashi/166/98外，这些病毒各自以100或1000pfu接种到3或4个含胚鸡蛋内。
感染后3天，从鸡蛋收集尿囊液，用MDCK细胞测定TCID50滴度。6+2重配病毒在尿囊液中的产量类似于野生型和重组B/Yamanashi/166/98病毒株(图7)。B/Victoria/504/2000和6+2重组病毒的滴度差异约为1.6log10TCID50(0.7-2.5log10TCID50/ml，95％CI)。通过3个不同的实验证明B/Victoria/504/2000和6+2重组病毒之间有差异(P＜0.001)。这些结果证明B/Yamanashi/166/98的鸡蛋生长特性可赋予在鸡蛋内很难复制的病毒株正常表达的HA和NA。
实施例8：ca B/Ann Arbor//1/66减毒的分子基础
MDV-B病毒(ca B/Ann Arbor/1/66)在人体内是减毒的，在雪貂中显示减毒表型，在细胞培养物中显示冷适应表型和温度敏感表型。利用BLAST搜索算法比较MDV-B内部基因的推导氨基酸序列与Los Alamos流感病毒数据库(万维网址：flu.lanl.gov)的序列。鉴定出任何其他病毒株中不存在的8个MDV-B独有的氨基酸(表6)。编码PB1、BM2、NS1和NS2的基因组区段显示没有独特取代的残基。PA和M1蛋白各有2个，NP蛋白有4个独特取代的氨基酸(表6)。在PB2的位置630处发现一个取代的氨基酸(另一病毒株B/Harbin/7/94(AF170572)在630位置处也有精氨酸残基)。
这些结果提示基因区段PB2、PA、NP和M1可能参与MDV-B的减毒表型。采用与上述MDV-A相似的方式，可利用8质粒系统产生重组和重配病毒(单和/或双，即，7∶1；6∶2重配病毒)，以不依赖于辅助病毒的方式将相关的质粒按照上述MDV-A相似的方式简单地共转染入培养的细胞。例如，可联用B/Lee/40的6个内部基因与MDV-B来源的HA和NA区段来产生6+2重配病毒。
表6：B/Ann Arbor/1/66的独特取代的氨基酸
Figure G2008800207207D00291
8种ca B/Ann Arbor蛋白的推算出的氨基酸序列用于BLAST检索。显示了MDV-B和比对序列之间不相同的氨基酸位置。密码子中有下划线的核苷酸代表取代位置。
为了确定这8个独特的氨基酸差异是否影响特征性MDV-B表型，构建一重组病毒，其中所有8个核苷酸位置编码反映野生型流感病毒遗传互补情况的氨基酸。构建了一组质粒，其中PA、NP和M1基因的8个残基通过定点诱变加以改变以反映野生型氨基酸(如表6所示)。具有所有8个改变的重组病毒称为rec53-MDV-B，其是通过构建质粒共转染共培养的COS7-MDCK细胞而获得。共培养MDCK细胞并在33℃生长确保转染后6-7天的上清液中含有高病毒滴度。滴定转染细胞的上清液，通过噬斑试验利用MDCK细胞和PCK细胞测定33℃和37℃的滴度。
如图8所示，在两个不同的独立实验中，recMDV-B在MDCK细胞和PCK细胞内都能表达ts-表型。设计的三基因重配病毒rec53-MDV-B含有表现出非-ts-表型的所有8个氨基酸改变，33℃和37℃，PCK细胞内的滴度差异只有0.7log10。该滴度低于ts定义所要求的2log10的差异，也显著低于recMDV-B所观察到的约3log10的差异。这些结果说明PA、NP和M1蛋白内的8个氨基酸改变足以产生具有同源和异源糖蛋白的非-ts、野生型样病毒。
随后测定了各基因区段对ts表型的作用。通过DNA共转染技术产生了含有PA、NP或M基因区段与野生型氨基酸互补(区段)的质粒来源的重组病毒。37℃，所有单基因重组病毒显示在MDCK细胞和PCK细胞内生长受限制(图9)，提示单个基因区段的改变不能逆转ts表型。此外，携带NP和M或PA和M基因区段的重组病毒也保留了ts-表型。相反，含有PA和NP基因区段的重组病毒在37℃和33℃时的滴度差异为2.0log10或更低，与rec53-MDV-B相似。这些结果说明NP和PA基因是影响ts-表型的主要基因。
为测定NP蛋白的所有4个氨基酸和PA蛋白的2个氨基酸是否影响非-ts表型，制备了具有改变的NP和PA基因改变的三基因和双基因重组病毒(图10)。NP蛋白中的两个氨基酸取代，A114→V114和H410→P410产生非-ts表型。在核蛋白中具有单取代，H410→P410的病毒在MDCK和PCK细胞中显示非-ts表型。另一方面，单取代A55→T55显示ts-表型，与位置509处的单取代一样。这些结果说明NP的氨基酸残基V114和P410参与37℃的有效生长(图11A)。采用类型的方案剖析PA基因中两个氨基酸的作用。构建一组重组病毒，各包含具有4个野生型共有氨基酸的NP基因区段和只有两个共有野生型氨基酸之一的PA基因。H497→Y497的取代维持ts(图11B)，证明该基因座对表型的表达无甚影响。相反，用V431取代M431导致ts表型逆转。这些结果显示NP中的氨基酸A114和H410以及PA中的M431是MDV-B的温度敏感性的主要决定因素。
根据以前的证据，ts-表型和减毒表型高度相关。现已证实在受感染雪貂的肺组织内检测不到ca B/Ann Arbor/1/66病毒，而鼻内感染后在肺组织内可检测到非减毒的B型流感病毒。为确定ts和att表型是否基于相同的突变，进行了以下研究。转染后获得的重组病毒在含胚鸡蛋内传代以产生病毒原种。9周龄的雪貂鼻内接种病毒，每个鼻孔0.5ml，滴度为5.5、6.0或7.0log10pfu/ml。感染3天后处死雪貂，如以前所述检测它们的肺和鼻甲。
雪貂(每组4只)鼻内感染recMDV-B或rec53-MDV-B。感染病毒后3天收集鼻甲和肺组织，检测病毒的存在。用7.0log10pfu rec MDV-B感染的雪貂肺组织内检测不到病毒。用7.0log10 pfu rec53-MDV-B感染的4只动物中有3只可在肺组织内检测到病毒(该组中的一只动物的原因不清)。感染低剂量(5.5log10 pfu)rec53-MDV-B的4只雪貂中有2只在肺组织内分离出了病毒。因此，PA、NP和M1蛋白的8个独特氨基酸的改变足以使att表型转变成非-att表型。
由于细胞培养的数据显示PA和NP对ts-表型起主要作用，因此在第二个实验中用6log pfu的rec53-MDV-B(PA、NP、M)、rec62-MDV-B(PA)、NPrec71-MDV-B(NP)感染雪貂。用rec53-MDV-B感染的4只动物中有2只在肺内检测到病毒。感染单和双重配病毒的雪貂在肺组织内未检测到病毒。因此，除了PA和NP蛋白的氨基酸外，M1蛋白对于att表型也很重要。具有野生型PA和NP的病毒在雪貂肺内不能复制，说明参与减毒的突变亚组也参与ts表型。
因此，B/Ann Arbor/1/66的ts和att表型最多由3个基因决定。将PA、NP和M1蛋白的8个氨基酸转变成野生型残基可使重组病毒在37℃具有复制能力。同样，含有MDV-B的6个内部基因和B/Hong Kong/330/01的HA和NA区段的6+2重组病毒显示ts-表型，而三基因重组病毒是非-ts的。
我们利用MDV-B骨架的结果表明6个氨基酸足以将ts/att表型转变成非-ta/非-att表型。因此，我们感兴趣的是确定引入那六个“减毒”残基是否能将这些生物学特性传递给异源野生型、非减毒B型流感病毒，例如B/Yamanashi/166/98。
制备了重组重配B/Yamanashi/166/98(recYam)(7)和重组病毒(rec6-Yam)：含6个氨基酸改变PA(V431→M431、H497→Y497)，NP(V114→A114、P410→H410)和M1(H159→Q159、M183→V183)。与33℃相比RecYam在37℃的滴度降低0.17log10，而rec6Yam明显是ts的，37℃和33℃间病毒滴度的差异是4.6log10。病毒如典型野生型B型流感病毒所预计的那样从感染recYam的雪貂有效回收。当将rec6Yam接种入雪貂时，在肺组织中未检测到病毒(表7)。因此，转移MDV-B的ts/att基因座足以将ts-和att-表型传递给不同的病毒(divergent virus)。
表7：在雪貂中的减毒研究
  重组病毒   野生型组分a   Ts-表型   雪貂   剂量[log10pfu]   鼻甲b[log10pfu/g]   肺组织[log10EID50/g]c
  rMDV-B   无   ts   4   6.0   4.01   ＜1.5
  rec53-B   NP，PA，M   非-ts   4   6.0   4.65   3.81
  rec62-B   NP，PA   非-ts   4   6.0   4.69   ＜1.5
  rec71NP-B   NP   ts   4   6.0   4.13   ＜1.5
  rec71M-B   M   ts   4   6.0   4.17   ＜1.5
  RecYam   非-ts   4   6.0   4.92   3.31
  rec6Yam   ts   4   6.0   4.02   ＜1.5
a利用具有不同于野生型的氨基酸的含MDV-B骨架的重组病毒鼻内感染雪貂。RecYam是重组B/Yamanashi/166/98，Rec6Yam表示在NP、PA和M1中具有6个“MDV-B-减毒”氨基酸改变、含有B/Yamanashi骨架的病毒。
b感染后3天，测定鼻甲和肺组织的病毒滴度，显示了4只受感染雪貂的平均滴度。
c＜1.5表明未检测到病毒。
因此，具有一个或多个这些氨基酸取代的B型流感病毒的人工改造变体表现出ts和att表型，其适用于例如作为主供体病毒株来生产减毒活流感病毒疫苗。
实施例9：测定控制B/ANN ARBOR/1/66流感病毒的冷适应表型的基因座
冷适应的(ca)B/Ann Arbor/1/66是减毒活B型流感病毒
Figure G2008800207207D00321
疫苗的主供体病毒(MDV-B)。将携带源自ca B/Ann Arbor/1/66的6个内部基因和流行野生型毒株的HA及NA表面糖蛋白的6∶2B型流感病毒疫苗表征为冷适应(ca)、温度敏感性(ts)和减毒(att)表型。序列分析显示MDV-B在PB2、PA、NP和M1蛋白中含有野生型B型流感病毒株中不存在的9个氨基酸。我们确定PA(M431V)和NP(A114V，H410P)中的3个氨基酸决定ts表型，除了这3个ts基因座外，M1(Q159H，V183M)中的两个氨基酸赋予att表型。
为理解ca表型的分子基础，采用基于质粒的逆转遗传体系评估这9个MDV-B特异性氨基酸对ca表型的作用。25℃和33℃下重组MDV-B在鸡胚肾(CEK)细胞中有效复制。相反，含有9个野生型氨基酸的重组野生型B/AnnArbor/1/66在25℃下不能有效复制。确定总共有5个野生型氨基酸是完全逆转MDV-B ca表型所需的：一个在PB2中(R630S)、一个在PA中(M431V)、3个在NP中(A114V、H410P、T509A)。此外，用野生型氨基酸替代MDV-B或6∶2疫苗毒株的M1蛋白中的两个氨基酸(Q159H，V183M)显著增强病毒在33℃(但不是25℃)在CEK细胞中的复制；V183M改变对该变化影响较大。
实施例10：通过Vero细胞的电穿孔从8个质粒拯救流感病毒
还可采用电穿孔从Vero细胞拯救重组流感病毒。这些方法适合于产生A型流感病毒和B型流感病毒株，还能从无血清条件下生长的Vero细胞中回收，例如冷适应的、温度敏感性、减毒病毒，从而有利于制备适合在例如鼻内疫苗制剂中给予的减毒活疫苗。除了其广泛适用于各种病毒株外，电穿孔技术除了细胞底物的生长培养基外无需额外的试剂，因此有害污染物的可能性较低。具体地说，该方法利用适应在无血清条件下生长的Vero细胞，例如无病原体并适于疫苗生产的Vero细胞分离物而有效产生重组和重配病毒。该特征使电穿孔技术成为将DNA导入细胞底物内的适宜商业方法。
将电穿孔技术与将DNA引入Vero细胞的各种方法，包括利用大量脂质试剂转染、磷酸钙沉淀和细胞微注射法进行比较。虽然利用脂质试剂拯救A型流感病毒获得一定成功，但只有电穿孔显示能从Vero细胞中拯救B型流感病毒和A型流感病毒。
电穿孔前的一天，分离90-100％汇合的Vero细胞，以每个T225培养瓶9x106个细胞的密度接种在补加了青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％FBS的MEM中(MEM，10％FBS)。第二天，胰蛋白酶处理细胞并重悬到每个T225培养瓶50ml的磷酸缓冲盐水(PBS)中。然后使细胞沉淀并重悬到每个T225培养瓶0.5ml的OptiMEM I中。可任选利用定制的不含人或动物来源组分的OptiMEM培养基。测定细胞密度，例如用血球计数器计数1∶40稀释液后，将5x106个细胞加入0.4cm电穿孔杯，终体积为400μl OptiMEM I。然后将20μg DNA加入含细胞的杯中，所述DNA由掺入MDV-A或MDV-B基因组的8个质粒的等摩尔混合物构成，其体积不超过25μl。通过扣击轻柔混合细胞，用连接有增强型电容增量器的BR基因脉冲仪II进行电穿孔，300伏、950微法。时间常数为28-33毫秒。
通过敲打轻柔混合杯的内含物，电穿孔后约1-2分钟用1ml移液管加入0.7ml含10％FBS的MEM。然后用移液管上下吹打数次再次轻柔混合细胞，随后分到6孔平皿的2个孔内，每孔含2ml MEM、10％FBS。然后用1ml MEM，10％FBS洗涤小杯，分到两孔中，终体积约为3.5ml/孔。
在其它实验中，如上所述对适于无血清生长条件，例如加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)的OptiPro(SFM)的Vero细胞进行电穿孔，除了在OptiMEM I中电穿孔后，用OptiPro(SFM)稀释细胞，随后培养细胞以供拯救病毒。
然后将经电穿孔的细胞在适于复制和回收所引入病毒的条件，即，对于冷适应主供体病毒株在33℃下生长。第二天(例如，电穿孔后约19小时)，除去培养基，用OptiMEM I或OptiPro(SFM)洗涤细胞，每孔3ml。将含青霉素/链霉素的OptiMEM I或OptiPro(SFM)加入各孔，每孔1ml，每日通过替换培养基来收集上清液。将上清液于-80℃保存在SPG中。通常在电穿孔后2-3天观察到峰值病毒产量。
表8：利用不同细胞类型、采用不同转染方法的8质粒拯救MDV病毒株的结果
Figure G2008800207207D00341
实施例11：B型流感病毒在鸡蛋中生长导致HA 196/197糖基化位点丧失
大多数B型流感病毒临床分离物含有潜在的HA N-连接的糖基化位点。对于B/Yamagata毒株，该HA N-连接糖基化位点存在于氨基酸残基196-199附近，对于B/Victoria毒株存在于氨基酸残基197-199附近。最近流行的B/Victoria毒株，例如B/Malaysia/2506/04和B/Ohio/1/05，以及最近流行的B/Yamagata毒株，例如B/Florida/7/04含有该潜在的HA N-连接糖基化位点。
为确定鸡蛋传代后这些毒株的HA糖基化位点是否保留，在鸡蛋中培养各毒株，进行核苷酸测序以确定所编码的HA多肽的氨基酸序列。用于该项研究的所述病毒获自佐治亚州亚特兰大的疾病控制和预防中心(CDC)。利用该病毒接种获自北康涅狄格州富兰克林查尔斯河公司(Charles River SPAFAS，Franklin，CT，North)的含胚鸡蛋，其在病毒接种前已受精10-11天。接种的鸡蛋在33℃温育。通过RT-PCR扩增接种鸡蛋中病毒的HA病毒RNA，然后测序。
鸡蛋传代后，B型流感病毒B/Ohio/1/05、B/Malaysia/2506/04和B/Florida/7/04的HA多肽的氨基酸序列在N-连接的糖基化位点处均发生改变。B/Ohio/1/05的糖基化位点处的序列从NET改变成SET。B/Malaysia/2506/04的糖基化位点处的序列从NET改变成NEA或SET。B/Florida/7/04的糖基化位点处的序列从NKT改变成NKP、DKT或IKT。参见下表9。
表9：在鸡蛋中传代前后的流感B HA 196/197糖基化位点序列
Figure G2008800207207D00351
*CDC的M.Shaw博士提供临床分离物的HA序列.
aX表示混合序列。
检测了B型流感病毒的各种其它毒株的HA糖基化位点处的氨基酸序列。参见图12，其提供了用鸡蛋传代后6种B/Victoria毒株和8种B/Yamagata毒株的部分HA氨基酸序列。潜在的N-连接糖基化位点(N-X-T/S)在图中以下划线标出。应该注意，鸡蛋传代后，所检测的14种B型流感病毒株无一保留它们潜在的N-X-T/S N-连接糖基化位点。
实施例12：HA 196/197糖基化位点丧失降低了B型流感病毒的抗原性
随后检测了HA 196-197糖基化位点对B型流感病毒株B/Ohio/1/05、B/Malaysia/2506/04和B/Florida/7/04的抗原性的影响。为比较糖基化与非糖基化病毒的抗原性，采用反向遗传学技术制备对应于B型流感病毒株B/Ohio/1/05、B/Malaysia/2506/04和B/Florida/7/04中每一种的一对病毒(见实施例3)。每对的两个成员是相同的，除了第一成员含有的HA多肽具有野生型氨基酸序列，即，含有从CDC获得的毒株中存在的N-连接糖基化位点的HA氨基酸序列，第二成员含有缺乏N-连接糖基化位点的HA多肽，即，从鸡蛋传代后病毒获得的HA氨基酸序列。
反向遗传学技术中使用的6种质粒提供了对应于ca B/Ann Arbor/1/66(MDV-B)的内部基因组区段的核苷酸序列。第七质粒提供对应于编码各野生型病毒的野生型NA多肽的基因组区段的核苷酸序列，例如利用B/Ohio/1/05毒株的野生型NA多核苷酸序列制备B/Ohio/1/05病毒对的各成员。第八质粒提供对应于编码HA多肽的基因组区段的核苷酸序列。所述HA多肽可以是野生型的或鸡蛋传代的HA，取决于该流感病毒是该病毒对的第一成员还是第二成员。
通过RT-PCR扩增野生型病毒的NA或HA vRNA并将扩增的cDNA克隆在pAD3000的两个BsmBI位点之间，从而获得野生型病毒的NA和HA多核苷酸序列。利用加利福尼亚州拉霍亚斯特拉塔基因公司的
Figure G2008800207207D00361
定点诱变试剂盒定点诱变含野生型HA区段的质粒来制备含有对应于编码鸡蛋传代HA多肽的基因组区段的核苷酸序列的质粒。
将质粒转染入共培养的MDCK和293细胞。所有拯救的病毒在MDCK细胞中有效复制，滴度为6-7log10PFU/mL。转染后7天，收集转染细胞的上清液，通过噬斑试验滴定。回收病毒的序列分析证实保留了野生型或鸡蛋传代的HA氨基酸序列，与在转染期间用于制备病毒的HA质粒一致。
利用感染后雪貂血清，通过HAI试验检测各病毒对的抗原性。鼻内接种6-7log10PFU病毒后21天，从雪貂收集血清。通过血凝素-抑制(HAI)试验评估雪貂血清中抵御各种病毒的抗体水平。通过在V形底96-孔微量滴定板中加入25μL连续稀释的血清样品与4HA单位的流感病毒(25μL体积)进行HAI试验。温育30分钟后，加入50μl 0.5％火鸡红细胞来检测血细胞凝集作用。HAI滴度表示为抑制病毒血小板凝集作用的最高血清稀释度。表10提供了成对野生型(HA糖基化+)/鸡蛋-传代(HA糖基化-)病毒的抗原性。
表10：雪貂中HA 196/197糖基化位点变体的抗原性
Figure G2008800207207D00371
用HA糖基化病毒产生的血清对HA糖基化病毒的HAI滴度高于所配对的HA非糖基化病毒，用HA非糖基化病毒产生的血清对所配对的HA非糖基化病毒的HAI滴度较高。各对HA糖基化/HA非糖基化病毒在HAI试验中的抗原性差异为1.5-4.5倍不等。该差异表明196/197糖基化位点影响病毒抗原性。
实施例13：具有HA 196/197糖基化位点的B型流感病毒不能在鸡蛋中 复制
为确定实施例12的成对流感病毒株的各成员是否能在鸡蛋中复制，病毒以102PFU/鸡蛋或104-105PFU/鸡蛋接种含胚鸡蛋，33℃温育3天。然后通过噬斑试验测定MDCK细胞中的病毒峰值滴度。成对病毒在鸡蛋中的复制情况(病毒滴度)和各病毒在HA氨基酸残基196-199处的序列见表11。
表11.成对HA 196/197糖基化变体在鸡蛋中的复制
Figure G2008800207207D00381
a，b用所示6∶2重配病毒以102PFU/鸡蛋(a)或104-105PFU/鸡蛋(b)接种鸡蛋。
c测定从鸡蛋中回收病毒的HA序列，氨基酸序列改变以下划线标出。
dND：未测定。
对于各病毒对，缺乏糖基化位点的病毒成员在鸡蛋中生长良好，生长至滴度高于8.0log10PFU/mL。然而，具有糖基化位点(NXT)的病毒成员在接种102PFU病毒的鸡蛋中复制不佳。参见表11，其表明HA糖基化病毒B/Ohio/1/05、B/Malaysia/2506/04和B/Florida/7/04分别只生长至病毒滴度为2.1log10PFU/mL、1.7log10PFU/mL和3.0log10PFU/mL。当用更大量的病毒(104-105PFU/鸡蛋)接种鸡蛋时，可以检测到HA糖基化病毒成员的复制。这些复制病毒的序列分析显示在196/197糖基化位点处引入了氨基酸取代。参见表11，其表明B/Ohio/1/05的野生型糖基化序列从NET改变至SET，B/Malaysia/2506/04的野生型糖基化序列从NET改变至SET或NEN，B/Florida/7/04的野生型糖基化序列从NKT改变至NKI或者脯氨酸取代紧邻NXT糖基化序列C-末端的谷氨酰胺。以前的研究(Bause，Biochem J.209(1983)：331-336；Gavel和Von Heijne，Protein Eng.3(1990)：433-442)显示毗邻HA NXT糖基化位点C-末端的脯氨酸阻止N-连接的糖基化。因此，看来HA 196/197处缺乏糖基化是B型流感病毒在鸡蛋中良好复制所需。
实施例14：鉴定能在鸡蛋中复制的HA糖基化 + B型流感病毒株
为确定含有196/197糖基化位点的任何B型流感病毒株是否能在鸡蛋中复制，用各种野生型B型流感病毒株接种鸡蛋。然后测定复制病毒的HA序列。大多数能在鸡蛋中复制的B型流感病毒在残基197-199(或196-198)处不含NXT糖基化位点。即使鸡蛋传代的病毒含有NXT糖基化位点，它们也正在丧失过程中；NXT序列是HA蛋白的残基197-199/196-198处的序列群之一。
两种病毒株-B/Jilin/20/03(B/JL)和B/Jiangsu/10/03(B/JS)-鉴定为在鸡蛋传代后具有NXT糖基化序列，NKT。B/JL在紧邻196-198糖基化位点C-末端的位置199处具有脯氨酸。如上所述，紧邻糖基化位点残基C-末端的脯氨酸可能干扰并阻止196/197糖基化。为更仔细检测B/JL和B/JS在鸡蛋中的复制情况，通过实施例12所述的反向遗传学技术制备B/JL、B/JS各自的以及相关B型流感病毒株B/Shanghai/361/02(B/SH)的缺乏和含有NXT糖基化位点序列的成对B型流感病毒株。然后测定这些成对病毒在MDCK细胞和鸡蛋中的复制情况。参见表12。
表12.B/Jiangsu/10/03在鸡蛋中保留了196-197糖基化位点
a，b用所示病毒以0.004的moi感染MDCK细胞，用在MDCK细胞中扩增的所示6∶2重配病毒以102PFU/鸡蛋(a)或104-105PFU/鸡蛋(b)接种鸡蛋并在33℃温育3天，所述病毒具有(G+)或不具有(G-)196/197HA糖基化位点。通过噬斑试验测定MDCK细胞内的病毒峰值滴度。
c测定从鸡蛋中回收病毒的HA序列，氨基酸序列改变以下划线标出。
所有3对病毒在MDCK细胞中复制良好，滴度范围是6.4-7.5log10PFU/mL。然而，不是所有病毒在鸡蛋中良好复制。以102log10PFU接种鸡蛋的HA 196/197糖基化(糖基化序列NKTQ)B/SH或B/JL病毒复制不佳。将B/SH或B/JL HA的接种剂量提高至104-105log10PFU则可检测到病毒复制。测序这些复制病毒显示糖基化位点丧失(B/SH中从NKT改变为SKT或DKT，B/JL中从NKT改变为NKS)。与B/SH和B/JL病毒不同，有或没有糖基化位点的B/JS病毒均能在鸡蛋中良好复制，滴度分别为7.3和8.4log10PFU。
HA特异性抗体的蛋白质印迹证实在MDCK细胞和鸡蛋中生长的各病毒的糖基化状态。通过将MDCK细胞培养上清液或尿囊液的病毒与2x蛋白质裂解缓冲液(英杰公司)混合，用10％SDS-PAGE凝胶电泳来进行蛋白质印迹。将在凝胶上电泳的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，利用鸡抗B型流感病毒株抗血清进行蛋白质印迹。与HRP偶联的抗-鸡抗体温育后，利用GHBS公司(GE Healthcare Bio-Sciences)的化学发光检测试剂盒检测蛋白质-抗体复合物。
蛋白质印迹分析显示当利用MDCK细胞复制时，HA糖基化+病毒保留其糖基化位点，因此在凝胶上迁移慢于所配对的HA糖基化-病毒。参见，例如图13a的泳道1和2，其显示与糖基化+HA(泳道1)病毒的HA抗血清交叉反应的条带迁移慢于具有糖基化-HA病毒的泳道条带(泳道2)。B/SH(图13a，泳道3和4)和B/JL(图13a，泳道5和6)病毒获得相似的结果。
当用鸡蛋复制时，只有一种病毒，即B/JS病毒保留了迁移模式，其中糖基化+HA病毒的条带(图13b，泳道3)迁移慢于糖基化-HA病毒的条带(图13b，泳道4)。该模式提示B/JS病毒是所测试的唯一能用鸡蛋复制并保留HA糖基化位点的病毒。
实施例15：HA氨基酸残基位置141处的精氨酸稳定196-197糖基化位 点
表12显示，虽然B/JS和B/JL流感病毒株在氨基酸残基196-199处具有氨基酸序列NKTQ，但只有B/JS能在鸡蛋中良好复制并保留NKTQ糖基化位点。B/JS和B/JL病毒的HA氨基酸序列的比较鉴定了3个不同的氨基酸残基。在这3个残基中，141R和237E是B/JS独有的(相对于其它B型流感病毒)。大多数B型流感病毒株在氨基酸残基位置141和237处含有甘氨酸。为检验141R和/或237E氨基酸残基中的一个或两个是否对稳定B/JS HA196糖基化位点有作用，诱变B/JS HA将141R和/或237E改变成甘氨酸。然后测定各种B/JS病毒在鸡蛋中的复制情况。
如表13所示，当B/JS HA残基141从R改变成G时，以102PFU剂量接种的该病毒不能在鸡蛋中复制。将接种剂量提高至104-105PFU使得该病毒能在鸡蛋中复制。测序具有HA 141G残基的复制B/JS病毒以确定196/197糖基化位点是否保留。测序显示NKT糖基化位点丧失，而换以DKT或NKTP。该发现表明B/JS的HA 141精氨酸残基可能稳定197/197HA糖基化位点。用甘氨酸取代B/JS HA氨基酸残基237处的谷氨酰胺不影响其在鸡蛋中的生长。数据未显示。
表13：HA 141R稳定鸡蛋传代期间的196/197糖基化位点
Figure G2008800207207D00411
a，b用所示病毒以0.004的moi感染MDCK细胞，用在MDCK细胞中扩增的所示6∶2重配病毒以102PFU/鸡蛋(a)或104-105PFU/鸡蛋(b)接种鸡蛋并在33℃温育3天，所述病毒具有(G+)或不具有(G-)196/197HA糖基化位点。通过噬斑试验测定MDCK细胞内的病毒峰值滴度。
c测定从鸡蛋中回收病毒的HA序列，氨基酸序列改变以下划线标出。
为进一步证实HA残基141R足以在鸡蛋复制期间稳定流感B HA 196/197糖基化位点，用精氨酸取代B/SH和B/Ohio/1/05的HA 141处的甘氨酸而引入氨基酸取代。如表13所示，在HA位置141处具有甘氨酸到精氨酸取代的B/SH和B/Ohio/1/05病毒能在鸡蛋中有效复制，滴度约为8.0log10PFU/mL。具有HA 141R取代的B/SH和B/Ohio/1/05病毒在鸡蛋复制期间还保留了HA糖基化。参见图14，其提供的蛋白质印迹证实鸡蛋传代的具有HA 141R残基的B/SH(泳道2)、B/Ohio(泳道4)和B/JS(泳道6)病毒的HA糖基化。这些数据表明HA残基141影响鸡蛋生长的B型流感病毒的HA 196/197糖基化位点的用途。
实施例16：B型流感病毒残基141处的精氨酸不影响病毒的抗原性
检验了取代HA氨基酸位置141处精氨酸残基对B型流感病毒株的抗原性的影响。为测定141R残基是否影响病毒抗原性，用不同的糖基化和非糖基化病毒制备雪貂血清。检验雪貂血清对在141和196/197残基中含有不同修饰的病毒的反应性。
利用7.0log10PFU鸡蛋来源的病毒，通过鼻内接种雪貂来制备雪貂血清，所述病毒分别在141和196/197位点处含有遗传签名GD(非糖基化)或RN(糖基化)。21天后收集雪貂的感染后血清以供在HAI试验中检验抗原性。
分别制备在HA氨基酸位置141和196/197处各含遗传签名GD、RN或GN的B/SH/361/02、B/Ohio/1/05和B/JS/10/03病毒来检验针对雪貂血清的抗原性。从感染的MDCK细胞制备这些病毒；含G141和196/197N残基的流感病毒不能在鸡蛋中生长。
在HAI试验中，用非糖基化(GD)B/SH/361/02产生的雪貂血清与非糖基化B/SH/361/02病毒反应良好，但不与糖基化B/SH/361/02病毒反应；非糖基化病毒的感染后雪貂血清的HAI滴度是糖基化病毒的4倍。类似地，用糖基化(RN)B/SH/361/02病毒产生的雪貂血清与糖基化B/SH/361/02病毒反应良好，但不与非糖基化B/SH/361/02病毒反应。非糖基化病毒的感染后雪貂血清的HAI滴度的差异仍是4倍。这4倍的差异表明非糖基化和糖基化病毒之间的抗原性差异，实施例12，表10也有讨论。
在HAI试验中，用糖基化(RN)B/SH/361/02产生的雪貂血清类似地与RN和GN糖基化病毒反应；对RN糖基化病毒的滴度是GN糖基化病毒的2倍。反应活性中的这种微小的差异表明位置141处的氨基酸残基从甘氨酸改变成精氨酸对B/SH/361/02抗原性没有显著影响。当利用B型流感病毒株B/Ohio/1/05和B/JS/10/03进行相同的一组HAI试验时获得相似结果。参见表14。
表14：氨基酸残基141对B型流感病毒株的抗原性没有影响
Figure G2008800207207D00421
利用鸡红细胞检验雪貂血清对MDCK来源病毒的HAI滴度。
从3份雪貂感染后血清计算几何平均HAI滴度。
相似HAI滴度以下划线标出。
实施例17：HA 196/197处糖基化影响与α-2，3连接唾液酸的结合
由于HA 196/197位点糖基化的B型流感病毒在MDCK细胞中生长良好，但在鸡蛋中不生长，HA 196/197处糖基化可能影响病毒受体结合特异性。Sia(α-2，3)Gal和Sia(α-2，6)Gal是在不同宿主细胞中差异分布的两种主要受体部分。MDCK细胞同时表达Sia(α-2，3)Gal和Sia(α-2，6)Gal部分。鸡胚绒毛膜尿囊膜细胞只表达Sia(α-2，3)Gal部分。可通过血细胞凝集试验，利用差异性表达Sia(α-2，3)和Sia(α-2，6)Gal部分的不同动物的红细胞(RBC)检测病毒受体结合特异性。马RBC主要表达Sia(α-2，3)Gal受体，而豚鼠RBC主要表达Sia(α-2，6)Gal受体。火鸡和鸡RBC大量表达Sia(α-2，3)和Sia(α-2，6)Gal部分(Ito等，Virol.156(1997)：493-499)。
利用马RBC(hRBC)、豚鼠RBC(gpRBC)和火鸡RBC(tRBC)检验鸡蛋来源的糖基化+(RN)或糖基化-(GS、RS、GD或RD)的B/Ohio/1/05和B/Jiangsu/10/03病毒的HA滴度。无论B型流感病毒的糖基化状态，它们均类似地与表达Sia(α-2，6)Gal部分的gpRBC和tRBC良好结合。相反，糖基化+(RN)病毒与只表达Sia(α-2，3)部分的hRBC结合不佳或者结合水平检测不到，提示HA 196/197处糖基化抑制病毒与Sia(α-2，3)Gal受体结合。参见表15。
表15：HA 196/197糖基化抑制HA结合具有α-2，3连接唾液酸的受体
Figure G2008800207207D00431
糖基化的病毒不能结合表达Sia(α-2，3)部分的细胞，例如含胚鸡蛋的尿囊细胞，使得B型流感疫苗毒株难以在鸡蛋中生长。糖基化位点丧失使得B型流感病毒株能在鸡蛋中生长，但改变了毒株的抗原性。如果能保留B型流感病毒的HA 196/197糖基化位点，同时维持在鸡蛋中生长和病毒的抗原性将有助于疫苗生产。在B型流感病毒株的HA氨基酸位置141处引入精氨酸是实现该目的的手段。
虽然出于清晰和理解的目的详细描述了本发明，但本领域技术人员应知道通过阅读本文可在形式和细节中作出各种改变而不脱离本发明的真正范围。例如，可以各种组合使用上述所有技术和设备。如同各份出版物、专利、专利申请或其它文件单独表明出于所有目的通过引用纳入本文的程度一样，本申请的引用的所有出版物、专利、专利申请或其它文件出于所有目的通过引用全文纳入本文。
具体地说，以下专利申请通过引用全文纳入本文：2007年6月18日提交的美国临时申请号60/944,600。

Claims (24)

1.一种制备在鸡蛋中复制增强的HA糖基化的B型流感病毒的方法，该方法包括：
(a)将导致HA位置141处的氨基酸取代为精氨酸的突变引入B型流感病毒基因组；和
(b)在产生B型流感病毒的条件下复制该突变的流感病毒基因组。
2.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过定点诱变实施所述引入步骤。
3.一种制备在鸡蛋中复制增强的HA糖基化的B型流感病毒的方法，该方法包括：
(a)将多个载体引入一群宿主细胞，所述载体包含对应于以下的核苷酸序列：
(i)第一B型流感病毒株的至少6个内部基因组区段；和
(ii)至少第二B型流感病毒株的编码HA和NA多肽的一个或多个基因组区段，其中所述HA多肽在氨基酸残基141处包含精氨酸；
(b)在不超过35℃的温度下培养该群宿主细胞；和
(c)回收流感病毒。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括在步骤(i)之前：
在所述多个载体的一个载体中引入突变；
其中所述一个载体包含对应于编码HA的基因组区段的核苷酸序列，和
其中所述突变导致氨基酸残基141处为精氨酸。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述第一B型流感病毒具有以下属性之一：温度敏感性、减毒或冷适应性。
6.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述第一B型流感病毒包含以下氨基酸残基：PB2630(630R)；PA431(431M)；PA497(497H)；NP55(55A)；NP114(114A)；NP410(410H)；NP510(510T)；M1159(159Q)和M1183(183V)。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤；
在所述多个载体的载体中引入突变；
所述载体包含对应于所述第一B型流感病毒株的6个内部基因组区段的核苷酸序列，和
所述突变导致存在以下氨基酸残基：PB2630(630R)；PA431(431M)；PA497(497H)；NP55(55A)；NP114(114A)；NP410(410H)；NP510(510T)；M1159(159Q)和M1183(183V)。
8.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述第一B型流感病毒是病毒株B/Ann Arbor/1/66。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞是Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、PCK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、293细胞或COS细胞中的一种。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体是质粒。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述多个载体包含8质粒组，其中所述8质粒中各自包含对应于所述第一或第二B型流感病毒株的不同基因组区段的核苷酸序列。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述多个载体中各质粒包含所有的核苷酸序列。
13.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法不包括利用辅助病毒。
14.如权利要求3所述的方法，其特征在于，通过脂质介导的转染或电穿孔实施所述引入步骤。
15.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述温度介于30-35℃之间。
16.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述温度介于32-35℃之间。
17.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括用鸡蛋复制回收的流感病毒；
其中用鸡蛋复制的流感病毒保留HA氨基酸残基位置196/197糖基化位点；和
其中所述流感病毒用鸡蛋复制到至少7.0log10PFU/ml的峰值滴度。
18.通过权利要求3或7所述方法制备的B型流感病毒。
19.一种免疫原性组合物，其包含权利要求18所述的B型流感病毒。
20.一种疫苗，其包含权利要求19所述的B型流感病毒。
21.如权利要求20所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗适合于鼻内给药。
22.如权利要求3或17所述的方法，其特征在于，还包括：
杀伤所述回收的病毒。
23.一种减毒的活B型流感病毒疫苗，其包含通过权利要求3或8所述方法制备的病毒。
24.一种治疗对象病毒感染的方法，包括：
给予所述对象通过权利要求3或8所述方法制备的病毒，其给予量有效产生抵御所述病毒感染的免疫反应。
CN200880020720A 2007-06-18 2008-06-18 血凝素多肽中有变化的b型流感病毒 Pending CN101715487A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94460007P 2007-06-18 2007-06-18
US60/944,600 2007-06-18
PCT/US2008/067301 WO2008157583A1 (en) 2007-06-18 2008-06-18 Influenza b viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101715487A true CN101715487A (zh) 2010-05-26

Family

ID=40156672

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880020720A Pending CN101715487A (zh) 2007-06-18 2008-06-18 血凝素多肽中有变化的b型流感病毒

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8673613B2 (zh)
EP (2) EP2069484B1 (zh)
JP (1) JP5666905B2 (zh)
CN (1) CN101715487A (zh)
CA (1) CA2690196A1 (zh)
ES (1) ES2523587T3 (zh)
HK (1) HK1133442A1 (zh)
WO (1) WO2008157583A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864130A (zh) * 2011-09-08 2013-01-09 中国农业科学院上海兽医研究所 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7465456B2 (en) 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
KR101229202B1 (ko) 2002-04-26 2013-02-01 메디뮨 엘엘씨 인플루엔자 바이러스의 생산을 위한 다중 플라스미드 시스템
JP4771959B2 (ja) 2003-12-23 2011-09-14 メディミューン，エルエルシー インフルエンザウイルス作製のための多重プラスミド系
CA2586690A1 (en) 2004-11-03 2006-06-15 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Influenza vaccination
US8673613B2 (en) 2007-06-18 2014-03-18 Medimmune, Llc Influenza B viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide
US20120027813A1 (en) * 2008-02-22 2012-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
AU2009333208A1 (en) 2008-12-16 2010-07-08 Baxter Healthcare Sa Production of influenza vaccines
AU2010212550B2 (en) 2009-02-10 2016-03-10 Seqirus UK Limited Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
ES2813347T3 (es) 2009-10-26 2021-03-23 Wisconsin Alumni Res Found Virus recombinantes de la influenza de alto título con replicación mejorada en células Vero
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
HUE036110T2 (hu) * 2012-07-17 2018-06-28 Merial Inc Legyengített sertésinfluenza vakcinák és eljárások azok elõállítására és alkalmazására
JP2016524915A (ja) 2013-07-15 2016-08-22 ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション Ｍｄｃｋ、ベロ細胞又は卵内で増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス
US10053671B2 (en) 2014-06-20 2018-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
US10633422B2 (en) 2015-06-01 2020-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA
WO2017007839A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Improved influenza virus replication for vaccine development
CN109477074B (zh) * 2016-02-19 2023-01-24 威斯康星旧生研究基金会 用于疫苗开发的改进的乙型流感病毒复制
US11241492B2 (en) 2019-01-23 2022-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to genes in influenza viruses
EP3921413A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) Humanized cell line
EP3938518A4 (en) * 2019-03-12 2023-01-11 Terra Bioworks, Inc. EXPRESSION VECTOR
WO2020223699A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Improved influenza virus replication for vaccine development
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
CN116144612B (zh) * 2022-12-08 2023-11-10 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） 重组乙型流感病毒及其制备方法与应用

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB660109A (en) 1946-10-01 1951-10-31 American Cyanamid Co Improvements in or relating to the treatment of allantoic fluid containing a propagated virus together with non-viral proteins to obtain the virus in purified and viable from for use in a vaccine
US3992522A (en) 1973-01-24 1976-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare Temperature-sensitive recombinant mutant viruses and a process for producing same
US3874999A (en) 1973-10-31 1975-04-01 American Cyanamid Co Process for the purification of virus vaccine
US4071618A (en) 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4000257A (en) 1975-12-22 1976-12-28 American Cyanamid Company Process for the purification of influenza virus vaccine
US4057626A (en) 1976-10-08 1977-11-08 Richardson-Merrell Inc. Process for detoxifying influenza B virus
US4338296A (en) 1979-10-16 1982-07-06 Smithkline-Rit Influenza virus and process of producing a vaccine therefrom
US4337242A (en) 1980-02-05 1982-06-29 Merck & Co., Inc. Vaccine stabilizer containing L-glutamic acid and L-arginine
US4512972A (en) 1980-06-30 1985-04-23 Kureha Chemical Industry Co., Ltd. Nasal preparation and processes for their production
JPS57136528A (en) 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
FR2505657A1 (fr) 1981-05-13 1982-11-19 Pasteur Institut Perfectionnements apportes aux agents de stabilisation de virus vivants pour la preparation de vaccins, et vaccins stabilises contenant lesdits agents de stabilisation
US4512285A (en) 1983-12-27 1985-04-23 Gof Manufacturing Company, Inc. Apparatus and method for egg turning during incubation
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8914968D0 (en) 1989-06-29 1989-08-23 Connaught Lab Production of virus and purification of viral envelope proteins for vaccine use
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5840520A (en) 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US6887699B1 (en) 1990-05-22 2005-05-03 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
ES2247584T3 (es) 1992-04-14 2006-03-01 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Virus atenuados por ingenieria genetica.
IL105456A (en) 1992-04-21 1996-12-05 American Home Prod Vaccines of attenuated respiratory syncytial virus
AU2088992A (en) 1992-05-05 1993-11-11 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, The Stabilized live vaccine
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
DK0702085T4 (da) 1994-07-18 2010-04-06 Conzelmann Karl Klaus Prof Dr Rekombinant infektiøs ikke-segmenteret negativ-strenget RNA-virus
US5824536A (en) 1994-08-23 1998-10-20 St. Jude Children's Research Hospital Influenza virus replicated in mammalian cell culture and vaccine production
US5789229A (en) 1994-09-30 1998-08-04 Uab Research Foundation Stranded RNA virus particles
US5716821A (en) 1994-09-30 1998-02-10 Uab Research Foundation Prevention and treatment of respiratory tract disease
AU3760495A (en) 1994-09-30 1996-04-26 Aviron Chimeric Influenza Virus And Electroporation Method
US6146873A (en) 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
US5690937A (en) 1995-06-05 1997-11-25 Aviron Temperature sensitive clustered changed-to-alanine mutants of influenza virus PB2 gene
ATE181112T1 (de) 1995-08-09 1999-06-15 Schweiz Serum & Impfinst Dem genom von minussträngigen rna-viren entsprechende cdna und verfahren zur herstellung von infektiösen minussträngigen rna-viren
JPH11512609A (ja) 1995-09-27 1999-11-02 アメリカ合衆国 クローン化されたヌクレオチド配列からの感染性ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）の生産
AU4161296A (en) 1995-10-20 1997-05-07 Davidson, Clifford M. Influenza vaccine
CN1118569C (zh) 1995-10-31 2003-08-20 株式会社载体研究所 具有自主复制能力的负链rna病毒载体
WO1997016539A1 (fr) 1995-11-01 1997-05-09 Dnavec Research Inc. Virus sendai recombinant
US6090391A (en) 1996-02-23 2000-07-18 Aviron Recombinant tryptophan mutants of influenza
DE19612966B4 (de) 1996-04-01 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
BR9710363A (pt) 1996-07-15 2000-01-11 Us Gov Health & Human Serv "vìrus sincicial respirátorio recombinante infeccioso isolado, partìcula do mesmo, processos para estimular o sistema imunológico de um indivìduo para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório e para produzir uma partìcula de vìrus sincicial respiratório recombinante, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante composição e ceta de vìrus sincicial respiratório recombinante"
CA2265554A1 (en) 1996-09-27 1998-04-02 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for attenuation in viruses of the order designated mononegavirales
BR9809456B1 (pt) 1997-05-23 2011-06-28 molécula isolada de polinucleotìdeo, composição de célula ou isenta de célula, partìcula de piv infeciosa, atenuada e imunogênica, e, composição imunogênica.
CA2295858C (en) 1997-07-11 2011-05-10 Yale University Rhabdoviruses with reengineered coats
JP2001517448A (ja) 1997-09-19 2001-10-09 アメリカン・サイアナミド・カンパニー 弱毒化呼吸合胞体ウイルス
GB9815040D0 (en) 1998-07-10 1998-09-09 Medical Res Council Conditional mutant
US6177082B1 (en) 1998-08-13 2001-01-23 The University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Cold-adapted equine influenza viruses
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
CN1163613C (zh) 1998-11-20 2004-08-25 中国科学院上海生物化学研究所 人白介素6核转录因子表达质粒系列及其在肿瘤治疗中的应用
EP1035209A1 (en) 1999-03-06 2000-09-13 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses
PT1820853E (pt) 1999-04-06 2012-01-03 Wisconsin Alumni Res Found Vírus recombinante da gripe para vacinas e terapia genética
US8715940B2 (en) 1999-04-06 2014-05-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of making recombinant influenza virus
GB9923176D0 (en) 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
RU2280690C2 (ru) 2000-03-02 2006-07-27 Полимун Сайнтифик Иммунбиологише Форшунг Гмбх Рекомбинантные вирусы гриппа а
KR100848719B1 (ko) 2000-04-28 2008-07-25 세인트 쥬드 칠드런즈 리써치 호스피탈 감염성 인플루엔자 바이러스 생성용 ｄｎａ 트랜스펙션시스템
WO2002024876A2 (en) 2000-09-25 2002-03-28 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Live influenza vaccine and method of manufacture
US7195905B2 (en) 2001-12-10 2007-03-27 Baxter Healthcare S.A. Enveloped virus vaccine and method for production
KR101229202B1 (ko) 2002-04-26 2013-02-01 메디뮨 엘엘씨 인플루엔자 바이러스의 생산을 위한 다중 플라스미드 시스템
US7465456B2 (en) 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
KR101251902B1 (ko) 2003-02-25 2013-04-08 메디뮨 엘엘씨 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법
US20060110406A1 (en) 2003-02-25 2006-05-25 Medimmune Vaccines, Inc. Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
CA2529647C (en) 2003-06-16 2013-08-13 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
US7037707B2 (en) 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
JP4771959B2 (ja) 2003-12-23 2011-09-14 メディミューン，エルエルシー インフルエンザウイルス作製のための多重プラスミド系
DK1748790T3 (en) 2004-05-24 2015-10-19 Medimmune Llc Multiplasmidsystem for the production of influenza
WO2006041819A1 (en) 2004-10-06 2006-04-20 Medimmune Vaccines, Inc. Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
WO2006049061A1 (ja) 2004-11-01 2006-05-11 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Ｈ５型又はｈ７型トリインフルエンザウイルスの検出方法
US8673613B2 (en) 2007-06-18 2014-03-18 Medimmune, Llc Influenza B viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide
WO2009122431A2 (en) * 2008-02-15 2009-10-08 Sun Pharma Advanced Research Company Ltd., Oral controlled release tablet

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864130A (zh) * 2011-09-08 2013-01-09 中国农业科学院上海兽医研究所 高效表达ha蛋白的重组流感病毒及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2069484B1 (en) 2014-08-13
US20140199683A1 (en) 2014-07-17
AU2008265760A1 (en) 2008-12-24
US8673613B2 (en) 2014-03-18
EP2069484A1 (en) 2009-06-17
WO2008157583A1 (en) 2008-12-24
JP2010530248A (ja) 2010-09-09
ES2523587T3 (es) 2014-11-27
JP5666905B2 (ja) 2015-02-12
US20100322969A1 (en) 2010-12-23
EP2674486A1 (en) 2013-12-18
HK1133442A1 (zh) 2010-03-26
EP2069484A4 (en) 2011-06-01
CA2690196A1 (en) 2008-12-24
US9068986B2 (en) 2015-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101715487A (zh) 血凝素多肽中有变化的b型流感病毒
CN1678345B (zh) 制备流感病毒的多质粒系统
JP5264955B2 (ja) インフルエンザウイルス作製のための多重プラスミド系
KR101316350B1 (ko) 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법
KR20080024212A (ko) 개의 세포에서 네거티브 센스 바이러스 ｒｎａ를발현시키기 위한 방법 및 조성물
CN101528941A (zh) 在犬细胞中表达负义病毒rna的方法和组合物
CN104278014A (zh) 流感血凝素和神经氨酸酶变体
CN104611299B (zh) 一种人工重组的h9n2禽流感病毒株、制备方法、疫苗组合物及其应用
CN101243189A (zh) 用于在犬细胞内表达反义病毒rna的方法和组合物
AU2008265760B2 (en) Influenza B viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20100526