KR20080024212A - 개의 세포에서 네거티브 센스 바이러스 ｒｎａ를발현시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

개의 세포에서 네거티브 센스 바이러스 ｒｎａ를발현시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20080024212A
KR20080024212A KR1020087001609A KR20087001609A KR20080024212A KR 20080024212 A KR20080024212 A KR 20080024212A KR 1020087001609 A KR1020087001609 A KR 1020087001609A KR 20087001609 A KR20087001609 A KR 20087001609A KR 20080024212 A KR20080024212 A KR 20080024212A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
cells
influenza
rna
dog
Prior art date
Application number
KR1020087001609A
Other languages
English (en)
Inventor
그레고리 듀크
조지 켐블
제임스 영
쟈오티 왕
Original Assignee
메드이뮨 백신즈 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 메드이뮨 백신즈 인코포레이티드 filed Critical 메드이뮨 백신즈 인코포레이티드
Publication of KR20080024212A publication Critical patent/KR20080024212A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Abstract

본 발명은 개의 세포 예를 들어, MDCK 세포에서 핵산 서열을 발현하는데 유용한 신규의 개 polI 조절 핵산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 이와 같은 핵산을 포함하는 발현 벡터와 세포, 그리고 이러한 핵산을 사용하여 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

개의 세포에서 네거티브 센스 바이러스 ＲＮＡ를 발현시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXPRESSING NEGATIVE-SENSE VIRAL RNA IN CANINE CELLS}
하나의 측면에서, 본 발명은 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터와 세포, 그리고 이러한 핵산을 이용하여 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
인플루엔자로 인한 유행병은, 인플루엔자가 일으키는 질병으로 인한, 전 세계 인구의 유병률과 사망률을 급진적으로 증가시키는 것을 특징으로 한다. 이 전염병의 심각성과 중증도를 좌우하는 몇 가지 인자들로서는, 인간의 면역성 감소와 바이러스가 인간들 사이에서 전이될 수 있는 효율을 포함한다. 이 중 전이 효율은 일반적으로 바이러스 자체뿐만 아니라, 인구 밀도, 그리고 특정 지역을 여행을 통해 용이하게 왕래할 수 있음에 의해 영향을 받는다. 이 전염병을 일으키는 바이러스는, 최근 들어 갑자기 나타난 항원성 변이체로서, 대다수의 인간들이 이전에 감염된 적이 없어서 그에 대한 면역성이 아주 미약하거나 전무한 바이러스이다. 뿐만 아니라, 이 질병이 급속히 확산되기 위해서는 반드시 인간들간 전이가 효율적으로 이루어져 하는데, 이 동물 바이러스가 인간 군집에 인수 공통의 형태로 침투하는 경우, 이 바이러스는 인간의 체 내에서 복제하도록 적응하여야 하고, 또한 효율적으로 전이될 수 있어야 한다.
전염성 인플루엔자는 매우 급속히 확산되고 있으며, 그 파급 효과 또한 가공할 만하다. 20세기에 가장 심각했던 경우는 1918년의 일인데, 이때, 미국 시민들 중 500,000명 이상이 사망하였으며, 전 세계적으로는 2∼4천만 명이 사망에 이르게 되었다. 이와 같은 전염병은 잠복해 있다가 감염 후 수 주 내지 수 개월 후에 발병하게 된다. 전염성 인플루엔자의 비교적 급속한 발병과 확산은 전 세계를 뒤흔들 엄청난 재앙에 대처하는데 있어서 몇 가지 문제점을 제공하여, 응급 처치 관계자 및 보건 관계자에게 엄청난 부담이 되고 있다. 최근 발병한 전염병에 대한 신속한 확인과 조치가 이러한 문제점들을 해결하기 위한 해결책 중 필수적인 요소이며; 현재, 드물기는 하지만 인간에서도 질병을 일으키는 조류 인플루엔자 바이러스를 비롯하여 갑자기 발생한 인플루엔자 바이러스를 모니터하기 위한 몇 가지 프로그램이 전 세계적으로 시행되고 있다. 그 결과 얻어진 감시 데이터는 이 질병의 위협성을 확인하고, 그에 대한 효율적인 대처 방법을 지도하기 위해서 미리 정해놓은 전염병 경계 수준(pandemic alert level)과 함께 활용되고 있다.
백신화는 매년 인플루엔자가 유행함으로 인하여 유발되는 질병을 예방함에 있어서 가장 중요한 공중 보건 수단이다. 잠재적인 전염병을 동정하고 나서 발병 수준이 상당히 증가하기까지의 간격이 짧으면, 다수의 인간들을 보호하는데 충분한 백신을 생산함에 있어 상당히 불리하다. 이 전염병이 다음에 발병하기 전에, 백신 기술과 이에 필요한 기본적 시설을 갖추는 것이 유병률과 사망률을 상당 수준 줄이는데 큰 몫을 할 것이다. "전염병 백신"을 생산하는데 필요한 기간을 단축하면, 이 전염병에 효과적으로 대처하기 위한 연구 기간 또는 이를 위한 방법의 개발 기간 또한 단축될 것이다.
현재, 미국에서 시판중인 비-감염성 균주에 대한 모든 인플루엔자 백신은 부화 달걀 내에서 증식되는 것이다. 인플루엔자 바이러스는 달걀에서 잘 자라긴 하지만, 백신의 생산은 달걀의 자생력에 좌우된다. 이 경우, 달걀은 조직적으로 공급되어야 하고, 백신 생산에 필요한 균주는 차기 인플루엔자 발병 시기가 도래하기 수 개월 전에 선택하여야 하므로, 백신 연구의 융통성에도 제한이 따르기 때문에, 때로는 백신 생산이 지연되고 생산된 백신의 공급 물량도 모자라게 된다. 불행히도, 몇몇 인플루엔자 백신 균주 예를 들어, 2003년에서 2004년까지 유행했던 선조형 A/후지안(Fujian)/411/02 균주는 부화 달걀 내에서 복제되기 어려워서, 시간과 비용을 많이 투자하여 세포 배양에 의해 분리해야만 했다.
또한, 세포 배양액 중에서 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위한 시스템도 최근 들어 개발된바 있다[예를 들어, Furminger. Vaccine Production, Nicholson외 다수 (eds) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten외 다수 (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151 참조]. 통상적으로, 이와 같은 방법은 적당한 무한 증식성 숙주 세포를 바이러스의 선택 균주로 감염시키는 단계를 포함한다. 달걀 내에서 백신을 생산하는 것과 관련된 다수의 난점을 없앤다고 해서, 인플루엔자 바이러스의 모든 병원성 균주가 잘 자라는 것은 아니며, 또한 확립된 조직 배양법에 따라서 생산될 수 있는 것도 아니다. 뿐만 아니라, 살아있는 약독화 백신의 생산에 적당하며, 원하는 특성 예를 들어, 약독성(attenuation), 온도 감수성 및 냉각 적응성(cold adaptation)을 가지는 다수의 균주가, 확립된 방법을 통하여 조직 배양액 중에서 성공적으로 생육되는 것은 아니다.
세포 배양액을 살아있는 바이러스로 감염시키는 것을 바탕으로 하는 세포 배양계 방법 이외에, 완전히 감염성인 인플루엔자 바이러스는 재조합 DNA 기술을 이용하여 세포 배양액 중에서도 생산될 수 있다. 재조합 DNA로써 인플루엔자 바이러스를 생산하면, 인플루엔자 백신 생산용 조직 배양법의 융통성과 유용성이 상당한 수준으로 증가하게 된다. 최근 들어, 바이러스 게놈을 암호화하는 cDNA가 통합된 재조합 플라스미드로부터 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스를 생산하기 위한 시스템에 관하여 보고된 바 있다. 예를 들어, 문헌[Neumann외 다수 (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350; Fodor외 다수 (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73:9679-9682; Hoffmann외 다수 (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97:6108-6113; WO 01/83794; Hoffmann and Webster (2000), Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids, 81 :2843-2847; Hoffmann외 다수 (2002), Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids, 99(17): 11411-11416; 미국 특허 제6,649,372호 및 동 제6,951,754호; 미국 특허 공보 20050003349 및 20050037487; 본원에 참고용으로 인용됨]을 참조하시오. 이러한 시스템(종종 "플라스미드 회수법(plasmid rescue)"이라고 칭함)은 임의의 선택한 균주로부터 면역원성 HA 및 NA 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 가능성을 제공한다.
그러나, 이와 같은 재조합법은 바이러스 게놈 rRNA의 전사를 유도하기 위한 RNA 중합 효소 I(RNA polI) 조절 요소를 포함하는 발현 벡터를 사용하는 것을 바탕으로 한다. 이러한 조절 요소는 인플루엔자 게놈 RNA의 한정된 5' 및 3' 말단부를 생성하는데 필수적인 것으로서, 이로써 완전히 감염성인 인플루엔자 바이러스를 생산할 수 있다. 현재의 재조합 시스템 예를 들어, 전술한 바와 같은 시스템에서는 바이러스 RNA를 발현하기 위해 인간의 RNA polI 조절 시스템을 사용한다. RNA polI 프로모터의 종 특이성으로 인하여, 상기와 같은 조절 요소들은 인간 또는 영장류의 세포에서만 활성을 갖는다. 그러므로, 인플루엔자 바이러스의 플라스미드 회수는 적당한 플라스미드를 인간 또는 영장류 세포에 형질 감염시킴으로써만 가능하다.
뿐만 아니라, 이러한 인간 또는 영장류 세포는 종종 인플루엔자 바이러스 역가를 백신 제조에 필요한 만큼 충분히 나타내지 못한다. 그 대신, 매딘-다비(Madin-Darby) 개 신장 세포(MDCK 세포)를 사용하는데, 이로써 백신 균주는 그것이 상업용 백신을 제조하는데 충분한 만큼의 역가를 나타내도록 복제할 수 있다. 그러므로, 플라스미드 회수법을 이용하여 인플루엔자 백신을 생산하는데는 2개 이 상의 상이한 세포 배양액을 사용하여야 한다. 개 RNA polI 조절 서열을 동정 및 클로닝하면, 바이러스 복제시 필요한 세포 배양액과 동일한 세포 배양액 중에서 플라스미드를 회수할 수 있으므로, 별도의 회수용 배양액을 준비하지 않아도 되는 것이다. 이와 같으므로, MDCK 세포 및 기타 개의 세포에서 플라스미드 회수용인 적당한 벡터를 구성하는데 사용될 수 있는 개 RNA polI 조절 요소를 동정 및 클로닝할 필요가 있는 것이다. 이러한 필요성과 기타 요망 사항들은 본 발명에 의해서 충족된다.
본원에 언급된 참고 문헌 또는 논의는, 그러한 것들이 본 발명에 선행하는 기술임을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 될 것이다. 또한, 특허에 관한 언급은 그것의 유용성을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.
발명의 개요
본원에는 예를 들어, 개의 세포에서 인플루엔자 게놈 RNA를 발현하는데 사용될 수 있는 조절 요소를 포함하는 핵산에 관하여 개시되어 있다. 조성물 예를 들어, 본 발명의 개 조절 서열을 포함하는 분리된 핵산, 벡터 및 세포와, 이것들을 사용하는 방법은 본 발명의 구체예에 해당한다.
그러므로, 임의의 측면에서, 본 발명의 분리된 핵산은 개의 RNA 중합 효소 I(polI) 조절 서열을 포함한다. 임의의 구체예에서, 조절 서열은 프로모터(promoter)를 포함한다. 임의의 구체예에서, 조절 서열은 인핸서(enhancer)를 포함한다. 임의의 구체예에서, 조절 서열은 프로모터와 인핸서를 둘 다 포함한다. 하나의 구체예에서, 조절 서열은 상응하는 원래 프로모터의 -250∼-1(프로모터로부터 전사된 첫 번째 뉴클레오티드(+1 뉴클레오티드라고도 알려짐)에 관함) 위치에 있는 뉴클레오티드 또는 이의 기능성 유도체를 포함한다. 하나의 구체예에서, 조절 서열은 바이러스 DNA 예를 들어, 클로닝된 바이러스 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 하나의 구체예에서, 클로닝된 바이러스 cDNA는 음성 또는 양성 가닥 바이러스의 바이러스 RNA 또는 상응하는 cRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 클로닝된 바이러스 cDNA는 인플루엔자 바이러스의 게놈 바이러스 RNA(또는 상응하는 cRNA)를 암호화한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열과 전사 종결 서열을 포함한다. 임의의 구체예에서, 전사 종결 서열은 RNA 중합 효소 I 종결 서열이다. 특정 구체예에서, 전사 종결 서열은 인간, 원숭이 또는 개의 polI 종결 서열이다.
임의의 측면에서, 본 발명은 개 RNA polI 프로모터를 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 바람직하게, 개의 RNA polI 프로모터는 전사될 핵산 예를 들어, 인플루엔자 게놈 RNA에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 하나의 구체예에서, 핵산을 개의 세포에 도입시키면, 인플루엔자 게놈 RNA가 전사되며, 적당한 인플루엔자 단백질이 존재할 경우에는, 이 RNA 전사체는 감염성 인플루엔자 바이러스로 팩킹(packing)될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 개 RNA 조절 서열(예를 들어, 개 RNA polI 프로모터)을 포함하는 분리된 핵산이 제공되는데, 여기서, 상기 조절 서열은 전사될 핵산에 작동 가능하도록 결합되어 있으며, 시험관 내 또는 생체 내 적당한 단백질(예를 들어, 인플루엔자 vRNA 분절을 암호화하는 핵산의 경우 에는 RNP 복합체)이 존재할 경우, 이 조절 서열은 전사된다. 하나의 구체예에서, 상기 조절 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 핵산은 인플루엔자 vRNA 분절이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 인간, 영장류, 마우스 또는 개 polI 폴리펩티드에 결합하며, 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 100% 이상, 또는 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 활성 단편 예를 들어, 개 RNA polI 조절 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 활성 단편은 또한 이 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제2의 폴리뉴클레오티드 서열의 적당한 폴리펩티드(예를 들어, 인간, 영장류, 마우스 또는 개 polI 폴리펩티드)의 존재 하에서, 전사를 개시하는 능력을 추가로 보유한다. 하나의 구체예에서, 서열 번호 1∼서열 번호 19에 제시된 핵산의 "기능적 활성 단편"은 서열 번호 1∼서열 번호 19의 전장 서열의 하나 이상의 기능적 활성(본원에 개시됨)을 보유한다. 예를 들어, 서열 번호 1에 제시된 조절 서열의 기능적 활성 단편은, 전사될 핵산에 이 조절 서열 단편이 작동 가능하도록 결합하여, 시험관 내 또는 생체 내 적당한 단백질이 존재할 경우 전사되도록 제공된다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 인간, 영장류, 마우스 또는 개 polI 폴리펩티드에 결합하며/결합하거나, 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 100% 이상, 또는 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 활성인 단편 예를 들어, 개 RNA polI 조절 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편은 또한 이 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제2의 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를, 적당한 폴리펩티드(예를 들어, 인간, 영장류, 마우스 또는 개 polI 폴리펩티드)의 존재 하에서, 개시하는 능력을 추가로 보유한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산은 개 RNA 중합 효소 I 조절 서열과 리보자임 서열을 포함한다. 이는 예를 들어, 간염 델타 바이러스 게놈 리보자임 서열 또는 이의 기능적 유도체일 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 임의로 당 업자에게 공지된 임의의 네거티브 가닥 RNA 바이러스로부터 게놈 바이러스 RNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 바이러스 RNA는 기타 모노네가비랄레스(Mononegavirales) 목에 속하는 바이러스의 게놈 바이러스 RNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 바이러스 RNA는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae), 뉴모비리내(Pneumovirinae), 래비도비리대(Rhabdoviridae), 필로비리대(Filoviridae), 보르나비리대(Bornaviridae), 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae), 버니아비리대(Bunyaviridae) 및 아레나비리대(Arenaviridae) 군에 속하는 바이러스의 게놈 바이러스 RNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 바이러스 RNA는 레스피로바이러스(Respirovirus), 모빌리바이러스(Morbillivirus), 루불라바이러스(Rubulavirus), 헤니파바이러스(Henipavirus), 애뷸라바이러스(Avulavirus), 뉴모바이러스(Pneumovirus), 메타뉴모바이러 스(Metapneumovirus), 베시큘로바이러스(Vesiculovirus), 리사바이러스(Lyssavirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 사이토래비도바이러스(Cytorhabdovirus), 뉴클레오래비도바이러스(Nucleorhabdovirus), 노비래비도바이러스(Novirhabdovirus), 마버그바이러스(Marburgvirus), 에볼라바이러스(Ebolavirus), 보르나바이러스(Bornavirus), 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토바이러스(Thogotovirus), 아이사바이러스(Isavirus), 오르토버니아바이러스(Orthobunyavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 나이로바이러스(Nairovirus), 플레보바이러스(Phlebovirus), 토스포바이러스(Tospovirus), 아레나바이러스(Arenavirus), 오피오바이러스(Ophiovirus), 테뉴이바이러스(Tenuivirus) 또는 델타바이러스(Deltavirus) 속에 속하는 바이러스의 게놈 바이러스 RNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 바이러스 RNA는 센다이 바이러스(Sendai virus), 홍역 바이러스, 수두 바이러스, 헨드라 바이러스(Hendra virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 인간 호흡기 세포 융합 바이러스(Human respiratory syncytial virus), 조류 뉴모바이러스(Avian pneumovirus), 소포성 구내염 인디아나 바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus), 광견병 바이러스, 소 유행열 바이러스(Bovine ephemeral fever virus), 상추 괴사 황색병 바이러스(Lettuce necrotic yellows virus), 감자 황색 난쟁이병 바이러스(Potato yellow dwarf virus), 감염성 조혈기 괴사 바이러스(Infectious hematopoietic necrosis virus), 빅토리아 호수 마버그 바이러스(Lake Victoria marburgvirus), 자이어 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus), 보르 나병 바이러스(Borna disease virus), 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 토고토 바이러스, 감염성 연어 빈혈 바이러스, 버니암웨라 바이러스(Bunyamwera virus), 한탄 바이러스, 더그비 바이러스(Dugbe virus), 리프트 계곡열 바이러스(Rift Valley fever virus), 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus), 감귤 소로시스 바이러스(Citrus psorosis virus), 벼 줄무늬 잎마름병 바이러스(Rice stripe virus) 및 간염 델타 바이러스(Hepatitis delta virus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스의 게놈 바이러스 RNA를 암호화한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 임의의 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 임의의 구체예에서, 벡터는 박테리아 복제 기원을 포함한다. 임의의 구체예에서, 벡터는 진핵 생물 복제 기원을 포함한다. 임의의 구체예에서, 벡터는 원핵 생물 세포에서 선택될 수 있는 선별 마커를 포함한다. 임의의 구체예에서, 벡터는 진핵 생물 세포에서 선별될 수 있는 선별 마커를 포함한다. 임의의 구체예에서, 벡터는 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)를 포함한다. 임의의 구체예에서, 다중 클로닝 위치는 개 RNA 중합 효소 I 조절 서열과 관련하여 배향되어 있어서, 이 다중 클로닝 위치에 도입된 폴리뉴클레오티드 서열이 조절 서열에 의해 전사될 수 있도록 만들어 준다. 임의의 구체예에서, 벡터는 개의 세포 예를 들어, MDCK 세포에서 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 세포 배양액 예를 들어, MDCK 세포 배양액으로부터 재조합적으로 바이러스를 회수하는데 유용한 발현 벡터를 제공한다. 일반적으로, 벡터는 바이러스의 생활 주기가 진행되는 동안에, 한정된 말단부를 가지는 RNA의 생산에 필요한 것으로 당 업자에게 공지된 임의의 바이러스를 회수하는데 유용하다. 이러한 바이러스로서는 네거티브 센스 가닥 RNA 바이러스 예를 들어, 전술한 바와 같은 바이러스들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 이 바이러스는 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 또는 인플루엔자 C 바이러스이다.
임의의 구체에에서, 본 발명의 벡터들 중 하나 이상은 RNA 전사 종결 서열을 추가로 포함한다. 임의의 구체예에서, 전사 종결 서열은 RNA 중합 효소 I 전사 종결 서열, RNA 중합 효소 II 전사 종결 서열, RNA 중합 효소 III 전사 종결 서열 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 구체예에서, 발현 벡터는 1 방향성 발현 벡터(uni-directional expression vector)이다. 기타 구체예에서, 발현 벡터는 2 방향성 발현 벡터(bi-directional expression vector)이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 2 방향성 발현 벡터에는 제2의 프로모터와 폴리아데닐화 위치 예를 들어, SV40 폴리아데닐화 위치 사이에 제1 프로모터가 삽입되어 있다. 임의의 구체예에서, 제1 프로모터는 개의 RNA polI 프로모터이다. 임의의 구체예에서, 제2 프로모터는 개의 RNA polI 프로모터이다. 하나의 구체예에서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 하나 이상의 클로닝 위치에 측접하고 있으면서, 반대 방향으로 정렬될 수 있다.
임의의 구체예에서, 발현 벡터는 개의 RNA polI 프로모터와 관련하여 하나 이상의 클로닝 위치의 3' 위치에 리보자임 서열 또는 전사 종결 서열을 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 개의 RNA polI 프로모터와 관련하여 하나 이상의 클로닝 위치의 3' 위치에 리보자임 서열 또는 전사 종결 서열을 포함하므로, vRNA는 정확한 5' 말단부와 3' 말단부를 가지도록 세포에서 합성될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 2 방향성 발현 벡터 내에서, 유전자 또는 cDNA는 본 발명의 상류 polII 프로모터와 하류 개 polI 조절 서열(예를 들어, polI 프로모터) 사이에 위치한다. 이 polII 프로모터로부터 유전자 또는 cDNA가 전사되면, 캡핑된(capped) 양성 배열 바이러스 mRNA가 생산되며, 개의 polI 조절 서열로부터 이 유전자 또는 cDNA가 전사되면, 캡핑되지 않은(uncapped) 네거티브 센스 vRNA가 생산된다. 대안적으로, 본 발명의 1 방향성 벡터 시스템에 있어서, 유전자 또는 cDNA는 polI 및 polII 프로모터의 하류에 위치한다. 상기 polII 프로모터는 캡핑된 양성 배열 바이러스 mRNA를 생산하며, 상기 polI 프로모터는 캡핑되지 않은 양성 배열 바이러스 cRNA를 생산한다.
다른 측면에서, 본 발명은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서, 상기 벡터는 바이러스 cDNA 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 본 발명의 하나 이상의 핵산(예를 들어, 본 발명에 의한 개의 polI 조절 서열)을 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9 개, 10개, 11개, 12개 또는 그 이상의 벡터는 하나의 플라스미드 내에 존재한다. 임의의 구체예에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 그 이상의 벡터는 별도의 플라스미드 내에 존재한다. 임의의 구체예에서, 각각의 벡터는 별도의 플라스미드 상에 존재한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 벡터는 2 방향성 발현 벡터이다. 본 발명의 2 방향성 발현 벡터는 통상적으로 제1 프로모터와 제2 프로모터를 포함하는데, 여기서, 상기 제1 및 제2 프로모터는 바이러스 핵산 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 게놈의 분절을 암호화하는, 동일한 이중 사슬 cDNA의 대안적 사슬에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 일반적으로, 이러한 프로모터 중 하나 이상은 개의 RNA polI 프로모터이다. 임의로, 상기 2 방향성 발현 벡터는 폴리아데닐화 신호 및/또는 종결 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리아데닐화 신호 및/또는 종결 서열은 2개의 프로모터 사이에 존재하는 인플루엔자 바이러스 게놈의 분절에 측접하여 위치한다. 하나의 바람직한 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 2 방향성 플라스미드계 발현 시스템과 1 방향성 플라스미드계 발현 시스템을 포함하는데, 여기서, 바이러스 cDNA는 본 발명의 개 polI 조절 서열(예를 들어, polI 프로모터)와 종결 서열(내부 전사 단위) 사이에 삽입되어 있다. 이와 같은 내부 전사 단위는 RNA 중합 효소 II(polII) 프로모터와 폴리아데닐화 위치(외부 전사 단위) 사이에 측접하여 존재한다. 1 방향 시스템에서, polI 및 polII 프로모터는 cDNA의 상류로서, 양성 배열의 캡핑되지 않은 cRNA(polI 프로모터로부터 유래)와 양성 배열의 캡핑된 mRNA(polII 프로모터로부터 유래)를 생산한다. 상기 1 방향 시스템 내의 polI 프로모터, polI 종결 서열, polII 프로모터 및 폴리아데닐화 신호는 "상류-대-하류 배향(upstream-to-downstream orientation)"을 포함하는 것이라 말할 수 있다. 2 방향 시스템에 있어서, polI 및 polII 프로모터는 cDNA의 반대쪽에 존재하는데, 이때, 상류 polII 프로모터는 양성 배열의 캡핑된 mRNA를 생산하고, 하류 polI 프로모터는 네거티브 센스의 캡핑되지 않은 바이러스 RNA(vRNA)를 생산한다. 이와 같은 polI-polII 시스템은 2개의 세포 RNA 중합 효소의 전사를 이 시스템의 프로모터(핵의 상이한 구획 내에 있을 것으로 추정)로부터 개시하는 것으로 시작된다. 2 방향 시스템 내 상기 polI 프로모터 및 polI 종결 서열은 "하류-대-상류 배향"을 포함하는 것이라 칭할 수 있는 반면에, 2 방향 시스템 내 상기 polII 프로모터 및 폴리아데닐화 신호는 "상류-대-하류 배향"을 포함하는 것이라 말할 수 있다.
다른 측면에서, 본원에 개시된 본 발명은 개 RNA 중합 효소 I에 의해 전사될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다. 임의의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 인플루엔자 vRNA 또는 cRNA를 생산한다. 임의의 구체예에서, 조성물은 다수의 발현 벡터(각각은 개의 RNA 중합 효소 I에 의해 전사될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함함)를 포함한다. 임의의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 다수의 인플루엔자 vRNA 또는 cRNA를 생산한다. 임의의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 8개의 인플루엔자 vRNA 또는 cRNA를 모두 생산한다.
다른 측면에서, 본원에 개시된 본 발명은, 헬퍼 바이러스(helper virus)의 부재/존재하에서 개 세포에 도입될 때 인플루엔자 게놈을 생산하는, 본 발명의 발현 벡터를 다수 개 포함하는 조성물을 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 조성물은, 헬퍼 바이러스의 부재/존재하에서 개 세포에 도입될 때 감염성 인플루엔자 바이러스를 생산하는, 발현 벡터를 다수 개 포함한다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 냉각-감수성(cold-sensitive) 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 약독화된 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 바이러스는 온도 감수성 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 냉각-적응성(cold-adapted) 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 약독화되었으며, 온도 감수성이고, 냉각-적응성인 인플루엔자 바이러스이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 조성물은, 5'→3' 방향으로, 즉, 프로모터는 5' 비-암호화 인플루엔자 바이러스 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있고, 이 5' 비-암호화 인플루엔자 바이러스 서열은 cDNA에 결합되어 있으며, 이 cDNA는 3' 비-암호화 인플루엔자 바이러스 서열에 결합되어 있고, 또한 이 3' 비-암호화 인플루엔자 바이러스 서열은 전사 종결 서열에 결합되어 있는 벡터를 포함한다. 임의의 구체예에서, 상기 벡터 내 cDNA 중 하나 이상은 센스 배향(sense orientation)으로 존재한다. 임의의 구체예에서, 상기 벡터 내 cDNA 중 하나 이상은 안티-센스 배향(anti-sense orientation)으로 존재한다.
임의의 구체예에서, 본 발명은 다수의 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는 데, 이때 상기 다수의 벡터는, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 중합 효소 산성 단백질(PA) cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 조절 서열을 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 중합 효소 염기성 단백질 1(PB1) cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 조절 서열을 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 중합 효소 염기성 단백질 2(PB2) cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 조절 서열을 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 조절 서열을 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 핵단백질(NP) cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 조절 서열을 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제(NA) cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 조절 서열을 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 매트릭스 단백질 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 조절 서열을 포함하는 벡터, 그리고 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 임의의 구체예에서, 조성물은 또한 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, 매트릭스 단백질 1(M1), 매트릭스 단백질 2(M2), 및 비-구조 단백질 1 및 2(NS1 및 NS2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 조성물이 개의 세포 내에 도입될 때, 감염성 인플루엔자 바이러스가 생산된 다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 냉각-감수성 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 약독화된 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 온도 감수성 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 냉각-적응성 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 감염성 인플루엔자 바이러스는 약독화되고, 온도 감수성이며, 냉각-적응성인 인플루엔자 바이러스이다.
임의의 구체예에서, 본 발명은 클로닝된 바이러스 cDNA로부터 감염성 인플루엔자 바이러스를 생산하는 조성물을 제공하며, 이 조성물은 각각의 플라스미드가 하나 이상의 바이러스 게놈 분절을 암호화하는 cDNA를 포함하고, 바이러스 게놈 분절에 상응하는 바이러스 cDNA가 본 발명의 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열과, 정확한 3' 말단부를 가지는 vRNA 또는 cRNA를 합성하기 위한 조절 요소(예를 들어, 개의 polI 종결 서열) 사이에 삽입되어 이 vRNA 또는 cRNA를 발현하는 플라스미드 세트를 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명은 클로닝된 바이러스 cDNA로부터 감염성 인플루엔자 바이러스를 생산하는 조성물을 제공하며, 이 조성물은 각각의 플라스미드가 하나 이상의 바이러스 게놈 분절을 암호화하는 cDNA를 포함하고, 바이러스 게놈 분절에 상응하는 바이러스 cDNA가 본 발명의 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열과, 정확한 3' 말단부를 가지는 vRNA 또는 cRNA를 합성하기 위한 조절 요소(예를 들어, 개의 polI 종결 서열) 사이에 삽입되어 이 vRNA 또는 cRNA를 발현하며, 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열, 바이러스 cDNA 및 정확한 3' 말단부를 가지는 vRNA 또는 cRNA를 합성시키기 위한 조절 요소가 차례로 RNA 중합 효소 II(polII) 프로모터와 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입되어, 바이러스 mRNA 및 상응하는 바이러스 단백질을 발현하고, 이 vRNA 또는 cRNA의 전체 세트와 바이러스 단백질이 발현되어, 그 결과 감염성 인플루엔자 바이러스 조립체를 형성하는 플라스미드 세트를 포함한다.
임의의 구체예에서, 정확한 3' 말단부를 가지는 vRNA 또는 cRNA의 합성용 조절 요소는 RNA 중합 효소 I(polI) 종결 서열이다. 당 업자에게 알려진 바와 같이, 인플루엔자 vRNA의 효율적인 복제 및 전사에는 vRNA의 5' 말단 및 3' 말단에 매우 특이적인 서열이 필요하다. 당 업자는 생산된 RNA 전사체의 3' 말단 서열이 상기 게놈 RNA의 복제 및/또는 전사를 효율적으로 만들어주는데 필요한 정확한 말단부를 가지는지를 확인하기 위하여 RNA 중합 효소 I(polI) 종결 서열을 이용할 수 있다. 임의의 구체예에서, 정확한 3' 말단부를 가지는 vRNA 또는 cRNA의 합성용인 조절 요소는 리보자임 서열이다. 임의의 구체예에서, 상기 polI 프로모터는 폴리아데닐화 신호에 인접하여 존재하며, 상기 polI 종결 서열은 polII 프로모터에 인접하여 존재한다. 임의의 구체예에서, 상기 polI 프로모터는 polII 프로모터에 인접하여 존재하고, 상기 polI 종결 서열은 폴리아데닐화 신호에 인접하여 존재한다. 임의의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스이다.
다른 측면에서, 본 발명은 인플루엔자 게놈 RNA를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 본 발명의 핵산을 전사하여 인플루엔자 게놈 RNA를 생산하는 단계 를 포함한다. 임의의 구체예에서, 상기 인플루엔자 게놈 RNA는 무-세포 시스템(cell-free system) 내에서 전사된다. 임의의 구체예에서, 상기 인플루엔자 게놈 RNA는 개의 세포 예를 들어, MDCK 세포에서 전사된다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 핵산 다수 개를 전사시켜, 다수의 RNA 분자 예를 들어, 다수의 인플루엔자 게놈 RNA를 생산하는 단계를 포함한다. 임의의 구체예에서, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 인플루엔자 게놈 RNA가 전사된다. 임의의 구체예에서, 인플루엔자 게놈 RNA의 완전한 세트가 전사된다. 임의의 구체예에서, 인플루엔자 게놈 RNA는 PA, PB1, PB2 및 NP의 존재 하에서, 개의 세포 예를 들어, MDCK 세포에서 전사될 때, 인플루엔자 단백질을 발현한다. 임의의 구체예에서, 인플루엔자 단백질은 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 및 NS2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 구체예에서, 인플루엔자 게놈 RNA의 완전한 세트는, PA, PB1, PB2 및 NP의 존재 하에서, 개의 세포 예를 들어, MDCK 세포에서 전사될 때, 감염성 인플루엔자 단백질을 발현한다. 임의의 구체예에서, 본 방법은 인플루엔자 게놈 RNA와 함께 PA, PB1, PB2 및 NP를 도입하는 단계를 포함한다. 임의의 구체예에서, PA, PB1, PB2 및 NP는 헬퍼 바이러스에 의하여 제공된다. 임의의 구체예에서, 인플루엔자 게놈 RNA의 완전한 세트는 냉각-적응성이고, 온도-감수성이며, 약독화된 인플루엔자 바이러스로부터 유래한다.
임의의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스의 vRNA 분절을 전사하는 방법은, 1) 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드(또는 이의 활성 단편)와 PB1, PB2, NP 및 PA와 같은 인플 루엔자 단백질 중 하나 이상을 접촉시키는 단계[여기서, 상기 핵산은 상기 vRNA 분절을 암호화하는 cDNA 분자에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; 및 2) 전사된 vRNA 분절을 분리하는 단계를 포함한다. 하나의 특정 구체예에서, 헬퍼 바이러스는 본 발명의 방법에 사용된다.
하나의 측면에서, 본 발명은 분절 RNA 게놈을 포함하는 재조합 감염성 재조합 바이러스(예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스)를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 바이러스 게놈 내 각 유전자에 상응하는 바이러스 cDNA를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 발현 벡터와, 하나 이상의 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 바이러스 mRNA를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는, 개 숙주 세포 예를 들어, MDCK 세포를 배양하는 단계; 및 감염성 바이러스 군집을 분리하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 감염성 바이러스 군집은 인플루엔자 바이러스 군집이다. 하나의 구체예에서, 본 방법은 상기 배양 단계를 수행하기 이전에, 하나 이상의 발현 벡터를 개 숙주 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 방법은 상기 도입 단계를 수행하기 이전에, 하나 이상의 발현 벡터를 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구체예에서, 분절 RNA 게놈을 포함하는 재조합 감염성 재조합 바이러스(예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스)를 생산하는 방법은, a) 본 발명의 하나 이상의 발현 벡터에 바이러스 게놈 내 각 유전자에 상응하는 바이러스 cDNA를 삽입하는 단계; (b) 상기 발현 벡터와, 하나 이상의 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 바이러스 mRNA를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 숙주 세포(예를 들어, 개 의 세포) 또는 이 숙주 세포의 군집에 (예를 들어, 전기 천공법에 의하여) 도입하는 단계; (c) 상기 숙주 세포를 항온 처리하는 단계; 및 (d) 감염성 바이러스 군집을 분리하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 감염성 재조합 바이러스는 인플루엔자이다. 임의의 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스는 냉각-적응성이고, 온도-감수성이며, 약독화된 인플루엔자 바이러스이다.
하나의 구체예에서, 분절 RNA 게놈을 포함하는 감염성 재조합 바이러스(예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스)를 생산하는 방법은, a) 본 발명의 하나 이상의 발현 벡터에 바이러스 게놈 내 각 유전자에 상응하는 바이러스 cDNA를 삽입하는 단계; (b) 상기 발현 벡터를 숙주 세포(예를 들어, 개의 세포) 또는 이 숙주 세포의 군집에 (예를 들어, 전기 천공법에 의하여) 도입하는 단계; (c) 상기 숙주 세포를 항온 처리하는 단계; 및 (d) 감염성 바이러스 군집을 분리하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 감염성 재조합 바이러스는 인플루엔자이다. 임의의 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스는 냉각-적응성이고, 온도-감수성이며, 약독화된 인플루엔자 바이러스이다.
하나의 구체에에서, 본 발명은 vRNA 분절 또는 상응하는 cRNA 그리고 인플루엔자 바이러스 단백질, 구체적으로, PB1, PB2, PA 및 NA를 발현하기 위해, 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포에서 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 본 구체예에 따르면, 헬퍼 바이러스는 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있거나 또는 사용될 수 없다.
다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 각 인플루엔자 게놈 RNA를 암호화하는 하나 이상의 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열을 포함하는 다수의 핵산과, 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 및 NS2)를 암호화하는 바이러스 mRNA를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 개의 세포를 배양하는 단계; 및 이 세포로부터 상기 재조합 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 방법은 (a) 개의 세포에, 이 세포에서 게놈 또는 항원 바이러스 RNA 분절, 핵 단백질 및 RNA-의존성 중합 효소를 발현시키는 발현 벡터를 도입하여, 리보 핵 단백질 복합체를 형성할 수 있고, 바이러스 입자가 헬퍼 바이러스의 부재 하에서도 조립될 수 있도록 하는 단계; 및 (b) 바이러스가 팩키징되어 회수되도록 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 임의의 구체예에서, 상기 재조합 네거티브 가닥 바이러스는 비-분절 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 상기 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스는 분절 바이러스이다. 임의의 구체에에서, 상기 네거티브 가닥 RNA 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다.
임의의 구체에에서, 본 방법은 배양된 개의 세포에, 헬퍼 바이러스의 부재 하에서도 바이러스의 게놈 RNA 분절을 함유하는 RNP 복합체와, 바이러스 입자의 조립체를 성할 수 있는 조건 하에서, 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 게놈 또는 항원성 RNA 분절, 핵 단백질, 및 RNA-의존성 중합 효소를 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 도입하는 단계; 및 이 바이러스 입자가 생산되는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 임의의 구체예에서, 상기 발현 벡터는 바이러스의 게놈 RNA 분절을 발현 한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 개의 세포는 핵 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 단백질과, RNA-의존성 RNA 중합 효소의 서브 유닛을 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함한다. 임의의 구체예에서, 상기 발현 벡터는 핵 단백질 중 하나 이상과 상기 RNA-의존성 RNA 중합 효소의 서브 유닛을 발현시킨다. 임의의 구체예에서, 상기 발현 벡터로부터 유래하는 하나 이상의 바이러스 단백질의 발현은, 인간 아데노바이러스 제2형의 스플라이싱된 3원성 리더 서열(tripartite leader sequence)에 결합되어 있는, 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터, 또는 인간 사이토메갈로바이러스 즉시-초기 프로모터로부터 선택되는 조절 서열, 또는 이 조절 서열의 기능성 유도체의 제어를 받는다.
임의의 구체예에서, 바이러스는 A형, B형 또는 C형 인플루엔자 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 하나 이상의 모 바이러스로부터 유래하는 vRNA를 가지는 재분류체(reassortment) 바이러스이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 벡터 다수 개를, 바이러스의 복제를 허용할 수 있는 숙주 세포 군집에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 각각의 벡터에는 인플루엔자 바이러스의 일부가 통합되어 있다. 숙주 세포는 바이러스가 생육할 수 있는 조건 하에서 배양될 수 있으며, 인플루엔자 바이러스는 회수될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 인플루엔자 바이러스는 약독화, 냉각 적응 바이러스 및/또는 온도 감수성 바이러스이다. 예를 들어, 임의의 구체예에서, 벡터-유래 재조합 인플루엔자 바이러스는 약독화, 냉각 적응, 온도 감수성 바이러스일 수 있는데, 예를 들어, 살아있는 약독화 백신 예를 들어, 비강 내 백신 제형으로서 투여되기에 적당한 것이다. 예시적인 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 B/앤 아버/1/66 바이러스 게놈 예를 들어, ca B/앤 아버(Ann Arbor)/1/66 바이러스 게놈의 전부 또는 일부가 통합된 다수의 벡터를 도입함으로써 생산된다.
몇몇 구체예에서, 하나의 인플루엔자 균주의 내부 게놈 분절(예를 들어, HA 및 NA를 제외한 모든 인플루엔자 단백질을 암호화하는 게놈 분절) 6개 이상을 암호화하는 cDNA와, 상이한 인플루엔자 균주의 게놈 분절(예를 들어, HA 및 NA vRNA 분절) 하나 이상을 암호화하는 cDNA를 포함하는 다수의 벡터는 숙주 세포 군집에 도입될 수 있다. 예를 들어, 선택된 약독화, 냉각 적응성 및/또는 온도 감수성 인플루엔자 A 또는 B 균주의 내부 게놈 분절("골격(backbone)") 중 6개 이상 예를 들어, B/앤 아버/1/66의 ca, att, ts 균주 또는 인공 조작된 ca, att, ts 인플루엔자 A 또는 B 균주는, 다른 바이러스 균주로부터 유래하는 면역원성 항원을 암호화하는 하나 이상의 분절과 함께, 숙주 세포 군집에 도입될 수 있다. 통상적으로, 면역원성 표면 항원은 헤마글루티닌(HA) 및/또는 뉴라미니다제(NA) 항원 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다. 면역원성 표면 항원을 암호화하는 단일 분절이 도입되는 구체예에 있어서, 선택된 바이러스의 7개의 상보성 분절은 또한 숙주 세포로 도입된다.
임의의 구체예에서, 발현 벡터는 전기 천공법에 의하여 세포에 형질 감염된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 리포좀 형질 감염 시약의 존재 하에서 세포로 형질 감염되거나, 또는 인산칼슘 침전법에 의하여 세포에 도입된다. 임의의 구체예 에서, 발현 벡터는 플라스미드이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 상기 바이러스의 각 게놈 RNA 분절 또는 상응하는 암호화 RNA를 발현하기 위한 개별 발현 벡터를 포함한다. 임의의 구체예에서, 각 게놈 RNA 분절 또는 암호화 RNA의 발현은, 전술한 바와 같이, 개 polI 프로모터로부터 유래하는 프로모터 서열의 제어하에 있게 된다.
임의의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 게놈 분절이 통합되어 있는 플라스미드 벡터 중 다수 개는 숙주 세포의 군집에 도입된다, 예를 들어, 임의의 구체예에서, 8개의 플라스미드(각 플라스미드에는 상이한 게놈 분절이 통합되어 있음)는 숙주 세포에 완전 인플루엔자 게놈을 도입하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 소형 게놈 내부 서열이 통합되어 있는 다수의 플라스미드를 사용할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 배양된 세포에서 3개 이상의 게놈 vRNA 분절을 가지는 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 바이러스의 성장을 허용할 수 있는 세포 군집에, 상기 세포에서 게놈 vRNA 분절을 발현할 수 있는 발현 벡터의 제1 세트를 도입하여, 상기 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공하는 단계; (b) 상기 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제2 세트를 상기 세포에 도입하는 단계; 그리고 (c) 상기 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 바 이러스는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트, 제2 세트, 또는 제1 및 제2 세트 둘 다는 전기 천공법에 의하여 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트 둘 다)는 본 발명의 핵산 예를 들어, 본 발명의 개 조절 서열(예를 들어, 개 polI)을 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트 둘 다)는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 배양 세포에서 3개 이상의 게놈 vRNA 분절을 가지는 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 세포에서 게놈 vRNA 분절을 발현하여 이 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공할 수 있고, 또한 이 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수도 있는 발현 벡터 세트를, 상기 바이러스의 성장을 허용하는 세포의 군집에 도입하는 단계; (b) 이 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼17개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼3개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 전기 천공법에 의해 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절과, 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 본 발명의 핵산 예를 들어, 본 발명의 개 조절 서열(예를 들어, 개 polI)을 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트 둘 다)는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 방법은 또한 개의 세포에 의해 생산된 바이러 스 입자를, 개의 세포와 동일하거나 상이한 세포를 사용하는 하나 이상의 추가의 세포 감염 단계에 의해 증폭시키는 단계를 포함한다. 임의의 구체예에서, 본 방법은 감염성 바이러스 입자를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 구체예에서, 본 방법은 바이러스 약독화 또는 사멸 단계를 추가로 포함한다. 임의의 구체예에서, 본 방법은 약독화 또는 사멸한 바이러스 입자를 백신 조성물에 통합시키는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 바이러스를 생산하는 방법을 통하여, 바이러스 역가(본 발명의 벡터를 숙주 세포에 도입한 후 24시간, 36시간 또는 48시간 경과시의 역가)를 0.1×103 PFU/㎖ 이상, 또는 0.5×103 PFU/㎖ 이상, 또는 1.0× 103 PFU/㎖ 이상, 또는 2×103 PFU/㎖ 이상, 또는 3×103 PFU/㎖ 이상, 또는 4×103 PFU/㎖ 이상, 또는 0.1∼l×103 PFU/㎖, 또는 1×103∼5×103 PFU/㎖, 또는 5×103 PFU/㎖ 이상으로 만들 수 있다.
몇몇 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스에 해당한다. 몇몇 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스에 해당한다. 몇몇 구체예에서, 본 방법은 개체에 투여시 예를 들어, 개체에 비강 내 투여시 면역 반응을 유도할 수 있는 재조합 및/또는 재분류 인플루엔자 바이러스를 회수하는 단계를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 바이러스는 투여 이전에 불활성화되며, 기타 구체예에서, 살아있는 약독화 바이러스가 투여된다. 본 발명의 방법에 따라서 제조된 재조합 및 재분류 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스도 또한 본 발명 의 특징을 이룬다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 약독화된 인플루엔자 바이러스, 냉각 적응된 인플루엔자 바이러스, 온도 감수성 인플루엔자 바이러스 또는 이와 같은 바람직한 특성들을 임의로 조합하여 가지는 바이러스를 포함한다. 하나의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B/앤 아버/1/66 균주 바이러스 예를 들어, B/앤 아버/1/66의 냉각 적응성, 온도 감수성, 약독화 균주를 포함한다. 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A/앤 아버/6/60 균주 바이러스 예를 들어, A/앤 아버/6/60의 냉각 적응성, 온도 감수성, 약독화 균주를 포함한다.
임의로, 재분류 바이러스는 백신 생산과 관련된 바람직한 특성들에 대해서 선택된 바이러스 균주의 6개의 내부 vRNA를 암호화하는 벡터를, 선택된 균주 예를 들어, 병원성 균주의 표면 항원(HA 및 NA)의 vRNA 분절을 암호화하는 벡터와 함께 도입시킴으로써 생산된다. 예를 들어, 상기 HA 분절은, 통상적으로 백신 생산 시와 같이, 바람직하게는 병인론적으로 관련된 H1, H3 또는 B 균주로부터 선택될 수 있다. 이와 유사하게, 상기 HA 분절은 예를 들어, H2 균주(예를 들어, H2N2), H5 균주(예를 들어, H5N1) 또는 H7 균주(예를 들어, H7N7)와 같은 급 발생한 병원성 균주로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 제1 균주의 7개의 상보성 유전자 분절은 HA 또는 NA 암호화 분절과 함께 도입된다. 임의의 구체예에서, 내부 유전자 분절은 인플루엔자 B/앤 아버/1/66 또는 A/앤 아버/6/60 균주로부터 유래된다. 또한, 변형된 HA 유전자를 포함하는 인플루엔자 바이러스(예를 들어, H5N1, H9N2, H7N7 또는 HxNy(여기서, x=1∼9이고, y=1∼15임)가 생산될 수 있다. 예를 들어, HA 유전자는 다가 염기성 절단 위치를 제거함으로써 변형될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 개의 세포는 신장 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 개의 신장 세포는 MDCK 세포이다. 기타 구체예에서, 상기 세포는 Vero 세포, Per.C6 세포, BHK 세포, PCK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포, 293 세포(예를 들어, 293T 세포), 및 COS 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 상기 세포주 중 2개 이상을 포함하는 공동 배양 혼합물 예를 들어, COS 세포와 MDCK 세포의 배양 혼합물 또는 293T 세포와 MDCK 세포의 배양 혼합물은 숙주 세포의 군집을 구성한다.
본 발명의 인플루엔자 벡터를 포함하는 숙주 세포는 바이러스의 복제 및 조립을 허용하는 조건 하에서 배양액 중에서 생육할 수 있다. 통상적으로, 인플루엔자 플라스미드가 통합되어 있는 숙주 세포는 37℃ 이하의 온도, 바람직하게는 35℃ 이하의 온도에서 배양될 수 있다. 임의의 구체예에서, 세포는 32∼35℃의 온도에서 배양된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 약 32∼약 34℃ 예를 들어, 약 33℃에서 배양된다. 바이러스가 특정 역가를 나타내도록 복제할 수 있는 적당한 시간 동안 배양한 후, 재조합 바이러스를 회수할 수 있다. 임의로, 회수된 바이러스는 불활성화될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스를 조작하여, 이 바이러스의 성장이, 특정 세포 유형 예를 들어, MRC-5, WI-38, FRhL-2, PerC6, 293, NIH 3T3, CEF, CEK, DF-1, Vero, MDCK, MvlLu, 인간 상피 세포 및 SF9 세포 유형에 국한되도록 할 수 있다. 하나의 구체예에서, 바이러스의 성장은 제한하되, 인플루엔 자 바이러스가 인간의 1차 세포(예를 들어, PerC6)에서 생육할 수 없게 된다. 다른 구체예에서, 성장은, 인플루엔자 바이러스가 인간 상피 세포에서 생육할 수 없도록 제한된다. 당 업자는 성장 제한 표현형이 하나 이상의 부가 표현형 예를 들어, 냉각 적응성, 온도 감수성 및 약독성 등과 함께 나타날 수 있음을 알게 될 것이다. 또한, 성장 제한 표현형에 관여하는 돌연 변이도 예를 들어, 전술한 바와 같은 부가적 표현형에 기여하고/기여하거나 이에 관련될 수 있음도 알 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 배양액 중 MDCK 세포로부터, 재조합체 또는 재분류체인 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스(즉, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 바이러스의 야생형 및 변이체 균주)를 회수하는 신규 방법을 제공한다. 임의의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 게놈이 통합되어 있어서 본 발명의 개 조절 서열에 의해 전사가 제어되는 다수의 벡터는, MDCK 세포 군집에 전기 천공되어 도입된다. 이 세포는 바이러스 복제를 허용하는 조건 하에서 생육할 수 있는데, 예를 들어, 냉각 적응되고, 약독화되었으며, 온도 감수성인 바이러스 균주의 경우, MDCK 세포는 37℃ 이하의 온도, 바람직하게는 35℃ 이하의 온도에서 생육한다. 통상적으로, 세포는 32∼35℃의 온도에서 배양된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 약 32∼34℃, 예를 들어, 약 33℃의 온도에서 배양된다. 임의로, (예를 들어, 백신 생산에 있어서) MDCK 세포는 어떠한 동물 유래 생성물이 없는 무 혈청 배지 중에서 생육한다.
전술한 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 게놈 플라스미드가 통합된 숙주 세포를 배양한 후에 회수될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 회수된 바이러스는 재조합 바이러스이다. 몇몇 구체예에서, 바이러스는 하나 이상의 바이러스 모 균주로부터 받은 유전자를 가지는 재분류 인플루엔자 바이러스이다. 임의로, 회수된 재조합 또는 재분류 바이러스는 또한 배양 세포 또는 달걀 내에서 계대 배양함으로써 증식되기도 한다.
임의로, 회수된 바이러스는 불활성화될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 회수된 바이러스는 인플루엔자 백신을 포함한다. 예를 들어, 회수된 인플루엔자 백신은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B의 선택된 균주로부터 유래하는 HA 및/또는 NA 항원을 가지는 재분류 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 6:2 또는 7:1 재분류 바이러스)일 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 HA 또는 NA 항원은 변형된 것이다. 임의의 바람직한 구체예에서, 재분류 인플루엔자 바이러스는 약독화된 표현형을 나타낸다. 임의로, 재분류 바이러스는 냉각 적응성 및/또는 온도 감수성 예를 들어, 약독화, 냉각 적응성 또는 온도 감수성 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스이다. 이러한 인플루엔자 바이러스는 예를 들어, 선택된 균주 예를 들어, 병원성 인플루엔자 균주에 특이적인 면역 반응의 예방제 생산용인, 살아있는 약독화 백신으로서 유용하다. 본 발명의 방법에 의하여 생산된 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 약독화된 재분류 바이러스는 본 발명의 부가적인 특징을 이룬다.
다른 측면에서, 본 발명은 재조합 인플루엔자 바이러스 백신을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명의 개 조절 서열(예를 들어, 개의 RNA polI 프로모터)에 의하여 전사가 제어되는, 인플루엔자 바이러스 게놈이 통합된 다수의 백터를, 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용할 수 있는 숙주 세포 군집에 도입하는 단계, 이 숙주 세포를 35℃ 이하의 온도에서 배양하는 단계, 및 개체에 투여시 면 역 반응을 유도할 수 있는 인플루엔자 바이러스를 회수하는 단계를 포함한다. 백신은 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 균주 바이러스를 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 인플루엔자 백신 바이러스는 약독화 인플루엔자 바이러스, 냉각 적응된 인플루엔자 바이러스 또는 온도 감수성인 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 바람직한 특성들을 조합하여 가진다. 하나의 구체예에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B/앤 아버/6/60 균주 바이러스를 포함한다. 대안적으로, 백신은 ca A/앤 아버/6/60 또는 ca B/앤 아버/1/66의 특징적인 생물 특성에 영향을 미치는 하나 이상의 치환된 아미노산 예를 들어, 이 균주의 독특한 아미노산이 통합되어 있는, 인공 조작된 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법에 의하여 생산된 재조합 바이러스 군집 (또는 이로부터 유래하는 바이러스)을 포함하는 백신이 제공된다. 특정 구체예에서, 백신은 본 방법에 의해 생산된 살아있는 바이러스를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 백신은 본 방법에 의하여 생산된 사멸 또는 불활성화 바이러스를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 백신은 본 방법에 의해 생산된, 살아있는, 사멸된 또는 불활성화된 바이러스로부터 제조된 면역원성 조성물을 포함한다. 기타 특정 구체예에서, 백신은 본 방법에 의하여 생산된, 살아있으며, 약독성이고, 냉각 적응성이며, 온도 감수성인 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 면역원성 조성물을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 백신은 본 방법에 의해 생산된, 살아있고, 약독성이며, 냉각 적응성이고, 온도 감수성인 인플루엔자 바이러스 또는 이로부터 유래하는 바 이러스를 포함한다.
도 1은 PerC6 및 MDCK 세포에서의 wt 및 ca B 균주(B/베이징(Beijing)/243/97)의 성장 곡선을 제시하고 있는 것으로서; 여기서, 각 시점에서의 바이러스 역가는 TCID50 검정법에 의해 측정되었다.
도 2는 PerC6 및 MDCK 세포에서의 wt 및 ca A 균주(A/시드니(Sydney)/05/97 및 A/베이징/262/95)의 성장 곡선을 제시하고 있는 것으로서; 여기서, 각 시점에서의 바이러스 역가는 TCID50 검정법에 의해 측정되었다.
도 3은 PerC6 및 MDCK 세포에서의 wt 및 ca A 균주(A/앤 아버/6/60)의 성장 곡선을 제시하고 있는 것으로서; 여기서, 각 시점에서의 바이러스 역가는 TCID50 검정법에 의해 측정되었다.
도 4는 PerC6 및 MDCK 세포에서의 A/시드니의 바이러스 RNA를 실시간 분석한 결과를 제시하는 것으로서, 이 분석에는 바이러스 RNA의 M 분절에 특이적인 택맨(Taqman)®(Roche Molecular Systems; Palo Alto, CA) 프로브를 사용하였다.
도 5는 MDCK 세포에서의 ca A/베트남(Vietnam)/1203/2004(H5N1)의 성장 곡선을 제시하는 것으로서; 여기서, 각 시점에서의 바이러스 역가는 TCID50 검정법에 의해 측정되었다.
도 6은 8-플라스미드 회수 기술에 의하여 생산된 7:1 재분류체로서 각 인플루엔자 유전자 분절의 회수 결과를 도형으로 제시한 것이다.
도 7은 PerC6 세포에서의 7:1 재분류체 각각에 대한 성장 곡선을 제시하는 것으로서; 여기서, 각 시점에서의 바이러스 역가는 TCID50 검정법에 의해 측정되었다.
도 8은 개의 RNA polI 조절 서열을 포함하는 EcoRI 단편의 제한 맵을 제시하는 것이다.
도 9a∼도9c는 개의 게놈 DNA로부터 클로닝된 약 3.5 kb의 핵산의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)을 제시하는 것으로서, 이는 18s rRNA 유전자(제시된 서열 내 1804번 뉴클레오티드로부터 시작됨)의 최소한의 일부를 암호화하는 것이다.
도 10은 본 발명의 발현 벡터를 용이하게 제조할 수 있도록 작성한 플라스미드 pAD3000의 맵을 제시하는 것이다.
도 11은 미니-게놈 검정법(mini-genome assay)에 사용된 MDCK polI 프로모터 구조물을 도형으로 제시한 것이다.
도 12는 미니-게놈 검정법의 결과를 제시하는 것이다. -1, +1 및 +2 위치의 MDCK 세포 polI 프로모터 구조물로부터 발생한 EGFP 신호를 각각 좌측 상부, 중간 상부 및 우측 상부 패널에 나타냈다. (-) 프로모터 대조군은 백그라운드 수준의 형광도만 나타내었다(좌측 하부) (+) 대조군 세포는 또한 CMV-EGFP 구조물로 형질 감염시켰다(우측 하부).
인플루엔자 바이러스의 플라스미드 회수법은 일반적으로, 바이러스 단백질을 발현하고 바이러스 게놈 RNA를 전사하기 위해 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 바이러스 게놈 RNA의 전사는 일반적으로 RNA polI 효소를 사용하여 수행되는데, 이 효소는 바이러스 게놈으로서 사용되기에 적당한 말단부를 가지는 전사체를 생산한다. 그러므로, RNA polI 프로모터 및 기타 조절 요소들은 플라스미드 회수시 게놈 RNA의 전사를 개시하는데 사용된다. 불행하게도, RNA polI 프로모터는 종 특이성이 매우 크다. 즉, 하나의 종으로부터 유래하는 RNA polI은 관련성이 없는 종으로부터 유래하는 RNA polI 프로모터에 효율적으로 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없다. 그러므로, RNA polI 프로모터의 활용 가능성은 플라스미드 회수법이 수행될 수 있는 세포에 한정된다. 본 발명이 개발되기 이전, 플라스미드 회수법은 개의 세포에서는 행해질 수 없었다. 처음으로, 개 세포에서 행해진 플라스미드 회수법은 다음과 같이 본 발명의 내용을 바탕으로 하여 수행될 수 있는 것이다.
그러므로, 제1 측면에서, 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열을 포함하는 본 발명의 분리된 핵산이 제공된다. 임의의 구체예에서, 상기 조절 서열은 프로모터이다. 하나의 구체예에서, 상기 조절 서열은 개의 polI 프로모터 서열이다. 다른 구체예에서, 상기 조절 서열은 클로닝된 바이러스 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 또 다른 구체예에서, 클로닝된 바이러스 cDNA는 음성 또는 양성 가닥 바이러스의 바이러스 RNA 또는 이와 상응하는 cRNA를 암호화한다. 하나의 구체예에서, 클로닝된 바이러스 cDNA는 인플루엔자 바이러스의 게놈 바이러스 RNA(또는 이와 상응하는 cRNA)를 암호화한다.
하나의 특정 구체에에서, 본 발명의 분리된 핵산은 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 임의의 구체예에서, 전사 종결 서열은 polI 종결 서열이다. 임의의 구체예에서, 전사 종결 서열은 인간, 원숭이 또는 개의 polI 종결 서열이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 인간, 영장류, 마우스 또는 개의 polI 폴리펩티드에 결합하고, 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 100% 이상, 또는 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 활성 단편 예를 들어, 개의 RNA polI 조절 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 활성 단편은, 적당한 폴리펩티드(예를 들어, 인간, 영장류, 마우스 또는 개의 polI 폴리펩티드)와, 상기 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제2의 폴리뉴클레오티드 서열의 존재 하에서, 전사를 개시하는 능력을 추가로 보유한다. 하나의 구체예에서, 서열 번호 1∼서열 번호 19에 제시된 핵산의 "기능적 활성 단편"은 본원에 개시된 바와 같이, 서열 번호 1∼서열 번호 19의 전장 서열의 기능적 활성을 하나 이상 보유한다. 예를 들어, 서열 번호 1에 제시된 조절 서열의 기능적 활성 단편은, 조절 서열 단편이 전사될 핵산에 작동 가능하도록 결합되어 있어서, 시험관 내 또는 생체 내 적당한 단백질이 존재할 때에 전사되도록 제공된다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 인간, 영장류, 마우스 또는 개의 polI 중합 효소에 결합하고/결합하거나, 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 100% 이상, 또는 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65% 동일한, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편 예를 들어, 개의 RNA polI 조절 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편은 또한 적당한 폴리펩티드(예를 들어, 인간, 영장류, 마우스 또는 개의 polI 폴리펩티드)와, 상기 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 제2의 폴리뉴클레오티드 서열의 존재 하에서, 전사를 개시하는 능력을 추가로 보유한다.
임의의 측면에서, 본 발명은 개의 RNA polI 프로모터를 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 바람직하게, 개의 RNA polI 프로모터는 전사될 핵산 예를 들어, 인플루엔자 게놈 RNA에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 핵산을 개의 세포로 도입시키면, 인플루엔자 게놈 RNA가 전사되며, 적당한 인플루엔자 단백질이 존재할 경우, RNA 전사체는 감염성 인플루엔자 바이러스로 팩킹될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 개 RNA 조절 서열(예를 들어, 개의 RNA polI 프로모터)을 포함하는 분리된 핵산이 제공되는데, 여기서, 상기 조절 서열은 전사될 핵산에 작동 가능하도록 결합되어 있어서, 시험관 내 또는 생체 내에서 적당한 단백질이 존재할 때 전사된다. 하나의 구체예에서, 상기 조절 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 핵산은 인플루엔자 vRNA 분절이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 개 세포 배양액 중에서 전적으로 클로닝된 바이러스 DNA로부터 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법 및 이를 위한 벡터를 제공한다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스는 본 발명의 개 RNA 조절 서열(예를 들어, 개의 polI 프로모터)의 전사 제어 하에서, 각각의 바이러스 게놈을 암호화하는 클로닝된 cDNA를 포함하는 다수의 벡터를 개 숙주 세포에 도입하고, 이 개 세포를 배양한 후, 이 세포 배양액으로부터 생산된 재조합 인플루엔자 바이러스를 분리함으로써 생산될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 게놈을 암호화하는 벡터가 개의 세포로 (예를 들어, 전기 천공법에 의해) 도입될 때, 백신으로서 적당한 재조합 바이러스는 표준적인 정제 방법에 의해 회수될 수 있다. 벡터 시스템과 본 발명의 방법을 이용함으로써, 백신 생산과 관련하여 바람직한 특성을 갖는 것으로서 선택된 균주의 6개의 내부 유전자 분절이 통합되어 있는 재분류 바이러스와, 선택 균주 예를 들어, 병원성 균주로부터 유래하는 면역원성 HA 및 NA 분절은 조직 배양액 중에서 신속하고 효율적으로 생산될 수 있다. 그러므로, 본원에 개시된 시스템과 방법은 재조합 및 재분류 인플루엔자 A 및 B 바이러스 예를 들어, 백신 예를 들어, 살아있는 약독화 백신으로서 적당한 바이러스를 개 세포 배양액 중에서 신속하게 생산하는데 유용하다. 본 발명의 방법에 의하여 생산된 백신은 비강 내 또는 근육 내 전달될 수 있다.
통상적으로, 단일의 마스터 공여 바이러스(master donor virus; MDV) 균주는 A 및 B 아형 각각에 대해 선택된다. 살아있는 약독화 백신의 경우, 상기 마스터 공여 바이러스 균주는 통상적으로, 백신 생산과 관련된 바이러스 균주의 바람직한 특성 예를 들어, 온도 감수성, 냉각 적응성 및/또는 약독성이 있는 것으로 선택된다. 예를 들어, 대표적인 마스터 공여 균주로서는 각각, A/앤 아버/6/60 및 B/앤 아버/1/66의 온도 감수성, 약독화 및 냉각 적응성 균주를 포함한다.
예를 들어, 선택된 마스터 공여 A형 바이러스(MDV-A) 또는 마스터 공여 B형 바이러스(MDV-B)는 바이러스 게놈을 구성하는, 클로닝된 바이러스 cDNA 다수 개로부터 생산될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 재조합 바이러스는 8개의 클로닝된 바이러스 cDNA로부터 생산된다. PB2, PB1, PA, NP, HA, NA, M 및 NS의 선택된 MDV-A 또는 MDV-B 서열을 제시하는 8개의 바이러스 cDNA는 발현 벡터 예를 들어, 2 방향성 발현 벡터 예를 들어, 플라스미드(예를 들어, pAD3000)에 클로닝되며, 이때 바이러스 게놈 RNA는 하나의 사슬로부터 유래하는 개의 RNA 중합 효소 I(polI) 프로모터로부터 전사될 수 있으며, 바이러스 mRNA는 다른 사슬로부터 유래하는 RNA 중합 효소 II(polII) 프로모터로부터 합성될 수 있다. 임의로, 임의의 유전자 분절 예를 들어, HA 분절은 예를 들어, 다중-기본 절단 위치(multi-basic cleavage site)를 포함하도록 변형될 수 있다.
이후, 감염성 재조합 MDV-A 또는 MDV-B 바이러스는, 8개의 바이러스 cDNA를 보유하는 플라스미드를 적당한 숙주 세포 예를 들어, MDCK 세포에 형질 감염시킨 이후에 회수된다. 본원에 개시된 플라스미드 및 방법을 이용할 때, 본 발명은 상이한 해당 유형(A 또는 B) 인플루엔자 바이러스로부터 유래하는 HA 및 NA와 함께, 선택된 바이러스(예를 들어, MDV-A, MDV-B, PR8)의 6개의 내부 유전자(PB1, PB2, PA, NP, M 및 NS)를 공동 형질 감염시켜, 예를 들어, 6:2 재분류 인플루엔자 백신을 생산하는데 유용하다. 예를 들어, HA 분절은, 백신 생산에서 통상적으로 수행되는 방식과 같이, 병인론적으로 상관된 H1, H3 또는 B 균주로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이와 유사하게, HA 분절은 병인론적 균주 예를 들어, H2 균주(예를 들어, H2N2), H5 균주(예를 들어, H5N1) 또는 H7 균주(예를 들어, H7N7)와 밀접하게 관련된 균주로부터 선택될 수 있다. MDV의 7개의 게놈 분절과, 선택된 균주(7:1 재분류체)의 HA 또는 NA 유전자가 통합되어 있는 재분류체도 생산될 수 있다. 뿐만 아니라, 이 시스템은 백신 생산과 관련하여, 표현형적 특성 예를 들어, 약독성(att), 냉각 적응성(ca) 및 온도 감수성(ts)의 분자학적 기초를 평가하는데 유용하다.
정의
특별히 한정하지 않는 한, 모든 과학 용어 및 기술 용어들은 그 용어들이 속하는 업계에서 일반적으로 사용되는 의미와 동일한 의미를 가지는 것으로 이해해야 할 것이다. 본 발명에 사용되는 다음과 같은 용어에 관하여는 이하에 정의하였다.
"핵산", "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"이란 용어는, 단일 사슬 또는 이중 사슬인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체, 또는 이의 키메라 또는 유사체를 의미하는 것이다. 임의로, 본원에 사용된 상기 용어에는, 천연 생성 뉴클레오티드 유사체가 천연 생성 뉴클레오티드(예를 들어, 펩티드 핵산)와 유사한 방식으로 단일 사슬 핵산에 혼성화한다는 점에서, 천연 생성 뉴클레오티드의 본질적인 특성을 갖는 상기 유사체의 중합체를 포함하기도 한다. 특별히 한정하지 않는 한, 본 발명의 특정 핵산 서열로서는 명백히 표시된 서열 이외에도, 이의 상보성 서열을 포함한다.
"유전자"란 용어는, 넓은 의미로서 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산을 의미하는 것이다. 그러므로, 유전자는 암호화 서열 및/또는 이 암호화 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. "유전자"란 용어는, 특정의 게놈 서열에도 적용될 뿐만 아니라, 이 게놈 서열에 의해 암호화되는 cDNA 또는 mRNA에도 적용된다.
유전자는 또한 예를 들어, 다른 단백질에 대한 인지 서열을 형성하는 비-발현형 핵산 분절을 포함한다. 비-발현형 조절 서열로서는 조절 단백질 예를 들어, 전사 인자가 결합하여, 이것과 인접하여 존재하거나 또는 근접하여 존재하는 서열을 전사시키는 "프로모터" 및 "인핸서"를 포함한다. "조직 특이적" 프로모터 또는 인핸서란, 특정 조직형(들) 또는 세포형(들)에 있어서 전사를 조절하는 서열을 의미한다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열"이란, 적당한 전사-관련 효소 예를 들어, RNA 중합 효소가 조건 예를 들어, 배양 또는 생리적 조건 하에 작용을 할 때, DNA 조절 부위와 작동 가능하도록 결합되어 있는 핵산 서열의 전사를 개시할 수 있는 이 DNA 조절 부위를 의미하는 것이다. 프로모터는 전사가 개시되는 핵산 서열의 상류 또는 하류에 존재할 수 있다. cDNA의 상류에 위치하는 프로모터 서열은 그것의 3' 말단부에서 전사 개시 위치와 경계를 형성하여, 백그라운드 수준 이상의 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 염기 또는 요소를 최소한으로 포함하는 상류(5' 방향)로 확장되어 존재한다. cDNA의 하류에 위치하는(그래서 (-)RNA를 발현하는) 프로모터 서열은 그것의 5' 말단부에서 전사 개시 위치와 경계를 형성하여, 백그라운드 수준 이상의 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 염기 또는 요소를 최소한으로 포함하는 하류(3' 방향)로 확장되어 존재한다. 본 발명의 2 방향 시스템은 상류 및 하류 프로모터 둘 다를 포함하는데; 1 방향 시스템은 상류 프로모터만 포함한다. 프로모터 서열 내부 또는 이와 인접한 부위에서는 전사 개시 위치(편리하게는 예를 들어, 뉴클레아제 S1에 의해 맵핑함으로써 한정되는 위치)가 발견되며, 또한 RNA 중합 효소의 결합을 촉진, 조절, 강화 또는 이에 관여하는 단백질 결합 도메인(공통 서열)을 포함하기도 한다.
본원에서, "개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열" 또는 "개의 RNA 중합 효소 I 조절 요소"(또는 이의 기능적 활성 단편)란, 개의 RNA 중합 효소 I과, 관련 전사 인자가 조건 예를 들어, 배양 또는 생리적 조건 하에 존재하여, 이 효소가 기능을 갖게 되는 때, 이 조절 서열 또는 조절 요소와 작동 가능하도록 결합되어 있는 핵산 서열의 전사를 증가시킬 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열의 예로서는, 그 조절 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 핵산의 전사를 백그라운드 수준 이상으로 증가시키는 개 RNA 중합 효소 I 프로모터와, 개의 중합 효소 I 프로모터와 작동 가능하도록 결합되어 있는 핵산의 전사를 개의 RNA 중합 효소 I 인핸서의 부재 하에서 관찰되는 수준 이상으로 증가시키는 개의 RNA 중합 효소 I 인핸서를 포함한다. 개의 RNA 중합 효소 I 조절 요소를 동정하기 위한 한 가지 테스트 방법으로서는, 목적 핵산에 작동 가능하도록 결합되어 있는 추정 개 RNA 중합 효소 I 조절 요소를, 적당한 개 세포 예를 들어, MDCK 세포에 도입하고, 통상의 검정법 예를 들어, 노던 블럿팅을 이용하여 목적 핵산의 전사 여부를 검출하는 방법이 있다. 추정 개 RNA 중합 효소 I 조절 요소의 존재 및 부재 하에서 핵산의 전사 수준을 비교함으로써, 당 업자는 이 핵산 요소가 개의 RNA 중합 효소 I 조절 요소인지 여부를 확인할 수 있다.
"벡터"란 용어는, 이종 핵산 서열을 세포에 도입하는데 사용될 수 있는 플라스미드, 바이러스 벡터, 재조합 핵산 및 cDNA를 의미하는 것이다. 본 발명의 벡터는 통상적으로 본 발명의 조절 서열을 포함할 것이다. 벡터는 자발적으로 복제할 수 있거나, 또는 자발적으로 복제할 수 없다. 벡터는 또한 자발적으로 복제하지 않는, 나출 RNA 폴리뉴클레오티드, 나출 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일한 사슬 내에 DNA와 RNA 둘 다로 이루어져 있는 폴리뉴클레오티드, 폴리-리신-컨쥬게이트화 DNA 또는 RNA, 펩티드-컨쥬게이트화 DNA 또는 RNA, 리포좀-컨쥬게이트화 DNA 등일 수도 있다. 가장 일반적으로, 본 발명의 벡터는 플라스미드이다.
"발현 벡터"란, 벡터 내에 통합된 핵산의 복제 예를 들어, 전사를 촉진할 수 있는 벡터 예를 들어, 플라스미드를 의미하는 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 조절 서열을 포함할 것이다. 발현 벡터는 자발적으로 복제할 수 있거나, 또는 자발적으로 복제할 수 없다. 통상적으로, 발현될 핵산은 프로모터 및/또는 인핸서에 "작동 가능하도록 결합되어"있으며, 또한 프로모터 및/또는 인핸서에 의하여 전사 조절 작용이 제어된다.
"2 방향 발현 벡터(bi-directional expression vector)"는 통상적으로, 2개의 프로모터 간에 존재하는 핵산에 대하여 반대 방향으로 배향되어 있어서, 발현이 양쪽 방향으로 개시될 수 있고, 그 결과, 예를 들어, 플러스(+) 또는 센스 사슬 RNA와, 음성(-) 또는 역배열 가닥 RNA를 둘 다 전사시키는, 2개의 대안적인 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다. 대안적으로, 상기 2방향 발현 벡터는 앰비센스(ambisense) 벡터로서, 바이러스 mRNA 및 바이러스 게놈 RNA(cRNA)가 동일한 사슬로부터 발현되는 벡터일 수 있다.
본 발명의 내용 중, "분리된"이란 용어는, 생물학적 물질 예를 들어, 핵산이나 단백질이, 천연의 상태에서 일반적으로 동반하거나 또는 상호 작용하는 성분으로부터 실질적으로 분리된 상태를 의미하는 것이다. 분리된 물질은 임의로는 천연 환경 예를 들어, 세포에서 특정 물질과 함께 발견되지 않는 물질을 포함한다. 예를 들어, 만일 어떤 물질이 천연 환경 예를 들어, 세포에 존재하면, 그 물질은 이와 같은 환경에서 발견되는 물질에는 원래 존재하지 않던, 세포 내 위치(예를 들어, 게놈 또는 유전 요소)에 존재하는 것이다. 예를 들어, 만일 천연 생성 핵산이 그 핵산이 원래 존재하지 않던 게놈 내 위치에 비-천연 생성 수단(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 또는 앰플리콘)에 의해 도입되면, 천연 생성 핵산(예를 들어, 암호화 서열, 프로모터 및 인핸서 등)은 분리된다. 이러한 핵산을 "이종" 핵산이라고도 부른다.
"재조합체"란 용어는, 특정 물질(예를 들어, 핵산 또는 단백질)이 인간의 개입에 의해 인공적으로 또는 합성에 의해서(비-천연적으로) 변형된 것을 의미하는 것이다. 변형은 특정 물질이 원래 있던 환경 또는 상태로 존재하거나, 또는 이로부터 분리되어 일어날 수 있다. 구체적으로, 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 바이러스에 관하여 언급할 때, 바이러스는 그것이 재조합 핵산이 발현됨에 따라서 생산될 때, 재조합체인 것이다.
"재분류체(reassortant)"란 용어는, 바이러스에 관하여 언급할 경우, 바이러스가 하나 이상의 모 바이러스 균주 또는 공급원으로부터 유래하는 유전 성분 및/또는 폴리펩티드 성분을 포함하는 경우를 의미하는 것이다. 예를 들어, 7:1 재분류체는 제1 모 바이러스로부터 유래하는 7개의 바이러스 게놈 분절(또는 유전자 분절)과, 제2 모 바이러스로부터 유래하는 하나의 상보성 바이러스 게놈 분절 예를 들어, 헤마글루티닌 또는 뉴라미니다제를 암호화하는 하나의 상보성 바이러스 게놈 분절을 포함하는 것이다. 6:2 재분류체란, 가장 일반적으로 제1 모 바이러스로부터 유래하는 6개의 내부 유전자인 6개의 게놈 분절과, 상이한 모 바이러스로부터 유래하는 2개의 상보성 분절 예를 들어, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제를 포함하는 것이다.
이종 핵산 또는 분리된 핵산에 관하여 언급할 때, "도입된"이란 용어는, 핵산이 세포의 게놈(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA) 내에 통합되어, 자발적 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현될 수 있을 경우(예를 들어, 형질 감염된 mRNA일 경우), 핵산이 진핵 생물 세포 또는 원핵 생물 세포로 통합됨을 의미하는 것이다. 상기 용어는 "감염", "형질 감염", "형질 전환" 및 "형질 도입"과 같은 방법에도 적용된다. 본 발명의 내용 중 다양한 방법들 예를 들어, 전기 천공법, 인산칼슘 침전법, 지질 매개 형질 감염법(리포팩션) 등이 핵산을 원핵 생물 세포에 도입하는데 사용될 수 있다.
"숙주 세포"란 용어는, 핵산 예를 들어, 벡터를 흡수할 수 있거나 흡수하였으며, 이 핵산의 복제 및/또는 발현, 그리고 임의로는 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 암호화된 생성물 및/또는 바이러스의 생산을 허용하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵 생물 세포 예를 들어, 이.콜라이 또는 진핵 생물 세포 예를 들어, 효모, 곤충, 양서류, 조류 또는 포유동물 세포 예를 들어, 인간 세포일 수 있다. 본 발명의 내용 중 대표적인 숙주 세포로서는 Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장) 세포, Per.C6 세포(인간 배아 망막 세포), BHK(새끼 햄스터 신장) 세포, 발달 초기 병아리 신장(PCK) 세포, 매딘-다비 개 신장(MDCK) 세포, 매딘-다비 소 신장(MDBK) 세포, 293 세포(예를 들어, 293T 세포), 및 COS 세포(예를 들어, COS1, C0S7 세포)를 포함한다. 숙주 세포란 용어는, 세포의 조합물 또는 혼합물 예를 들어, 상이한 세포 유형 또는 세포주(예를 들어, Vero와 CEK 세포)의 혼합 배양액을 포함하는 의미이다. 전기 천공된 SF Vero 세포의 공동 배양에 관하여는, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는, 2004년 12월 22일자로 출원된 PCT/US04/42669에 개시되어 있다.
본원에서 "인공 조작된"이란 표현은, 바이러스, 바이러스 핵산 또는 바이러스에 의해 암호화된 생성물 예를 들어, 폴리펩티드 또는 백신이, 재조합 방법 예를 들어, 위치 배향 돌연 변이 유발법, PCR 돌연 변이 유발법 등에 의해 도입된 하나 이상의 돌연 변이를 포함하는 경우를 의미하는 것이다. 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연 변이 및/또는 아미노산 치환을 포함하는 바이러스(또는 바이러스 성분이나 생성물)에 관하여 언급할 때, "인공적으로 조작된"이란 표현은, 바이러스(또는 바이러스 성분이나 생성물)를 암호화하는 바이러스 게놈 또는 게놈 분절이, 비-재조합 방법(예를 들어, 25℃에서 점진적으로 계대 배양시키는 방법)에 의해 생산된 천연 생성 공급원 예를 들어, 천연 생성 바이러스 균주 또는 이전에 제조하여 둔 실험실용 균주 예를 들어, 야생형 또는 냉각 적응 A/앤 아버/6/60 또는 B/앤 아버/1/66 균주로부터 유래하지 않는 경우를 의미하는 것이다.
"서열 동일성%"란 용어는, 본원에서 "동일성%"라는 용어와 호환되어 사용되는 것으로서, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬하였을 때, 2개 이상의 펩티드 서열 간 아미노산 서열 동일성 수준 또는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 간 뉴클레오티드 서열 동일성 수준을 의미하는 것이다. 예를 들어, 본원에 있어서, 동일성%가 80%란 의미는, 소정의 알고리즘에 의해 측정된 서열 동일성%가 80%란 의미이며, 또한 소정의 서열이 상이한 길이를 가지는 다른 서열과 80% 이상 동일하다는 의미이다. 서열 동일성의 대표적인 수준으로서는 소정의 서열에 대하여 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 98% 이상인 경우를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"서열 상동성%"란 용어는 본원에서 "상동성%"와 호환되어 사용되는 용어로서, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬하였을 때, 2개 이상의 펩티드 서열 간 아미노산 서열 상동성 수준 또는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 간 뉴클레오티드 서열 상동성 수준을 의미하는 것이다. 예를 들어, 본원에 있어서, 상동성%가 80%란 의미는, 소정의 알고리즘에 의해 측정된 서열 상동성%가 80%란 의미이며, 또한 소정의 서열의 상동체가 소정의 서열 길이에 대한 서열 상동성이 80% 이상이라는 의미이다. 서열 상동성의 대표적인 수준으로서는 소정의 서열에 대하여 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 98% 이상인 경우를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
2개의 서열들 간 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 대표적인 컴퓨터 프로그램으로서는 BLAST 프로그램 군 예를 들어, BLASTN, BLASTX 및 TBLASTX, BLASTP 및 TBLASTN(인터넷상 NCBI 웹사이트를 통하여 공중이 이용 가능함)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 문헌[Altschul외 다수, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10(공개된 디폴트 세팅 즉 매개 변수(w = 4, t = 17)에 대한 구체적인 참고 문헌), 및 Altschul외 다수, 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]을 참조하시오. 서열 검색은 통상적으로 GenBank 단백질 서열 및 기타 공중이 이용 가능한 데이터베이스 내 아미노산 서열에 대하여 소정의 아미노산 서열을 평가할 때 사용되는 BLASTP 프로그램을 이용하여 수행된다. 상기 BLASTX 프로그램은 모든 해독 틀 내에서 번역된 핵산 서열을 GenBank 단백질 서열 및 기타 공중이 이용 가능한 데이터베이스 내 아미노산 서열에 대하여 검색할 경우에 바람직하다. BLASTP 및 BLASTX는 디폴트 매개 변수[개방 갭 패널티 = 11.0, 연장 갭 패널티 = 1.0] 및 BLOSUM-62 매트릭스를 사용하여 실행된다[상기 문헌 참조].
2개 이상의 서열 간 "동일성%"를 측정하기 위하여 선택된 서열의 바람직한 정렬법은 예를 들어, 디폴트 매개 변수(예를 들어, 개방 갭 패널티 = 10.0 및 연장 갭 패널티 = 0.1)와 BLOSUM 30 유사도 매트릭스를 이용하는, CLUSTAL-W 프로그램(MacVector 6.5 버젼)으로써 수행된다.
"~에 특이적인 혼성화" 또는 "특이적 혼성화" 또는 "~에 선택적으로 혼성화하다"란, 특정 뉴클레오티드 서열이 복합 혼합체(예를 들어, 총 세포) DNA 또는 RNA에 존재하는 경우, 엄중한 조건 하에서 특정 뉴클레오티드 서열에 핵산 분자가 우선적으로 결합, 이중체화, 또는 혼성화하는 경우를 의미하는 것이다.
"엄중한 조건"이란 용어는, 프로브가 그것의 표적 내부 서열에 우선적으로 혼성화하고, 기타 서열에는 낮은 정도로 혼성화하거나 거의 혼성화하지 않는 조건을 의미하는 것이다. 핵산 혼성화 실험 예를 들어, 서던 혼성화 및 노던 혼성화와 같은 실험에 관한 내용 중 "엄중한 혼성화" 및 "엄중한 혼성화 세척 조건"이란, 서열에 의존적이고, 상이한 환경 매개 변수에 따라서 달라지는 혼성화 또는 혼성화 세척 조건을 의미하는 것이다. 핵산의 혼성화에 관한 보다 자세한 지침에 관하여는 문헌[Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NY; Sambrook외 다수, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd ed., NY; 및 Ausubel외 다수, eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY]에서 살펴볼 수 있다.
일반적으로, 고도로 엄중한 혼성화 및 세척 조건은 소정의 이온 세기와 pH에서의 특정 서열에 대한 용융점(Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치되는 프로브에 혼성화되는 온도(소정의 이온 세기 및 pH에서의 온도)이다. 매우 엄중한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하도록 선택된다.
서던 또는 노던 블럿팅에 있어서, 약 100개 이상의 상보성 잔기를 가지는 상보성 핵산이 필터 상에 혼성화되는 엄중 혼성화 조건의 일례로서는, 42℃에서 1㎎의 헤파린과 50%의 포르말린을 처리하고, 밤새도록 혼성화시키는 경우가 있다. 매우 엄중한 세척 조건의 일례로서는, 약 15분 동안 72℃에서 0.15M의 NaCl을 처리하는 경우가 있다. 엄중한 세척 조건의 일례로서는 15분 동안 65℃에서 0.2×SSC로 세척하는 경우가 있다. SSC 완충액에 관한 설명은 문헌[Sambrook외 다수]을 참조하시오. 고도로 엄중한 세척에서는 우선, 낮은 엄중도 세척이 선행되어, 백그라운드 프로브 신호를 제거할 수 있다. 예를 들어, 약 100개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 이중체에 있어서, 대표적인 중간 정도의 엄중도 세척은, 15분 동안 45℃에서 1×SSC를 첨가함으로써 행해진다. 예를 들어, 약 100개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 이중체에 있어서, 대표적인 낮은 엄중도 세척은, 15분 동안 40℃에서 4∼6×의 SSC를 첨가함으로써 행해진다. 일반적으로, 신호 대 노이즈 비율은 구체적인 혼성화 검정법에 있어서의 관련 없는 프로브에서 관찰되는 비율에 비하여 2배(또는 그 이상)에 달하는데, 이는 곧, 특이적인 혼성화가 관찰된다는 의미이다.
본원에 있어서 "약"이란 용어는, 별도의 언급이 없는 한, 이 용어에 의하여 한정되는 수치의 10% 이상만큼 위 또는 아래에 해당하는 경우를 의미한다. 예를 들어, "약 5㎍/㎏"이란 용어는, 4.5∼5.5㎍/㎏의 범위를 의미하는 것이다. 다른 예로서, "약 1시간"이란, 48∼72분의 범위를 의미하는 것이다.
본원에 있어서, "암호화하다"라는 용어는, 핵산 예를 들어, 데옥시리보핵산의 특성 즉, 상보성 핵산 예를 들어, 폴리펩티드로 번역될 수 있는 핵산을 전사하는 특성을 일컫는 의미이다. 예를 들어, 데옥시리보핵산은 데옥시리보핵산으로부터 전사되는 RNA를 암호화할 수 있다. 이와 유사하게, 데옥시리보핵산은 데옥시리보핵산으로부터 전사된 RNA로부터 번역되는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
개의 RNA polI 조절 요소를 포함하는 핵산
하나의 구체예에서, 본 발명의 개 RNA 조절 서열(예를 들어, 개 RNA polI 프로모터)을 포함하는 분리된 핵산이 제공된다. 조절 서열은 예를 들어, 전사될 핵산에 작동 가능하도록 결합되어, 시험관 내 또는 생체 내에서 적당한 단백질의 존재하에 전사될 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 조절 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 핵산은 인플루엔자 vRNA 분절이다.
임의의 측면에서, 본 발명은 개의 RNA polI 프로모터를 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 바람직하게, 개 RNA polI 프로모터는 전사될 핵산 예를 들어, 인플루엔자 게놈 RNA에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 핵산을 개의 세포에 도입시키면, 인플루엔자 게놈 RNA를 전사시킬 수 있고, 적당한 인플루엔자 단백질의 존재하에, RNA 전사체(들)는 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스로 팩킹될 수 있다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 인간, 영장류, 마우스 또는 개 polI 폴리펩티드와 결합하고, 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% 또는 60% 이상 동일한, 개 RNA polI 조절 서열 또는 이의 단편을 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 RNA polI 조절 서열 또는 이의 단편은 추가로 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합된 유전자의 전사를 개시하는 능력을 보유한다.
뿐만 아니라, 본 발명의 핵산은 또한 개 RNA polI 프로모터를 포함하는 핵산의 유도체도 포함한다. 이러한 유도체는 당 업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여, 이하 정의된 개 RNA polI 조절 서열로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 유도체는 위치-특이적 돌연 변이 유발법 예를 들어, 핵산을 이루는 1개, 2개, 3개, 5개 또는 10개 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실에 의하여 생산될 수 있다. 대안적으로, 유도체는 랜덤한 돌연 변이 유발법에 의하여 제조될 수 있다. 핵산을 랜덤하게 돌연 변이시키는 하나의 방법은, 0.1mM MnCl2의 존재 및 밸런스를 맞추지 않은 뉴클레오티드 농도 하에서 PCR 반응을 통해 핵산을 증폭시키는 과정을 포함한다. 이러한 조건은 PCR 반응에 사용된 중합 효소의 통합 오류(misincorporation) 비율을 높이므로, 증폭된 핵산을 랜덤하게 돌연 변이시킨다. 바람직하게, 유도체 핵산은 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합된 유전자의 전사를 개시할 수 있는 능력을 보유한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 핵산은 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 유전자의 전사를 개 세포에서 개시할 수 있는 서열을 포함하므로, 기능성 유도체이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 개의 polI 폴리펩티드와 결합하여, 개의 세포에서 인플루엔자 vRNA 전사를 (시험관 내 또는 생체 내) 개시할 수 있는 서열을 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은, 서열 번호 1에 제시된 서열의 -250∼-1번 뉴클레오티드(+1 뉴클레오티드라고도 알려진, 프로모터로부터 전사된 제1 뉴클레오티드에 관함) 또는 이의 기능적 유도체를 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다. 서열 번호 1에서 발견되는, 개의 polI 조절 서열로부터 발현된 18S 리보좀 RNA에 대한 +1번 위치의 뉴클레오티드는 서열 번호 1의 1804번 위치에 있는 뉴클레오티드이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 개 polI 조절 서열은, 엄중한 혼성화 조건 하에서, 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 핵산에 혼성화하여, 조절 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 유전자의 전사를 개의 세포에서 개시할 수 있는 분리된 핵산(또는 이의 상보성 서열)을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 개 polI 조절 서열은 개 RNA polI 폴리펩티드에 결합할 수 있고, 하나의 구체예에서는, 이 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 유전자의 전사를 개의 세포에서 개시할 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 핵산은 진핵 생물 polI 폴리펩티드와 결합하여, 인플루엔자 vRNA의 전사를 (시험관 내 또는 생체 내) 개시할 수 있는 서열을 포함한다. 임의의 구체예에서, 개 RNA polI 폴리펩티드와 개 polI 조절 서열의 결합 여부는 뉴클레아제 보호 검정법(nuclease protection assay)을 이용하여 확인된다. 임의의 구체예에서, 개 RNA polI 폴리펩티드와 개 polI 조절 서열의 결합 여부는, 단백질 상호 작용을 평가하기 위한 바이어코어(BIACORE) 시스템(Biacore International AG, Uppsala, Sweden)을 이용하여 확인된다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 개의 RNA polI과 결합하는 서열을 포함한다. 임의의 구체예에서, 상기 서열은 영장류 RNA polI, 인간 polI, 및 마우스 polI으로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 중합 효소와의 친화도보다 큰 친화도로 개 RNA polI과 결합한다. 임의의 구체예에서, 상기 서열은 개 RNA polII와의 친화도보다 높은 친화도로 개의 RNA polI과 결합한다. 임의의 구체예에서, 상기 서열은 개 RNA polIII와의 친화도보다 높은 친화도로 개 RNA polI과 결합한다. 임의의 구체예에서, 개 polI 조절 서열과의 결합 여부는, 단백질 상호 작용을 평가하기 위한 바이어코어 시스템(Biacore International AG, Uppsala, Sweden)을 이용하여 확인된다.
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00001
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00002
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00003
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00004
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00005
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00006
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00007
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00008
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00009
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00010
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00011
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00012
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00013
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00014
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00015
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00017
임의의 구체예에서, 개의 RNA polI 프로모터는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다:
Figure 112008004795782-PCT00018
벡터 및 발현 벡터
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터 예를 들어, 세포 배양액으로부터 바이러스를 재조합적으로 회수하는데 유용한 발현 벡터를 제공한다. 일반적으로, 발현 벡터는 바이러스의 생활 주기 동안 한정된 말단부를 가지는 RNA를 생산하는데 필요하다고 당 업자에게 공지된 임의의 바이러스를 회수하는데 유용하다. 예를 들어, 전술한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 게놈 RNA는 재조합 시스템 내에서 효율적으로 복제 및 팩키징될, 일정한 5' 말단 및 3' 말단을 가져야 한다. 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는 문헌[Neumann외 다수(2002), 83:2635-2662]을 참조하시오. 다음과 같은 논의는 인플루엔자와 함께 사용되기에 적당한 발현 벡터에 중점을 두고 있으나; 기타의 바이러스도 본 발명의 벡터를 사용하여 회수될 수 있음에 주의하여야 할 것이다.
본 발명에 따르면, 하나의 구체예에서, 인플루엔자의 8개의 게놈 분절(이 분절은 상이한 인플루엔자 바이러스로부터 유래할 수 있는데, 예를 들어, X 균주로부터는 6개, 그리고 Y 균주로부터는 2개 유래할 수 있음) 각각에 상응하는 바이러스 게놈 RNA를 암호화하는 cDNA는 인플루엔자 바이러스의 조작 및 생산을 위하여 재조합 벡터에 삽입될 수 있다. 다양한 벡터 예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드, 파지 및 인공 염색체가 본 발명에 사용될 수 있다. 통상적으로, 조작의 용이성을 위해, 상기 cDNA는 플라스미드 벡터, 즉, 박테리아 세포 및 진핵 생물 세포에서 기능을 하는 하나 이상의 복제 기원, 및 임의로, 플라스미드 서열이 통합되어 있는 세포의 스크리닝 또는 선별용으로서 편리한 마커를 제공하는 플라스미드 벡터에 삽입된다. 예를 들어, 문헌[Neumann외 다수, 1999, PNAS. USA 96:9345-9350]을 참조하시오.
하나의 구체예에서, 본 발명의 벡터는 둘 중 어느 하나의 방향으로 삽입된 cDNA로부터 유래하는 바이러스 게놈 분절의 전사를 개시할 수 있는(즉, (+) 사슬 및 (-) 사슬 바이러스 RNA 분자를 생성할 수 있는) 2 방향성 발현 벡터이다. 2 방향성 전사를 수행하기 위하여, 바이러스 게놈 분절 각각을 2개 이상의 독립 프로모터를 가지는 발현 벡터에 삽입할 수 있으며, 바이러스 게놈 RNA 복사체들은 제1 RNA 중합 효소 프로모터(예를 들어, 개 RNA polI 프로모터)에 의해 하나의 사슬로부터 전사되고, 바이러스 mRNA는 제2 RNA 중합 효소 프로모터(예를 들어, 개 세포에서 RNA polII에 의해 전사를 개시할 수 있는 개 RNA PolII 프로모터 또는 기타 프로모터)로부터 합성된다. 그러므로, 2개의 프로모터는 바이러스 게놈 RNA 분절의 삽입에 적당한, 하나 이상의 클로닝 위치(즉, 제한 효소 인지 서열), 바람직하게는 독특한 클로닝 위치에 측접하고 있으면서, 반대 방향으로 정렬될 수 있다. 대안적으로, (+) 사슬 mRNA와 (-) 사슬 바이러스 RNA(cRNA)가 벡터의 동일한 사슬로부터 전사되는 "앰비센스" 발현 벡터가 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 바이러스 게놈 RNA를 전사하는 polI 프로모터는 바람직하게는 개의 polI 프로모터이다.
각각의 발현된 vRNA 또는 cRNA의 올바른 3' 말단을 확보하기 위하여, 각각의 vRNA 또는 cRNA 발현 벡터는 리보자임 서열 또는 RNA 암호화 서열의 적당한 종결 서열(예를 들어, 인간, 마우스, 영장류 또는 개의 RNA 중합 효소 I 종결 서열)의 하류를 통합할 수 있다. 이는 예를 들어, 간염 델타 바이러스 게놈 리보자임 서열 또는 이의 기능성 유도체, 또는 쥣과 동물의 rDNA 종결 서열(Genbank 등록 번호 M12074)일 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, PolI 종결 서열을 사용할 수 있다[Neumann외 다수, 1994, Virology 202:477-479]. RNA 발현 벡터는 vRNA 발현 벡터와 동일한 방식으로 구성될 수 있다[Pleschka외 다수, 1996, J. Virol. 70:4188-4192; Hoffmann and Webster, 2000, J. Gen Virol. 81 :2843-2847; Hoffmann외 다수, 2002, Vaccine 20:3165-3170; Fodor외 다수, 1999, J. Virol. 73:9679-9682; Neumann외 다수, 1999, P.N.A.S.USA 96:9345-9350; 및 Hoffmann외 다수, 2000, Virology 267:310-317; 상기 각 문헌은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨].
기타 시스템에 있어서, polI 및 polII 프로모터에 의해 전사된 바이러스 서열은 상이한 발현 벡터로부터 전사될 수 있다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 개의 조절 서열 예를 들어, 개의 polI 프로모터("vRNA 발현 벡터")의 제어를 받는 바이러스 게놈 분절 각각을 암호화하는 벡터와, polII 프로모터의 제어를 받으며, 하나 이상의 바이러스 폴리펩티드 예를 들어, 인플루엔자 PA, PB1, PB2 및 NP 폴리펩티드를 암호화하는 벡터("단백질 발현 벡터")를 사용할 수 있다.
어느 하나의 경우, polII 프로모터와 관련하여, 발현될 인플루엔자 바이러스 게놈 분절은 적당한 전사 제어 서열(프로모터)에 작동 가능하도록 결합하여 mRNA 합성을 유도할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 게놈 분절의 전사를 조절하기 위해서 발현 벡터에 사용하기 적당한 프로모터가 다수 존재한다. 임의의 구체예에서, 사이토메갈로 바이러스(CMV) DNA 의존성 RNA 중합효소 II(PolII) 프로모터가 사용된다. 원한다면, 예를 들어, 조건부 발현을 조절하기 위해서, 특정 조건 하에서, 또는 특정 조직 또는 세포에서 RNA 전사를 유도하는 기타 프로모터를 대신 사용할 수 있다. 다수의 바이러스 및 포유동물 프로모터 예를 들어, 인간 프로모터를 사용할 수 있거나, 또는 이러한 프로모터는 특정 용도에 따라서 분리될 수 있다. 예를 들어, 동물 및 인간 바이러스의 게놈으로부터 얻어진 대안적인 프로모터로서는 아데노바이러스(adenovirus)(예를 들어, 아데노바이러스 2), 파필로마 바이러스(papilloma virus), B형 간염 바이러스 및 폴리오마 바이러스(polyoma virus)의 프로모터와, 다양한 레트로바이러스 프로모터를 포함한다. 포유동물 프로모터로서는 액틴 프로모터, 면역 글로불린 프로모터 및 열 충격 프로모터 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 조절 서열은 인간 아데노바이러스 2의 스플라이싱된 3원성 리더 서열에 결합되어 있는, 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터를 포함한다[Berg외 다수, Bio Techniques 14:972-978]. 뿐만 아니라, 박테리오파지 프로모터 예를 들어, T7 프로모터는 동계 RNA 중합 효소와 함께 사용될 수 있다.
바이러스 단백질, 구체적으로, RNP 복합체 형성용 바이러스 단백질을 발현하는데 사용되는 발현 벡터는 원하는 바이러스에 상동성인 바이러스 단백질을 발현하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 발현 벡터에 의한 바이러스 단백질의 발현은 당 업자에게 공지된 임의의 조절 서열에 의하여 조절될 수 있다. 조절 서열은 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 단백질 발현 벡터 내에서 바이러스 단백질의 발현을 제어하는데 사용될 수 있는 프로모터의 다른 예로서는, SV40 초기 프로모터 부위(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 루 육종 바이러스의 3' 장 말단 반복부에 포함된 프로모터(Yamamoto외 다수, 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner외 다수, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster외 다수, 1982, Nature 296:39-42); 원핵 생물 발현 벡터용 프로모터 예를 들어, β-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff외 다수, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), 또는 tac 프로모터(DeBoer외 다수, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25; 및 "Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94); 노팔린 합성 효소 프로모터 부위를 포함하는 식물 발현 벡터용 프로모터(Herrera-Estrella외 다수, Nature 303:209-213) 또는 꽃 양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner외 다수, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), 및 광합성 효소인 리불로스 비스포스페이트 카복실라제의 프로모터(Herrera-Estrella외 다수, 1984, Nature 310:115-120); 효모 또는 기타 진균으로부터 유래하는 프로모터 요소 예를 들어, Gal4 프로모터, ADC(알콜 탈수소 효소) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 트랜스게닉 동물에서 사용되는, 다음과 같은 동물 전사 제어 부위: 췌장 선포 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 부위(Swift외 다수, 1984, Cell 38:639-646; Omitz외 다수, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; McDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 부위(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프 세포에서 활성인 면역 글로불린 유전자 제어 부위(Grosschedl외 다수, 1984, Cell 38:647-658; Adames외 다수, 1985, Nature 318:533-538; Alexander외 다수, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 림프 세포 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방암 바이러스 제어 부위(Leder외 다수, 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 부위(Pinkert외 다수, 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성인 알파-태아 단백질 유전자 제어 부위(Krumlauf외 다수, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer외 다수, 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항 트립신 유전자 제어 부위(Kelsey외 다수, 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 미엘린 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 부위(Mogram외 다수, 1985, Nature 315:338-340; Kollias외 다수, 1986, Cell 46:89-94); 뇌의 희돌기 세포(ligodendrocyte cell)에서 활성인 미엘린 구성 단백질 유전자 제어 부위(Readhead외 다수, 1987, Cell 48:703-712), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 부위(Sani, 1985, Nature 314:283-286), 및 시상 하부에서 활성인 성선 자극 방출 호르몬 유전자 제어 부위(Mason외 다수, 1986, Science 234:1372-1378)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
특정 구체예에서, 본 발명의 단백질 발현 벡터는 핵산 서열에 작동 가능하도록 결합되어 있는 프로모터, 하나 이상의 복제 기원, 및 임의로는 하나 이상의 선별 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 포함한다. 다른 구체예에서, 2 시스트론성 mRNA를 생산할 수 있는 본 발명의 단백질 발현 벡터는 2 시스트론성 mRNA 서열을 삽입함으로써 생산될 수 있다. 임의의 내부 리보좀 도입 위치(IRES) 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 IRES 요소로서는 포유동물 BiP IRES 및 C형 간염 바이러스 IRES를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 핵산은 플라스미드 pAD3000 또는 이의 유도체에 삽입된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 20050266026 및 도 10을 참조하시오. 그러므로, 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 2 방향성 발현 벡터이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 2개의 프로모터 사이에 있는 인플루엔자 바이러스 게놈의 분절에 측접하여 존재하는 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터는 사이토메갈로바이러스(CMV) DNA 의존성 RNA polII 프로모터를 포함한다.
유전자가 삽입된 발현 벡터는 예를 들어, 다음과 같은 3가지의 일반적인 접근 방법에 의하여 동정될 수 있다: (a) 핵산 혼성화; (b) "마커" 유전자 기능의 유무; 및 (c) (발현 벡터일 경우에는) 삽입된 서열의 발현. 첫 번째 접근 방법에 있어서, 벡터(들) 내에 삽입된 바이러스 유전자의 존재 여부는 삽입된 유전자(들)와 상동성인 서열을 포함하는 프로브를 이용한 핵산 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 두 번째 접근 방법에 있어서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 벡터(들) 내에 유전자(들)를 삽입함으로 인하여 유도되는 임의의 "마커" 유전자의 기능(예를 들어, 항생제 내성 또는 형질 전환 표현형)의 존부에 따라서 동정 및 선별될 수 있다. 세 번째 접근 방법에 있어서, 발현 벡터는 발현된 유전자 산물을 검정함으로써 동정될 수 있다. 이러한 검정법은 예를 들어, 시험관 내 검정 시스템에서의 바이러스 단백질의 물리적 특성 또는 기능적 특성 예를 들어, 항체와 바이러스 단백질의 결합 특성을 바탕으로 할 수 있다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 단백질 발현 벡터는 RNP 복합체의 형성에 필요한 바이러스 단백질을 암호화 및 발현한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 단백질 발현 벡터는 바이러스 입자를 형성하는데 필요한 바이러스 단백질을 암호화 및 발현한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 단백질 발현 벡터는 특정 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 바이러스 단백질 모두를 암호화 및 발현한다.
전사는 임의로는 인핸서 서열을 포함시킴으로써 강화될 수 있다. 인핸서는 통상적으로 그 길이가 짧으며(예를 들어, 10∼500 bp), 프로모터와 함께 전사를 증가시키는 역할을 하는 시스-작용성(cis-acting) DNA 요소이다. 다수의 인핸서 서열이 포유동물 유전자(헤모글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-태아 단백질 및 인슐린) 및 진핵 생물 세포 바이러스로부터 분리되었다. 인핸서는 스플라이싱되어 벡터 내 5' 또는 3' 위치에서 이종 암호화 서열이 있는 위치까지 클로닝될 수 있지만, 통상적으로는 5' 위치에서 프로모터가 있는 위치까지 삽입된다. 통상적으로 프로모터, 원한다면 부가의 전사 강화 서열은 이종 DNA가 도입될 숙주 세포 유형에서의 발현을 최적화하는 것으로 선택된다[Scharf외 다수(1994) Heat stress promoters and transcription factors Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler외 다수(1990) Assembly of enhancers, promoters and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185:512-27]. 임의로, 앰플리콘은 또한 번역 개시에 필요한 리보좀 결합 위치 또는 내부 리보좀 도입 위치(IRES)를 함유할 수도 있다.
본 발명의 발현 벡터는 또한 전사 종결 서열과 mRNA 안정화 서열 예를 들어, 폴리아데닐화 위치 또는 종결 서열(예를 들어, 인간, 마우스, 영장류 또는 개의 알 중합 효소 I 종결 서열)을 포함할 수도 있다. 이러한 서열은 일반적으로 진핵 생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 말단, 경우에 따라서는 3' 말단의 비번역 부위로부터 얻을 수 있다. 몇몇 구체예에서, SV40 폴리아데닐화 서열은 폴리아데닐화 신호를 제공한다.
또한, 전술한 바와 같이, 상기 벡터는 전술한 유전자들 이외에도, 임의로는 하나 이상의 선별 마커 유전자를 포함하므로, 형질 전환된 숙주 세포 선별을 위한 표현형적 특징을 제공하며, 마커 예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원 효소 또는 네오마이신 내성 유전자는 진핵 생물 세포 배양액에서 선별용으로서 적당하다.
전술한 바와 같이 적당한 DNA 서열 및 적당한 프로모터 또는 제어 서열을 함유하는 발현 벡터는 숙주 세포를 형질 전환하여 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 박테리아 세포에서 복제될 수 있지만, 일반적으로 본 발명의 발현 벡터를 발현시키기 위해서는, 이 벡터를 포유 동물 세포 예를 들어, Vero 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 293 세포, COS 세포에 도입하는 것이 바람직할 것이며, 더욱 바람직하게, MDCK 세포에 도입하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 발현 벡터는 하나 이상의 돌연 변이(예를 들어, 특정의 인플루엔자 전염성 균주의 HA 유전자 예를 들어, H5N1 내에 존재하는 다가 염기 절단 위치를 제거 또는 불활성화하는 돌연 변이)가 발생한 게놈 vRNA 또는 상응하는 cRNA를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이러한 돌연 변이는 바이러스를 약독화시킬 수 있다. 예를 들어, vRNA 분절은 팬-핸들 이중체(pan-handle duplex) 프로모터 부위 내에 존재하는 약화 염기쌍 치환(attenuated base pair substitution), 구체적으로, 예를 들어, NA-특이적 vRNA의 이중체 부위 내 11∼12번 위치에서 일어나는 C→A로의 치환 및 G→U로의 치환과 같은 공지의 약화 염기쌍 치환을 가지는 인플루엔자 A 바이러스의 vRNA 분절일 수 있다[Fodor외 다수, 1998, J. Virol. 6923-6290]. 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산하는 본 발명의 방법을 사용함으로써, 신규의 약화 돌연 변이를 확인할 수 있다.
또한, 문헌[미국 특허 제6,951,754호, 동 제6,887,699호, 동 제6,649,372호, 동 제6,544,785호, 동 제6,001,634호, 동 제5,854,037호, 동 제5,824,536호, 동 제5,840,520호, 동 제5,820,871호, 동 제5,786,199호, 동 제5,166,057호 및 미국 특허 출원 공보 20060019350, 20050158342, 20050037487, 20050266026, 20050186563, 20050221489, 20050032043, 20040142003, 20030035814, 및 20020164770]에 개시된 바와 같은 발현 벡터 중 임의의 벡터도 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 문헌에 개시된 벡터는, 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 핵산(예를 들어, 본 발명의 개 조절 서열 예를 들어, 개 polI 프로모터 서열)을 바이러스 vRNA 또는 cRNA를 합성시키는 발현 벡터에 도입함으로써, 본 발명에 따라서 사용되도록 적응될 수 있다.
부가의 발현 요소
가장 일반적으로, 인플루엔자 바이러스 단백질을 암호화하는 게놈 분절은 발현 예를 들어, 기능성 바이러스 단백질로의 번역에 필요한 임의의 부가 서열을 포함한다. 기타의 경우, 바이러스 단백질 예를 들어, HA 또는 NA 단백질을 암호화하는 미니유전자 또는 기타 인공 구조물을 사용할 수 있다. 이 경우, 이종 암호화 서열이 효율적으로 번역되도록 돕는 특정의 개시 신호를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 신호로서는 예를 들어, ATG 개시 코돈과 이에 인접하여 존재하는 서열을 포함할 수 있다. 전체 삽입물의 번역을 확보하기 위해서, 개시 코돈은 바이러스 단백질과 관련된 올바른 해독 틀 내에 삽입된다. 외재성 전사 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원으로부터 유래하는 것(천연의 것 및 합성된 것)일 수 있다. 발현 효율은 세포 시스템에 사용하기에 적당한 인핸서를 포함시킴으로써 강화될 수 있다.
원하는 경우, 부가의 발현 요소 예를 들어, 신호 서열, 분비 또는 국소화 서열 등을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 일반적으로 인-프레임(in-frame) 형태로서, 목적 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 벡터에 통합되어, 예를 들어, 폴리펩티드 발현을 원하는 세포 내 구획, 막 또는 기관이나, 세포 배양 배지에 표적화될 수 있다. 이러한 서열은 당 업자에게 공지되어 있으며, 그 예로서는 분비 리더 펩티드, 기관 표적화 서열(예를 들어, 핵 내 국소화 서열, ER 체류 신호, 미토콘드리아 운반 서열) 또는 막 국소화(membrane localization)/부착(anchor) 서열(예를 들어, 종결 운반 서열, GPI 부착 서열) 등을 포함한다.
키메라 바이러스를 제조하기 위한 발현 벡터
본 발명의 발현 벡터는 또한 바이러스 게놈과 이종인 서열을 발현시키는 키메라 바이러스를 생산하는데 사용될 수도 있다. vRNA 또는 상응하는 cRNA를 발현시키는 발현 벡터는 바이러스 단백질을 발현시키는 발현 벡터와 함께 숙주 세포 내에 도입되어, 신규의 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스 또는 키메라 바이러스를 생산할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 US20040002061을 참조하시오. 이러한 바이러스에 조작되어 들어갈 수 있는 이종 서열로서는 안티센스 핵산 및 리보자임과 같은 핵산을 포함한다. 대안적으로, 펩티드 또는 폴리펩티드를 발현하는 이종 서열은 이러한 바이러스에 조작되어 들어갈 수 있다. 다음과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 이종 서열은 이와 같은 바이러스에 조작되어 들어갈 수 있다: 1) 병원성의 특징을 이루는 항원; 2) 자가 면역성 질환의 특징을 이루는 항원; 3) 알레르기원인 항원; 및 4) 종양의 특징을 이루는 항원. 예를 들어, 본 발명의 키메라 바이러스 내에 조작되어 들어갈 수 있는 이종 유전자 서열로서는 인간 면역 결핍증 바이러스(HIV)의 에피토프 예를 들어, gp160; B형 간염 바이러스의 표면 항원(HBsAg); 헤르페스 바이러스의 당 단백질(예를 들어, gD, gE); 폴리오바이러스의 VP1; 및 비 바이러스성 병원체 예를 들어, (소수의 경우이긴 하지만) 박테리아 및 기생체의 항원 결정기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
자가 면역성 질환 예를 들어, 진성 당뇨병, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루프스병, 류머티즘성 관절염, 악성 빈혈, 애디슨병, 경피증, 자가 면역성 위축성 위염, 연소자형 당뇨병 및 원판상 홍반성 루프스병의 특징을 이루는 항원은 통상적으로 세포 표면, 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 기타 포유 동물의 조직으로부터 유래할 것이다.
알레르기원인 항원은 일반적으로 단백질 또는 당 단백질 예를 들어, 화분, 먼지, 곰팡이, 포자, 비듬, 곤충 및 음식물로부터 유래하는 항원이다.
종양 항원의 특징을 이루는 항원은 통상적으로, 종양 조직의 세포 표면, 세포질, 핵 또는 기관 등으로부터 유래할 것이다. 그 예로서는, 종양 단백질의 특징을 이루는 항원, 예를 들어, 돌연 변이된 발암 유전자에 의하여 암호화되는 단백질; 종양과 관련된 바이러스 단백질; 그리고 당 단백질을 포함한다. 종양으로서는 암류로부터 유래하는 종양; 입술, 비인강, 인두 및 구강, 식도, 위, 결장, 직장, 간, 쓸개, 췌장, 후두, 폐 및 기관지, 피부 흑색종, 유방, 자궁 경부, 자궁, 난소, 방광, 신장, 자궁, 뇌 및 기타 신경계의 일부, 갑상선, 전립선, 정소, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 및 백혈병으로부터 유래하는 종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 이종 서열은 인간 면역 결핍증 바이러스(HIV), 바람직하게는 인간 면역 결핍증 바이러스-1 또는 인간 면역 결핍증 바이러스-2의 게놈으로부터 유래한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 이종 암호화 서열은 네거티브 가닥 RNA 바이러스 유전자 암호화 서열 내에 삽입될 수 있으므로, 이종 펩티드 서열을 함유하는 키메라 유전자 산물이 바이러스 단백질 내에 발현된다. 본 발명의 이와 같은 구체예에서, 이종 서열은 또한 인간의 면역 결핍증 바이러스, 바람직하게는 인간 면역 결핍증 바이러스-1 또는 인간 면역 결핍증 바이러스-2의 게놈으로부터 유래할 수 있다.
이종 서열이 HIV-유래된 서열일 경우, 이러한 서열로서는 env 유전자로부터 유래하는 서열(즉, gpl60, gp120, 및/또는 gp41의 전부 또는 일부를 암호화하는 서열), pol 유전자(즉, 역전사 효소, 엔도뉴클레아제, 프로테아제 및/또는 인테그라제의 전부 또는 일부를 암호화하는 서열), gag 유전자(즉, p7, p6, p55, p17/18, p24/25의 전부 또는 일부를 암호화하는 서열), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, 및/또는 vpx를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이와 같은 하이브리드 분자를 구성하기 위한 한 가지 접근 방법으로서는, 이종 암호화 서열을 네거티브 가닥 RNA 바이러스 유전자의 DNA 상보체에 삽입하여, 이종 서열이 바이러스 중합 효소 활성에 필요한 바이러스 서열, 예를 들어, 개의 RNA polI 프로모터 및 폴리아데닐화 위치에 측접하도록 만드는 방법이 있다. 대안적인 접근 방법에 있어서는, 개의 RNA polI 프로모터를 암호화하는 올리고뉴클레오티드 예를 들어, 바이러스 게놈 분절의 3'-말단 또는 3' 및 5' 말단 둘 다의 상보체는 하이브리드 분자를 구성하기 위해 이종 암호화 서열로 결찰될 수 있다. 외래 유전자 또는 외래 유전자의 분절의 표적 서열 내 위치는, 표적 서열 내 적당한 제한 효소 위치의 존재로써 구태적으로 나타내어진다. 그러나, 최근에는 분자 생물학계에서 이러한 문제점을 가볍게 해소해 주는 방법이 개발되었다. 제한 효소 위치가 위치-배향 돌연 변이 유발법을 사용하여 표적 서열 내 임의의 위치에 용이하게 배치될 수 있게 된 것이다[예를 들어, 문헌(Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488)에 개시된 기술 참조]. 여기에 개시된 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 기술의 변법을 통하여, 서열을 특정의 위치(즉, 제한 효소 위치)에 삽입할 수 있으며, 또한 하이브리드 분자도 용이하게 구성할 수 있게 되었다. 대안적으로, PCR 반응은 클로닝을 할 필요 없이, 재조합 주형을 제조하는데 사용될 수 있었다. 예를 들어, PCR 반응은 DNA-배향 RNA 중합 효소 프로모터(예를 들어, 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6)를 함유하는 이중-사슬 DNA 분자와, 이종 유전자 및 개 RNA polI 프로모터를 함유하는 하이브리드 서열을 제조하는데 사용될 수 있었다. 이후, RNA 주형은 이러한 재조합 DNA로부터 직접 전사될 수 있었다. 또 다른 구체예에서, 재조합 vRNA 또는 이에 상응하는 cRNA는 RNA 리가제를 사용하여, 음성 극성을 가지는 이종 유전자와 개의 RNA polI 프로모터를 특정하는 RNA들을 결찰함으로써 제조될 수 있다.
2 시스트론성 mRNA는 바이러스 서열의 번역을 내부에서 개시할 수 있고, 또한 보통의 말단 개시 위치로 외래 단백질 암호화 서열을 발현시킬 수 있도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 2 시스트론성 mRNA 서열은 바이러스 서열이 통상의 말단 개방 해독 틀(내부에 있는 위치로부터 외래 서열이 시작됨)로부터 번역되도록 구성될 수 있다. 임의의 내부 리보좀 도입 위치(IRES) 서열이 사용될 수 있다. 선택된 IRES 서열은 바이러스 팩키징 제한(virus packaging limitation)을 방해하지 않도록 짧아야 한다. 그러므로, 이와 같은 2 시스트론성 접근 방법에 사용하기 위해 선택된 IRES는 그 길이가 500 뉴클레오티드 이하이어야 하며, 바람직하게는 250 뉴클레오티드 이하이어야 한다. 또한, 사용된 IRES는 피코나바이러스 요소와 서열이나 구조적으로 상동성이 없는 것이 바람직하다. 바람직한 IRES 요소로서는, 포유 동물의 BiP FRES와 C형 간염 바이러스의 IRES를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
대안적으로, 외래 단백질은 전사 단위가 개시 위치 및 폴리아데닐화 위치를 가지는 내부 전사 단위로부터 발현될 수 있다. 다른 구체예에서, 외래 유전자는 네거티브 가닥 RNA 바이러스 유전자에 삽입되므로, 결과로 발현된 단백질은 융합 단백질이다.
재조합 바이러스를 생산하는 방법
본 발명은, 헬퍼 바이러스의 부재 하에서 본 발명의 단백질 발현 벡터와, vRNA 또는 이것과 상응하는 cRNA를 발현하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입시킴으로써, 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 숙주 세포로서는 개의 세포 예를 들어, MDCK 세포가 있다. 본 발명은 또한 헬퍼 바이러스의 존재 하에서 본 발명의 단백질 발현 벡터와, vRNA 또는 이것과 상응하는 cRNA를 발현하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입시킴으로써, 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 숙주 세포는 개의 세포 예를 들어, MDCK 세포이다.
단백질 발현 벡터와 상기 vRNA 또는 이것과 상응하는 cRNA를 발현시키는 발현 벡터는 당 업자에게 공지된 임의의 기술을 이용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 벡터는 전기 천공법, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법, 리포좀, 미세 주입법 및 미세 입자-충격법에 의하여, 숙주 세포에 도입될 수 있다[예를 들어, Sambrook외 다수, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 참조]. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 동시에 또는 연속적으로 도입될 수 있다.
하나의 구체예에서, vRNA 또는 이것과 상응하는 cRNA를 발현시키는 하나 이상의 발현 벡터는, 바이러스 단백질을 발현시키는 발현 벡터를 도입하기 이전에 숙주 세포에 도입된다. 다른 구체예에서, 바이러스 단백질을 발현시키는 하나 이상의 발현 벡터는, vRNA 또는 이것과 상응하는 cRNA를 발현시키는 하나 이상의 발현 벡터를 도입하기 이전에 숙주 세포에 도입된다. 이러한 구체예에 따르면, vRNA 또는 이것과 상응하는 cRNA를 발현시키는 발현 벡터는 함께 또는 상이한 형질 감염법을 통하여 별도로 도입될 수 있다. 또한, 이러한 구체예에 따르면, 바이러스 단백질을 발현시키는 발현 벡터는 함께 또는 상이한 형질 감염법을 통하여 별도로 도입될 수 있다.
다른 구체예에서, vRNA 또는 이것과 상응하는 cRNA를 발현시키는 하나 이상의 발현 벡터와, 바이러스 단백질을 발현시키는 하나 이상의 발현 벡터는 숙주 세포에 동시 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 모두는 리포좀을 사용하여 숙주 세포에 도입된다.
본 발명의 방법을 수행하기 위한 발현 벡터의 적량 및 적당 비율은 통상의 실험을 통하여 결정될 수 있다. 알려져 있는 바와 같이, 플라스미드를 숙주 세포로 도입시키기 위한 리포좀 형질 감염법 또는 칼슘 침전법의 경우, 각 플라스미드는, 종래의 방식으로 형질 감염 시약과 혼합되기 이전에, 최종 DNA 총 농도 약 0.1㎍/㎖로 희석되어, 수 ㎍ 예를 들어, 1∼10㎍으로 사용될 수 있다. NP 및/또는 RNA-의존성 RNA 중합 효소 서브 유닛을 발현하는 벡터는 vRNA 분절을 발현하는 벡터보다 높은 농도로 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 당 업자는, 발현 백터의 양과 비율은 숙주 세포에 따라서 달라질 수 있음을 알 것이다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 단백질 발현 벡터는 숙주 세포에 0.5㎍ 이상, 바람직하게는 1㎍ 이상, 2.5㎍ 이상, 5㎍ 이상, 8㎍ 이상, 10㎍ 이상, 15㎍ 이상, 20㎍ 이상, 25㎍ 이상, 또는 50㎍ 이상 도입되어, 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산할 수 있다. 다른 구체예에서, vRNA 또는 cRNA를 발현시키는 본 발명의 하나 이상의 발현 벡터는 숙주 세포에 0.5㎍ 이상, 바람직하게는 1㎍ 이상, 2.5㎍ 이상, 5㎍ 이상, 8㎍ 이상, 10㎍ 이상, 15㎍ 이상, 20㎍ 이상, 25㎍ 이상 또는 50㎍ 이상 도입되어, 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산할 수 있다.
본 발명의 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있는 숙주 세포로서는 1차 세포, 배양된 세포 또는 2차 세포, 그리고 형질 전환 또는 무한 증식성 세포(예를 들어, 293 세포, 293T 세포, CHO 세포, Vero 세포, PK, MDBK, OMK 및 MDCK 세포)를 포함한다. 숙주 세포로서는 바람직하게, 동물 세포가 있으며, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포가 있고, 또한 가장 바람직하게는 개의 세포가 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스는 MDCK 세포에서 생산된다.
본 발명은 안정하게 형질 도입된 숙주 세포주 내에서 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 안정하게 형질 도입된 본 발명의 숙주 세포주는, 적당한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 위치 등)에 의해 제어되는 cDNA 및 선별 마커를 숙주 세포에 도입시킴으로써 생산될 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 형질 도입된 세포를 풍부 배지 중에서 1∼2일 동안 생육시킨 후, 선별 배지에 대해 스위칭(switching)시킬 수 있다. 선별 마커는 세포에 내성을 부여하고, 또한 세포가 자신의 염색체에 플라스미드를 안정적으로 통합할 수 있도록 만들어 준다. DNA가 안정적으로 통합되어 형질 도입된 숙주 세포는 클로닝되어, 세포주로 증식될 수 있다.
다수의 선별 시스템 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler외 다수, 1977, Cell 11 :223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy외 다수, 1980, Cell 22:817) 유전자를 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 사용할 수 있다. 또한, 대사 길항 물질 내성을 이용하여, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[Wigler외 다수, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare외 다수, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527]; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Colberre-Garapin외 다수, 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre외 다수, 1984, Gene 30:147) 유전자에 대한 선별의 기초로 삼을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 감염성 재조합 음성-RNA 바이러스(약독화되지 않은 바이러스)는 예를 들어, 종래의 방법에 의해 약독화 또는 사멸될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스는 열이나 포르말린을 처리함으로써 사멸될 수 있으며, 그 결과, 이 바이러스는 복제할 수 없게 된다. 본 발명의 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스(약독화되지 않은 바이러스)는, 예를 들어, 면역원성이되 병원성이 아닌 자손 바이러스를 생산하도록, 비 천연 숙주를 통한 계대 배양으로써 약독화될 수 있다.
본 발명에 따라서 생산된, 약독화된, 살아있거나 또는 사멸한 바이러스는 추후 종래의 방식으로 백신 조성물에 통합될 수 있거나, 또는 예를 들어, 달걀 내에서 부가의 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다. 이러한 바이러스가 전술한 바와 같이 외래 항원을 암호화하는 키메라 vRNA 분절을 가지는 경우, 이 바이러스는 제형화되어 하나 이상의 병원체에 대해 동시에 백신화할 수 있다. 본 발명에 따라서 생산된, 키메라 vRNA 분절을 가지는 약독화 재조합 바이러스는 또한 기타 치료 수단으로서, 예를 들어, 항-종양 제제 또는 유전자 요법 도구로서 디자인될 수도 있으며, 이러할 경우, 바이러스가 생산된 이후에는, 이 바이러스는 약학적으로 허용 가능한 담체나 희석제와 함께 적당한 약학 조성물에 통합될 것이다.
선별 방법에 있어서 헬퍼 바이러스 배양액을 제거할 필요가 없기 때문에, 헬퍼 바이러스를 사용하지 않는 본 발명의 회수법은 재분류 바이러스, 특히, 백신용으로 바람직한 재분류 인플루엔자 바이러스를 생산하는데 특히 바람직하다.
본 발명의 방법은 감염성 바이러스 입자의 회수 효율을 개선시키기 위하여, 당 업자에게 공지된 방법의 측면들을 통합하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 역 유전학 기술(reverse genetics technique)은, 바이러스 중합 효소에 의한 인지 및 성숙한 비리온을 생산할 때 필요한 팩키징 신호에 필수적인, 네거티브 가닥 바이러스 RNA의 비-암호화 부위를 함유하는 합성 재조합 바이러스 RNA를 제조하는 단계를 포함한다. 재조합 RNA는 재조합 DNA 주형으로부터 합성된후, 정제된 바이러스 중합 효소 복합체와 함께 시험관 내에서 재구성되어, 세포를 형질 감염시키는데 사용될 수 있는 재조합 리보핵단백질(RNP)을 형성하게 된다. 만일 바이러스 중합 효소 단백질이 시험관 내 또는 생체 내에서 합성 RNA 전사시에 존재한다면, 더욱 효율적으로 형질 감염이 이루어질 수 있다. 합성 재조합 RNP는 감염성 바이러스 입자로 회수될 수 있다. 전술한 기술에 관하여는 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[미국 특허 제5,166,057호(1992년 11월 24일); 미국 특허 제5,854,037호(1998년 12월 29일); 미국 특허 제5,789,229호(1998년 8월 4일); 유럽 특허 공보 EP 0702085A1(1996년 2월 20일자 발행); 미국 특허 출원 제09/152,845호; 국제 특허 공보 PCR WO 97/12032(1997년 4월 3일); WO 96/34625(1996년 11월 7일); 유럽 특허 공보 EP-A780475; WO 99/02657(1999년 1월 21일); WO 98/53078(1998년 11월 26일); WO 98/02530(1998년 1월 22일); WO 99/15672(1999년 4월 1일); WO 98/13501(1998년 4월 2일); WO 97/06720(1997년 2월 20일); 및 EPO 780 47SA1(1997년 1월 25일)]에 개시되어 있다.
특정 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스 구체예
본 발명은 배양 세포에서 3개 이상의 게놈 vRNA 분절을 가지는 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 재조합 바이러스 입자 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 세포에서 게놈 vRNA 분절을 발현할 수 있는 발현 벡터의 제1 세트를, 상기 바이러스의 생육을 허용할 수 있는 세포 군집에 도입하여, 상기 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공하는 단계; (b) 상기 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제2 세트를 상기 세포에 도입하는 단계; 및 (c) 이 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 재조합 바이러스는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트, 제2 세트, 또는 상기 제1 세트 및 제2 세트는 전기 천공법에 의해 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 인플루엔자 폴리펩티드 전부 또는 하나 이상의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트)는 본 발명의 핵산 예를 들어, 본 발명의 개 RNA polI 조절 서열(예를 들어, 개 RNA polI 프로모터)을 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 상기 제1 세트 및 제2 세트)는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 하나의 구체예에서, 헬퍼 바이러스가 본 방법에 사용된다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용된 배양 세포는 개의 세포이다.
본 발명은 배양 세포에서 3개 이상의 게놈 vRNA 분절을 가지는 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 재조합 바이러스 입자 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (a) 세포에서 게놈 vRNA 분절을 발현하여 상기 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공할 수 있고, 또한 이 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수도 있는 발현 벡터 세트를, 이 바이러스의 생육을 허용할 수 있는 세포의 군집에 도입하는 단계; (b) 이 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼17개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼3개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 전기 천공법에 의해 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절과, 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 본 발명의 핵산, 예를 들어, 본 발명의 개 RNA polI 조절 서열(예를 들어, 개 RNA polI 프로모터)을 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트)는 제2 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 하나의 구체예에서, 헬퍼 바이러스는 본 방법에 사용된다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용된 배양 세포는 개의 세포이다.
본 발명은 배양 세포 중에서 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 재조합 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 상기 세포에서 게놈 vRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제1 세트를, 상기 바이러스의 생육을 허용할 수 있는 세포 군집에 도입하여 상기 바이러스의 완전한 게놈 vRNA를 제공하는 단계; (b) 상기 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제2 세트를 상기 세포에 도입하는 단계; 그리고 (c) 상기 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 하나의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트, 제2 세트, 또는 제1 및 제2 세트 둘 다는 전기 천공법에 의하여 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제2 세트는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터의 제1 세트 또는 제2 세트(또는 제1 세트 및 제2 세트 둘 다)는 본 발명의 핵산 예를 들어, 본 발명의 개 RNA polI 조절 서열(예를 들어, 개 RNA polI 프로모터)을 포함한다. 하나의 구체예에서, 헬퍼 바이러스가 본 방법에 사용된다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용된 배양 세포는 개의 세포이다.
본 발명은 배양 세포에서 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 세포에서 게놈 vRNA를 발현하여 이 바이러스의 완전한 게놈 vRNA를 제공할 수 있고, 또한 이 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수도 있는 발현 벡터 세트를, 상기 바이러스의 생육을 허용할 수 있는 세포 군집에 도입하는 단계; (b) 이 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 개의 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 세포는 MDCK 세포이다. 임의의 구체예에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스이다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼17개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼8개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 1∼3개의 플라스미드에 함유되어 있다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 전기 천공법에 의해 도입된다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절을 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 인플루엔자 바이러스의 각 vRNA 분절과, 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드의 mRNA를 암호화한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 본 발명의 핵산 예를 들어, 본 발명의 개 RNA polI 조절 서열(예를 들어, 개 RNA polI 프로모터)을 포함한다. 임의의 구체예에서, 발현 벡터 세트는 제2의 바이러스의 vRNA 또는 mRNA를 암호화한다. 예를 들어, 벡터 세트는 제2 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA mRNA 및/또는 vRNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 하나의 구체예에서, 헬퍼 바이러스가 본 방법에 사용된다. 하나의 구체예에서, 본 방법에 사용된 배양 세포는 개의 세포이다.
본 발명은 3개 이상의 게놈 vRNA 분절을 가지는 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 배양 개 세포에서 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 헬퍼 바이러스의 부재 하에서, 상기 바이러스의 생육을 허용할 수 있고, 이 개 세포에서 게놈 vRNA 분절을 직접 발현시켜 상기 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절 또는 이의 상응하는 cRNA를 제공할 수 있는 발현 벡터의 제1 세트가 삽입된, 개 세포의 제1 군집을 제공하여 임의의 RNA 분절을 제공하는 단계[여기서, 핵 단백질 및 RNA-의존성 RNA 중합 효소를 제공하여, 이 바이러스의 게놈 vRNA 분절을 함유하는 RNP 복합체를 형성할 수도 있는 개 세포가 생산되며, 상기 바이러스 입자는 상기 개의 세포에서 조립될 수 있음]; 및 (b) 상기 개 세포를 배양함으로써, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계. 임의의 구체예에서, 상기 개의 세포는 MDCK 세포 세포이다.
본 발명은 또한 배양된 개 세포에서 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: (i) 상기 바이러스의 생육을 허용할 수 있으며, (a) 헬퍼 바이러스의 부재 하에서 상기 바이러스의 게놈 vRNA를 제공할 수 있고 (b) 핵 단백질 및 RNA-의존성 RNA 중합 효소를 제공할 수 있도록 변형되어, 상기 게놈 vRNA를 함유하는 RNA 복합체가 형성될 수 있으며, 상기 바이러스 입자가 조립될 수 있는, 개 세포의 제1 군집을 제공하는 단계[여기서, 상기 게놈 vRNA는 상기 세포에서 개의 RNA polI 조절 서열 또는 이의 기능적 유도체의 제어 하에 직접 발현됨]; 및 (ii) 상기 개 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계.
본 발명은 또한 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스의 감염성 바이러스 입자를 배양 세포에서 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (i) 상기 바이러스의 생육을 허용할 수 있고, (a) 헬퍼 바이러스의 부재 하에서 상기 바이러스의 게놈 vRNA를 제공할 수 있으며 (b) 핵 단백질 및 RNA-의존성 RNA 중합 효소를 제공할 수 있도록 변형되어, 이 게놈 vRNA를 함유하는 RNP 복합체(들)를 형성할 수 있고, 상기 바이러스 입자가 조립될 수 있는, 개 세포의 군집을 제공하는 단계[여기서, 상기 게놈 RNA는 개의 RNA polI 조절 서열 또는 이의 기능적 유도체 예를 들어, 전술한 바와 같은 개 RNA polI 프로모터의 제어 하에 상기 개 세포에서 직접 발현됨]; 및 (ii) 상기 개 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계.
특정 구체예에서, 개 숙주 세포 내에 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 8개 이상의 게놈 vRNA 분절을 보유하는 감염성 재조합 네거티브 가닥 RNA 바이러스는 본원에 개시된 방법을 이용하여 생산된다.
특정 구체예에서, 본 발명은, vRNA 분절 또는 상응하는 cRNA, 그리고 인플루엔자 바이러스 단백질, 구체적으로 PB1, PB2, PA 및 NA를 발현하기 위해서, 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포에서 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 본 구체예에 따르면, 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는데 헬퍼 바이러스는 사용될 수 있거나 또는 사용될 수 없다.
본 발명의 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스는 자손을 복제 및 생산할 수 있거나 또는 그럴 수 없다. 바람직하게, 본 발명의 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스는 약독화된다. 약독화된 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스는 예를 들어, NS1 유전자에 돌연변이가 발생한 것일 수 있다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 감염성 재조합 바이러스는 본 발명의 백신 조성물을 제조하는데 유용한 기타 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법에 의하여 생산된 재조합 또는 재분류 바이러스는 백신으로서 사용되는 부가의 바이러스를 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의하여 생산된 재조합 또는 재분류 바이러스 군집은 본 발명의 개 RNA polI 조절 서열(예를 들어, 개 RNA polI 프로모터)이 통합되어 있다. 결과적으로, 바이러스 군집은 달걀이나 기타 배양액 중에서 생육되며, 그 결과, 백신이나 면역원성 조성물의 제조용인 부가의 바이러스가 생산된다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스는 이종(즉, 비-인플루엔자 바이러스) 서열을 발현한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스는 상이한 인플루엔자 균주로부터 유래하는 인플루엔자 바이러스 단백질을 발현한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 감염성 재조합 인플루엔자 바이러스는 융합 단백질을 발현한다.
벡터의 숙주 세포로의 도입
인플루엔자 게놈 분절을 포함하는 벡터는 이종 핵산을 진핵 생물 세포에 도입시키기 위한 방법으로서 당 업계에 널리 공지된 방법[예를 들어, 미국 특허 출원 공보 US20050266026 및 US20050158342 참조] 예를 들어, 인산 칼슘 공동 침전법, 전기 천공법, 미세 주입법, 리포팩션 및 폴리아민 형질 감염 시약을 사용하는 형질 감염법에 따라서, 숙주 세포에 도입(예를 들어, 형질 감염)될 수 있다. 예를 들어, 벡터 예를 들어, 플라스미드는 제조자의 지침에 따라서 폴리아민 형질 감염 시약인 트랜스IT-LT1(TransIT-LT1; Mirus)을 사용하여, 숙주 세포 예를 들어, MDCK 세포, COS 세포, 293T 세포, 또는 이들 세포의 혼합물에 형질 감염될 수 있다. 숙주 세포 군집에 도입될 각각의 벡터 약 1㎍은 160㎕의 배지(바람직하게, 무 혈청 배지) 중에 희석된 트랜스IT-LT1 약 2㎕와 합하여져, 총 부피 200㎕가 될 수 있다. DNA:형질 감염 시약의 혼합물을 45분 동안 실온에서 항온 처리한 다음, 여기에 800㎕의 배지를 첨가한다. 이후, 형질 감염 혼합물을 숙주 세포에 첨가하고, 이 세포를 전술한 바와 같이 배양한다. 그러므로, 세포 배양액 중에서 재조합 또는 재분류 바이러스를 생산하기 위해서는, 8개의 게놈 분절(PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA 및 NA) 각각이 통합되어 있는 벡터를 약 20㎕의 트랜스IT-LT1과 혼합한 후, 이를 숙주 세포에 형질 감염시켜야 한다. 임의로, 형질 감염시키기 이전에 혈청-함유 배지는 무 혈청 배지 예를 들어, Opti-MEM I으로 교환하고, 이를 다시 4∼6일 동안 항온 처리한다.
대안적으로, 전기 천공법을 사용하여 인플루엔자 게놈 분절이 통합되어 있는 벡터를 숙주 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 US20050266026 및 US20050158342(본원에 참고용으로 인용됨)를 참조하시오. 예를 들어, 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스가 통합되어 있는 플라스미드 벡터는, 다음과 같은 방법에 따라서 전기 천공법을 이용하여 MDCK 세포에 도입된다. 요약하면, 예를 들어, 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 개질 이글 배지(MEM) 중에서 생육한 5×106개의 MDCK 세포를 0.4㎖의 OptiMEM 중에 재현탁하고, 이를 전기 천공 큐벳에 넣는다. 20㎍(총 부피 25㎕ 이하)의 DNA를 큐벳 내 세포에 첨가한 후, 이를 가볍게 두드려주어 조심스럽게 혼합한다. 제조자의 지침에 따라서 300 볼트, 950 마이크로패러드에서 시간 상수 28∼33msec로 전기 천공법을 실시한다[예를 들어, BioRad Gene Pulser II, Capacitance Extender Plus 연결]. 전기 천공법을 실시하고 나서 약 1∼2분 후 가볍게 두드려주어 세포를 다시 혼합하고, 이 큐벳에 0.7㎖의 MEM과 10% FBS를 직접 첨가한다. 이후, 세포를 표준 6-웰 조직 배양 접시[2㎖ MEM, 10% FBS 또는 OptiMEM 함유, 혈청은 함유하지 않음]의 2개의 웰에 옮겨 담는다. 이 큐벳을 세척하여 나머지 세포를 회수하고, 세척 현탁액을 2개의 웰에 나누어 담는다. 최종 부피는 약 3.5㎖가 되도록 한다. 이후, 세포를 바이러스가 생육할 수 있는 조건 예를 들어, 약 33℃의 온도(냉각 적응 균주)하에서 항온 처리한다.
벡터를 숙주 세포에 도입하는 것에 관한 추가의 설명은 문헌[예를 들어, 미국 특허 제6,951,754호, 동 제6,887,699호, 동 제6,649,372호, 동 제6,544,785호, 동 제6,001,634호, 동 제5,854,037호, 동 제5,824,536호, 동 제5,840,520호, 동 제5,820,871호, 동 제5,786,199호, 및 동 제5,166,057호 및 미국 특허 출원 공보 20060019350, 20050158342, 20050037487, 20050266026, 20050186563, 20050221489, 20050032043, 20040142003, 20030035814 및 20020164770]에서 살펴볼 수 있다.
세포 배양
통상적으로, 바이러스의 증식은 숙주 세포가 일반적으로 배양되는 배지 조성물 중에서 이루어진다. 인플루엔자 바이러스를 복제하는데 적당한 숙주 세포로서는 예를 들어, Vero 세포, Per.C6 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 293 세포 및 COS 세포, 예를 들어, 293T 세포 및 COS7 세포를 포함한다. MDCK 세포가 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 비-발암성(non-tumorigenic) MDCK 세포를 숙주 세포로서 사용하는 것도 본 발명의 구체예에 해당한다. 상기 세포주 중 2개를 포함하는 공동 배양액 예를 들어, 293T 세포 또는 COS 세포 중 어느 하나와 MDCK 세포를 예를 들어, 1:1의 비율로 포함하는 공동 배양액을 사용하여, 복제 효율을 개선할 수도 있다. 예를 들어, 20050158342를 참조하시오. 통상적으로, 세포는, 습도 및 CO2 농도를 중성 완충 pH(예를 들어, pH 7.0∼7.2)를 유지하도록 적당하게 제어하면서, 표준적인 상업용 배양 배지 예를 들어, 혈청(예를 들어, 10% 소 태아 혈청)이 보충된 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium), 또는 무 혈청 배지 중에서 배양된다. 임의로, 배지는 박테리아 성장을 막는 항생제 예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등 및/또는 부가의 영양분 예를 들어, L-글루타민, 피루브산나트륨, 비-필수 아미노산, 바람직하게 성장을 촉진하기 위한 부가 보충 성분 예를 들어, 트립신, β-머캡토에탄올 등을 함유한다.
포유동물 세포를 배양액 중에 유지시키는 방법에 관하여는 자세히 보고된 바 있으며, 당 업자에게도 공지되어 있다. 일반적인 방법에 관하여는 예를 들어, 문헌[Freshney (1983) Culture of Animal Cells : Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, New York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5th ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam]에 개시되어 있다. 인플루엔자 바이러스를 시험관 내에서 생산함에 있어서 특정의 목적을 가지는 조직 배양 방법에 관한 부연 설명은 예를 들어, 본원에 그 자체로서 인용되어 있는 문헌[Merten외 다수 (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, Cohen and Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines]에 개시되어 있다. 부가적으로, 본 발명에서 채택한 이러한 방법의 변법은 통상의 실험을 통해 용이하게 결정된다.
인플루엔자 바이러스의 생산용인 세포는 혈청-함유 배지 또는 무 혈청 배지 중에서 배양될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 예를 들어, 정제된 바이러스를 제조할 때, 무 혈청 조건 하에서 숙주 세포를 생육하는 것이 바람직하다. 세포는 소규모 예를 들어, 25㎖ 미만의 배지, 배양 튜브 또는 플라스크 내, 또는 교반이 행하여지는 큰 플라스크, 로터가 장착된 병 또는 미세 담체 비드(예를 들어, DEAE-덱스트란 미세 담체 비드 예를 들어, 도마셀(Dormacell)(Pfeifer & Langen); 슈퍼비드(Duperbead)(Flow Laboratories); 스티렌 공중합체-3중-메틸아민 비드 예를 들어, 힐렉스(Hillex), 솔로힐(SoloHill)(Ann Arbor), 플라스크, 병 또는 반응기 배양액 중에서 배양될 수 있다. 미세 담체 비드는 작은 구(지름 100∼200㎛)로서, 세포 배양액의 일정 부피당 부착성 세포 성장에 큰 표면적을 제공한다. 예를 들어, 배지 1ℓ에는 성장 표면이 8000㎠ 이상인 2천만개 이상의 미세 담체 비드가 포함될 수 있다. 바이러스를 상업용으로서 생산함에 있어서(예를 들어, 백산 생산), 세포를 생물 반응기 또는 발효조 내에서 배양하는 것이 바람직할 수도 있다. 생물 반응기로서는 부피가 1ℓ도 안 되는 것으로부터 100ℓ가 넘는 것에 이르기까지 여러 가지가 있는데, 그 예로서는 사이토 3 생물 반응기(Cyto3 Bioreactor)(Osmonics, Minnetonka, MN); NBS 생물 반응기(New Brunswick Scientific, Edison, N. J.); 실험실용 및 상업용 규모의 생물 반응기(B. Braun Biotech International)(B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)가 있다.
본 발명에 있어서, 배양 부피에 상관없이, 배양액의 온도는 35℃ 이하로 유지시키는 것이 중요하며, 이로써, 재조합 및/또는 재분류 인플루엔자 바이러스, 구체적으로, 냉각 적응성, 온도 감수성 및 약독화 재조합 및/또는 재분류 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 회수할 수 있게 된다. 예를 들어, 임의의 구체예에서, 세포는 온도 약 32∼35℃, 통상적으로는 온도 약 32∼약 34℃, 일반적으로는 약 33℃에서 배양된다.
통상적으로, 조절기 예를 들어, 자동 온도 조절 장치 또는 세포 배양 시스템의 온도를 감지 및 유지하는 기타 장치를 사용하여, 온도가 바이러스 복제 기간 동안 35℃를 넘지 않도록 만들 수 있다.
바이러스의 회수
바이러스는 통상적으로 감염된(형질 감염된) 세포가 생육한 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 통상적으로, 미정제 배지는 인플루엔자 바이러스를 농축하기 전에는 투명하다. 일반적으로 사용되는 방법으로서는 여과법, 한외 여과법, 황산 바륨 상에의 흡착법 및 용리법, 그리고 원심 분리법을 포함한다. 예를 들어, 감염된 배양액으로부터 유래하는 미정제 배지는 처음에 예를 들어, 1000∼2000×g에서, 세포 파편 및 기타 큰 입자형 물질을 제거하는데 충분한 시간 예를 들어, 10∼30분 동안 원심 분리를 수행함으로써 투명해질 수 있다. 대안적으로, 배지를 0.8㎛의 아세트산셀룰로스 필터를 통과시켜 여과하면, 그 결과, 원 상태의 세포 및 기타 큰 입자형 물질이 제거된다. 임의로는, 투명한 배지 상청액을 원심 분리(예를 들어, 15,000×g, 약 3∼5 시간)하여 인플루엔자 바이러스를 펠릿으로 만들기도 한다. 적당한 완충액 예를 들어, STE(0.01M Tris-HCl; 0.15M NaCl; 0.0001M EDTA) 또는 인산염 완충 염수(PBS, pH7.4) 중에 바이러스 펠릿을 재현탁시킨 후, 바이러스는 수크로스(60∼12%) 또는 타르타르산칼륨(50∼10%) 상에서 밀도 구배 원심 분리함으로써 농축된다. 연속적 또는 단계적 구배 예를 들어, 수크로스 구배 12∼60%(12%씩 4단계)인 경우가 적당하다. 구배물을 바이러스가 회수되었음을 입증하는 밴드로 농축되기에 충분한 속도 및 시간에서 원심 분리한다. 대안적으로, 그리고, 대부분의 거대 규모 상업용으로서, 바이러스는 연속적 방식으로 작동하는 대역별-원심 분리 로터(zonal-centrifuge rotor)를 사용하여 밀도 구배법을 통해 분배된다. 당 업자가 조직 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스를 제조할 수 있도록 안내하기에 충분한 부연 설명은 예를 들어, 문헌[Furminger. Vaccine Production, Nicholson외 다수 (eds) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten외 다수 (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151, 및 미국 특허 제5,690,937호, 미국 특허 출원 제20040265987호, 동 재20050266026호 및 동 제20050158342호(본원에 참고용으로 인용됨)]에 개시되어 있다. 원한다면, 회수된 바이러스는 수크로스-인산염-글루타메이트(SPG)(안정화제)의 존재 하에 -80℃의 온도에서 보관될 수 있다.
인플루엔자 바이러스
인프루엔자 바이러스 게놈은 면역원성 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA) 단백질을 암호화하는 선형 (-) 사슬 리보핵산(RNA)의 8개의 분절과, 6개의 내부 중심 폴리펩티드 즉, 뉴클레오캡시드 핵 단백질(NP); 매트릭스 단백질(M); 비-구조 단백질(NS); 및 3개의 RNA 중합 효소(PA, PB1, PB2) 단백질로 구성되어 있다. 복제시, 게놈 바이러스 RNA는 숙주 세포의 핵 내에서 (+) 사슬 메신저 RNA와 (-) 사슬 게놈 cRNA로 전사된다. 8개의 게놈 분절 각각은 RNA 이외에, NP와 중합 효소 복합체(PB1, PB2 및 PA)를 함유하는 리보 핵 단백질 복합체로 팩키징된다.
본 발명의 MDCK 세포에서 본 발명의 방법에 의하여 생산될 수 있는 인플루엔자 바이러스로서는, 약독화된 온도 감수성의 마스터 균주로서 확인된 균주에 선택된 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미다제 항원이 통합되어 있는 재분류 바이러스 를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 바이러스는 예를 들어, 온도-감수성(ts), 냉각-적응성(ca) 또는 약독화(att)된 균주 중 하나 이상인 마스터 균주[예를 들어, A/앤 아버/6/60, B/앤 아버/1/66, PR8, B/레닌그라드(Leningrad)/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/레닌그라드/179/86, B/레닌그라드/14/55, B/잉글랜드(England)/2608/76, A/푸에르토 리코(Puerto Rico)/8/34 (즉, PR8) 등 또는 이의 항원성 변이체나 유도체]를 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 백신
역사적으로, 인플루엔자 바이러스 백신은, 관련 균주의 실험을 통한 징후를 바탕으로 하여 선택된 바이러스 균주를 이용하여 부화 달걀 내에서 생산되어 왔다. 더욱 최근에는, 재분류 바이러스는 약독화된 온도-감수성의 마스터 균주의 선택된 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 항원이 통합되어 있는 재분류 바이러스가 생산되고 있다. 달걀 내에서 수차례 계대 배양함으로써 바이러스를 배양한 후, 인플루엔자 바이러스는 회수되며, 이 바이러스는 임의로는, 예를 들어, 포름알데히드 및/또는 β-프로피오락톤을 사용하여 불활성화된다. 그러나, 이러한 방식으로 인플루엔자 백신을 생산할 경우에는 몇 가지 단점이 있다. 즉, 달걀에 남아 있던 오염 물질은 항원성, 발열원성이 매우 커서, 투여시 종종 심각한 부작용을 초래한다는 점이다. 더욱 중요한 점은, 생산용으로 디자인된 균주는 차기 인플루엔자 발병 시기가 도래하기 수 개월 전(인플루엔자 백신을 생산 및 불활성화할 수 있는 시간)의 것으로서 선택 및 공급하여야 한다는 점이다. 세포 배양액 중에서 재조합 및 재분류 백신을 생산하려는 시도는, 백신 생산용으로서 승인된 균주 중 임의의 것이 표준적인 세포 배양 조건 하에서 효율적으로 성장할 수 없는 특성에 의해 좌절되었다.
본 발명은 하나의 또는 다수의 선택된 항원성 바이러스 균주에 상응하는 백신을 신속하게 생산할 수 있는, 배양액 중에서 재조합 및 재분류 바이러스를 생산하기 위한 벡터 시스템, 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 세포 배양액 중에서 다수의 플라스미드 시스템으로부터 바이러스를 효율적으로 생산하는 조건 및 균주가 제공된다. 임의로, 원할 경우, 바이러스는 바이러스를 회수하는데 사용되었던 배양액과 상이한 세포 배양액 또는 달걀 중에서 추가로 증식할 수 있다.
예를 들어, 표준적인 세포 배양 조건 예를 들어, 37℃에서 인플루엔자 B 마스터 균주 B/앤 아버/1/66이 생육할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 각각에 인플루엔자 바이러스 게놈 분절이 통합되어 있는 다수의 플라스미드는 적당한 세포에 도입되어, 35℃ 이하의 온도의 배양액 중에 유지된다. 통상적으로, 배양액은 약 32∼35℃, 바람직하게는 약 32∼약 34℃, 예를 들어, 약 33℃에서 유지된다.
통상적으로, 배양액은 시스템 예를 들어, 습도와 CO2 농도가 제어되고, 온도 조절기 예를 들어, 자동 온도 조절 장치가 장착되어, 온도가 35℃를 넘지 않도록 일정하게 유지되는 세포 배양 항온 처리기 내에 유지된다.
재분류 인플루엔자 바이러스는 마스터 인플루엔자 바이러스의 게놈 분절을 암호화하는 cDNA와, 목적 균주(예를 들어, 목적으로 하는 항원성 변이체)로부터 유래하는 상보성 분절을 포함하는 벡터 하위 세트를 도입함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 통상적으로, 마스터 균주는 백신 투여와 관련된 바람직한 특성을 바탕으로 하여 선택된다. 예를 들어, 백신 생산 예를 들어, 살아있는 약독화된 백신 생산에 있어서, 마스터 공여 바이러스 균주는 약독화된 표현형, 냉각 적응성 및/또는 온도 감수성이 있는 것으로서 선택될 수 있다. 여기서, 인플루엔자 A 균주 ca A/앤 아버/6/60; 인플루엔자 B 균주 ca B/앤 아버/1/66; 또는 바람직한 표현형적 특성을 가지는 것으로 선택된 기타 균주(예를 들어, 약독성, 냉각 적응성 및/또는 온도 감수성 균주)를 마스터 공여 균주로서 선택하는 것이 바람직하다.
하나의 구체예에서, 인플루엔자 마스터 바이러스 균주의 6개의 내부 vRNA 분절을 암호화하는 cDNA를 포함하는 플라스미드(즉, PB1, PB2, PA, NP, NB, M1, BM2, NS1 및 NS2)는, 항원으로서 바람직한 균주 예를 들어, 매우 국소적이거나 전반적인 인플루엔자 감염을 유발시키는 것으로 예상되는 균주로부터 유래하는 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 vRNA 분절을 암호화하는 cDNA와 함께 적당한 숙주 세포에 형질 감염된다. 효율적으로 회수하는데 적당한 온도 예를 들어, 35℃ 이하의 온도 예를 들어, 약 32∼35℃, 예를 들어, 약 32∼약 34℃, 또는 약 33℃에서, 세포 배양액 중에서 재분류 바이러스를 복제시킨 후, 재분류 바이러스는 회수된다. 임의로는, 회수된 바이러스는 변성제 예를 들어, 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤을 사용하여 불활성화될 수 있다.
백신을 예방제로서 투여하는 방법 및 이를 위한 조성물
본 발명의 재조합 및 재분류 바이러스는 적당한 담체 또는 부형제 중에 예방학적으로 투여되어, 그 결과 인플루엔자 바이러스 중 하나 이상의 균주에 특이적인 면역 반응을 촉진할 수 있다. 통상적으로, 담체 또는 부형제로서는, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제 예를 들어, 멸균수, 염수 수용액, 완충 염수 수용액, 덱스트로즈 수용액, 글리세롤 수용액, 에탄올, 감염되지 않은 달걀에서 얻은 요수(allantonic fluid)(즉, 정상적인 요수 "NAF") 또는 이들의 혼합물이 있다. 멸균성, pH, 등장성 및 안정성을 보장하는 이러한 용액은 당 업계에 확립된 방법에 따라서 제조된다. 일반적으로, 담체 또는 부형제는 알레르기 효과 및 기타 원치않는 효과를 최소화하는 것으로서 선택되고, 또한 특정의 투여 방식 예를 들어, 피하, 근육 내 및 비강 내 등의 투여 방식에 적당한 것으로서 선택된다.
일반적으로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 중 하나 이상의 균주에 특이적인 면역 반응을 촉진하는데 충분한 양만큼 투여된다. 바람직하게, 인플루엔자 백신을 투여하면, 보호 면역 반응이 유도된다. 하나 이상의 인플루엔자 균주에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 투여량 및 방법에 관하여는 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 불활성화된 인플루엔자 바이러스는 약 1∼1000 HID50(인간 감염 투여량)으로서 제공되는데, 즉, 투여된 양당 약 105∼108 pfu(플라크 형성 단위)의 범위로서 제공된다. 대안적으로, 약 10∼50㎍ 예를 들어, 약 15㎍의 HA가 애쥬반트 없이 투여되는데, 애쥬반트와 함께 투여될 때에는 이보다 소량으로 투여된다. 통상적으로, 투여량은 예를 들어, 연령, 신체적 조건, 체중, 성별, 식성, 투여 시간 및 기타 임상 요인을 바탕으로 하여 상기 범위 내로 조정될 것이다. 예방용 백신 제형은 예를 들어, 바늘 및 시린지, 또는 바늘이 없는 주사 장치를 사용하는 피하 또는 근육 내 주사에 의하여 전신 투여된다. 대안적으로, 백신 제형은 점적, 큰 입자 에어로졸(약 10 마이크론 이상)에 의해 비강 내 투여되거나, 또는 상기도로 도포된다. 상기 전달 경로 중 임의의 경로를 통하여 보호성 전신 면역 반응을 유도함에 있어서, 비강 내 투여는 인플루엔자 바이러스 도입 위치에서 점막 면역성을 유도하는 부가의 이점을 부여한다. 비강 내 투여에 있어서, 약독화된 살아있는 바이러스 백신은 종종, 예를 들어, 약독화, 냉각 적응성 및/또는 온도 감수성의 재조합 또는 재분류 인플루엔자 바이러스인 것이 바람직하다. 단일 투여로 인한 보호성 면역 반응(protective immune response)을 촉진함에 있어서, 동일하거나 상이한 경로에 의하여 추가 투여될 수 있으며, 그 결과, 바람직한 예방 효과를 얻을 수 있다.
대안적으로, 면역 반응은 인플루엔자 바이러스를 사용하여 수지상 세포를 생체 외 또는 생체 내 표적화함으로써 촉진될 수 있다. 예를 들어, 증식성 수지상 세포는 수지상 세포에 의하여 인플루엔자 항원을 포획하기 충분한 양과 충분한 시간 동안 바이러스에 노출된다. 이후, 이 세포는 표준적인 정맥 내 이식법에 의해 백신화될 개체에 투여된다.
임의로, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 서브유닛의 예방 투여용인 제형은 또한 인플루엔자 항원에 대한 면역 반응을 강화하기 위한 하나 이상의 애쥬반트를 함유하기도 한다. 적당한 애쥬반트로서는 사포닌, 무기 겔 예를 들어, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질 예를 들어, 리소레시틴, 플루론산 폴리올, 다가 음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 유액, 바실레 칼메트-구에린(bacille Calmette-Guerin (BCG)), 코린박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum), 및 합성 애쥬반트 QS-21 및 MF59를 포함한다.
원한다면, 인플루엔자 바이러스의 예방용 백신은 하나 이상의 면역 촉진 분자를 투여할 때 같이 투여될 수 있다. 면역 촉진 분자로서는, 면역 촉진 활성, 면역 증강 활성 및 전-염증 활성을 가지는 다수의 시토킨, 림포카인 및 케모킨 예를 들어, 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12 및 IL-13); 성장 인자(예를 들어, 과립구-대식 세포(GM)-콜로니 자극 인자(CSF)); 및 기타 면역 촉진 분자 예를 들어, 대식 세포 염증 인자, Flt3 리간드, B7.1; B7.2 등을 포함한다. 상기 면역 촉진 분자는 인플루엔자 바이러스와 동일한 제형으로서 투여될 수 있거나, 또는 별도 투여될 수 있다. 단백질 또는 이 단백질을 발현하는 발현 벡터는 면역 촉진 효과를 나타내도록 투여될 수 있다.
다른 구체예에서, 인플루엔자 게놈 분절을 포함하는 본 발명의 벡터는 이종 핵산을 숙주 유기체 또는 숙주 세포 예를 들어, 포유동물 세포 예를 들어, 인간 개체로부터 유래하는 세포에, 적당한 약학적 담체 또는 부형제(전술함)와 함께 도입하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 이종 핵산은 유전자 또는 유전자 분절의 비 필수 부위 예를 들어, 7번 분절의 M 유전자에 삽입된다. 상기 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 RNA 예를 들어, 안티센스 RNA 또는 리보자임을 암호화할 수 있다. 이후, 이종 핵산은, 이종 핵산이 통합되어 있는 재조합 바이러스를 생산함으로써 숙주 또는 숙주 세포에 도입되며, 바이러스는 전술한 바와 같이 투여된다. 하나의 구체예에서, 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 것이 아니다.
대안적으로, 이종 핵산을 포함하는 본 발명의 벡터는 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포에 벡터를 공동 형질 감염함으로써, 숙주 세포에 도입되어 발현될 수 있다. 임의로, 세포는 회수되거나, 또는 개체에, 통상적으로는 세포를 얻었던 개체에 전달된다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는, 확립된 세포 운반 방법 또는 이식 방법을 통하여, 목적으로 하는 조직, 기관 또는 시스템 위치(전술한 바와 같음)에 이식된다. 예를 들어, 조혈 모세포 계통의 줄기 세포 예를 들어, 골수, 제대혈 또는 조혈 모 줄기 세포로부터 유래하는 말초 혈액은 표준적인 절달 기술 또는 주입 기술을 이용하여 개체에 전달될 수 있다.
대안적으로, 이종 핵산을 포함하는 바이러스는 생체 내에서 개체 세포에 전달될 수 있다. 통상적으로, 이러한 방법은 벡터 입자를 표적 세포 군집(예를 들어, 혈액 세포, 피부 세포, 간 세포, 신경 세포(뇌 세포 포함), 신장 세포, 자궁 세포, 근육 세포, 소장 세포, 자궁 경부 세포, 질 세포, 전립선 세포 등과, 다수의 세포, 조직 및/또는 기관으로부터 유래하는 종양 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 투여는 예를 들어, 바이러스 입자를 정맥 내 투여하거나, 또는 바이러스 입자를 목적으로 하는 위치(들)에 다수의 방법 예를 들어, 주사(예를 들어, 바늘이나 시린지, 또는 바늘 없는 백신 전달 장치 사용)함으로써 직접 전달하거나, 국소 투여, 또는 조직, 기관 또는 피부 위치에 밀어넣는 방법을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터 입자는, 흡입, 경구, 정맥 내, 표피 하, 진피 하, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 초 내, 질 내 또는 직장 내 투여되거나, 또는 바이러스 입자를 수술시 체강 또는 체 내 다른 위치에 투여함으로써 전달될 수 있다.
전술한 방법은 치료학적 또는 예방학적으로 효과적인 폴리펩티드(또는 펩티드) 또는 RNA(예를 들어, 안티센스 RNA 또는 리보자임)을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 벡터를, 시험관 내, 세포 외, 또는 생체 내 표적 세포 군집에 도입함으로써, 질병 또는 질환을 치료학적 및/또는 예방학적으로 치료하는데 유용하다. 통상적으로, 목적으로 하는 폴리펩티드(또는 펩티드) 또는 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 "발현 벡터" 및 "부가의 발현 요소" 섹션에 기술된 바와 같이, 적당한 조절 서열에 작동 가능하도록 결합된다. 임의로, 하나 이상의 이종 암호화 서열은 단일의 벡터 또는 바이러스에 통합된다. 예를 들어, 치료학적 또는 예방학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 이외에, 벡터는 또한 부가의 치료학적 또는 예방학적 폴리펩티드 예를 들어, 항원, 보조-자극 분자, 시토킨 및 항체 등 및/또는 마커 등을 포함할 수도 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 제제 예를 들어, 벤조나제로 처리되어 잠재적인 발암 유전자를 제거한, 본 발명의 재분류 및 재조합 바이러스(또는 이의 일부)를 포함하는 조성물을 제공한다. 그러므로, 발암 유전자가 없는 백신 조성물은 특히 본 발명의 구체예에 포함된다.
본 발명의 방법 및 벡터는 다양한 질환 예를 들어, 유전적 질환 및 후천적 질환을, 예를 들어, 바이러스 및 박테리아 등으로 인하여 유발되는 감염성 질병에 대한 백신으로서 치료학적 또는 예방학적으로 치료하는데 사용될 수 있다.
키트
본 발명의 벡터와 벡터 시스템의 사용을 촉진하기 위해서, 벡터 중 임의의 것 예를 들어, 공통 인플루엔자 바이러스 플라스미드, 변이체 인플루엔자 폴리펩티드 플라스미드, 인플루엔자 폴리펩티드 라이브러리 플라스미드 등과, 실험용 또는 치료용 인플루엔자 바이러스의 팩키징 및 감염에 유용한 부가의 성분들 예를 들어, 완충액, 세포, 배양 배지를 키트의 형태로 팩키징할 수 있다. 통상적으로, 키트는 상기 성분들 이외에도, 예를 들어, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침, 팩키징 재료 및 용기를 포함할 수 있는 부가 재료를 함유한다.
바이러스 핵산 및 단백질의 조작
본 발명의 내용 중, 본 발명의 개 RNA polI 조절 서열 또는 기타 핵산을 포함하는 핵산, 발현 벡터, 인플루엔자 바이러스 핵산 및/또는 단백질 등은 널리 공지된 분자 생물학적 기술에 따라서 조작될 수 있다. 이러한 방법 예를 들어, 증폭법, 클로닝법, 돌연 변이 유발법, 형질 전환법 등에 대한 상세한 절차는 예를 들어, 문헌[Ausubel외 다수 Current Protocols in Molecular Biology (2000년 증보판) John Wiley & Sons, New York ("Ausubel"); Sambrook외 다수 Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook"), 및 Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger")]에 개시되어 있다.
전술한 참고 문헌 이외에, 예를 들어, 본 발명의 cDNA 프로브를 증폭시키는데 유용한 시험관 내 증폭 기술 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), Qβ-레플리카제 증폭법, 및 기타 RNA 중합 효소 매개 기술(예를 들어, NASBA)에 대한 절차는 문헌[Mullis외 다수 (1987) 미국 특허 제4,683,202호; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis외 다수 eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"); Arnheim and Levinson (1990) C& EN 36; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81; Kwoh외 다수 (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 1173; Guatelli외 다수 (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874; Lomell외 다수 (1989) J Clin Chem 35:1826; Landegren외 다수 (1988) Science 241:1077; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer외 다수 (1990) Gene 89:117, 및 Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13:563]에 개시되어 있다. 본 발명에 있어서, 핵산을 클로닝하는데 유용한 추가의 방법으로서는 미국 특허 제5,426,039호(Wallace외 다수)에 개시된 방법을 포함한다. PCR에 의하여 큰 핵산을 증폭시키는 개선된 방법에 관하여는 문헌[Cheng외 다수 (1994) Nature 369:684] 및 이 문헌에 인용된 참고 문헌에 요약되어 있다.
본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 다양한 고상 기술 예를 들어, 모노뉴클레오티드-계 및/또는 트리뉴클레오티드-계 포스포라미디트 커플링 화학 기술을 활용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 활성화된 단량체 및/또는 삼량체를 연속으로 첨가하여 폴리뉴클레오티드 사슬을 연장시킴으로써 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Caruthers, M.H.외 다수 (1992) Meth Enzymol 211 :3]을 참조하시오.
원하는 서열을 합성하는 대신에, 본질적으로 다양한 공급원 예를 들어, 더 미들랜드 서티파이드 리에이전트 컴파니(The Midland Certified Reagent Company; mcrc@oligos.com), 더 그레이트 아메리칸 진 컴파니(The Great American Gene Company; www.genco.com), 익스프레스진 인코포레이션(ExpressGen, Inc.; www.expressgen.com), 오페론 테크놀로지스 인코포레이션(Operon Technologies, Inc.; www.operon.com) 및 기타 다수의 공급원으로부터 임의의 핵산을 주문하여 구입할 수 있다.
뿐만 아니라, 바이러스 폴리펩티드 내에 발병한 선택된 아미노산 잔기들의 치환은 예를 들어, 위치 배향 돌연 변이 유발법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 원하는 표현형 예를 들어, 약독화된 표현형, 냉각 적응성, 온도 감수성과 기능적 상관된 아미노산 치환이 일어난 바이러스 폴리펩티드는, 특정 돌연 변이를 폴리펩티드를 암호화하는 바이러스 핵산 분절에 도입함으로써 생산될 수 있다. 위치 배향 돌연 변이 유발법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Ausubel, Sambrook, 및 Berger, 상동]에 개시되어 있다. 위치 배향 돌연 변이 유발법을 수행하는 다양한 키트가 시판중에 있으며, 그 예로서는 카멜레온 위치 배향 돌연 변이 유발 키트(Chameleon Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene, La Jolla)가 있으며, 또한 이는 제조자의 지침에 따라서 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환을 인플루엔자 A 또는 B 폴리펩티드를 각각 암호화하는 게놈 분절에 도입하는데 사용될 수 있다.
기타 바이러스
본 발명의 핵산, 벡터 및 방법은 또한 기타 재조합 바이러스를 발현 및 정제하는데 사용될 수도 있다. 다음과 같은 논의들은 기타 바이러스와 함께 사용되는 벡터를 순응시킴에 있어서 중요한 사항들을 알려 준다.
만일 표적 바이러스가 양성 가닥, 분절 RNA 게놈을 포함하면, 개 RNA polI 프로모터는 내부 전사 단위(1 방향 시스템) 내 cDNA의 상류에 존재하는 것이 바람직하다. 이 구체예에서, 양성 가닥 RNA는 신규의 바이러스에 직접 통합되어 생산된다. 그러나, 표적 바이러스가 네거티브 가닥을 포함하는 구체예에 있어서, 1 방향 시스템을 이용하여 생산된 분절 RNA 게놈도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
만일 표적 바이러스가 네거티브 가닥 분절 RNA 게놈을 포함하면, 개의 RNA polI 프로모터는 바람직하게는, 내부 전사 단위(2 방향 시스템) 내 cDNA의 하류에 존재하는 것이 바람직하다. 이 구체예에서, 네거티브 가닥 RNA는 새로운 바이러스에 직접 통합되어 생산된다. 표적 바이러스가 양성 가닥을 포함하는 구체예에 있어서, 2 방향 시스템을 이용하여 생산된 분절 RNA 게놈도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 또한 감염성 또는 비 감염성 비 분절 RNA 게놈(단일 사슬 또는 이중 사슬)을 포함하는 바이러스를 생산하는데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 감염성 바이러스 게놈 RNA를 숙주 세포에 단순히 도입하는 것만으로도, 이 세포에서 바이러스 생활 주기를 개시하고, 궁극적으로는 완전한 바이러스를 생산하는데 충분하다. 예를 들어, 피코나바이러스 게놈 RNA를 숙주 세포에 단순히 도입하는 것만으로도, 완전한 피코나바이러스를 생산하는데 충분하다. 비 감염성 게놈 RNA를 포함하는 바이러스의 생활 주기를 개시할 경우에는, 일반적으로, 게놈과 함게 바이러스 입자 내에 운반되는 기타 바이러스 단백질을 추가로 도입해야 한다. 예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스 III은 RNA 의존성 RNA 중합 효소를 운반하는데, 여기서, 상기 중합 효소는 새로 감염된 숙주 세포에서 바이러스 게놈 RNA 복제와 바이러스 mRNA 전사를 개시하는데 필요하며, 이 중합 효소가 존재하지 않으면, 파라인플루엔자 III 게놈 RNA도 감염성을 갖지 않는다. 감염성인 비 분절 게놈 RNA를 포함하는 바이러스가 생산되는 본 발명의 구체예에 있어서, 바이러스 게놈을 포함하는 핵산을 운반하는 본 발명의 이중 발현 플라스미드를 적당한 숙주 세포에 단순히 도입하기만 하여도, 완전한 바이러스를 생산하는데 충분하다. 비 감염성의 비 분절 게놈 RNA를 포함하는 바이러스가 생산되는 구체예에 있어서, 부가의 발현 플라스미드는 또한 바이러스 게놈을 운반하는 이중 발현 플라스미드와 함께 숙주 세포에 도입될 수 있다. 부가의 플라스미드는 보통은 감염시에 숙주 세포에 도입되는, 바이러스 생활 주기를 개시하는데 필요한 단백질(예를 들어, RNA 의존성 RNA 중합 효소)를 발현해야 한다.
감염성의 비 분절 RNA 게놈을 포함하는 피코나바이러스가 생산되는 구체예에서, 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 cDNA는 본 발명의 이중 프로모터 발현 플라스미드에 삽입된다. 외부 전사 단위 내 상류 프로모터, 바람직하게는 polII 프로모터는 완전한 바이러스 게놈을 포함하는 양성 가닥 mRNA의 생산을 유도하는데, 여기서, 폴리단백질은 mRNA로부터 번역되고, 각각의 단백질은 (예를 들어, 폴리단백질 내 프로테아제에 의해) 절단되어 폴리단백질로부터 방출된다. 바이러스 게놈은 양성 가닥 RNA를 포함하므로, 내부 전사 단위(1 방향 시스템) 내 제2의 상류 프로모터, 바람직하게는 개 RNA polI 프로모터는 게놈의 양성 가닥 복사체의 생산을 유도한다. 만일 바이러스 게놈이 네거티브 가닥 RNA를 포함하면, 내부 전사 단위(2 방향 시스템) 내 존재하는 제2의 하류 프로모터, 바람직하게는 개의 RNA polI 프로모터는 게놈의 네거티브 가닥 복사체의 생산을 유도한다. 네거티브 가닥인 비 분절 RNA 바이러스가 1 방향 시스템을 사용하여 생산되는 구체예는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이와 유사하게, 양성 가닥인 비 분절 RNA 바이러스가 2 방향 시스템을 사용하여 생산되는 구체예도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
비 감염성인 비 분절 RNA 게놈을 포함하는 바이러스[여기서, 폴리단백질은 생산되지 않음]는 또한 본 발명을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 시스템은 래비도비리대(rhabdoviridae) 바이러스 또는 파라믹소비리대(paramyxoviridae) 바이러스, 바람직하게는 파라인플루엔자(parainfluenza) 바이러스 III 즉, 생활 주기가 보통, 바이러스 유래 RNA 의존성 RNA 중합 효소에 의해 게놈 네거티브 가닥 RNA로부터 다수의 1 시스트론 mRNA를 생산하는 단계를 포함하는 바이러스를 생산하는데 사용될 수 있으며; 각각의 단백질은 1 시스트론 mRNA로부터 발현된다. 이러한 구체예에서, 프로모터, 바람직하게는 polII 프로모터를 포함하는 외부 전사 단위는 양성 가닥, 즉, 제1 유전자(NP)만이 번역되는 바이러스 게놈의 다중 시스트론 복사체의 생산을 유도한다. 뿐만 아니라, 프로모터, 바람직하게는 개의 polI 프로모터를 포함하는 내부 전사 단위는 새로운 바이러스에 통합하기 위한 게놈의 mRNA 복사체의 발현을 유도한다. 파라인플루엔자 III 바이러스 게놈은 네거티브 가닥 RNA를 포함하므로, 내부 전사 단위의 프로모터는 cDNA(2 방향 시스템)의 하류에 존재하는 것이 바람직하다. 만일 바이러스 게놈이 양성 가닥 RNA를 포함하면, 내부 전가 단위의 프로모터는 cDNA(1 방향 시스템)의 상류에 존재하는 것이 바람직하다. 양성 가닥 RNA 게놈을 포함하는 바이러스가 2 방향 시스템을 사용하여 생산되는 구체예와, 네거티브 가닥 RNA 게놈을 포함하는 바이러스가 1 방향 시스템을 사용하여 생산되는 구체예는 본 발명의 범위에 포함된다. 부가의 바이러스 단백질(다중 시스트론 mRNA로부터 발현되는 단백질 제외)은 바이러스 전사 및 복제에 필요하고(L 및 P), 이러한 단백질은 각각 별도의 발현 플라스미드에 제공된다.
본 발명은 또한 이중 사슬의 분절 RNA 게놈을 포함하는 바이러스가 생산되는 구체예도 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 표적 바이러스 게놈 내 각 유전자를 포함하는 플라스미드는 본 발명의 이중 프로모터 발현 플라스미드에 삽입될 수 있다. 이 플라스미드는 1 방향 플라스미드 또는 2 방향 플라스미드일 수 있다. 외부 전사 단위 내 프로모터, 바람직하게는 polII 프로모터는 암호화된 단백질로 번역되는 각 유전자의 mRNA 전사체의 발현을 유도한다. 내부 전사 단위 내 프로모터, 바람직하게는 개 polI 프로모터는 양성 가닥(1 방향 시스템) 또는 네거티브 가닥(2 방향 시스템) 중 어느 하나의 전사를 유도한다. 결과적으로, 생산되는 제1 사슬은 바이러스 RNA 중합 효소에 의한 상보성 사슬 생산용인 주형으로서 작용할 수 있다. 결과로 생성된 이중 사슬 RNA 산물은 새로운 바이러스에 통합된다.
특정 구체예
1. 개 RNA 중합 효소 I 조절 서열을 포함하는 분리된 핵산.
2. 제1항의 구체예에 있어서, 상기 조절 서열은 프로모터인 것인 핵산.
3. 제1항의 구체예에 있어서, 상기 조절 서열은 인핸서인 것인 핵산.
4. 제1항의 구체예에 있어서, 상기 조절 서열은 인핸서 및 프로모터인 것인 핵산.
5. 제1항의 구체예에 있어서, 상기 RNA 중합 효소 조절 서열은 서열 번호 1의 1∼1804번 뉴클레오티드, 또는 이의 기능적 활성 단편을 포함하는 것인 핵산.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 구체예에 있어서, 상기 조절 서열은 네거티브 가닥 바이러스 게놈 RNA 또는 상응하는 cRNA를 암호화하는 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 것인 핵산.
7. 제6항의 구체예에 있어서, 상기 네거티브 가닥 바이러스 게놈 RNA는 인플루엔자 게놈 RNA인 것인 핵산.
8. 제6항 또는 제7항의 구체예에 있어서, 상기 핵산은 전사 종결 서열을 추가로 포함하는 것인 핵산.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 구체예에 의한 핵산을 포함하는 발현 벡터.
10. 제9항의 구체예에 있어서, 상기 발현 벡터는 박테리아 복제 기원을 포함하는 것인 발현 벡터.
11. 제9항의 구체예에 있어서, 상기 발현 벡터는 원핵 생물 세포에서 선택될 수 있는 선별 마커를 포함하는 것인 발현 벡터.
12. 제9항의 구체예에 있어서, 상기 발현 벡터는 진핵 생물 세포에서 선택될 수 있는 선별 마커를 포함하는 것인 발현 벡터.
13. 제9항의 구체예에 있어서, 상기 발현 벡터는 다중 클로닝 위치를 포함하는 것인 발현 벡터.
14. 제13항의 구체예에 있어서, 상기 다중 클로닝 위치는 개 RNA 중합 효소 I 조절 서열과 관련하여 배향되어 있어서, 이 다중 클로닝 위치에 도입된 암호화 서열이 조절 서열로부터 전사할 수 있도록 만들어 주는 것인 발현 벡터.
15. 제7항의 구체예의 핵산을 전사하여, 인플루엔자 게놈 RNA를 생산하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 게놈 RNA를 생산하는 방법.
16. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 의한 발현 벡터와, PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 및 NS2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 개 세포를 배양하는 단계; 및 재조합 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
17. 제16항의 구체예에 있어서, 헬퍼 바이러스가 사용되는 것인 방법.
18. 제16항의 구체예에 있어서, 상기 생산된 인플루엔자 바이러스는 감염성인 것인 방법.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의한 구체예에 있어서, 1×103PFU/㎖ 이상의 인플루엔자 바이러스를 생산하는 것인 방법.
20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 구체예에 의한 핵산을 포함하는 세포.
21. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 구체예에 의한 발현 벡터를 포함하는 세포.
22. 제20항 또는 제21항의 구체예에 있어서, 상기 세포는 개의 세포인 것인 세포.
23. 제22항의 구체예에 있어서, 상기 개의 세포는 신장 세포인 것인 개의 세포.
24. 제23항의 구체예에 있어서, 상기 개의 신장 세포는 MDCK 세포인 것인 개의 신장 세포.
25. 배양된 개 세포에서 3개 이상의 게놈 vRNA 분절을 가지는 재조합 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산하는 방법으로서, (a) 개의 세포에서 게놈 vRNA 분절을 발현하여, 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공할 수 있는 발현 벡터의 제1 세트를 개의 세포 군집에 도입하는 단계; (b) 상기 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제2 세트를 상기 세포에 도입하는 단계; 그리고 (c) 상기 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
26. 제25항의 구체예에 있어서, 감염성 인플루엔자 바이러스 입자가 생산되는 것인 방법.
27. 제25항 또는 제26항의 구체예에 있어서, 헬퍼 바이러스가 사용되는 것인 방법.
28. 배양된 개 세포에서 감염성 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하는 방법으로서, (a) 개 세포에서 i) 게놈 vRNA 분절을 발현하여, 감염성 인플루엔자 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 발현할 수 있고, ii) 이 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터 세트를 개 세포 군집에 도입하는 단계; (b) 이 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
29. 인플루엔자 바이러스의 vRNA 분절을 전사하는 방법으로서, 서열 번호 1∼서열 번호 19의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 개 polI 중합 효소 폴리펩티드를 접촉시키는 단계[여기서, 상기 핵산은 네거티브 가닥 바이러스의 vRNA 분절을 암호화하는 cDNA 분자에 작동 가능하도록 결합되어 있음]; 및 전사된 vRNA 분절을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
30. 제29항의 구체예에 있어서, 상기 vRNA는 숙주 세포에서 전사되는 것인 방법.
31. 제16항 내지 제19항 및 제25항 내지 제28항 중 어느 하나의 항의 구체예에 있어서, 각각의 발현 벡터는 별개의 플라스미드 상에 존재하는 것인 방법.
32. 다수의 벡터를 포함하는 조성물로서, 여기서, 상기 다수의 벡터는, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 polI 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 polI 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 polI 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 polI 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 polI 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 polI 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 polI 프로모터를 포함하는 벡터, 그리고 전사 종결 서열에 결합되어 있는 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 개의 polI 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 것인 조성물.
33. 제32항의 구체예에 있어서, 상기 조성물은 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 및 NS2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 추가로 포함하는 것인 조성물.
34. 제32항 또는 제33항의 구체예에 의한 조성물을 포함하는 숙주 세포.
35. 제16항 내지 제19항 및 제25항 내지 제28항 중 어느 하나의 항의 구체예에 의한 방법으로 생산된 바이러스를 포함하는 백신.
36. 제16항 내지 제19항 및 제25항 내지 제28항 중 어느 하나의 항의 구체예에 의한 방법으로 생산된 바이러스로 제조된 면역원성 조성물을 포함하는 백신.
37. 각각의 발현 벡터가 별개의 플라스미드 상에 존재하는, 제35항 또는 제36항의 구체예에 의한 백신을 포함하는 조성물.
이하의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 어떠한 방식으로든 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: MDCK 세포에서의 인플루엔자 균주의 성장
본 실시예에서는 인플루엔자 배양용인 몇몇 세포주의 특징에 관하여 기술하고 있다. 몇몇 상이한 세포주 및 1차 세포 예를 들어, MRC-5, WI-38, FRhL2, PerC6, 293, NIH 3T3, CEF, CEK, DF-1, Vero 및 MDCK를 사용하여, 이 세포들이 실험실 적응(예를 들어, 냉각 적응(ca)) 인플루엔자 균주로부터 유래하는 야생형(wt) 및 유전자 재조합체 즉, A형 및 B형을 생산하는지 여부에 대해 평가하였다. 다수의 세포 유형들은 몇몇 냉각-적응된 인플루엔자 균주를 제한된 정도로만 생산하였지만, MDCK만은 A형 및 B형 바이러스를 고 역가로 일정하게 생산하였다. 예를 들어, PerC6 세포는 임의의 wt 및 ca B형 바이러스의 복제를, 성장 동역학은 상이하되 MDCK 세포에서와 유사한 수준으로 허용하였다(도 1 참조). 이와는 대조적으로, PerC6는 다수의 ca A형 바이러스의 복제를 허용하지 못하였다. 도 2는 wt 및 ca A/시드니/05/97 및 A/베이징/262/95 바이러스에 대한 성장 곡선을 나타내는 것이다. 두 경우에 있어서, ca 균주는 PerC6 세포에서는 복제하지 않았다. 이와 유사하게, 도 3은, ca 균주는 PerC6 세포에서는 효율적으로 복제하지 않고, wt A/앤 아버 /6/60의 복제는 MDCK 세포에서 안정적이지 않음을 입증하는, wt 및 ca A/앤 아버/6/60에 대한 성장 곡선을 나타내는 것이다. 인플루엔자 바이러스의 PerC6 세포 내 복제를 실시간 PCR 분석한 결과, 감염 후 처음 24시간 경과시에는 ca 및 wt A 인플루엔자 바이러스 균주 모두의 바이러스 RNA(vRNA) 양은 증가하였으나, wt 균주의 바이러스 RNA만이 120시간 동안 계속 증가하였도, ca 균주는 그렇지 않았음을 알 수 있었다. 이와는 반대로, wt 및 ca vRNA는 3일 경과시까지 MDCK 세포에서 증가하다가 곧 정체기에 접어들었다(도 4 참조).
상기 MDCK 세포는 또한 이 세포가 잠재적 전염병의 백신인 ca A/베트남/1203/2004의 복제를 허용하는 능력을 갖는지에 대해서도 테스트되었다. MDCK 세포는 소량의 ca A/베트남/1203/2004으로 감염시켰으며, 상청액 중 바이러스는 감염 후 여러 시점에서 정량하였다. 감염 후 48시간 경과시까지, ca A/베트남/1203/2004의 역가는 약 8 log10 TCID50/㎖에 도달하였으며, 이후 3∼4일 동안에도 이 상태를 일정하게 유지하였다. 도 5를 참조하시오.
실험시, ATCC로부터 입수한 MDCK 세포(수탁 번호; CCL-34)를 10% 소 태아 혈청 공급원을 함유하는 배지(미국산) 또는 적당한 무 혈청 배지(예를 들어, SFMV 100) 중에서 제한된 회차 수만큼 증식시켜, 초기의 특성 규명 연구용인 예비-마스터(pre-master) 세포 스톡을 만들었다. 적당한 무 혈청 배지에 관하여는, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 미국 가 명세서 출원 제60/638,166호(2004년 12월 23일 출원); 및 미국 가 명세서 출원 제60/641,139호(2005년 1월 5일 출 원); 및 및 미국 출원 제11/304,589호(2005년 12월 16일 출원)에 개시되어 있다. 세포는 냉각-적응 백신 균주 및 활동성 균주의 복제를 허용하는 두 가지 유형의 세포 스톡과 두 가지 유형의 배지 모두에서 용이하게 생육할 수 있었다[이하, 표 1 및 도 5 참조].
Figure 112008004795782-PCT00019
[▲ 혈청의 부재 및 존재 하에서 생육한 MDCK에 있어서, 냉각-적응된 인플루엔자 균주의 복제력 비교]
PerC6 세포에서의 제한된 성장에 관여하는 유전자 분절을 관찰하기 위해, 8-플라스미드 회수 기술(eight-plasmid rescue technique)을 적용한 결과, 인플루엔자 A/AA/6/60 균주의 각 유전자 분절에 대한 7:1 재분류체를 생산하였다. 예를 들어, 미국 특허 제6,951,754호[8-플라스미드 인플루엔자 회수 시스템에 관하여 기술함]를 참조하시오. 도 6은 7:1 재분류체 각각에 대한 개략도와 명명법에 관하여 제시되어 있다. 이후, 결과로 생산된 재분류체를, 이 재분류체가 PerC6 세포에서 복제하는 능력을 가지는지 여부에 대해 검정하였다. 도 7을 참조하시오. 성장 제한 표현형을 맵에 PB2 및 PB1 유전자 분절로서 나타내었다. 이러한 표현형과 관련된 정확한 위치의 자세한 맵은 당 업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 작성될 수 있다. 예를 들어, 특정 유전자 분절 내 wt 및 ca 균주의 서열을 비교하면, wt 또는 ca 균주 내에서 역 돌연 변이될 수 있는 구체적인 차이점에 대한 동정이 가능할 것이다. 이후, 이러한 돌연 변이체를, 이 돌연 변이체가 PerC6 세포에서 성장할 수 있는 능력을 가지는지 여부에 대해 분석하였다. wt 균주의 성장을 억제하거나 ca 균주의 성장을 허용하는 임의의 돌연 변이를 성장 제한 표현형에 관여하는 돌연 변이로서 정의한다.
실시예 2: MDCK 세포주의 발암성
2개의 예비-마스터 MDCK 세포 스톡[하나는 혈청을 함유하는 배지 중에서 생육되었고, 다른 하나는 무 혈청 배지 중에서 생육됨]의 발암 가능성을, 5회 세포 계대 배양된 후 백신을 생산하는데 사용될 것으로 예측되는 단계에 있는, 무 흉선(athymic) 누드 마우스 모델에서 평가하였다. 발암성을 평가하기 위하여, 107개의 세포를 10마리의 마우스로 이루어진 군에 피하 주사하였으며, 84일 경과시 동물들을 안락사시켜 관찰하였다. 무 혈청 배지 중에서 계대 배양된 세포를 접종한 10마리의 동물들 중 6마리에서 신생 물질이 형성되었음을 알 수 있었다. 이와는 대조적으로, 10% 소 태아 혈청이 보충된 배지 중에서 계대 배양된 세포를 접종한 동물 중 어느 것에서도 신생 물질 형성에 대한 증거는 찾아볼 수 없었으나; 접종 위치에 섬유 육종이 약간 형성되었음을 알 수 있었으며, 또한 혈청 중에서 계대 배양된 세포는 발암성을 나타내지 않았다(표 2 참조).
2개의 상이한 배지 중에서 계대 배양된 MDCK 세포의 발암성 및 세포 핵학
혈청 불포함 10% 혈청
4회차 계대 배양 20회차 계대 배양 4회차 계대 배양 20회차 계대 배양
발암성 ND 신생 물질 형성됨 ND 신생 물질이 형성되지 않음. 다만, 주사 위치에 섬유 육종이 형성됨
TP50 * 평가치 (종양이 발생하지 않은 동물의 수/ 총 동물의 수 ND 약 107 (6/10) ND 평가 불가 (> 107) (0/10)
세포 핵학 (중간 염색체 번호; 평가) 78; 52∼82번 염색체 에 고루 분포됨 78; 52∼82번 염색체 에 고루 분포됨 78; 소수 세포의 경우에는, 70∼82번 염색체에 이상이 발생함 78; 소수 세포의 경우에는, 70∼82번 염색체에 이상이 발생함
TP50 * = 50%의 동물에서 종양을 유발하는데 필요한 세포 수 ND = 수행하지 않음
표 2에 나타낸 바와 같이, 각각의 배지 중에서 4회차 및 20회차 계대 배양한 2개의 예비 마스터 세포 스톡에 대해서 세포 핵형 분석을 수행하였다. 10% FCS 중에서 계대 배양된 비-발암성 세포의 중간 유사 분열 중기 염색체의 번호는 78이었으며, 이 경우, 기타 염색체(70∼82번 염색체)의 세포 내 분포는 비교적 제한적이었다. 무 혈청 배지 중에서 계대 배양된 세포의 중간 유사 분열 중기 염색체의 번호도 78이었으나, 상당수의 세포는 이수성 염색체(52∼82번 유사 분열 중기 염색체)를 가지는 것으로 확인되었다. 두 경우에 있어서, 세포 핵학 특성은 계대 배양을 하더라도 바뀌지 않았다.
실시예 3: 무 혈청 배지 중에서 생육할 수 있도록 하기 위한 MDCK 세포의 적응
ATCC로부터 입수한 MDCK 세포를 감마 조사 FBS를 함유하는 배지 중에서 계대 배양하였다. 이후, 이 세포들을 세포 은행 생산을 허용하도록 선택된 무 혈청 배지 제제 중에서 제한된 횟수만큼 계대 배양한다. 무 혈청 배지에 관하여는 미국 가 명세서 출원 제60/638,166호, 동 제60/641,139호 및 동 제11/304,589호에 개시되어 있다. 이와 같은 추가의 계대 배양은 37℃ 또는 33℃에서 수행될 수 있다. 이와 같이, 혈청이 아닌, 식물-유래 보충 성분을 함유하는 3개의 배지 중에서 수행되는 MDCK 세포의 계대 배양을 통하여, FCS 함유 배지 중에서 계대 배양된 MDCK 세포와 유사한 핵형을 가지는 세포를 얻을 수 있었다(데이터는 제시하지 않음).
실시예 4: MDCK 세포의 클로닝
세포 생산이 독특한 유전적 질서에 의해 결정된다는 사실을 확인하기 위하여, 희석을 제한함으로써 세포를 생물학적으로 클로닝하였다. 클론을 다양한 표현형적 특성 예를 들어, 복제 시간 및 상대적 발암성, 그리고 바이러스 복제 능에 대해 스크리닝하였다. 추상적 실험에 대한 초기의 증거로서, FCS를 함유하는 배지 중에서 54개의 MDCK 클론들을 생산하였다. 이 클론들을 계대 배양하였는데, 이들 클론은 각각 소량의 ca A/뉴 칼레도니아/20/99로 감염시켰다. 감염 후 수 일 경과시, 상청액을 제거하고, 상청액 중 바이러스 양을 TCID50으로 측정하였다. 소수의 클론은 비교적 높은 역가의 바이러스를 생산하였으며, 클로닝되지 않은 모 세포는 이보다 높은 역가의 바이러스를 생산하였다. 우수한 생물학적 특성 및 생리적 특성을 갖는 클론을 사용하여, 이하에 기술된 바와 같은 마스터 세포 은행(Master Cell Bank; MCB)을 확립하였다.
실시예 5: 마스터 세포 은행의 테스트 및 특성 규명
우발적인 제제가 존재하지 않음을 확인하기 위해 MCB를 광범위하게 테스트하였다. 예를 들어, 있을 수 있는 바이러스 제제에 대해 몇몇 PCR 및/또는 항체-특이적 테스트를 1회 이상 실시하였다(이하, 표 3 참조).
MCB에 대한 테스트 방식
일반적 테스트
무균 상태
마이코플라스마 존부
시험관 내 우발적 제제(다수의 세포주) 존부
생체 내 우발적 제제 존부
PERT
공동 배양
세포 핵학적 특성 관찰
전자 현미경
발암성 원 상태 세포(TP50)
세포 DNA의 발암성
세포 용해물의 발암성
9CFR 당 소 바이러스
9CFR 당 돼지 바이러스
MCB에 대한 테스트 방식
PCR */ Ab 특이적 테스트
제1형 및 제2형 AAV
HCMV
EBV
HSV
B, C 및 E형 간염 바이러스
HHV 6, 7 및 8
HIV 1 및 2
HPV
HTLV I 및 II
폴리오마(BK 및 JC 바이러스)
써코바이러스(Circovirus)
개의 파르보바이러스
개의 심신 이상(distemper)
아데노바이러스
SV40
실시예 6: 세포 배양액-유래 인플루엔자 바이러스의 전 임상적 특성 규명
본 실시예는 세포 배양액과 달걀로부터 생산된 인플루엔자 균주의 특성 규명 및 이 시스템으로부터 생산된 바이러스들을 비교한 결과에 관하여 기술하고 있다. 일반적으로, 인플루엔자 바이러스는 인간의 백신으로서 사용하기 적당하며, 바이러스를 이러한 용도로서 적합하도록 만드는 생물학적 특성을 보유한다. 이 실시예에서, 인플루엔자 바이러스는 냉각-적응성(ca: 저온에서 효율적으로 증식하는 능력을 가짐), 온도 감수성(ts: 고온에서 시험관 내 제한적으로 복제함) 및 약독화(att: 패럿의 폐 조직 내에서 복제되는 것을 확인할 수 없음)된 것으로서, 본원에서는 ca ts att 균주라고 칭한다. 비교 항목으로는 다음과 같은 것들을 포함한다: 바이러스 생산물의 생화학적 평가, 항원성 평가 및 유전적 평가(서열 결정); 인간 세포에서 복제한 후 바이러스의 생물학적 특성 규명 및 생화학적 특성 규명; 허용 가능한 동물 모델에 있어서의 복제; 및 허용 가능한 동물 모델에서의 면역원성.
유전적, 생화학적 및 항원성 비교
A/H1N1, A/H5N1, A/H3N2 및 B 형 ca ts att 균주는 MDCK 세포에서 비교적 높은 역가로서 복제하였다. 뿐만 아니라, 이러한 MDCK 세포 내 ca ts att 균주를 계대 배양하였을 경우에도 게놈 서열은 바뀌지 않았다. 3개의 ca ts att 균주인 ca A/시드니/05/97, ca A/베이징/262/95 및 ca B/앤 아버/1/94를 MDCK 세포 중에서 1회 또는 2회 계대 배양하고, 6개의 내부 유전자 모두의 전체 암호화 부위를 서열 결정하여, 이를 출발 물질과 비교하였다. 뉴클레오티드 변이는 관찰되지 않았는데, 이는 곧, 이와 같은 기질을 통한 계대 배양이 상기 균주의 유전적 조성을 바꾸지 않았음을 입증하는 것이다. 배지 조성, 접종량(moi), 항온 처리 온도 및 수집 시간을 포함하는, 생산 과정을 모의할 것으로 기대되는 조건 하에서, MDCK 세포에서 생산된 상이한 백신 균주에 대해 추가의 서열 특성 규명 작업을 수행하였다. 예비 데이터를 바탕으로 하였을 때, MDCK-생산 바이러스의 게놈 서열에는 변이가 일어나지 않을 것이라고 예상된다.
게놈은 MDCK 세포에서 계대 배양된 이후에도 유전적으로 안정하기 때문에, 달걀 또는 MDCK 세포에서 생산된 백신 간의 생물학적 특징은 뚜렷한 차이를 보이지 않을 것으로 예상된다. 그러나, 세포 배양액으로부터 유래하는 1차 바이러스 생산물은 달걀에서 생산된 생산물에 비하여, 특히, 바이러스 단백질인 HA 및 NA의 번역 후 변형이나, 바이러스 막 지질 조성면에서 몇 가지 미미한 차이점을 보이는데; 이 두 가지 경우 모두 비리온의 전체적인 물리적 특성을 잠재적으로 바꿀 수 있었다. 세포 배양액 생산 백신 및 달걀 생산 백신의 항원성에 대한 예비적 전 임상 데이터를 통하여, 이러한 중요한 매개 변수에서는 거의 차이를 보이지 않음을 입증할 수 있었다. 몇몇 백신 균주의 달걀 스톡을 MDCK 세포로써 계대 배양시켜, 참조 항혈청을 이용하여 HAI 역가를 측정함으로써 이 두 가지 생산물의 항원성을 측정하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, HAI 역가는 모두 각각에 대해서 2배 이내의 범위에서 차이를 나타냈는데, 이는 곧, 세포에서의 백신의 복제는 달걀 유래 물질에 비하여 백신의 항원성을 바꾸지 않았음을 말해주는 것이다.
달걀 및 MDCK 세포에서 생산된 균주의 HAI 역가
HAI 역가
균주 달걀-유래 MDCK 유래
A/파나마(Panama)/20/99 256 256
A/우한(Wuhan)/359/95 1024 2048
A/와이오밍(Wyoming)/03/2003 512 1024
B/질린(Jilin)/20/2003 64 32
B/홍콩(Hong Kong)/330/01 64 64
B/지앙수(Jiangsu)/10/2003 128 128
실시예 7: 배양액 중 인간 상피 세포의 감염
임의의 구체예에서, 인간 기원의 세포에서 MDCK 및 달걀 생산 백신을 복제시킨 후 이것들의 생화학적, 생물학적 및 구조적 유사성을 평가하기 위하여, 백신들을, 관련 이배체인 인간 세포 예를 들어, 정상의 인간 기관지 상피 세포(NHBE) 중에서 1회 계대 배양할 수 있다. 이와 같은 계대 배양은 인간의 기도가 1회 감염되었을 때의 상황을 모의하여, 자손 바이러스 즉, 궁극적으로 효과적인 면역 반응을 유도해내는 바이러스의 비교를 가능하도록 만드는데 사용될 것이다. 이 물질들을 통하여 백신의 헤마글루티닌(결합 및 융합)과 뉴라미다제의 활성에 대한 연구를 수행하였으며, 또한 기타 생화학적 및 구조적 연구 예를 들어, 전자 현미경 관찰, 전체 입자 비율에 대한 감염성 및 바이러스 게놈 균등물에 관한 연구도 수행하였다. 전반적으로, 이러한 연구는 유효하고 안전한 달걀 생산 백신과 세포-유래 백신을 비교하기 위한 것이다. 분석적 연구 결과를 이하 표 5에 요약하였다.
세포 및 달걀 생산 백신을 비교하기 위한 전 임상 연구
생체 내(페럿) 시험관 내*
약독화/복제 상 기도에서의 복제 정도 하 기도에서의 복제 동역학 바이러스 결합 헤마글루티닌 역가 상이한 시알산의 결합
면역원성 교차 반응성 동역학 물리적 특성 EM을 통한 형태 관찰 결과 감염성: 총 입자(게놈)
감염성 관찰 가능한 정도의 복제에 필요한 양 항체 반응에 필요한 양 융합 활성 최적 pH 최적 온도
게놈 서열
뉴라미니다제 활성
* = 1차적 생산물과 인간 세포 중에서 1회 계대 배양 후의 생산물 비교
실시예 8: 전 임상 동물 모델
페럿은 약독화 인플루엔자 백신과 구성 백신 균주의 약독화와 면역원성을 평가하는데 꾸준히 사용되고 있는 동물 모델이다. MCB로부터 생산된 세포-유래 인플루엔자 균주의 수행력(Performance)은 달걀에서 생산된 동일한 균주와 비교된다. 이 물질들을 제어된 연구 조건 하에서 상호 비교함으로써, 이 바이러스 생산물의 유사성(comparability)을 정확하게 확인할 수 있다.
2개의 백신이 페럿을 감염시키거나 또는 페럿의 체내에 "흡수"되는 능력을 평가하기 위하여, 이 동물을 가볍게 마취하고, 이것에 세포 생산 바이러스 제제 또는 달걀 생산 바이러스 제제를 비강 내 접종하였다. 접종 후 몇몇 시점에서 비강 세척 물질을 수집하고, 바이러스 양을 소수의 허용 가능한 방법 중 하나의 방법에 의해 평가하여, 동물의 상기도 내에서의 바이러스 복제 정도 및 동역학을 평가하였다. 바이러스를 일정 범위로 투여하여 실험을 수행하였으며, 이때, 이 실험에서는 다수의 균주와 상이한 3가 혼합물을 사용하여 달걀 생산 균주에 대한, 세포 배양액 생육 균주의 상대적 감염도를 일반화하였다. 인플루엔자 균주의 면역원성, 바이러스가 감염을 개시하는 능력과 유전적으로 연관된 특성을 평가하는데에도 동일한 연구를 수행하였다. 동물을 육종하고, 바이러스 접종 후 다양한 시점(주)에서 비강 내 세척액을 수집하였는데; 이때, 표본들은 감염에 대한 비강 내 IgA 반응 및 혈청 항체를 평가하는데 사용하였다. 이러한 데이터, 감염도, 혈청 중 항체 및 점막 항체 반응이 최고인 시점을 이용하여, 달걀 생산 백신에 대한 세포 생산 백신의 상대적 감염도를 비교 및 평가할 것이다. 세포 생산 및 달걀 생산 백신 균주는 유사한 감염성과 면역원성을 가질 가능성이 가장 클 것이라 예상된다. 만일 세포 유래 백신이 달걀 유래 생산물보다 감염성 또는 면역원성을 더욱 크게 나타낸다면, 그 투여량을 낮출 수 있는지 여부를 평가하는 추가의 연구도 수행한다.
인간에 단일 단위 투여된 세포 배양액 유래 백신을 평가하기 위하여, 페럿 내에서 다수의 면역원성 및 복제 연구를 수행하였다. ca ts att 균주를 감염시켰을 때에는, 일반적으로 페럿 체내에서 강력하고 신속한 항체 반응을 유도한다. 뿐만 아니라, 각각의 ca ts att 균주는 통상적으로 테스트되며, 그 결과 비강 인두에서는 비교적 높은 역가로 복제하나, 이 동물의 폐 내에서는 감지못할 수준으로 복제하는, 약독화된(att) 표현형을 나타냄을 알 수 있다. 이와 같은 생물학적 특징을 바탕으로 한, 세포 배양액 성장의 영향력도 평가된다. 그러나, att 표현형은 이 균주의 유전자 조성의 완전한 일부이므로, 어떠한 차이점도 확인되지 않을 것이다. 이 균주의 성장 동역학과 교차 반응성은 이 동물에 인간 투여량만큼 1회 투여한 후 평가된다. 목적 혈청 항체는 유전적으로 같은 계통에 속하는 다수의 균주와 교차 반응하고; 세포-유래 백신은 동일한 성능을 가질 것이라 예상된다.
이와 같은 동등성 평가를 통하여, 1차 바이러스 생산물의 잠재적인 생화학적 및/또는 생리학적 차이점에 대해 상당한 정도로 관찰할 수 있었으며, 이를 통하여, 인간 세포 또는 동물 연구에서 처음 계대 배양한 바이러스에 의해 측정되는 ca ts att 균주 성능의 후성적인(epigenetic) 차이점에 따른 영향력을 입증할 수 있다. 현재, 서열 정보를 바탕으로 하여, MDCK 세포에서 생산되었을 때 ca ts att 균주의 면역원 성능에는 아무런 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.
페럿은 인플루엔자에 대한 널리 입증된 동물 모델로서, 통상적으로 약독화 표현형과 ca ts att 균주의 면역원성을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 8∼10주령의 동물을 사용하여 약독화 여부에 대해 평가하며; 통상적으로, 연구는 테스트 군 또는 대조군 당 3∼5마리의 동물을 사용하도록 디자인된다. 면역원성에 관한 연구는 8주령∼6월령의 동물을 사용하여 수행되며, 일반적으로 테스트 군 또는 대조군 당 3∼5 마리의 동물을 사용한다. 이러한 숫자는, 군 사이에서 통계학적으로 유효하거나 관찰 상 중요한 비교 결과를 얻는데 충분한 정보를 제공한다. 대부분의 연구에 있어서, 인플루엔자-유사 징후가 관찰될 수 있긴 하지만, 그 가능성은 희박하다. 페럿은 식욕이나 체중 감소, 비강 내 또는 안구 방혈과 같은 징후를 나타내지 않으며; 인플루엔자-유사 질병에 관한 징후를 관찰하는 작업은 연구 과정 중 필요한 부분이므로, 개입 예를 들어, 진통제 투여는 이루어지지 않는다. 불편함에 대한 다른 징후 예를 들어, 피부가 헌다거나 체중 감소가 심하다거나 하는 현상들이 나타날 경우에는 연구에 참여한 수의사와 함게 논의한 후 동물에게 적절한 조치를 취하여야 할 것이다.
실시예 9: 마스터 바이러스 종자( Master Virus Seed ; MVS ) 개발
현재 인플루엔자 백신 균주는, 조류 세포에 야생형 바이러스와, A형 또는 B형 MDV를 공동 감염시켜, 원하던 6:2 유전자 배위를 가지는 자손을 분리 및 스크리닝함으로써 생산된다. 이러한 방법에는 조류 세포 배양액 및/또는 SPF 알을 통하여 바이러스를 수차례 계대 배양하는 과정이 필요하다. 최근 들어, 인플루엔자 바이러스 제제를 생산하는데 플라스미드 구조법이 도입되었다. 이 방법에 있어서, 광범위하게 테스트 및 특성 규명된 세포 은행으로부터 유래하는 Vero(아프리카 녹색 원숭이) 세포를 8개의 DNA 플라스미드(각 플라스미드는 8개의 인플루엔자 RNA 분절 중 하나의 cDNA 복사체를 함유함)로 전기 천공시킨다. 전기 천공 후 수일 경과시, 이 전기 천공된 세포의 상청액은 인플루엔자 바이러스를 함유한다. 이후 상청액을 SPF 알에 접종하여, 백신 균주를 증식시키고, 이를 생물학적으로 클로닝한다. 이 두 가지 방법을 통하여, SPF 알에 접종되어 MVS를 생산하는 백신 균주가 생산된다. 플라스미드 회수법은 몇 가지 이점 예를 들어, 야생형 분리주를 사용하는 경우보다 타이밍을 신뢰할 수 있고, 유전적으로 보다 정확한 유전자 분절을 얻을 수 있으며, 또한 우발적 제제에 의한 잠재적 오염 가능성이 감소한다는 이점을 가지며, 이들 두 가지 방법에 의해 생산된 각각의 MVS는 서로 구별이 불가능하며, 다량의 백신을 생산하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용함으로써, 이 방법은 플라스미드 회수시 Vero 세포 대신 MDCK 세포를 이용한다.
백신 균주의 최종 증폭 단계는 MDCK 세포 은행으로부터 유래하는 세포에서 수행된다. 이와 같은 최종 증폭 단계는 소규모의(< 20ℓ) MDCK 세포 배양액을 사용하여 이루어질 수 있다. 이 세포로부터 유래하는 상청액을 수집하고, 농축 및 특성 규명/테스트하여, MVS를 생산한다.
실시예 10: 개 RNA polI 조절 서열의 클로닝
본 실시예는 개 18S 리보좀 RNA 유전자를 이 유전자의 5' 말단 핵산 서열에 클로닝하는 것에 관하여 기술하고 있다.
우선, 마스터퓨어 DNA 정제 키트(MasterPure DNA Purification kit; EPICENTRE Biotechnologies; Madison, WI)를 사용하여 MDCK 세포(수탁 번호 CCL-34, ATCC)로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 서열 정렬 결과, 18S rRNA 유전자는 개, 인간, 마우스, 래트 및 닭의 유전자와 약 90% 동일함을 알 수 있다. PCR용 프라이머 쌍을 18S rRNA 유전자의 5' 말단에 인접한 보존 부위 내 서열을 바탕으로 디자인하여, 서던 혼성화를 통해 얻어진 상보성 서열을 가지는 막 상 분해 단편들의 검출용인 프로브로서, MDCK 게놈 DNA로부터 유래하는 약 500 bp의 부위를 증폭시켰다. BamH I(약 2.2kb) 및 EcoR I(약 7.4kb)로 각각 분해한 게놈 DNA로부터 단일의 제한 단편을 동정하였다. 이 두 단편을 pGEM 7 벡터(Promega Corp.; Madison, WI)에 클로닝하여, 추가 분석을 실시하였다. EcoR I 단편을 함유하는 플라스미드를 미국 모식균 배양 수집소에 2006년 4월 19일자로 제출하였고, ATCC 수탁 번호 PTA-7540을 지정받았다.
제한 분해 분석법에 의해 얻어진 2개의 클론을 정렬하고, 이 2개의 클론의 양쪽 말단부를 서열 결정하여 상기 2개의 클론의 배향을 확인하였다. EcoRI 단편의 제한 맵을 도 8에 제시하였다. 그 다음, 5' EcoR I 위치와 그 다음 BamH I 위치(3' 배향) 사이에 있는 단편의 완전한 핵산 서열을 서열 결정하고, 이를 약 3530 염기가 함유된 뉴클레오티드 서열로 조립하였다. 이 서열을 도 9a∼도9c에 제시하였다(서열 번호 1).
그 다음, 개 RNA polI 조절 요소로부터 발현된 전사체의 처음 뉴클레오티드를 동정하기 위해 프라이머 연장 실험을 실시하였다. 요약하면, MDCK 세포로부터 총 RNA를 분리하였다. 표지화된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이 RNA에 어닐링(annealing)시키고, 이를 18S rRNA의 5' 말단부를 향하여 DNA 합성을 프라이밍(priming)하는데 사용하였다. 전사체의 첫 번째 뉴클레오티드를 동정하기 위해, 동일한 프라이머를 사용하여 rRNA의 서열을 결정하였는데, 이때, 종래의 디데옥시뉴클레오티드계 방법을 이용하였다. 프라이머 증폭 과정을 통해 얻어진 핵산의 길이를, 서열 결정 반응에서 얻어진 다양한 핵산의 길이와 비교함으로써, 18S rRNA의 첫 번째 염기를 동정할 수 있었다. 첫 번째 전사된 뉴클레오티드(+1 위치)는 도 9a∼도9c에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열 중 1804번 염기에 해당한다.
이 뉴클레오티드의 상류 서열이 하류 유전자를 전사시키기에 충분한 조절 요소를 함유하는지 여부를 확인하기 위하여, 표준 기술을 이용해서 조절 서열의 제어하에 있는 EGF 유전자를 포함하는 구조물을 구성하였다. 이 구조물에 사용된 EGFP 유전자는 문헌[Hoffmann외 다수 (2000) "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template Virology 15:267(2):310-7]에 개시된 바와 같은 EGFP 유전자이다. 이후, 이 구조물을 종래의 기술을 이용하여 MDCK 세포에 형질 감염시켰다. 형질 감염후 24시간 경과시, RNA를 형질 감염 세포로부터 분리하고, EGFP 유전자를 암호화하는 표지화 DNA를 이용하여 노던 블럿팅을 수행하였다. 적당한 크기의 전사체를 검출함으로써, MDCK 세포에 형질 감염된 플라스미드가, 조절 요소에 대해 3' 말단인 서열의 전사를 유도한 조절 서열을 함유함을 확인할 수 있었다.
실시예 11: 개 RNA 중합 효소 I 조절 요소의 동정
본 실시예는 개 RNA 중합 효소 I 조절 요소인, 개 RNA 중합 효소 I 프로모터의 동정 및 특성 규명에 관하여 기술하고 있다.
개의 RNA polI 프로모터 및 기타 조절 부위는, 표준적인 프로모터 서열에 대한 18S rRNA의 전사를 개시하는 부위에 대해 5' 말단인 서열을 관찰함으로써 확인된다. 뿐만 아니라, 간단한 결실 실험을 수행하여, 효율적으로 전사를 개시하는데 필요한 서열을 동정하였다. 이와 같은 하나의 결실 실험에 있어서, 제한 위치는 위치 배향 돌연 변이 유발법에 의해 도 9a∼도 9c의 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 플라스미드 내에 도입되거나 또는 이 플라스미드 내에서 동정된다. 상기 제한 위치는 전술한 바와 같은 +1 뉴클레오티드 위치로부터 3' 말단 방향으로 약 50 뉴클레오티드 부위 즉, 도 9a∼도 9c에 제시된 바와 같은 서열 내 1804번 뉴클레오티드 부위에 도입된다. 이 +1 위치에 대한, 도 9a∼도 9c 뉴클레오티드 서열의 5' 말단부 방향 제한 위치를 위치-배향 돌연 변이 유발법에 의해 동정 또는 도입한다.
이후, 이와 같은 제한 위치들을 함유하는 벡터를 적당한 제한 효소로 분해하여 선형화하였다. 그 다음, 적당한 뉴클레아제(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 II 등)를 사용하여, 선형 핵산을 절단한다. 상이한 시점에서 반응을 중단시킴으로써, 전사가 개시되는 위치에서 5' 방향으로, 상이한 크기의 결실부를 생성할 수 있다. 그 다음, 선형 플라스미드를 다시 환형으로 만들고, 이를 적당한 숙주 세포내에 형질 전환시킨 다음, 이를 스크리닝하여 원하는 결실부를 포함하는 플라스미드를 동정하였다. 대안적으로, 결실부에 측접하여 존재하는, 도입될 서열을 함유하는 적당한 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있다. 이후, 이러한 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 표준적인 기술로써 루프-아웃 결실부를 함유하는 유도체를 생성한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 표준적인 기술을 이용하여 위치-배향 치환부를 생성하는데 사용될 수도 있다.
상이한 결실 또는 치환 돌연 변이체가 전사를 개시하는 능력은, 플라스미드를 MDCK 세포에 형질 감염시키고, 전술한 바와 같이 노던 블럿팅에 의해 플라스미드로부터 전사된 RNA를 검출함으로써 측정된다. 전사가 가능한 플라스미드의 서열을, 전사가 불가능한 플라스미드 서열과 비교함으로써, 개의 RNA 중합 효소 I 프로모터 서열을 동정한다. 이후, 종래 기술을 이용하여 이 서열을 암호화하는 핵산을 클로닝한다.
대안적으로, 개의 RNA polI 프로모터는, 당 업계에 공지된 기타 방법 예를 들어, 미니게놈 접근법을 사용하여, 서열 번호 1에 제시된 핵산으로부터 맵핑될 수 있다. 예를 들어, polI 프로모터의 제어하에 있는, 클로닝된 네거티브 센스 CAT 유전자를 함유하는 인플루엔자 미니게놈 리포터(pFlu-CAT)를 사용하는 것에 관하여 개시된 미국 특허 출원 제20050266026호를 참조하시오. 또한 EGFP 미니게놈에 관한 문헌[Hoffmann외 다수 (2000) "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template, Virology 15:267(2):310-7); 및 CAT minigenome system pPOLI-CAT-RT, Pleschka외 다수 (1996) J. Virol. 70(6):4188-4192]도 참조하시오.
효율적으로 전사를 개시하는데 필요한 서열을 동정 및 특성 규명하기 위한 시스템을 사용하기 위하여, 전술한 바와 같은 상이한 결실/치환 돌연 변이체 또는 기타 서열 번호 1의 내부 서열들을 선택된 리포터 플라스미드(예를 들어, PFlu-CAT, EGFP 미니게놈)에 도입하였더니, 이 리포터 유전자의 네거티브 센스 복사체의 전사가 결실 또는 치환 돌연 변이체에 의한 전사의 개시에 의존하게 되었다. 전술한 바와 같은 EGFP-함유 구조물은 이와 같은 결실 또는 치환 돌연 변이체를 제조하는데 편리하게 사용될 수 있다. 그 다음, 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합 효소는 리포터 플라스미드로부터 전사된 네거티브 가닥 RNA로부터 양성 가닥 mRNA를 합성한다. 이후, 이와 같은 양성 가닥 mRNA는 세포 기구에 의해 번역되어, 이 리포터 단백질(EGFP 또는 CAT) 활성이 검출될 수 있다.
이와 같은 검정법에 있어서, PB1, PB2, PA 및 NP 또는 PB1, PA, NP(-PB2는 음성 대조군)의 cDNA를 함유하는 발현 플라스미드 세트를, 인플루엔자 A 바이러스 EGFP 미니게놈 또는 pFlu-CAT 리포터를 포함하는 플라스미드(추정 개 polI 조절 서열의 제어하에 있음)와 함께, MDCK 세포를 형질 감염시키는데 사용하였다. 이후, 세포를 리포터 서열의 전사 및 번역을 허용하는 조건 하에서 배양하였다.
종래의 기술을 이용하여 리포터 단백질의 활성을 검출하였다. EGFP의 경우, 형질 감염된 세포를 형질 감염 후 48시간 경과시 상 콘트라스트 현미경 또는 형광 현미경으로 관찰하였다. 대안적으로, 유동성 혈구 계측법을 사용하여, EGFP 발현 여부를 검출하였다. CAT 유전자를 포함하는 미니게놈을 이용하는 검정법에 있어서, pFlu-CAT을 이용하여 중합 효소의 활성을 측정한다. 이와 같은 검정법에 있어서, CAT 발현은, CAT 단백질을 직접 검출하거나(예를 들어, ELISA에 의함), CAT를 암호화하는 mRNA를 검출하거나(예를 들어, 노던 블럿팅에 의함), 또는 리포터 활성에 대한 지표로서 CAT 활성을 검출함으로써(예를 들어, 방사능 표지화된 아세틸기를 적당한 기질로 운반한 결과를 검출함에 의함) 측정될 수 있다.
예를 들어, 프로모터 활성을 나타내는 MDCK 클론으로부터 유래하는 DNA 단편(상기 프라이머 증폭 및 전사 검정법 참조)을 쥣과 동물 polI 종결 인자 앞에 위치하는 네거티브 센스 EGFP 유전자의 5' 및 3' 말단에 융합된, 인플루엔자 5' 및 3' 비 번역 부위를 포함하는 삽입부의 상류에 클로닝하였다(도 11 참조). 삽입된 MDCK 서열이 상이한 3개의 별도 구조물을 제조하였다: 서열 번호 1의 MDCK 서열 1∼1802(-1), 1∼1803(+1) 및 1∼1804(+2). 이와 같은 구조물 각각을 별도로 발현 플라스미드(인플루엔자 복제 단백질인 PB1, PB2, PA 및 NP에 대한 플라스미드)와 합하고, 이를 MDCK 세포에 전기 천공으로 도입하였다. 전기 천공 후 24시간 경과시, 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 3개의 MDCK 단편, -1, +1 및 +2(좌측 상부, 중간 상부 및 우측 상부)는 EGFP 형광도를 나타내었지만, 프로모터 활성을 나타내지 않던 구조물은 백그라운드 수준의 형광도만 나타내었다(좌측 하부). 1∼1803번(+1) 단편에서는 가장 높은 수준의 형광도를 나타내었다. CMV 프로모터를 보유하여 EGFP를 발현시키는 플라스미드를 양성 대조군으로서 사용하였다(우측 하부).
인플루엔자 복제 단백질은 진정한 인플루엔자 vRNA 말단만을 복제할 것이다. MDCK polI 서열을 함유하는 각각의 플라스미드로부터 얻어지는 EGFP 신호는, 개 조절 서열 단편이, 인플루엔자 복제를 허용할 수 있는 올바른 인플루엔자 vRNA 말단부를 가지는 RNA를 생산하였던 프로모터 활성을 나타냄을 말해준다.
개 RNA polI 조절 서열을 동정 및 특성 규명하는데 유용한 기타 검정법으로서는 RNA 풋-프린팅 실험(foot-printing experiment)을 포함한다. 이 방법에 있어서, 예를 들어, 도 9a∼도 9c에 제시된 서열을 포함하는 RNA 분자는 개의 RNA 중합 효소 I의 하나 이상의 서브 유닛과 연결되어 있다. 개의 RNA polI 중 하나 이상의 서브유닛은, 이 서브유닛의 구체적인 친화도에 따라서, 적당한 RNA 서열과 결합한다. 그 다음, RNAase 예를 들어, RNAase I을 사용하여, 개 RNA 중합 효소의 하나 이상의 서브유닛에 의해 보호받지 않는 RNA를 분해한다. 이후, 상기 RNAase는 불활성화되고, 보호받은 RNA 단편은 RNA 중합 효소 I의 하나 이상의 서브유닛을 보호함으로써 분리된다. 분리된 단편은 RNA 중합 효소 I의 하나 이상의 서브유닛에 의해 결합된 서열을 포함하며, 프로모터/인핸서 활성을 가지는 서열에 대한 훌륭한 후보가 된다. 또한, 이와 같은 풋-프린팅 실험은, 개의 RNA 중합 효소 I의 상이한 서브유닛이 존재할 때 수행되어, 어느 서브유닛이 어느 RNA 서열과 결합하는지를 확인할 수 있다. 이러한 실험을 통하여, 예를 들어, 상이한 개 polI 중합 효소 서브유닛의 서열들을 기타 종으로부터 유래하는 RNA 중합 효소 I 서브유닛의 서열들(공지의 서열 및 결합 특이성을 가짐)과 비교함으로써, 결합된 상이한 서열들의 활성을 측정할 수 있는 것이다.
시험관 내 기술은 또한 추정 개 polI 조절 서열에 의한 전사를 모니터하는데에도 사용될 수 있다. 이 기술에 있어서, 전술한 바와 같은 상이한 결실/치환 돌연 변이체 또는 서열 번호 1의 기타 내부 서열은 목적 전사체에 작동 가능하도록 결합되어 있다. 전사에 필요한 개 RNA 중합 효소 I 단백질 세트는 이후 상기 전사체에 첨가된다. 개 RNA 중합 효소 I 단백질에 의해 생산된 RNA 전사체를 예를 들어, 노던 블럿팅에 의해 검출함으로써, 전사가 효과적으로 일어났음을 확인할 수 있다.
유사한 검정법을 활용하여 기타 개 RNA polI 조절 요소 예를 들어, 인핸서, 억제 인자, 또는 RNA polI에 의한 전사에 영향을 주는 기타 요소를 동정할 수 있다. 일반적으로, 이러한 검정법에서, 서열 번호 1의 결실부, 치환부 또는 내부 서열을 포함하는 리포터 구조물로부터의 발현 수준은, 전술한 바와 같이 동정된 최소 RNA polI 프로모터에 의한 발현 수준과 비교된다. 발현 수준을 비교함으로써, 전사의 증강 또는 감소와 관련된 요소가 존재함을 확인할 수 있다.
실시예 12: MDCK 세포에서의 인플루엔자 회수
본 실시예는 실시예 10에서 클로닝된 개의 RNA polI 조절 요소를 사용하여, MDCK 세포 배양액 중 인플루엔자 바이러스를 회수하는 것에 관하여 기술하고 있다.
개의 RNA polI 프로모터 및/또는 18S rRNA 유전자의 상류에 존재하는 본 발명의 기타 핵산의 제어하에 있는 바이러스 게놈 RNA를 암호화하는 발현 벡터를, 종래의 분자 생물학적 기술을 이용하여 구성하였다. 이러한 구조물을 MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스를 회수하는데 사용하였다.
적당한 세포로 도입될 때 감염성 바이러스 입자를 생산하는 단백질과 관련된 바이러스 RNA를 얻어내기 위하여, 인플루엔자 단백질 및 게놈 RNA를 발현하는 발현 플라스미드를 사용하는 방법에 관한 추가의 안내는, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 문헌[예를 들어, 미국 특허 제5,578,473호, 동 제5,576,199호, 동 제5,820,871호, 동 제5,854,037호, 국제 특허 공보 WO 00/60050, 및 미국 특허 공보 2002/0164770 및 2004/01422003]에 개시되어 있다.
지금까지, 본 발명을 명확하게 이해하기 위하여 더욱 자세히 기술하였는데, 이때 상기 기술된 사항을 통하여, 본 발명에 다양한 형태의 변화가 가하여질 수 있을 뿐 아니라, 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않고서 더욱 미세한 범위까지 변화를 가할 수 있음을 당 업자는 알고 있을 것이다. 예를 들어, 전술한 모든 기술과 장치는 다양하게 병행 및 병용될 수 있다. 본 출원에 언급된 모든 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌들은 그 자체로서, 모든 목적을 위하여, 상기 각각의 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌이 모든 목적을 위하여 참고 문헌으로서 인용되어 있다고 기술되어 있는 바와 동일한 정도로, 참고용으로서 인용되어 있다. 뿐만 아니라, 미국 가 명세서 출원 제60/793,522호(2006년 4월 19일 출원); 미국 특허 출원 제60/793,525호(2006년 4월 19일 출원); 미국 특허 출원 제60/702,006호(2005년 7월 22일 출원); 미국 특허 출원 제60/699,556호(2005년 7월 15일 출원); 미국 특허 출원 제60/699,555호(2005년 7월 15일 출원); 미국 특허 출원 제60/692,965호(2005년 6월 21일 출원); 및 미국 특허 출원 제60/692,978호(2005년 6월 21일 출원)도 그 자체로서 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune Vaccines, Inc Duke, Gregory Kemble, George Young, James Wang, Zhaoti <120> Methods and Compositions for Expressing Negative-Sense Viral RNA in Canine Cells <130> FL412PCT <150> 60/793,522 <151> 2006-04-19 <150> 60/793,525 <151> 2006-04-19 <150> 60/702,006 <151> 2005-07-22 <150> 60/699,555 <151> 2005-07-15 <150> 60/699,556 <151> 2005-07-15 <150> 60/692,965 <151> 2005-06-21 <150> 60/692,978 <151> 2005-06-21 <160> 19 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3532 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 1 aattctggag aaacagattg tgttataaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 60 gagaaaatcc ttatgttctt tgagcctccc ctccccccca gaattgagtt cctcttccac 120 gacctcttct cattcaaccc aatagacaag tatttggggg ggggggtcag gtcccagacg 180 ctgagagggt ggaggtgaag gtggtgcggg gggggggggg cacaccgtcc tctccagcgc 240 ctttggttca gacctccttc gtgacctccc tccctccctc cctccctcct ccctcctcct 300 cctcctccct cttcgtctta taaatatata aataaaatcc taaagaaaag aaaaagaaaa 360 aaaaaaaaag gaaggacacg agaaaaaacg gtgcatccgt tgccgtcctg agagtcctcg 420 cctggtttcg gctctacgtt ccctccctga cctcggaaac gtgcctgagt cgtcccggga 480 gccccgcgcg gcgagcgcga ccccctttcg ggcggcagcg ggcccggacg gacggacgga 540 cggacggacg ggttttccaa ggctcccccg ccccgggagg acgggggttc gcggtgcgcg 600 gccgtgtgct ccggggccct ccgccgtccc cgggccgaga ggcgagatcc gaggcgcctg 660 acggcctcgc cgcccggatc tgtcccgctg tcgttcgcgc cggttgtcgg gtgccactgg 720 cggccgcttt tatagagcgt gtccctccgg aggctcggcg gcgacaggca aggaacagct 780 ttggtgtcgg tttcccgggg ccgagttcca ggaggagggc ggctccggcg cgagcgtctg 840 tcgccggggc ctcggcgcga tgcgctcgcc ggagattgga ctccggagct gcgagggagt 900 gtcgccgtcg cccgtgtcgc ccgtgtccgc tccgcctcgc tcccggagga ggccgtgcgg 960 gccgcctggg tgggtcgacc agcaccgccg gtggctcctc ctcgcccgcg cggaccgacc 1020 tgggcgcctc gggggcgggg gacagggtgt gtcccgccgt ccgtcctgtg gctccgggcg 1080 atcttcgggc cttccttccg tgtcactcgg ttgtctcccg tggtcacgcc ctggcgacgg 1140 ggaccggtct gagcctggag gggaagcccg tgggtggcgc gacagacccg gctgcgggca 1200 cgtgtggggg tcccgggcgt cggacgcgat tttctcccct ttttccgagg cccgctgcgg 1260 aggtgggtcc cgggcggtcg gaccgggtgc cacgcggggg tgggcgggcc gtccgttcgg 1320 gcgtccggcc ccggtggcga ttcccggtga ggctgcctct gccgcgcgtg gccctccacc 1380 tcccctggcc agagccgggg ttggggacgg cggtaggcac ggggcggtcc tgagggccgc 1440 gggggacggc tccgcacggt gcctgctccg gagaactttg atgatttttc aaagtcctcc 1500 cggagatcac tggcttggcg gcgtggcggc gtggcggcgt ggcggcgtgg cggcgtggcg 1560 gcgtggcgtc tccaccgacc cgtatcgccc ctcctcccct cccccccccc ccccgttccc 1620 tgggtcgacc agatagccct gggggctccg tggggtgggg gtgggggggc gccgtggggc 1680 aggttttggg gacagttggc cgtgtcacgg tcccgggagg tcgcggtgac ctgtggctgg 1740 tccccgccgg caggcgcggt tattttcttg cccgagatga acattttttg ttgccaggta 1800 ggtgctgaca cgttgtgttt cggcgacagg cagacagacg acaggcagac gtaaaagaca 1860 gccggtccgt ccgtcgctcg ccttagagat gtgggcctct gggcgcgggt ggggttccgg 1920 gcttgaccgc gcggccgagc cggtccctgt cctcgctcgc tggagcctga gccgtccgcc 1980 tgggcctgcg cgccggctct cgtgctggac tccaggtggc ccgggtcgcg gtgtcgccct 2040 ccggtctccg gcacccgagg gagggcggtg tgggcaggtg gcggtgggtc ttttaccccc 2100 gtgcgctcca tgccgtgggc acccggccgt tggccgtgac aacccctgtc tcgcaaggct 2160 ccgtgccgcg tgtcaggcgt cccccgctgt gtctggggtt gtccggtcgc tcctgccccc 2220 ccccccccgg gggtcgaggg gcttgccggt gaggcggaag caggtccccc cggtcgccgt 2280 cctcgctggg cttttgctcc tcgggaagcc ccctcggggc cgcagcttgc tgccgatcga 2340 tcgatgtggt gatctcgtgc tctcctgggc cgggcctaag ccgcgtcaga cgagggacgg 2400 gcgtccacgg cggatgcgac cgctcttctc gttctgcccg cgggcccctc cctccccggc 2460 tcctccgcgc ccggccgtcg tggcgggtgc gcggggggcg cgcgccgggg ttgggggtgg 2520 tgcggactcc ggcccgaccc cggcctcccg ccttcttgcc tcgcggcgct ggcgggaccg 2580 gggtcctcgg acgcggcgga cactctcgcc ggcctttccc gaaggccctg ggtccgtggc 2640 gagcggccct cccctcctcc gcgggggagg gccggcccga cgccgcgctg ctcaccgccc 2700 ggcctgggcg cgcttgagcg cgttgcgccc ggccctccgt ggtgcccctg gagcgctcca 2760 ggtcgcctca ggtgcctgag gccgagcggt ggcgtcgttt ccttccccgg cgactcccct 2820 cgggctgccg ccgccgtcgt cggcgtgtcc gaggagcggg tggtggaaga agtcggcaag 2880 ggaggcgcac ccgtgcccct ggcgggggcg cgggcgcctc gtcttccttc ccctctcctc 2940 tcctcccccc tcgcgcgccg gcggggggtg ggtggcgtgg ggcggtgtga ctcggaggac 3000 ttggcggggc tcgtgaggcc gcggcgggcc gggccacgcc gcggcgcttg ccagccgagg 3060 ggctgcccct ctctccggca cgggtcgtgt ccccgtctcc gtccctctct ctcgcgctcg 3120 cgggaggcgg ggagctctct cctctgggcg gtgacgtgac cacgccgtgc gcgggcgagg 3180 cgggggtggc gtcctcgagg gggcaccggc cgcgagcgct cggggttgcc ctgtgcctgt 3240 cccttgccgg agatccgccc cccgccccgc gagcctgtcg gccccggagc gccgcctggt 3300 ggggcccgtt tgggaggacg aacgggtggg gcgatgcgcc ctcggtgaga aagccttctc 3360 tagcgatccg agagggtgcc ttggggtacc ggagccccca gccgctgccc ctcctctgcg 3420 cgtgtagtgt ggccagcgac gcggggttgg actcccgtcg cgacgtgttt gggcagagtg 3480 ccgctctttg cctacctacc cgcgctgcgc tcccccctcc gagacggggg ag 3532 <210> 2 <211> 333 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 2 ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60 cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatcg cccctcctcc 120 cctccccccc cccccccgtt ccctgggtcg accagatagc cctgggggct ccgtggggtg 180 ggggtggggg ggcgccgtgg ggcaggtttt ggggacagtt ggccgtgtca cggtcccggg 240 aggtcgcggt gacctgtggc tggtccccgc cggcaggcgc ggttattttc ttgcccgaga 300 tgaacatttt ttgttgccag gtaggtgctg aca 333 <210> 3 <211> 168 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 3 gggctccgtg gggtgggggt gggggggcgc cgtggggcag gttttgggga cagttggccg 60 tgtcacggtc ccgggaggtc gcggtgacct gtggctggtc cccgccggca ggcgcggtta 120 ttttcttgcc cgagatgaac attttttgtt gccaggtagg tgctgaca 168 <210> 4 <211> 140 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 4 gccgtggggc aggttttggg gacagttggc cgtgtcacgg tcccgggagg tcgcggtgac 60 ctgtggctgg tccccgccgg caggcgcggt tattttcttg cccgagatga acattttttg 120 ttgccaggta ggtgctgaca 140 <210> 5 <211> 114 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 5 tggccgtgtc acggtcccgg gaggtcgcgg tgacctgtgg ctggtccccg ccggcaggcg 60 cggttatttt cttgcccgag atgaacattt tttgttgcca ggtaggtgct gaca 114 <210> 6 <211> 85 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 6 gtgacctgtg gctggtcccc gccggcaggc gcggttattt tcttgcccga gatgaacatt 60 ttttgttgcc aggtaggtgc tgaca 85 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 7 aggcgcggtt attttcttgc ccgagatgaa cattttttgt tgccaggtag gtgctgaca 59 <210> 8 <211> 164 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 8 ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60 cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatcg cccctcctcc 120 cctccccccc cccccccgtt ccctgggtcg accagatagc cctg 164 <210> 9 <211> 137 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 9 ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60 cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatcg cccctcctcc 120 cctccccccc ccccccc 137 <210> 10 <211> 109 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 10 ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60 cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatc 109 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 11 ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgt 55 <210> 12 <211> 299 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 12 ttgatgattt ttcaaagtcc tcccggagat cactggcttg gcggcgtggc ggcgtggcgg 60 cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg acccgtatcg cccctcctcc 120 cctccccccc cccccccgtt ccctgggtcg accagatagc cctgggggct ccgtggggtg 180 ggggtggggg ggcgccgtgg ggcaggtttt ggggacagtt ggccgtgtca cggtcccggg 240 aggtcgcggt gacctgtggc tggtccccgc cggcaggcgc ggttattttc ttgcccgag 299 <210> 13 <211> 244 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 13 ggcggcgtgg cggcgtggcg gcgtggcggc gtggcgtctc caccgacccg tatcgcccct 60 cctcccctcc cccccccccc ccgttccctg ggtcgaccag atagccctgg gggctccgtg 120 gggtgggggt gggggggcgc cgtggggcag gttttgggga cagttggccg tgtcacggtc 180 ccgggaggtc gcggtgacct gtggctggtc cccgccggca ggcgcggtta ttttcttgcc 240 cgag 244 <210> 14 <211> 190 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 14 gcccctcctc ccctcccccc ccccccccgt tccctgggtc gaccagatag ccctgggggc 60 tccgtggggt gggggtgggg gggcgccgtg gggcaggttt tggggacagt tggccgtgtc 120 acggtcccgg gaggtcgcgg tgacctgtgg ctggtccccg ccggcaggcg cggttatttt 180 cttgcccgag 190 <210> 15 <211> 134 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 15 gggctccgtg gggtgggggt gggggggcgc cgtggggcag gttttgggga cagttggccg 60 tgtcacggtc ccgggaggtc gcggtgacct gtggctggtc cccgccggca ggcgcggtta 120 ttttcttgcc cgag 134 <210> 16 <211> 106 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 16 gccgtggggc aggttttggg gacagttggc cgtgtcacgg tcccgggagg tcgcggtgac 60 ctgtggctgg tccccgccgg caggcgcggt tattttcttg cccgag 106 <210> 17 <211> 80 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 17 tggccgtgtc acggtcccgg gaggtcgcgg tgacctgtgg ctggtccccg ccggcaggcg 60 cggttatttt cttgcccgag 80 <210> 18 <211> 217 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 18 ggcgtggcgt ctccaccgac ccgtatcgcc cctcctcccc tccccccccc cccccgttcc 60 ctgggtcgac cagatagccc tgggggctcc gtggggtggg ggtggggggg cgccgtgggg 120 caggttttgg ggacagttgg ccgtgtcacg gtcccgggag gtcgcggtga cctgtggctg 180 gtccccgccg gcaggcgcgg ttattttctt gcccgag 217 <210> 19 <211> 56 <212> DNA <213> Canis familiaris <400> 19 tcgcggtgac ctgtggctgg tccccgccgg caggcgcggt tattttcttg cccgag 56

Claims (20)

  1. 개의 RNA 중합 효소 I 조절 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조절 서열은 프로모터인 것인 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 RNA 중합 효소 I 조절 서열은 서열 번호 1의 1∼1803번 뉴클레오티드, 또는 이의 기능적 활성 단편을 포함하는 것인 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조절 서열은 네거티브 가닥 바이러스 게놈 RNA 또는 상응하는 cRNA를 암호화하는 cDNA에 작동 가능하도록 결합되어 있는 것인 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 전사 종결 서열을 더 포함하는 것인 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 상기 네거티브 가닥 바이러스 게놈 RNA는 인플루엔자 게놈 RNA인 것인 핵산.
  7. 제6항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  8. 제6항의 핵산을 전사하여, 인플루엔자 게놈 RNA를 생산하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 게놈 RNA를 생산하는 방법.
  9. 제7항의 발현 벡터와, PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1 및 NS2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인플루엔자 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현하는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 개 세포를 배양하는 단계; 및 재조합 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생산된 인플루엔자 바이러스는 감염성인 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 1×103 PFU/㎖ 이상의 인플루엔자 바이러스를 생산하는 것인 방법.
  12. 제7항의 발현 벡터를 포함하는 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포는 개의 세포인 것인 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 개의 세포는 신장 세포인 것인 개의 세포.
  15. 제14항에 있어서, 상기 개의 신장 세포는 MDCK 세포인 것인 개의 신장 세포.
  16. 배양된 개 세포에서 3개보다 많은 게놈 vRNA 분절을 가지는 재조합 분절 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 생산하는 방법으로서,
    (a) 개의 세포에서 게놈 vRNA 분절을 발현하여, 상기 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공할 수 있는 발현 벡터의 제1 세트를 개 세포 군집에 도입하는 단계; (b) 상기 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 제2 세트를 상기 세포에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 세포를 배양하여, 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 감염성 인플루엔자 바이러스 입자가 생산되는 것인 방법.
  18. 배양된 개 세포에서 감염성 인플루엔자 바이러스 입자를 생산하는 방법으로서,
    (a) 개의 세포에서 i) 게놈 vRNA 분절을 발현하여, 상기 바이러스의 완전한 게놈 vRNA 분절을 제공할 수 있고, ii) 상기 바이러스의 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 발현할 수 있는 발현 벡터의 세트를 개 세포 군집에 도입하는 단계; (b) 상기 세포를 배양하여, 상기 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제16항의 방법에 의하여 생산된 바이러스.
  20. 제16항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 헬퍼 바이러스(helper virus)가 사용되는 것인 방법.
KR1020087001609A 2005-06-21 2006-06-20 개의 세포에서 네거티브 센스 바이러스 ｒｎａ를발현시키기 위한 방법 및 조성물 KR20080024212A (ko)

Applications Claiming Priority (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69297805P 2005-06-21 2005-06-21
US69296505P 2005-06-21 2005-06-21
US60/692,978 2005-06-21
US60/692,965 2005-06-21
US69955505P 2005-07-15 2005-07-15
US69955605P 2005-07-15 2005-07-15
US60/699,555 2005-07-15
US60/699,556 2005-07-15
US70200605P 2005-07-22 2005-07-22
US60/702,006 2005-07-22
US79352506P 2006-04-19 2006-04-19
US79352206P 2006-04-19 2006-04-19
US60/793,525 2006-04-19
US60/793,522 2006-04-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080024212A true KR20080024212A (ko) 2008-03-17

Family

ID=37595721

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087001609A KR20080024212A (ko) 2005-06-21 2006-06-20 개의 세포에서 네거티브 센스 바이러스 ｒｎａ를발현시키기 위한 방법 및 조성물
KR1020087001669A KR20080025171A (ko) 2005-06-21 2006-06-20 이종성 프로테아제를 발현시키기 위한 방법 및 조성물

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087001669A KR20080025171A (ko) 2005-06-21 2006-06-20 이종성 프로테아제를 발현시키기 위한 방법 및 조성물

Country Status (11)

Country Link
US (4) US20060286591A1 (ko)
EP (2) EP1917361A4 (ko)
JP (2) JP2008543331A (ko)
KR (2) KR20080024212A (ko)
AU (2) AU2006262381A1 (ko)
BR (1) BRPI0612268A2 (ko)
CA (2) CA2613283A1 (ko)
IL (1) IL188202A0 (ko)
NO (1) NO20080358L (ko)
RU (1) RU2008101367A (ko)
WO (2) WO2007002008A2 (ko)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7763609B2 (en) 2003-12-15 2010-07-27 Schering Corporation Heterocyclic aspartyl protease inhibitors
US7959929B2 (en) * 2005-04-21 2011-06-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
US11865172B2 (en) 2005-04-21 2024-01-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
JP2008543331A (ja) 2005-06-21 2008-12-04 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド イヌ細胞中でウイルスのネガティブセンスｒｎａを発現する方法および組成物
US7790434B2 (en) 2005-06-21 2010-09-07 Medimmune, Llc Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells
US7682619B2 (en) 2006-04-06 2010-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Canine influenza virus
CN101528941B (zh) * 2006-04-19 2014-03-12 米迪缪尼有限公司 在犬细胞中表达负义病毒rna的方法和组合物
KR20090057015A (ko) 2006-09-11 2009-06-03 노파르티스 아게 난을 사용하지 않는 인플루엔자 바이러스 백신의 제조
US9163053B2 (en) * 2007-05-18 2015-10-20 Fluidigm Corporation Nucleotide analogs
CA2691745C (en) 2007-06-26 2017-08-15 Japan Health Sciences Foundation Vaccine antigen capable of inducing cross-reacting and neutralizing antibody against high-risk-type human papillomavirus
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
CN102215865B (zh) 2008-09-24 2013-10-30 米迪缪尼有限公司 病毒纯化方法
USH2283H1 (en) 2009-04-27 2013-09-03 Novartis Ag Vaccines for protecting against influenza
KR101800245B1 (ko) 2009-05-21 2017-11-22 노파르티스 아게 비-내인성 ｐｏｌ ｉ 프로모터를 사용하는 역 유전학
KR20120039047A (ko) 2009-07-31 2012-04-24 노파르티스 아게 역유전학 시스템
CN102220437B (zh) * 2011-04-27 2014-04-23 贵州省烟草科学研究所 部分接种鉴定烟草病毒病抗性的方法
EP2820126B1 (en) 2012-03-02 2017-05-17 Seqirus UK Limited Influenza virus reassortment
GB201220119D0 (en) * 2012-11-08 2012-12-26 Univ Cork Vector
CN105120893B (zh) 2012-12-03 2018-11-13 诺华股份有限公司 流感病毒重配
US10232031B2 (en) 2013-03-13 2019-03-19 Seqirus UK Limited Influenza virus reassortment
DE202013005130U1 (de) 2013-06-05 2013-09-10 Novartis Ag Influenza Virus Reassortierung
DE202013005100U1 (de) 2013-06-05 2013-08-26 Novartis Ag Influenza Virus Reassortierung
MX2015016755A (es) 2013-06-06 2016-04-13 Novartis Ag Reagrupamiento del virus de influenza.
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
JP6748067B2 (ja) * 2015-03-17 2020-08-26 一般財団法人阪大微生物病研究会 インフルエンザウイルス作出用細胞
CN106520700B (zh) * 2016-11-10 2019-12-27 中国食品药品检定研究院 稳定表达牛胰蛋白酶原的mdck细胞系及其用途
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JPWO2020004425A1 (ja) * 2018-06-27 2021-07-08 一般財団法人阪大微生物病研究会 インフルエンザウイルスの培養方法
CN109762938B (zh) * 2019-02-01 2022-06-10 中国水产科学研究院珠江水产研究所 用于区分鳜鱼弹状病毒vRNA、cRNA和mRNA的引物组合及试剂盒
CN109652384B (zh) * 2019-02-21 2021-10-26 昆明理工大学 一种体外培养戊型肝炎病毒的方法
BR102020010208A2 (pt) 2020-05-21 2022-04-12 Fundação Oswaldo Cruz Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso.

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6001634A (en) * 1989-08-28 1999-12-14 Palese; Peter Recombinant negative strand RNA viruses
US6887699B1 (en) * 1990-05-22 2005-05-03 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US6348327B1 (en) * 1991-12-06 2002-02-19 Genentech, Inc. Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
ES2210273T5 (es) 1994-07-18 2010-03-29 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Virus con arn de cadena negativa no segmentado recombinante infeccioso.
FR2723104B1 (fr) * 1994-07-27 1996-09-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouvelle topoisomerase iv, sequences nucleotiques correspondantes et leurs utilisations
US5824536A (en) * 1994-08-23 1998-10-20 St. Jude Children's Research Hospital Influenza virus replicated in mammalian cell culture and vaccine production
US5789229A (en) * 1994-09-30 1998-08-04 Uab Research Foundation Stranded RNA virus particles
US5753489A (en) * 1994-11-10 1998-05-19 Immuno Ag Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture
WO1996015232A1 (en) 1994-11-16 1996-05-23 St. Jude Children's Research Hospital Novel replication process
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
US5690937A (en) * 1995-06-05 1997-11-25 Aviron Temperature sensitive clustered changed-to-alanine mutants of influenza virus PB2 gene
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
AU727923B2 (en) 1995-09-27 2001-01-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
BRPI9710363B8 (pt) 1996-07-15 2021-07-06 Us Gov Health & Human Serv partìcula de vìrus sincicial respirátorio recombinante (rsv) infeccioso atenuado, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante (rsv), vetor de expressão, e, método de produção de um vìrus sincicial respiratório recombinante (rsv) infeccioso.
AU4427897A (en) 1996-09-27 1998-04-17 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for att enuation in viruses of the order designated mononegavirales
KR100702523B1 (ko) 1997-05-23 2007-04-04 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법
DE69837764T2 (de) 1997-07-11 2008-01-31 Yale University, New Haven Rhabdovirus mit gentechnisch veränderter hülle
US6946291B2 (en) * 1998-04-24 2005-09-20 University Hospitals Of Cleveland Mixed cell diagnostic systems
US6544785B1 (en) * 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
US6146642A (en) * 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
DE60033284T3 (de) 1999-07-14 2014-10-30 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren
IL152426A (en) 2000-04-28 2011-07-31 St Jude Childrens Res Hospital A DNA transfection system to form an infectious negative-strand RNA virus
US20030171324A1 (en) * 2000-07-18 2003-09-11 Shyam Ramakrishnan Regulation of human desc1-like serine protease
US20040241139A1 (en) * 2000-07-20 2004-12-02 Gerd Hobom Recombinant influenza viruses with bicistronic vRNAs coding for two genes in tandem arrangement
BRPI0307679A2 (pt) * 2002-02-13 2016-11-08 Wisconsin Alumni Res Found vetor viral de influenza, vírus recombinate de influenza, molécula isolada de ácido nucleico e métodos para expressar um segmento heterólogo de ácido nucleico em uma célula e para preparar vírus semelhante a influenza incompetente na replicação.
US8709442B2 (en) * 2002-02-21 2014-04-29 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Recombinant negative strand virus RNA expression systems and vaccines
US7465456B2 (en) * 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
KR101169468B1 (ko) * 2002-04-26 2012-08-01 메디뮨 엘엘씨 인플루엔자 바이러스의 생산을 위한 다중 플라스미드시스템
US7132523B2 (en) * 2002-07-03 2006-11-07 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Human PRSS11-Like S2 serine protease and uses thereof
WO2004033668A2 (en) * 2002-10-10 2004-04-22 Diversa Corporation Proteases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
KR101190932B1 (ko) * 2003-02-25 2012-10-16 메디뮨 엘엘씨 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법
CA2421086A1 (fr) * 2003-02-28 2004-08-28 Institut Pasteur Promoteur de l'arn polymerase i de poulet et son utilisation
KR20060026854A (ko) * 2003-05-28 2006-03-24 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 ＰｏｌⅡ 프로모터 및 리보자임을 갖는 재조합 인플루엔자벡터
WO2004112831A2 (en) * 2003-05-28 2004-12-29 Wisconsin Alumni Research Foundation High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy
CA2551489C (en) * 2003-12-23 2013-09-03 Gregory Duke Multi plasmid system for the production of influenza virus
BRPI0518568A2 (pt) * 2004-12-24 2008-11-25 Solvay Pharm Bv mÉtodo para produzir uma partÍcula do vÍrus da influenza replicativo sem o uso de vÍrus auxiliar, partÍcula de vÍrus da influenza replicativo, cÉlula, composiÇço, uso de uma composiÇço, mÉtodo para gerar proteÇço imunolàgica contra infecÇço de um indivÍduo com um vÍrus da influenza, e, Ácido nuclÉico
US7790434B2 (en) * 2005-06-21 2010-09-07 Medimmune, Llc Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells
JP2008543331A (ja) 2005-06-21 2008-12-04 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド イヌ細胞中でウイルスのネガティブセンスｒｎａを発現する方法および組成物
CN101528941B (zh) * 2006-04-19 2014-03-12 米迪缪尼有限公司 在犬细胞中表达负义病毒rna的方法和组合物

Also Published As

Publication number Publication date
CA2613283A1 (en) 2007-01-04
NO20080358L (no) 2008-03-03
US8278433B2 (en) 2012-10-02
KR20080025171A (ko) 2008-03-19
WO2007002008A2 (en) 2007-01-04
RU2008101367A (ru) 2009-08-10
US20120329150A1 (en) 2012-12-27
EP1917361A4 (en) 2009-07-29
EP1917352A4 (en) 2009-03-25
US20060286591A1 (en) 2006-12-21
JP2008546408A (ja) 2008-12-25
IL188202A0 (en) 2008-03-20
WO2007002007A2 (en) 2007-01-04
AU2006262381A1 (en) 2007-01-04
US20100203641A1 (en) 2010-08-12
WO2007002008A3 (en) 2007-12-27
WO2007002007A8 (en) 2007-05-10
EP1917361A2 (en) 2008-05-07
US8742089B2 (en) 2014-06-03
US20110045586A1 (en) 2011-02-24
CA2613284A1 (en) 2007-01-04
EP1917352A2 (en) 2008-05-07
BRPI0612268A2 (pt) 2009-01-27
WO2007002007A3 (en) 2007-06-21
JP2008543331A (ja) 2008-12-04
AU2006262380A1 (en) 2007-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8742089B2 (en) Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells
AU2007240448B8 (en) Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells
JP5666905B2 (ja) ヘマグルチニンポリペプチド中に変化を有するインフルエンザｂウイルス
JP5303603B2 (ja) インフルエンザウイルスの生産用多重プラスミドシステム
KR101316350B1 (ko) 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법
JP2007520214A (ja) インフルエンザウイルス作製のための多重プラスミド系
KR20070110838A (ko) 인플루엔자 바이러스의 구제
US8097459B2 (en) Methods and compositions for increasing replication capacity of an influenza virus
US7790434B2 (en) Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells
AU2013204811B2 (en) Methods and compositions for expressing negative-sense viral rna in canine cells
CN101243189A (zh) 用于在犬细胞内表达反义病毒rna的方法和组合物
MX2008000245A (en) Methods and compositionsfor expressing negative-sense viral rna in canine cells

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid