DE202013005130U1

DE202013005130U1 - Influenza Virus Reassortierung

Info

Publication number: DE202013005130U1
Application number: DE202013005130U
Authority: DE
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Seqirus UK Ltd
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2013-09-10
Anticipated expiration: 2023-06-06

Abstract

Verwendung eines viralen Rückgrats zur Erhöhung der Virusausbeute in einem Kulturwirt, wobei das virale Rückgrat mindestens zwei Abschnitte von 105p30 oder PR8-X umfasst.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung stammt aus dem Gebiet der Influenza A-Virus Reassortierung (reassortment). Darüber hinaus betrifft sie die Herstellung von Impfstoffen zum Schutz gegen Influenza A-Viren.
STAND DER TECHNIK
Der wirksamste Schutz gegen eine Influenzainfektion ist die Impfung gegen zirkulierende Stämme, und es ist wichtig, Influenzaviren für die Impfstoffherstellung so schnell wie möglich herzustellen.
Wildtyp-Influenzaviren wachsen oftmals in Eiern und in Zellkultur in niedrigen Titern heran. Um einen besser wachsenden Virusstamm für die Impfstoffherstellung zu gewinnen, ist es momentan übliche Praxis, den zirkulierenden Impfstoff-Stamm mit einem schneller wachsenden Donorstamm, der eine hohe Ausbeute aufweist, zu reassortieren. Dies kann durch Co-Infektion eines Kulturwirtes mit dem zirkulierenden Influenzastamm (dem Impfstoff-Stamm) und dem Donorstamm mit hoher Ausbeute und Selektion nach reassortierten Viren erreicht werden, die Hämagglutinin-(HA) und Neuramidase-(NA)Abschnitte des Impfstoff-Stamms und die anderen viralen Abschnitte (d. h. jene, die für PB1, PB2, PA, NP, M₁, M₂, NS₁ and NS₂ kodieren) des Donorstamms enthalten. Eine andere Herangehensweise besteht darin, die Influenzaviren durch reverse Genetik zu reassortieren (siehe z. B. Referenzen 1 und 2).
Gegenwärtig gibt es nur eine begrenzte Anzahl von Donorstämmen für die Reassortierung von Influenzaviren im Zuge der Impfstoffherstellung, und der am häufigsten verwendete Stamm ist der A/Puerto Rico/8/34 (A/PR/8/34) Stamm. Dennoch wachsen reassortierte Influenzaviren, die Abschnitte des A/PR/8/34 Rückgrates umfassen, nicht immer ausreichend gut, um eine effiziente Impfstoffherstellung sicherzustellen. Daher besteht im Stand der Technik ein Bedarf, weitere und verbesserte Donorstämme für die Neuzusammenstellung von Influenzaviren bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfinder haben herausgefunden, dass Varianten von bekannten Donorstämmen im Vergleich zu dem ursprünglichen Donorstamm zu hohen viralen Titern heranwachsen können und daher bessere Donorstämme für die Reassortierung von Influenzaviren sein können. Beispiele für solche Stämme sind ein A/PR/8/34-artiger Stamm, der vorliegend als PR8-X bezeichnet wird, und ein A/New Caledonia/20/1999-artiger Stamm, der vorliegend als der 105p30-Stamm bezeichnet wird.
Die Erfindung stellt ein reassortiertes Influenzavirus bereit, das zwei oder mehr Rückgratabschnitte von den Influenzastämmen 105p30 oder PR8-X umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines viralen Rückgrats zur Erhöhung der Virusausbeute in einem Kulturwirt, wobei das virale Rückgrat mindestens zwei Abschnitte von 105p30 oder PR8-X umfasst.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines reassortierten Influenza A Virus zur Herstellung eines Medikamentes zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum, wobei das reassortierte Virus mindestens zwei virale Rückgratabschnitte von einem Donorstamm umfasst, wobei der Donorstamm ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 105p30 oder PR8-X.
Wenn einer der mindestens zwei viralen Rückgratabschnitte der PA-Abschnitt ist, so kann dieser eine Sequenz aufweisen, die mindestens 99% Identität oder 100% Identität mit einer Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus den SEQ ID Nrn.: 9 und 17. Wenn der virale Rückgratabschnitt der PB1-Abschnitt ist, so kann dieser eine Sequenz aufweisen, die mindestens 99% Identität oder 100% Identität mit einer Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID Nrn.: 10 und 18. Wenn der virale Rückgratabschnitt der PB2-Abschnitt ist, so kann dieser eine Sequenz aufweisen, die mindestens 99% Identität oder 100% Identität mit einer Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID Nrn.: 11 und 19. Wenn der virale Rückgratabschnitt der M-Abschnitt ist, so kann dieser eine Sequenz aufweisen, die mindestens 99% Identität oder 100% Identität mit einer Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID Nrn.: 13 und 21. Wenn der virale Rückgratabschnitt der NP-Abschnitt ist, so kann dieser eine Sequenz aufweisen, die mindestens 99% Identität oder 100% Identität mit einer Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID Nrn.: 12 und 20. Wenn der virale Rückgratabschnitt der NS-Abschnitt ist, so kann dieser eine Sequenz aufweisen, die mindestens 99% Identität oder 100% Identität zu einer Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID Nrn.: 14 und 22.
Die Rückgratabschnitte können ferner eine Sequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem PA-Abschnitt mit mindestens 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 9, wobei der PA-Abschnitt ein Thymin in der Position aufweist, die dem Nukleotid 375 von SEQ ID Nr.: 9 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 9 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird; und/oder ein Thymin in der Position, die dem Nukleotid 1233 von SEQ ID Nr.: 9 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 9 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird;
(b) einem PB1-Abschnitt mit mindestens 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 10, wobei der PB1-Abschnitt ein oder mehrere, oder alle, der folgenden umfasst: ein Adenin in der Position, die Nukleotid 64 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 294 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Guanin in der Position die Nukleotid 297 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Cytosin in der Position, die Nukleotid 549 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 639 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Cytosin in der Position, die Nukleotid 1002 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Thymin in der Position, die Nukleotid 1551 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, oder ein Guanin in der Position, die Nukleotid 2076 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 9 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird;
(c) einem PB2-Abschnitt mit 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 11, wobei der PB2-Abschnitt ein oder mehrere, oder alle, der folgenden umfasst: ein Adenin in der Position, die Nukleotid 393 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, ein Adenin in der Position, die Nukleotid 1068 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 1355 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, ein Cytosin in der Position, die Nukleotid 1422 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, oder ein Adenin in der Position, die Nukleotid 1662 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 11 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird;
(d) einem NP-Abschnitt mit 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 12, wobei das NP-Segment ein oder mehrere, oder alle, der folgenden umfasst: ein Thymin in der Position, die Nukleotid 54 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Adenin in der Position, die Nukleotid 69 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Thymin in der Position, die Nukleotid 282 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Adenin in der Position, die Nukleotid 303 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Adenin in der Position, die Nukleotid 630 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 924 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 1350 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 12 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird;
(e) einem M-Abschnitt mit 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 13, wobei der M-Abschnitt ein oder mehrere, oder alle, der folgenden umfasst: ein Adenin in der Position, die Nukleotid 4 von SEQ ID Nr.: 13 entspricht, ein Cytosin in der Position, die Nukleotid 4 von SEQ ID Nr.: 13 entspricht, und ein Adenin in der Position, die Nukleotid 4 von SEQ ID Nr.: 13 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 13 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird.

Vorzugweise umfasst das reassortierte Influenzavirus alle dieser Abschnitte.
Die Erfinder haben ferner überraschenderweise entdeckt, dass Influenzaviren, die Rückgrad-Abschnitte von zwei oder mehreren Influenza-Donorstämmen umfassen, im Vergleich mit reassortierten Influenza A-Viren, die alle Rückgrat-Abschnitte desselben Donorstamms enthalten, in einem Kulturwirt schneller wachsen können. Die Erfinder haben insbesondere herausgefunden, dass Influenzaviren, die Rückgratabschnitte aus zwei Donorstämmen umfassen, die eine hohe Ausbeute aufweisen, reassortierte Viren mit für den Ziel-Impfstoff relevanten HA/NA-Genen in einer höheren Ausbeute herstellen können, als reassortierte Viren, die mit einem der beiden ursprünglichen Donorstämmen hergestellt wurden.
Im Prinzip können alle Abschnitte von eng miteinander verwandten Influenza A-Viren spezifisch reassortiert werden, um lebensfähige Viren herzustellen, aber auf Grund ineffizienter Aktivitäten der resultierenden viralen Bestandteile wird es sich nur bei einem kleinen Anteil dieser Viren um reassortierte Viren mit starkem Wachstum handeln. Die Erfinder haben Rückgratkombinationen bereitgestellt, die Stämme, die eine hohe Ausbeute aufweisen, erzeugen. Reassortierte Influenza A-Viren, die Rückgratabschnitte von zwei oder mehreren Influenza-Donorstämmen umfassen, können die viralen PB1- und PB2-Abschnitte aus demselben Donorstamm enthalten, insbesondere aus einem A/New Caledonia/20/1999-artigen Stamm, der vorliegend als der 105p30-Stamm bezeichnet wird. Die viralen PB1- und PB2-Abschnitte können mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit der in SEQ ID Nr.: 2 und/oder der in SEQ ID Nr.: 3 dargestellten Sequenz aufweisen.
Umfasst das reassortierte Influenza A-Virus Rückgratabschnitte von zwei oder drei Donorstämmen, so kann jeder Donorstamm mehr als einen der Rückgratabschnitte des reassortierten Influenza A-Virus bereitstellen, wobei jedoch einer oder zwei der Donorstämme auch nur einen einzelnen Rückgratabschnitt zur Verfügung stellen können.
Umfasst das reassortierte Influenza A-Virus Rückgratabschnitte von zwei, drei, vier oder fünf Donorstämmen, so können einer oder zwei der Donorstämme mehr als einen der Rückgratabschnitte des reassortierten Influenza A-Virus bereitstellen. Im Allgemeinen kann das reassortierte Influenza A-Virus nicht mehr als sechs Rückgratabschnitte umfassen. Dementsprechend kann zum Beispiel, wenn einer der Donorstämme fünf der viralen Abschnitte zur Verfügung stellt, das reassortierte Influenza A-Virus insgesamt nur Rückgratabschnitte von insgesamt zwei verschiedenen Donorstämmen umfassen.
Umfasst das reassortierte Influenza A-Virus den PB1-Abschnitt aus A/Texas/1/77, so umfasst es vorzugsweise nicht den PA-, NP- oder M-Abschnitt aus A/Puerto Rico/8/34. Umfasst das reassortierte Influenza A-Virus den PA-, NP- oder M-Abschnitt aus A/Puerto Rico/8/34, so umfasst es vorzugsweise nicht den PB1-Absschnitt aus A/Texas/1/77. In einigen Ausführungsformen umfasst die Erfindung keine reassortierten Influenza A-Viren, die den PB1-Abschnitt aus A/Texas/1/77 und die PA-, NP- und M-Abschnitte von A/Puerto Rico/8/34 aufweisen. Der PB1-Abschnitt aus A/Texas/1/77 kann die Sequenz haben, die in SEQ ID Nr.: 46 dargestellt ist, und die PA-, NP- oder M-Abschnitte von A/Puerto Rico/8/34 können die Sequenz haben, die in SEQ ID Nrn.: 47, 48 bzw. 49 dargestellt ist.
Die erfindungsgemäßen Influenza A-Virusstämme können in der gleichen Zeit und unter den gleichen Wachstumsbedingungen im Vergleich zu A/Puerto Rico/8/34 zu höheren viralen Titern in MDCK-Zellen heranwachsen und/oder im Vergleich mit reassortierten Influenzastämmen, die alle Rückgratabschnitte desselben Influenza-Donorstamms umfassen, eine höhere Freisetzungseffizienz aufweisen. Ferner wird ein reassortierter Influenza A-Virus bereitgestellt, der mindestens einen viralen Rückgratabschnitt aus einem solchen Influenzastamm umfasst.
In Ausführungsformen, in denen der reassortierte Influenza A-Virus Rückgratabschnitte von mindestens zwei Influenza-Donorstämmen umfasst, kann, wie im vorangehenden Absatz diskutiert, mindestens ein Rückgratabschnitt von einem Donorstamm gewonnen werden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 105p30 und PR8-X. Bevorzugte reassortierte Influenza A-Viren umfassen 1, 2, 3 oder 4 virale Abschnitte aus dem 105p30 Donorstamm, wobei der PA-Abschnitt mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit SEQ ID Nr.: 17 haben kann, der NP-Abschnitt mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit SEQ ID Nr.: 20 haben kann, der M-Abschnitt mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit SEQ ID Nr.: 21 haben kann, und/oder der NS-Abschnitt mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit SEQ ID Nr.: 22 haben kann. In einigen Ausführungsformen können solche Influenza A-Viren auch mindestens einen viralen Rückgratabschnitt aus dem PR8-X Donorstamm umfassen. Wenn der mindestens eine virale Abschnitt der PA-Abschnitt ist, kann er mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit SEQ ID Nr.: 9 haben. Wenn der mindestens eine virale Abschnitt der NP-Abschnitt ist, kann er mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit SEQ ID Nr.: 12 haben. Wenn der mindestens eine virale Abschnitt der M-Abschnitt ist, kann er mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit SEQ ID Nr.: 13 haben. Wenn der mindestens eine virale Abschnitt der NS-Abschnitt ist, kann er mindestens 95% Identität oder 100% Identität mit SEQ ID Nr.: 9 haben. Die Erfinder haben gezeigt, dass reassortierte Influenza A-Viren, die solche Rückgratabschnitte umfassen, in einem Kulturwirt gut wachsen. Im Allgemeinen wird ein reassortierter Influenzavirus nur einen der jeweiligen Rückgratabschnitte enthalten. Umfasst das Influenzavirus beispielsweise den PA-Abschnitt von 105p30 wird es nicht gleichzeitig den PA-Abschnitt von PR8-X umfassen.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Virus (a) den PB2-Abschnitt von 105p30, den PB1-Abschnitt von 105p30 und den NS-Abschnitt von 105p30; oder (b) den PB2-Abschnitt von 105p30, den PB1-Abschnitt von 105p30 und den M-Abschnitt von 105p30; oder (c) den PB2-Abschnitt von 105p30, den PB1-Abschnitt von 105p30 und den NP-Abschnitt von 105p30; oder (d) den PB2-Abschnitt von 105p30, den PB1-Abschnitt von 105p30 und den PA-Abschnitt von 105p30. Diese Viren können alle übrigen Rückgratabschnitte von PR8-X umfassen. Diese Ausführungsformen sind bevorzugt, da die Erfinder herausgefunden haben, dass solche reassortierten Influenza A-Viren in einem Kulturwirt besonders gut wachsen.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen reassortierten Influenza A-Virus bereit. Diese Verfahren umfassen Schritte, bei denen man (i) ein oder mehrere Expressionskonstrukte, das/die für die viralen Abschnitte kodiert/kodieren, welche für die Herstellung eines Influenza A-Virus erforderlich sind, in einen Kulturwirt einführt, wobei die viralen Rückgratabschnitte von zwei oder mehreren Influenzastämmen stammen; und (ii) den Kulturwirt kultiviert, um reassortiertes Virus herzustellen und optional (iii) das in Schritt (ii) gewonnene Virus aufreinigt.
Das Verfahren kann Schritte umfassen, bei denen man (i) ein oder mehrere Expressionskonstrukte, das/die für die viralen Abschnitte kodiert/kodieren, welche für die Herstellung eines Influenza A-Virus erforderlich sind, in einen Kulturwirt einführt, wobei die viralen Rückgratabschnitte aus zwei oder mehreren Influenzastämmen stammen und wobei die PB1- und PB2-Abschnitte von demselben Donorstamm stammen; und (ii) den Kulturwirt kultiviert, um reassortiertes Virus herzustellen und optional (iii) das in Schritt (ii) gewonnene Virus aufreinigt.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen reassortierten Influenza A-Virus bereitgestellt, das Schritte umfasst, bei denen man (i) ein oder mehrere Expressionskonstrukte, das/die für die viralen Abschnitte kodieren, welche für die Herstellung eines Influenza A-Virus erforderlich sind, in einen Kulturwirt einführt, wobei die viralen Rückgratabschnitte aus zwei oder mehreren Influenzastämmen stammen und wobei der HA- und der PB1-Abschnitt aus unterschiedlichen Influenzastämmen stammen, die denselben Influenza HA-Subtyp aufweisen; und (ii) den Kulturwirt kultiviert, um reassortiertes Virus herzustellen und optional (iii) das in Schritt (ii) gewonnene Virus aufreinigt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen reassortierten Influenza A-Virus bereit, das Schritte umfasst, bei denen man (i) ein oder mehrere Expressionskonstrukte, das/die für die viralen Abschnitte kodieren, welche für die Herstellung eines Influenza A-Virus erforderlich sind, in einen Kulturwirt einführt, wobei ein oder mehrere virale Rückgratabschnitte aus einem 105p30- und/oder PR8-X-Influenzastamm stammt/stammen, und wobei mindestens ein viraler Abschnitt aus einem zweiten Influenzastamm abgeleitet ist; und (ii) den Kulturwirt kultiviert, um reassortiertes Virus herzustellen und optional (iii) das in Schritt (ii) gewonnene Virus aufreinigt.
Die Verfahren können ferner Schritte umfassen, bei denen man: (iv) einen Kulturwirt mit dem in Schritt (ii) oder Schritt (iii) gewonnenen Virus infiziert; (v) den Kulturwirt aus Schritt (iv) kultiviert, um weiteren Virus herzustellen; und optional (vi) das in Schritt (v) gewonnene Virus aufreinigt.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Influenzaviren bereit, das Schritte umfasst, bei denen man (a) einen Kulturwirt mit einem erfindungsgemäßen reassortierten Virus infiziert; (b) den Wirt aus Schritt (a) kultiviert, um das Virus herzustellen; und optional (c) das in Schritt (b) gewonnene Virus aufreinigt.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereit, das Schritte umfasst, bei denen man (d) ein Virus durch die Verfahren von einer der oben beschriebenen Ausführungsformen herstellt und (e) Impfstoff aus dem Virus herstellt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Influenzastämme PR8-X und 105p30 bereit.
Die Erfindung umfasst ferner H1N1-Influenzavirus-Variantenstämme, in denen der Genomabschnitt M ein Lysin in der Position aufweist, die Aminosäure 95 von SEQ ID Nr.: 33 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 33 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird. Die erfindungsgemäßen H1N1-Influenzavirus-Variantenstämme können ferner einen HA-Abschnitt aufweisen, der ein Glycin in der Position aufweist, die Aminosäure 225 von SEQ ID Nr.: 35 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 35 durchgeführt wird, und/oder ein Asparagin in der Position aufweist, die Aminosäure 231 von SEQ ID Nr.: 35 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 35 durchgeführt wird, wobei jeweils ein Algorithmus für ein paarweises Alignment verwendet wird. Der H1N1-Influenzavirus-Variantenstamm kann ferner einen NA-Abschnitt aufweisen, der ein Histidin in der Position aufweist, die Aminosäure 70 von SEQ ID Nr.: 31 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 31 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird.
Der bevorzugte Algorithmus für ein paarweises Alignment ist der globale Alignment-Algorithmus von Needleman-Wunsch [3], unter Verwendung von Standardparametern (z. B. mit Gap opening penalty = 10,0 und mit Gap extension penalty = 0,5, unter Verwendung der EBLOSUM62 Scoring-Matrix). Dieser Algorithmus ist in dem needle-Werkzeug des EMBOSS-Pakets implementiert [4].
Die Erfindung stellt ein Expressionssystem bereit, das ein oder mehrere Expressionskonstrukte umfasst, welches/welche die Abschnitte eines Influenza A-Virus umfasst/umfassen, die für vRNA kodieren, wobei das/die Expressionskonstrukt(e) für die viralen Rückgratabschnitte von zwei oder mehreren Influenza-Donorstämmen kodiert/kodieren. Das/die Expressionskonstrukt(e) kann/können für die PB1- und PB2-Abschnitte desselben Donorstamms kodieren.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Expressionssystem bereit, das ein oder mehrere Expressionskonstrukte umfasst, welches/welche die Abschnitte eines 105p30- oder PR8-X-Stamms umfasst/umfassen, die für vRNA kodieren, wobei das/die Expressionskonstrukt(e) mindestens einen viralen Rückgratabschnitt aus dem 105p30- oder dem PR8-X-Stamm umfassen. Das/die Expressionskonstrukt(e) kann/können ferner die vRNAs umfassen, welche für die PB2-, NP-, NS-, M- und PA-Abschnitte von PR8-X kodieren.
Die Erfindung stellt ferner eine Wirtszelle bereit, die die erfindungsgemäßen Expressionssysteme umfasst. Diese Wirtszellen können einen Influenza A Virus ausgehend von dem/den Expressionskonstrukt(en) in dem Expressionssystem exprimieren.
Expressionskonstrukte, die in den erfindungsgemäßen Expressionssystemen verwendet werden können, werden ebenfalls bereitgestellt. Die Erfindung stellt zum Beispiel ein Expressionskonstrukt bereit, das für die Rückgratabschnitte der erfindungsgemäßen reassortierten Influenzastämme auf demselben Konstrukt kodiert.
Donorstämme
Ein Donostamm ist ein Influenzastamm, der ein oder mehrere Rückgratabschnitte (d. h. solche, die für PB1, PB2, PA, NP, M1, M2, NS1 und NS2 kodieren) eines Influenzastamms bereitstellt. Der NA-Abschnitt kann auch von einem Donorstamm bereitgestellt werden, oder er kann von einem Impfstoffstamm bereitgestellt werden. Der Impfstoffstamm ist der Influenzastamm, der den HA-Abschnitt des reassortierten Influenzastamms bereitstellt. Bei dem Impfstoffstamm kann es sich um einen beliebigen Stamm handeln, und dieser kann von Saison zu Saison variieren. Die reassortierten Influenzastämme der Erfindung können ferner ein oder mehrere, jedoch nicht alle, der Rückgratabschnitte des Impfstoffstamms umfassen. Da das reassortierte Influenzavirus insgesamt 8 Abschnitte umfasst, wird es somit x virale Abschnitte von dem Impfstoffstamm enthalten (wobei x von 1 bis 7 ist) und 8-x virale Abschnitte von dem einen oder den mehreren Donorstämmen.
Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass reassortierte Influenza A-Viren, die Rückgratabschnitte aus zwei oder mehreren Influenza-Donorstämmen umfassen, in einem Kulturwirt im Vergleich mit reassortierten Influenzaviren, die alle Rückgratabschnitte desselben Donorstamms enthalten, zu höheren Titern heranwachsen können. Die Erfinder haben gezeigt, dass dieser Effekt auf der Gegenwart von Rückgratabschnitten aus zwei Donorstämmen beruht. Besonders gute Ergebnisse werden jedoch mit Influenza A-Stämmen erreicht, in denen der M-Genomabschnitt Lysin an der Position aufweist, die bei einem Alignment mit SEQ ID Nr.: 33 der Aminosäure 95 von SEQ ID Nr.: 33 entspricht.
Reassortierte Influenza A-Viren, die die PB1- und PB2-Abschnitte desselben Influenzastamms (zum Beispiel 105p30) umfassen, sind ebenfalls vorteilhaft, weil sie im Vergleich mit Influenzaviren, bei denen die PB1- und PB2-Abschnitte aus verschiedenen Viren stammen, eine bessere Freisetzungseffizienz zeigen. Die PB1- und PB2-Abschnitte von 105p30 haben die Sequenz von SEQ ID Nrn: 18 bzw. 19.
Die Erfinder haben ebenfalls gezeigt, dass einige Influenzavirusstämme in MDCK-Zellen in der gleichen Zeit und unter denselben Wachstumsbedingungen im Vergleich mit A/Puerto Rico/8/34 zu höheren viralen Titern heranwachsen können.
Varianten von Influenza-Donorstämmen, die von den erfindungsgemäßen Donorstämmen oder anderen bekannten Donorstämmen, wie A/PR/8/34 (wt PR8) abgeleitet sind, können ebenfalls als Donorstämme nützlich sein. Diese Donorstämme können (in derselben Zeit und unter denselben Wachstumsbedingungen) im Vergleich mit dem Donorstamm, von dem sie abgeleitet wurden, zu höheren viralen Titer heranwachsen. Die Erfinder haben zum Beispiel überraschenderweise herausgefunden, dass ein mehrmaliges Passagieren des Influenzastamms A/PR/8/34 in Zellkultur zu einem Virusstamm (PR8-X) führt, der im Vergleich mit dem ursprünglichen A/PR8/34 Stamm zu viel höheren viralen Titern heranwächst. Die Erfinder haben gleichermaßen herausgefunden, dass ein mehrmaliges Passagieren des Stamms A/New Caledonia/20/1999 in Zellen zu einem Stamm (105p30) führt, der in derselben Zeit und unter denselben Wachstumsbedingungen im Vergleich mit dem nicht-passagierten A/New Caledonia/20/1999-Stamm sogar zu noch höheren viralen Titer heranwächst. Reassortierte Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von einem Donorstamm der Erfindung umfassen, werden üblicherweise virale Titer erreichen, die unter denselben. Wachstumsbedingungen und in demselben Zeitraum (zum Beispiel 12 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden oder 72 Stunden) mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 50%, mindestens 100%, mindestens 500% oder mindestens 1000% höher sind als die viralen Titer, die mit dem Donorstamm erhalten werden, von dem die Variante abgeleitet wurde.
Die Abschnitte von PR8-X haben die Sequenzen von SEQ ID Nr.: 9 (PA), SEQ ID Nr.: 10 (PB1), SEQ ID Nr.: 11 (PB2), SEQ ID Nr.: 12 (NP), SEQ ID Nr.: 13 (M), SEQ ID Nr.: 14 (NS), SEQ ID Nr.: 15 (HA) oder SEQ ID Nr.: 16 (NA).
Die Abschnitte von 105p30 haben die Sequenzen von SEQ ID Nr.: 17 (PA), SEQ ID Nr.: 18 (PB1), SEQ ID Nr.: 19 (PB2), SEQ ID Nr.: 20 (NP), SEQ ID Nr.: 21 (M), SEQ ID Nr.: 22 (NS), SEQ ID Nr.: 23 (HA) oder SEQ ID Nr.: 24 (NA).
Die Abschnitte von PR8-X, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden können, können die folgenden sein:

(a) ein PA-Abschnitt mit mindestens 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 9, wobei der PA-Abschnitt ein Thymin in der Position aufweist, die dem Nukleotid 375 von SEQ ID Nr.: 9 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 9 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird; und/oder ein Thymin in der Position, die dem Nukleotid 1233 von SEQ ID Nr.: 9 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 9 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird;
(b) ein PBI-Abschnitt mit mindestens 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 10, wobei der PB1-Abschnitt ein oder mehrere, oder alle, der folgenden umfasst: ein Adenin in der Position, die Nukleotid 64 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 294 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Guanin in der Position die Nukleotid 297 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Cytosin in der Position, die Nukleotid 549 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 639 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Cytosin in der Position, die Nukleotid 1002 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, ein Thymin in der Position, die Nukleotid 1551 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, oder ein Guanin in der Position, die Nukleotid 2076 von SEQ ID Nr.: 10 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 9 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird;
(c) ein PB2-Abschnitt mit 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 11, wobei der PB2-Abschnitt ein oder mehrere, oder alle, der folgenden umfasst: ein Adenin in der Position, die Nukleotid 393 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, ein Adenin in der Position, die Nukleotid 1068 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 1355 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, ein Cytosin in der Position, die Nukleotid 1422 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, oder ein Adenin in der Position, die Nukleotid 1662 von SEQ ID Nr.: 11 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 11 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird;
(d) ein NP-Abschnitt mit 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 12, wobei das NP-Segment ein oder mehrere, oder alle, der folgenden umfasst: ein Thymin in der Position, die Nukleotid 54 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Adenin in der Position, die Nukleotid 69 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Thymin in der Position, die Nukleotid 282 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Adenin in der Position, die Nukleotid 303 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Adenin in der Position, die Nukleotid 630 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 924 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, ein Guanin in der Position, die Nukleotid 1350 von SEQ ID Nr.: 12 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 12 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird;
(e) ein M-Abschnitt mit 97% Identität, mindestens 98% Identität oder mindestens 99% Identität zu der Sequenz von SEQ ID Nr.: 13, wobei der M-Abschnitt ein oder mehrere, oder alle, der folgenden umfasst: ein Adenin in der Position, die Nukleotid 4 von SEQ ID Nr.: 13 entspricht, ein Cytosin in der Position, die Nukleotid 4 von SEQ ID Nr.: 13 entspricht, und ein Adenin in der Position, die Nukleotid 4 von SEQ ID Nr.: 13 entspricht, wenn ein Alignment mit SEQ ID Nr.: 13 mit einem Algorithmus für ein paarweises Alignment durchgeführt wird.
Der PR8-X-Stamm unterscheidet sich in diesen Mutationen von A/PR/8/34 und somit verweist das Vorhandensein der in dem vorhergehenden Abschnitt aufgeführten Nukleotide auf ein schnelleres Wachstum in einem Kulturwirt.

Influenzastämme, die einen, zwei, drei, vier, fünf sechs oder sieben der Abschnitte aus den Stämmen 105p30 oder PR8-X enthalten, können ebenfalls als Donorstämme verwendet werden.
Variationen in der DNA- und der Aminosäuresequenz können auch von spontanen Mutationen stammen, die während des Passagierens der Viren vorkommen können. Solche abweichenden Influenzastämme können ebenfalls im Rahmen der Erfindung verwendet werden.
Reassortierte Viren
Die Erfindung stellt reassortierte Influenzaviren zur Verfügung, die mindestens zwei virale Rückgratabschnitte von den Donorstämmen der Erfindung umfassen, z. B. einem PR8-X- oder einem 105p30-Stamm. Die reassortierten Influenzaviren der Erfindung können reassortierte Viren zwischen zwei, drei oder mehreren unterschiedlichen Influenzastämmen sein, vorausgesetzt, dass mindestens ein viraler Abschnitt von einem Donorstamm der Erfindung abgeleitet ist.
In einigen Aspekten stellt die Erfindung reassortierte Influenzaviren bereit, die Rückgratabschnitte von zwei oder mehreren Influenza-Donorstämmen umfassen. Die PB1- und PB2-Abschnitte können von demselben Donorstamm stammen.
Die Erfindung stellt reassortierte Influenzaviren bereit, die mindestens einen viralen Rückgratabschnitt der erfindungsgemäßen Donorstämme umfassen, z. B. von einem PR8-X oder einem 105p30 Stamm. Die erfindungsgemäßen reassortierten Influenzaviren können Reassortierungen zwischen zwei, drei oder mehreren verschiedenen Influenzastämmen sein, sofern mindestens ein viraler Abschnitt von einem erfindungsgemäßen Donorstamm abgeleitet ist.
Influenzaviren sind segmentierte Negativstrang-RNA-Viren. Influenza-A- und Influenza-B-Viren haben acht Abschnitte (NP, M, NS, PA, PB1, HA und NA) während Influenza C-Virus sieben Abschnitte hat. Die erfindungsgemäßen reassortierten Viren umfassen die Rückgratabschnitte von zwei oder mehreren Donorstämmen oder mindestens zwei (d. h. zwei, drei, vier, fünf oder sechs) Rückgratabschnitte aus den erfindungsgemäßen Donorstämmen. Die viralen Rückgratabschnitte sind jene, die nicht für HA oder NA kodieren. Dementsprechend werden die Rückgratabschnitte üblicherweise für die PB1-, PB2-, PA-, NP-, M₁-, M₂- NS₁- und NS₂-Polypeptide des Influenzavirus kodieren. Die reassortierten Viren werden üblicherweise nicht die Abschnitte umfassen, die für HA und NA der Donorstämme kodieren, obwohl reassortierte Viren, die entweder das HA oder das NA, nicht aber beide, von den erfindungsgemäßen Donorstämmen umfassen, auch in Betracht gezogen werden.
Sind die erfindungsgemäßen reassortierten Viren solche, die die Rückgratabschnitte eines einzelnen Donorstamms umfassen, so werden die reassortierten Viren üblicherweise Abschnitte von dem Donorstamm und dem Impfstoff-Stamm in einem Verhältnis von 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2 oder 7:1 enthalten. Liegt eine Mehrheit von Abschnitten des Donorstamms vor, so ist insbesondere ein Verhältnis von 6:2 üblich. Umfassen die reassortierten Viren Rückgratabschnitte von zwei Donorstämmen, so wird das reassortierte Virus üblicherweise Abschnitte von dem ersten Donorstamm, dem zweiten Donorstamm und dem Impfstoff-Stamm in einem Verhältnis von 1:1:6, 1:2:5, 1:3:4, 1:4:3, 1:5:2, 1:6:1, 2:1:5, 2:2:4, 2:3:3, 2:4:2, 2:5:1, 3:1:2, 3:2:1, 4:1:3, 4:2:2, 4:3:1, 5:1:2, 5:2:1 oder 6:1:1 umfassen.
Die Erfindung umfasst auch reassortierte Viren, die virale Abschnitte von drei verschiedenen, Donorstamm/Donorstämmen umfassen, wobei mindestens zwei virale Abschnitte von den Influenzastämmen PR8-X oder 105p30 abgeleitet sind. Solche reassortierten Influenzaviren werden üblicherweise den HA-Abschnitt und/oder den NA-Abschnitt von einem Impfstoff-Stamm umfassen. Umfassen die reassortierten Viren virale Abschnitte von mehr als einem Influenza-Donorstamm, so kann es sich bei dem/den weiteren Donorstamm/Donorstämme um jeden beliebigen Donorstamm, einschließlich der erfindungsgemäßen Donorstämme, handeln. Einige der viralen Abschnitte können zum Beispiel von den Influenzastämmen A/PR/8/34 oder AA/6/60(A/Ann Arbor/6/60) abgeleitetsein. Reassortierte Viren, die virale Abschnitte des AA/6/60 Stamms enthalten, können vorteilhaft sein, zum Beispiel wenn das reassortierte Virus in einem attenuierten Influenza-Lebendimpfstoff verwendet werden soll.
Die erfindungsgemäßen reassortierten Viren können in derselben Zeit (zum Beispiel 12 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden oder 72 Stunden) und unter denselben Wachstumsbedingungen zu höheren viralen Titern heranwachsen als die Wildtyp-Impfstoffstämme, von denen einige der viralen Abschnitte des reassortierten Virus abgeleitet sind. Der virale Titer kann durch Standardverfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die erfindungsgemäßen reassortierten Viren können in demselben Zeitraum und unter denselben Bedingungen einen viralen Titer erreichen, der mindestens 10% höher, mindestens 20% höher, mindestens 50% höher, mindestens 100% höher, mindestens 200% höher, mindestens 500% höher oder mindestens 1000% höher ist, als der virale Titer des Wildtyp-Impfstoffstamms.
Die Erfindung ist für die Reassortierung von pandemischen sowie auch von inter-pandemischen (saisonalen) Influenza-Impfstoffstämmen geeignet. Die reassortierten Influenzastämme können die Influenza A-Virus HA-Subtypen H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 oder H17 enthalten. Sie können die Influenza A-Virus NA Subtypen N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 oder N9 enthalten. Ist der Impfstoffstamm, der in den erfindungsgemäßen reassortierten Influenzaviren verwendet wird, ein saisonaler Influenzastamm, so kann der Impfstoffstamm einen H1- oder H3-Subtyp aufweisen. In einem Aspekt der Erfindung ist der Impfstoffstamm ein H1N1- oder H3N2-Stamm.
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Impfstoffstämme können auch pandemische Stämme oder potentiell pandemische Stämme sein. Die Eigenschaften eines Influenzastamms, die ihm das Potential verleihen, einen pandemischen Ausbruch zu verursachen, sind: (a) er umfasst im Vergleich zu den Hämagglutininen in momentan zirkulierenden humanen Stämmen ein neues Hämagglutinin, d. h. eines, das in der humanen Population für mehr als ein Jahrzehnt nicht in Erscheinung getreten ist (z. B. H2) oder zuvor niemals in der menschlichen Bevölkerung nachgewiesen wurde (z. B. H5, H6 oder H9, die im Allgemeinen nur in Populationen von Vögeln nachgewiesen wurden), so dass die menschliche Population gegenüber dem Hämagglutinin des Stamms immunologisch naiv sein wird; (b) er ist in der Lage, in der menschlichen Bevölkerung horizontal übertragen zu werden; und (c) er ist für Menschen pathogen. Ein Impfstoffstamm mit einem Hämagglutinin vom Typ H5, wie z. B. ein H5N1-Stamm, ist bevorzugt, wenn das reassortierte Virus in Impfstoffen für die Immunisierung gegen eine pandemische Influenza verwendet wird. Andere mögliche Stämme umfassen H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 und H7N7 und sämtliche anderen aufkommenden, potentiell pandemischen Stämme. Die Erfindung ist besonders zur Herstellung reassortierter Viren zur Verwendung in einem Impfstoff zum Schutz gegen potentiell pandemische Virusstämme geeignet, die sich ausgehend von einer nicht-menschlichen Tierpopulation auf Menschen verbreiten können oder sich auf diese Weise verbreitet haben, zum Beispiel ein H1N1-Influenzastamm, das aus dem Schwein stammt.
Der erfindungsgemäße reassortierte Influenzastamm kann den HA-Abschnitt und/oder den NA-Abschnitt von einem A/California/4/09-Stamm umfassen. Dementsprechend kann zum Beispiel der HA-Genabschnitt für ein H1-Hämagglutinin kodieren, das näher mit SEQ ID Nr.: 32 als mit SEQ ID Nr.: 25 verwandt ist (d. h. es weist bei Verwendung desselben Algorithmus und derselben Parameter im Vergleich mit SEQ ID Nr.: 32 einen höheren Grad an Sequenzidentität auf als mit SEQ ID Nr.: 25). SEQ ID Nrn.: 32 und 25 sind zu 80% identisch. In ähnlicher Weise kann das NA-Gen für eine N1-Neuramidase kodieren, die näher mit SEQ ID Nr.: 27 verwandt ist, als mit SEQ ID Nr.: 26. SEQ ID Nrn.: 27 und 26 sind zu 82% identisch.
Stämme, die als Impfstoff-Stämme verwendet werden können, umfassen Stämme, die gegen eine antivirale Therapie resistent sind (z. B. resistent gegen Oseltamivir [5] und/oder Zanamivir), einschließlich resistenter pandemischer Stämme [6].
Die Wahl des Donorstamms zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren kann von dem Impfstoffstamm, der reassortiert werden soll, abhängen. Da Reassortierungen zwischen evolutionär weit entfernten Stämmen in Zellkultur nicht gut repliziert werden könnten, ist es möglich, dass der Donorstamm und der Impfstoffstamm denselben HA- und/oder NA-Subtyp aufweisen. In anderen Ausführungsformen können der Impfstoffstamm und der Donorstamm jedoch verschiedene HA- und/oder NA-Subtypen haben, und diese Zusammenstellung kann die Selektion reassortierter Viren ermöglichen, die den HA- und/oder NA-Abschnitt von dem Impfstoffstamm enthalten. Obwohl die 105p30- und PR8-X-Stämme den H1-Influenza-Subtyp umfassen, können diese Donorstämme daher für Impfstoffstämme verwendet werden, die den H1-Influenza-Subtyp nicht enthalten.
Reassortierungen der erfindungsgemäßen Donorstämme, bei denen der HA- und/oder der NA-Abschnitt in einen anderen Subtyp verändert wurde, können ebenfalls verwendet werden. Der H1-Influenza-Subtyp des 105p30- oder PR8-X-Stamms kann zum Beispiel in einen H3- oder H5-Subtyp geändert werden.
Daher umfasst die Erfindung ein Influenza A-Virus, das zwei, drei, vier, fünf, sechs oder sieben virale Abschnitte aus den erfindungsgemäßen Stämmen 105p30 oder PR8-X und einen HA-Abschnitt, der nicht vom H1-Subtyp ist, umfasst. Die reassortierten Donorstämme können ferner einen NA-Abschnitt umfassen, der nicht vom N1-Subtyp ist. Geeignete Techniken zur Reassortierung der Donorstämme sind für einen Fachmann offensichtlich.
Die Erfindung umfasst ferner reassortierte Donorstämme, die mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs oder mindestens sieben virale Abschnitte aus den erfindungsgemäßen Stämmen 105p30 oder PR8-X und einen H1 HA-Abschnitt umfassen, der von einem anderen Influenzastamm abgeleitet ist.
Reassortierte Viren, die einen NS-Abschnitt enthalten, der für kein funktionelles NS-Protein kodiert, sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. NS1-knock-out-Mutanten werden in Referenz 7 beschrieben. Diese NS1-Virusstamm-Mutanten sind besonders zur Herstellung von attenuierten Influenza-Lebendimpfstoffen geeignet.
Der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete 'zweite Influenzastamm' unterscheidet sich von dem verwendeten Donorstamm.
Reverse Genetik:
Die Erfindung ist besonders zur Herstellung von reassortierten Influenzavirusstämmen mittels Methoden der reversen Genetik geeignet. In diesen Methoden werden die Viren in Kulturwirten unter Verwendung eines Expressionssystems hergestellt.
In einem Aspekt kann das Expressionssystem für die PB1- und PB2-Abschnitte aus demselben Donorstamm kodieren. In diesem erfindungsgemäßen Aspekt kann das System für mindestens einen (d. h. einen, zwei, drei oder vier) der Abschnitte NP, M, NS und/oder PA aus einem anderen Influenza-Donorstamm kodieren.
In einem weiteren Aspekt kann das System für ein oder mehrere (z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6) Genomabschnitt aus dem PR8-X Stamm kodieren, wobei dieser/diese allerdings üblicherweise den PR8-X HA-Abschnitt nicht umfassen wird/werden, und üblicherweise nicht den PR8-X NA-Abschnitt. Dementsprechend kann das System für mindestens einen der Abschnitte NP, M, NS, PA, PB1 und/oder PB2 (möglicherweise alle sechs) aus PR8-X kodieren.
Das System kann ein oder mehrere (z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder 6) Genomabschnitte des 105p30-Stamms kodieren, wobei dieser/diese allerdings üblicherweise den 105p30 HA-Abschnitt nicht umfassen wird/werden, und üblicherweise nicht den 105p30 NA-Abschnitt. Dementsprechend kann das System für mindestens einen der Abschnitte NP, M, NS, PA, PB1 und/oder PB2 (möglicherweise alle sechs) von 105p30 kodieren.
Reverse Genetik für Influenza A- und Influenza B-Viren kann mit 12 Plasmiden durchgeführt werden, um die vier Proteine zu exprimieren, die zur Initiierung von Replikation und Transkription benötigt werden (PB1, PB2, PA und Nukleoprotein), und alle acht viralen Genomabschnitte. Um die Anzahl an Konstrukten zu verringern, kann jedoch eine Mehrzahl von RNA-Polymerase I-Transkriptionskassetten (zur Synthese der viralen RNA) auf einem einzelnen Plasmid eingeschlossen werden (z. B. die Sequenzen, die für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder alle 8 vRNA-Abschnitte von Influenza kodieren), und eine Mehrzahl von Protein-kodierenden Regionen mit RNA-Polymerase II-Promotoren auf einem weiteren Plasmid (z. B. Sequenzen, die für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 mRNA-Transkripte von Influenza kodieren) [8]. Es ist ebenfalls möglich, einen oder mehrere vRNA-Abschnitte von Influenza unter der Kontrolle eines pol I-Promoters einzuschließen, und eine oder mehrere für Proteine von Influenza kodierende Regionen unter der Kontrolle eines anderen Promoters, insbesondere eines pol II-Promoters, auf demselben Plasmid. Dies wird vorzugsweise durch Verwendung von bi-direktionalen Plasmiden erreicht.
Bevorzugte Aspekte des Verfahren von Referenz 8 umfassen: (a) PB1-, PB2- und PA-mRNA-kodierende Regionen auf einem einzelnen Expressionskonstrukt; und (b) alle 8 vRNA-kodierende Abschnitte auf einem einzelnen Expressionskonstrukt. Es ist besonders bevorzugt, die Neuramidase-(NA) und die Hämagglutinin-(HA)Abschnitte auf einem Expressionskonstrukt und die anderen sechs viralen Abschnitte auf einem anderen Expressionskonstrukt einzuschließen, da neu auftretende Influenzastämme üblicherweise Mutationen in den NA- und/oder HA-Abschnitten aufweisen. Dementsprechend besteht der Vorteil, die HA- und/oder NA-Abschnitte auf einem separaten Expressionskonstrukt vorliegen zu haben, darin, dass nur der Vektor, welcher die HA- und NA-Abschnitte umfasst, ausgetauscht werden muss. Daher können in einem Aspekt der Erfindung die NA- und/oder die HA-Abschnitte auf einem Expressionskonstrukt eingeschlossen werden, und die vRNA-kodierenden Abschnitte des/der erfindungsgemäßen Donorstamms/Donorstämme, mit Ausnahme des/der HA- und/oder NA-Abschnitts/Abschnitte, auf einem anderen Expressionskonstrukt. Die Erfindung stellt daher ein Expressionskonstrukt bereit, das ein, zwei, drei, vier, fünf oder sechs vRNA-kodierende virale Rückgratabschnitte eines erfindungsgemäßen Donorstamms umfasst. Das Expressionskonstrukt darf keine viralen HA- und/oder NA-Abschnitte umfassen, die ein funktionales HA- und/oder NA-Protein erzeugen.
Bekannte Systeme der reversen Genetik umfassen die Expression von DNA-Molekülen, die für die gewünschten viralen RNA-(vRNA)Moleküle kodieren, von pol I-Promotoren, bakteriellen RNA-Polymerase-Promotoren, Bakteriophagen-Polymerase-Promotoren, usw. Da Influenzaviren die Gegenwart einer viralen Polymerase erfordern, um den Lebenszyklus zu vervollständigen, können die Systeme diese Proteine ebenfalls bereitstellen, z. B. umfasst das System ferner DNA-Moleküle, die für virale Polymerase-Proteine kodieren, so dass die Expression beider Typen von DNA zum Zusammenbau eines vollständigen, infektiösen Virus führt. Es ist auch möglich, die virale Polymerase als Protein bereitzustellen.
Wird reverse Genetik zur Expression von Influenza-vRNA verwendet, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass eine präzise Beabstandung der Sequenzelemente in Bezug aufeinander für die Polymerase wichtig ist, um die Replikation zu initiieren. Es daher wichtig, dass das DNA-Molekül, welches für die virale RNA kodiert, richtig zwischen dem pol I-Promoter und der Terminationssequenz angeordnet ist, wobei diese Anordnung allerdings gänzlich innerhalb der Fähigkeiten derer liegt, die mit reversen Genetiksystemen arbeiten.
Um ein rekombinantes Virus herzustellen, muss eine Zelle alle Abschnitte des viralen Genoms exprimieren, die für den Zusammenbau eines Virions notwendig sind. DNA, die in die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte kloniert wird, stellt vorzugsweise die gesamte virale RNA und alle Proteine bereit, wobei es aber auch möglich ist, ein Helfervirus zu verwenden, um einige der RNA und Proteine bereitzustellen, obwohl Systeme bevorzugt werden, die kein Helfervirus verwenden. Da das Influenzavirus ein segmentiertes Virus ist, wird das virale Genom üblicherweise unter Verwendung von mehr als einem Expressionskonstrukt in den erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden. Es wird jedoch ebenfalls in Betracht gezogen, einen oder mehrere Abschnitte oder sogar alle Abschnitte des viralen Genoms auf einem einzigen Expressionskonstrukt zu kombinieren.
In einigen Ausführungsformen wird auch ein Expressionskonstrukt miteinbezogen, das zur Expression eines akzessorischen Proteins in der Wirtszelle führt. Es kann zum Beispiel vorteilhaft sein, eine nicht-virale Serinprotease (z. B. Trypsin) als Teil eines reversen Genetiksystems zu exprimieren.
Expressionskonstrukte
Expressionskonstrukte, die in den erfindungsgemäßen Expressionssystemen verwendet werden, können uni-direktionale oder bi-direktionale Expressionskonstrukte sein. Wird mehr als ein Transgen in den Verfahren verwendet (entweder auf demselben Expressionskonstrukt oder auf verschiedenen Expressionskonstrukten), ist es möglich, eine uni-direktionale und/oder eine bi-direktionale Expression zu verwenden.
Da Influenzaviren ein Protein für ihre Infektiosität benötigen, ist es im Allgemeinen bevorzugt, bi-direktionale Expressionskonstrukte zu verwenden, da dies die Gesamtzahl von Expressionskonstrukten verringert, die von der Wirtszelle benötigt werden. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren von mindestens einem bi-direktionalem Expressionskonstrukt Gebrauch machen, wobei ein Gen oder eine cDNA zwischen einem stromaufwärts gelegenen pol II-Promoter und einem stromabwärts gelegenen, nicht-endogenen pol I-Promoter lokalisiert ist. Die Transkription des Gens oder der cDNA von dem pol II-Promoter erzeugt mit einem Cap versehene, virale mRNA positiver Orientierung, die in ein Protein translatiert werden kann, während die Transkription von dem nicht-endogenen pol I-Promoter vRNA mit negativer Orientierung erzeugt. Das bi-direktionale Expressionskonstrukt kann ein bi-direktionaler Expressionsvektor sein.
Bi-direktionale Expressionskonstrukte umfassen mindestens zwei Promotoren, die ausgehend von demselben Konstrukt die Expression in verschiedenen Richtungen antreiben (d. h. sowohl von 5' nach 3' als auch von 3' nach 5'). Die zwei Promotoren können in funktionsfähiger Weise mit verschiedenen Strängen der gleichen doppelsträngigen DNA verbunden sein. Vorzugsweise ist einer der Promotoren ein pol I-Promoter, und mindestens einer der anderen Promotoren ist ein pol II-Promoter. Dies ist nützlich, da der pol I-Promoter verwendet werden kann, um vRNAs zu exprimieren, die nicht mit einem Cap versehen sind, während der pol II-Promoter zur Transkription von mRNAs verwendet werden kann, die anschließend in Proteine translatiert werden, wodurch eine simultane Expression von RNA und Protein von demselben Konstrukt möglich ist. Wird mehr als ein Expressionskonstrukt innerhalb eines Expressionssystems verwendet, können die Promotoren eine Mischung aus endogenen und nicht-endogenen Promotoren sein.
Die in den Expressionskonstrukten verwendeten pol I- und pol II-Promotoren können endogen aus einen Organismus derselben taxonomischen Ordnung stammen, aus der die Wirtszelle abgeleitet wurde. Alternativ können die Promotoren aus einem Organismus einer anderen taxonomischen Ordnung als die Wirtszelle abgeleitet werden. Der Begriff ”Ordnung” bezieht sich auf konventionelle taxonomische Klassifizierung, und Beispiele für Ordnungen sind Primaten, Rodentia, Carnivora, Beuteltiere, Zetazeen, usw. Menschen und Schimpansen sind in derselben taxonomischen Ordnung (Primaten), aber Menschen und Hunde sind in verschiedenen Ordnungen (Primaten vs. Carnivora). Es kann zum Beispiel der menschliche pol I-Promoter zur Expression von viralen Abschnitten in Hundezellen (z. B. MDCK-Zellen) verwendet werden.
Das Expressionskonstrukt wird typischerweise eine RNA Transkriptionsterminationssequenz umfassen. Die Terminationssequenz kann eine endogene Terminationssequenz oder eine Terminationssequenz sein, die für die Wirtszelle nicht endogen ist. Geeignete Terminationssequenzen werden für den Fachmann offensichtlich sein und umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) die RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz, die RNA Polymerase II-Transkriptionsterminationssequenz und Ribozyme. Ferner können die Expressionskonstrukte ein oder mehrere Polyadenylierungssignale für mRNAs enthalten, insbesondere am Ende eines Gens, dessen Expression durch einen pol II-Promoter kontrolliert wird.
Ein Expressionssystem kann mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens sieben, mindestens acht, mindestens neun, mindestens zehn, mindestens elf oder mindestens zwölf Expressionskonstrukte enthalten.
Ein Expressionskonstrukt kann ein Vektor, wie ein Plasmid oder ein anderes episomales Konstrukt, sein. Solche Vektoren werden typischerweise mindestens einen bakteriellen und/oder eukaryontischen Replikationsursprung umfassen. Ferner kann der Vektor einen selektierbaren Marker umfassen, der eine Selektion in prokaryontischen und/oder eukaryontischen Zellen erlaubt. Beispiele für solche selektierbaren Marker sind Gene, die eine Resistenz gegen Antibiotika, wie Ampicillin oder Kanamycin, verleihen. Der Vektor kann ferner eine oder mehrere multiple Klonierungsstellen umfassen, um die Klonierung einer DNA-Sequenz zu ermöglichen.
Alternativ dazu kann ein Expressionskonstrukt ein lineares Expressionskonstrukt sein. Solche linearen Expressionskonstrukte werden typischerweise keine Amplifikations- und/oder Selektionssequenzen enthalten. Lineare Konstrukte, die solche Amplifikations- und/oder Selektionssequenzen umfassen, sind jedoch auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Referenz 9 beschreibt ein lineares Expressionskonstrukt, das einzelne lineare Expressionskonstrukte für jeden viralen Abschnitt beschreibt. Es ist auch möglich, mehr als einen, zum Beispiel zwei, drei, vier, fünf oder sechs virale Abschnitte auf demselben linearen Expressionskonstrukt einzuschließen. Solch ein System wurde zum Beispiel in Referenz 10 beschrieben.
Expressionskonstrukte können unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Solche Verfahren wurden zum Beispiel in Referenz 11 beschrieben. Ist das Expressionskonstrukt ein lineares Expressionskonstrukt, so ist es möglich, es mittels einer einzigen Restriktionsenzymschnittstelle vor der Einführung in die Wirtszelle zu linearisieren. Alternativ dazu ist es möglich, das Expressionskonstrukt aus einem Vektor unter Verwendung von mindestens zwei Restriktionsenzymschnittstellen auszuschneiden. Es ist ferner ebenfalls möglich, ein lineares Expressionskonstrukt zu erhalten, indem man es mittels eines Ampflifikationsverfahrens für Nukleinsäure amplifiziert (z. B. durch PCR).
Die in den erfindungsgemäßen Systemen verwendeten Expressionskonstrukte können nicht-bakterielle Expressionskonstrukte sein. Dies bedeutet, dass das Konstrukt in einer eukaryontischen Zelle die Expression von viralen RNA-Abschnitten, die von diesem kodiert werden, bewirken kann, aber es beinhaltet keine Komponenten, die für die Vermehrung des Konstruktes in Bakterien benötigt würden. Daher wird das Konstrukt keinen bakteriellen Replikationsursprung (ori) enthalten, und es wird üblicherweise keinen bakteriellen Selektionsmarker (z. B. einen antibiotischen Resistenzmarker) enthalten. Solche Expressionskonstrukte sind in Referenz 12 beschrieben, die durch Verweis eingeschlossen ist.
Die Expressionskonstrukte können durch chemische Synthese hergestellt werden. Die Expressionskonstrukte können entweder ausschließlich durch chemische Synthese hergestellt werden oder teilweise. Geeignete Verfahren zur Herstellung von Expressionskonstrukten mittels chemischer Synthese sind zum Beispiel in Referenz 12 beschrieben, welche durch Verweis eingeschlossen ist.
Die erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte können unter Verwendung jeglicher dem Fachmann bekannter Verfahren in Wirtszellen eingeführt werden. Erfindungsgemäße Expressionskonstrukte können zum Beispiel durch Elektroporation, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Fällung, Liposomen, Mikroinjektion oder Mikropartikel-Bombardierung in Wirtszellen eingeführt werden.
Zellen
Der Kulturwirt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige eukaryontische Zelle sein, die das gewünschte Virus herstellen kann. Die Erfindung wird typischerweise eine Zelllinie verwenden, obwohl zum Beispiel primäre Zellen als Alternative verwendet werden können. Die Zelle wird typischerweise eine Säugetierzelle sein. Geeignete Säugetierzellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Hamster-, Rind-, Primaten- (inklusive Human- und Affen-) und Hundezellen. Verschiedene Zelltypen, wie Nierenzellen, Fibroblasten, Retinazellen, Lungenzellen, usw., können verwendet werden. Beispiele für geeignete Hamsterzellen sind die Zelllinien, welche BHK21 oder HKCC heißen. Geeignete Affenzellen sind z. B. Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze, wie z. B. Nierenzellen, wie in der Vero Zelllinie [13–15]. Geeignete Hundezellen sind z. B. Nierenzellen, wie in den CLDK- und MDCK-Zelllinien.
Weitere geeignete Zellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, CHO; 293T; BHK; MRC 5; PER.C6 [16]; FRhL2; WI-38; usw. Geeignete Zellen sind weithin erhältlich, z. B. von der American Type Cell Culture (ATCC) Sammlung [17], von den Coriell Cell Repositories [18] oder von der European Collection of Cell Cultures (ECACC). Die ATCC stellt zum Beispiel viele verschiedene Verozellen unter den Katalognummern CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 und CRL 1587 bereit, und sie stellt MDCK-Zellen unter der Katalognummer CCL 34 zur Verfügung. PER.C6 ist von der ECACC unter der Hinterlegungsnummer 96022940 verfügbar.
Bevorzugte Zellen zur Verwendung in der Erfindung sind MDCK-Zellen [19–21], die aus der Madin-Darby-Hundeniere gewonnen wurden. Die ursprünglichen MDCK-Zellen sind von der ATCC als CCL 34 erhältlich. Es ist bevorzugt, dass Ableitungen von MDCK-Zellen verwendet werden. Solche Ableitungen werden zum Beispiel in Referenz 19 beschrieben, die MDCK-Zellen offenbart, welche an das Wachstum in Suspensionskultur angepasst wurden ('MDCK 33016' oder '33016-PF', hinterlegt als DSM ACC 2219; siehe auch Ref. 20). Ferner offenbart Referenz 22 von MDCK abgeleitete Zellen, die in Suspension in serumfreier Kultur wachsen ('B-702', hinterlegt als FERM BP-7449). In einigen Ausführungsformen kann die verwendete MDCK Zelllinie tumorigen sein. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, nicht-tumorigene MDCK zu verwenden. Referenz 23 offenbart zum Beispiel nicht-tumorigene MDCK-Zellen, einschließlich 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) und 'MDCK-SF103' (ATCC PTA-6503). Referenz 25 offenbart MDCK-Zellen mit einer hohen Empfindlichkeit für eine Infektion, einschließlich 'MDCK.5F1'-Zellen (ATCC CRL 12042).
Es ist möglich, eine Mischung von mehr als einem Zelltyp zu verwenden, um die Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Es ist jedoch bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Verfahren mit einem einzelnen Zelltyp durchgeführt werden, z. B. mit monoklonalen Zellen. Vorzugsweise stammen die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zellen aus einer einzelnen Zelllinie. Ferner kann die gleiche Zelllinie zur Reassortierung des Virus und für jede beliebige anschließende Vermehrung des Virus verwendet werden.
Vorzugsweise werden die Zellen in der Abwesenheit von Serum kultiviert, um eine übliche Quelle von Kontaminanten zu vermeiden. Viele serumfreie Medien für die eukaryontische Zellkultur sind dem Fachmann bekannt (z. B. Iscove-Medium, Ultra CHO Medium (BioWhittaker), EX-CELL (JRH Biosciences)). Ferner können proteinfreie Medien verwendet werden (z. B. PF-CHO (JRH Biosciences)). Anderenfalls können die Zellen zur Replikation auch in den handelsüblichen Medien kultiviert werden, die Serum enthalten (z. B. MEM oder DMEM Medium mit 0,5% bis 10% fötalem Kälberserum).
Die Zellen können in einer adhärenten Kultur oder in Suspension vorliegen.
Herkömmliche Reassortierung
Traditionell werden Influenzaviren durch Co-Infektion eines Kulturwirts, üblicherweise Eiern, mit einem Donorstamm und einem Impfstoffstamm reassortiert. Reassortierte Viren werden durch Zugabe von Antikörpern mit einer Spezifität für die HA- und/oder die NA-Proteine des Donorstamms selektiert, um reassortierte Viren auszuwählen, die die HA- und/oder NA-Proteine des Impfstoffstamms enthalten. Durch mehrere Passagen mit dieser Behandlung kann man nach schnell wachsenden, reassortierten Viren selektieren, welche die HA- und/oder NA-Abschnitte des Impfstoffstamms enthalten.
Die Erfindung ist zur Verwendung in diesen Verfahren geeignet. Es kann leichter sein, Impfstoffstämme mit einem im Vergleich zu dem/den Donorstamm/Donorstämmen unterschiedlichen HA- und/oder NA-Subtyp zu verwenden, da dies die Selektion von reassortierten Viren ermöglicht. Es ist jedoch auch möglich, Impfstoffstämme mit demselben HA- und/oder NA-Subtyp wie dem Donorstamm/den Donorstämmen zu verwenden, und in einigen Aspekten der Erfindung ist dies bevorzugt. In diesem Fall sollten Antikörper mit einer bevorzugten Spezifität für die HA- und/oder NA-Proteine des Donorstamms/der Donorstämme zur Verfügung stehen.
Virusherstellung
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Influenzaviren bereit, das Schritte umfasst, bei denen man (a) einen Kulturwirt mit einem erfindungsgemäßen reassortierten Virus infiziert; (b) den Wirt aus Schritt (a) kultiviert, um das Virus herzustellen; und optional (c) das in Schritt (b) erhaltene Virus aufreinigt.
Bei dem Kulturwirt kann es sich um Zellen oder um embryonierte Hühnereier handeln. Werden in diesem Aspekt der Erfindung Zellen als Kulturwirt verwendet, so ist es bekannt, dass Zellkulturbedingungen (z. B. Temperatur, Zelldichte, pH-Wert, usw.) in Abhängigkeit von der Zelllinie und dem verwendeten Virus über einen weiten Bereich variabel sind und an die Anforderungen der Anwendung angepasst werden können. Die folgenden Informationen stellen daher lediglich Richtlinien dar.
Wenn der Impfstoff in Eiern produziert wird, werden die Eier mit einem Inokulum infiziert. Dieses kann hergestellt werden, indem man ein reassortiertes Virus der Erfindung mit Phosphatpuffer mischt, der 25 μg/mL Hydrocortison, und 0,5 mg/ml Gentamicinsulfat enthält. Das Virus-Inokulum kann bis zur Inokulation bei Raumtemperatur gelagert werden.
Vorinkubierte embryonierte Hühnereier (vorzugsweise 11 Tage alte Eier) werden jeweils mit dem Inokulum inokuliert (z. B. mit etwa 0,2 ml des Inokulums). Die Eier werden unter Verwendung einer Injektionsvorrichtung inokuliert. Dabei kann es sich um eine Spritze handeln, wobei es jedoch bevorzugt ist, einen automatischen Inokulationsapparat für Eier zu verwenden, da dieser eine Herstellung im großen Maßstab ermöglicht. Die Erfindung stellt eine Injektionsvorrichtung bereit (wie z. B. eine Spritze oder einen automatischen Inokulationsapparat für Eier), der ein reassortiertes Influenzavirus der Erfindung umfasst. Vorzugsweise werden die Eier vor der Inokulation einer Formaldehyddesinfektion unterzogen. Die reassortierten Influenzaviren der Erfindung wachsen gut in Eiern, und die Erfindung stellt eine Allantoisflüssigkeit bereit, die ein reassortiertes Influenzavirus der Erfindung umfasst, sowie auch ein Ei, das die Allantoisflüssigkeit umfasst.
Die inokulierten Eier können bei einer Temperatur von 33–35°C inokuliert werden. Vorzugsweise werden sie bei 34°C für etwa 72 Stunden inkubiert. Am Ende dieses Inkubationszeitraums werden die Eier visuell und auf das Vorhandensein eines lebenden Embryos mit altersgemäß adäquaten Blutgefäßen untersucht. Die Embryonen werden durch Abkühlen der Eier abgetötet, z. B. durch Lagerung der Eier für 12–46 Stunden bei 2–8°C.
Die Allantoisflüssigkeit der embryonierten Eier wird gesammelt, vorzugsweise unter Verwendung einer Erntemaschine für Eier. Die gesammelte Allantoisflüssigkeit (als ”ungereinigter monovalenter Gesamtvirus-Bulk” bezeichnet) wird bei einer Temperatur von 2–8°C gelagert, z. B. in einem thermoregulierten Behälter aus rostfreiem Stahl. Die geerntete Allantoisflüssigkeit kann durch kontinuierliche Zentrifugation bei moderater Geschwindigkeit geklärt werden. Dieser Schritt entfernt große Partikel, die möglicherweise bei der Ernte der Allantoisflüssigkeit gesammelt wurden (z. B. Teile der Eischalen).
Die Allantoisflüssigkeit wird anschließend einem Adsorptionsschritt unterzogen, der die Allantoisflüssigkeit weiter durch eine Präzipitation von Virusmaterial klärt, indem eine Adsorption an ein dibasisches Kalziumhydrogenphosphat-Gel erfolgt. Um das dibasische Kalziumhydrogenphosphat(CaHPO₄)-Gel zu erhalten werden 0,5 mol/L Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄) und 0,5 mol/L Kalziumchlorid (CaCl₂) zu dem geklärten Virus-Pool gegeben, wobei eine Endkonzentration von 1,87 g CaHPO₄ pro Liter erreicht wird. Die Erfindung stellt ein Präzipitat von Influenzaviren bereit, die an ein dibasisches Kalziumhydrogenphosphat-Gel adsorbiert sind, wobei das Influenzavirus mindestens zwei unterschiedliche PR8-X-Abschnitte umfasst.
Nach der Sedimentation für mindestens 8 Stunden bis zu einem Maximum von 36 Stunden wird der Überstand entfernt und das Sediment, welches die Influenzaviren enthält, wird durch Zugabe von 8,7% Dinatrium-EDTA-Lösung resolubilisiert. Das resuspendierte Influenzasediment wird durch eine 6 μm-Filtermembran filtriert, um potenziell verbliebene Pellets zu entfernen.
Das Influenzavirus wird weiter gereinigt (Entfernung von Proteinen und Phospholipiden) und durch isopyknische Ultrazentrifugation in einem linearen Saccharose-Gradienten (0–55%) bei einer Flussrate von 8–20 Litern pro Stunde aufkonzentriert. Der Gradient wird gebildet, indem eine Saccharoselösung 55% (w/w) mit 0,01% Thiomersal und ein Phosphatpuffer pH 7,4 mit 0,01% Thiomersal verwendet werden. Dies kann in Gegenwart von 100 ± 15 μg/ml Thiomersal erfolgen, um die Keimzahl im Verfahren zu kontrollieren, da die Zentrifugation bei Raumtemperatur durchgeführt wird.
Das Influenzavirus wird gespalten und durch Zentrifugation in einem linearen Saccharose-Gradienten (0–55%), der 1,5% Natriumdesoxycholat enthält, weiter aufgereinigt. Tween 80 ist in dem Gradienten in einer Menge von 0,1% vorhanden. Das Virus wird bei einer Rate von 8 Litern pro Stunde verarbeitet. Am Ende der Zentrifugation werden die Fraktionen gesammelt. Es wird eine Fraktion ausgewählt, die vornehmlich aus aufgeschlossenen Influenzavirus-Antigenen besteht, wobei verbleibende Gesamtviruspartikel und Phospholipide, die von der Virusmembran nach der Spaltung stammen, soweit wie möglich minimiert werden.
Die Fraktion wird dreifach in einem Phosphatpuffer verdünnt, der 0,025% Polysorbat 80 enthält. Anschließend wird sie schrittweise bis zu einer 0,45 μm-Filtermembran herunterfiltriert, kurz mit Ultraschall behandelt (um die Filtration zu ermöglichen), und durch eine 0,2 μm-Membran filtriert. Am Ende der Filtration werden die Filter mit Phosphatpuffer gespült, der 0,025% Tween 80 enthält. Die resultierende Lösung wird bei 22 ± 2°C für mindestens 84 Stunden inkubiert. Nach Abschluss des ersten Inaktivierungsschritts wird das Material mit Phosphatpuffer verdünnt, um den Gehalt an Gesamtprotein auf eine berechnete Konzentration von 500 μg/ml zu verringern.
Es wird Formaldehyd bis zu einer berechneten Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben. Die Inaktivierung erfolgt in einem Niedrigdichte-Polyethylen-Beutel von 100 L für die einmalige Verwendung bei 20 ± 2°C für mindestens 72 Stunden.
Die Erfindung stellt ein Zwischenprodukt bei der Influenza-Impfstoffherstellung (Bulk) bereit, das folgendes umfasst: (i) ein Detergenz, (ii) Split-Influenzaviren mit HA, NA und weiteren viralen Proteinen, und (iii) virale RNA von mindestens zwei verschiedenen PR8-X-Abschnitten. Der Bulk kann mit Formaldehyd inaktiviert worden sein.
Das inaktivierte Split-Virusmaterial wird durch Membranen mit einem Molekulargewichtsausschluss von 30.000 Dalton ultrafiltriert.
Nach einer Verringerung des Volumens bleibt das Volumen während der Ultrafiltration (Diafiltration) durch Zugabe von Phosphatpuffer und Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 0,01% Polysorbat 80 enthält, konstant.
Das Material wird auf 15–25 Liter konzentriert und umgehend in den finalen Filtrationsschritt eingesetzt.
Nach der Ultrafiltration wird das inaktivierte Split-Material schrittweise bis zu einer 0,2 μm-Membran herunterfiltriert.
Die abschließende Sterilfiltration durch eine 0,22 μm-Sterilmembran wird in einer Klasse 100-Umgebung durchgeführt. Am Ende der Filtration werden die Filter mit einer Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 0,01% Tween 80 enthält, gespült. Hierdurch wird das Filtrat auf eine Proteinkonzentration von weniger als 1000 μg/ml verdünnt, um die Aggregation während der nachfolgenden Lagerung zu vermeiden.
Die finalen monovalenten Bulk-Materialien der inaktivierten Split-Influenzaviren werden bei 2–8°C für maximal 18 Monate in Typ1-Glasflschen gelagert.
Wenn der Impfstoff in Zellkultur produziert wird, werden die Zellen vorzugsweise in serumfreien oder proteinfreien Medien kultiviert.
Die Vervielfältigung der Zellen kann in Übereinstimmung mit Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Zellen können zum Beispiel in einem Perfusionssystem kultiviert werden, wobei gewöhnliche unterstützende Verfahren, wie Zentrifugation oder Filtration, verwendet werden. Darüber hinaus können die Zellen erfindungsgemäß vor der Infektion in einem Fed-Batch-System vervielfältigt werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein Kultursystem als Fed-Batch-System bezeichnet, in dem die Zellen anfänglich in einem Batch-System kultiviert werden und die Abreicherung von Nährstoffen (oder von einem Teil der Nährstoffe) in dem Medium durch kontrollierte Zufütterung von konzentrierten Nährstoffen ausgeglichen wird. Es kann vorteilhaft sein, den pH-Wert des Mediums während der Vervielfältigung der Zellen vor der Infektion auf einen Wert zwischen pH 6,6 und pH 7,8 einzustellen, und insbesondere auf einen Wert zwischen pH 7,2 und 7,3. Die Kultivierung von Zellen geschieht vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 30 und 40°C. Während der Kultivierung der infizierten Zellen (Schritt ii) werden die Zellen vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 30°C und 36°C oder zwischen 32°C und 34°C oder bei 33°C kultiviert. Dies ist besonders bevorzugt, da gezeigt wurde, dass die Inkubation von infizierten Zellen in diesem Temperaturbereich in der Herstellung eines Virus resultiert, der zu einer verbesserten Wirksamkeit führt, wenn er zu einen Impfstoff formuliert wird [25].
Der Sauerstoffpartialdruck kann während der Kultivierung vor der Infektion vorzugsweise auf einen Wert zwischen 25% und 95%, und insbesondere auf einen Wert zwischen 35% und 60%, eingestellt werden. Die Werte für den Sauerstoffpartialdruck, die im Zusammenhang mit der Erfindung angegeben werden, basieren auf der Sättigung von Luft. Die Infektion von Zellen geschieht bei einer Zelldichte von vorzugsweise etwa 8–25 × 10⁵ Zellen/mL im Batch-System oder vorzugsweise etwa 5–20 × 10⁶ Zellen/mL im Perfusionssystem. Die Zellen können mit einer viralen Dosis (MOI Wert, ”multiplicity of infection”; entspricht der Anzahl viraler Einheiten pro Zelle zum Zeitpunkt der Infektion) zwischen 10^–8 und 10, vorzugsweise zwischen 0,0001 und 0,5, infiziert werden.
Virus kann auf Zellen in adhärenter Kultur oder in Suspension kultiviert werden. Mikrocarrier-Kulturen können verwendet werden. In einigen Ausführungsformen können die Zellen daher an das Wachstum in Suspension angepasst werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen auch das Abernten und die Isolierung von Viren oder den von ihnen erzeugten Proteinen. Während der Isolierung von Viren oder Proteinen werden die Zellen von dem Kulturmedium durch Standardverfahren wie Separation, Filtration oder Ultrafiltration getrennt. Die Viren oder Proteine werden dann durch Verfahren, die dem Fachmann ausreichend bekannt sind, wie Gradientenzentrifugation, Filtration, Präzipitation, Chromatographie, usw., konzentriert und anschließend aufgereinigt. Es ist ferner erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Viren während oder nach der Aufreinigung inaktiviert werden. Eine Virusinaktivierung kann zum Beispiel mit β-Propiolacton oder mit Formaldehyd an einem beliebigen Punkt innerhalb des Aufreinigungsprozesses erfolgen.
Der Kulturwirt können Eier sein. Das momentane Standardverfahren für das Anzüchten von Influenzaviren für Impfstoffe verwendet embryonierte SPF Hühnereier, wobei Virus aus dem Ei-Inhalt aufgereinigt wird (Allantois-Flüssigkeit). Es ist auch möglich, ein Virus durch Eier zu passagieren und anschließend in Zellkultur zu vervielfältigen, und umgekehrt.
Impfstoff
Die Erfindung verwendet Virus, das nach dem Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen hergestellt wurde.
Impfstoffe (insbesondere für Influenzavirus) basieren im Allgemeinen entweder auf lebendem Virus oder auf inaktiviertem Virus. Inaktivierte Impfstoffe können auf vollständigen Virionen, ”gespaltenen” Virionen (split virions) oder auf gereinigten Oberflächenantigenen basieren. Antigene können auch in Form von Virosomen präsentiert werden. Die Erfindung kann für die Herstellung von jedem dieser Impfstofftypen verwendet werden.
Wird ein inaktiviertes Virus verwendet, so kann der Impfstoff ein vollständiges Virion, ein gespaltenes Virion oder gereinigte Oberflächenantigene umfassen (bei Influenza, einschließlich Hämagglutinin und üblicherweise auch Neuramidase). Chemische Mittel zur Inaktivierung eines Virus umfassen die Behandlung mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren der folgenden Agenzien: Detergenzien, Formaldehyd, β-Propiolacton, Methylenblau, Psoralen, Carboxyfulleren (C60), binäres Ethylamin, Acetylethylenimin oder Kombinationen davon. Nicht-chemische Verfahren zur viralen Inaktivierung sind im Stand der Technik bekannt, wie zum Beispiel UV-Licht oder Gammabestrahlung.
Virionen können aus Virus-enthaltenen Flüssigkeiten, z. B. aus Allantois-Flüssigkeit oder aus Zellkulturüberstand, mittels diverser Verfahren geerntet werden. Ein Aufreinigungsverfahren kann eine zonale Zentrifugation mittels einer linearen Saccharosegradientenlösung, die ein Detergenz zum Aufschluss von Virionen enthält, umfassen. Die Antigene können dann, nach einer optionalen Verdünnung, durch Diafiltration aufgereinigt werden.
Gespaltene Virionen werden durch Behandlung von aufgereinigten Virionen mit Detergenzien (z. B. Ethylether, Polysorbat 80, Desoxycholat, Tri-N-butylphosphat, Triton X-100, Triton N101, Cetyltrimethylammoniumbromid, Tergitol NP9, usw.) zur Herstellung von Subvirion-Präparationen gewonnen, was auch das ”Tween-Ether” Spaltverfahren umfasst. Verfahren zur Spaltung von Influenzaviren sind zum Beispiel im Stand der Technik wohlbekannt, siehe z. B. Ref. 26–31, usw. Die Spaltung des Virus wird üblicherweise durchgeführt, indem man das vollständige Virus, sei es infektiös oder nicht-infektiös, mit einer den Aufschluss bewirkenden Konzentration eines Spaltmittels aufschließt oder fragmentiert. Der Aufschluss führt zu einem vollständigen oder teilweisen Lösen der Virusproteine, was die Integrität des Virus verändert. Bevorzugt Spaltmittel sind nicht-ionische und ionische (z. B. kationische) Tenside, z. B. Alkylglycoside, Alkylthioglycoside, Acylzucker, Sulphobetaine, Betaine, Polyoxyethylenalkylether, N,N-Dialkylglucamide, Hecameg, Alkylphenoxy-Polyethoxyethanole, NP9, quartäre Ammoniumverbindungen, Sarcosyl, CTABs (Cetyltrimethylammoniumbromide), Tri-N-butylphosphat, Cetavlon, Myristyltrimethylammoniumsalze, Lipofectin, Lipofectamin und DOT-MA, die Octyl- oder Nonylphenoxy-Polyoxyethanole (z. B. die Triton-Tenside, wie z. B. Triton X-100 oder Triton N101), Polyoxyethylen-Sorbitanester (die Tween-Tenside), Polyoxyethylenether, Polyoxyethlenester, usw. Ein nützliches Spaltverfahren verwendet die aufeinander folgenden Wirkungen von Natriumdesoxcholat und Formaldehyd, und die Spaltung kann während der anfänglichen Virionaufreinigung stattfinden (z. B. in einer Saccharosedichtegradientenlösung). Daher kann ein Spaltverfahren die Klärung des Virion-enthaltenen Materials (um nicht-Virionmaterial zu entfernen), das Aufkonzentrieren der geernteten Virionen (z. B. unter Verwendung eines Adsorptionsverfahrens, wie z. B. CaHPO₄-Adsorption), das Abtrennen von vollständigen Virionen von nicht-Virionmaterial, die Spaltung von Virionen unter Verwendung eines Spaltmittels in einem Dichtegradientenzentrifugationsschritt (z. B. unter Verwendung eines Saccharosegradienten, der ein Spaltmittel, wie Natriumdesoxycholat umfasst) und anschließende Filtration (z. B. Ultrafiltration) zur Entfernung von unerwünschten Materialien umfassen. Gespaltene Virionen können nützlicherweise in Natriumphosphat-gepufferter, isotonischer Natriumchloridlösung resuspendiert werden. Beispiele für gespaltene Influenzaimpfstoffe sind die Produkte BEGRIVAC^TM, FLUARIX^TM, FLUZONE^TM und FLUSHIELD^TM.
Impfstoffe mit aufgereinigten Influenzavirus-Oberflächenantigenen umfassen die Oberflächenantigene Hämagglutinin und üblicherweise auch Neuramidase. Verfahren zur Herstellung dieser Proteine in aufgereinigter Form sind im Stand der Technik wohlbekannt. Die Produkte FLUVIRIN^TM, AGRIPPAL^TM und INFLUVAC^TM sind Influenza-Untereinheit(subunit)-Impfstoffe.
Eine andere Form von inaktiviertem Antigen ist das Virosom [32] (Nukleinsäure-freie Virusähnliche liposomale Partikel). Virosomen können durch Lösen von Virus mit einem Detergenz hergestellt werden, gefolgt von der Entfernung des Nukleocapsids und Rekonstitution der Membran, welche die viralen Glykoproteine enthält. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Virosomen umfasst die Zugabe von viralen Membranglykoproteinen zu überschüssigen Mengen von Phospholipiden, wodurch Liposomen mit viralen Proteinen in ihrer Membran entstehen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch zur Herstellung von Lebendimpfstoffen verwendet werden. Solche Impfstoffe werden üblicherweise mittels Aufreinigung von Virionen aus Virion-enthaltenen Flüssigkeiten hergestellt. Die Flüssigkeiten können zum Beispiel durch Zentrifugation geklärt und mit einem Puffer (der z. B. Saccharose, Kaliumphosphat und Mononatriumglutamat enthält) stabilisiert werden. Verschiedene Formen von Influenzavirus-Impfstoffen sind momentan verfügbar (z. B. siehe Kapitel 17 & 18 von Referenz 33). Lebendvirusimpfstoffe umfassen das Produkt FLUMIST^TM von MedImmune (ein trivalenter Lebendvirusimpfstoff).
Das Virus kann abgeschwächt werden. Das Virus kann temperatursensitiv sein. Das Virus kann an die Kälte angepasst sein. Diese drei Merkmale sind besonders nützlich, wenn Lebendvirus als ein Antigen verwendet wird.
HA ist das Hauptimmunogen in den derzeitigen inaktivierten Influenzaimpfstoffen, und Impfstoffdosen werden durch Verweis auf die HA-Menge, üblicherweise durch SRID gemessen, standardisiert. Bestehende Impfstoffe umfassen üblicherweise etwa 15 μg HA pro Stamm, obwohl geringere Dosen z. B. für Kinder oder in pandemischen Situationen oder bei Verwendung eines Adjuvans verwendet werden können. Fraktionierte Dosen, wie z. B. ½ (d. h. 7,5 μg HA pro Stamm), ¼ und 1/8 sind verwendet worden, so wie auch höhere Dosen (z. B. 3× oder 9× Dosen [34, 35]). Impfstoffe können daher zwischen 0,1 und 150 μg HA pro Influenzastamm umfassen, vorzugsweise zwischen 0,1 und 50 μg, z. B. 0,1–20 μg, 0,1–15 μg, 0,1–10 μg, 0,1–7,5 μg, 0,5–5 μg, usw. Spezielle Dosen umfassen z. B. etwa 45, etwa 30, etwa 15, etwa 10, etwa 7,5, etwa 5, etwa 3,8, etwa 3,75, etwa 1,9, etwa 1,5, usw. pro Stamm.
Bei Lebendimpfstoffen wird die Dosierung statt mittels des HA-Gehalts anhand der mittlere infektiösen Dosis in Gewebekultur (TCID₅₀) gemessen, und ein TCID₅₀ von zwischen 10⁶ und 10⁸ (vorzugsweise von zwischen 10^6,5–10^7,5) ist üblich.
Influenzastämme, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden, können ein natürliches HA aufweisen, wie es in einem Wildtypvirus gefunden wird, oder ein modifiziertes HA. Es ist zum Beispiel bekannt HA, zu verändern, um Determinanten zu entfernen (z. B. hyperbasische Regionen um die HA1/HA2 Schnittstelle herum), die eine hohe Pathogenität des Virus in Vogelarten zur Folge haben. Die Verwendung von reverser Genetik ermöglicht solche Modifikationen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung eignen sich zur Immunisierung gegen inter-pandemische Stämme und sind darüber hinaus auch besonders nützlich für die Immunisierung gegen pandemische oder potentiell pandemische Stämme. Die Erfindung ist zur Impfung von Menschen sowie nicht-menschlichen Tieren geeignet.
Andere Stämme, deren Antigene nützlicherweise in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden können, sind Stämme, die gegen eine antivirale Therapie resistent sind (z. B. gegen Oseltamivir [36] und/oder Zanamivir resistent), einschließlich resistenter pandemischer Stämme [37].
Die Zusammensetzung kann ein monovalenter Impfstoff sein. Die Zusammensetzungen der Erfindung können alternativ dazu ein Antigen/Antigene von zwei oder von mehreren (z. B. 2, 3, 4 oder mehr) Influenzavirusstämmen umfassen, einschließlich Influenza A-Virus und/oder Influenza B-Virus, vorausgesetzt, dass mindestens ein Influenzastamm ein erfindungsgemäß reassortierter Influenzastamm ist. Zusammensetzungen, in denen mindestens zwei, mindestens drei oder alle Antigene von erfindungsgemäß reassortierten Influenzastammen stammen, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Beinhaltet ein Impfstoff mehr als einen Influenzastamm, so werden die unterschiedlichen Stämme üblicherweise separat angezüchtet und gemischt, nachdem die Viren geerntet und die Antigene hergestellt wurden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann daher den Schritt des Mischens von Antigenen von mehr als einem Influenzastamm umfassen. Ein trivalenter Impfstoff ist typisch, der Antigene von zwei Influenza A-Virusstämmen und einem Influenza B-Virusstamm umfasst. Ein tetravalenter Impfstoff ist ebenfalls nützlich [38], der Antigene von zwei Influenza A-Virusstämmen und von zwei Influenza B-Virusstämmen, oder von drei Influenza A-Virusstämmen und von einem Influenza B-Virusstamm umfasst.
Ein Influenza-Impfstoff kann alle Antigene von saisonalen Influenzastämmen umfassen. Er kann darüber hinaus Antigene von saisonalen und pandemischen Influenzastämmen umfassen. Der Impfstoff kann z. B. ein tetravalenter Impfstoff sein, der Antigene von drei saisonalen Influenzastämmen (z. B. zwei A-Stämme und ein B-Stamm) und einem pandemischen Influenzastamm umfasst. Ein trivalenter Influenzaimpfstoff kann auch mit einem monovalenten pandemischen Influenzaimpfstoff verwendet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Impfstoffzusammensetzungen, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, sind pharmazeutisch verträglich. Sie umfassen üblicherweise zusätzlich zu den Antigenen weitere Komponenten, z. B. umfassen sie üblicherweise einen oder mehrere pharmazeutische Träger und/oder Hilfsstoffe. Wie unten beschrieben, können Adjuvantien ebenfalls eingebracht werden. Eine gründliche Diskussion solcher Komponenten ist in Referenz 39 verfügbar.
Impfstoffzusammensetzungen werden im Allgemeinen in wässriger Form vorliegen. Dennoch können einige Impfstoffe in einer trockenen Form vorliegen, z. B. in Form von injizierbaren Feststoffen oder in Form von getrockneten oder polymerisierten Präparationen auf einem Pflaster.
Impfstoffzusammensetzungen können Konservierungsmittel, wie Thiomersal oder 2-Phenoxyethanol umfassen. Es ist jedoch bevorzugt, dass der Impfstoff im Wesentlichen frei (d. h. weniger als 5 μg/ml) von quecksilberhaltigem Material ist, z. B. frei von Thiomersal [30, 40]. Impfstoffe, die kein Quecksilber enthalten, sind stärker bevorzugt. Als Alternative zu quecksilberhaltigen Verbindungen kann ein α-Tocopherolsuccinat eingebracht werden [30]. Konservierungsmittelfreie Impfstoffe sind besonders bevorzugt.
Um die Tonizität zu kontrollieren, ist es bevorzugt, ein physiologisches Salz einzuschließen, wie z. B. ein Natriumsalz. Natriumchlorid (NaCl) ist bevorzugt, wobei dieses zwischen 1 und 20 mg/ml vorliegen kann. Andere Salze, die vorhanden sein können, umfassen Kaliumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat, Dinatriumphosphatdihydrat, Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, usw.
Impfstoffzusammensetzungen werden üblicherweise eine Osmolalität zwischen 200 mOsm/kg und 400 mOsm/kg, vorzugsweise zwischen 240–360 mOsm/kg, aufweisen und werden stärker bevorzugt in den Bereich von 290–310 mOsm/kg fallen. Es wurde in der Vergangenheit berichtet, dass die Osmolalität keinen Einfluss auf den durch die Impfung verursachten Schmerz hat [41]; jedoch ist es dennoch bevorzugt, die Osmolalität in diesem Bereich zu halten.
Impfstoffzusammensetzungen können einen oder mehrere Puffer umfassen. Typische Puffer umfassen: einen Phosphatpuffer, einen Tris-Puffer, einen Borat-Puffer, einen Succinat-Puffer, einen Histidin-Puffer (insbesondere mit einem Aluminiumhydroxidadjuvans) oder einen Citrat-Puffer. Puffer werden üblicherweise im Bereich von 5–20 mM mit eingeschlossen.
Der pH einer Impfstoffzusammensetzung wird üblicherweise zwischen 5.0 und 8.1 liegen, wobei zwischen 6,0 und 8,0, z. B. 6,5 und 7,5 oder zwischen 7,0 und 7,8 noch üblicher ist. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann daher einen Schritt umfassen, bei dem man den pH des Bulk-Impfstoffs vor dem Verpacken anpasst.
Die Impfstoffzusammensetzung ist vorzugsweise steril. Die Impfstoffzusammensetzung ist vorzugsweise nicht pyrogen, z. B. enthält diese < 1 EU (Endotoxin-Einheit, ein Standardmaß) pro Dosis, und vorzugsweise < 0,1 EU pro Dosis. Die Impfstoffzusammensetzung ist vorzugsweise glutenfrei.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen können Detergenz umfassen, z. B. ein Polyoxyethylensorbitanestertensid (bekannt als 'Tweens'), ein Octoxynol (wie Octoxynol-9 (Triton X-100) oder t-Octylphenoxypolyethoxyethanol), ein Cetyltrimethylammoniumbromid ('CTAB') oder Natriumdesoxycholat, insbesondere bei einem Spaltimpfstoff oder einem Oberflächenantigen-Impfstoff. Das Detergenz kann nur in Spuren vorhanden sein. Daher kann der Impfstoff jeweils weniger als 1 mg/ml Octoxynol-10 und Polysorbat 80 umfassen. Bei anderen Restkomponenten, die in Spuren vorhanden sind, kann es sich um Antibiotika handeln (z. B. Neomycin, Kanamycin, Polymyxin B).
Eine Impfstoffzusammensetzung kann Material für eine einzelne Immunisierung umfassen oder Material für mehrere Immunisierungen (d. h. ein 'Multidosis'-Kit). Die Aufnahme eines Konservierungsmittels ist in Multidosis-Zusammenstellungen bevorzugt. Als Alternative (oder zusätzlich) zur Aufnahme eines Konservierungsmittels in Multidosis-Zusammensetzungen, können die Zusammensetzungen in einem Behältnis enthalten sein, das über einen aseptischen Adapter für die Entfernung von Material verfügt.
Influenzaimpfstoffe werden üblicherweise in einem Dosierungsvolumen von etwa 0,5 ml verabreicht, obwohl eine halbe Dosis (d. h. etwa 0,25 ml) an Kinder verabreicht werden kann.
Zusammensetzungen und Kits werden vorzugsweise zwischen 2°C und 8°C gelagert. Sie sollten nicht eingefroren werden. Sie sollten idealerweise von direktem Licht ferngehalten werden.
DNA der Wirtszelle
Wurde das Virus isoliert und/oder in einer Zelllinie angezüchtet, so ist es die übliche Verfahrensweise, die Menge an verbleibender DNA der Zelllinie im Impfstoff zu minimieren, um jegliche potentielle onkogene Aktivität der DNA zu minimieren.
Daher enthält eine erfindungsgemäß hergestellte Impfstoffzusammensetzung vorzugsweise weniger als 10 ng (vorzugsweise weniger als 1 ng, und stärker bevorzugt weniger als 100 pg) an Rest-DNA aus der Wirtszelle pro Dosis, obwohl Spuren von Wirtszell-DNA vorhanden sein können.
Es ist bevorzugt, dass die durchschnittliche Länge von jeglicher Rest-DNA aus der Wirtszelle weniger als 500 bp beträgt, z. B. weniger als 400 bp, weniger als 300 bp, weniger als 200 bp, weniger als 100 bp, usw.
Kontaminierende DNA kann während der Impfstoffherstellung mittels üblicher Aufreinigungsverfahren entfernt werden, z. B. mittels Chromatographie, usw. Die Entfernung von Rest-DNA aus der Wirtszelle kann durch Nukleasebehandlung, z. B. durch Verwendung einer DNase, verstärkt werden. Ein bequemes Verfahren zur Verringerung von Kontamination mit Wirtszell-DNA ist in den Referenzen 42 & 43 offenbart, und umfasst eine zweistufige Behandlung, bei der zuerst eine DNase (z. B. eine Benzonase) verwendet wird, die während des viralen Wachstums angewendet werden kann, und dann ein kationisches Detergenz (z. B. CTAB) benutzt, das während des Aufschlusses des Virions angewendet werden kann. Die Behandlung mit einem alkylierendem Mittel, wie β-Propiolacton, kann ebenfalls verwendet werden, um Wirtszell-DNA zu entfernen, und es kann vorteilhafterweise auch zur Inaktivierung von Virionen verwendet werden [44].
Adjuvantien
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können vorteilhafterweise ein Adjuvans umfassen, das so wirken kann, dass die Immunantworten (humorale und/oder zelluläre), welche in einem Individuum ausgelöst werden, das die Zusammensetzung erhält, verstärkt werden. Bevorzugte Adjuvantien umfassen Öl-in-Wasser-Emulsionen. Viele solche Adjuvantien sind bekannt, und sie umfassen üblicherweise mindestens ein Öl und mindestens ein Tensid, wobei das/die Öl(e) und Tensid(e) biodegradierbar (metabolisierbar) und biokompatibel sind. Die Öltropfen in der Emulsion haben im Allgemeinen einen Durchmesser von weniger als 5 μm, und idealerweise weisen sie einen Durchmesser im Submikronbereich auf, wobei diese kleinen Größen mit einem Mikrofluidisator erreicht werden können, um stabile Emulsionen bereitzustellen. Tröpfchen mit einer Größe von weniger als 220 nm sind bevorzugt, da sie einer Filtersterilisation unterzogen werden können.
Die Emulsion kann Öle umfassen, wie die von einer tierischen (wie Fisch) oder pflanzlichen Quelle. Quellen für pflanzliche Öle umfassen Nüsse, Samen und Getreide. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Kokusnussöl und Olivenöl, die Verbreitesten, sind Beispiele für Nussöle. Es kann Jojobaöl, z. B. solches, das aus der Jojobabohne gewonnen wird, verwendet werden. Öle aus Samen umfassen Distelöl, Baumwollsamenöl, Sonnenblumensamenöl und ähnliche. Innerhalb der Getreidegruppe ist Maisöl dasjenige, das am Leichtesten verfügbar ist, wobei aber das Öl von anderen Getreidekörnern, wie Weizen, Hafer, Roggen, Reis, Teff, Triticale und ähnlichen, ebenfalls verwendet werden können. Auch wenn Fettsäureester von Glycerol und 1,2-Propandiol mit 6–10 Kohlenstoffen natürlicherweise nicht in Saatölen vorkommen, können diese durch Hydrolyse, Trennung und Veresterung der geeigneten Materialien ausgehend von den Nuss- und Samenölen hergestellt werden. Fette und Öle aus Milch von Säugetieren sind metabolisierbar und können daher bei der Durchführung dieser Erfindung verwendet werden. Die Verfahren zur Trennung, Aufreinigung, Verseifung und andere Mittel, die notwendig sind, um reine Öle aus tierischen Quellen zu gewinnen, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Der meiste Fisch enthält metabolisierbare Öle, die ohne Weiteres gewonnen werden können. Zum Beispiel stellen Kabeljau-Leberöl, Haileberöle und Walöl, wie Walrat, Beispiele für einige der Fischöle dar, die vorliegend verwendet werden können. Mehrere Öle mit verzweigten Ketten werden biochemisch in 5-Carbon-Isopren-Einheiten synthetisiert und werden üblicherweise als Terpenoide bezeichnet. Haileberöl umfasst ein verzweigtes, ungesättigtes Terpenoid, das als Squalen (2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaen) bekannt ist, und welches vorliegend besonders bevorzugt ist. Squalan, das gesättigte Analog von Squalen, ist ebenfalls ein bevorzugtes Öl. Fischöle, einschließlich Squalen und Squalan, stehen ohne Weiteres aus kommerziellen Quellen zur Verfügung oder können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gewonnen werden. Ein weiteres bevorzugtes Öl ist α-Tocopherol (siehe unten).
Mischungen von Ölen können verwendet werden.
Tenside können anhand ihrer 'HLB' (hydrophile/lipophile Balance) klassifiziert werden. Bevorzugte erfindungsgemäße Tenside weisen einen HLB-Wert von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15 und mehr, und vorzugsweise von mindestens 16, auf. Die Erfindung kann mit Tensiden verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: die Polyoxyethylensorbitanestertenside (üblicherweise als Tweens bezeichnet), insbesondere Polysorbat 20 und Polysorbat 80; Copolymere von Ethylenoxid (EO), Propylenoxid (PO) und/oder Butylenoxid (BO), die unter dem Markennamen DOWFAX^TM verkauft wird, wie lineare EO/PO Block-Copolymere; Octoxynole, das in der Anzahl der sich wiederholenden Ethoxy(oxy-1,2-ethanediyl)-Gruppen schwanken kann, wobei Octoxynol-9 (Triton X-100 oder t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) von besonderem Interesse ist; (Octylphenoxy)-Polyethoxyethanol (IGEPAL CA-630/NP-40); Phospholipide, wie Phosphatidylcholin (Lecithin); Nonylphenolethoxylate, wie die Tergitol^TM NP Serie; Polyoxyethylenfettsäureether, die abgeleitet sind von Lauryl-, Cetyl-, Stearyl- und Oleyl-Alkoholen (als Brij-Tenside bekannt), wie z. B. Triethylenglycolmonolaurylether (Brij 30); und Sorbitanester (üblicherweise bekannt als die SPANs), wie Sorbitantrioleat (Span 85) und Sorbitanmonolaurat. Nicht-ionische Tenside sind bevorzugt. Bevorzugte Tenside zum Einbringen in die Emulsion sind Tween 80 (Polyoxyethylensorbitanmonooleate), Span 85 (Sorbitantrioleat), Lecithin und Triton X-100.
Mischungen von Tensiden können verwendet werden, z. B. Tween 80/Span 85-Mischungen. Eine Kombination aus einem Polyoxyethylensorbitanester, wie Polyoxyethylensorbitanmonooleate (Tween 80), und einem Octoxynol, wie t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), ist ebenfalls geeignet. Eine weitere nützliche Kombination umfasst Laureth 9 und einen Polyoxyethylensorbitanester und/oder ein Octoxynol.
Bevorzugte Mengen von Tensiden (Gewichts-%) sind: Polyoxyethylensorbitanester (wie Tween 80) 0,01 bis 1%, insbesondere etwa 0,1%; Octyl- oder Nonylphenoxypolyoxyethanole (wie Triton X-100 oder andere Detergenzien in der Triton-Serie) 0,001 to 0,1%, insbesondere 0,005 bis 0,02%; Polyoxyethylenether (wie Laureth 9) 0,1 bis 20%, vorzugsweise 0,1 bis 10% und insbesondere 0,1 bis 1% oder etwa 0,5%.
Umfasst der Impfstoff ein gespaltenes Virus, so ist es bevorzugt, dass dieser freie Tenside in der wässrigen Phase umfasst. Dies ist vorteilhaft, da das freie Tensid eine 'spaltende Wirkung' auf das Antigen ausüben kann, wodurch sämtliche ungespaltenen Virionen und/oder Virionaggregate, die anderenfalls vorhanden sein könnten, aufgeschlossen werden. Dies kann die Sicherheit von Splitvirusimpfstoffen verbessern [45].
Bevorzugte Emulsionen haben eine durchschnittliche Tröpfchengröße von < 1 μm z. B. ≤ 750 nm, ≤ 500 nm, ≤ 400 nm, ≤ 300 nm, ≤ 250 nm, ≤ 220 nm, ≤ 200 nm, oder kleiner. Diese Tröpfchengröße kann bequem durch Methoden, wie z. B. Mikrofluidisierung, erreicht werden.
Spezifische Öl-in-Wasser-Emulsionsadjuvantien, die im Zusammenhang mit der Erfindung nützlich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:

• Eine Submikronemulsion aus Squalen, Tween 80 und Span 85. Die Volumen-Zusammensetzung der Emulsion kann etwa 5% Squalen, etwa 0,5% Polysorbat 80 und etwa 0,5% Span 85 aufweisen. In Bezug auf das Gewicht werden diese Verhältnisse zu 4,3% Squalen, 0,5% Polysorbat 80 und 0,48% Span 85. Dieses Adjuvans ist als 'MF59' [46–48] bekannt, wie genauer in Kapitel 10 von Ref. 49 und Kapitel 12 von Ref. 50 beschrieben. Die MF59-Emulsion umfasst vorteilhafterweise Citrat-Ionen, z. B. 10 mM Natriumcitratpuffer.
• Eine Emulsion, die Squalen, ein Tocopherol und Polysorbat 80 umfasst. Die Emulsion kann eine Phosphat-gepufferte Salzlösung umfassen. Diese Emulsionen können von 2 bis 10% des Volumens Squalen, von 2 bis 10% Tocopherol und von 0,3 bis 3% Polysorbat 80 aufweisen, und das Gewichtsverhältnis von Squalen:Tocopherol ist vorzugsweise < 1 (z. B. 0,90), da dies eine stabilere Emulsion bereitstellt. Squalen und Polysorbat 80 können in einem Volumenverhältnis von etwa 5:2 oder in einem Gewichtsverhältnis von etwa 11:5 vorhanden sein. Daher können die drei Komponenten (Squalen, Tocopherol, Polysorbat 80) in einem Gewichtsverhältnis von 1068:1186:485 oder etwa 55:61:25 vorhanden sein. Eine solche Emulsion ('AS03') kann hergestellt werden, indem man Tween 80 in PBS löst, um eine 2%ige Lösung erhalten wird, anschließend 90 ml dieser Lösung mit einer Mischung aus (5 g DL α-Tocopherol und 5 ml Squalen) mischt, und die Mischung dann mikrofluidisiert. Die resultierende Emulsion kann Submikron-Öltröpfchen aufweisen, z. B. solche mit einem durchschnittlichen Durchmesser von zwischen 100 und 250 nm, vorzugsweise etwa 180 nm. Die Emulsion kann auch ein 3-de-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3d MPL) umfassen. Eine andere nützliche Emulsion dieses Typs kann pro menschlicher Dosis, 0,5–10 mg Squalen, 0,5–11 mg Tocopherol, und 0,1–4 mg Polysorbate 80 [51] umfassen, z. B. in den oben diskutierten Verhältnissen.
• Eine Emulsion aus Squalen, einem Tocopherol und einem Tritondetergenz (z. B. Triton X-100). Die Emulsion kann ferner ein 3d-MPL umfassen (siehe unten). Die Emulsion kann einen Phosphatpuffer enthalten.
• Eine Emulsion, die ein Polysorbat (z. B. Polysorbat 80), ein Tritondetergenz (z. B. Triton X-100) und ein Tocopherol (z. B. ein α-Tocopherolsuccinate) umfasst. Die Emulsion kann diese drei Komponenten in einem Massenverhältnis von etwa 75:11:10 (z. B. 750 μg/ml Polysorbat 80, 110 μg/ml Triton X-100 und 100 μg/ml α-Tocopherolsuccinat) umfassen, und diese Konzentrationen sollten jeglichen Beitrag dieser Komponenten von Antigenen umfassen. Die Emulsion kann auch Squalen umfassen. Die Emulsion kann auch ein 3d-MPL umfassen (siehe unten). Die wässrige Phase kann einen Phosphatpuffer enthalten.
• Eine Emulsion von Squalen, Polysorbat 80 und Poloxamer 401 (”Pluronic^TM L121”). Die Emulsion kann in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4, formuliert sein. Diese Emulsion ist ein nützliches Trägermittel für Muramyl-Dipeptide und wurde mit Threonyl-MDP in dem ”SAF-1”-Adjuvans [52] (0,05–1% Thr-MDP, 5% Squalan, 2,5% Pluronic L121 und 0,2% Polysorbat 80) verwendet. Es kann auch ohne das Thr-MDP verwendet werden, wie im ”AF”-Adjuvans [53] (5% Squalan, 1,25% Pluronic L121 und 0,2% Polysorbat 80). Mikrofluidisierung ist bevorzugt.
• Eine Emulsion, die Squalen, ein wässriges Lösungsmittel, ein hydrophiles nicht-ionisches Polyoxyethylenalkylether-Tensid (z. B. Polyoxyethylen (12) – Cetostearylether) und ein hydrophobes nicht-ionisches Tensid (z. B. ein Sorbitanester oder ein Mannidester, wie Sorbitanmonoleat oder 'Span 80') umfasst. Die Emulsion ist vorzugsweise thermoreversibel und/oder weist mindestens 90 Volumen-% der Öltröpfchen in einer Größe von weniger als 200 nm auf [54]. Die Emulsion kann ferner einen oder mehrere der folgenden Substanzen umfassen: Alditol; ein cryoprotektives Mittel (z. B. einen Zucker, wie Dodecylmaltosid und/oder Saccharose); und/oder ein Alkylpolyglykosid. Die Emulsion kann einen TLR4 Agonisten umfassen [55]. Solche Emulsionen können lyophilisiert werden.
• Eine Emulsion von Squalen, Poloxamer 105 und Abil-Care [56]. Die Endkonzentration (Gewicht) dieser Komponenten Impfstoffen mit Adjuvans sind 5% Squalen, 4% Poloxamer 105 (Pluronic-Polyol) und 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 Dimethicon; Capryl-/Caprin-Triglycerid).
• Eine Emulsion, die 0,5–50% eines Öls, 0,1–10% eines Phospholipids und 0,05–5% eines nichtionischen Tensids aufweist. Wie in Referenz 57 beschrieben wird, sind bevorzugte Phospholipidkomponenten Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Phosphatidsäuren, Sphingomyelin und Cardiolipin. Submikron-Tröpfchengrößen sind vorteilhaft.
• Eine Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsion aus einem nicht-metabolisierbaren Öls (wie leichtes Mineralöl) und mindestens einem Tensid (wie Lecithin, Tween 80 oder Span 80). Zusätze können eingebracht werden, wie z. B. QuilA-Saponin, Cholesterol, ein Saponin-lipophiles Konjugat (wie GPI-100, das in Referenz 58 beschrieben wird, hergestellt durch Zugabe von aliphatischen Aminen zu Desacylsaponin über die Carboxylgruppe von Glucuronsäure), Dimethyldioctadecylammoniumbromid und/oder N,N-Dioctadecyl-N,N-bis (2-hydroxyethyl) propandiamin.
• Eine Emulsion, in der ein Saponin (z. B. QuilA oder QS21) und ein Sterol (z. B. ein Cholesterol) als helikale Mizellen verbunden sind [59].
• Eine Emulsion, die ein Mineralöl, einen nicht-ionischen lipophilen ethoxylierten Fettalkohol und ein nicht-ionisches hydrophiles Tensid (z. B. einen ethoxylierten Fettalkohol und/oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer) umfasst [60].
• Eine Emulsion, die ein Mineralöl, einen nicht-ionischen hydrophilen ethoxylierten Fettalkohol und ein nicht-ionisches lipophiles Tensid (z. B. einen ethoxylierten Fettalkohol und/oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer) umfasst [60].

In einigen Ausführungsformen kann eine Emulsion unmittelbar zum Zeitpunkt der Verabreichung mit Antigen gemischt werden, und daher können das Adjuvans und Antigen getrennt in einem abgepackten oder vertriebenen Impfstoff gehalten werden, wobei sie fertig für die finale Formulierung zum Zeitpunkt der Verwendung sind. In anderen Ausführungsformen wird eine Emulsion mit Antigen während der Herstellung gemischt, und die Zusammensetzung wird daher in einer flüssigen Form, die Adjuvans enthält, verpackt. Das Antigen wird üblicherweise in flüssiger Form vorliegen, so dass der Impfstoff letztendlich durch Mischen zweier Flüssigkeiten hergestellt wird. Das Volumenverhältnis der beiden Flüssigkeiten für das Mischen kann schwanken (z. B. zwischen 5:1 und 1:5), beträgt jedoch üblicherweise etwa 1:1. Werden in den obigen Beschreibungen von spezifischen Emulsionen Konzentrationen der Komponenten genannt, so sind diese Konzentrationen typisch für eine unverdünnte Zusammensetzung, und die Konzentration nach der Mischung mit einer Antigenlösung wird daher abnehmen.
Verpackung der Impfstoffzusammensetzungen
Geeignete Behältnisse für erfindungsgemäße Zusammensetzungen (oder Kitbestandteile) umfassen Fläschchen, Spritzen (z. B. Wegwerfspritzen), Nasensprays, usw. Diese Behältnisse sollten steril sein.
Liegt eine Zusammensetzung/Komponente in einem Fläschchen vor, so ist das Fläschchen vorzugsweise aus Glas- oder Plastikmaterial hergestellt. Das Fläschchen wird vorzugsweise sterilisiert, bevor die Zusammensetzung in dieses eingebracht wird. Um Probleme mit Latex-sensitiven Patienten zu vermeiden, sind die Fläschchen vorzugsweise mit einem Latex-freien Stöpsel versiegelt, und die Abwesenheit von Latex in sämtlichem Verpackungsmaterial ist bevorzugt. Das Fläschchen kann eine einzelne Dosis an Impfstoff umfassen oder es kann mehr als eine Dosis umfassen (ein 'Multidosis'-Fläschchen), z. B. 10 Dosen. Bevorzugte Fläschchen sind aus farblosem Glas hergestellt.
Ein Fläschchen kann einen Deckel (z. B. ein Luer-Lock) aufweisen, der so angepasst ist, dass eine vorgefüllte Spritze in den Deckel eingeführt werden kann, der Inhalt der Spritze kann in das Fläschchen ausgestoßen werden (z. B. um das lyophilisierte Material darin aufzunehmen), und der Inhalt des Fläschchens kann zurück in die Spritze gezogen werden. Nach Entfernung der Spritze von dem Fläschchen kann eine Nadel angebracht werden, und die Zusammensetzung kann an einen Patienten verabreicht werden. Der Deckel ist vorzugsweise innerhalb eines Siegels oder einer Abdeckung angeordnet, so dass das Siegel oder die Abdeckung entfernt werden muss, bevor der Deckel erreicht werden kann. Ein Fläschchen kann einen Deckel haben, der die aseptische Entnahme seines Inhalts erlaubt, insbesondere für Multidosis-Fläschchen.
Ist eine Komponente in einer Spritze verpackt, so kann die Spritze eine an ihr angebrachte Nadel aufweisen. Wenn keine Nadel angebracht ist, kann mit der Spritze eine separate Nadel zum Zusammenbau und zur Verwendung geliefert werden. Eine solche Nadel kann umhüllt sein. Sicherheitsnadeln sind bevorzugt. 1-Inch 23-Gauge-, 1-Inch 25-Gauge- und 5/8-Inch 25-Gauge-Nadeln sind üblich. Spritzen können mit abziehbaren Etiketten bereitgestellt werden, auf denen die Chargennummer, die Influenzasaison und das Verfallsdatum der Inhaltsstoffe aufgedruckt sein können, um das Erstellen von Aufzeichnungen zu ermöglichen. Der Kolben in der Spritze weist vorzugsweise einen Stopper auf, um den Kolben davon abzuhalten, unabsichtlich während des Aufziehens entfernt zu werden. Die Spritzen können einen Latexgummideckel und/oder -kolben haben. Wegwerfspritzen enthalten eine einzelne Impfstoffdosis. Die Spritze wird üblicherweise eine Kappe für die Spitze haben, um die Spitze vor der Befestigung einer Nadel zu versiegeln, und die Kappe für die Spitze ist vorzugsweise aus einem Butylgummi hergestellt. Sind die Spritze und die Nadel getrennt verpackt, so ist die Nadel vorzugsweise mit einer Butylgummiabschirmung ausgestattet. Bevorzugte Spritzen sind diejenigen, die unter dem Markennamen ”Tip-Lok”^TM vermarktet werden.
Die Behältnisse können markiert sein, um das Volumen einer halben Dosis anzuzeigen, z. B. um die Verabreichung an Kinder zu ermöglichen. Zum Beispiel kann eine Spritze, die eine 0,5 ml Dosis enthält, eine Markierung aufweisen, die ein Volumen von 0,25 anzeigt.
Wird ein Glasbehältnis (z. B. eine Spritze oder ein Fläschchen) verwendet, so ist es bevorzugt, ein Behältnis zu verwenden, das aus einem Borsilikatglas hergestellt ist, und nicht aus einem Kalknatronglas.
Ein Kit oder eine Zusammensetzung kann mit einem Handzettel verpackt sein (z. B. in derselben Box), wobei dieser Details zum Impfstoff enthält, z. B. Anweisungen zur Verabreichung, Details zu den Antigenen in dem Impfstoff, usw. Die Anweisungen können auch Warnungen enthalten, z. B. dass eine Adrenalinlösung verfügbar zu halten ist, falls es in der Folge einer Impfung zu einer anaphylaktischen Reaktion kommt, usw.
Behandlungsverfahren und Verabreichung des Impfstoffs
Die Erfindung stellt einen erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff bereit. Diese Impfstoffzusammensetzungen sind für die Verabreichung an menschliche oder nicht-menschliche, tierische Individuen, wie Schweine oder Vögel, geeignet, und die Erfindung stellt ein Verfahren zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum bereit, bei dem man eine erfindungsgemäße Zusammensetzung an das Individuum verabreicht. Die Erfindung stellt ebenfalls eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Verwendung als Medikament bereit, und sie stellt die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum bereit.
Die durch diese Verfahren und Verwendungen ausgelöste Immunantwort wird üblicherweise eine Antikörperantwort, vorzugsweise eine protektive Antikörperantwort, umfassen. Verfahren zur Bestimmung von Antikörperantworten, der Fähigkeit zur Neutralisierung und der Schutzwirkung nach einer Influenzavirusimpfung sind im Stand der Technik wohlbekannt. Studien bei Menschen haben gezeigt, dass Antikörpertiter gegen Hämagglutinin von humanem Influenzavirus mit der Schutzwirkung korrelieren (ein Hämagglutinin-Inhibitionstiter einer Serumprobe von etwa 30–40 führt zu etwa 50% Schutzwirkung vor Infektion durch ein homologes Virus) [61]. Antikörperantworten werden üblicherweise durch Hämagglutinin-Inhibition, durch Mikroneutralisation, durch Einzelradialimmundiffusion (SRID) und/oder durch Einzelradialhämolyse (SRH) gemessen. Diese Assayverfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Die am stärksten bevorzugte Immunisierungsroute ist die durch intramuskuläre Injektion (z. B. in den Arm oder in das Bein), wobei jedoch andere verfügbare Wege subkutane Injektion, intranasale [62–64], orale [65], intradermale [66,67], transkutane, transdermale [68] Verabreichung, usw., umfassen.
Impfstoffe, die erfindungsgemäß hergestellt wurden, können verwendet werden, um sowohl Kinder als auch Erwachsene zu behandeln. Influenzaimpfstoffe werden momentan zur Verwendung bei der Immunisierung von Kinder und Erwachsenen empfohlen. Ein humanes Individuum kann daher weniger als 1 Jahr alt, 1–5 Jahre alt, 5–15 Jahre alt, 15–55 Jahre alt oder mindestens 55 Jahre alt sein. Bevorzugte Individuen für den Erhalt der Impfstoffe sind die älteren Menschen (z. B. ≥ 50 Jahre alt, ≥ 60 Jahre alt, und vorzugsweise ≥ 65 Jahre), die jungen Menschen (z. B. ≤ 5 Jahre alt), Individuen im Krankenhaus, Arbeiter im Gesundheitssystem, Armeekräfte und militärisches Personal, schwangere Frauen, chronisch Kranke, immundefiziente Individuen, Individuen, die eine antivirale Verbindung (z. B. eine Oseltamivir- oder Zanamivir-Verbindungen; siehe unten) in den 7 Tagen vor Empfang des Impfstoffes zu sich genommen haben und Menschen, die ins Ausland reisen. Die Impfstoffe sind jedoch nicht nur für diese Gruppen geeignet, und sie können in allgemeinerer Form in der Bevölkerung verwendet werden. Bei pandemischen Stämmen ist die Verabreichung an alle Altersgruppen bevorzugt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzungen genügen 1, 2 oder 3 der CPMP-Kriterien für die Wirksamkeit. In Erwachsenen (18–60 Jahre) sind diese Kriterien: (1) ≥ 70% Seroprotektion; (2) ≥ 40% Serokonversion; und/oder (3) ein GMT-Anstieg ≥ 2.5-fach. In Älteren (> 60 Jahre), sind diese Kriterien: (1) ≥ 60% Seroprotektion; (2) ≥ 30% Serokonversion; und/oder (3) ein GMT-Anstieg von ≥ 2-fach. Diese Kriterien basieren auf Open-Label-Studien mit mindestens 50 Patienten.
Die Behandlung kann ein Einzeldosis-Schema oder ein Mehr-Dosen-Schema sein. Mehrere Dosen können in einem Schema für die primäre Immunisierung und/oder in einem Schema für eine Auffrischungsimpfung (booster) verwendet werden. In einem Mehr-Dosen-Programm können die verschiedenen Dosen auf demselben Weg oder auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, z. B. eine parenterale Primärimpfung und eine mukosale Auffrischung, ein mukosale Primärimpfung und eine parenterale Auffrischung, usw. Die Verabreichung von mehr als einer Dosis (üblicherweise zwei Dosen) ist besonders bei immunologisch naiven Patienten nützlich, z. B. bei Menschen, die niemals zuvor einen Influenzaimpfstoff erhalten haben, oder bei Impfung gegen einen neuen HA-Subtyp (wie in einem pandemischen Ausbruch). Mehrere Dosen werden üblicherweise im Abstand von mindestens 1 Woche verabreicht (z. B. etwa 2 Wochen, etwa 3 Wochen, etwa 4 Wochen, etwa 6 Wochen, etwa 8 Wochen, etwa 10 Wochen, etwa 12 Wochen, etwa 16 Wochen, usw).
Durch die Erfindung hergestellte Impfstoffe können an Patienten im Wesentlichen zur gleichen Zeit (z. B. im Laufe derselben medizinischen Beratung oder desselben Besuchs bei einer Gesundheitsfachkraft oder eines Impfzentren) verabreicht werden wie andere Impfstoffe; z. B. im Wesentlichen zur gleichen Zeit wie ein Masernimpfstoff, ein Mumpsimpfstoff ein Rötelnimpfstoff, ein MMR-Impfstoff, ein Varicellaimpfstoff, ein MMRV-Impfstoff, ein Diphtherieimpfstoff, ein Tetanusimpfstoff, ein Pertussisimpfstoff, ein DTP-Impfstoff, ein konjugierter H. influenzae Typ B-Impfstoff, ein inaktivierter Poliovirusimpfstoff, ein Hepatitis B-Virus-Impfstoff, ein Menigokokken-Konjugat-Impfstoff (wie ein tetravalenter A-C-W135-Y-Impfstoff), ein Impfstoff gegen Respiratorisches Syncytialvirus, ein Pneumokokken-Konjugat-Impfstoff, usw. Die Verabreichung zur im Wesentlichen gleichen Zeit wie ein Pneumokokkenimpfstoff und/oder ein Meningokokkenimpfstoff ist besonders in älteren Patienten nützlich.
In ähnlicher Weise können die Impfstoffe der Erfindung an Patienten zur im Wesentlichen gleichen Zeit (z. B. während derselben medizinischen Beratung oder desselben Besuchs bei einer Gesundheitsfachkraft) wie eine antivirale Verbindung verabreicht werden, und insbesondere eine antivirale Verbindung, die gegen Influenzavirus aktiv ist (z. B. Oseltamivir und/oder Zanamivir). Diese antiviralen Mittel umfassen Neuramidase-Inhibitoren, wie eine (3R,4R,5S)-4-Acetylamino-5-amino-3(1-ethylpropoxy)-1-cyclohexen-1-carboxylsäure oder eine 5-(Acetylamino)-4-[(aminoiminomethyl)-amino]-2,6-anhydro-3,4,5-tridesoxy-D-glycero-D-galactonon-2-enonsäure, einschließlich Ester davon (z. B. die Ethylester) und Salze davon (z. B. die Phosphatsalze). Ein bevorzugtes antivirales Mittel ist (3R,4R,5S)-4-Acetylamino-5-amino-3(1-ethylpropoxy)-1-cyclohexen-1-carboxylsäure, Ethylester, Phosphat (1:1), welches auch als Oseltamivirphosphat (TAMIFLU^TM) bekannt ist.
Allgemeines
Der Begriff ”umfassend” umfasst ”enthaltend” sowie auch ”bestehend aus”, z. B. kann eine Zusammensetzung, die X ”umfasst”, ausschließlich aus X bestehen, oder sie kann etwas zusätzliches enthalten, z. B. X + Y.
Das Wort ”im Wesentlichen” schließt ”vollständig” nicht aus, z. B. kann eine Zusammensetzung, die ”im Wesentlichen frei” von Y ist, vollständig frei von Y sein. Sofern erforderlich, kann der Begriff ”im Wesentlichen” bei der Definition der Erfindung weggelassen werden.
Der Begriff ”etwa” in Bezug auf einen numerischen Wert x ist optional und bedeutet beispielsweise x ± 10%.
Sofern nicht ausdrücklich genannt, ist bei einem Verfahren, das einen Schritt umfasst, bei dem man zwei oder mehrere Komponenten mischt, keine besondere Reihenfolge beim Mischen erforderlich. Daher können Komponenten in beliebiger Reihenfolge gemischt werden. Gibt es drei Komponenten, so können zwei der Komponenten miteinander kombiniert werden, und anschließend kann diese Kombination mit der dritten Komponente kombiniert werden, usw.
Die verschiedenen Schritte der Verfahren können zur gleichen Zeit oder zu verschiedenen Zeiten ausgeführt werden, an derselben oder an verschiedenen geographischen Standorten, z. B. Ländern, und durch dieselben oder durch verschiedene Menschen oder Entitäten.
Werden bei der Kultivierung von Zellen tierische Materialien (insbesondere aus Rindern) verwendet, so sollten sie aus Quellen gewonnen sein, die frei von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSEs) sind, und insbesondere frei von boviner spongiformer Enzephalopathie (BSE). Insgesamt ist es bevorzugt, Zellen in vollständiger Abwesenheit von Materialien zu kultivieren, die von Tieren abgeleitet sind.
Wird eine Verbindung an den Körper als Teil einer Zusammensetzung verabreicht, so kann diese Verbindung alternativ durch eine geeignete Prodrug ersetzt werden.
Verweise auf eine prozentuale Sequenzidentität zwischen zwei Aminosäuresequenzen bedeuten, dass, wenn sie in einem Alignment gegenübergestellt werden, dieser prozentuale Anteil an Aminosäuren im Vergleich beider Sequenzen übereinstimmt. Dieses Alignment und die prozentuale Homologie oder Sequenzidentität kann mit Softwareprogrammen bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel mit denen, die in Abschnitt 7.7.18 von Referenz 69 beschrieben sind. Ein bevorzugtes Alignment wird durch den Smith-Waterman-Homologie-Suchalgorithmus bestimmt, der eine affine gap-Suche mit einem gap open penalty von 12 und einem gap extension penalty von 2, und eine BLOSUM Matrix von 61 verwendet. Der Smith-Waterman-Homologie-Suchalgorithmus wird in Referenz 70 gelehrt.
Verweise auf eine prozentuale Sequenzidentität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen bedeuten, dass, wenn sie sie in einem Alignment gegenübergestellt werden, dieser prozentuale Anteil an Basen im Vergleich beider Sequenzen übereinstimmt. Dieses Alignment und die prozentuale Homologie oder Sequenzidentität kann mit Softwareprogrammen bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel mit denen, die in Abschnitt 7.7.18 von Referenz 69 beschrieben sind. Ein bevorzugtes Alignmentprogramm ist GCG Gap (Genetics Computer Group, Wisconsin, Suite Version 10.1), vorzugsweise unter Verwendung von 'Standard'-Parametern, bei denen es sich um folgende handelt: open gap = 3; extend gap = 1.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Virustiter (durch Focus-Forming-Assay (FFA); 1A) und HA-Titer (durch Hämagglutinierungs-Assay mit roten Blutkörperchen; 1B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion von wt PR8- und PR8-X-Viren, die in MDCK-Zellen angezüchtet wurden. Die durchgehende Linie in 1A und die schraffierten Säulen in 1B stellen Ergebnisse mit Wildtyp-PR8 dar. Die gepunktete Linie in 1A und die leeren Säulen in 1B stellen Ergebnisse mit Wildtyp-PR8-X dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse in den 1A und 1B zeigt den Virustiter (IU/ml) bzw. den HA-Titer.
2 zeigt Virustiter (durch FFA; 2A) und HA-Titer (durch Hämagglutinierungs-Assay mit roten Blutkörperchen; 2B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion von durch reverse Genetik gewonnene PR8- und PR8-X-Viren, die in MDCK-Zellen angezüchtet wurden. Die durchgehende Linie in 2A und die schraffierten Säulen in 2B stellen Ergebnisse mit PR8 dar. Die gepunktete Linie in 2A und die leeren Säulen in 2B stellen Ergebnisse mit mittels RG erhaltenem PR8-X dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse in den 2A und 2B zeigt den Virustiter (IU/ml) bzw. den HA-Titer.
3 vergleicht Virustiter (durch FFA; 3A) und HA-Titer (durch Hämagglutinierungs-Assay mit roten Blutkörperchen; 3B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion in MDCK-Zellen von durch reverse Genetik gewonnenen 6:2 reassortierten Viren, die entweder mit PR8- oder PR8-X-Rückgratabschnitten hergestellt wurden, welche die HA- und NA-Abschnitte von PR8-X umfassen. Die durchgehende Linie in 3A und die schraffierten Säulen in 3B stellen Ergebnisse mit dem PR8-Rückgrat dar. Die gepunktete Linie in 3A und die leeren Säulen in 3B stellen Ergebnisse mit dem PR8-X-Rückgrat dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse in den 3A und 3B zeigt den Virustiter (IU/ml) bzw. den HA-Titer.
4 vergleicht Virustiter durch FFA (4A) und HA-Titer (durch Hämagglutinierungs-Assay mit roten Blutkörperchen; 4B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion in MDCK-Zellen von durch reverse Genetik gewonnenen 6:2 reassortierten Viren, die entweder mit wt PR8- oder PR8-X-Rückgratabschnitten hergestellt wurden, welche die HA- und NA-Abschnitte von einem pandemischen H1-Stamm (Stamm 1) umfassen. Die durchgehende Linie in 4A und die schraffierten Säulen in 4B stellen Ergebnisse mit dem wt PR8-Rückgrat dar. Die gepunktete Linie in 4A und die leeren Säulen in 4B stellen Ergebnisse mit dem PR8-X-Rückgrat dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse in den 4A und 4B zeigt den Virustiter (IU/ml) bzw. den HA-Titer.
5 vergleicht Virustiter durch einen Focus-Forming-Assay (FFA) (5A) und HA-Titer (5B) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion in MDCK-Zellen von durch reverse Genetik gewonnenen 6:2 reassortierten Viren, die entweder mit wt PR8- oder PR8-X-Rückgratabschnitten hergestellt wurden, welche die HA- und NA-Abschnitte von 105p30 umfassen. Die durchgehende Linie in 5A und die schraffierten Säulen in 5B stellen Ergebnisse mit dem wt PR8-Rückgrat dar. Die gepunktete Linie in 5A und die leeren Säulen in 5B stellen Ergebnisse mit dem PR8-X-Rückgrat dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse zeigt den Virustiter (IU/ml) bzw. den HA-Titer.
6 zeigt Virustiter durch einen Focus-Forming-Assay (FFA) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion von Wildtyp PR8-X- und 105p30-Viren (6A) oder von durch reverse Genetik gewonnene PR8-X- und 105p30-Viren (6B), die in MDCK-Zellen angezüchtet wurden. In den 6A und 6B stellen die durchgezogenen Linien Ergebnisse mit 105p30 dar. Die gepunkteten Linien stellen Ergebnisse mit PR8-X dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse in den 6A und 6B zeigt den Virustiter (IU/ml) bzw. den HA-Titer.
7 zeigt die Wachstumseigenschaften von reassortierten Viren, die Rückgratabschnitte des wt PR8-Stamms (Linie mit Dreiecken) oder des 105p30-Stamms (Linie mit Quadraten) sowie die HA- und NA-Abschnitte von einem pandemischen H1-Influenzastamm (Stamm 2) enthalten. Die X-Achse in den 7A und 7B geben die Stunden nach der Infektion an. Die Y-Achse in 7A zeigt den Titer Log10 in FFU pro mL. Die Y-Achse in 7B zeigt den Titer log10 in Viruspartikeln pro mL.
8 vergleicht Virustiter durch einen Focus-Forming-Assay (FFA) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion in MDCK-Zellen von durch reverse Genetik gewonnenen 6:2 reassortierten Viren, die entweder mit 105p30- oder PR8-X Rückgratabschnitten hergestellt wurden, welche die HA- und NA-Abschnitte von (A) einem H1-Stamm (Stamm 1) oder (B) einem pandemischen H1-Stamm (Stamm 2) umfassen. Die durchgehenden Linien stellen Ergebnisse mit dem 105p30-Rückgrat dar. Die gepunkteten Linien stellen Ergebnisse mit dem PR8-X-Rückgrat dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse zeigt den Virustiter (IU/ml).
9 vergleicht Virustiter durch einen Focus-Forming-Assay (FFA) zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion in MDCK-Zellen von durch reverse Genetik gewonnenen 6:2 reassortierten Viren, die mit dem Rückgrat #17, #19 oder PR8-X in Kombination mit den HA- und NA-Abschnitten von (A) einem pandemischen H1-Stamm (Stamm 3) oder (B) einem H3 (Stamm 1) hergestellt wurden. In 9A und 9B stellen die gepunkteten Linien mit den kreisförmigen Markierungen Ergebnisse mit dem Rückgrat #17 dar. Die durchgehenden Linien mit den diamantenförmigen Markierungen stellen Ergebnisse mit dem Rückgrat #19 dar. Die gepunkteten Linien mit den quadratförmigen Markierungen stellen Ergebnisse mit dem Rückgrat PR8-X dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse zeigt den Virustiter (IU/ml).
10 vergleicht Virustiter durch einen Focus-Forming-Assay (FFA) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion in MDCK-Zellen von durch reverse Genetik gewonnenen 6:2 reassortierten Viren, die mit dem chimären #19-Rückgrat oder mit dem PR8-X-Rückgrat plus den HA- und NA-Abschnitten aus den folgenden Stämmen hergestellt wurden: (A) ein pandemischer H1-Stamm (Stamm 2), (B) ein pandemischer H1-Stamm (Stamm 4), (C) ein H1-Stamm (Stamm 2), (D) ein H1-Stamm (Stamm 3) oder (E) ein H3-Stamm (Stamm 2). In den 10A–E stellen die durchgehenden Linien mit den dreieckigen Markierungen Ergebnisse mit dem Rückgrat #19 dar. Die gepunkteten Linien mit quadratischen Markierungen stellen Ergebnisse mit dem PR8-X-Rückgrat dar. Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion, und die Y-Achse zeigt den Virustiter (IU/ml).
11 vergleicht die HA-Ausbeuten (durch Lektin-Capture-ELISA) 60 Stunden nach der Infektion in MDCK-Zellen von verschiedenen 6:2 reassortierten Viren, die entweder mit dem chimären Rückgrat #19 (leere Säulen) oder mit dem PR8-X-Rückgrat (ausgefüllte Säulen) plus den HA- und NA-Abschnitten von den folgenden Stämmen hergestellt wurden: (A) ein pandemischer H1-Stamm (Stamm 2), (B) ein pandemischer H1-Stamm (Stamm 4), (C) ein H3-Stamm (Stamm1), oder (D) ein H3-Stamm (Stamm 2). Entsprechende 6:2 reassortierte Viren, die durch klassische Reassortierung (”classical”) mit dem wt PR8-Rückgrat hergestellt wurden, wurden als Kontrollen einbezogen (schraffierte Säulen). Die Y-Achse zeigt die HA-Menge in μg pro mL.
12 zeigt die Wachstumskurven von reassortierten Influenzaviren, die die Rückgrate 17, 18, 19 und 20 umfassen (wie in Tabelle 1 gezeigt; Linien mit Diamanten, Quadraten, Dreiecken bzw. Kreuzen), von einer Kontrolle, die dieselben HA- und NA-Abschnitte von einem H3-Influenzastamm (Stamm 1), aber alle Rückgratabschnitte von PR8-X (Linie mit Kreisen) umfasst, und von dem äquivalenten Wildtypstamm (Linie mit Pluszeichen). Die X-Achse zeigt die Stunden nach der Infektion (hpi), und die Y-Achse zeigt IU/mL.
13 zeigt die Wachstumskurve von reassortierten Influenzaviren, die die Rückgrate 17 und 19 (Linie mit Diamanten bzw. Dreiecken) und die HA-Abschnitte von einem H3-Influenzastamm (Stamm 3) umfassen, von einer Kontrolle, die dieselben HA- und NA-Abschnitte, aber alle Rückgratabschnitte von PR8-X umfasst, (Linie mit Pluszeichen) und von dem äquivalenten Wildtypstamm (Linie mit Kreisen).
14 zeigt die Ergebnisse eines FFA (14(A) und 14(C) und eines HA-ELISA (14(B) und 14(D))-Assays, wobei reassortierte Influenzaviren, die das Rückgrat 19 enthielten (offene Box), die das PR8-X-Rückgrat enthielten (schraffierte Box), und das Wildtyp-Influenzavirus (gepunktete Box) verwendet wurden. Die 14(A) und 14(B) zeigen die Ergebnisse mit einem H1-Influenzastamm (Stamm 2), und die 14(C) und (D) zeigen die Ergebnisse mit einem H3-Influenzavirusstamm. Die Y-Achse in den 14(A) und (C) zeigt den Virustiter in IU/mL, und die Y-Achse in den 14(B) und 14(D) zeigt den HA in μg/ml.
15 ist ein Alignment der viralen M1-Abschnitte von A/New Caledonia/20/99 (SEQ ID Nr.: 33) und 105p30 (SEQ ID Nr.: 45).
ARTEN ZUR AUSFÜHRUNGG DER ERFINDUNG
Entwicklung neuer Donorstämme
Um Donorstämme mit einem hohen Wachstum bereitzustellen, wird der Donorstamm A/Puerto Rico/8/34 fünfmal in MDCK 33016 Zellen passagiert. Durch Verwendung dieses Verfahrens waren die Erfinder in der Lage, den Stamm PR8-X zu gewinnen, der im Vergleich zum Originalstamm verbesserte Wachstumseigenschaften aufweist.
Der Influenza-Donorstamm 105p30 wurde durch Isolierung eines A/New Caledonia/20/1999-Influenzavirus aus einem klinischen Isolat in MDCK 33016 Zellen und 30-fachem Passagieren des Virus bereitgestellt. Der resultierende Stamm hat einen M-Abschnitt mit Lysin in der Position, die bei einem Alignment mit SEQ ID Nr.: 33 der Aminosäure 95 von SEQ ID Nr.: 33 entspricht.
Wachstumseigenschaften von wt PR8- und PR8-X-Viren
Um die Wachstumseigenschaften von PR8-X- und wt PR8-Donorstämmen zu vergleichen, wird der virale Titer dieser Virusstämme in MDCK-Zellen durch Focus-Forming-Assays und Hämagglutinierungs-Assays gemessen.
Focus-Forming-Assays (FFA)
Für den FFA werden nicht-infizierte MDCK-Zellen in einer Dichte von 1.8 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen in 100 μl DMEM mit 10% FCS ausplattiert. Am nächsten Tag wird das Medium abgesaugt, und die Zellen werden mit Viren in einem Volumen von 50 μl infiziert (Viren verdünnt in DMEM + 1% FCS). Die Zellen werden bei 37°C bis zum nächsten Tag inkubiert.
Zu mehreren Zeitpunkten nach der Infektion wird das Medium abgesaugt, und die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen. 50 μl eiskaltes 50%/50% Aceton-Methanol wird zu jeder Vertiefung hinzugeben, und anschließend wird bei –20°C für 30 Minuten inkubiert. Die Acetonmischung wird abgesaugt, und die Zellen werden einmal mit PBST gewaschen (PBS + 0,1% Tween). 50 μl 2% BSA in PBS wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur (RT) für 30 Minuten. 50 μl einer 1:6000 Verdünnung von anti-NP werden in Blockierungspuffer hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei RT für 1 Stunde. Die Antikörperlösung wird abgesaugt, und die Zellen werden dreimal mit PBST gewaschen. Sekundärer Antikörper (Ziege-anti-Maus) wird in einer Verdünnung von 1:2000 in 50 μl Blockierungspuffer hinzugegeben, und die Platte wird bei RT für 1 Stunde inkubiert. Die Antikörperlösung wird abgesaugt, und die Zellen werden dreimal mit PBST gewaschen. 50 μl KPL True-Blue wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben, und es wird für 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Absaugen des True-Blue gestoppt, und es wird einmal mit dH₂O gewaschen. Das Wasser wird abgesaugt, und man lässt die Zellen trocknen.
Die Ergebnisse (1) zeigen, dass der PR8-X-Stamm im Vergleich mit dem wt PR8-Stamm, von dem er abgeleitet ist, im gleichen Zeitraum zu höheren Titer heranwachsen kann.
Wachstumseigenschaften von reassortierten Viren, die ein PR8-X- oder wt PR8-Rückgrat enthalten
Um die Eignung des Stamms PR8-X als Donorstamm für Virus-Reassortierung zu testen, werden reassortierte Viren durch reverse Genetik hergestellt, die die HA- und NA-Proteine von einem pandemischen H1-Stamm und die übrigen viralen Abschnitte entweder von PR8-X oder von PR8 enthalten. Die viralen Titer dieser reassorierten Viren werden wie oben beschrieben durch FFA- und HA-Assays bestimmt. Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass reassortierte Viren, die virale Abschnitte von PR8-X enthalten, im Vergleich zu reassortierten Viren, die virale Abschnitte von dem PR8/34-Stamm enthalten, in MDCK-Zellen schneller wachsen.
Wachstumseigenschaften des 105p30-Stamms im Vergleich mit PR8-X
MDCK-Zellen werden mit 105p30 und PR8-X bei einer MOI von 10^–3 infiziert, und es werden zu mehreren Zeitpunkten nach der Infektion Proben genommen. Der Titer wird durch einen FFA-Assay bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass 105p30 im Vergleich zu PR8-X in MDCK-Zellen sogar noch schneller wächst (6).
Wachstumseigenschaften von reassortierien Viren, die ein 105p30- oder ein wt PR8-Rückgrat enthalten
Um die Eignung des Stamms 105p30 als ein Donorstamm für die Virusreassortierung zu testen, wird reverse Genetik zur Herstellung von reassorieren Viren verwendet, die die HA- und NA-Abschnitte von einem pandemischen H1-Influenzastamm und die Rückgratabschnitte von dem 105p30- oder dem wt PR8-Stamm enthalten. MDCK-Zellen werden mit den rerassortierten Viren bei einer MOI von 10^–3 infiziert, und es werden 1 Stunde, 12 Stunden, 36 Stunden und 60 Stunden nach der Infektion Proben entnommen. Die Titer werden entweder durch Focus-Forming-Assays oder durch Bestimmung der Viruspartikel mittels Echtzeit-Nachweis-PCR ermittelt. Die reassorieren Viren, die die Rückgratabschnitte des 105p30-Stamms enthalten, wachsen schneller als die Viren, die mit den Rückgratabschnitten des wt PR8-Stamms reassortiert werden. Dies zeigt, dass der Stamm 105p30 ein guter Donorstamm zur Herstellung von schnell wachsenden reassorierten Viren ist (7).
Freisetzung von Influenzaviren unter Verwendung von Rückgratabschnitten aus zwei Donorstämmen

Die Freisetzungsseffizienz von reassortierten Influenzaviren, die die HA- und NA-Abschnitte aus einem H3-Influenzavirus und Rückgratabschnitte aus dem 105p30- und demPR8-X-Donorstamm enthalten, wird in MDCK-Zellen getestet. Die reassortierten Influenzaviren enthalten Rückgratabschnitte aus dem 105p30- und dem PR8-X-Donorstamm, wie es in der folgenden Tabelle angegeben wird: Tabelle 1

Rückgrat #	PB1	PB2	PA	NP	M	NS
1	PR8-X	PR8-X	PR8-X	105p30	105p30	105p30
2	PR8-X	PR8-X	105p30	PR8-X	105p30	105p30
3	PR8-X	PR8-X	105p30	105p30	PR8-X	105p30
4	PR8-X	PR8-X	105p30	105p30	105p30	PR8-X
5	PR8-X	105p30	PR8-X	PR8-X	105p30	105p30
6	PR8-X	105p30	PR8-X	105p30	PR8-X	105p30
7	PR8-X	105p30	PR8-X	105p30	105p30	PR8-X
8	PR8-X	105p30	105p30	PR8-X	PR8-X	105p30
9	PR8-X	105p30	105p30	PR8-X	105p30	PR8-X
10	PR8-X	105p30	105p30	105p30	PR8-X	PR8-X
11	105p30	PR8-X	PR8-X	PR8-X	105p30	105p30
12	105p30	PR8-X	PR8-X	105p30	PR8-X	105p30
13	105p30	PR8-X	PR8-X	105p30	105p30	PR8-X
14	105p30	PR8-X	105p30	PR8-X	105p30	PR8-X
15	105p30	PR8-X	105p30	PR8-X	PR8-X	105p30
16	105p30	PR8-X	105p30	105p30	PR8-X	PR8-X
17	105p30	105p30	PR8-X	PR8-X	PR8-X	105p30
18	105p30	105p30	PR8-X	PR8-X	105p30	PR8-X
19	105p30	105p30	PR8-X	105p30	PR8-X	PR8-X
20	105p30	105p30	105p30	PR8-X	PR8-X	PR8-X

Reassortierte Influenzaviren, die ein Rückgrat gemäß Nummer 3, 4, 10, 11, 14 und 16–20 enthalten, sind freisetzbar. Influenzaviren, die die Rückgratnummern 3, 4, 10, 11 oder 16 enthalten, erreichen virale Titer von weniger als 10² IU/mL. Influenzaviren, die die Rückgratnummern 17 und 18 enthalten, erreichen virale Titer zwischen 10² und 10⁶ IU/mL, und Influenzaviren, die die Rückgratnummern 19 und 20 enthalten, erreichen Titer von mehr als 10⁶ IU/mL.
Diese Daten zeigen, dass Influenzaviren, bei denen die PB1- und PB2-Abschnitte von demselben Influenza-Donorstamm stammen, im Vergleich mit Influenzaviren, in denen diese Abschnitte aus verschiedenen Influenza-Donorstämmen stammen, eine höhere Freisetzungseffizienz zeigen können.
Wachstumseigenschaften von reassortierten Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von zwei Donorstämmen enthalten
Es werden reassortierte Influenzastämme erzeugt, die Rückgratnummern 17, 18, 19 und 20 (wie in Tabelle 1 oben gezeigt) sowie die HA- und NA-Abschnitte von einem H3-Influenzastamm (Stamm 1) enthalten. Als Kontrollen werden der äquivalente Wildtyp H3-Influenzavirus und ein reassortierter Influenzavirus verwendet, der dieselben HA- und NA-Abschnitte und alle Rückgratabschnitte von PR8-X umfasst.
Ferner werden reassortierte Influenzastämme hergestellt, die die Rückgratnummern 17 und 19 sowie die HA- und NA-Abschnitte von einem zweiten H3-Influenzavirus (Stamm 1) oder von einem pandemischen H1-Influenzavirus (Stamm 3) enthalten. Als Kontrolle für den H3-Stamm wird der äquivalente Wildtyp H3 (Stamm 2) Influenzavirus und ein reassortierter Influenzavirus verwendet, der dieselben HA- und NA-Abschnitte und alle Rückgratabschnitte von PR8-X umfasst. Für den pandemischen H1-Influenzavirus wird ein reassortierter Influenzavirus verwendet, der dieselben HA- und NA-Abschnitte und alle Rückgratabschnitte von PR8-X umfasst.
Die reassortierten Influenzaviren und die Kontrollviren werden in MDCK-Zellen gezüchtet, und der Virustiter wird zu verschiedenen Zeitpunkten durch FFA gemessen. Bei den reassortierten H3-Viren (Stamm 1), die die Rückgrate 17, 19 und 20 enthalten, und den H3-Influenzaviren (Stamm 3), die die Rückgrate 17 und 19 enthalten, wachsen die Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von zwei Donorstämmen enthalten, im Vergleich mit dem Wildtypvirus und dem reassortierten Virus, welches Rückgratabschnitte von nur einem einzelnen Donorstamm enthält, zu höheren Titern heran (siehe 11 und 12).
Bei dem pandemischen H1-Influenzavirus, wachsen die reassortierten Influenzastämme, die die Rückgrate 17 und 19 enthalten, im Vergleich mit der Kontrolle, die alle Rückgratabschnitte von PR8-X enthielt, zu höheren Titern heran (siehe 9).
Die Daten zeigen, dass reassortierte Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von zwei verschiedenen Donorstämmen enthalten, im Vergleich mit reassortierten Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von nur einem einzelnen Donorstamm enthalten, verbesserte Wachstumsraten zeigen können.
Die Experimente wurden auch unter Verwendung reassortierter Influenzaviren wiederholt, die das Rückgrat 19 oder die Rückgratabschnitte von PR8-X in Kombination mit den HA- und NA-Abschnitten von vier verschiedenen H1-Stämmen oder von einem H3-Stamm enthielten. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
Reassortierte Influenzaviren mit Rückgratabschnitten von zwei verschiedenen Donorstämmen ergeben höhere Ausbeuten
Um zu testen, ob reassortierte Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von zwei verschiedenen Influenza-Donorstämmen enthalten, auch zu höheren Ausbeuten führen können, wird die HA-Ausbeute von den reassortieren Stämmen durch HA-ELISA getestet. Zu diesem Zweck werden dieselben, oben beschriebenen, reassortierten Influenzaviren, die Rückgrat #19 und die HA/NA-Abschnitte der H3 (Stamm 2)- und H1-Influenzastämme enthalten, verwendet. Als Kontrollen werden die äquivalenten Wildtyp-Influenzaviren und reassortierten Influenzaviren, die dieselben HA- und NA-Abschnitte und alle Rückgratabschnitte von PR8-X umfassen, verwendet. Zusätzlich werden die viralen Titer mit einem FFA-Assay bestätigt.
Die Ergebnisse bestätigen, dass die reassortierten Stämme, die Rückgratabschnitte von zwei verschiedenen Donorstämmen enthalten, im Vergleich mit Influenzaviren, die alle Rückgrate von PR8-X enthielten, zu höheren Ausbeuten heranwachsen können (siehe 13(A) und (C)). Ferner ergeben reassortierte Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von zwei Donorstämmen enthalten, auch höhere HA-Ausbeuten (siehe 13(B) und (D)).
Diese Daten zeigen, dass reassortierte Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von zwei Donorstämmen enthalten, im Vergleich mit reassortierten Influenzaviren, die Rückgratabschnitte von nur einem Donorstamm enthalten, höhere Ausbeuten erzielen.
Es wird verstanden werden, dass die Erfindung nur beispielhaft beschrieben wurde und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne den Bereich und die Idee der Erfindung zu verlassen.
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SEQUENZEN

Claims

Verwendung eines viralen Rückgrats zur Erhöhung der Virusausbeute in einem Kulturwirt, wobei das virale Rückgrat mindestens zwei Abschnitte von 105p30 oder PR8-X umfasst.
Verwendung eines reassortierten Influenza A-Virus zur Herstellung eines Medikaments zur Auslösung einer Immunantwort in einem Individuum, wobei das reassortierte Virus mindestens zwei virale Rückgratabschnitte von einem Donorstamm umfasst, wobei der Donorstamm ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 105p30 oder PR8-X.