KR101800245B1 - 비-내인성 ｐｏｌ ｉ 프로모터를 사용하는 역 유전학 - Google Patents

Abstract

전이유전자의 발현은 숙주 세포가 유래되는 동일한 분류 목으로부터 유기체에 내인성이 아닌 pol I 프로모터를 사용하여 숙주 세포 내에서 구동된다.

Description

비-내인성 ＰＯＬ Ｉ 프로모터를 사용하는 역 유전학{REVERSE GENETICS USING NON-ENDOGENOUS POL I PROMOTERS}

이 특허 출원은 2009년 5월 21일 출원된 미국의 가특허 출원 61/216,919로부터 우선권을 주장하며, 이것의 완전한 내용은 참고로써 본원에 포함된다.

이 발명은 역 유전학 분야에 관한 것이다. 더 나아가, 이는 다양한 바이러스에 대한 예방을 위한 백신을 제조하는 것에 관한 것이다.

역 유전학은 세포 배양물에서 RNA 바이러스의 재조합 발현 및 조작을 허용한다. 이는 재조합 바이러스(재교배(reassortant)를 포함) 및/또는 그것의 돌연변이의 빠른 생성을 허용하기 때문에 바이러스학과 백신 제조에서 강력한 도구이다. 본 방법은 바이러스 게놈을 암호화하는 하나 이상의 발현 구성체를 가지는 숙주 세포를 트랜스펙팅하는 단계와 세포로부터 바이러스를 분리하는 단계를 수반한다. 예를 들어, 참고문헌 1 및 2는 인플루엔자 게놈 RNA가 개(canine) pol I 프로모터를 사용하여 개 세포에서 발현되는 방법을 설명한다. 다른 자료는 인간 세포에서 인간 pol I 프로모터를 사용하는 인플루엔자 게놈 RNA의 발현을 보고하였다.

선행 기술 방법의 한가지 중요한 문제점은 pol I 프로모터가 매우 종 특이적이라는 것이다. 예를 들어, 인간 pol I 프로모터는 영장류 세포에서만 활성이고[3], 유사하게 개 세포에서 발현은 개 pol I 프로모터를 필요로 할 것이다. 따라서, 바이러스가 내인성 pol I 프로모터를 특징으로 하지 않는 셀 라인에서 성장되어야 할 필요가 있다면, 바이러스를 구제하고 성장시키기 위한 2가지의 다른 세포 형태를 사용할 필요가 있었다. 그러나, 이것은, 예를 들어 경쟁적 배양물 선택 압력이 회피될 수 있다는 이점을 가지기 때문에, 다양한 셀 라인의 사용을 피하는 것은 바람직하다. 백신 생성의 모든 단계를 위한 단일 셀 라인의 사용은 또한 조절 승인을 가능하게 한다. 따라서, 당업계에서 역 유전학을 실행하기 위한 또 다른 방법을 제공하는 지속적인 필요가 있다.

본 발명자들은 현재 놀랍게도 숙주 세포가 유래된 동일한 분류 목(order)으로부터 유기체에 내인성이 아닌 pol I 프로모터를 사용하여 숙주 세포에서 전이유전자의 발현을 구동할 수 있다는 것을 발견하였다.

한 구체예에서, 본 발명은 구성체(들)로부터의 RNA 분자의 발현이 숙주 세포의 목(order)에 내인성이 아닌 pol I 프로모터에 의해 조절되는, 하나 이상의 발현 구성체(들)를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이들 숙주 세포는 본 발명의 발현 시스템에서 사용될 수 있다.

본 발명은 추가로 (i) 관심의 전이유전자의 발현이 제1 유기체로부터의 pol I 프로모터에 의해 구동되는 발현 구성체를 제조하는 단계, (ii) 단계 (i)의 발현 구성체를 숙주 세포에 도입하는 단계(숙주 세포는 제1 유기체의 다른 분류 목에 있다)를 포함하는, 숙주 세포의 RNA 발현을 위한 방법을 추가로 제공한다.

추가 구체예에서, 본 발명은 바이러스가 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 생성되는, 재조합 바이러스를 만드는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 (i) 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 재조합 바이러스를 생성하는 단계, (ii) 배양 숙주를 단계 (i)에서 얻은 바이러스로 감염시키는 단계, (iii) 단계 (ii)로부터의 배양 숙주를 배양하여 바이러스를 생성하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)에서 얻은 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는, 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다(예를 들어, 백신으로 제형화). 백신을 제조하는 방법을 제공하기 위해, 본 방법은 그 다음에 (v) 바이러스를 백신으로 제형화하는 단계를 더 포함한다.

상기 논의한 바와 같이 도입되는 비-내인성 pol I 프로모터(들)에 추가로, 숙주 세포는 내인성 pol I 프로모터들을 포함할 것이다. 비-내인성 pol I 프로모터(들)는 세포에서 비-내인성 RNA, 특히 바이러스 RNA의 발현을 구동한다. 본 발명은 따라서 내인성 rRNA와 적어도 하나의 비-내인성 pol I 프로모터의 발현을 조절하고, 바이러스 RNA 또는 그것의 상보체의 발현을 조절하는 적어도 하나의 내인성 pol I 프로모터를 가지는 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 (i) 단백질-코딩 mRNA에 대한 DNA에서 코돈 사용은 개 세포에 대해 최적화되고, (ii) 바이러스 RNA는 영장류 pol I 프로모터의 조절 하에 있는, 단백질-코딩 mRNA 및 바이러스 RNA를 둘 다 암호화하는 DNA 발현 구성체를 제공한다. 개 세포는 이상적으로는 MDCK 세포이고, 영장류 프로모터는 이상적으로는 인간 pol I 프로모터이다. 단백질-코딩 mRNA의 발현은 개 세포에 대해 최적화된 pol II의 조절하에 있을 수 있다.

발현 구성체

본 발명자는 놀랍게도 세포와 분류 목(order)이 다른 유기체로부터 pol I 프로모터를 사용하여 세포에서 RNA 발현을 구동할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서 pol I 프로모터는 세포가 유래된 동일 분류 목으로부터 유기체에 내인성이 아니다. 용어 "목(order)"은 통상적인 분류 순위를 말하며, 목의 예는 영장목, 설치목, 식육목, 유대목, 고래목 등이 있다. 인간과 침팬지는 동일한 분류 목(영장목)에 있지만, 인간과 개는 다른 목에 있다(영장목 대 식육목).

따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 구성체로부터의 RNA 분자의 발현이 숙주 세포의 목에 내인성이 아닌 pol I 프로모터에 의해 구동되는 하나 이상의 발현 구성체(들)를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

한 구체예에서, 숙주 세포는 비-영장류 세포이고 pol I 프로모터는 영장류 pol I 프로모터이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 비-영장류 세포이고, 프로모터는 인간 프로모터이다. 추가 구체예에서, 숙주 세포는 비-인간 세포이고, pol I 프로모터는 인간 pol I 프로모터이다. 또 다른 구체예에서, pol I 프로모터는 비-개(non-canine) pol I 프로모터이고, 숙주 세포는 개 세포이다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 개 세포이고 프로모터는 영장류 pol I 프로모터이다. 더욱 바람직한 구체예에서, pol I 프로모터는 인간 프로모터이고 숙주 세포는 개 세포(예컨대, MDCK 세포)이다. 이 구체예는 인간 pol I 프로모터가 잘 특성화되어 있고, 백신의 생성을 위해 종종 개 세포가 사용되기 때문에 바람직하다.

숙주 세포에서 사용되는 발현 구성체는 단일-방향성 또는 양-방향성 발현 구성체일 수 있다. 숙주 세포가 하나 이상의 전이유전자를 발현시키면(동일 또는 다른 발현 구성체에서), 단일-방향성 및/또는 양-방향성의 발현을 사용할 수 있다.

양-방향성 발현 구성체는 동일한 구성체로부터 다른 방향으로(즉, 5'에서 3' 및 3'에서 5') 발현을 구동하는 적어도 2개의 프로모터를 함유한다. 적어도 하나의 프로모터는 본원에서 논의되는 바와 같은 비-내인성 pol I 프로모터이다. 2개의 프로모터는 동일한 이중 가닥 DNA의 다른 가닥에 작동가능하게 연결될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터 중 하나는 비-내인성 pol I 프로모터이고 나머지 프로모터 중 적어도 하나는 pol II 프로모터이다. 이것은 pol I 프로모터가 캡핑되지 않은 cRNA를 발현시키는데 사용될 수 있는 반면, pol II 프로모터는 이후에 단백질로 번역될 수 있는 mRNA를 전사하는데 사용되어, 따라서 동일 구성체로부터 RNA와 단백질의 동시 발현을 허용할 수 있기 때문에 유용하다. pol II 프로모터는 내인성 또는 비-내인성일 수 있다. 하나 이상의 발현 구성체가 발현 시스템 내에 사용된다면, 프로모터는 내인성과 비-내인성 프로모터의 혼합일 수 있으며, 단, 적어도 하나의 프로모터는 숙주 세포에서 발현을 구동할 수 있는 비-내인성 pol I 프로모터이다.

발현 구성체는 전형적으로 RNA 전사 종결 서열을 포함할 것이다. 종결 서열은 내인성 종결 서열 또는 숙주 세포에 내인성이 아닌 종결 서열일 수 있다. 적당한 종결 서열은 당업자에게 명백할 것이고, 제한되는 것은 아니지만, RNA 폴리머라아제 I 전사 종결 서열, RNA 폴리머라아제 II 전사 종결 서열 및 리보자임을 포함한다. 게다가, 발현 구성체는 mRNA에 대해, 특히 발현이 pol II 프로모터에 의해 조절되는 유전자의 말단에서 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.

발현 시스템은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 또는 적어도 12개의 발현 구성체를 함유할 수 있다.

발현 구성체는 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 다른 에피솜 구성체일 수 있다. 이러한 벡터는 적어도 하나의 박테리아 및/또는 진핵세포 기원의 복제를 전형적으로 포함할 것이다. 추가로, 벡터는 원핵 및/또는 진핵 세포에서 선택을 허용하는 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 선택가능한 마커의 예는 암피실린 또는 카나마이신과 같은 항생물질에 저항성을 부여하는 유전자이다. 벡터는 DNA 서열의 클로닝을 가능하게 하기 위해 하나 이상의 다양한 클로닝을 추가로 포함할 수 있다.

또 다르게는, 발현 구성체는 선형 발현 구성체일 수 있다. 이러한 선형 발현 구성체는 어떤 증폭 및/또는 선택 서열을 전형적으론 함유하지 않을 것이다. 그러나, 이러한 증폭 및/또는 선택 서열을 포함하는 선형 구성체는 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 인플루엔자 바이러스의 발현을 위한 이러한 선형 발현 구성체를 사용하는 방법의 예는 참고문헌 4에서 설명된다.

본 발명의 발현 구성체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발생될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 참고문헌 5에서 설명되었다. 발현 구성체가 선형 발현 구성체인 경우, 단일 제한효소 자리를 이용하여 숙주 세포에 도입 전에 선형화할 수 있다. 대안으로, 적어도 2개의 제한효소 자리를 사용하여 벡터로부터 발현 구성체를 절단할 수 있다. 추가로, 핵산 증폭 기술(예를 들어, PCR)을 사용하여 그것을 증폭시킴으로써 선형 발현 구성체를 얻는 것이 또한 가능하다.

본 발명의 발현 구성체는 당업자에게 알려진 어떤 기술을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 구성체는 전기천공법, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포좀, 미세주입법, 또는 미세입자-충격을 사용함으로써 숙주 세포에 도입될 수 있다.

발현 숙주가 개 세포, 예컨대 MDCK 셀 라인인 경우, 단백질-코딩 영역은, 예를 들어, 야생형 개 유전자로부터 또는 개 바이러스로부터의 프로모터를 사용하여 및/또는 인간 세포보다 개 세포에 더 적당한 코돈 사용을 가짐으로써 개 발현에 대해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 인간 유전자는 Phe에 대한 코돈으로서 UUC가 약간 선호되지만(54%), 개 세포에서는 더 강하게 선호된다(59%). 유사하게, 인간 세포의 Ile 코돈에 대해 주된 선호도가 없는 반면, 개 코돈의 53%는 Ile에 대한 AUC를 사용한다. 개 파르보바이러스(ssDNA 바이러스)와 같은 개 바이러스는 또한 코돈 최적화를 위한 지침을 제공하며, 예를 들어, 개 파르보바이러스의 Phe 코돈의 95%는 UUU(대 개 게놈에서 41%)이고, Ile 코돈의 68%는 AUU(대 32%), Val 코돈의 46%는 GUU(대 14%), Pro 코돈의 72%는 CCA(대 25%), Tyr 코돈의 87%는 UAU이고(대 40%), His 코돈의 87%는 CAU이고(대 39%), Gln 코돈의 92%는 CAA이고(대 25%), Glu 코돈의 81%는 GAA이고(대 40%), Cys 코돈의 94%는 UGU이고(대 42%), Ser 코돈의 단지 1%는 UCU이고(대 24%), CCC는 Phe에 대해 결코 사용되지 않고, UAG는 정지 코돈으로서 결코 사용되지 않는다. 따라서 단백질-코딩 유전자는 특성이 개 세포에서 발현을 위해 이미 최적화된 유전자와 더 유사하게 만들어질 수 있고, 따라서 발현을 가능하게 한다.

역 유전학

상기 설명한 발현 구성체들 및 숙주 세포들은 역 유전학적 기법을 통해 재조합 바이러스 주(strain)를 만드는데 특히 적당하다. 기법들은 양성가닥 RNA 바이러스 [6,7], 음성가닥 RNA 바이러스 [8,9] 및 이중 가닥 RNA 바이러스 [10]를 포함하는, 매우 다양한 RNA 바이러스의 생성을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 바이러스가 상기 설명한 바와 같은 발현 시스템을 사용하여 생성되는 재조합 바이러스를 생성하는 방법을 제공한다.

공지된 역 유전학 시스템은 pol I 프로모터, 박테리아 RNA 폴리머라아제 프로모터, 박테리오파지 폴리머라아제 프로모터 등으로부터 원하는 바이러스 RNA(vRNA) 분자를 암호화하는 DNA 분자를 발현시키는 단계를 수반한다. 추가로, 바이러스가 감염 바이러스를 형성하기 위해 특정 단백질을 필요로 하는 경우, 시스템은 또한 이들 단백질을 제공하며, 예를 들어 시스템은 DNA 형태 둘 다의 발현이 완전한 감염성 바이러스의 조합을 유발하도록 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자를 추가로 포함한다.

역 유전학이 vRNA의 발현을 위해 사용되는 경우, 서열 구성요소의 서로에 대한 정확한 스페이싱이 복제를 개시하기 위한 폴리머라아제에 대해 핵심이 된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 바이러스 RNA를 암호화하는 DNA 분자가 pol I 프로모터와 종결 서열 사이에 정확하게 위치되는 것을 중요하지만, 이 위치는 역 유전학 시스템에서 일하는 사람의 능력 내에서 잘 알려져 있다.

일반적으로, 역 유전학은 그것의 라이프 사이클 동안 게놈 RNA의 생성을 필요로하는 것으로 알려져 있는 임의의 바이러스의 발현에 적당하다. 이러한 바이러스는, 제한되는 것은 아니지만, 하기 설명하는 것과 같은 양성가닥 및 음성가닥 RNA 바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 바이러스는 오르토믹소바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스이다. 본 발명의 방법은 추가로 비-분절 및 분절 바이러스에 적당하다.

바이러스가 양성가닥 RNA 바이러스인 경우, 이는 종종 바이러스 게놈을 포함하는 발현 구성체를 가지는 세포를 트랜스펙팅하기에 충분하다. 예를 들어, 폴리오바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드의 트랜스펙션은 감염성 폴리오바이러스의 회수를 초래하였다[6,7]. 안티센스 바이러스 RNA가 보통 비-감염성이고 라이프 사이클을 완전하게 하기 위한 RNA 폴리머라아제를 필요로 하기 때문에 음성가닥 RNA 바이러스를 위한 역 유전학은 더욱 공격적으로 존재하였다. 따라서, 바이러스 폴리머라아제는 단백질로서 또는 인시츄 단백질 발현을 위한 유전자로서 제공되어야 한다.

바이러스가 감염성을 위한 단백질을 필요로 한다면, 이것이 숙주 세포에 의해 필요로 되는 발현 구성체의 총 수를 감소시키기 때문에 일반적으로 양-방향성 발현 구성체를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 방법은 유전자 또는 cDNA가 위쪽의 pol II 프로모터와 아래쪽의 비-내인성 pol I 프로모터 사이에 위치하는 적어도 하나의 양-방향성 발현 구성체를 이용할 수 있다. pol II 프로모터로부터의 유전자 또는 cDNA의 전사는 단백질로 번역될 수 있는 캡핑된 포지티브-센스 바이러스 mRNA를 생성하는 반면, 비-내인성 pol I 프로모터로부터의 전사는 네가티브-센스 vRNA를 생성한다. 양-방향성 발현 구성체는 양-방향성 발현 벡터일 수 있다.

재조합 바이러스를 생성하기 위해서, 세포는 비리온을 조립하는데 필요한 바이러스 게놈의 모든 절편을 발현시켜야 한다. 본 발명의 발현 구성체로 클로닝된 DNA는 바이러스 RNA와 단백질 모두를 바람직하게 제공하지만, 헬퍼 바이러스를 사용하지 않는 시스템이 바람직하다고 해도 일부의 RNA와 단백질을 제공하기 위한 헬퍼 바이러스를 또한 사용할 수 있다. 하나 이상의 발현 구성체를 사용하여 비-분절 바이러스의 바이러스 게놈을 발현시키는 것은 본 발명의 범주 내이지만, 바이러스가 비-분절 바이러스라면, 이는 보통 본 발명의 방법에서 단일 발현 구성체를 이용하여 달성될 수 있다. 바이러스가 분절 바이러스인 경우, 바이러스 게놈은 본 발명의 방법에서 하나 이상의 발현 구성체를 사용하여 발현된다. 그러나, 이는 또한 단일 발현 구성체에서 하나 이상의 절편 또는 심지어 모든 절편의 바이러스 게놈을 합하는 것으로 생각된다.

본 발명의 방법은 재교배(reassortant) 바이러스 주의 생성에 특히 적당하다. 이 기술은 바이러스 절편의 조합을 만들고, 바이러스 절편에서 코딩 또는 비-코딩 서열의 조작을 가능하게 하고, 돌연변이 등을 도입하기 위한 플라스미드의 시험관내 조작에 사용할 수 있다. 재교배 바이러스 주의 생성을 위한 발현 시스템의 사용은 백신의 빠른 생성이 전염병에 대응하기 위해 필요한 상황에서 특히 유리한 재교배 종자 바이러스를 얻는데 필요한 시간을 상당히 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 따라서, 본 발명의 이런 양태의 방법이 적어도 2가지의 다른 야생형 균주로부터의 또는 적어도 2가지의 야생형 균주로부터 유래되는 바이러스 유전자를 발현시키는 하나 이상의 발현 구성체를 사용하는 것은 바람직하다.

일부 구체예에서, 발현 구성체는 또한 숙주 세포에서 부수 단백질의 발현을 유발하도록 포함될 것이다. 예를 들어, 역 유전학 시스템의 부분으로서 비-바이러스 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신)를 발현시키는 것이 유리할 수 있다.

본 발명의 발현 구성체가 인플루엔자 A 바이러스 절편의 발현을 위해 사용될 때, 인플루엔자 A 바이러스 절편을 음성 선택 마커(예를 들어, cccB) 및 매우 보존된 인플루엔자 A 바이러스 유전자 말단을 포함하는 발현 구성체로 도입함으로써 발현 구성체를 발생시킬 수 있다[11]. 이것의 이점은 발현 구성체의 유전자 말단에 상보적인 말단을 가진다면, 제한 자리가 요구되지 않고 임의의 인플루엔자 A 바이러스 절편이 클로닝될 수 있다는 것이다.

세포들

본 발명은 관심의 바이러스를 만들 수 있는 임의의 진핵 또는 원핵 세포로 실행될 수 있다. 본 발명은, 예를 들어 1차 세포가 대안으로서 사용될 수 있지만 셀 라인을 전형적으로 사용할 것이다. 세포는 전형적으로 포유동물일 것이다. 적당한 포유동물 세포는, 제한되는 것은 아니지만, 햄스터, 소, 영장류(인간 및 원숭이를 포함) 및 개 세포를 포함한다. 신장세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포 등과 같은 다양한 세포 형태가 사용될 수 있다. 적당한 햄스터 세포의 예는 명칭 BHK21 또는 HKCC를 가지는 셀 라인이다. 적당한 원숭이 세포는, 예를 들어 아프리카 그린 원숭이 세포, 예칸대 Vero 셀 라인에서와 같은 신장세포이다[12-14]. 적당한 개 세포는, 예를 들어 CLDK 및 MDCK 셀 라인에서와 같은 신장세포이다.

추가의 적당한 세포는, 제한되는 것은 아니지만, CHO; 293T; BHK; MRC 5; PER.C6 [15]; FRhL2; WI-38 등을 포함한다. 적당한 세포는, 예를 들어 ATCC(American Type Cell Culture) 수집물로부터[16], Coriell Cell Repositories [17]로부터 또는 ECACC(European Collection of Cell Cultures)로부터 널리 이용가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587 하에서 다양한 다른 Vero 세포를 공급하고, 카탈로그 번호 CCL 34 하에서 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁번호 96022940 하에서 ECACC로부터 이용가능하다.

본 발명에서 사용을 위한 바람직한 세포(특히 성장하는 인플루엔자 바이러스에 대해)는 Madin Darby 개 신장으로부터 유래되는 MDCK 세포이다[18-20]. 본래의 MDCK 세포는 CCL 34로서 ATCC로부터 이용가능하다. 이들 세포 또는 다른 MDCK 세포의 유도체가 사용되는 것은 바람직하다. 이러한 유도체는, 예를 들어 현탁 배양물에서 성장을 위해 적합하게 된 MDCK 세포를 개시하는 참고문헌 18에서 설명된다(DSM ACC 2219로서 기탁된 'MDCK 33016' 또는 '33016-PF'; 또한 참고문헌 18을 참조). 추가로, 참고문헌 21은 무혈청 배양물 내 현탁액에서 성장하는 MDCK-유래 세포를 개시한다(FERM BP-7449로서 기탁된 'B-702'). 일부 구체예에서, 사용된 MDCK 셀 라인은 종양형성성일 수 있다. 또한, 비종양형성성 MDCK 세포를 사용하는 것도 포함된다. 예를 들어, 참고문헌 22는 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (ATCC PTA-6503)을 포함하는 비 종양형성성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 23은 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL 12042)를 포함하여 감염에 높은 감수성을 가지는 MDCK 세포를 개시한다.

본 발명의 방법을 실행하기 위해서 한 가지 이상의 세포 형태의 혼합물을 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 본 발명의 방법은 단일의 세포 형태, 예를 들어 단일클론 세포로 실행되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포는 단일 셀 라인으로부터 나온다. 더 나아가서, 동일한 셀 라인이 바이러스를 구제하기 위해 그리고 바이러스의 어떤 이후의 증식을 위해 사용될 수도 있다.

바람직하게는, 세포는 통상적인 오염원을 피하기 위해 혈청의 부재하에서 배양된다. 진핵 세포 배양물에 대해 다양한 무혈청 배지가 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, Iscove's 배지, 울트라 CHO 배지(BioWhittaker), EX-CELL (JRH Biosciences)). 추가로, 무단백질 배지가 사용될 수 있다(예를 들어, PF-CHO (JRH Biosciences)). 다르게는, 복제를 위한 세포가 또한 통상적인 혈청-함유 배지(예를 들어, 0.5% 내지 10% 소 태아 혈청이 있는 MEM 또는 DMEM 배지)에서 배양될 수 있다.

세포는 점착성 배양물 또는 현탁액에 있을 수 있다.

적당한 셀 라인에 대한 스크리닝

본 발명에 따라서 사용을 위한 적당한 세포는 널리 이용가능하다. 추가로, 당업계에 흔히 알려진 기술을 사용하여 추가 세포들에 대한 스크리닝이 가능하다. 예를 들어 새로운 pol I 프로모터가 확인되는 경우, 그것이 새로운 프로모터에 의한 발현을 지지할 셀 라인을 찾기 위해 바람직한 경우, 적당한 세포에 대한 스크리닝이 필요할 수 있다. 마찬가지로, 새로운 세포가 분리된다면, pol I 프로모터가 그 안에서 발현을 구동시키는 것을 확인하는 것이 필요할 수 있다.

세포를 스크리닝하기 위한 적당한 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 리포터 유전자는 관심의 pol I 프로모터의 조절하에서 클로닝될 수 있고, 구성체는 스크리닝되어야 하는 셀 라인에 트랜스펙팅될 수 있다. 이러한 실험에서, 프로모터 서열이 없는 리포터 유전자를 함유하는 구성체로 트랜스펙팅된 세포는 대조군으로서 사용될 수 있다. 따라서, 시험 샘플(예를 들어, 관심의 pol I 프로모터의 조절하에서 전이유전자를 함유하는 세포) 내 유전자의 발현이 대조군 내 발현보다 상당히 더 높은 경우(예를 들어, 시험 샘플로서 동일한 전이유전자를 함유하지만, 전이유전자가 전이유전자의 발현을 구동하기 위한 프로모터를 함유하지 않는 경우의 세포), 셀 라인은 본 발명에 따르는 프로모터와 함께 사용하기에 적당하다. 전이유전자의 발현은 예를 들어, 전이유전자 RNA를 역 전사하고 얻은 cDNA를 실시간 PCR을 받게 함으로써 측정될 수 있다. 대안으로, pol I 프로모터의 대조군 하에서 안티센스 방향으로 리포터 유전자(예를 들어, GFP, YFP, luc 등)를 클로닝하는 것이 또한 가능하다. 이러한 구성체로부터의 전사는 그 다음에 바이러스 폴리머라아제에 의해 mRNA로 전사될 수 있고 이후에 단백질로 번역될 수 있다. 따라서, 리포터 유전자를 발현시키는 임의의 세포는 리포터 유전자 생성물의 존재에 의해 용이하게 확인될 수 있다.

외래 pol I가 세포를 얻기 위해 정상적으로 발현을 구동시키지 않고, pol I 프로모터가 발현을 구동시킬 수 있는 세포를 조정하는 것이 추가로 가능하다. 이것은, 예를 들어 세포들을 보통 그것들에 대해 적당하지 않은 성장 조건을 받게 함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 단지 부착되어서 정상적으로 성장하는 셀 라인이 현탁액에서 인위적으로 수용될 수 있고 이들 조건 하에서 성장을 계속하는 세포들은 추가로 증식될 수 있다. 대안으로 예를 들어 고결합 플라스틱 배양 접시를 사용함으로써 또는 배양물에 혈청을 첨가함으로써, 보통 현탁액에서 성장하는 세포를 부착되도록 배양하는 것이 가능하다. 유사하게 무-혈청 조건 하에서 세포의 성장을 위해 보통 혈청이 필요로 되는 세포를 성장시키는 것, 또는 반대로 혈청에 무-혈청 성장에 적합하게 된 세포를 노출시키는 것이 가능하다. 그 다음에 선택된 세포들은 앞서 설명한 바와 같은 pol I 프로모터의 활성에 대해 분석될 수 있다. 이 방식으로 변경될 수 있는 적당한 성장 변수는 당업자에게 명백할 것이고, 제한되는 것은 아니지만, 온도, pH, pO₂,혈청 농도 등을 포함한다. 더 나아가, 세포들은 UV 방사와 같은 물리적 또는 화학적 처리를 받을 수 있다. 마찬가지로, 정상 배양 조건 하에서 거의 통과되지 않은 새로운 특성의 세포들에 대한 스크리닝이 가능하다.

예를 들어, 참고문헌 18은 MDCK 세포들(보통 부착)이 무-혈청 조건 하에서 현탁액 중에서 성장하기에 적합한 방법을 설명한다. 출발 세포들은 현탁액에서 성장하는 세포들을 배양하기 위해 보통 사용되는 조건하에서 롤러 보틀 내 무-혈청 배지 중에서 배양되었다. 이들 선택 조건 하에서 몇몇 경로에 따라서, 몇몇 셀 라인이 무-혈청 배지 내 현탁액에서 성장할 수 있도록 얻어졌다. 하나의 예는 33016 셀 라인이다(DSM ACC 2219로서 기탁됨). 본 발명자들은 인간 pol I 프로모터가 이들 MDCK 세포들에서 리포터 유전자의 발현을 구동시킬 수 있다는 것을 증명하였다.

RNA 폴리머라아제 I 프로모터

대부분의 역 유전학 방법은 바이러스 게놈 RNA의 전사를 구동시키기 위한 RNA 폴리머라아제 I(RNA pol I) 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 사용한다. pol I 프로모터는 많은 바이러스, 예를 들어 인플루엔자의 완전한 감염에 필요한 비변형된 5' 및 3' 말단으로 전사를 제공한다.

천연 pol I 프로모터는 2개의 분리 영역: 코어 프로모터와 위쪽의 프로모터 구성요소(UPE)를 가지는 이분성이다. 이 일반적인 유기화가 대부분의 종으로부터의 pol I 프로모터에 흔하지만, 프로모터의 실제 서열은 크게 다양하다. 코어 프로모터는 약 -45 내지 +20으로 연장하는 전사 시작점을 둘러싸고, 이는 전사를 개시하기에 충분하다. 코어 프로모터는 일반적으로 GC가 풍부하다. 코어 프로모터는 단독으로 전사를 개시하기에 충분하지만, 프로모터의 효능은 UPE에 의해 매우 많이 증가된다. UPE는 전형적으로 약 -180 내지 -107로 연장하고 이는 또한 GC가 풍부하다. 프로모터의 활성은 말단의 인핸서-유사 서열의 존재에 의해 더욱 향상될 수 있으며, 개시전 복합체를 안정화함으로써 작용할 수 있다.

pol I 프로모터의 서열은 인간, 개 및 닭을 포함하는 다양한 종에서 확인되었다. 본 발명은 숙주 세포로서 동일한 분류 목에서 유기체에 내인성이 아닌 pol I 프로모터를 사용한다. 따라서 용어 "내인성" 및 "비-내인성"은 숙주 세포 및 발현 구성체에 존재하는 pol I 프로모터에 관하여 사용된다. pol I 프로모터에서 내부-종 서열 변화는 세포에서 임의의 특정 pol I 프로모터가 내인성이든지 또는 비-내인성이든지 여부를 결정하는 것이 간단하다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명은 pol I 프로모터로서 동일한 분류 목으로부터 유래되지 않는 숙주 세포에서 RNA 발현을 위해 인간, 개 또는 닭 pol I 프로모터(예를 들어, 개 숙주 세포에서 영장류 pol I 프로모터)를 이용할 수 있다. 인실리코(in silico) 또는 실험에서 서열 비교는 어떤 특정 pol I 프로모터가 유래되는 유기체를 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, 도 10은 전사 시작 자리까지 < 60% 서열 동일성을 가지는 개 및 인간 pol 프로모터의 배열을 나타낸다.

본 발명의 발현 구성체는 적어도 하나의 코어 프로모터를 포함하며; 바람직하게는 그것들은 또한 적어도 하나의 UPE를 포함하고, 그것들은 또한 하나 이상의 인핸서 구성요소를 포함할 수 있다. 천연 프로모터의 단편을 사용하는 것이 가능하며, 단, 이들 단편은 전사를 개시할 수 있다. 예를 들어, 도 3은 전장 개 pol I 프로모터(SEQ ID NO: 3)의 서열과 전이유전자의 발현을 구동시키기에 충분한 다양한 단편을 나타낸다(또한 도 4 및 SEQ ID NO: 4 및 5를 참조). 추가로, 도 2는 인간 pol I 프로모터의 서열(SEQ ID NO: 1)과 숙주 세포에서 단독으로 전이유전자 발현에 충분한 단편을 나타낸다(도 5 및 SEQ ID NO: 2를 참조).

본 발명에 따라서 사용될 수 있는 인간 pol I 프로모터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 서열, 또는 그것의 변이체를 포함할 수 있다. 개 프로모터가 본 발명에 따라서 사용될 때, 그것은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5, 또는 그것의 변이체의 서열을 포함할 수 있다.

pol I 프로모터는 (i) 임의의 SEQ ID NO: 1 내지 5와 적어도 p% 서열 동일성을 가지는 서열, 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 1 내지 5의 임의의 단편을 포함할 수 있으며, 단, 프로모터는 관심의 숙주 세포에서 RNA-암호화 서열에 작동가능하게 연결된 전사를 개시하고 구동하는 능력을 가진다. p 값은 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 그 이상일 수 있다. 단편 그 자체는 발현을 구동시키기에 충분한 길이일 수 있고(예를 들어, SEQ ID NO: 4는 SEQ ID NO: 3의 단편이다) 단편은 다른 서열에 결합될 수 있으며, 이 결합은 발현을 구동시킬 것이다. 관심의 숙주 세포에서 발현을 구동시키는 이러한 pol I 프로모터의 능력은 프로모터의 조절하에서 안티센스 리포터 유전자로, 예를 들어 상기 설명한 분석을 사용하여 용이하게 평가될 수 있다.

바이러스 제조

추가 양태에서, 본 발명은 (i) 본원에서 설명하는 바와 같은 재조합 바이러스를 생성하는 단계, (ii) 배양 숙주를 단계 (i)에서 얻은 바이러스로 감염시키는 단계, (iii) 단계 (ii)로부터의 숙주를 배양하여 바이러스를 생성하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)에서 얻은 바이러스를 정제하는 단계 및 (선택적으로) (v) 바이러스를 백신으로 제형화하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.

세포가 본 발명의 이 양태에서 배양 숙주로서 사용된다면, 세포 배양물 조건(예를 들어, 온도, 세포 밀도, pH 값 등)이 셀 라인을 받는 넓은 범위에 걸쳐 다양하며, 사용되는 바이러스는 본 용도의 필요에 적합하게 될 수 있다는 것은 알려져 있다. 따라서 하기 정보는 거의 지침을 나타내지 않는다.

상기 언급한 바와 같이, 세포는 무-혈청 또는 무-단백질 배지에서 바람직하게 배양된다.

세포의 증식은 당업자에게 알려진 방법에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 원심분리 또는 여과와 같은 통상의 지지 방법을 사용하여 관류 시스템에서 배양될 수 있다. 게다가, 세포는 감염 전 첨가식 배양(fed-batch) 시스템에서 본 발명에 따라서 증식될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 배양 시스템은, 세포가 배치(batch) 시스템에서 처음에 배양되고, 배지 내 영양소들(또는 영양소의 부분)의 고갈은 농축된 영양소의 조절된 공급에 의해 보상되는 첨가식 배양 시스템으로서 언급된다. 감염 전 세포의 증식 동안 배지의 pH 값을 pH 6.6 내지 pH 7.8의 값 및 특히 pH 7.2 내지 pH 7.3의 값으로 조절하는 것은 유리할 수 있다. 세포의 배양은 바람직하게는 30 내지 40℃의 온도에서 일어난다. 단계 (iii)에서, 세포는 바람직하게는 30 내지 36℃ 또는 32 내지 34℃ 또는 33℃의 온도에서 배양된다. 이것은 이 온도 범위에서 감염된 세포의 인큐베이션이 백신으로 제형화될 때 개선된 효능을 초래하는 바이러스의 생성을 야기하기 때문에, 본 발명의 방법이 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위해 사용된다면 특히 바람직하다[24].

산소 분압은 감염 전 배양 동안 바람직하게는 25% 내지 95%의 값 및 특히 35% 내지 60%의 값으로 조절될 수 있다. 본 발명의 내용에서 언급되는 산소 분압에 대한 값은 공기의 포화를 기준으로 한다. 세포의 감염은 바람직하게는 배치 시스템에서 약 8-25 x 1O⁵ 세포/㎖ 또는 바람직하게는 관류 시스템에서 약 5-2O x 1O⁶ 세포/㎖의 세포 밀도로 일어난다. 세포는 10^-8 내지 10, 바람직하게는 0.0001 내지 0.5의 바이러스 투여량(MOI 값, "감염다중도"; 감염시간에서 세포 당 바이러스 단위의 수에 대응)으로 감염될 수 있다

바이러스는 배양물 또는 현탁액에 부착성인 세포에서 성장될 수 있다. 마이크로담체 배양물이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 따라서 세포들은 현탁액에서 성장을 위해 적합하게 될 수 있다.

본 발명에 따르는 방법은 또한 바이러스 또는 그것들에 의해 생기는 단백질의 수확과 분리단계를 포함한다. 바이러스 또는 단백질의 분리동안, 세포는 분리, 여과 또는 초미세여과와 같은 표준 방법에 의해 배양물 배지로부터 분리된다. 바이러스 또는 단백질은 그 다음에 기울기 원심법, 여과, 침전, 크로마토그래피 등과 같은 당업자에게 충분하게 알려진 방법에 따라서 농축된 다음, 정제된다. 바이러스가 정제 동안 또는 정제 후 불활성화되는 것은 본 발명에 따라서 바람직하다. 바이러스 불활성화는, 예를 들어 β-프로피오락톤 또는 포름알데히드에 의해 정제 과정의 임의의 시점에 일어날 수 있다.

단계 (i)에서 분리된 바이러스는 또한 단계 (ii)의 난(egg)에서 성장될 수 있다. 백신에 대한 인플루엔자 바이러스 성장을 위한 현재 표준 방법은 난 내용물(요막 유체)로부터 정제된 바이러스를 가지는, 발육된 SPF 계란을 사용한다. 또한 난을 통해 바이러스를 통과시키고 이후에 세포 배양물에서 증식시키는 것이 가능하다.

바이러스

본 발명의 방법은 세포에서 역 유전학에 의해 발현될 수 있는 임의의 바이러스에 의해 실행될 수 있다. 이러한 바이러스는 분절 또는 비-분절된 바이러스 일 수 있다. 추가로, 바이러스는 양성가닥 RNA 바이러스 또는 음성가닥 바이러스일 수 있다. 추가 구체예에서, 바이러스는 또한 이중 가닥 RNA 바이러스 일 수 있다.

바이러스가 음성가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 뉴모비리나에(Pneumovirinae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 보르나비리다에(Bornaviridae), 오르소믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 분야비리다에(Bunyaviridae), 또는 아레나비리다에(Arenaviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과(family)로부터 나온다. 추가로, 바이러스는 파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 오르소믹소바이러스(Orthomyxovirus), 레스피로바이러스(Respirovirus), 모르빌리바이러스(Morbillivirus), 루불라바이러스(Rubulavirus), 헤니파바이러스(Henipavirus), 아불라바이러스(Avulavirus), 뉴모바이러스(Pneumovirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 베시클로바이러스(Vesiculovirus), 리사바이러스(Lyssavirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 사이토르하브도바이러스(Cytorhabdovirus), 뉴클레오하브도바이러스(Nucleorhabdovirus), 노비르하브도바이러스(Novirhabdovirus), 마르부르그바이러스(Marburgvirus), 에볼라바이러스(Ebolavirus), 보르나바이러스(Bornavirus), 인플루엔자바이러스 A(Influenzavirus A), 인플루엔자바이러스 B(Influenzavirus B), 인플루엔자바이러스 C(Influenzavirus C), 토고토바이러스(Thogotovirus), 이사바이러스(Isavirus), 오르소분야바이러스(Orthobunyavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 나이로바이러스(Nairovirus), 프레보바이러스(Phlebovirus), 토스포바이러스(Tospovirus), 아레나바이러스(Arenavirus), 오피오바이러스(Ophiovirus), 테누이바이러스(Tenuivirus), 또는 델타바이러스(Deltavirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스이다. 특정 구체예에서, 음성가닥 RNA 바이러스는 센다이 바이러스(Sendai virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 멈프스 바이러스(Mumps virus), 헨드라 바이러스(Hendra virus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus), 인간 호흡기세포융합바이러스(Human respiratory syncytial virus), 조류 뉴모바이러스(Avian pneumovirus), 수포성 구내염 인디아나 바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus), 광견병 바이러스, 소 유행열 바이러스(Bovine ephemeral fever virus), 레터스 네크로틱 옐로 바이러스(Lettuce necrotic yellows virus), 감자 황고병 바이러스(Potato yellow dwarf virus), 감염성 조혈 괴사 바이러스(Infectious hematopoietic necrosis virus), 빅토리아호 마르부르그바이러스(Lake Victoria marburgvirus), 자이르 에볼라 바이러스(Zaire ebolavirus), 보르나병 바이러스(Borna disease virus), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 토고토 바이러스(Thogoto virus), 감염성 연어 패혈 바이러스(infectious salmon anemia virus), 부니암웨라바이러스(Bunyamwera virus), 한탄 바이러스(Hantaan virus), 두그베 바이러스(Dugbe virus), 리프트 밸리열 바이러스(Rift Valley fever virus), 토마토 반점 윌트 바이러스(Tomato spotted wilt virus), 림프구성 맥락수막염바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus), 시트러스 소로시스 바이러스(Citrus psorosis virus), 벼줄무늬잎마름병바이러스(Rice stripe virus) 및 델타 간염 바이러스(Hepatitis delta virus)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다(하기 참조).

바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 아르테리비리데(Arteriviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 피코르나비리다에(Picornaviridae) 및 로니비리다에(Picornaviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과로부터 나온다. 추가로, 바이러스는 아테리바이러스(Arterivirius), 코로나바이러스(Coronavirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 토로바이러스(Torovirus), 오카바이러스(Okavirus), 리노바이러스(Rhinovirus), 헤파토바이러스(Hepatovirus), 카르디오바이러스(Cardiovirus), 아프토바이러스(Aphthovirus), 파레코바이러스(Parechovirus), 에르보바이러스(Erbovirus), 코부바이러스(Kobuvirus) 및 테스코바이러스(Teschovirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스 일 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스, 폴리오 바이러스, 인간 엔테로바이러스 A(HEV-A), 인간 엔테로바이러스 B(HEV-B), 인간 엔테로바이러스 C, 인간 엔테로바이러스 D, A형 간염 및 인간 리노바이러스 A 및 B로 구성되는 군으로부터 선택된다.

바이러스가 이중가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 비르나비리다에(Birnaviridae), 시스토비리다에(Cystoviridae), 히포비리다에(Hypoviridae), 파르티티비리다에(Partitiviridae), 레오비리다에(Reoviridae) 및 토티비리다에(Totiviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과로부터 나올 수 있다. 추가로, 바이러스는 아쿠아비르나바이러스(Aquabirnavirus), 아비비르나바이러스(Avibirnavirus), 엔토모비르나바이러스(Entomobirnavirus), 시스토바이러스(Cystovirus), 파르티티바이러스(Partitivirus), 알파크립토바이러스(Alphacryptovirus), 베타크립토바이러스(Betacryptovirus), 아쿠아레오바이러스(Aquareovirus), 콜티바이러스(Coltivirus), 시포바이러스(Cypovirus), 피지바이러스(Fijivirus), 이드노레오바이러스(Idnoreovirus), 미코레오바이러스(Mycoreovirus), 오르비바이러스(Orbivirus), 오르소레오바이러스(Orthoreovirus), 오리자바이러스(Oryzavirus), 피토레오바이러스(Phytoreovirus), 로타바이러스(Rotavirus) 및 세아도르나바이러스(Seadornavirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스 일 수 있다.

본 발명은 빠른 돌연변이를 겪는 바이러스에 특히 적당하며 재조합 접근은 이후에 추가로 증식되어 적당한 백신을 얻을 수 있는 바이러스의 더 빠른 분리를 허용한다. 따라서, 바람직한 구체예에서 바이러스는 인플루엔자이다.

인플루엔자 바이러스

인플루엔자 바이러스는 본 발명의 방법에서 사용에 특히 적당하며, 이 바이러스에 대한 역 유전학으로서 특히 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스가 잘 특성화되어 있었다. 인플루엔자 바이러스는 분절된 음성 가닥 RNA 바이러스이다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 8개의 절편을 가지는 반면, 인플루엔자 C 바이러스는 7개를 가진다. 바이러스는 복제와 전사를 개시하기 위해 적어도 4개의 바이러스 단백질(PB1, PB2, PA 및 뉴클레오단백질)을 필요로 한다.

인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대한 역 유전학은 12개의 플라스미드로 실행되어 2개의 요구되는 단백질과 모든 8개의 게놈 절편을 발현시킬 수 있다. 그러나 구성체의 수를 감소시키기 위해, 복수의 RNA 폴리머라아제 I 전사 카세트(바이러스 RNA 합성에 대해)가 단일 플라스미드(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8개의 인플루엔자 vRNA 절편을 암호화하는 서열), 및 다른 플라스미드에서 RNA 폴리머라아제 II 프로모터를 가지는 복수의 단백질-코딩 영역(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 인플루엔자 mRNA 전사를 암호화하는 서열)에 포함될 수 있다[25]. 또한 동일 플라스미드 상에서 pol I 프로모터의 조절하에 하나 이상의 인플루엔자 vRNA 절편 및 다른 프로모터, 특히 pol II 프로모터의 조절하에 하나 이상의 인플루엔자 단백질 코딩 영역을 포함하는 것이 가능하다. 상기 설명한 바와 같이, 이는 바람직하게는 양-방향성 플라스미드에 의해 행해진다. 참고문헌 25 방법의 바람직한 양태는: (a) 단일 플라스미드 상의 PB1, PB2 및 PA mRNA-암호화 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 상에서 모든 8개 vRNA 암호화 절편을 수반한다. 하나의 플라스미드 상에서 뉴라미니다아제(NA) 및 헤마글루티닌(HA) 절편을 포함하고 다른 플라스미드에서 6개의 다른 절편을 포함하는 것은 새롭게 나타난 인플루엔자 바이러스 주가 보통 NA 및/또는 HA 절편에서 돌연변이를 가지기 때문에 특히 바람직하다. 따라서 이 구체예에서, 단지 HA 및 NA 서열을 포함하는 벡터가 치환되어야할 필요가 있다.

인플루엔자 A 바이러스에 대한 바람직한 발현 시스템은 복수의 다른 야생형 균주로부터 유래되는 게놈 절편을 암호화한다. 시스템은 PR/8/34 균주(A/Puerto Rico/8/34)로부터 1개 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개) 게놈 절편을 암호화할 수 있지만, 보통 이것/이것들은 PR/8/34 HA 절편을 포함하지 않을 것이고 보통 PR/8/34 NA 절편을 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 PR/8/34로부터의 절편들 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 적어도 하나(가능하게는 6개 모두)를 암호화할 수 있다.

인플루엔자 A 바이러스에 대해 다른 유용한 발현 시스템은 AA/6/60 인플루엔자 바이러스(A/Ann Arbor/6/60)로부터의 1개 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) 게놈 절편을 암호화할 수 있지만, 보통 이것/이것들은 AA/6/60 HA 절편을 포함하지 않을 것이고 보통 AA/6/60 NA 절편을 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 AA/6/60로부터의 절편들 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 적어도 하나(가능하게는 6개 모두)를 암호화할 수 있다.

시스템은 A/California/4/09 균주, 예를 들어 HA 절편 및/또는 NA 절편으로부터 하나 이상의 게놈 절편을 암호화할 수 있다. 따라서, 예를 들어, HA 유전자 절편은 SEQ ID NO: 7보다 SEQ ID NO: 6에 대해 더욱 밀접한(즉, 동일한 알고리즘과 변수를 사용하여 SEQ ID NO: 6를 SEQ ID NO: 7와 비교할 때 더 높은 정도의 서열을 가진다) H1 헤마글루티닌을 암호화할 수 있다. SEQ ID NO: 6 및 7은 80% 동일성을 가진다. 유사하게는, NA 유전자는 SEQ ID NO: 9보다 SEQ ID NO: 8과 더욱 밀접하게 관련되는 N1 뉴라미니다아제를 암호화할 수 있다. SEQ ID NO: 8 및 9는 82% 동일성이 있다.

인플루엔자 B 바이러스에 대한 발현 시스템은 복수의 다른 야생형 균주로부터 유래하는 게놈 절편을 암호화할 수 있다. 시스템은 AA/1/66 인플루엔자 바이러스 (B/Ann Arbor/1/66)로부터의 1개 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) 게놈 절편을 암호화할 수 있지만, 보통 이것/이것들은 AA/1/66 HA 절편을 포함하지 않을 것이고 보통 AA/1/66 NA 절편을 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 AA/1/66로부터의 적어도 하나의 절편 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2를 암호화할 수 있다.

A/PR/8/34, AA/6/60, AA/1/66, A/Chile/1/83 및 A/California/04/09 균주로부터의 바이러스 절편 및 서열은 널리 이용가능하다. 그것의 서열은 공용 데이터베이스, 예를 들어, GI:89779337, GI89779334, GI:89779332, GI:89779320, GI:89779327, GL89779325, GI:89779322, GI89779329에서 이용가능하다. 인플루엔자 바이러스에 대한 역 유전학 시스템은 숙주 세포에서 부수 단백질의 발현을 유발하는 발현 구성체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비-바이러스 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신)를 발현시키는 것은 유리할 수 있다.

백신

본 발명의 제3 양태의 방법은 백신을 만드는 방법에 따라서 생성된 바이러스를 이용한다.

백신(특히 인플루엔자 바이러스에 대해)은 일반적으로 생 바이러스 또는 불활성화 바이러스 중 하나를 기반으로 한다. 불활성화 백신은 전 비리온, '스플리트' 비리온, 또는 정제된 표면 항원을 기반으로 할 수 있다. 항원들은 또한 바이로좀의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 임의의 이들 종류의 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

불활성화 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전 비리온, 스플리트 비리온, 또는 정제된 표면 항원(인플루엔자에 대해, 헤마글루티닌을 포함하고, 보통 뉴라미니다아제를 포함한다)을 포함할 수 있다. 바이러스를 불활성화하기 위한 화학적 수단은 하나 이상의 하기 약제의 유효량으로 처리를 포함한다: 세정제, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌(C60), 바이너리 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 그것의 조합. 바이러스 불활성화의 비-화학적 방법은, 예를 들어 UV 광 또는 감마 조사와 같이 당업계에 공지되어 있다.

비리온은 바이러스-함유 유체, 예를 들어 요막액 또는 세포 배양물 상청액으로부터 다양한 방법에 의해 수확될 수 있다. 예를 들어, 정제 과정은 비리온을 붕괴하는 세정제를 포함하는 선형 수크로오스 기울기 용액을 사용하는 띠원심분리를 수반할 수 있다. 항원은 그 다음에 선택적 희석 후 투석여과에 의해 정제될 수 있다.

스플리트 비리온은 세제(예를 들어, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, Triton X-100, Triton N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, Tergitol NP9, 등)로 정제된 비리온을 처리하여 서브비리온 제제를 생산함으로써 얻어지고, 'Tween-에테르'를 스플리팅 과정을 포함한다. 인플루엔자 바이러스의 스플리팅 방법은, 예를 들어 당업계에 잘 알려져 있다, 예를 들어 참고문헌 26-31 등 참조. 바이러스의 스플리팅은 스플리팅 약제의 붕괴 농도로 감염성이든 비-감염성이든 전체 바이러스를 붕괴 또는 단편화함으로써 수행된다. 붕괴는 바이러스 단백질의 전체 또는 부분적인 용해화를 초래하여 바이러스의 일체성을 변경시킨다. 바람직한 스플리팅 약제는 비-이온성 및 이온성 (예를 들어, 양이온성) 계면활성제, 예를 들어, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실 당, 술포베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, NP9, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, 세타블론, 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예를 들어, Triton X-100 또는 Triton N101과 같은 Triton 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등이다. 하나의 유용한 스플리팅 과정은 데옥시콜산 나트륨 및 포름알데히드의 연속적인 효과를 사용하고, 스플리팅은 처음의 비리온 정제 동안(예를 들어, 수크로오스 밀도 기울기 용액에서) 일어날 수 있다. 따라서 스플리팅 과정은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질을 제거하기 위함), 수확한 비리온의 농축(예를 들어, CaHPO₄ 흡착과 같은 흡착 방법을 사용함), 비-비리온 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 기울기 원심분리 단계에서 스플리팅 약제를 사용하는 비리온의 스플리팅(예를 들어, 데옥시콜산 나트륨과 같은 스플리팅 약제를 함유하는 수크로오스 기울기를 사용), 이어서 원치않는 물질을 제거하기 위한 여과(예를 들어, 초미세여과)를 수반할 수 있다. 스플리트 비리온은 인산나트륨-완충된 등장 염화나트륨 용액에서 유용하게 재현탁될 수 있다. 스플리트 인플루엔자 백신의 예는 BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품이다.

본 발명의 방법은 또한 생 백신을 만들기 위해 사용될 수 있다. 이러한 백신은 보통 비리온-함유 유체로부터 비리온을 정제함으로써 제조된다. 예를 들어, 유체는 원심분리에 의해 맑아지고 버퍼(예를 들어, 수크로오스, 인산칼륨, 및 글루탐산모노나트륨을 함유)로 안정화될 수 있다. 다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신이 현재 이용가능하다(예를 들어, 참고문헌 32의 17 & 18 장 참조). 생 바이러스 백신은 Medlmmune's FLUMIST™ 제품을 포함한다(3가 생 바이러스 백신).

정제된 인플루엔자 바이러스 표면 항원 백신은 표면 항원 헤마글루티닌, 및 또한 전형적으로 뉴라미니다아제를 포함한다. 정제된 형태로 이들 단백질을 제조하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 인플루엔자 서브유닛 백신이다.

다른 형태의 불활성화 항원은 바이로좀이다[33](무 핵산 바이러스 유사 리포좀 입자). 바이로좀은 세정제로 바이러스의 용해화와 이어서 뉴클레오캡시드의 제거 및 바이러스 글리코단백질을 함유하는 막의 복원에 의해 제조될 수 있다. 바이로좀을 제조하기 위한 또 다른 방법은 과량의 인지질에 바이러스 막 글리코단백질을 첨가하여 그것의 막에서 바이러스 단백질을 갖는 리포좀을 제공하는 단계를 수반한다.

바이러스는 약화될 수 있다. 바이러스는 온도-민감성일 수 있다. 바이러스는 저온-적응될 수 있다. 이들 3가지 특징들은 항원으로서 생 바이러스를 사용할 때 특히 유용하다.

HA는 현재 불활성화 인플루엔자 백신에서 주요 면역원이고, 백신 투여량은 SRID에 의해 전형적으로 측정되는 HA 수준에 대해 표준화되어 있다. 예를 들어, 어린이 또는 유행병 상황에서, 또는 보조제를 사용할 때 더 낮은 투여량이 사용될 수 있지만, 현존하는 백신은 균주 당 약 15㎍의 HA를 함유한다. 더 높은 용량(예를 들어 3x 또는 9x 투여량[34,35])이 사용된 것과 같이, ¹/₂(즉, 균주 당 7.5㎍ HA), ¹/₄ 및 ¹/₈ 과 같은 분할 용량이 사용되었다. 따라서 백신은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 150㎍, 바람직하게는 0.1 내지 50㎍, 예를 들어 0.1-20㎍, 0.1-15㎍, 0.1-1O㎍, 0.1-7.5㎍, 0.5-5㎍ 등의 HA를 포함할 수 있다. 특정 용량은 균주 당, 예를 들어, 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 3.75, 약 1.9, 약 1.5 등을 포함한다.

생 백신에 대해, 용량은 HA 함량보다 오히려 중앙 조직 배양물 감염 용량(TCID₅₀)에 의해 측정되고, 균주 당 10⁶ 내지 10⁸ (바람직하게는 10^6.5-10^7.5)의 TCID₅₀이 전형적이다.

본 발명으로 사용되는 인플루엔자 균주는 야생형 바이러스에서 발견되는 바와 같은 천연 HA 또는 변형된 HA를 가질 수 있다. 예를 들어, 조류 종에서 매우 병원성이 되는 바이러스를 야기하는 결정 요인(예를 들어, HA1/HA2 절단 자리 주변의 과-염기성 영역)을 제거하기 위한 HA를 변형시키는 것은 알려져 있다. 역 유전학의 사용은 이러한 변형을 가능하게 한다.

백신에서 사용을 위한 인플루엔자 바이러스 주는 계절마다 변화한다. 유행기간 사이에, 백신은 전형적으로 2가지의 인플루엔자 A 균주(H1N1 및 H3N2) 및 한 가지의 인플루엔자 B 균주를 포함하며, 3가의 백신이 전형적이다. 본 발명은 또한 H2, H5, H7 또는 H9 서브타입 균주와 같은 유행의 바이러스 주(즉, 백신 수용자 및 일반적인 인간 집단이 면역학적으로 나이브(naive)한 균주, 특히 인플루엔자 A 바이러스)를 사용할 수 있고, 유행의 균주에 대한 인플루엔자 백신은 1가일 수 있고 또는 유행 균주에 의해 보충되는 정상적인 3가의 백신을 기초로 할 수 있다. 그러나, 계절과 백신에 포함되는 항원의 특성에 의존하여, 본 발명은 하나 이상의 HA 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16에 대해 예방할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9에 대해서 예방할 수 있다.

게다가 유행기 사이의 균주에 대한 면역화에 적당할뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 유행성 또는 잠재적으로-유행성인 균주에 대한 면역화를 위해 특히 유용하다. 유행성의 발생을 야기하는 가능성을 제공하는 인플루엔자 균주의 특성은: (a) 현재-순환하는 인간 균주에서 헤마글루티닌과 비교하여 새로운 헤마글루티닌, 즉, 십년 이상 동안 인간 집단에서 드러나지 않았던 것(예를 들어, H2) 또는 이전에 인간 집단에서 전혀 보이지 않았던 것(예를 들어, 단지 새 집단에서만 일반적으로 발견된 H5, H6 또는 H9)을 함유하여, 인간 집단은 균주의 헤마글루티닌에 면역적으로 나이브하게 된다는 것이고; (b) 인간 집단에서 수평으로 전달될 수 있다는 것이고; (c) 인간에게 병원성이라는 것이다. H5 헤마글루티닌 형을 가지는 바이러스는 H5N1 균주와 같은 유행성 인플루엔자에 대한 면역화를 위해 바람직하다. 다른 가능한 균주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 및 어떤 다른 출현하는 잠재적으로 유행성인 균주를 포함한다. 본 발명은 비-인간 동물 집단 내지 인간, 예를 들어, 돼지-기원 H1N1 인플루엔자 균주를 퍼뜨릴 수 있는 또는 퍼진 잠재적인 유행성 바이러스 주에 대한 예방에 특히 적당하다. 본 발명은 이어서 비-인간 동물 뿐만 아니라 인간에게 백신 접종하기에 적당하다.

항원이 유용하게 본 조성물에 포함될 수 있는 다른 균주들은 저항성 유행성 균주[37]를 포함하는 항바이러스 치료에 저항성인(예를 들어, 오셀타미비르(oseltamivir)[36] 및/또는 자나미비르(zanamivir)에 저항성인) 균주이다.

본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는 하나 이상의(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 그 이상) 인플루엔자 바이러스 주로부터의 항원(들)을 포함할 수 있다. 백신이 하나 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우, 다른 균주들은 전형적으로 별개로 성장되고 바이러스가 수확되고 항원이 제조된 후 혼합되었다. 따라서 본 발명의 과정은 하나 이상의 인플루에자 균주로부터의 항원들을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 2가지의 인플루엔자 A 바이러스 주와 한 가지의 인플루엔자 B 바이러스 주로부터의 항원을 포함하는 3가의 백신이 전형적이다. 4가의 백신도 또한 유용하다. 2가지의 인플루엔자 A 바이러스 주와 2가지의 인플루엔자 B 바이러스 주, 또는 3가지 인플루엔자 A 바이러스 주와 한가지 인플루엔자 B 바이러스 주를 포함하는 4가의 백신이 또한 유용하다[38].

약제학적 조성물

본 발명에 따라서 제조되는 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능하다. 그것들은 보통 항원들에 더하여 성분을 포함하며, 예를 들어, 전형적으로 한 가지 이상의 약제학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 하기 설명하는 바와 같이, 보조제가 또한 포함될 수 있다. 이러한 성분의 철저한 논의는 참고문헌 39에서 이용가능하다.

백신 조성물은 일반적으로 수성 형태일 것이다. 그러나, 일부 백신은 건조 형태, 예를 들어 주사 가능한 고체 또는 패치 상의 건조된 또는 중합화된 제제의 형태일 수 있다.

백신 조성물은 티메로살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나, 수은함유 물질이 실질적으로 없는(즉, 5㎍/㎖ 미만), 예를 들어, 무-티메로살이어야 한다[30,40]. 수은을 함유하지 않는 백신이 더 바람직하다. α-토코페롤 숙시네이트는 수은 화합물에 대한 대안으로서 포함될 수 있다[30]. 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하다.

등장성을 조절하기 위해, 나트륨 염과 같은 생리적 염을 포함하는 것을 바람직하다. 1 내지 20mg/㎖에서 존재할 수 있는 염화나트륨(NaCl)이 바람직하다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산2나트륨 탈수화물, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.

백신 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg의 삼투압을 가질 것이고, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위에 있을 것이다. 삼투압은 백신접종에 의해 야기되는 통증에 영향을 미치지 않는 것으로 이전에 보고되었지만[41], 그럼에도 이 범위의 삼투압을 유지하는 것은 바람직하다.

백신 조성물은 하나 이상의 버퍼를 포함할 수 있다. 전형적인 버퍼는 포스페이트 버퍼; Tris 버퍼; 보레이트 버퍼; 숙시네이트 버퍼; 히스티딘 버퍼(특히 알루미늄 히드록시드 보조제와 함께); 또는 시트레이트 버퍼를 포함할 수 있다. 버퍼는 전형적으로 5-2OmM의 범위에 포함될 것이다.

백신 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 및 더 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8에 있을 것이다. 본 발명의 과정은 따라서 패키징 전에 벌크 백신의 pH를 조절하는 단계를 포함할 수 있다.

백신 조성물은 바람직하게는 멸균이다. 백신 조성물은 예를 들어, 용량 당 <1 EU (엔도톡신 단위, 표준 측정), 및 바람직하게는 용량 당 <0.1 EU를 함유하여 바람직하게는 비-발열성이다. 백신 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.

본 발명의 백신 조성물은 특히 스플리트 또는 표면 항원 백신에 대해 세제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('Tweens'로서 알려짐), 옥톡시놀(예컨대 옥토시놀-9(Triton X-1OO) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드('CTAB'), 또는 데옥시콜산 나트륨을 포함할 수 있다. 세제는 단지 미량으로 존재할 수 있다. 따라서 백신은 각각 1mg/㎖ 미만의 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 미량의 다른 잔여 성분들은 항생제일 수 있다(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B).

백신 조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있고 또는 다수회 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있다(즉, '다수회 투여' 키트). 보존제의 포함은 다회투여 배치가 바람직하다. 다수회 투여 조성물에서 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서(또는 더하여), 조성물은 물질의 제거를 위한 무균성 어댑터를 가지는 용기에 함유될 수 있다.

인플루엔자 백신은 절반의 용량(즉, 약 0.25㎖)이 어린이에게 투여될 수도 있지만, 전형적으로 약 0.5㎖의 투약 부피로 투여된다.

조성물과 키트는 바람직하게는 2℃ 내지 8℃에서 저장된다. 그것들은 냉동되어서는 안 된다. 그것들은 이상적으로는 직사광선 밖에서 유지되어야 한다.

숙주 세포 DNA

바이러스가 셀 라인에서 분리되고 및/또는 성장된다면, DNA의 어떤 종양 유발 활성을 최소화하기 위해 최종 백신의 잔여 셀 라인 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 실행이다.

따라서 본 발명에 따라서 제조되는 백신 조성물은 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수 있지만, 바람직하게는 투여량 당 잔여 숙주 세포 DNA의 10ng 미만(바람직하게는 1ng 미만, 및 더 바람직하게는 100pg 미만)을 함유한다.

임의의 잔여 숙주 세포 DNA의 평균 길이가 500bp 미만, 예를 들어 400bp 미만, 300bp 미만, 200bp 미만, 100 bp 미만 등인 것이 바람직하다.

DNA를 오염시키는 것은 표준 정제 과정, 예를 들어 크로마토그래피 등을 사용하여 백신 제조 동안 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는 예를 들어, DNase를 사용함으로써 뉴클레아제 처리에 의해 향상될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키는 편리한 방법은 바이러스 성장 동안 사용될 수 있는 DNase(예를 들어, 벤조나아제)를 사용하는 단계, 다음에 비리온 파괴 동안 사용될 수 있는 양이온성 세제(예를 들어, CTAB)를 사용하는 단계의 2-단계 처리를 수반하는 참고문헌 42 & 43에서 개시된다. β-프로피올락톤과 같은 알킬화제로 처리는 또한 숙주 세포 DNA를 제거하기 위해 사용될 수 있고, 유리하게는 또한 비리온을 불활성하기 위해 사용될 수 있다[44].

보조제

본 발명의 조성물은 유리하게는 조성물을 투여받는 피험자에서 유발되는 면역 반응(체액 및/또는 세포내)을 향상시키는 작용을 할 수 있는 보조제를 포함할 수 있다. 바람직한 보조제는 수중유 에멀젼을 포함한다. 바람직한 보조제는 수중유 에멀젼을 포함한다. 다양한 이러한 보조제가 알려져 있으며, 그것들은 전형적으로 생체분해가능하고(대사적으로 안정하고) 생체에 적합한 오일(들)과 계면활성제(들)로 적어도 한 가지의 오일 및 적어도 한 가지의 계면활성제를 포함한다. 에멀젼 내 오일 방울은 일반적으로 직경이 5μm 미만이고, 이상적으로 서브-마이크론 직경을 가지며, 이런 작은 크기는 극소 액체화기로 달성되어 안정한 에멀젼을 제공한다. 220nm 미만의 크기를 가지는 방울들은 그것들이 여과살균을 받을 수 있기 때문에 바람직하다.

에멀젼은 오일, 예컨대, 동물(예컨대, 어류) 또는 식물성 공급원으로부터의 오일을 포함할 수 있다. 식물성 오일에 대한 공급원은, 견과, 종자 및 곡류를 포함한다. 땅콩 오일, 대두 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일, 가장 흔하게 이용가능한 견과 오일을 예시한다. 예를 들어, 호호바 콩으로부터 얻은 호호바 오일이 사용될 수 있다. 종자 오일은 홍화오일, 면실 오일, 해바라기 씨 오일, 참깨 종자 오일 등을 포함한다. 곡물 군에서, 옥수수 오일은 가장 용이하게 이용가능하지만, 다른 곡물, 예컨대, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프(teff), 라이밀 등의 오일이 또한 사용될 수 있다. 종자 오일에서 자연적으로 발생하지 않는 글리세롤과 1,2-프로판디올의 6-10개 탄소 지방산 에스테르는 견과 및 종자 오일로부터 출발하는 적합한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유동물 우유로부터의 지방과 오일은 대사가능하고 따라서 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 동물 공급원으로부터 순수한 오일을 얻기 위해 필요한 분리, 정제, 비누화 및 다른 수단을 위한 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. 대부분의 어류는 용이하게 회수될 수 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들어, 대구 간유, 상어 간유, 및 경랍과 같은 고래 오일은 본원에서 사용될 수 있는 몇몇 어류 오일을 예시한다. 다수의 분지쇄 오일은 5-탄소 이소프렌 단위로 생화학적으로 합성되고 일반적으로 테르피노이드로서 언급된다. 상어 간유는 본원에서 특히 바람직한, 스쿠알렌으로서 알려진 분지된, 불포화된 테르피노이드 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔을 함유한다. 스쿠알렌, 스쿠알렌에서 포화된 유사체는 또한 바람직한 오일이다. 스쿠알렌을 포함하는 어류 오일 및 스쿠알렌은 상업적 공급원으로부터 용이하게 이용가능하고 또는 당업계에 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있다. 다른 바람직한 오일은 α-토코페롤이다(하기 참조).

오일의 혼합물이 사용될 수 있다.

계면활성제는 그것의 'HLB'에 의해 분류될 수 있다(친수성/친유성 밸런스). 본 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 및 더 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 가진다. 본 발명은, 제한되는 것은 아니지만, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제(흔히 Tweens로서 언급됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 에틸렌 옥사이드(EO), 프로필렌 옥사이드(PO), 및/또는 부틸렌 옥사이드(BO), DOWFAX™ 상표명 하의 고체, 예컨대 선형 EO/PO 차단 공중합체; 특정 관심의 옥톡시놀-9 (Triton X-100, 또는 t-옥틸펜옥시폴리에톡시에탄올)과 함께 반복되는 에톡시(옥시-1,2-에탄디일) 기의 수로 다양할 수 있는 옥톡시놀; (옥틸펜옥시)폴리에톡시에탄올(IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린(레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예컨대 Tergitol™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(Brij 계면활성제로서 알려짐), 예컨대, 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르(흔히 SPAN으로서 알려짐), 예컨대, 소르비탄 트리올레이트(Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함한다. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), Span 85 (소르비탄 트리올레이트), 레시틴 및 Triton X-1OO이다.

계면활성제의 혼합물은 예를 들어, Tween 80/Span 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Tween 80)와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 t-옥틸펜옥시폴리에톡시에탄올(Triton X-100)의 조합이 또한 적당하다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9 + 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.

바람직한 계면활성제의 양(중량%)은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예컨대 Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1 %; 옥틸- 또는 노닐펜옥시 폴리옥시에탄올(예컨대 Triton X-100, 또는 Triton 시리즈의 다른 세제) 0.001 내지 0.1 %, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르(예컨대 라우레스 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 및 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%이다.

백신이 스플리트 바이러스를 함유하는 경우, 수층에 계면활성제가 없는 것이 바람직하다. 이는 무 계면활성제는 항원에서 '스플리팅 효과'를 발휘하여, 달리 존재할 수 있는 임의의 비스플리트 비리온 및/또는 비리온 덩어리들을 방해하기 때문에 유리하다. 이것은 스플리트 바이러스 백신의 안전성을 개선시킬 수 있다[45].

바람직한 에멀젼은 < 1 μm, 예를 들어 ≤750nm, ≤500nm, ≤400nm, ≤300nm, ≤250nm, ≤220nm, ≤200nm, 또는 그 미만의 평균 방울 크기를 가진다. 이들 방울 크기는 미세유체화와 같은 기술에 의해 통상적으로 달성될 수 있다.

본 발명에 유용한 특정 수중유 에멀젼 보조제는, 제한되는 것은 아니지만:

● 스쿠알렌, Tween 80, 및 Span 85의 서브마이크론 에멀젼. 에멀젼의 조성물은 약 5부피% 스쿠알렌, 약 0.5부피% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85일 수 있다. 중량조건에서, 이들 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85이다. 이 보조제는 참고문헌 49의 Chapter 10 및 참고문헌 50의 Chapter 12에서 더욱 상세하게 설명되는 'MF59'로서 알려져 있다[46-48]. MF59 에멀젼은 유리하게는 시트레이트 이온, 예를 들어, 1OmM 시트르산나트륨 버퍼를 포함한다.

● 스쿠알렌, DL-α-토코페롤, 및 폴리소르베이트 80 (Tween 80)의 에멀젼. 에멀젼은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 그것은 또한 Span 85 (예를 들어, 1 %로) 및/또는 레시틴을 포함할 수 있다. 이들 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% Tween 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 이것이 더욱 안정한 에멀젼을 제공하기 때문에 바람직하게는 ≤ 1이다. 스쿠알렌과 Tween 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 하나의 이러한 에멀젼은 PBS 중에서 Tween 80을 용해하여 2% 용액을 제공한 다음, 90㎖의 이 용액과 (5g의 DL-α-토코페롤과 5㎖ 스쿠알렌)의 혼합물을 혼합함으로써 만들어질 수 있다. 결과된 에멀젼은 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm의 평균 직경으로 서브마이크론 오일 방울을 가질 수 있다. 에멀젼은 또한 3-탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3d-MPL)를 포함할 수 있다. 다른 유용한 이 종류의 에멀젼은, 인간 투여 용량 당, 0.5-10 mg 스쿠알렌, 0.5-11 mg 토코페롤, 및 0.1-4 mg 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다[51].

● 스쿠알렌, 토코페롤 및 Triton 세제(예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀젼은 인산염 완충액을 함유할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀젼은 인산 완충액을 함유할 수 있다.

● 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제(예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤(예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 이들 3가지 성분을 약 75 : 11 : 10 (예를 들어, 750㎍/㎖ 폴리소르베이트 80, 11O㎍/㎖ Triton X-100 및 1OO㎍/㎖ α-토코페롤 숙시네이트)의 중량 비율로 포함할 수 있고, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 어떤 기여를 포함하여야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 수층은 인산염 완충액을 함유할 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401 ("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 에멀젼은 인산염 완충 식염수, pH 7.4에서 제형화될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이고, "SAF-1" 보조제에서 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다[52](0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 이는 또한 "AF" 보조제에서와 같이, Thr-MDP 없이 사용될 수 있다[53] (5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미세유체화가 바람직하다.

● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올레이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는 열가역적이고 및/또는 200 nm 미만의 크기를 가지는 적어도 90% 오일 방울(부피)를 가진다[54]. 에멀젼은 또한 하나 이상의 알디톨; 동결방지제(예를 들어, 도데실말토사이드 및/또는 수크로오스와 같은 당); 및/또는 알킬폴리글리코시드를 포함할 수 있다. 에멀젼은 TLR4 작용제를 포함할 수 있다[55]. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.

● 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼[56]. 보조제 백신에서 이들 성분의 최종 농도(중량)은 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105(플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴/카프릭 트리글리세라이드)이다.

● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 가지는 에멀젼. 참고문헌 57에서 설명된 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카르디올리핀이다. 서브마이크론 방울 크기가 유리하다.

● 비-대사가능 오일(예컨대 경유)과 적어도 하나의 계면활성제(예컨대, 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 수중유 서브마이크론. QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 콘쥬게이트(예컨대, GPI-0100, 참고문헌 58에서 설명되고, 글루쿠론산의 카르복실기를 통해 데스아실사포닌에 지방족 아민의 첨가에 의해 생성됨), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스 (2-히드록시에틸)프로판디아민과 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

● 사포닌(예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셀로서 결합되는 에멀젼[59].

● 미네랄 오일, 비-이온성 친유성 에톡실화된 지방 알코올, 및 비-이온성 친수성 계면활성제(예를 들어, 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 차단 공중합체)를 포함하는 에멀젼[60]

● 미네랄 오일, 비-이온성 친수성 에톡실화된 지방 알코올, 및 비-이온성 친유성 계면활성제(예를 들어, 에톡실화된 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 차단 공중합체)를 포함하는 에멀젼[60].

일부 구체예에서 에멀젼은 전달시 즉석에서 항원과 혼합될 수 있고, 따라서 보조제 및 항원은 포장되거나 또는 유통된 백신에서 개별적으로 유지되어, 사용시 최종 제형을 준비할 수 있다. 다른 구체예에서, 에멀젼은 제조 동안 항원과 혼합되고, 따라서 조성물은 액체 보조 형태로 포장된다. 항원은 일반적으로 백신이 최종적으로 2가지의 액체를 혼합함으로써 제조될 수 있는 수성 형태일 것이다. 혼합을 위한 2가지 액체의 부피 비는 다양할 수 있지만(예를 들어 5:1 내지 1:5) 일반적으로 약 1:1이다. 성분의 농도가 상기 설명의 특정 에멀젼에서 주어진다면, 이들 농도는 전형적으로 희석되지 않은 조성물에 대한 것이고, 따라서 항원 용액과 혼합한 후 농도는 감소할 것이다.

백신 조성물의 패키징

본 발명의 조성물(또는 키트 성분)에 대한 적당한 용기는 바이알, 주사기(예를 들어, 일회용 주사기), 비강 스프레이 등을 포함한다. 이들 용기는 멸균이어야 한다.

조성물/성분이 바이알에 위치하는 경우, 바이알은 바람직하게는 유리 또는 플라스틱 재료로 만들어진다. 바이알은 바람직하게는 조성물이 그것에 첨가되기 전에 멸균된다. 라텍스-민감성 환자에 대한 문제를 피하기 위해, 바이알은 바람직하게는 무-라텍스 마개로 밀봉되고, 모든 패키징 재료에서 라텍스의 부재는 바람직하다. 바이알은 1회 투여량의 백신을 포함할 수 있고, 또는 1 투여량 이상('다회 투여량' 바이알), 예를 들어 10회 투여량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색의 유리로 만들어진다.

바이알은 사전에 채워진 주사기가 캡에 삽입될 수 있도록 적합하게 된 캡(예를 들어, Luer lock)을 가질 수 있고, 주사기의 내용물은 바이알로 배출될 수 있고(예를 들어, 그 안에서 동결건조된 재료를 재구성하기 위함) 바이알의 내용물은 주사기로 다시 제거될 수 있다. 바이알로부터 시린지의 제거 후, 이어서 바늘이 부착될 수 있고, 조성물이 환자에게 투여될 수 있다. 캡이 들어갈 수 있기 전에 봉인 또는 커버가 제거되도록 하기 위해서, 캡은 바람직하게는 봉인 또는 커버 내에 위치된다. 바이알은, 특히 다회투여 바이알에 대해 그것의 내용물의 무균성 제거를 허용하는 캡을 가질 수 있다.

성분이 주사기에 패키징될 때, 주사기는 그것에 부착된 바늘을 가질 수 있다. 바늘이 부착되지 않는다면, 개개의 바늘은 조립과 사용을 위해 주사기와 함께 공급될 수 있다. 이러한 바늘은 피복될 수 있다. 안전한 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 주사기는 제품 번호, 인플루엔자 시즌 및 내용물의 유효기간이 인쇄되어 있어서 기록관리를 가능하게 하는 필-오프 라벨이 제공될 수 있다. 주사기의 플런저는 바람직하게는 흡입 동안 플런저가 우연히 제거되는 것을 방지하기 위한 마개를 가진다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 가질 수 있다. 일회용 주사기는 1회 투여량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 바늘의 부착 전에 팁(tip)을 밀봉하기 위한 팁 캡을 가질 것이고, 팁 캡은 바람직하게는 부틸 고무로 만들어진다. 주사기와 바늘이 개별적으로 포장된다면, 바늘은 바람직하게는 부틸 고무 실드로 맞춰진다. 바람직한 주사기는 상표명 "Tip-Lok"™ 하에서 시판되는 것이다.

용기는, 예를 들어 어린이에게 전달을 가능하게 하기 위해 절반의 투여량 부피를 나타내도록 표시될 수 있다. 예를 들어, 0.5㎖ 투여량을 함유하는 주사기는 0.25㎖ 부피를 나타내는 표시를 가질 수 있다.

유리 용기(예를 들어, 주사기 또는 바이알)이 사용된다면, 소다 석회 유리보다는 붕규산 유리로 만들어지는 유리를 사용하는 것이 바람직하다.

키트 또는 조성물은 백신의 세부사항, 예를 들어 투여를 위한 설명서, 백신 내 항원의 세부사항 등을 포함하여 전단과 함께 포장될 수 있다(예를 들어, 동일 박스에서). 설명서는 또한, 예를 들어 백신접종 등의 후 과민반응의 경우에 용이하게 이용가능한 아드레날린 용액을 유지하도록 경고를 포함할 수 있다.

치료 방법, 및 백신의 투여

본 발명은 본 방법에 따라서 제조되는 백신을 제공한다. 이들 백신 조성물은 인간 또는 돼지 같은 비-인간 동물 피험자에게 투여에 적당하며, 본 발명은 본 발명의 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 면역 반응을 상승시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 약제로서 사용을 위한 본 발명의 조성물을 제공하고, 피험자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 사용을 제공한다.

이들 방법 및 사용에 의해 상승되는 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 예방 항체 반응을 포함할 것이다. 인플루엔자 바이러스 백신접종 후 항체 반응, 중화능력 및 예방을 평가하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 혈구 응집소에 대한 항체 적정 농도가 예방과 연관성이 있음을 보여주었다(약 30-40의 혈청 샘플 적혈구 응집반응-억제 적정 농도는 상동 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 예방)[61]. 항체 반응들은 전형적으로 적혈구 응집반응 억제, 마이크로중화, 단일 라디칼 면역확산(SRID) 및/또는 단일 라디칼 용혈작용(SRH)에 의해 측정된다. 이들 분석 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 면역화 경로는 근육내 주사에 의하지만(예를 들어, 팔 또는 다리), 다른 이용가능한 경로는 피하 주사, 비강내[62-64], 경구[65], 피내[66,67], 경피성, 피부경유 [68] 등을 포함한다.

본 발명에 따라서 제조되는 백신은 어린이와 성인 둘다를 처치하는데 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재 6개월령부터 소아과와 성인 면역화에서 사용을 위해 추천된다. 따라서 인간 피험자는 1세 미만, 1-5세, 5-15세, 15-55세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신을 투여받기 위한 바람직한 피험자는 노인(예를 들어, ≥ 50세, ≥ 60세, 및 바람직하게는 ≥ 65세), 유아(예를 들어, ≤ 5세), 입원 피험자, 의료계 종사자, 무장 서비스 및 군 인사, 임산부, 만성 질환자, 면역결핍 피험자, 백신 투여받기 7일 전에 항바이러스 화합물을 취한 피험자(예를 들어, 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조), 달걀 알레르기가 있는 사람 및 해외 여행자이다. 그러나, 백신은 단지 이들 군에 대해서만 적당한 것은 아니고, 집단에서 더 일반적으로 사용될 수 있다. 유행성 균주에 대해, 모든 세대 군에 대한 투여가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 조성물은 효능에 대한 CPMP 기준의 1, 2 또는 3을 만족시킨다. 성인에서(18-60세), 이들 기준은: (1) ≥ 70% 혈청방어율; (2) ≥ 40% 혈청 전환; 및/또는 ≥ 2.5-배의 GMT 증가이다. 노인에서 ( > 60세), 이들 기준은: (1) ≥ 60% 혈청방어율; (2) ≥ 30% 혈청 전환; 및/또는 (3) ≥ 2-배의 GMT 증가이다. 이들 기준은 적어도 50명의 환자에서 개방 표지 시험 연구를 기준으로 한다.

처치는 1회 투여 스케줄 또는 다회 투여 스케줄에 의할 수 있다. 다회 투여는 프라임 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄로 사용될 수 있다. 다회 투여 스케줄에서 다양한 용량이 동일 또는 다른 경로, 예를 들어 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 주어질 수 있다. 1회 이상의 용량의 투여(전형적으로 2 용량)은 면역적으로 나이브한 환자들, 예를 들어, 새로운 HA 서브타입에 대한 백신접종 전, 또는 백신접종에 대해(유행성 발생에서와 같이) 인플루엔자 백신을 결코 받지 않은 사람들에 대해 특히 유용하다. 다회 투여는 전형적으로 적어도 1주 간격(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다.

본 발명에 의해 제조되는 백신은 실질적으로 동시에(예를 들어, 동일한 의학적 상담 동안 또는 의료 전문가 또는 백신접종 센터를 방문) 다른 백신, 예를 들어, 홍역 백신, 멈프스 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 콘쥬게이트된 H. 인플루엔자 b형 백신, 불활성화 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 콘쥬게이트 백신(예컨대 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 콘쥬게이트 백신 등과 실질적으로 동시에 환자에게 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 및/또는 뇌수막염 백신과 실질적으로 동시에 투여는 노인 환자에서 특히 유용하다.

유사하게 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대해 활성인 항바이러스 화합물(예를 들어, 오셀타미비르 및/또는 타나미비르)과 실질적으로 동시에(예를 들어 동일한 의료 상담 동안 또는 의료 전문가 방문) 환자에게 투여될 수 있다. 이들 항바이러스는 뉴라미니다아제 억제제, 예컨대, (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복실산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-안히드로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-엔온산, 그것의 에스테르(예를 들어, 에틸 에스테르) 및 그것의 염(예를 들어, 포스페이트 염)을 포함한다. 바람직한 항바이러스는 오셀타미비르 포스페이트(TAMIFLU™)로서 알려진 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복실산, 에틸 에스테르, 포스페이트(1:1)이다.

일반

용어 "포함하는"은 "구성하는"뿐만 아니라 "포함하는"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 오로지 X로 이루질 수도 있고, 추가적인 어떤 것 예를 들어 X + Y를 포함할 수도 있다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다. 수치 x와 관련된 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어, x±10%을 의미한다.

구체적으로 언급되지 않는다면, 2이상의 성분들을 혼합하는 단계는 혼합의 어떤 특정 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 성분들은 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 3가지 성분들이 있다면, 2성분들은 서로 혼합될 수 있고, 조합은 제3 성분 등과 혼합될 수 있다.

동물(및 특히 소) 물질이 세포의 배양물에서 사용된다면, 전염성 해면상뇌증(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs), 및 특히 광우병(BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 전반적으로, 동물-유래 물질이 완전히 없는 배양물 세포가 바람직하다.

화합물이 조성물의 부분으로서 신체에 투여된다면, 화합물은 적당한 프로드러그에 의해 또 다르게 치환될 수 있다.

도 1은 루시퍼라아제 리포터로 pol I 프로모터 활성을 분석하는데 사용한 발현 구성체를 예시한다.
도 2는 전장(FL) 인간 pol I 프로모터 서열(SEQ ID NO: 1)을 나타낸다. 전장 서열 내 pHW2000 인간 Pol I 프로모터 서열(SEQ ID NO: 2; "short" 인간 pol I 프로모터))은 밑줄친 글자체로 나타낸다. 화살표는 전사 시작 자리를 나타낸다.
도 3은 전장 (FL) 개 pol I 프로모터 서열(NW_878945; SEQ ID NO: 3)을 나타낸다. 전장 프로모터 서열 내 SHORT 프로모터 서열은 밑줄 친 대문자 글자체(SEQ ID NO: 5)로 나타내고, 전장 프로모터 서열 내 MID 프로모터 서열은 밑줄친 대문자체 및 굵은 소문자체로 나타낸다;
도 4는 MDCK 세포 내 개 pol I 프로모터 활성을 나타낸다. 민무늬 회색 컬럼은 FL 개 pol I 프로모터에 의한 결과를 나타내고, 크로스-해지드(cross-hatched) 컬럼은 MID 개 프로모터에 의한 결과를 나타내고, 점 무늬 컬럼은 SHORT 개 pol I 프로모터에 의한 결과를 나타낸다. "A"는 LUC 및 바이러스 폴리머라아제를 나타내고, "B"는 LUC 및 감염(MOI = 0.05)을 나타내고, "C"는 LUC를 나타내고, "D"는 DNA가 없다. y-축은 상대적인 RLU(relative light units)를 나타낸다.
도 5는 MDCK 33016 세포에서 인간 pol I 프로모터 활성을 나타낸다. 민무늬 회색 컬럼은 인간 pol I 프로모터에 의한 결과를 나타내고, 크로스-해지드 컬럼은 FL 개 pol I 프로모터에 의한 결과를 나타내고, 점선 컬럼은 MID 개 pol I 프로모터에 의한 결과를 나타내고, 수직 사선(vertically hatched) 컬럼은 SHORT 개 pol I 프로모터에 의한 결과를 나타낸다. "A"는 LUC 및 바이러스 폴리머라아제를 나타내고, "B"는 LUC 및 감염(MOI = 0.05)을 나타내고, "C"는 LUC를 나타낸다. y-축은 RLU(relative light unit)를 나타낸다.
도 6은 MDCK 세포 33016 세포에서 FL과 SHORT 인간 pol I 프로모터 및 전장 개 pol I 프로모터의 활성의 비교를 나타낸다. 민무늬 회색 컬럼은 전장 인간 프로모터에 의한 결과를 나타내고, 해지드 컬럼은 전장 개 프로모터에 의한 결과를 나타내고, 점 무늬 컬럼은 짧은 인간 pol 프로모터에 의한 결과를 나타낸다. A는 LUC + 폴리머라아제를 나타내고, B는 LUC + 감염을 나타내고, C는 LUC만을 나타낸다. y-축은 RLU(relative light unit)를 나타낸다.
도 7은 MDCK 33016 세포(도 7A) 및 MDCK ATCC 세포(도 7B)에서 인간 pol I 프로모터(점 무늬 컬럼) 및 개 pol I 프로모터(크로스 해지드 컬럼)의 활성을 나타낸다. A는 LUC + 폴리머라아제를 나타내고, B는 LUC + 감염을 나타내고, C는 LUC만 나타낸다. y-축은 RLU를 나타낸다.
도 8은 바이러스 구조 후 세포 용혈물에서 N 및 NP 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 9는 역 유전학 구성체로 감염시킨 세포로부터 상청액을 사용하는 병소 형성(focus-forming) 분석의 결과를 나타낸다.
도 10은 인간 및 개 pol I 프로모터의 DNA 서열의 배열을 나타낸다(각각 SEQ ID NO 1 및 3).
도 11A는 MDCK ATCC, MDCK 33016-PF 및 293T 세포에서 인간 pol I (hPolI) 프로모터 또는 개 pol I 프로모터(cPolI)의 조절하에 리포터 전이유전자의 발현 수준을 나타낸다. 검정색 컬럼은 293T 세포에 의한 결과를 나타내고, 백색 컬럼은 MDCK 33016-PF에 의한 결과를 나타내고, 크로스-해지드 컬럼은 MDCK ATCC 세포에 의한 결과를 나타내고; 도 11B는 인간 및 개 세포에서 트랜스펙션 효율을 비교한다. 양 그래프에서 y-축은 RLU를 나타낸다.
도 12는 TMPRSS2 헬퍼 플라스미드의 존재(백색 컬럼) 및 부재(검정색 컬럼)에서 그리고 피더 세포(feeder cell)의 첨가가 있고(검정색 컬럼) 첨가가 없는(백색 컬럼) MDCK ATCC, MDCK 33016-PF 및 293T 세포의 인간 pol I 프로모터-계 역 유전학에 의한 A/Puerto Rico/8/34 인플루엔자 균주의 구제를 나타낸다(12B). y-축은 바이러스 적정 농도를 나타낸다(ffu/㎖).
도 13은 MDCK 33016-PF 세포에서 인간 또는 개 pol I-구동된 역 유전학에 의한 A/Puerto Rico/8/34 인플루엔자 균주의 구조를 비교한다. 검정색 컬럼은 TMPRSS2 헬퍼 플라스미드의 부재하에 결과를 나타내고 백색 바(bar)는 TMPRSS2 헬퍼 플라스미드의 존재하에 결과를 나타낸다. y-축은 바이러스 적정농도를 나타낸다(ffu/㎖).
서열의 간단한 설명
SEQ ID NO: 1은 전장(FL) 인간 pol I 프로모터 서열이다.
SEQ ID NO: 2는 pHW2000 인간 Pol I 프로모터 서열이다.
SEQ ID NO: 3은 전장(FL) 개 pol I 프로모터 서열이다.
SEQ ID NO: 4는 MID 개 pol I 프로모터 서열이다.
SEQ ID NO: 5는 SHORT 개 pol I 프로모터 서열이다.
SEQ ID NO: 6은 A/California/04/09로부터의 HA 서열이다.
SEQ ID NO: 7은 A/Chile/1/1983로부터의 HA 서열이다.
SEQ ID NO: 8은 A/California/04/09로부터의 NA 서열이다.
SEQ ID NO: 9는 A/Chile/1/1983로부터의 NA 서열이다.

인간 pol I 프로모터는 인간 및 개 세포에서 활성이다.

비-내인성 숙주 세포에서 pol I 프로모터의 활성을 평가하기 위해서, MDCK 세포를 인간 pol I 프로모터의 487bp 단편 또는 개 pol I 프로모터의 다양한 단편의 대조군 하에서 안티센스 방향으로 루시퍼라아제(luc) RNA의 발현을 허용하는 발현 구성체로 트랜스펙팅하였다(도 3에서 나타내는 바와 같음). 발현한 RNA는 바이러스 폴리머라아제에 의해 mRNA로 전사될 수 있고 이후에 luc 단백질로 번역될 수 있다. 따라서, 전이유전자를 발현하는 세포는 루시퍼라아제 활성에 대한 분석에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 작업을 위한 분석을 위해 바이러스 폴리머라아제를 제공하는 것이 필요하다. 이는 바이러스 폴리머라아제를 암호화하는 발현 구성체로 세포를 코-트랜스펙팅함으로써, 또 다르게는 헬퍼 바이러스로 트랜스펙팅 세포를 감염시킴으로써 달성될 수 있다. 이 분석은 도 1에서 예시된다.

도 11A는 개 pol I 프로모터로서 동일한 효능을 가지는 MDCK ATCC 세포 및 MDCK 33016-PF 세포의 전이유전자의 발현을 구동할 수 있다는 것을 보여준다. MDCK ATCC 세포의 인간 pol I 프로모터를 가지는 전이유전자의 발현 수준은 인간 293T 세포에서 관찰되는 것보다 훨씬 더 높다. 시험한 세포 종류의 트랜스펙션 효율이 비교가능하다는 것을 확인하기 위해서, 그것들은 CMV 프로모터의 조절하에서 루시퍼라아제 유전자를 함유하는 구성체로 트랜스펙션되었다. 루시퍼라아제 활성의 수준을 측정하였다. 결과를 도 11B에 나타내고 시험 세포의 트랜스펙션 효율이 비교가능하다는 것을 확인한다.

도 4는 개 pol I 프로모터의 모든 시험 단편이 MDCK 세포에서 luc 전이유전자의 발현을 구동시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 도 5는 전장 인간 pol I 프로모터가 MDCK 세포의 전이유전자의 발현을 구동할 수 있고 개 pol I 프로모터보터 훨씬 더 효율적이라는 것을 증명한다.

전이유전자의 발현을 구동하기 위해 필요한 인간 pol I 프로모터의 영역을 더 정의하기 위해서, 실험을 도 2에서 나타낸 바와 같은 인간 pol I 프로모터의 단편으로 반복하였다("short" pol I). 전장 pol I 프로모터가 더 활성인 한편, 전장 및 short 인간 pol I 프로모터는 MDCK 세포에서 활성이라는 것이 발견되었다(도 6).

인간 pol I 프로모터의 활성이 특정 셀 라인으로 제한되는지 여부를 결정하기 위해서, 인간 및 개 pol I 프로모터 서열을 함유하는 구성체를 ATCC 및 MDCK 33016 세포로부터 MDCK에 추가로 트랜스펙팅하였다[18]. 도 7에서 나타내는 바와 같이, 인간 pol I 프로모터는 세포 종류 둘 다에서 전이유전자의 발현을 구동할 수 있지만, 발현은 MDCK 33016 세포에서 더 효율적이었다. 인간 pol I 프로모터를 사용하는 MDCK 세포로부터 인플루엔자 바이러스의 구제.

인간 pol I 프로모터를 사용하는 인플루엔자 바이러스 구제의 효율을 MDCK 및 293T 세포에서 비교하였다. 인플루엔자 바이러스 게놈을 pHW2000 발현 벡터에 클로닝하였다[69]. 이 벡터는 MDCK 세포에서 활성이 되는 것으로 보이는 인간 pol I 프로모터의 단편을 함유한다(도 5 참조). 특히, 하기 벡터를 사용하였다: pHW-WSN PA (0.534 ㎍/㎕); pHW-WSN PB1 (0.432 ㎍/㎕); pHW-WSN PB2 (0.357 ㎍/㎕); pHW-WSN NP (0.284 ㎍/㎕); pHW- WSN NS (0.217 ㎍/㎕); pHW-WSN M (0.232 ㎍/㎕); pHW-WSN HA (0.169 ㎍/㎕); pHW-WSN NA (0.280 ㎍/㎕) 및 pcDNA-TMPRSS (0.775 ㎍/㎕; 세린 프로테아제를 암호화). 단백질-암호화 유전자를 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 조절하였다.

바이러스 구제를 위해, 293T 세포를 2㎖의 둘베코 변형 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)가 있는 6-웰 디쉬 중에서 10% FCS로 5 x 10⁶ 세포/웰의 밀도로 씨딩하였다. MDCK 세포를 2㎖의 배지를 담은 6-웰 디쉬 중에서 0.3 x 10⁶ 세포/웰에서 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이팅하였고, 그것들이 50-80%의 합류점(confluency)에 도달하였을때 트랜스펙팅하였다.

293T 및 MDCK 세포를 각각 FuGENE 6 Transfection 시약(Roche Cat.#l 1988387001) 및 Lipofectamine LTX Plus 시약(Invitrogen Cat.#15338-100)을 사용하여 트랜스펙팅하였다. 세포를 하기 프로토콜에 따라서 1 ㎍의 각각의 벡터로 트랜스펙팅하였다. FuGENE 6에 대해, 시약(3㎕의 FuGENE/㎍ DNA)을 73㎕ 무혈청 배지(항생제 없음)에서 희석하였고, 부드럽게 혼합하였고, 실온에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 그 뒤에 DNA를 각각 희석한 FuGENE에 첨가하였고, 부드럽게 혼합하였고, 실온에서 적어도 15분 동안 인큐베이팅하였다. DNA/FuGENE 복합체를 성장 배지를 제거하지 않고 293T 세포에 적가하였고, 세포를 24시간 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다.

리포펙타민으로 트랜스펙션을 위해, 시약(25μl)을 500μl 무혈청 배지로 희석하였고 실온에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. DNA를 첨가하였고 혼합물을 30분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 다음에, 성장 배지를 세포로부터 제거한 후 500 μl의 무혈청 배지를 트랜스펙션 시약에 적가하였다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 이후에 인큐베이팅하였다. 트랜스펙션 24시간 후, 배지를 변경하였다.

감염 2일 후, 세포로부터 상청액을 5분 동안 1000rpm에서 원심분리에 의해 수집하였다. 상청액에서 수집한 바이러스를 병소형성 분석을 위해 사용하였다. 게다가, 감염 세포를 용해하였고 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용하였다.

웨스턴 블롯 분석

293T 및 MDCK 세포를 용해하였고 표준 프로토콜에 따라서 웨스턴 블롯 분석을 받게 하였다. M 및 NP 단백질에 대한 항체를 막에서 이들 단백질을 검출하기 위해 사용하였다. S6에 대한 항체들을 로딩 대조군으로서 사용하였다. 'WSN'으로서 라벨링한 레인들을 구제한 바이러스로부터의 단백질로 로딩하였다. 'M' 및 'NP'를 라벨링한 레인은 대조군으로서 재조합 M 및 NP 단백질을 함유한다. 이들 재조합 단백질이 다른 유전자로부터 발현되기 때문에, 그것들은 겔에서 약간 더 느리게 이동한다.

인간 pol I 프로모터의 조절 하에서 발현 구성체가 293T 및 MDCK 세포에서 바이러스 구제를 허용한다는 것이 명백한 경우 분석의 결과를 도 8에서 나타낸다.

병소형성 분석

감염되지 않은 MDCK 세포를 10% FCS가 있는 500μl의 DMEM 중에서 48웰 플레이트 중의 6.25 x 1O⁴ 세포/웰의 밀도에서 플레이팅하였다. 다음날 세포를 37℃에서 2시간 동안 100-150μl의 부피 중에서 바이러스로 감염시켰다. 세포를 따라서 다양한 바이러스의 희석으로 감염시켰다. 2시간의 감염 후, 배지를 흡입하였고 500μl의 DMEM를 10% FCS와 함께 각 웰에 첨가하였다. 세포를 다음날까지 37℃에서 인큐베이팅하였다.

감염 24시간 후, 배지를 흡입하였고, 세포를 일단 PBS로 세척하였다. PBS 중에서 500μl의 빙냉한 80% 아세톤을 각 웰에 첨가한 다음 30분 동안 4℃에서 인큐베이팅하였다. 아세톤 혼합물을 흡입하였고 세포를 PBST (PBS + 0.1% Tween)로 일단 세척하였다. PBS 중에서 500μl의 2% BSA를 각 웰에 첨가한 다음 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 항-NP의 500μl의 1:6000 희석을 차단 버퍼 중에 첨가한 다음 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 항체 용액을 흡입하였고 세포를 PBST로 2회 세척하였다. 2차 항체(염소 항 마우스)를 500μl 차단 버퍼 중에서 희석 1:2000에 첨가하였고, 플레이트를 RT에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 항체 용액을 흡입하였고 세포를 PBST로 3회 세척하였다. 500μl의 KPL True Blue를 각 웰에 첨가하였고 10분 동안 인큐베이팅하였다. 반응을 True-Blue를 흡입함으로써 중단하였고 dH₂O로 한번 세척하였다. 물을 흡입하였고 세포를 남겨서 건조시켰다.

분석 결과를 도 9에서 나타내며, 이는 감염성 바이러스가 293T 및 MDCK 세포로부터 얻어진다는 것을 분명히 증명한다.

인간 pol I 역 유전학 시스템을 사용하는 A/Puerto Rico/8/34 인플루엔자 균주의 바이러스 구제를 참고문헌 70에서 설명하는 바와 같이 MDCK ATCC, MDCK 33016-PF 및 293T 세포에서 시험하였다.

바이러스를 세린 프로테아제를 암호화하는 헬퍼 플라스미드 TMPRSS2의 존재 및 부재하에서 구제하는 실험을 수행하였다. 추가로, 바이러스 구제 24시간 후 피더 세포의 첨가와 함께 및 피더 세포의 첨가 없이 수행하였다. 결과를 도 12에서 나타내고, 효율적인 바이러스 구제는 인간 pol I 프로모터를 사용하여 다양한 조건 하에 MDCK 세포에서 이루어질 수 있다는 것을 증명하였다.

인간 pol I 프로모터를 사용하여 MDCK 33016-PF 중의 바이러스 구제의 효율을 개 pol I 프로모터를 사용하는 구제와 비교가능한지 여부를 비교하기 위해, 세포를 참고문헌 70에서 설명한 바와 같이 인간 pol I RG 시스템 또는 개 pol I RG 시스템으로 트랜스펙팅하였다. 실험을 TMPRSS 헬퍼 플라스미드의 존재 및 부재하에서 수행하였다. 결과(도 13)은 인간 pol I 시스템이 사용될 때, A/Puerto Rico/8/34 균주를 개 pol I 시스템과 비교가능한 효율로 구제한다는 것을 증명하였다.

본 발명은 단지 예시의 방법에 의해 설명되었고 변형이 본 발명의 정신과 범주 내에서 유지된다는 것이 이해될 것이다.

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SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG DORMITZER Philip FRANTI Michael SUPHAPHIPHAT Pirada MASON Peter KEINER Bjoern CROTTA Stephania <120> REVERSE GENETICS USING NON-ENDOGENOUS POL I PROMOTERS <130> P054792WO <140> PCT/IB2010/........ <141> 2010-05-21 <150> US61/216,919 <151> 2009-05-21 <160> 9 <170> SeqWin99, version 1.02 <210> 1 <211> 499 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttccgagtc cccgtgggga gccggggacc gtcccgcccc cgtcccccgg gtgccgggga 60 gcggtccccg ggccgggccg cggtccctct gccgcgatcc tttctggcga gtccccgtgc 120 ggagtcggag agcgctccct gagcgcgcgt gcggcccgag aggtcgcgcc tggccggcct 180 tcggtccctc gtgtgtcccg gtcgtaggag gggccggccg aaaatgcttc cggctcccgc 240 tctggagaca cgggccggcc ccctgcgtgt ggcacgggcg gccgggaggg cgtccccggc 300 ccggcgctgc tcccgcgtgt gtcctggggt tgaccagagg gccccgggcg ctccgtgtgt 360 ggctgcgatg gtggcgtttt tggggacagg tgtccgtgtc gcgcgtcgcc tgggccggcg 420 gcgtggtcgg tgacgcgacc tcccggcccc gggggaggta tatctttcgc tccgagtcgg 480 cattttgggc cgcccgggt 499 <210> 2 <211> 219 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gccgggaggg cgtccccggc ccggcgctgc tcccgcgtgt gtcctggggt tgaccagagg 60 gccccgggcg ctccgtgtgt ggctgcgatg gtggcgtttt tggggacagg tgtccgtgtc 120 gcgcgtcgcc tgggccggcg gcgtggtcgg tgacgcgacc tcccggcccc gggggaggta 180 tatctttcgc tccgagtcgg cattttgggc cgcccgggt 219 <210> 3 <211> 1814 <212> DNA <213> Canis spec. <220> <221> misc_feature <222> 1647 <223> N = A, C, T or G <400> 3 agcgtgagca ggagaattct ggagaaacag attgtgttat aagaaagaaa gaaagaaaga 60 aagaaagaaa gaaagagaaa atccttatgt tctttgagcc tcccctcccc cccagaattg 120 agttcctctt ccacgacctc ttctcattca acccaataga caagtatttg gggggggggg 180 gtcaggtccc agacgcttaa agggtggaag tgaaagtggt gcgggggaag ggggggggca 240 caccgtcctc tccagcgcct ttggttcaaa cctccttcgt gacctccctc cctccctccc 300 tccttcgtct tataaatata taaataaaat cctaaagaaa aagaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaggaagga cacgagaaaa aacggtgcat ccgttgccgt cctaagagtc ctcgcctggt 420 ttcggctcta cgttccctcc ctgacctcgg aaacgtgcct gagtcgtccc gggagccccg 480 cgcggcgagc gcgaccccct ttccgggcgg cagcgggccc ggacggacgg acggacggac 540 ggacgggttt tccaaggctc ccccgccccg ggaggacggg ggttcgcgcg gtgcgcggcc 600 gtgtgctccc ggggccctcc gccgtccccg ggccgagagg cgagatccga ggcgccctga 660 cggcctcgcc gcccggatct gtcccgctgt cgttcgcgcc ggttgtcggg tgccacctgg 720 cggccgcttt tatagagcgt gtcccctccg gaggctcggc ggcgacaggc aaggaacagc 780 tttggtgtcg gtttcccggg gccgagttcc aggaggaggg cggctccggc gcgagcgtcc 840 ggctgtcgcc ggggcctcgg cgcgcgatgc gctcgccgga gattggacct ccggagctgc 900 gagggagtgt cgccgtcgcc gctgtcgccg ctgtcgcctc cgcctcgctc ccggaggagg 960 ccgtgcgggc cgcctgggtg ggtcgaccag cacccgccgg tggctcctcc tccgcccgcg 1020 cggaccgacc tgggccgcct cgggggcggg ggacagggtg tgtcccgccg tccgtcctgt 1080 ggctccgggc gatcttcggg ccttccttcc gtgtcactcg gttgtctccc gtggtcacgc 1140 cctggcgacg gggaccggtc tgagcctgga ggggaagccc gtgggtggcg cgacagaccc 1200 ggctgcgggc acgtgtgggg gtcccgggcg tcggacgcga ttttctcccc ttgttccgag 1260 gcccgctgcg gaggtgggtc ccgggcggtc ggaccgggtg ccacgcgggg gtgggcgggc 1320 cgtccgttcg ggcgtccggc cccggtggcg attcccggtg aggctgcctc tgccgcgcgt 1380 ggccctccac ctcccctggc ccgagccggg gttggggacg gcggtaggca cggggcggtc 1440 ctgagggccg cgggggacgg cctccgcacg gtgcctgcct ccggagaact ttgatgattt 1500 ttcaaagtct cctcccggag atcactggcg tggcggcgtg gcggcgtggc ggcgtggcgg 1560 cgtggcgtct ccaccgaccg cgtatcgccc ctcctcaccc cccccccccc ccgggttacc 1620 tggggcgacc agaaagccct gggggcnggg ggctccgtgg ggtgggggtg ggggggcgcc 1680 gtggggcagg ttttgggtac agttggccgt gtcacggtcc cgggaggtcg cggtgacctg 1740 tggctggtcc ccgccggcag gcgcggttat tttcttgccc gaaatgaaca ttttttgttg 1800 ccaggtaggt gctg 1814 <210> 4 <211> 474 <212> DNA <213> Canis spec. <220> <221> misc_feature <222> 307 <223> N = A, T, C or G <400> 4 cccggtggcg attcccggtg aggctgcctc tgccgcgcgt ggccctccac ctcccctggc 60 ccgagccggg gttggggacg gcggtaggca cggggcggtc ctgagggccg cgggggacgg 120 cctccgcacg gtgcctgcct ccggagaact ttgatgattt ttcaaagtct cctcccggag 180 atcactggcg tggcggcgtg gcggcgtggc ggcgtggcgg cgtggcgtct ccaccgaccg 240 cgtatcgccc ctcctcaccc cccccccccc ccgggttacc tggggcgacc agaaagccct 300 gggggcnggg ggctccgtgg ggtgggggtg ggggggcgcc gtggggcagg ttttgggtac 360 agttggccgt gtcacggtcc cgggaggtcg cggtgacctg tggctggtcc ccgccggcag 420 gcgcggttat tttcttgccc gaaatgaaca ttttttgttg ccaggtaggt gctg 474 <210> 5 <211> 288 <212> DNA <213> Canis spec. <220> <221> misc_feature <222> 121 <223> N = A, C, T or G <400> 5 ggcgtggcgg cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg accgcgtatc 60 gcccctcctc accccccccc ccccccgggt tacctggggc gaccagaaag ccctgggggc 120 ngggggctcc gtggggtggg ggtggggggg cgccgtgggg caggttttgg gtacagttgg 180 ccgtgtcacg gtcccgggag gtcgcggtga cctgtggctg gtccccgccg gcaggcgcgg 240 ttattttctt gcccgaaatg aacatttttt gttgccaggt aggtgctg 288 <210> 6 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 6 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val 50 55 60 Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140 Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Ala Asp Thr Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser 210 215 220 Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys 245 250 255 Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Met Glu 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Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 7 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 7 Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ser Ala Thr Asp 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Asn His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Ser Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Lys Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Ala Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu 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Claims (16)

1. 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 구성체를 포함하는 개 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하는, 재조합 바이러스를 생성하는 방법으로서, 구성체로부터의 바이러스 RNA 분자의 발현은 바이러스 RNA 분자가 바이러스를 생성하기 위해서 발현되는 조건 하에서 영장류 pol I 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
2. (i) 제1항의 방법에 의해 재조합 바이러스를 생성하는 단계; (ii) 배양 숙주를 단계 (i)에서 얻은 바이러스로 감염시키는 단계; (iii) 단계 (ii)로부터의 숙주를 배양하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)에서 얻은 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는, 바이러스 제조 방법.
3. (a) 제2항의 방법에 의해 바이러스를 제조하는 단계 및 (b) 바이러스로부터 백신을 제조하는 단계를 포함하는, 백신 제조 방법.
4. 제1항에 있어서, pol I 프로모터는 인간 pol I 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 세포는 MDCK 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, MDCK 세포는 셀 라인 MDCK 33016(DSM ACC2219)인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 세포는 적어도 하나의 양-방향성 발현 구성체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 발현 구성체는 발현 벡터 또는 선형 발현 구성체인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제4항에 있어서, 인간 pol I 프로모터는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 바이러스는 분절 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 바이러스는 비-분절 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 바이러스는 음성 가닥 RNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 바이러스 RNA 분자를 암호화하는 적어도 하나의 발현 구성체를 포함하는 바이러스를 생성하기 위한 개 숙주 세포로서, 상기 구성체로부터 바이러스 RNA 분자의 발현은 영장류 pol I 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 개 숙주 세포.
15. 내인성 rRNA의 발현을 조절하는 적어도 하나의 내인성 pol I 프로모터 및 바이러스 RNA 또는 그것의 상보체의 발현을 조절하는 적어도 하나의 비-내인성 영장류 pol I 프로모터를 가지는 바이러스를 생성하기 위한 개 세포.
    
16. 삭제

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