KR20220128613A - 재배열 인플루엔자 바이러스의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

재배열 인플루엔자 바이러스의 제조 방법이 제공된다. 또한, 방법에 따라 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스 및 상기 재배열 인플루엔자 바이러스에 기초한 백신이 제공된다.

Description

재배열 인플루엔자 바이러스의 제조 방법

본 발명은 재배열 인플루엔자 바이러스의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 재배열 인플루엔자 바이러스, 특히 인플루엔자 백신의 제조의 맥락에서 종자 바이러스로 사용될 수 있는 재배열 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스 및 백신 또한 본 발명의 측면이다.

재배열 인플루엔자 바이러스는 2개 이상의 모 인플루엔자 균주에서 유래된 절편을 함유하는 게놈을 갖는다. 이러한 재배열 바이러스는 고성장 인플루엔자 균주의 특성을 이용하여 순환하는 균주의 헤마글루티닌(HA) 및/또는 뉴라미니다제(NA) 항원의 생산을 증가시킬 수 있고 순환하는 균주의 HA 및/또는 NA 항원은 인플루엔자 백신의 전형적인 구성성분이기 때문에 인플루엔자 백신을 제조하는데 유용하다. 백신 제조에 있어서, 재배열 바이러스(종자 바이러스라고도 지칭될 수 있음)는 전형적으로 순환하는 균주의 HA 및 NA 절편, 및 고성장 인플루엔자 균주의 골격 절편(즉, PB1, PB2, PA, M, NS 및 NP)를 함유한다. 이 종자 바이러스는 인플루엔자 백신 제조 프로세스에서 사용되는 배양 숙주 플랫폼 (예를 들어, 난(egg) 또는 세포)에서 성장 특성이 불량할 수 있는 순환하는 균주를 단순히 증식시키는 것 보다 더 빠르게 HA 및 NA를 함유하는 바이러스를 성장시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 최근의 순환하는 균주의 HA 및 NA와 고성장 모 A/Puerto Rico/8/34 (PR8)의 6개의 골격 유전자를 함유하는 재배열 인플루엔자 A 바이러스는 PR8 골격의 맥락에서 순환하는 균주의 HA의 높은 수율로 인해 백신 제조에 선호되는 종자 바이러스인 것으로 나타났다 [1]. 재배열 인플루엔자 바이러스를 생성하기 위해 다음의 2개의 방법이 사용되었다; 고전적인 재배열 및 역 유전학.

고전적인 재배열에서는 배양 숙주(전형적으로 조류 난)에 2개의 모 균주(즉, 순환하는 균주 및 고성장 균주)를 접종하였다. 그런 다음, 순환하는 균주의 HA 및/또는 NA를 포함하는 재배열 바이러스를 고성장 균주의 HA 및/또는 NA에 대한 항체의 존재 하에 배양 숙주를 성장시킴으로써 선택하였다. 원하는 HA 및 NA 표면 유전자를 함유하는 재배열 바이러스를 분리하여 백신 제조를 위한 종자 바이러스로 사용할 수 있다.

그러나, 고전적인 재배열에 관련된 한 가지 단점은 유전자 서열의 제어된 조작을 허용하지 않는 다는 것인데, 이는 고병원성 인플루엔자 바이러스로부터 후보 종자 바이러스를 생성하려고 할 때 문제가 될 수 있다. 예를 들어, 일부 H5 또는 H7 인플루엔자 균주의 HA는 고전적인 재배열 방법을 사용하여 삭제할 수 없는 다염기 절단 부위 형태의 병원성 결정인자를 포함한다. 고전적인 재배열은 또한 배양 숙주에 16개의 유전자가 존재하는 것(득, 각 모 균주에서 8개)을 의미하는 2개의 인플루엔자 균주가 접종되기 때문에 각 모 균주로부터 7:1, 6:2, 5:3 또는 4:4 유전자 배열 비율을 갖는 재배열 바이러스의 혼합물을 제조할 수 있다. 그 결과, 백신 제조에서 종자 바이러스로 사용하기 위해 원하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 분리하는 데 시간이 많이 걸릴 수 있다. 예를 들어, 현재 새로운 인플루엔자 균주가 도착한 후 백신 제조에서 종자 바이러스로 사용될 최종 고성장 재배열체를 얻는 데 약 35일이 소요된다.

역 유전학에서는 원하는 인플루엔자 바이러스를 생성하는 데 필요한 유전 정보를 세포에 전달하여 인플루엔자 바이러스를 생성할 수 있다. 역 유전학은 처음에 시험관내 조립과 헬퍼 바이러스에 감염된 세포 내로 바이러스 리보핵단백질(RNP)의 형질감염을 필요로 하였다 [2,3]. 후속 기술은 중합효소 및 NP 유전자에 대한 단백질 발현 작제물과 함께 모든 바이러스 RNA(vRNA)를 암호화하는 RNA 중합효소 I 플라스미드의 형질감염을 포함하였다 [4]. 보다 최근에는, 역 유전학 방법은 동일한 템플릿에서 음성 센스 vRNA와 양성 mRNA 모두의 발현을 허용하는 변형된 RNA 중합효소 I 시스템을 사용하는 것을 포함한다 [5]. 이 방법에서, 원하는 유전자 각각은 RNA 중합효소 I 프로모터와 종결 서열 사이에 삽입된 바이러스 cDNA로 구성되고 CMV 프로모터 및 폴리아데닐화 신호가 플랭킹된 pHW2000 플라스미드에 복제된다. 8개의 플라스미드를 세포에 형질감염시킨 후, vRNA와 mRNA가 모두 합성되어 바이러스가 생산된다. 추가 개선은 플라스미드 [6] 대신 선형 DNA 발현 작제물을 사용하는 시스템의 개발과 단일 표현 작제물 [7]의 사용으로 이어졌다.

고전적인 재배열과 달리 역 유전학은 바이러스를 제조하는 데 사용되는 유전자 서열을 조작할 수 있다. 따라서, 역 유전학은 약독화 표현형을 갖는 바이러스를 제조하기 위해 세포에서 발현 작제물의 형질감염 전에 바이러스 유전자 서열이 조작될 수 있기 때문에 약독화 인플루엔자 생백신의 생산을 위한 종자 바이러스를 생성하는 데 사용될 수 있다. 합성 DNA 서열은 역 유전학에서 종자 바이러스를 제조하는 데 사용될 수도 있으며, 이로써 야생형 유행성 바이러스를 처리해야 하는 요구 사항을 무효화할 수 있다 [8]. 역 유전학은 또한 4-7일 안에 종자 바이러스를 제조할 수 있도록 하며, 이는 고전적인 재배열에 의해 제공되는 것 보다 훨씬 더 빠르다.

그러나, 역 유전학에는 여러 가지 단점이 있다. 예를 들어, 역 유전학에서 각 인플푸엔자 유전자의 서열은 발현 작제물이 제조될 때 미리 결정되는 데, 이는 이 기술이 고전적인 재배열과 비교하여 더 균질한 재배열 바이러스 집단을 제조한다는 것을 의미한다. 이것은 순환하는 HA 및 NA가 역 유전학의 표준으로 사용되는 골격 유전자와 덜 호환되어 효과적으로 성장하지 않는 경우 문제가 될 수 있다. 이 상황에서 HA 및 NA는 다른 골격 유전자 배열로 더 효과적으로 성장할 수 있지만, 역 유전학에 사용하기 위해 보다 적절한 골격 유전자를 식별하고 테스트하는 데 시간이 많이 소요된다. 이것은 골격 절편에서 서열 변이를 갖는 바이러스의 개발 및 적합한 성장 특징을 갖는 종자 바이러스의 선택을 가능하게 하는 역유전학 유래 재배열 인플루엔자 바이러스의 여러 계대를 초래할 수 있다. 일부 역 유전학 시스템의 또 다른 문제는 역 유전학 시스템을 비효율 적으로 만들 수 있는 (예를 들어, 낮은 형질감염 효율로 인해) 필요한 발현 작제물을 배양 숙주내로 도입하는 것이 어려울 수 있다는 것이다.

고전적인 재배열과 역 유전학의 요소를 조합한 재배열 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법은 이전에 논의되었다. 예를 들어, 숙주 세포가 첫 번째 인플루엔자 균주로 감염되고 두 번째 인플루엔자 균주로부터의 적어도 하나의 절편을 암호화하는 하나 이상의 발현 작제물(들)로 형질감염되는 방법은 참고문헌 11에서 논의된다. 이 방법은 siRNA에 의해 표적화된 절편이 존재하지 않는 재배열 바이러스를 제조하기 위해 siRNA와 같은 인플루엔자 바이러스 절편의 번역 및/또는 전사를 억제하는 제제를 사용하는 맥락에서만 기술된다.

따라서, 본 발명의 목적은 고전적인 재배열 및 역 유전학 방법 모두와 관련된 단점을 극복하는 개선된 재배열 인플루엔자 바이러스를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

제1 측면에서, 본 발명은 (i) 배양 숙주를 제1 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및 제1 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 포함하는 모 인플루엔자 바이러스 균주와 접촉시키는 단계; (ii) 인플루엔자 유전자가 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자를 포함하는, 하나 이상의 인플루엔자 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 작제물(들)을 상기 배양 숙주 내로 도입시키는 단계; (iii) 상기 배양 숙주를 배양하여 재배열 바이러스를 생성하는 단계; (iv) 상기 제2 HA 유전자 또는 상기 제2 NA 유전자를 포함하는 재배열 바이러스를 선택하는 단계; 및 임의로 (v) 상기 제2 HA 유전자 또는 상기 제2 NA 유전자를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는, 재배열 인플루엔자 바이러스의 생성 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스의 집단을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 분리된 재배열 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

본 발명의 방법은 제1 HA 유전자 및 제1 NA 유전자를 제공하는 모 인플루엔자 바이러스 균주가 비균질한 비리온 집단을 포함하기 때문에 유리하다 (즉, 서열 변이체/유사 종이 존재함). 이것은 배양 숙주에 전달되는 골격 절편에 서열 가변성을 도입함으로써, 본 발명의 방법이 클론 발현 작제물(들) (예를 들어, 플라스미드)이 이용되는 역 유전학 기술보다 더 넓은 다양성의 재배열 바이러스를 제조할 수 있게 한다. 역 유전학 시스템과 대조적으로, 초기에 구출된 바이러스는 서열 변이를 도입하고 개선된 특성을 갖는 바이러스를 선택하기 위해 여러 번 계대되어야 할 수 있지만, 본 발명의 방법은 서열 변이체가 (모 인플루엔자 균주의 번식 동안 자연적으로 축적된, 축적된 서열 변이로 인해) 본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열된 바이러스에 즉시 존재할 수 있게 한다. 이 방법에 의해 제조된 재배열 바이러스의 폭 넓은 다양성은 또한 하나 이상의 특히 원하는 특성 (예를 들어, 높은 HA 수율 및/또는 높은 성장)을 갖는 재배열 바이러스를 식별할 가능성을 증가시킨다.

본 발명의 방법의 또 다른 이점은 비-기능성 재배열 바이러스를 초래하는 원하는 HA 및/또는 NA와 호환성이 떨어지는 바이러스 게놈의 임의의 서열에 대해 방법이 본질적으로 선택된다는 것이다. 이러한 비-기능성 바이러스는 배양 숙주에서 효과적으로 전파되지 않으며 원하는 높은 성장 특징을 갖는 변이체에 의해 경쟁에서 앞서게 될 것이다. 이것은 발현 구조가 제조되어 배양 숙주에 전달된 후에만 서열 비호환성이 확인되고 원하는 재배열 바이러스의 생성하는데 문제가 있었던 역 유전학 기술과 대조된다. 관련된 이점에서, 본 발명의 방법은 또한 개선된 성장 특성을 제공하기 위해 상승 작용을 일으키는 돌연변이의 조합을 함유하는 재배열 바이러스의 보다 쉽고 빈번한 식별을 허용한다. 사실, 다중 돌연변이는 역 유전학을 사용하여 전혀 식별되지 않을 수 있다. 예를 들어, 단일 돌연변이가 부정적인 영향을 미치는 상황에서 이 변이체는 폐기될 수 있으며, 따라서 부정적인 효과를 구제하고 조합하여 추가 이점을 이끌어낼 수 있는 추가 서열 변이체와 관련하여 테스트되지 않을 수 있다.

본 발명은 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자가 제2 인플루엔자 바이러스 균주에 감염되는 대신에 발현 작제물의 일부로서 배양 숙주에 도입되기 때문에 고전적인 재배열과는 구별된다. 발현 작제물을 사용하여 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자를 제공하는 것은 HA 유전자 또는 NA 유전자가 고전적인 재열에서는 불가능한 방식으로 배양 숙주에 제공되기 전에 조작될 수 있음을 의미한다. HA 서열을 조작하는 이러한 능력은 다염기 절단 부위와 같은 병원성 결정인자의 결실을 허용하기 때문에 유행성 또는 잠재적 유행성 균주 (예를 들어, H5 및 H7 균주)의 맥락에서 특히 유리하다. 발현 작제물 상에서 HA 유전자 또는 NA 유전자를 전달하는 또 다른 이점은 이것이 미리 결정된 서열을 갖는 단일 HA 또는 NA 클론의 발현을 허용한다는 것이다. 이것은 복제 중에 HA 또는 NA 유전자에 도입되어 예를 들어 항원성에 감소될 수 있는 위험이 있는 복제 바이러스 (예컨데, 고전적인 재배열)의 맥락에서 HA 또는 NA 유전자가 전달되는 방법과 대조된다.

따라서 이 방법은 역 유전학에 있을 수 있으므로 재배열 인플루엔자 바이러스에 존재해야 하는 HA 절편 또는 NA 절편을 제어할 수 있지만, 동시에 모 인플루엔자 바이러스 균주 감염을 통해 배양 숙주에 골격 유전자의 집단을 도입함으로써 일부 고유 가변성을 갖는 골격 절편의 풀 (pool)을 제공한다. 이것은 백신 제조에 사용하기 위해 최적화된 종자 바이러스가 보다 신속하게, 특히 역 유전학 (예를 들어 PR8)에서 전형적으로 사용되는 골격 유전자가 순환 균주의 HA 및/또는 NA로 재배열될 때 차선의 특성을 제공하는 상황에서 생성되도록 하기 때문에 유리하다. 이러한 상황에서, 역류전학 실험에서 처음 구제된 바이러스는 바이러스의 성장을 개선하기 위해 배양 숙주에서 여러 번 계대해야 한다. 강력한 성장 특성을 갖는 재배열 바이러스가 이 방법에 의해 제조되는 다양한 재배열 바이러스의 풀로부터 선택될 수 있기 때문에 동일한 다중 대계가 본 발명의 방법에서 반드시 필요한 것은 아니다. 즉, 복제 바이러스의 맥락에서 생성된 모 균주의 골격 유전자의 다양성은 생존할 수 없거나 제대로 성장하지 않는 재배열 바이러스에 대한 낮은 수준의 선택 및 제거와 조합하여 고성장 재배열 바이러스의 보다 효율적인 생성을 가능하게 한다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 백신의 제조에 특히 유용할 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 방법에 의해 재배열 인플루엔자 바이러스를 제조하는 단계, 및 (b) 재배열 인플루엔자 바이러스로부터 백신을 제조하는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 백신이 제공된다.

도 1은 표 1에 기술되는 바와 같이, 고전적인 재배열에 의해 제조된 H1N1 바이러스 및 역 유전학에 의해 제조된 바이러스의 M1 단백질에 존재하는 서열 변이의 그래프 표현이다. 0% cf 컨센서스(consensus) 골격 값은 컨센서스 골격 서열에 비해 해당 위치에서 서열 변이체가 존재하지 않음을 나타낸다. 역 유전학에 의해 제조된 바이러스의 M1 단백질에는 서열 변이체가 없다.
도 2는 표 2에 기술되는 바와 같이, 고전적인 재배열에 의해 제조된 H1N1 및 H3N2 바이러스 및 역 유전학에 의해 제조된 바이러스의 NP 단백질에 존재하는 서열 변이의 그래프 표현이다. 0% cf 컨센서스 골격 값은 해당 위치에 서열 변위체가 존재하지 않음을 나타낸다. 고전적인 재배열에 의해 제조된 바이러스에서 NP 단백질은 서열 전체에 걸쳐 변이를 나타내는 반면, 역 유전학에 의해 얻어진 바이러스의 NP 단백질은 4개의 서열 위치에서만 변이를 나타낸다.
도 3은 표 3에 기술되는 바와 같이, 고전적인 배열에 의해 제조된 H1N1 및 H3N2 바이러스 및 역 유전학에 의해 제조된 바이러스의 NS1 단백질에 존재하는 서열 변이의 그래프 표현이다. 0% cf 컨센서스 골격 값은 해당 위치에 서열 변이체가 존재하지 않음을 나타낸다. 고전적인 재배열에 의해 제조된 바이러스에서 NS1 단백질은 서열 전체에 걸쳐 변이를 나타내는 반면, 역 유전학에 의해 얻어진 바이러스의 NS1 단백질은 3개의 서열 위치에서만 변이를 나타낸다.
도 4는 표 4에 기술되는 바와 같이, 고전적인 배열에 의해 제조된 H1N1 및 H3N2 바이러스 및 역 유전학에 의해 제조된 바이러스의 PA 단백질에 존재하는 서열 변이의 그래프 표현이다. 0% cf 컨센서스 골격 값은 해당 위치에 서열 변이체가 존재하지 않음을 나타낸다. 고전적인 재배열에 의해 제조된 바이러스에서, PA 단백질은 서열 전체에 걸쳐 변이를 나타내는 반면, 역 유전학에 의해 얻어진 바이러스의 PA 단백질은 2개의 서열 위치에서만 변이를 나타낸다.
도 5는 표 5에 기술되는 바와 같이, 고전적인 재배열에 의해 제조된 H1N1 및 H3N2 바이러스 및 역 유전학에 의해 제조된 바이러스의 PB2 절편에 존재하는 서열 변이의 그래프 표현이다. 0% cf 컨센서스 골격 값은 해당 위치에 서열 변이체가 존재하지 않음을 나타낸다. 고전적인 재배열에 의해 제조된 바이러스에서 PB2 단백질은 서열 전체에 걸쳐 변이를 나타내는 반면, 역 유전학에 의해 얻어진 바이러스의 PB2 단백질은 8개의 서열 위치에서만 변이를 나타낸다.

재배열 인플루엔자 바이러스

인플루엔자 바이러스는 분할된 음성 가닥 RNA 바이러스이다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스 게놈은 8개의 단일 가닥 바이러스 RNA (vRNA) 절편을 함유한다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 8개의 게놈 절편은 크기 순서대로 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS이다. PB2, PB1, PA, NP, M 및 NS는 내부 단백질과 비구조 단백질을 암호화하며, 골격 절편으로 지칭될 수 있다. HA 및 NA 절편은 표면 당단백질을 암호화한다. 본 발명의 방법은 재배열 인플루엔자 A 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 재배열 인플루엔자 B 바이러스를 제조하는데 사용될 수 있다.

인플루엔자 A 바이러스의 경우, 8개의 게놈 절편은 다음과 같이 11개의 단백질을 암호화한다: 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 2개의 기질 단백질 (M1 및 M2), 이종삼량체 RNA-의존성 RNA 중합효소 (하나의 중합효소 산성 소단위 (PA), 및 2개의 중합효소 염기성 소단위 (PB1 및 PB2)로 구성됨), 핵단백질 (NP), 및 2개의 비구조 단백질 (NS1 및 NS2; NS2는 핵 수출 단백질 (NEP)이라고도 함). 일부 인플루엔자 A 바이러스는 또한 세포사멸 촉진 펩티드인 PB1-F2를 발현한다. PB2, PA, HA, NP 및 NA 절편은 각각 단일 발현 단백질을 암호화한다. PB1, M 및 NS 절편은 하나 이상의 단백질을 암호화한다. PB1 절편은 PB1 단백질뿐만 아니라 PB1-F2 단백질 (PB1 절편의 +1 판독 프레임에 암호화됨)을 암호화한다. M 절편은 M1 및 M2 단백질을 암호화한다. NS 절편은 NS1 및 NS2/NEP 단백질을 암호화한다. M2 및 NS2/NEP 단백질은 M 및 NS 절편으로부터 스플라이싱된 mRNA에서 발현된다.

인플루엔자 B 바이러스의 경우, 8개의 게놈 절편은 또한 11개의 단백질을 암호화하지만, 인플루엔자 A 바이러스와 약간의 차이점이 있다. 인플루엔자 A 바이러스의 경우 PB2, PA, HA 및 NP 절편이 각각 단일 발현 단백질을 암호화하고, NS 절편은 NS1 및 NS2/NEP 단백질을 암호화한다. PB1-F2 단백질은 인플루엔자 B 바이러스에 존재하지 않으며, 이는 PB1 절편이 PB1 단백질만을 암호화하는 것을 의미한다. NA 단백질 외에도 인플루엔자 B 바이러스의 NA 절편은 대체 -1 판독 프레임에서 NB 기질 단백질을 암호화한다. NB 기질 단백질은 인플루엔자 A의 M2 단백질에 해당한다. M 절편은 M1 단백질을 암호화하고, 대체 +2 판독 프레임에서 BM2 단백질을 암호화한다.

재배열 인플루엔자 바이러스는 둘 이상의 모 인플루엔자 바이러스 균주에서 유래된 게놈 절편을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스는 제1 모 인플루엔자 바이러스 균주 (공여 균주)로부터의 하나 이상의 유전자 절편, 및 제2 모 인플루엔자 바이러스 균주 (백신 균주)로부터의 하나 이상의 유전자 절편을 포함한다. 인플루엔자 공여 균주는 때때로 바이러스의 NA 절편을 제공할 수 있지만, 전형적으로 재배열 인플루엔자 바이러스에서 골격 절편을 제공하는 균주이다. 백신 균주는 HA 또는 NA 절편을 제공하는 인플루엔자 균주이다. 전형적으로, 재배열 인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 절편은 모두 백신 균주에서 유래한다. 본 발명의 방법에서, 발현 작제물의 일부로서 배양 숙주 내로 도입되는 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자는 백신 균주에서 유래한다. 백신 균주는 전형적으로 순환하는 균주이다. 백신 균주는 공여 균주와 상이하다.

재배열 바이러스에 존재하는 게놈 절편은 각 모 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 제공되는 절편 수를 나타내는 유전자 배열 비율을 사용하여 설명할 수 있다. 예를 들어, 재배열 바이러스가 2개의 모 인플루엔자 바이러스 균주 (예를 들어, 공여 균주 및 백신 균주)의 게놈 절편을 함유하는 경우, 재배열 바이러스의 유전자 배열 비율은 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2, 또는 7:1일 수 있다. 재배열 바이러스는 존재하는 경우 3개의 모 인플루엔자 바이러스 균주의 게놈 절편을 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, 재배열 바이러스의 유전자 배열 비율은 1:1:6, 1:2:5, 1:3:4, 1:4:3, 1:5:2, 1:6:1, 2:1:5, 2:2:4, 2:3:3, 2:4:2, 2:5:1, 3:1:2, 3:2:1, 4:1:3, 4:2:2, 4:3:1, 5:1:2, 5:2:1, 또는 6:1:1일 수 있다.

본 발명의 의해 제조된 재배열 바이러스의 게놈 절편의 대부분은 백신 균주로부터의 절편과 공여 균주 절편의 재배열을 통해 공여 균주의 특성을 이용하는 것이 바람직하기 때문에 전형적으로 공여 균주에서 유래한다. 이러한 특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스는 5:3, 6:2, 또는7:1의 유전자 배열 비율을 가지며, 여기서 비율의 첫 번째 숫자는 공여 균주로부터의 절편 수를 나타내고, 비율의 두 번째 숫자는 백신 균주로부터의 절편 수를 나타낸다.

바람직한 구현예에서, 재배열 인플루엔자 바이러스는 6:2의 유전자 배열 비율을 갖는다. 이들 구현예에서, 재배열 인플루엔자 바이러스는 공여 균주로부터의 6개의 골격 절편 (즉, PB1, PB2, PA, NP, M, 및 NS) 및 백신 균주로부터의 2개의 절편 (즉, HA 및 NA)을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 재배열 인플루엔자 바이러스는 6:2의 유전자 배열 비율을 갖는 재배열 인플루엔자 A 바이러스이다.

다른 구현예에서, 재배열 인플루엔자 바이러스는 7:1의 유전자 배열 비율을 갖는다. 이들 구현예 중 일부에서, 재배열 인플루엔자 바이러스는 공여 균주로부터의 6개의 골격 절편, 백신 균주로부터의 HA 절편, 및 공여 균주로부터의 NA 절편을 포함한다. 즉, 재배열 인플루엔자 바이러스는 백신 균주로부터의 HA 절편 및 공여 균주로부터의 나머지 7개 절편을 포함한다. 다른 구현예에서, 재배열 인플루엔자 바이러스는 공여 균주로부터의 6개의 골격 절편 및 HA 절편, 및 백신 균주로부터의 NA 절편을 포함한다. 즉, 재배열 인플루엔자 바이러스는 백신 균주로부터의 NA 절편 및 공여 균주로부터의 나머지 7개 절편을 포함한다. 7:1의 유전자 배열 비율은 재배열 인플루엔자 B 바이러스에 대해 바람직하다.

다른 구현예에서, 재배열 인플루엔자 바이러스는 5:3의 유전자 배열 비율을 갖는다. 이들 구현예에서, 재배열 바이러스는 5개의 골격 절편 (즉, PB1, PB2, PA, NP, M, 및 NS로 이루어진 군으로부터 선택된 5개의 절편) 및 백신 균주로부터의 3개의 절편을 포함한다. 이들 구현예에서, 백신 균주로부터의 3개의 절편은 HA, NA 및 하나의 골격 절편 (즉, PB1, PB2, PA, NP, M, 및 NS로 이루어진 군으로부터 선택된 1개의 절편)이다. 바람직한 구현예에서, 백신 균주로부터의 3개의 절편은 HA, NA 및 PB1이고 나머지 5개의 골격 절편 (즉, PB2, PA, NP, M 및 NS)은 공여 균주로부터의 것이다.

인플루엔자 바이러스 균주

본 발명의 방법에서, 배양 숙주가 접촉되는 모 인플루엔자 바이러스 균주는 공여 균주이다. 공여 균주는 복제가 가능하다 (즉, 감염 후 배양 숙주에서 증식할 수 있음). 배양 숙주를 공여 균주와 접촉시키면 바이러스가 배양 숙주를 감염시킬 때 공여 균주의 게놈 절편이 배양 숙주로 전달된다.

원하는 특성 세트를 보유하는 모든 인플루엔자 바이러스 균주를 공여 균주로서 사용할 수 있다. 특정 구현예에서, 공여 균주는 세포 및/또는 난에서 우수한 성장 특성을 갖는 균주이다. 전형적으로, 배양 숙주에서 바이러스가 증식될 때 HA의 수율에 따라 우수한 성장 특성이 측정된다. 우수한 성장 특성을 갖는 공여 균주는 고성장 모 균주 (HGP 균주)로 지칭될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 모 인플루엔자 바이러스 균주는 고성장 모 균주이다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 고성장 모 균주의 예로는 A/Puerto Rico/8/1934 (PR8), A/Texas/1/1977, A/New York/55/2004, A/Ann Arbor/6/60, A/Leningrad/134/17/57, B/Ann Arbor/1/66, B/Florida/4/2006, B/Panama/45/1990 및 B/Lee/1940가 있다. 바람직한 구현예에서, A/Puerto Rico/8/1934는 인플루엔자 A 바이러스에 대한 공여 균주이다. 고성장 모 균주와 비교하여 유사하거나 더 높은 바이러스 역가로 성장하는 균주를 공여 균주로 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에서 공여 균주로서 사용될 수 있는 인플루엔자 균주는 전형적으로 균질하지 않은 골격 절편의 집단을 배양 숙주에 제공한다. 이는 공여 균주가 균질하지 않은 비리온 집단을 포함하기 때문이다 (즉, 서열 변이체가 존재함). 이러한 변이체 골격 절편은 인플루엔자 바이러스 게놈의 자발적 돌연변이에서 발생할 수 있다. 돌연변이율은 세포 감염당 뉴클레오티드당 치환 (s/n/c)으로 표현될 수 있고, 인플루엔자 바이러스에 대해 10^-5에서 10^-7까지 다양하다. 이는 비리온 집단에서 약 1000개의 인플루엔자 비리온 중 1개가 게놈 세그먼트의 돌연변이를 포함한다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 공여 균주는 밀접하게 관련된 유사 종 인플루엔자 바이러스의 집단을 포함한다. 용어 "유사 종"은 단일 기원에서 유래하지만 서열 변이체를 함유하는 인플루엔자 바이러스를 나타내는 데 사용된다. 이것은 다른 기원 (별도의 종으로 간주됨)에서 유래된 인플루엔자 바이러스 간의 서열 변이와 상이하다. 따라서, 본 발명의 방법은 유사 종의 인플루엔자 바이러스 (즉, 단일 기원에서 유래된 서열 변이를 갖는 인플루엔자 바이러스)의 집단을 포함하는 공여 균주와 배양 숙주를 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 방식으로, 변형된 골격 절편의 집단이 배양 숙주에게 전달된다.

골격 절편 (예를 들어, NP 절편)의 집단 내의 변이는 골격 절편의 서열이 정렬될 때 골격 절편의 집단 내에서 가장 발산하는 2개의 서열 사이에서 상이한 서열 위치의 수에 따른 백분율로 표현될 수 있다. 서열 차이는 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 집단 내에서 가장 발산하는 2개의 서열을 확인하기 위해, 다중 서열 정렬을 수행할 수 있다. 여러 단백질 서열을 정렬하는 데 적합한 도구를 이용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Maderia et al. Nucleic Acids Research 2019 (47) doi: 10.1093/nar/gkz268]에서 언급된 바와 같이 디폴트 매개변수를 사용하는 클러스터 오메가 툴 (Clustal Omega tool)). 예를 들어, 실시예 5에서 논의된 바와 같이, NP 단백질은 498개의 아미노산 서열을 가지며, 44개의 돌연변이는 고전적인 재배열에 의해 제조된 H1N1 바이러스의 NP 단백질 아미노산 서열에서 확인되었다. 이는 H1N1 재배열 그룹 내에서 가장 발산하는 2개의 NP 단백질 서열을 비교할 때 NP 단백질에 걸쳐 약 9% 변이에 해당한다. 골격 단백질 전반엘 걸친 백분율 서열 변이는 하기 공식을 사용하여 계산될 수 있다:

일부 구현예에서, 공여 균주는 골격 절편의 하나 이상에서 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15% 또는 적어도 20% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종 집단을 포함한다. 유사 종의 공여 균주는 임의의 골격 절편에서 30% 이하의 아미노산 서열 변이를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 공여 균주는 M1 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다.

일부 구현예에서, 공여 균주는 NP 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여 균주는 NP 단백질에서 적어도 8% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다.

일부 구현예에서, 공여 균주는 NS1 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여 균주는 NS1 단백질에서 적어도 15% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다.

일부 구현예에서, 공여 균주는 PA 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다.

일부 구현예에서, 공여 균주는 PB2 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다.

일부 구현예에서, 공여 균주는 M1 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이, NP 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이, NS1 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이, PA 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이 및 PB2 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다.

일부 구현예에서, 공여 균주는 M1 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이, NP 단백질에서 적어도 8% 아미노산 서열 변이, NS1에서 적어도 15% 아미노산 서열 변이, PA 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이 및 PB2 단백질에서 적어도 5% 아미노산 서열 변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 유사 종의 집단을 포함한다.

본 발명의 발법에 사용하기 위해 다른 공여 균주를 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 공여 균주를 제조하기 위해, 인플루엔자 바이러스 균주는 본 발명의 방법에 사용되는 배양 숙주에서 증식될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 배양 숙주에서 인플루엔자 바이러스 균주를 계대시키면 변이 균주가 이들이 유래된 인플루엔자 바이러스 균주와 비교하여 (동일한 시간 및 동일한 성장 조건 하에서) 더 높은 바이러스 역가로 성장할 수 있도록 하는 서열 변이를 함유하는 변이 인플루엔자 균주가 생성된다. 따라서 변이 인플루엔자 균주는 본 발명의 방법에 사용되는 배양 숙주에서 개선된 성장 특성을 가지며, 바람직한 공여 균주이다. 예를 들어, A/Puerto Rico/8/1934 인플루엔자 균주를 세포 배양물에서 여러 번 계대하면 원래 A/Puerto Rico/8/1934 균주와 비교하여 세포에서 더 높은 바이러스 역가로 성장하는 변이 인플루엔자 균주 (PR8-X 균주)가 제조되었다. 따라서, 특정 구현예에서, PR8-X 균주는 공여 균주이다. 유사하게, A/New Caledonia/20/1999 균주를 세포 배양물에서 여러 번 계대하면 동일한 시간 및 동일한 성장 조건 하에서 야생형 A/New Caledonia/20/1999 균주와 비교하여 더 높은 바이러스 역가로 성장하는 변이 균주 (105p30 균주)가 제조되었다.

PR8-X의 유전자 절편은 서열 번호: 1 (PA), 서열 번호: 2 (PB1), 서열 번호: 3 (PB2), 서열 번호: 4 (NP), 서열 번호: 5 (M), 서열 번호: 6 (NS), 서열 번호: 7 (HA) 또는 서열 번호: 8 (NA)의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, PR8-X의 유전자 절편과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 절편을 포함하는 인플루엔자 균주를 공여 균주로서 사용할 수 있다.

105p30의 유전자 절편은 서열 번호: 9 (PA), 서열 번호: 10 (PB1), 서열 번호: 11 (PB2), 서열 번호: 12 (NP), 서열 번호: 13 (M), 서열 번호: 14 (NS), 서열 번호: 15 (HA) 또는 서열 번호: 16 (NA)의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 105p30의 유전자 절편과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 절편을 포함하는 인플루엔자 균주를 공여 균주로서 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 공여 균주는 전형적으로 공여 균주가 유래되는 인플루엔자 균주로 얻은 바이러스 역가와 비교할 때 개선된 바이러스 역가 및/또는 성장 동역학을 달성할 것이다. 특정 구현예에서, 공여 균주의 개선된 바이러스 역가는 공여 균주가 유래되는 인플루엔자 균주와 동일한 성장 조건 및 동일한 시간 (예를 들어 12시간, 24시간, 48시간 또는 72시간) 하에 성장할 때 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000% 이상 더 높다.

특정 구현예에서, 공여 균주는 백신을 제조하는데 사용하도록 규제 승인을 받은 균주이다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 재배열 바이러스가 백신을 제조하는 데 사용될 수 있고 이는 공여 균주가 기존 규제 승인을 받지 않은 경우보다 더 쉽게 시판될 수 있게 하기 때문에 규제 승인을 받은 공여 균주를 사용하는 것이 유리하다.

본 발명자들은 배양 숙주가 정제된 공여 균주와 접촉될 때 재배열 인플루엔자의 생산이 증진된다는 것을 발견하였다. 공여 균주를 정제하는 것은 공여 균주가 제2 HA 유전자 및/또는 제2 NA 유전자의 형질감염과 동시에 배양 숙주에 전달될 때 유리할 수 있다. 이것은 오염된 난 단백질 또는 세포 배양 단백질이 배양 숙주에 대한 발현 작제물의 형질감염을 방해할 수 있기 때문이다. 따라서, 일부 구현예에서, 배양 숙주는 정제된 공여 균주와 접촉한다. 이러한 특정 구현예에서, 배양 숙주는 정제된 공여 균주와 접촉하고, 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 작제물(들)은 형질감염에 의해 배양 숙주 내로 도입된다.

공여 균주는 방법에 사용하기 전에 세포 배양물 및/또는 난에서 증식되었을 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 배양 숙주를 감염시키기 위한 공여 균주 (예를 들어, 공여 균주 집단)를 제조하기 위해 세포 배양물 또는 난에서 인플루엔자 바이러스 균주를 계대하는 단계를 포함한다. 사전 계대 단계 (또는 하나 초과의 사전 계대 단계)는 이것이 배양 숙주에 전달되는 비리온의 집단에 존재하는 서열 변이체의 수를 증가시킬 수 있기 때문에 유리할 수 있다.

공여 균주는 표준 방법을 사용하여 세포 배양 배지 또는 요막액으로부터 농축 및 정제할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 배양 숙주가 공여 균주와 접촉하기 전에 공여 균주를 정제하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 정제 프로세스는 자당 구배 용액 또는 친화성 크로마토그래피 방법을 사용한 원심분리를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 공여 균주는 여과 및/또는 원심분리에 의해 정제된다. 한 구현예에서, 공여 균주를 정제하는 단계는 여과 단계에 이은 원심분리 단계를 포함한다. 예를 들어, 공여 균주를 포함하는 배양 배지 또는 요막액은 0.45μm 필터를 통해 여과될 수 있고, 후속적으로 원심분리 필터 장치를 사용하여 예를 들어 약 1400 x g에서 1시간 동안 원심분리에 의해 정제될 수 있다. 정제 후, 공여 균주는 본 발명의 방법에 사용하기 전에, 정제된 공여 균주가 저장 및 수송되도록 하는 완충액, 예를 들어 PBS에 현탁될 수 있다.

헬퍼 바이러스는 (예를 들어, RNA-의존성 RNA 중합효소 (RdRp) 또는 바이러스 게놈 복제에 관여하는 기타 단백질과 같은 구성성분을 제공함으로써) 발현 작제물로부터의 인플루엔자 유전자 절편의 발현을 촉진하기 위해 초기 유전자 기술에 사용되었다. 전형적으로, 이러한 초기 역 유전학 시스템은 바이러스 절편-암호화 RNA, 정제된 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질 및 바이러스 핵단백질 구성성분을 포함하는 리보핵단백질 복합체 형태의 발현 작제물을 사용하였다. 이러한 단백질 구성성분은 RNA에 의해 암호화된 바이러스 절편을 배양 숙주로 복제하는 데 필요한 기계를 전달하였다. 리보핵단백질 복합체 (RdRp 및 NP)의 단백질 구성성분은 바이러스 절편-암호화 RNA를 사용한 시험관내 조립 전에 인플루엔자 바이러스로부터 정제할 필요가 있다. RNP 구성성분으로 배양 숙주를 형질감염시키는 것 외에도, 바이러스의 효율적인 생산을 위해 헬퍼 바이러스가 필요하다. 그러나, 헬퍼 바이러스의 구성 성분은 일반적으로 이러한 역 유전학 기술에서 제조된 재배열 바이러스에 통합하기 위한 것이 아니다. 역 유전학 시스템에서 사용된 발현 작제물의 후속 개발은 RNP나 헬퍼 바이러스 구성성분 모두 필요하지 않다는 것을 의미했는데, 그 이유는 후기 발현 작제물이 바이러스 입자를 제조하는데 필요한 모든 구성성분을 제공할 수 있기 때문이다.

본 발명의 방법에서 배양 숙주와 접촉하는 모 인플루엔자 바이러스 균주는 바이러스 게놈의 복제에 관여하는 모 인플루엔자 바이러스 균주의 구성성분이 본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스로의 통합을 위한 것이기 때문에 헬퍼 바이러스가 아니다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에는 헬퍼 바이러스가 없다.

발현 작제물

본 발명의 방법에서, 하나 이상의 인플루엔자 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 작제물(들)은 배양 숙주 내로 도입된다. 하나 이상의 발현 작제물(들)은 공지된 역 유전학 기술로부터 발현 작제물(들)을 도입하기 위한 임의의 방법을 사용하여 세포 배양물 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 방법은 외인성으로 첨가된 RNP의 사용은 필요로 하지 않으며, 따라서 하나 이상의 발현 작제물(들)과 함께 제공되는 추가적인 바이러스 RNA-유도된 RNA 중합효소 단백질 및 바이러스 핵단백질을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 리보핵단백질 복합체 (예를 들어, 정제된 RNA-의존성 RNA 중합효소 단백질 및 바이러스 핵단백질과 복합체화된 바이러스 절편-암호화 RNA)는 발현 작제물이 아니다. 본 발명에 따른 발현 작제물에는 RNP가 없다. 하나 이상의 발현 작제물(들)을 배양 숙주 내로 도입시키는 단계는 배양 숙주를 리보핵단백질 복합체와 접촉시키거나 형질감염시키지 않고 (예를 들어, 동시에 또는 별도로 배양 숙주를 RNP 복합체와 접촉시키거나 형질감염시키지 않고) 하나 이상의 발현 작제물(들)을 배양 숙주 내로 전달하는 것을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 인플루엔자 비리온은 발현 작제물이 아니다. 이는 배양 숙주를 인플루엔자 균주와 접촉시키는 것이 배양 숙주 내로 하나 이상의 발현 작제물(들)을 도입하는 것에 해당하지 않는다는 것을 의미한다. 즉, 배양 숙주 내로 하나 이상의 발현 작제물(들)을 도입하는 단계는 배양 숙주를 인플루엔자 비리온과 접촉시키거나 감염시키지 않는 수단을 통해 배양 숙주 내로 하나 이상의 발현 작제물(들)을 전달하는 것을 포함한다. 이것은 모든 인플루엔자 유전자가 모 인플루엔자 바이러스 균주에 의한 감염을 통해 배양 숙주에 전달되는 고전적인 재배열과 상이하다.

본 발명에서 사용하기 위한 발현 작제물은 전형적으로 (예를 들어, 당업자에게 공지된 재배열 기술을 사용하여) 시험관 내에서 조립될 수 있는 재배열 또는 합성 핵산 작제물이다. 하나 이상의 발현 작제물(들)을 사용하는 것은 (고전적인 재배열 방법론의 경우와 같이) 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 필요한 인플루엔자 유전자가 제공되는 것이 불가능한 방식으로 인플루엔자 유전자의 서열이 정확하게 조작될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 발현 작제물은 단방향 또는 양방향성 발현 작제물일 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 감염성을 위한 단백질을 필요로하므로, 일반적으로 양방향성 발현 작제물을 사용하는 것이 바람직한데, 양방향성 발현 작제물은 숙주 세포에 필요한 발현 작제물의 총 수를 감소시키기 때문이다. 따라서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 유전자 또는 cDNA가 상류의 pol II 프로모터와 하류의 비-내인성 pol I 프로모터 사이에 위치하는 적어도 하나의 양방향성 발현 작제물을 이용할 수 있다. pol II 프로모터로부터의 유전자 또는 cDNA의 전사는 단백질로 번역될 수 있는 캡핑된 양성-센스 바이러스 mRNA를 제조하는 반면, 비-내인성 pol I 프로모터로부터의 전사는 음성-센스 vRNA를 제조한다. 양방향성 발현 작제물은 양방향성 발현 벡터일 수 있다.

양방향성 발현 작제물은 동일한 작제물에서 상이한 방향 (즉, 5'에서 3'으로 및 3'에서 5'으로 둘 모두)으로 발현을 유도하는 적어도 2개 이상의 프로모터를 함유한다. 2개의 프로모터는 동일한 이중 가닥 DNA의 다른 가닥에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 바람직하게는 프로모터 중 하나는 pol I 프로모터이고 다른 프로모터 중 적어도 하나는 pol II 프로모터이다. 이것은 pol I 프로모터가 캡핑되지 않은 vRNA를 발현하는데 사용될 수 있는 반면 pol II 프로모터는 이후에 단백질로 번역될 수 있는 mRNA를 전사하는데 사용될 수 있고, 이로써 동일한 작제물로부터 RNA 및 단백질의 동시 발현을 허용할 수 있기 때문에 유용하다. 하나 이상의 발현 작제물이 발현 시스템 내에서 사용되는 경우, 프로모터는 내인성 및 비-내인성 프로모터의 혼합물일 수 있다.

발현 작제물에 사용된 pol I 및 pol II 프로모터는 숙주 세포가 유래되는 동일한 분류학적 순서로부터 유기체에 대해 내인성일 수 있다. 대안적으로, 프로모터는 숙주 세포와 상이한 분류학적 순서로 유기체로부터 유래할 수 있다. 용어 "순서"는 기존의 분류학적 순위를 말하며, 순서의 예로는 영장류, 설치류, 육식 동물류, 유대목류, 고래류 등이다. 인간과 침팬지는 같은 분류학적 순서 (영장류)에 있지만, 인간과 개는 다른 순서 (영장류 대 육식동물류)에 있다. 예를 들어, 인간 pol I 프로모터는 개의 세포 (예를 들어, MDCK 세포)에서 바이러스 절편을 발현하기 위해 사용될 수 있다 [9].

발현 작제물은 전형적으로 RNA 전사 종결 서열을 포함할 것이다. 종결 서열은 내인성 종결 서열이거나 숙주 세포에 내인성이 아닌 종결 서열일 수 있다. 적합한 종결 서열은 당업자에게 자명할 것이며, RNA 중합효소 I 전사 종결 서열, RNA 중합효소 II 전사 종결 서열, 및 리보자임을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 나아가, 발현 작제물은 mRNA에 대한 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를, 특히 그것의 발현이 pol II 프로모터에 의해 제어되는 유전자의 단부에 함유할 수 있다.

발현 작제물은 벡터, 예컨데 플라스미드 또는 다른 에피솜성 작제물일 수 있다. 이러한 벡터는 전형적으로 적어도 하나의 박테리아 및/또는 진핵생물 복제 기원을 포함할 것이다. 나아가, 벡터는 원핵세포 및/또는 진핵세포에서의 선택을 허용하는 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 선택가능한 마커의 예로는 항생물질, 예컨데 암피실린 또는 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자이다. 벡터는 DNA 서열의 복제를 용이하게 하기 위한 하나 이상의 다수의 복제 부위를 추가로 포함할 수 있다.

발현 작제물은 선형 발현 작제물일 수 있다. 이러한 발현 작제물은 전형적으로 어떠한 증폭 및/또는 선택 서열을 함유하지 않을 것이다. 그러나, 이러한 증폭 및/또는 선택 서열을 포함하는 선형 작제물 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 참고문헌 6은 각 바이러스 절편에 대한 개별적인 선형 발현 작제물을 묘사하는 선형 발현 작제물을 기술한다. 또한 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6개의 바이러스 절편을 동일한 선형 발현 작제물 상에 포함하는 것도 가능하다. 이러한 시스템은 예를 들어 참고문헌 6에 기술되어 있다.

발현 작제물은 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들어 참고문헌 10에 기술되어 있다. 발현 작제물이 선형 발현 작제물인 경우, 그것을 숙주 세포 내로 도입시키기 전에 단일 제한 효소 부위를 활용하여 선형화하는 것이 가능하다. 대안적으로, 적어도 2개의 제한 효소 부위를 사용하여 벡터로부터 발현 작제물을 잘라내는 것이 가능하다. 게다가, 핵산 증폭 기술을 사용하여 (예를 들어, PCR에 의해) 그것을 증폭시킴으로써 선형 발현 작제물을 얻는 것 또한 가능하다.

본 발명의 방법에 사용된 발현 작제물은 비-박테리아 발현 작제물일 수 있다. 이것은 작제물이 그 안에 암호화된 바이러스 RNA 절편의 진핵세포에서의 발현을 구동시킬 수 있지만, 박테리아에서의 작제물의 증식에 필요한 구성성분들을 포함하지 않은 것을 의미한다. 따라서 작제물은 박테리아 복제 기원 (ori)을 포함하지 않을 것이며, 보통은 박테리아 선택 마커 (예를 들어, 항생물질 내성 마커)를 포함하지 않을 것이다. 이러한 발현 작제물은 참고문헌 7에 기술된다.

발현 작제물은 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 발현 작제물은 화학적 합성에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 제조될 수 있다. 화학적 합성에 의해 발현 작제물을 제조하는데 적합한 방법은 예를 들어 참고문헌 7에 기술된다. 따라서, 특정 구현예에서 발현 작제물은 합성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 발현 작제물은 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 작제물은 합성 RNA 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 발현 작제물은 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 작제물은 전기천공, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포솜, 미세주입, 또는 미세입자-폭발을 사용함으로써 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

일부 구현예에서, 발현 작제물은 네이키드 핵산의 형태일 수 있다. 네이키드 핵산은 인플루엔자 바이러스에서 정제되었을 수 있다. 다른 구현예에서, 발현 작제물은 전사된 RNA의 형태일 수 있다. 다른 구현예에서, 발현 작제물은 하나 이상의 셔틀 벡터의 형태일 수 있다. 셔틀 벡터의 예에는 비-인플루엔자 바이러스 및 레플리콘, 예를 들어 알파바이러스 기반 레플리콘이 포함된다.

발현 작제물의 뉴클레오티드 서열은 조작될 수 있으며, 이는 본 발명의 방법에서 제조된 재배열 바이러스에 존재하는 인플루엔자 절편의 서열이 제어되도록 한다. 따라서, 발현 작제물에 의해 암호화된 인플루엔자 HA는 야생형 바이러스에서 발견되는 것과 같은 천연 HA 또는 변형된 HA를 가질 수 있다. 예를 들어, 바이러스를 고병원성으로 만드는 결정인자 (예를 들어, HA1/HA2 절단 부위 주변의 초염기성 영역)를 제거하기 위해 HA를 변형시키는 것이 알려져 있다. 일부 구현예에서, HA는 다염기성 절단 부위를 제거하도록 변형된다. 이러한 특정 구현예에서, HA는 H5 또는 H7 인플루엔자 균주로부터 유래하고, 다염기성 절단 부위를 포함하지 않는다. 유사하게, 발현 작제물에 의해 암호화된 인플루엔자 NA는 야생형 바이러스에서 발견되는 것과 같은 NA, 또는 변형된 NA를 가질 수 있다. 예를 들어, 백신 균주 NA가 기존의 뉴마미니다제 억제제 내성 돌연변이를 포함하는 경우 NA는 항바이러스성 뉴라미니다제 억제제에 대한 민감성을 부여하도록 변형될 수 있다. 인플루엔자 유전자 (예를 들어, HA 또는 NA 유전자)를 발현 작제물 상의 배양 숙주 내로 도입시키면 배양 숙주 내로 도입되기 전에 서열이 변형될 수 있다.

HA 및/또는 NA 서열은 또한 하나 이상의 인플루엔자 균주로부터의 서열을 함유하는 키메라 HA 또는 키메라 NA 서열을 제조하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 HA 또는 키메라 NA는 1개의 균주로부터의 HA 또는 NA의 세포질, 또는 세포질 및 막횡단 부분 및 적어도 다른 균주로부터의 HA 또는 NA의 세포외 항원성 부분을 함유할 수 있다. 이 접근법은 변형되지 않은 HA 및/또는 NA 절편이 낮은 수율로 제조될 수 있는 상황에서 HA 또는 NA의 항원성 부분을 함유하는 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위한 기술로 이전에 기술되었다. 그러나, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스 균주에 의한 감염에 의해 배양 숙주에 전달되는 비리온의 집단에 존재하는 서열 변이체가 비-키메라 HA 및 및/또는 비-키메라 NA를 포함하는 재배열 바이러스의 효율적인 생산을 위한 충분한 변이를 제공할 수 있기 때문에 키메라 HA 및/또는 키메라 NA 절편의 사용에 대한 필요성을 피할 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, HA 서열은 비-키메라 HA 서열이다. 즉, HA 서열은 동일한 인플루엔자 균주로부터의 세포질, 막횡단 및 세포외 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, NA 서열은 비-키메라 NA 서열이다. 즉, NA 서열은 동일한 인플루엔자 균주로부터의 세포질, 막횡단 및 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, HA 서열 및/또는 NA 서열이 비-키메라 서열이지만, 본원에 기술한 바와 같은 다른 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비-키메라 HA 서열은 바이러스를 고병원성으로 만드는 결정인자 (예를 들어, HA1/HA2 절단 부위 주변의 초염기성 영역)를 제거하도록 변형될 수 있다. 유사하게, 백신 균주 NA가 기존의 뉴라미니다제 억제제 내성 돌연변이를 포함하는 경우, 비-키메라 NA 서열은 항바이러스성 뉴라미니다제 억제제에 대한 민감성을 부여하도록 변형될 수 있다.

배양 숙주에 전달되는 인플루엔자 유전자의 수는 본 발명의 방법에 의해 제어될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 7개 이하의 인플루엔자 유전자를 포함한다. 7개 이하의 인플루엔자를 제공하면, 고전적인 제배열(여기서 8개의 절편이 제2 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 제공된) 보다 더 적은 수의 인플루엔자 유전자가 배양 숙주에 제공되고 따라서 방법에 의해 생성된 재배열 바이러스에 존재할 수 있는 유전자 배열 비율의 수를 감소시키기 때문에 유리하다. 인플루엔자 유전자의 수를 추가로 제한함으로써, 방법에 의해 생성된 재배열 바이러스에 존재할 수 있는 유전자 배열 비율 또한 제한된다. 하나 이상의 발현 작제물(들)은 6개 이하의 인플루엔자 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 5개 이하의 인플루엔자 유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 4개 이하의 인플루엔자 유전자를 포함한다.

더 적은 수의 인플루엔자 유전자를 제공하는 것은 특정 유전자 배열 비율을 갖는 재배열 바이러스의 생산을 최대화하고자 할 때 특히 유리할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 발현 작제물(들)이 단일 HA 유전자 및 단일 NA 유전자만을 포함할 때 7:1 및 6:2 바이러스를 제조할 가능성이 증가한다. 이는 재배열 바이러스의 생산을 위한 배양 숙주에 존재하는 유일한 골격 절편이 공여 균주이기 때문이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 2개 이하의 인플루엔자 유전자를 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 하나의 HA 유전자 및 하나의 NA 유전자를 포함한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 3개 이하의 인플루엔자 유전자를 포함한다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 하나의 HA 유전자, 하나의 NA 유전자 및 하나의 골격 유전자를 포함한다. 골격 절편은 PB2, PB1, PA, NP, M, 및 NS로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 골격 유전자는 PB1이다. 배양 숙주에 HA 및 NA 유전자가 있는 단일 골격 절편을 도입시키면 5:3 재배열 바이러스를 생산할 수 있다. 이들 구현예에서, 공여 균주로부터의 상응하는 골격 절편에 대한 음성 선택은 바람직하게는 골격 절편의 전사 및/또는 번역을 억제하는 제제를 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, RNAi 제제가 사용된다. 전사 및/또는 번역을 억제하는 제제를 사용하는 것은 골격 절편이 HA 및 NA보다 인플루엔자 비리온의 표면 상에 덜 노출되고 따라서 골격 절편을 위한 또는 골격 절편에 대한 하나 이상의 항체를 사용하는 선택에 덜 순응하기 때문에 유리하다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 단일 인플루엔자 유전자 만을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 단일 인플루엔자 유전자는 제2 HA 유전자이다. 본 발명의 이러한 측면은 공여 균주로부터 NA 유전자를 갖는 재배열 바이러스를 제조하는 것이 바람직한 상황에서 유용하다. 단일 HA 유전자만을 포함하는 하나 이상의 발현 작제물(들)을 사용하면 배양 숙주에 단일 제2 HA 유전자만이 존재하기 때문에 7:1 재배열 바이러스의 생산을 증가시킨다. 다른 구현예에서, 단일 인플루엔자 유전자는 제2 NA 유전자이다. 본 발명의 이러한 측면은 공여 균주로부터 HA 유전자를 갖는 재배열 바이러스를 제조하는 것이 바람직한 상황에서 유용하다. 단일 NA 유전자만을 포함하는 하나 이상의 발현 작제물(들)을 사용하면 배양 숙주에 단일 제2 NA 유전자만이 존재하기 때문에 7:1 재배열 바이러스의 생산을 증가시킨다. 본 발명의 이러한 구현예는 바람직한 특징을 갖는 재배열 인플루엔자 B 바이러스가 모 인플루엔자 B 균주를 함유할 수 있기 때문에 재배열 인플루엔자 B 바이러스를 제조하고자 할 때 특히 유용한다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 배양 숙주가 공여 균주와 접촉함과 동시에 배양 숙주 내로 도입된다. 배양 숙주가 공여 균주와 접촉함과 동시에 배양 숙주 내로 하나 이상의 발현 작제물(들)을 도입하는 것 또한 공동-전달(co-delivery)로 기술될 수 있다. 본 발명자들은 발현 작제물(들)의 전달 및 공여 균주로의 감염이 동시에 재배열 인플루엔자 바이러스의 생산을 증진시킨다는 것을 발견하였다. 본 발명의 맥락에서, 동시는 5분 이내를 의미한다. 결과적으로, 배양 숙주를 공여 균주와 접촉시킨 후 최대 5분 후에 배양 숙주에 하나 이상의 발현 작제물(들)을 도입하는 것은 동시에 전달되는 것으로 간주된다.

한 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)의 공동-전달 및 배양 숙주를 공여자 균주와 접촉시키는 것은 발현 작제물(들) 및 정제된 공여 균주의 동시-형질감염을 포함한다. 이러한 특정 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 정제된 모 인플루엔자 균주와 혼합되고 당업자에게 공지된 임의의 형질감염 방법을 사용하여 숙주 세포에 전달된다. 적합한 형질감염 방법은 전기천공, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포솜, 미세주입, 또는 미세입자-폭발 또는 기타 형질감염 시약을 포함한다.

다른 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 배양 숙주가 공여 균주와 접촉하기 전에 배양 숙주 내로 도입된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 배양 숙주가 공여 균주와 접촉한 후에 배양 숙주 내로 도입된다. 특정 구현예에서 배양 숙주와의 접촉과 하나 이상의 발현 작제물의 도입 사이의 시간 차이는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 120 또는 180분 이하이다. 다른 구현예에서 배양 숙주와의 접촉과 하나 이상의 발현 작제물의 도입 사이의 시간 차이는 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 또는 24시간 이하이다. 특정 구현예에서 배양 숙주와의 접촉과 하나 이상의 발현 작제물의 도입 사이의 시간 차이는 1-3시간이다. 이러한 시차를 둔 전달은 공동-전달이 실용적이지 않은 상황에서 유리할 수 있다.

배양 숙주 내로 도입된 하나 이상의 발현 작제물(들)은 인플루엔자 A 바이러스 HA 하위유형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16을 포함할 수 있다. 이들은 인플루엔자 A 바이러스 NA 하위 유형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9를 함유할 수 있다. 배양 숙주 내로 도입된 하나 이상의 발현 작제물(들)은 계절성 인플루엔자 유전자로부터의 하나 이상의 인플루엔자 유전자를 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 예를 들어 H1 또는 H3 하위유형을 갖는 HA를 함유할 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서 하나 이상의 발현 작제물(들)은 H1N1 또는 H3N2 균주인 백신 균주로부터의 인플루엔자 유전자를 포함한다.

재배열 바이러스의 생산, 선택 및 분리

공여 균주와 접촉하며 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 작제물이 도입되는 배양 숙주를 배양함으로써 제조된 재배열 바이러스는 하나 이상의 발현 작제물(들)에 의해 암호화되는 공여 균주 및 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자로부터의 인플루엔자 유전자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 공여 균주와 접촉하며 제2 HA 유전자 및 제2 NA 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 작제물이 도입되는 배양 숙주를 배양함으로써 제조된 재배열 바이러스는 하나 이상의 발현 작제물(들)에 의해 암호화되는 공여 균주 및 제2 HA 유전자 및 제2 NA 유전자로부터의 인플루엔자 유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 공여 균주와 접촉하며 제2 HA 유전자, 제2 NA 유전자, 및 제2 골격 유전자(즉, PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자)를 포함하는 하나 이상의 발현 작제물이 도입되는 배양 숙주를 배양함으로써 제조된 재배열 바이러스는 하나 이상의 발현 작제물(들)에 의해 암호화되는 공여 균주, 제2 HA 유전자, 제2 NA 유전자 및 제2 골격 유전자를 포함한다.

본 발명의 방법은 또한 제2 HA 유전자(즉, 백신 균주의 HA 유전자)를 포함하는 재배열 바이러스의 생산을 증진시키기 위한 선택 단계를 포함한다. 선택 단계는 백신 균주(제2 HA 유전자)로부터 유래된 HA를 포함하는 재배열 바이러스의 선택을 증진시키는 임의의 방법을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 재배열 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위해 배양 숙주를 배양한 후에 수행된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은: (i) 배양 숙주를 제1 헤마글루티닌(HA) 유전자 및 제1 뉴라미니다제(NA) 유전자를 포함하는 모 인플루엔자 바이러스스 균주와 접촉시키는 단계; (ii) 인플루엔자 유전자가 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자를 포함하는, 하나 이상의 인플루엔자 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 작제물(들)을 배양 숙주내로 도입시키는 단계; (iii) 배양 숙주를 배양하여 재배열 바이러스를 제조하는 단계; 및 그 다음에 재배열 바이러스가 제조된 후, (iv) 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자를 포함하는 재배열 바이러스를 선택하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 선택 단계 이전에 배양 숙주로부터 재배열 바이러스를 분리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 재배열 바이러스를 포함하는 세포 배양 상척액을 배양 숙주로부터 분리하고, 재배열 바이러스를 포함하는 상청액에 대해 선택 단계를 수행한다.

일부 구현예에서, 선택 단계는 공여 균주로부터의 HA를 포함하는 재배열 바이러스에 대한 음성 선택을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 백신 균주로부터의 HA를 포함하는 재배열 바이러스에 대한 양성 선택을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계는 하나 이상의 음성 선택 단계와 하나 이상의 양성 선택 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 선택 단계는 하나 이상의 음성 선택 단계를 포함하지만 양성 선택 단계를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 선택 단계는 양성 선택 단계를 포함하지만 음성 선택 단계를 포함하지 않는다. 하나 이상의 음성 선택(들)은 백신 균주에서 유래된 HA를 포함하는 재배열 바이러스의 생산을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 양성 선택(들)은 백신 균주에서 유래된 HA를 포함하는 재배열 바이러스의 생산을 증진시키기 위해 사용될 수 있다.

음성 및/또는 양성 선택 단계는 또한 백신 균주로부터의 다른 절편을 포함하는 재배열 바이러스의 생산을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 선택 단계는 백신 균주에서 유래된 NA(제2 NA 유전자)를 포함하는 재배열 바이러스의 선택을 증진시킨다. 바람직한 구현예에서, 선택 단계는 백신 균주로부터의 HA 및 NA를 포함하는 재배열의 선택을 증진시킨다. 추가 구현예에서, 선택 단계는 백신 균주로부터의 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 절편을 포함하는 재배열 바이러스의 선택을 증진시킨다. 바람직한 구현예에서 선택 단계는 바이러스 균주의 HA, NA 및 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 절편으로 이루어진 군으로부터 선택된 골격 절편을 포함하는 재배열 바이러스의 선택을 증진시킨다.

일부 구현예에서, 음성 선택은 배양 숙주를 제1 HA 단밸질에 대한 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 음성 선택은 배양 숙주로부터 분리된 재배열 바이러스를 제1 HA 단백질에 대한 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 음성 선택은 방법에 의해 제조된 재배열 바이러스를 포함하는 세포 배양 상청액을 제1 HA 단백질에 대한 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 제1 HA 단백질에 대한 항혈청에 존재한다. 다른 구현예에서, 제1 HA 단백질에 대한 하나 이상의 단일클론 항체는 음성 선택 단계에서 사용된다.

음성 선택은 또한 백신 균주의 HA 유전자 또는 단백질에 비해 공여 균주의 HA 유전자 또는 단백질의 전사 및/또는 번역을 우선적으로 감소시키는 억제제에 배양 숙주를 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 전사 또는 번역 수준에서 공여 균주의 HA 유전자 또는 단백질 수준의 우선적 감소는 백신 균주의 HA 유전자가 통합되고 전파될 가능성이 그들의 상대적 풍부도가 증가함에 따라 증가하기 때문에 백신 균주의 HA를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스의 형성에 유리하다. 적합한 억제제는 당업자에게 공지되어 있을 것이며 다른 곳에서 기술된다 [11]. 특정 구현예에서, 공여 균주의 HA 유전자 또는 단백질의 전사 및/또는 번역을 우선적으로 감소시키는 억제제는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 또는 예를 들어 포스포로티오에이트 올리고머 (PSO) 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)와 같은 작은 간섭 DNA (siDNA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 공여 균주의 HA 유전자 또는 단백질의 전사 및/또는 번역을 우선적으로 감소시키는 하나 이상의 억제제가 사용된다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 백신 균주의 HA 유전자 또는 단백질에 비해 공여 균주의 HA 유전자 또는 단백질의 전사 및/또는 번역을 우선적으로 감소시키는 억제제에 배양 숙주를 노출시키는 것을 포함하지 않는다.

바람직한 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 제2 HA 유전자 및 제2 NA 유전자를 포함한다. 이들 구현예에서, 선택 단계는 배양 숙주를 제1 HA 단백질에 대한 하나 이상의 항체 및/또는 NA 단백질에 대한 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체는 제1 HA 및/또는 NA 단백질에 대한 항혈청에 존재한다. 다른 구현예에서, 제1 HA 단백질에 대한 하나 이상의 단일클론 항체 및/또는 제1 NA 단백질에 대한 하나 이상의 단일클론 항체가 음성 선택 단계에서 사용된다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 발현 작제물(들)은 제2 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자를 포함한다. 이들 구현예에서, 추가적인 골격 절편(즉, PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 절편)은 백신 균주에 의해 배양 숙주에 제공된다. 이러한 구현예는 제2 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자 절편을 함유하는 재배열 바이러스의 생산을 증진시키기 위하여 공여 균주의 제1 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자에 대한 음성 선택 단계를 포함할 수 있다. 백신 균주의 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자 절편에 비해 공여 균주의 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP의 전사 및/또는 번역을 우선적으로 감소시키는 억제제를 사용하는 음성 선택이 바람직하다. 그 이유는 골격 절편에 의해 암호화된 단백질이 HA 및 NA 단백질만큼 인플루엔자 비리온의 표면의 항체에 쉽게 접근할 수 없고 따라서 골격 절편의 번역 또는 전사를 억제하는 것이 하나 이상의 항체에 노출되는 것 보다 음성 선택 단계로서 더 효과적이기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 제2 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자 절편에 대한 하나 이상의 항체에 배양 숙주를 노출시키는 것은 노출은 대안적으로 또는 추가로 음성 선택 단계로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 백신 균주의 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자 절편에 비해 공여 균주의 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자 절편의 전사 및/또는 번역을 우선적으로 감소시키는 억제에 배양 숙주를 노출시키는 것을 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, 양성 선택 단계는 배양 숙주를 제2 HA 단백질에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 양성 선택 단계는 배양 숙주로부터 분리된 재배열 바이러스를 제2 HA 단백질에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 양성 선택 단계는 방법에 의해 제조된 재배열 바이러스를 포함하는 세포 매양 상청액을 제2 HA 단백질에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 방식으로, 제2 HA 유전자를 포함하는 재배열 바이러스는 배양 숙주로부터 양성으로 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 양성 선택에 사용되는 하나 이상의 항체가 (예를 들어, 자기 비드 (magnetic bead)로) 표지된다. 표지는 제2 HA 유전자를 포함하는 재배열 바이러스의 후속 분리를 돕는다.

본 발명의 방법은 하나 이상의 선택 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재배열 바이러스는 항혈청의 존재 하에 여러 번 계대될 수 있다. 다중 선택 단계는 제2 HA 유전자를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스의 선택을 증진시키기 위해 수행된다. 바람직한 구현예에서, 다중 선택 단계는 제2 HA 유전자를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스의 선택을 향상시키기 위해 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 2, 3, 4, 5 또는 6개의 음성 선택 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 2개의 음성 선택 단계를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 3개의 음성 선택 단계를 포함한다.

본 발명의 방법에서 하나 이상의 발현 작제물(들)을 사용하는 것은 모든 인플루엔자 유전자 절편이 모 인플루엔자 바이러스 균즈에 의해 제공될 때 고전적인 재배열에 존재하는 것 보다 더 적은 바람직하지 않은 서열 변이체 또는 유사-종을 포함함을 의미한다. 결과적으로, 상기 방법은 전형적으로 원하는 재배열 바이러스를 제조하기 위해 더 적은 수의 선택 단계를 필요로 한다. 더 적은 수의 선택 단계는 재배열 바이러스가 고전적인 재배열 보다 더 빠르게 제조될 수 있음을 의미한다. 따라서, 한 구현예에서, 방법은 단일 선택 단계만 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 2개 이하의 선택 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 방법은 3개 이하의 선택 단계를 포함한다. 선택 단계는 같이 (즉, 동시에) 또는 순차적으로(즉, 차례대로) 수행될 수 있다.

선택 단계는 특정 유전자 배열 비율을 갖는 바이러스를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 유전자에 대한 선택 단계는 7:1 바이러스의 생산을 증가시키는 데만 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 음성 선택은 단일 인플루엔자 절편에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 음성 선택은 HA 유전자 단독에 대한 것이다. 다른 구현예에서, 음성 선택은 NA 유전자 단독에 대한 것이다. 유사하게, 6:2 재배열 바이러스의 생산을 증가시키려고 할 때, 음성 선택은 2개의 인플루엔자 절편에 대한 것이다. 이들 구현예에서, 선택은 전형적으로 공여 균주의 HA 및 NA 절편에 대한 음성 선택이다.

일부 구현예에서, 선택 단계는 방법의 첫 번째 단계에서 사용된 동일한 배양 숙주에서 수행된다. 다른 구현예에서, 선택 단계는 상이한 배양 숙주에서 수행된다. 이들 구현예에서, 방법의 단계 (iii)에서 제조되는 바이러스는 하나 이상의 음성 선택 단계가 수행되는 제1 배양 숙주에서 제2 배양 숙주로 전달된다. 제1 배양 숙주 및 제2 배양 숙주는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 구현예에서, 제1 배양 숙주는 세포이고, 제2 배양 숙주는 부화된 계란 (embryonated hen egg)이다.

본 발명의 방법은 특정 부류의 재배열 바이러스가 분리될 수 있는 재배열 바이러스의 풀을 제조한다. 이것은 더 적은 수의 변이체와 저 적은 바이러스의 다양성이 역 유전학 기술에서 제조되기 때문에 역 유전하게 의해 제공되는 것 보다 바이러스 특정 특성을 선택하는데 큰 능력을 제공한다. 특정 재배열 인플루엔자 바이러스의 분리는 유리한 특성을 갖는 재배열 바이러스가 추가 프로세싱을 위해 선택될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 높은 성장 특성을 가지며 순환하는 인플루엔자 균주의 HA 및 NA를 포함하는 재배열 바이러스는 백신 제조에서 종자 바이러스를 사용하기 위해 분리될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 제2 HA 유전자 및 제2 NA 유전자를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 방법은 재배열 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 A HA를 갖는 재배열 바이러스를 제조한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인플루엔자 A HA 및 NA를 갖는 재배열 인플루엔자 A 바이러스 또는 재배열 바이러스를 제조한다. 백신 종자 바이러스의 분석은 인플루엔자 A 종자 바이러스의 95%가 6:2 또는 5:3 유전자 배열 비율을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 방법은 6:2 또는 5:3 재배열 바이러스를 생성할 가능성을 증가시키는 제한된 수의 골격 절편을 제공하기 때문에 인플루엔자 A 종자 바이러스를 생성하는데 특히 효과적이다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 HA 하위유형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16을 함유할 수 있다. 그들은 인플루엔자 A 바이러스 NA 하위유형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9를 함유할 수 있다. 본 발명의 재배열 인플루엔자 바이러스에 사용되는 백신 균주가 계절성 인플루엔자 균주인 경우, 백신 균주는 H1 또는 H3 하위유형을 가질 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 백신 균주는 H1N1 또는 H3N2 균주이다.

다른 구현예에서, 상기 방법은 재배열 인플루엔자 B 바이러스 또는 인플루엔자 B HA를 갖는 재배열 바이러스를 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인플루엔자 B 바이러스 또는 인플루엔자 B HA 및 NA를 갖는 재배열 바이러스를 제조한다. 인플루엔자 B 바이러스의 유전자 배열 비율은 더 다양하고 예측하기 어렵다. 본 발명의 방법은 재배열 인플루엔자 B 바이러스의 유전자 배열 비율에서 개선된 제어를 제공하기 때문에 유리하다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B 균주의 HA 절편을 함유할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 유행성 균주 또는 잠재적 유행성 균주를 기반으로 하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 제조하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 재배열 바이러스는 유행성 균주 또는 잠재적 유행성 균주로부터의 HA를 포함한다. 유행성 발병을 일으킬 가능성이 있는 인플루엔자 균주의 특성은 다음과 같다: (a) 현재 순환하는 인간 균주의 헤마글루티닌, 즉 10년 이상 동안 인간 집단에서 분명하지 않은 것 (예를 들어, H2) 또는 이전에 인간 개체군에서 전혀 발견되지 않은 것 (예를 들어, 일반적으로 조류 집단에서만 발견되는 H5, H6 또는 H9)과 비교하여 새로운 헤마글루티닌을 함유하여, 인간 집단이 균주의 헤마글루티닌에 면역학적으로 모자랄 것이고; (b) 인간 집단에서 수평으로 전염될 수 있고; 그리고 (c) 인간에게 병원성이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 H5 헤마글루티닌 유형을 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 제조한다. H5 헤마글루티닌 유형은 재배열 바이러스가 H5N1 균주와 같은 유행성 인플루엔자에 대한 면역을 위한 백신에 사용되는 경우 바람직하다. 다른 가능한 균주에는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 밀 기타 잠재적 유행성 균주가 포함된다. 본 발명은 비-인간 동물 집단에서 인간으로 퍼졌거나 퍼졌을 수 있는 잠재적 유행성 바이러스 균주, 예를 들어 돼지-유래 H1N1 인플루엔자 균주에 대해 보호하기 위한 백신에 사용하기 위한 재배열 바이러스를 제조하는 데 적합하다.

배양 숙주

본 발명의 방법에 사용하기 위한 배양 숙주는 부화된 계란 또는 세포일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 배양 숙주는 세포 배양물이다.

인플루엔자 바이러스 성장을 위한 한 가지 방법은 바이러스가 난 내용물(요막액)에 접종되고, 성장하고, 정제되는 특정 무병원체(SPF) 부화된 계란을 사용한다. 인플루엔자 바이러스는 동물 세포 배양물에서도 성장할 수 있으며 복제 정확도, 속도 및 환자 알레르기의 이유로 이 성장 방법이 바람직하다. 난-기반 바이러스 성장이 사용되는 경우, 그런 다음 하나 이상의 아미노산이 바이러스와 함께 난의 요막액에 도입될 수 있다 [42].

세포가 사용될 때, 본 발명은 전형적으로 세포주를 사용하지만, 예를 들어 1차 세포가 대안으로 사용될 수 있다. 세포는 전형적으로 포유동물일 것이다. 적절한 포유동물 기원의 세포는 햄스터, 소, 영장류(인간 및 원숭이 포함) 및 개 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 신장 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포 등과 같이 다양한 세포 유형이 사용될 수 있다. 적합한 햄스터 세포의 예는 명칭 BHK21 또는 HKCC를 갖는 세포주이다. 적합한 원숭이 세포는 예를 들어 Vero 세포주에서와 같이 신장 세포와 같은 아프리카 녹색 원숭이 세포이다 [12-14]. 적합한 개 세포는 예를 들어 CLDK 및 MDCK 세포주에서와 같이 신장 세포이다. 따라서, 적합한 세포주는 MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 성장하는 인플루엔자 바이러스에 바람직한 포유동물 세포주는 다음을 포함한다: Madin Darby 개 신장에서 유래된 MDCK 세포 [15-18]; 아프리카 녹색 원숭이(Cercopithecus aethiops) 신장에서 유래된 Vero 세포 [12-14]; 또는 인간 배아 망막아세포에서 유래된 PER.C6 세포 [19]. 이들 세포주는 예를 들어 American Type Cell Culture (ATCC) collection [20], Coriell Cell Repositories [21], 또는 European Collection of Cell Cultures (ECACC)로부터 널리 입수 가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587 하에 다양한 기타 Vero 세포를 공급하고, 카탈로그 번호 CCL-34 하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁 번호 96022940 하에 ECACC로부터 입수 가능하다. 포유동물 세포주에 대해 덜 선호되는 대안으로서, 바이러스는 오리 (예를 들어, 오리 망막) 또는 암탉 (예를 들어, 닭 배아 섬유아세포 (CEF) 등을 포함하는 조류 세포주에서 성장할 수 있다 [예를 들어, 참고문헌 22-24]. 예시는 닭 배아 줄기 세포, EB45, EB14, 및 EB14-074 [26]에서 유래된 EBx 세포주를 포함하는 조류 배아 줄기 세포 [22,25]를 포함한다. EB66은 선호되는 세포주이다.

본 발명에서 사용하기 위한 특히 바람직한 세포는 Madin Darby 개 신장에서 유래된 MDCK 세포 [15-1618]이다. 원래의 MDCK 세포는 ATCC로부터 CCL-34로 입수 가능하다. MDCK 세포의 유도체 또한 사용될 수 있다. 예를 들어 참고문헌 15는 현탁 배양물에서 성장에 적응된 MDCK 세포주를 개시한다 (DSM ACC 2219로 기탁된 'MDCK 33016'). 유사하게, 참고문헌 27은 무혈청 배양물에서 성장하는 MDCK 유래 세포주를 개시한다 (FERM BP-7449 증착된 'B-702'). 참고문헌 28은 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (PTA-6503)을 포함하는 비-종양형성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 2 [2]　WO2005/113758. 9는 'MDCK.5F1' 세포 (ATCC CRL-12042)를 포함하는, 감염에 대한 감수성이 높은 MDCK 세포주를 개시한다. 이들 MDCK 세포주 중 어느 것이든 사용할 수 있다.

MDCK 세포와 같은 세포주에서의 성장을 위해, 바이러스는 현탁액 [15,30,31]에서 또는 부착 배양의 세포에서 성장할 수 있다. 현탁 배양을 위한 한 가지 바람직한 MDCK 세포주는 MDCK 33016 (DSM ACC 2219로 증착됨)이다. 대안으로, 미세담체 배양을 사용할 수 있다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 바람직하게는 무혈청 배양 배지 및/또는 무단백질 배지에서 성장된다. 배지가 인간 또는 동물 기원의 혈청으로부터의 첨가제를 함유하지 않는 경우, 배지는 본 발명의 맥락에서 무혈청 배지로 지칭된다. 무-단백질은 단백질, 성장 인자. 기타 단백질 첨가제 및 비-혈청 단백질을 제외하고 세포의 증식이 일어나는 배양을 의미하는 것으로 이해되지만, 선택적으로 바이러스 성장에 필요할 수 있는 트립신 또는 다른 프로테아제와 같은 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 배양에서 성장하는 세포는 자연적으로 단백질 자체를 함유한다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 세포주는 예를 들어 바이러스 복제 중에 바람직하게는 37℃ [33]　(예를 들어, 30-36℃, 또는 약 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃) 이하에서 성장한다.

바이러스가 세포주에서 성장하는 경우, 그런 다음 성장 배양, 및 또한 배양을 시작하는 데 사용되는 바이러스 접종물은 바람직하게는 단순 헤르페스 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나 바이러스, 아데노바이러스, 라이노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 버나바이러스, 써코바이러스, 및/또는 파보바이러스가 없다 (즉, 상기에 의한 오염에 대해 테스트를 받았고 음성 결과를 얻었을 것이다) [32].

바이러스가 포유동물 세포주에서 성장한 경우, 그런 다음 조성물은 유리하게는 난 단백질 (예를 들어, 오브알부민(ovalbumin) 및 오보뮤코이드(ovomucoid)) 및 닭 DNA가 없어 알레르기성을 감소시킬 것이다. 알레르겐을 피하는 것은 Th2 반응을 최소화하는 데 유용하다. 세포가 본 발명의 방법에서 배양 숙주로 사용되는 경우, 세포 배양 조건 (예를 들어, 온도, 세포 밀도, pH 값 등)은 세포주 및 인플루엔자 바이러스에 따라 광범위하게 가변적이며 적용 요건에 적응될 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 하기 정보는 지침을 나타낸다.

세포의 증식은 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 원심분리 또는 여과와 같은 일반적인 지원 방법을 사용하여 관류 시스템에서 배양될 수 있다. 게다가, 세포는 감염 전에 유가식(fed-batch) 시스템에서 본 발명에 따라 증식될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 배양 시스템은 유가식 시스템으로 지칭되며, 여기서 세포는 초기에 회분식 시스템에서 배양되고 배지 내의 영양소(또는 영양소의 일부)의 고갈은 농축된 영양소의 제어된 공급에 의해 보상된다. 감염 전 세포를 증식시키는 동안 배지의 pH 값을 pH 6.6과 pH 7.8 사이의 값 및 특히 pH 7.2와 pH 7.3 사이의 값으로 조정하는 것이 유리할 수 있다. 세포 배양은 바람직하게는 30 내지 40℃의 온도에서 발생한다. 인플루엔자 바이러스로 감염 후, 세포는 바람직하게는 30℃ 내지 36℃ 또는 32℃ 내지 34℃ 또는 약 33℃의 온도에서 배양된다. 이것은 이 온도 범위에서 감염된 세포의 배양이 백신으로 제형화될 때 개선된 효능을 초래하는 바이러스를 생산하는 것으로 나타났기 때문에 특히 바람직하다 [33].

산소 분압은 감염 전 배양 동안 바람직하게는 25% 내지 95%, 특히 35% 내지 60% 값으로 조정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 언급된 산소 분압에 대한 값은 공기의 포화도를 기준으로 한다. 세포의 감염은 바람직하게는 회분식 시스템에서 약 8-25 x 10⁵ 세포 또는 바람직하게는 관류 시스템에서 약 5-20 x 10⁶　세포/mL의 세포 밀도에서 발생한다. 세포는 10^-8 내지 10, 바람직하게는 0.0001 내지 0.5의 바이러스 용량 (MOI 값, "감염 다중도"; 감염 시 세포당 바이러스 단위의 수에 해당함)으로 감염될 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 바이러스 또는 바이러스에 의해 생성된 단백질의 수확 및 분리를 포함할 수 있다. 바이러스 또는 단백질을 분리하는 동안, 세포는 분리, 여과 또는 한외여과와 같은 표준 방법에 의해 배양 배지에서 분리된다. 그런 다음, 구배 원심분리, 여과, 침전, 크로마토그래피 등과 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 바이러스 또는 단백질을 농축시킨 다음 정제한다. 바이러스는 정제 중에 또는 정제 후에 비활성화되는 것이 바람직하다. 바이러스 비활성화는 예를 들어 정제 과정 내에서 임의의 지점에서 β-프로피오락톤 또는 포름알데히드에 의해 발생할 수 있다.

숙주 세포 DNA

바이러스가 세포주에서 분리 및/또는 성장한 경우, DNA의 잠재적인 발암 활성을 최소화하기 위해 최종 백인에 남아있는 세포주 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 관행이다.

따라서, 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 비록 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수 있지만, 용량 당 10ng 미만(바람직하게는 1ng 미만, 더욱 바람직하게는 100pg 미만)의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하는 것이 바람직하다.

임의의 잔류 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500bp 미만, 예를 들어 400bp 미만, 300bp 미만, 200bp 미만, 100bp 미만 등인 것이 바람직하다.

오염시킨 DNA는 표준 정제 절차, 예를 들어 크로마토그래피 등을 사용하여 백신 제조 중에 제거될 수 있다. 잔류 숙주 세포 DNA의 제거는 예를 들어 DNase를 사용하여 뉴클레아제 처리에 의해 증진될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키는 편리한 방법은, 처음에 바이러스 성장 중에 사용될 수 있는 DNase (예를 들어,벤조나아제)를 사용한 다음 비리온 분해 (disruption) 중에 사용될 수 있는 양이온성 계면활성제(detergent) (예를 들어, CTAB)를 사용하는 2단계 처리를 포함하는 참고문헌 34 및 35에 개시되어 있다. β-프로피오락톤과 같은 알킬화제로 처리하는 것은 숙주 세포 DNA를 제거할 수도 있고, 유리하게는 비리온을 비활성화하는 데 사용될 수 있다 [36].

백신

본 발명은 백신을 제조하는 방법에 따라 제조된 바이러스를 이용한다.

인플루엔자 백신을 일반적으로 살아있는 바이러스 또는 비활성화된 바이러스를 기반으로 한다. 비활성화 백신은 전체 비리온, '분할(split)' 비리온, 또는 정제된 표면 항원을 기반으로 할 수 있다. 항원은 또한 바이로솜의 형태로 제시될 수 있다. 본 발명은 이러한 유형의 백신을 제조하는 데 사용될 수 있다.

비활성화된 인플루엔자 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전체 비리온, 분할 비리온, 또는 정제된 표면 항원(헤마글루티닌을 포함하고, 보통 뉴라미니다제 또한 포함함)을 포함할 수 있다. 바이러스를 비활성화하기 위한 화학적 수단은 계면활성제, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌(C60), 이원 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 유효량으로 처리하는 것을 포함한다. 바이러스 비활성화의 비화학적 방법, 예를 들어 UV 광 또는 감마 조사가 당업계에 공지되어 있다.

비리온은 다양한 방법에 의해 바이러스 함유 유체, 예를 들어 요막액 또는 세포 배양 상청액에서 수득될 수 있다. 예를 들어, 정제 프로세스는 선형 자당 구배 용액(선택적으로 비리온을 분해하기 위한 계면활성제를 포함함)을 사용한 띠원심분리 또는 친화성 크로마토그래피 방법을 포함할 수 있다. 항원은 이어서 선택적인 희석 후 정용여과에 의해 정제될 수 있다.

분할 비리온은 정제된 비리온을 계면활성제 (예를 들어, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, Triton X-100, Triton N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, Tergitol NP9 등)로 처리하여 'Tween-ether' 분할 프로세스를 포함한 서브비리온 제제를 제조함으로써 얻어진다. 인플루엔자 바이러스를 분할하는 방법은 예를 들어 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 참고문헌 37-42 등 참조). 바이러스를 분할하는 것은 전형적으로 분할제의 농도를 분해하여 감염성이든 비감염성이든 전체 바이러스를 분해하거나 단편화함으로써 수행된다. 분해는 바이러스 단백질의 전체 또는 부분 가용화를 초래하여, 바이러스의 완전성을 변화시킨다. 바람직한 분할제는 비이온성 및 이온성 (예를 들어, 양이온성) 계면활성제, 예를 들어 알킬글리코사이드, 알킬티오글리코사이드, 아실당, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카멕, 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, NP9, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, Cetavlon, 미리스틸트리메틸암모늄염, 이포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA , 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예를 들어, Triton X-100 또는 Triton N101과 같은 Triton 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등이다. 한 가지 유용한 분할 절차는 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데히드의 연속 효과를 사용하며, 분할은 초기 비리온 정제 (예를 들어, 자당 밀도 구배 용액) 중에 발생할 수 있다. 따라서 분할 과정은 비리온-함유 물질의 정화(비리온이 아닌 물질 제거), 수득된 비리온의 농도 (예를 들어, 흡착 방법, 예컨데 CaHPO4 흡착 사용), 비리온이 아닌 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 구배 원심분리 단계에서 분할제를 사용한 비리온의 분할 (예를 들어 나트륨 데옥시콜레이트와 같은 분할제를 포함하는 자당 구배 사용), 및 이어서 여과 (예를 들어, 한외여과)를 포함하여, 원하지 않는 물질을 제거할 수 있다. 분할 비리온은 인산나트륨-완충 등장성 염화나트륨 용액에 유용하게 재현탁될 수 있다. 분할 인플루엔자 백신의 예로는 BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품이 있다.

정제된 인플루엔자 바이러스 표면 항원 백신은 표면 항원 헤마글루티닌 및 전형적으로 뉴라미니다제 또한 포함한다. 정제된 형태로 이들 단백질을 제조하는 방법이 당업계에 잘 알려져있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 인플루엔자 서브유닛 백신이다.

비활성화된 항원의 또 다른 형태는 바이로솜 [43](리포솜 입자와 같은 핵산이 없는 바이러스)이다. 바이로솜은 계면활성제를 사용하여 바이러스를 용해시킨 후 뉴클레오캡시드를 제거하고 바이러스 당단백질을 함유하는 막을 재구성하여 제조될 수 있다. 바이로솜을 제조하는 다른 방법은 과량의 인지질에 바이러스 막 당단백질을 첨가하여 그들의 막에 바이러스 단백질이 있는 리포솜을 만드는 것이다.

본 발명의 방법은 또는 생백신을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이러한 백신은 일반적으로 비리온-함유 유체에서 비리온을 정제함으로써 제조된다. 예를 들어, 유체는 원심분리에 의해 정화되고, 완충액 (예를 들어 자당, 인산칼륨, 및 글루타민산나트륨을 함유함)을 사용하여 안정화될 수 있다. 다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신이 현재 이용 가능하다 (예를 들어, 참고문헌 44의 챕터 17 및 18 참조). 살아있는 바이러스 백신은 MedImmune의 FLUMIST™ 제품 (3가 바이러스 생백신)을 포함한다.

바이러스는 약화될 수 있다. 바이러스는 온도에 민감할 수 있다. 바이러스는 추위에 적응할 수 있다. 이 세 가지 기능은 살아있는 바이러스를 항원으로 사용할 때 특히 유용하다.

HA는 현재 비활성화된 인플루엔자 백진의 주요 면역원이며, 백신 용량은 전형적으로 SRID로 측정되는 HA 수준을 참조하여 표준화된다. 기존 백신에는 전형적으로 균주 당 약 15μg의 HA가 함유되어 있지만, 예를 들어 어린이를 위해, 또는 유행성 상황에서, 또는 보조제를 사용할 때 더 낮은 용량을 사용할 수 도 있다. ½ (즉, 균주 당 7.5μg HA), ¼ 및 1/8과 같은 분할 용량이 더 높은 용량 (예를 들어, 3x 또는 9x 용량 [45,46])으로 사용되었다. 따라서 백신은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 150μg의 HA, 바람직하게는 0.1 내지 50μg, 예를 들어 0.1-20μg, 0.1-15μg, 0.1-10μg, 0.1-7.5μg, 0.5-5μg의 HA를 포함할 수 있다. 특정 용량은 예를 들어 균주 당 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 3.75, 약 1.9, 약 1.5 등을 포함한다.

생백신의 경우, 용량은 HA 함량보다는 중앙 조직 배양 감염 용량 (TCID50)으로 측정되며, 균주 당 10⁶ 내지 10⁸ (바람직하게는 10^6.5-10^7.5)의 TCID50이 일반적이다.

유행성 균주에 대한 면역화에 적합할 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 유행성 또는 잠재적-유행성 균주에 대한 면역화에 유용할 수 있다. 본 발명은 인간뿐만 아니라 비인간 동물에게도 백신을 접종하는데 적합하다.

항원이 조성물에 유용하게 포함될 수 있는 다른 균주는 내성 유행성 균주[48]를 포함하여 항 바이러스 요법에 내성인 균주 (예를 들어 오셀타미비르 [47] 및/또는 자나미비르)이다.

본 발명의 조성물 (예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 백신)은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상)의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 항원(들)을 포함할 수 있다. 백신이 두 가지 이상의 인플루엔자 균주를 포함하는 경우, 바이러스를 수득하고 항원을 제조한 후 상이한 균주를 별도로 성장시키고 혼합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 인플루엔자 균주로부터 항원을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 2개의 인플루엔자 A 바이러스 균주와 1개의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 항원을 포함하는 3가 백신이 일반적이다. 2개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 2개의 인플루엔자 B 바이러스 균주, 또는 3개의 인플루엔자 A 바이러스 및 1개의 B 바이러스 균주로부터의 항원을 포함하는 4가 백신 또한 유용하다 [49].

약제학적 조성물

본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 약학적으로 허용가능하다. 그들은 일반적으로 항원 외에 구성성분을 포함하며, 예를 들어 그들은 전형적으로 하나 이상의 약제학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)를 포함한다. "약제학적으로 허용되는 담체"는 조성물을 투여받는 개체에게 해로운 항체의 생산을 자체적으로 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 적합한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 수크로스, 트레할로스, 락토오스, 및 지질 응집체 (예를 들어, 오일 액적 또는 리포솜)와 같은, 크고 천천히 대사되는 거대분자이다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 조성물은 또한 물, 식염수, 글리세롤 등과 같은 약제학적으로 허용되는 희석제를 함유할 수 있다. 추가적으로, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 존재할 수 있다. 멸균 발열원이 없는 인산염 완충 생리 식염수가 전형적인 담체이다(이러한 구성성분에 대한 철저한 논의는 참고문헌 50에서 확인 가능함). 하기에 기술되는 바와 같이 보조제가 또한 포함될 수 있다.

백신 조성물은 일반적으로 수성 형태일 것이다. 그러나, 일부 백신은 건조 형태, 예를 들어 주사 가능한 고체 또는 패치 상에 건조되거나 중합된 제제의 형태일 수 있다.

백신 조성물은 티오메르살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 방부제를 포함할 수 있다. 그러나, 백신에는 티오메르살-프리인 것과 같이 수은 물질이 실질적으로 없는 것 (즉, 5μg/ml 미만)이 바람직하다 [41,51]. 수은을 함유하지 않는 백신이 더 바람직하다. α-토코페롤 숙시네이트는 수은 화합물의 대안으로 포함될 수 있다 [41]. 방부제가 없는 백신이 특히 바람직하다.

장성을 조절하기 위해서는 나트륨염과 같은 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염화 나트륨 (NaCl)이 바람직하며, 이는 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염에는 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨 탈수화물, 염화 마그네슘, 염화칼슘 등이 있다.

백신 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg의 삼투압 농도를 가질 것이며, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg 범위에 속할 것이다. 삼투압 농도는 이전에 예방 접종으로 인한 통증에 영향을 미치지 않는 것으로 보고되었지만 [52], 그럼에도 불구하고 삼투압 농도를 이 범위로 유지하는 것이 바람직하다.

백신 조성물은 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 전형적인 완충액은 인산염 완충액; Tris 완충액, 붕산염 완충액; 숙시네이트 완충액; 히스티딘 완충액(특히 수산화알루미늄 보조제 사용); 또는 구연산염 완충액을 포함한다. 완충액은 일반적으로 5-20mM 범위에 포함될 것이다.

백신 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 및 보다 전형적으로 6.0 내지8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다. 따라서, 본 발명의 프로세스는 패키징 전에 벌크 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.

백신 조성물은 바람직하게는 멸균된다. 백신 조성물은 바람직하게는 예를 들어 용량 당 <1 EU (내독소 단위, 표준 측정치), 및 바람직하게는 용량 당 <0.1 EU 를 함유하는 비-발열원이다. 백신 조성물은 바람직하게는 무글루텐이다.

본 발명의 백신 조성물은 특히 분할 또는 표면 항원 백신을 위한 계면활성제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 ('Tween'으로 알려짐), 옥톡시놀 (예를 들어, 옥톡시놀-9 (Triton X-100) 또는 t-옥시페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드('CTAB'), 또는 나트륨 데옥시콜레이트를 포함할 수 있다. 계면활성제는 미량으로만 존재할 수 있다. 따라서 백신은 각각 1mg/ml 미만의 옥톡시놀 10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 미량의 기타 잔류 구성성분은 항생제 (예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)일 수 있다.

백신 조성물은 단일 예방 접종을 위한 물질을 포함할 수 있거나 다중 예방 접종를 위한 물질 (즉, '다회용' 키트)를 포함할 수 있다. 방부제를 포함하는 것은 다회용 배열에서 바람직하다. 다회용 조성물에 방부제를 포함시키는 것에 대한 대안으로서 (또는 추가로), 조성물은 물질 제거를 위한 무균 어댑터를 갖는 용기에 함유될 수 있다.

인플루엔자 백신은 전형적으로 약 0.5ml의 용량으로 투여되지만, 어린이에게는 절반의 용량 (즉, 약 0.25ml)이 투여될 수 있다.

조성물과 키트는 바람직하게는 2℃ 내지 8℃에서 보관된다. 그들은 얼면 안 된다. 이상적으로는 직사광선을 피해야 한다.

보조제

본 발명의 조성물 (예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 백신)은 유리하게는 조성물을 투여받는 대상체에게 유발되는 면역 반응 (체액 및/또는 세포)을 증진시키는 기능을 할 수 있는 보조제를 포함할 수 있다.

보조제는 인플루엔자 항원과 잘 작용하는 것으로 나타났기 때문에 바람직하게는 수중유 에멀젼 보조제이다.

수중유 에멀젼 보조제

수중유 에멀젼은 인플루엔자 바이러스 백신을 보조하는데 사용하기에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 이러한 다양한 에멀젼이 공지되어 있고, 이들은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하며, 오일(들) 및 계면활성제(들)는 생분해성 (대사성) 및 생체적합성이다. 에멀젼의 오일 액적은 일반적으로 직경이 5 μm이고, 심지어 서브-마이크론 직경을 가질 수도 있으며, 이러한 작은 크기는 안정적인 에멀젼을 제공하기 위해 미세유동화기로 달성된다. 평균 크기가 200 nm 미만인 액적은 필터 멸균될 수 있으므로 바람직하다.

바람직한 구현예에서, 수중유 에멀젼은 균일하다. 균일한 에멀젼은 그 안에 분산된 대부분의 액적 (입자)이 특정 크기 범위 (예를 들어, 직경) 내에 있는 것을 특징으로 한다. 적합한 특정 크기 범위는 예를 들어 50-220 nm, 50-180 nm, 80-180 nm, 100-175 nm, 120-185 nm, 130-190 nm, 135-175 nm, 150-175 nm일 수 있다. 일부 구현예에서, 균일한 에멀젼은 특정 직경 범위를 벗어나는 액적 (입자) 수의 ≤10%를 함유한다. 일부 구현예에서, 수중유 에멀젼 제제에서 오일 액적의 평균 입자 크기는 동적 광산란에 의해 측정된 바와 같이 135-175 nm, 예를 들어 155 nm ± 20 nm이고, 이러한 제제는 광학 입자 감지에 의해 측정된 바와 같이 제제의 mL 당 1 x 10⁷ 미만의 큰 입자를 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "큰 입자"는 1.2 μm의 직경, 전형적으로 1.2-400 μm의 직경을 갖는 것을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 균일한 에멀젼은 바람직한 크기 범위를 벗어나는 액적의 10% 미만, 5% 미만, 또는 3% 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 수중유 에멀젼 제제에서 입자의 평균 액적 크기는 125-185 nm, 예를 들어 약 130 nm, 약 140 nm, 약 150 nm, 약 155 nm, 약 160 nm, 약 170 nm, 또는 약 180 nm이고, 수중유 에멀젼은 제제의 액적 수의 5% 미만이 125-185 nm 범위 밖에 있다는 점에서 균일하다.

본 발명은 동물(어류와 같은) 또는 식물성 기원으로부터의 것과 같은 오일과 함께 사용될 수 있다. 식물성 오일의 공급원에는 견과류, 씨앗 및 곡물이 포함된다. 땅콩 기름, 콩 기름, 코코넛 기름, 올리브유 등이 가장 일반적으로 사용되고, 견과류 오일을 예로 들 수 있다. 예를 들어 호호바 콩에서 얻은 호호바 오일을 사용할 수 있다. 종자유는 홍화유, 면실유, 해바라기씨유, 참기름 등을 포함한다. 곡물군에서 옥수수 오일을 가장 쉽게 구할 수 있지만, 밀, 귀리, 호밀, 쌀, 테프, 삼백초 등과 같은 다른 시리얼 곡물의 오일도 사용할 수 있다. 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10개의 탄소 지방산 에스테르는 종자유에서 자연적으로 발생하지 않지만, 견과류 오일 및 종자유에서 시작하여 적절한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의해 제조될 수 있다. 포유동물 우유로부터의 지방 및 오일은 대사 가능하므로 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 동물 공급원으로부터의 순수한 오일을 얻기 위해 필요한 분리, 정제, 비누화 및 기타 수잔을 위한 절차가 당업계에 잘 알려져 있다. 대부분의 어류에는 쉽게 회수할 수 있는 대사성 오일이 함유되어 있다. 예를 들어, 대구 간유, 상어 간유, 및 경뇌유와 같은 고래 오일은 본원에서 사용될 수 있는 여러 어유의 예이다. 많은 분지형 사슬 오일은 5-탄소 이소프렌 유닛에서 생화학적으로 합성되며, 일반적으로 테르페노이드로 지칭된다. 상어 간유는 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔으로 알려진 분지형, 불포화 테르페노이드를 함유하며, 이는 본원에서 특히 바람직하다. 스쿠알렌의 포화 유사체인 스쿠알란 또한 선호되는 오일이다. 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하는 어유는 상업적 기원으로부터 용이하게 입수 가능하거나 당업계에 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다 (하기 참조). 오일의 혼합물이 사용될 수 있다.

계면활성제는 그들의 'HLB' (친수성/친유성 균형)로 분류할 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 및 더 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 갖는다. 본 발명은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (일반적으로 Tween로 지칭됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 선형 EO/PO 블록 코폴리머와 같은 DOWFAX™의 상품명으로 판매되는, 에틸렌 옥사이드 (EO), 프로필렌 옥사이드 (PO) 및/또는 부틸렌 옥사이드 (BO)의 코폴리머; 반복 에톡시 (옥시-1,2,-에탄디일) 기의 수가 다양할 수 있는 옥톡시놀, 특히 관심 대상인 옥톡시놀-9 (Triton X-100 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스파티딜콜린(레시틴)과 같은 인지질; 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30)와 같은, 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올 (Brij 계면활성제로 알려짐)에서 유래된 폴리옥시에틸렌 지방산 에테르; 및 소르비탄 트리올레이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트와 같은 소르비탄 에스테르 (일반적으로 SPAN으로 알려짐)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 계면 활성제로 사용될 수 있다. 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함시키기 위한 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), Span 85 (소르비탄 트리올레에이트), 레시틴 및 Triton X-100이다.

계면활성제의 혼합물, 예를 들어 Tween 80/Span 85 혼합물을 사용할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (Tween 80)와 같은 소르비탄 에스테르 및 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100)과 같은 옥톡시놀의 조합 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합은 라우레스 9와 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.

계면활성제의 바람직한 양 (중량%)은 다음과 같다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예컨데 Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예컨데 Triton X-100, 또는 Triton 시리즈의 다른 계면활성제) 0.001 내지 0.1 %, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨데 라우레스 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1 내지 10 % 및 특히 0.1 내지 1 % 또는 약 0.5%.

가장 바람직한 수중류 에멀젼은 수중 스쿠알렌 에멀젼, 바람직하게는 서브마이크론 수중 스쿠알렌 에멀젼이다.

본 발명에 유용한 특정 수중유 에멀젼은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 그 중에서 스쿠알렌-함유 에멀젼이 바람직하다:

스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트리올레이트의 서브마이크론 에멀젼. 에멀젼은 수성상에 시트르산염 이온, 예를 들어 10 mM 시트르산나트륨 완충액을 포함할 수 있다. 에멀젼은 3.2-4.6 mg/ml 스쿠알렌, 4.1-5.3 mg/ml 폴리소르베이트 80, 및 4.1-5.3 mg/ml 소르비탄 트리올레이트를 포함할 수 있다. 에멀젼의 부피별 조성물은 약 4.6% 스쿠알렌, 약 0.45% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% 소르비탄 트리올레이트일 수 있다. "MF59" [53,54,55]로 알려진 보조제는 참고문헌 56의 챕터 10 및 참고문헌 57의 챕터 12에 더 자세히 기술되어 있다. 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트리올레이트는 9750:1175:1175의 중량비로 존재할 수 있다. 약 39 mg/mL 스쿠알렌, 약 4.7 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 약 4.7 mg/mL 소르비탄 트리올레이트의 농도가 일반적이다. 155-185 nm의 Z-평균 액적 크기가 바람직하며, 다분산도는 <0.2이다.

스쿠알렌, 토코페롤 (특히, DL α-토코페롤) 및 소르베이트 80을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 이들 에멀젼은 부피 별로 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% 폴리소르베이트 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 보다 안정한 에멀젼을 제공할 수 있으므로 바람직하게는 <1 (예를 들어, 0.90)이다. 스쿠알렌 및 폴리소르베이트 80은 약 5:2의 부피비 및 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 따라서, 세 가지 구성성분(스쿠알렌, 토코페롤, 폴리소르베이트 80)은 1068:1186:485 또는 약 55:61:25의 중량비로 존재할 수 있다. 하나의 이러한 에멀젼 ("AS03")은 4.3중량% 스쿠알렌, 4.8중량% 토코페롤, 및 2중량% 폴리소르베이트 80을 포함한다. 약42.7 mg/mL의 스쿠알렌, 약 47.4 mg/mL DL-α-토코페롤, 및 약 19.4 mg/mL 폴리소프베이트 80의 농도가 일반적이다. 140-170 nm의 Z-평균 액적 크기가 바람직하다. 에멀젼은 또한 3-데-O-아세틸화 모노포스포릴 지질 A(3d MPL)를 포함할 수 있다. 이러한 유형의 또 다른 유용한 에멀젼은 예를 들어 상기 논의된 비율로 인간 용량 당 0.5-10 mg 스쿠알렌, 0.5-11 mg 토코페롤, 및 0.1-4 mg 폴리소르베이트 80 [58]을 포함할 수 있다.

스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예컨데 소르비탄 모노올레이트 또는 'Span 80')을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는 열가역적이고/이거나 200 nm 미만의 크기를 갖는 오일 액적의 적어도 90% (부피 기준)을 갖는다 [59]. 에멀젼은 또한 알디톨; 동결 보호제 (예를 들어, 당, 예컨데 도데실말토시드 및/또는 수크로스와 같은 당); 및/또는 알킬폴리글리코시드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 에멀젼은 TLR4 작용제 [60]를 포함할 수 있다. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다. 바람직한 에멀젼은 스쿠알렌, 소르비탄 올레이트, 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 및 만니톨 (예를 들어 32.5% 스쿠알렌, 4.82% 소르비탄 올레이트, 6.18% 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 및 6% 만니톨; 중량%)을 포함하며, 평균 액적 크기는 150 nm 이하이다. 약 49.6 mg/mL 스쿠알렌, 약 7.6 mg/mL 소르비탄 올레이트, 및 약 9.6 mg/mL 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르, 및 9.2 mg/mL 만니톨의 농도가 일반적이다.

스쿠알렌, 포스파티딜콜린, 폴록사머 188, 글리세롤 및 인산암모늄 완충액 [61]을 포함하고, 선택적으로 α-토코페롤 ('SE') 또한 포함하는 에멀젼.

스쿠알렌, 토코페롤 및 Triton 계면활성제 (예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다 (하기 참조). 에멀젼은 인산염 완충액을 포함할 수 있다.

폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 계면활성제 (예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤 (예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 약 75:11:10 (예를 들어, 750 μg/ml 폴리소르베이트 80, 110 μg/ml Triton X-100 및 100 μg/ml α-토코페롤 숙시네이트)의 질량비에서 이들 세 가지 구성성분을 포함할 수 있고, 이러한 농도는 항원으로부터 이들 구성성분의 임의의 기여를 포함해야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 수성상은 인산염 완충액을 포함할 수 있다.

스쿠알란, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401 ("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 인산염 완충 식염수, 에멀젼은 pH 7.4에서 제형화될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩티드의 유용한 전달 비히클이며, "SAF-1" 보조제 [62] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다. 에멀젼은 "AF" 보조제 [63] (5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80)에서와 같이 Thr-MDP 없이도 사용될 수 있다.

미세 유동화(Microfluidisation)가 바람직하다.

스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care [64]의 에멀젼. 보조용 백신에서 이들 구성성분의 최종 농도 (중량)는 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머105 (플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴산/카프르산 트리글리세라이드)이다.

0.5-50% 오일, 0.1-10% 인지질, 및 0.05-5% 비이온성 계면활성제를 갖는 에멀젼. 참고문헌 65에 기술된 바와 같이, 바람직한 인지질 구성성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카디오리핀이다. 서브마이크론 액적 크기가 유리하다.

비-대사성 오일 (예를 들어, 경질 미네랄 오일)과 적어도 하나의 계면활성제 (예컨데, 레시틴, Tween 80 또는 Span 80)의 서브마이크론 수중유 에멀젼. 첨가제, 예컨데 QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유체 접합체 (예컨데, 글루쿠론산의 카르복실기를 통해 데스아실사포닌에 지방족 아민을 첨가하여 제조된, 참고문헌 66에 기술된 GPI-0100), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스 (2-하이드록시에틸)프로판디아민이 포함될 수 있다.

사포닌 (예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셀 로 결합된 에멀젼 [67].

미네랄 오일, 비이온성 친유성 에톡실화 지방 알코올, 및 비이온성 친수성 계면활성제 (예를 들어, 에톡실화 지방 알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머)를 포함하는 에멀젼 [68].

주사용 백신을 제조하기 위해, 이러한 에멀젼은 일반적으로 수성 면역원 제제와 혼합될 것이다. 이 혼합은 전형적으로 수성 형태의 에멀젼과 1:1 부피 비율의 수성 성태의 면역원을 포함하며, 이 경우 에멀젼 구성성분의 비율은 최종 백신의 절반이 될 것이다. 예를 들어, 5 부피%의 스쿠알렌이 포함된 에멀젼은 2.5부피%의 최종 농도를 갖는 백신을 제공하기 위해 항원 용액과 1:1 비율로 혼합될 수 있다. 물론, 예를 들어 5:1 내지 1:5의 혼합을 위한 2개의 액체의 부피비를 사용하는 다른 혼합 비율도 가능하다. 따라서, 백신 조성물에서 상기 에멀젼 구성성분의 농도는 그들의 비율이 동일하게 유지되는 희석 (예를 들어, 2 또는 3과 같은 정수)에 의해 수정될 수 있다. 예를 들어, 소아용 백신은 더 낮은 농도의 보조제, 예를 들어 4 부피%, 3.5 부피%, 3 부피%, 2.5 부피%, 2 부피%, 1.5 부피%, 또는 1 부피%의 스쿠알렌을 함유할 수 있다.

항원과 보조제가 혼합된 후, 헤마글루티닌 항원은 일반적으로 수용액에 남아 있을 것이지만, 그 자체가 오일/물 경계면 주위에 분포할 수 있다. 일반적으로, 헤마글루티닌이 에멀전의 오일 상으로 들어갈 경우는 거의 없다.

조성물이 토코페롤을 포함하는 경우, 임의의 α, β, γ, δ, ε 또는 ζ 토코페롤을 사용할 수 있지만, α-토코페롤이 바람직하다. 토코페롤은 여러 형태, 예를 들어, 상이한 염 및/또는 이성질체를 가질 수 있다. 염은 유기염, 예컨데 숙시네이트, 아세테이트, 니코티네이트등을 포함한다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤 모두를 사용할 수 있다. 토코페롤은 비타민 E가 이 환자군에서 면역 반응에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었기 때문에 고령자 (예를 들어, 60세 이상의 연령)의 백신에 포함되는 것이 유리하다 [69]. 그들은 또한 에멀젼을 안정화시키는 데 도움이 될 수 있는 항산화 특성을 갖는다 [70]. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이고, 이 토코페롤의 바람직한 염은 숙시네이트이다. 숙시네이트 염은 생체 내에서 TNF-관련 리간드와 협력하는 것으로 밝혀졌다. 또한, α-토코페롤 숙시네이트는 인플루엔자 백신과의 호환성이 있으며, 수은 화합물의 대안으로 유용한 방부제로 알려져 있다 [41]. 방부제가 없는 백신이 특히 바람직하다.

백신 조성물의 패키징

본 발명의 조성물 (또는 키트 구성성분)의 적합한 용기는 바이알, 주사기 (예를 들어, 일회용 주사기), 비강 스프레이 등을 포함한다. 이러한 용기는 멸균되어야 한다.

조성물/구성성분이 바이알에 위치하는 경우, 바이알은 바람직하게는 유리 또는 플라스틱 물질로 만들어진다. 바이알은 바람직하게는 조성물이 바이알에 첨가되기 전에 멸균된다. 라텍스에 민감한 환자의 문제를 피하기 위해, 바이알은 바람직하게는 라텍스가 없는 마개로 밀봉되며, 모든 패키징에 라텍스가 없는 것이 바람직하다. 바이알은 단일 용량의 백신을 포함할 수 있거나, 1회 이상의 용량 ('다회용' 바이알), 예를 들어 10회 용량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 만들어진다.

바이알은 미리 채워진 주사기가 캡 내로 삽입되고 주사기의 내용물이 바이알 내로 배출되고 (예를 들어, 내부의 동결건조된 물질을 재구성하기 위해), 바이알의 내용물이 주사기로 다시 제거될 수 있도록 적용된 캡 (예를 들어, 루어 락(Luer lock))을 가질 수 있다. 바이알로부터 주사기를 제거한 후, 바늘을 부착할 수 있고 조성물을 환자에게 투여할 수 있다. 캡은 밀봉재 또는 덮개 내부에 위치하는 것이 바람직하므로, 밀봉재 또는 덮개는 캡에 접근하기 전에 제거되어야 한다. 바이알은 특히 다회용 바이알의 경우 그의 내용물을 무균 상태로 제거할 수 있는 캡을 가질 수 있다.

구성성분이 실린지에 패키징되어 있는 경우, 주사기는 주사기에 부착된 바늘을 가질 수 있다. 바늘이 부착되지 않은 경우, 주사기와 함께 별도의 바늘을 제공하여 조립하여 사용할 수 있다. 이러한 바늘은 싸여있을 수 있다. 안전한 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 일반적이다. 기록 보관을 용이하게 하기 위해 내용물의 로트 번호, 인플루엔자 시즌 및 만료 날짜를 인쇄할 수 있는 필-오프 (peel-off) 라벨이 있는 주사기가 제공될 수 있다. 주사기의 플런저는 바람직하게는 흡인 동안 플런저가 우발적으로 제거되는 것을 방지하기 위해 스토퍼를 갖는다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 가질 수 있다. 일회용 주사기는 단일 용량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 바늘을 부착하기 전에 팁을 밀봉하기 위한 팁 캡을 가지며, 팁 탭은 바람직하게는 부틸 고무로 만들어진다. 주사기와 바늘이 별도로 포장된 경우, 바늘에 부틸 고무 실드를 장착하는 것이 바람직하다. 바람직한 주사기는 상표명 "Tip-Lok"™ 하에 시판되는 주사기이다.

용기는 예를 들어 아이들에게 쉽게 전달하기 위해 절반-용량 부피를 나타내도록 표시될 수 있다. 예를 들어, 0.5ml 용량을 함유하는 주사기에는 0.25ml 용량을 나타내는 표시가 있을 수 있다.

유리 용기 (예를 들어, 주사기 또는 바이알)를 사용하는 경우, 소다 석회 유리보다 보로실리케이트 유리로 만든 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

키트 또는 조성물은 백신의 세부사항, 예를 들어, 투여 지침, 백신 내 항원의 세부사항 등)이 포함된 전단지와 함께 (예를 들어, 동일한 상자에) 패키징될 수 있다. 지침에는 예를 들어 백신 접종 후 아나필락시스 반응 등이 나타날 경우 즉시 사용할 수 있는 아드레날린 용액을 보유하라는 경고 또한 포함될 수 있다.

치료 방법 및 백신 투여

본 발명은 본 발명에 따라 제조된 백신을 제공한다. 이들 백신 조성물은 인간 또는 돼지와 같은 비-인간 동물 대상체에 투여하기에 적합하고, 본 발명은 대상체에게 본 발명의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 높이는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공하고, 대상체에서 면역 반응을 높이기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.

이들 방법에 의해 높아진 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호 항체 반응을 포함할 것이다. 인플루엔자 바이러스 백신 후 항체 반응, 중화 능력 및 보호를 평가하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체 역가가 보호와 상관 관계가 있다는 것을 보여주었다 (약 30-40의 혈청 샘플의 혈구응집-억제 역가는 동종 바이러스에 의한감염으로부터 약 50% 보호) [71]. 항체 반응은 전형적으로 혈구응집 억제, 미세중화, 단일 방사상 면역확산 (SRID), 및/또는 단일 방사상 용혈 (SRH)에 의해 측정된다. 이들 검정 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 예방 접종 경로는 근육내 주사 (예를 들어 팔이나 다리로)이지만, 다른 이용 가능한 경로로는 피하 주사, 비강내 [72-74], 경구 [75], 피내 [76,77], 피부 (transcutaneous), 경피 (transdermal) [78] 등이 있다.

본 발명에 따라 제조된 백신은 어린이 및 성인 모두를 치료하는데 사용될 수 있다. 현재 인플루엔자 백신은 생후 6개월부터 소아 및 성인 예방 접종에 사용하도록 권장된다. 따라서 인간 대상체는 1세 미만, 1-5세, 5-15세, 15-55세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신 접종을 위한 바람직한 대상체는 고령자 (예를 들어, ≥50 세, ≥60세, 및 바람직하게는 ≥65세), 어린이 (예를 들어 ≤5세), 입원 대상체, 의료 종사자, 군 복무자 및 군인, 임산부, 만성 질환자, 면역 결핍 환자, 백신 접종 전 7일 이내에 항바이러스 화합물 (예를 들어, 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 복용한 환자, 난 알레르기가 있는 사람 및 해외 여행 중인 사람이다. 그러나, 백신은 이러한 군에서만 적합하지 않으며, 인구 집단에서 보다 일반적으로 사용될 수 있다. 유행성 균주의 경우, 모든 연령대에 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 조성물은 효능에 대한 CPMP 기준의 1, 2 또는 3을 충족한다. 성인 (18-60세)에서 이러한 기준은 다음과 같다: (1) ≥70% 혈청보호; (2) ≥40% 혈청전환; 및/또는 (3) ≥2.5배의 GMT 증가. 고령자 (>60세)에서, 이러한 기준은 다음과 같다: (1) ≥60% 혈청보호; (2) ≥30% 혈청전환; 및/또는 (3) ≥2배의 GMT 증가. 이러한 기준은 최소 50명의 환자를 대상으로 한 공개 라벨 연구를 기반으로 한다.

치료는 단일 용량 일정 또는 다중 용량 일정에 의해 이루어질 수 있다. 다중 용량은 1차 예방 접종 일정 및/또는 추가 예방 접종 일정에 사용될 수 있다. 다중 투여 일정에서, 다양한 투여량은 동일하거나 상이한 경로, 예를 들어 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등으로 제공될 수 있다. 1회 이상의 용량 (전형적으로 2회 용량)을 투여하는 것은 면역학적으로 경험이 없는 환자, 예를 들어 이전에 인플루엔자 백신을 접종한 적이 없는 사람에게 특히 유용하거나 새로운 HA 하위유형 (유행성 발병에서와 같이)에 대한 예방 접종에 특히 유용하다. 다중 용량은 전형적으로 적어도 1주 간격 (예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다.

본 발명에 의해 제조된 백신은 다른 백신과 실질적으로 동일한 시간, 예를 들어, 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 결합 H. 인플루엔자 b 백신, 비활성화된 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 접합 백신 (예컨데 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 접합 백신 등과 (예를 들어, 동일한 의료 상담 또는 의료 전문가 또는 예방 접종 센터 방문 중) 실질적으로 동일한 시간에 환자에게 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 및/또는 수막구균 백신과 실질적으로 동일한 시간에 투여하는 것은 고령 환자에게 특히 유용하다.

유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 및 특히 인플루엔자 바이러스에 대해 활성인 항바이러스 화합물 (예를 들어, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)과 (예를 들어 동일한 의료 상담 또는 의료 전문가 방문 중) 실질적으로 동일한 시간에 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 항바이러스제는 뉴라미니다제 억제제, 예컨데 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-사이클로헥산-1-카르복실산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-안히드로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에논산, 이의 에스테르 (예를 들어, 에틸 에스테르) 및 이의 염 (예를 들어, 인산염)을 포함한다. 바람직한 항바이러스제는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-사이클로헥센-1-카르복실산, 에틸 에스테르, 오셀타미비르 인산염 (TAMIFLU™)로도 알려진 인산염 (1:1)이다.

정의

용어 "포함하는 (comprising)"은 "포함하는 (including)" 뿐만 아니라 "구성하는 (consisting)"을 포함하며, 예를 들어 X를 "포함하는(comprising)" 조성물은 X로만 구성되거나 예를 들어 X + Y와 같은 추가 항목을 포함할 수 있다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 제외하지 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.

수치 x와 관련된 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어 x + 10%를 의미한다.

실시예

재료 및 방법

달리 명시되지 않는 한, 하기 실시예에서 하기 재료 및 방법을 사용하였다.

세포, 바이러스 및 항혈청

293T 세포는 Melbourne University로부터 얻었으며 10% FBS, 1 X GlutaMAX (Gibco) 및 1 X 항생제/항진균제 (Gibco)를 함유하는 DMEM에 유지시켰다. MDCK (WHO) 세포는 WHO로부터 얻었으며 10% FBS, 1 X GlutaMAX (Gibco) 및 1 X 항생제/항진균제 (Gibco)를 함유하는 DMEM에 유지시켰다. MDCK 33016PF 세포 [79]는 화학적으로 정의된 배지 (Lonza)에서 유지시켰다.

A/Texas/1/1977 고 성장 모 (HGP) 바이러스 (PR8로 5:3 재배열)는 D274 (Seqirus)로부터 얻었다. PR8 HGP 바이러스는 역 유전학을 사용하여 생성되었다. 바이러스는 부화된 계란에서 증식되었다.

A/PR/8/1934 및A/Texas/1/1977에 대한 트립신 과요오드산염-처리된 양 항혈청이 Seqirus에서 생성되었다.

플라스미드

pHW2000 벡터 [80]에서 PR8 (H1N1), A/Wyoming/3/2003 (H3N2), 및 A/Indonesia/NIHRD11771/2011 (H5N1)의 HA 및 NA를 함유하는 플라스미드는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 생성되었다. H6N1의 경우, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 H6(A/turkey/Massachusetts/3740/1965) 및 N1 (A/Brisbane/59/2007 및 A/California/07/2009)을 암호화하는 플라스미드를 생성하였다.

HGP 바이러스의 정제

고성장 모 바이러스 (PR8 및 A/Texas/1/1977)를 배양 숙주의 감염 전에 정제하였다. 각 모 인플루엔자 바이러스 균주에 대해, 2ml의 감염된 요막액을 0.45 μm 필터를 통해 여과시키고 Microsep 300K Omega 원심분리 장치 (PALL)을 사용하여 약 1400 x g에서 1시간 동안 원심분리하여 정제하였다. 보유된 바이러스를 인산염 완충 식염수 (PBS)^-에 희석하고 새로운 Microsep 장치를 사용하여 다시 원심분리하였다. 보유된 바이러스를 PBS^-를 사용하여 1 ml로 희석하고; 100 μl 분취량으로 -80 ℃에서 동결시켰다.

인플루엔자 바이러스의 배양 숙주로의 시차 전달

재배열 인플루엔자 바이러스의 생산을 위한 인플루엔자 유전자의 시차 전달은 293T/MDCK 공동 배양물을 플라스미드 DNA로 형질감염시킨 다음 형질감염 후 1-24시간째에 HGP로 감염시켜 수행하였다. 바이러스 HA 및 NA를 발현하는 1-2 μg을 사용한 293T/MDCK 세포의 형질감염은 제조업체의 지침에 따라 TransIT-293 (Mirus), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), 또는 Lipofectamine 3000 (Invitrogen) 형질감염 시약을 사용하여 수행하였다.

형질감염 후 대략 3시간째에, 세포를 PBS^-로 세척하고; 상청액을 1 ml/웰의 신선한 OptiMEM 로 교체하였다. 그런 다음 세포를 HGP로 감염시켰다. TPCK-트립신은 형질감염 후 1일째에 첨가되었다 (1 μg/ml). 형질감염 후 3일째에 상청액을 수집하였다.

인플루엔자 바이러스 유전자의 배양 숙주로의 공동 전달

293T 과 MDCK 세포 (WHO 또는 MDCK 33016PF, 현탁액 또는 부착물)의 공동 배양물을 바이러스 HA 및 NA를 암호화하는 플라스미드 DNA 각각 1-2 μg과 함께 순수 정제된 HGP 바이러스 (순수 HGP 바이러스의 10-20　μl/형질감염 (6_웰 플레이트))로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 시약 TransIT-293 (Mirus), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), 또는 Lipofectamine 3000 (Invitrogen)을 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. TransIT-293을 사용하여 형질감염된 세포를 형질 감염 후 약 3시간째에 세척하였다. TPCK-트립신 (1 μg/ml)을 이전에 기술한 바와 같이 형질감염 1일 째, 또는 형질감염 후 4-8시간 후에 첨가하였다. 상청액을 형질감염 후 3-6일째에 수집하였다.

재배열 인플루엔자 바이러스의 선택

형질감염 상청액을 이후에 HGP 바이러스에 대해 생성된 항혈청의 존재 하에 난에서 계대하였다. 간단히 말하면, 첫 번째 항혈청 계대를 위해 부화된 난에 200 μl/난의 순수 형질감염 상청액을 접종하고, 1시간 후에 200 μl/난의 트립신 페리오데이트 처리 항혈청 (적절한 경우, PR8 또는 A/Texas/1/1977에 대해 생성)을 접종하였다. 두 번째 항혈청 계대를 위해 첫 번째 항혈청 계대에서 채취한 감염된 요막액을 HA 역가에 따라 희석하고 200 μl/난으로 난을 접종하기 전에 동일한 부피의 항혈청과 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 일부 형질감염의 경우, 바이러스는 희석을 제한함으로써 복제되었다.

재배열체의 HA 및 NA 유전자형을 유전자 특이적 프라이머 (Geneworks) 및 프로브 (Applied Biosystems 또는 Sigma)를 사용하여 실시간 PCR에 의해 결정하였다. Taqman RT-PCR mastermix (Applied Biosystems)를 사용하여 반응을 준비하고 제조업체의 지침에 따라 7500 Fast Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 PCR를 수행하였다.

실시예 1 -H5N1 (A/Indonesia/NIHRD11771/2011) 재배열 바이러스의 생성

고성장 모 균주 (A/Texas/1/1977)와 A/Indonesia/NIHRD11771/2011의 HA 및 NA 유전자를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 H5N1 재배열 바이러스를 생성하였다.

293T/MDCK (WHO)의 공동 배양물을 A/Indonesia/NIHRD11771/2011의 HA 및 NA 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 후 고성장 모 균주로 감염시키거나, HA- 및 NA-암호화 플라스미드 및 고성장 모 균주로 동시에 공동 형질감염시켰다 (표 1).

형질감염 후, 세포 배양물을 항혈청으로 처리하였다. 첫 번째 항혈청 계대 후, HA 역가가 두 실험 모두에서 검출되었지만, 고 성장 모체가 플라스미드와 동시에 세포 배양물에 전달된 경우 더 높은 HA 역가가 관찰되었다. 두 번째 항혈청 계대는 동시 형질감염뿐만 아니라 세포 배양물을 고성장 모 균주로 형질감염시키기 전에 플라스미드로 형질감염된 실험 모두에 대해 유사한 수준의 바이러스 복제를 입증하였다.

RT-PCR에 의한 유전자형 분석은 두 바이러스가 재배열체임을 나타낸다.

실시예 2 - H1N1 (A/PR/8/1934) 재배열 바이러스의 생성

고성장 모 균주 (A/Texas/1/77)와 A/PR/8/1934의 HA 및 NA 유전자를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 재배열 H1N1 바이러스 (A/PR/8/1934)를 생성하였다.

293T/MDCK (WHO)의 공동 배양물을 HA- 및 NA-암호화 플라스미드와 HGP로 동시에 공동 형질감염시켰다 (표 2).

바이러스 분리를 확인하기 위해, 두 번째 항혈청 방법에서와 같이 항혈청과 함께 바이러스의 사전-배양을 포함하는 세 번째 항혈청 계대를 수행하였다. 이 세 번째 항혈청 계대 후, 자손 바이러스의 HA 역가는 야생형 A/PR/8/1934의 전형적인 수준으로 증가하였다. 세 번째 항혈청 계대 후 바이러스의 유전자형 분석은 A/PR/8/1934의 HA 및 NA 유전자를 보여 6:2 재배열체가 성공적으로 생성되었음을 입증하였다.

실시예 3 - H3N1 (A/Wyoming/3/2003) 재배열 바이러스의 생성.

H1N1 HGP 바이러스 (A/PR/8/1934)과 A/Wyoming/3/2003의 HA 및 NA 유전자를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 재배열 H3N1 바이러스를 생성하였다.

293T/MDCK (WHO)의 공동 배양물을 A/Wyoming/3/2003의 HA 및 NA 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시킨 다음 형질감염 후 약 3.5시간째에 HGP로 감염시키거나, HA-및 NA-암호화 플라스미드와 HGP로 동시에 공동 형질감염시켰다 (표 3).

첫 번째 항혈청 계대 후, HA 역가가 시차를 둔 HGP 재배열체와 공동 전달된 HGP 재배열체 모두에 대해 검출되었다. 두 번째 항혈청 계대는 두 가지 하이브리드 재배열 방법에 대해 유사한 수준의 바이러스 복제를 입증하였다. 실시간 PCR에 의한 유전자형 분석은 두 바이러스가 재배열체임을 보여주었다.

실시예 4 - H6N1 재배열 바이러스의 생성.

H3N2 HGP 바이러스 (A/Texas/1/1977) 및 H6 (A/turkey/Massachusetts/3740/1965) 및 N1 (A/Brisbane/59/2007 및 A/California/07/2009) 유전자를 암호화하는 플라스미드를 사용하여 재배열 H6N1 바이러스를 생성하였다.

293T/adherent MDCK 33016PF 세포의 공동 배양물을 HA- 및 NA-암호화 플라스미드와 HGP로 동시에 공동 형질감염시켰다 (표 4).

실시간 PCR에 의한 유전자형 분석은 두 H6N1 자손 바이러스가 재배열체임을 보여주었다.

실시예 5 - 유전적 다양성 평가

유사 종을 제조하기 위해 인플루엔자 바이러스를 복제하는 맥락에서 생성될 수 있는 유전적 다양성을 고전적인 재배열 또는 역 유전학 (RG)에 의해 얻은 인플루엔자 A 바이러스에 존재하는 비표면 인플루엔자 단백질의 서열을 비교하여 평가하였다. 10 RG 바이러스 (원래 Seqirus, CDC 및 NIBSC에서 구출됨) 절편 유전자의 핵산 서열을 시퀀싱한 후 번역하여 단백질 서열을 결정하였다. 이들 서열을 고전적인 재분류 (Seqirus, NYMC 및 NIBSC에 의해 생성된 재배열체)로 얻은 16 H1N1 및 32 H3N2 바이러스에 대한 해당 서열과 비교하였다.

M1, NP, NS1, PA 및 PB2 단백질 서열의 분석은 RG 구출된 바이러스보다 재배열된 바이러스에 존재하는 서열 변이 수준이 더 큰 것으로 입증되었다. 각 데이터 세트 내의 서열 발산은 RG 구출 바이러스보다 재배열 바이러스 데이터 세트에서 일관되게 더 컸다.

각 골격 절편의 아미노산 서열 변이는 하기 표 1-5에 예시되어 있다. 특정 위치에서 아미노산의 빈도는 각 소스에 대해 분석된 서열 수의 백분율로 표현된다. 동일한 데이터가 도 1-5에 표시되어 있다.

이들 데이터는 배양 숙주가 유사 종이 존재하는 모 인플루엔자 바이러스 균주와 접촉할 때 배양 숙주에 전달되는 골격 유전자 절편의 서열 가변성을 설명한다. 이들 데이터는 또한 골격 절편이 원래 역 유전학 기술에서 사용되는 플라스미드와 같은 발현 작제물에 전달되는 바이러스 서열 가변성이 부족함을 보여준다.

고전적인 재배열 및 역 유전학에 의해 제조된 바이러스에 존재하는 서열 다양성을 또한 시퀀싱된 골격 유전자에 존재하는 돌연변이의 수를 평가함으로써 분석하였다. 이들 분석은 표 6-10에 제시되어 있으며, 인플루엔자 비리온의 집단 (예를 들어, 고전적인 재배열에서)으로 감염을 통해 인플루엔자 유전자 절편을 배양 숙주에 전달함으로써 제조된 바이러스에서 증가된 골격 유전자 서열 다양성을 보여준다. RG 재배열체의 것과 비교하여, 유사하게 증진된 정도의 서열 변이는 본 발명의 하이브리드 재배열 방법에 사용될 때 모 인플루엔자 바이러스 균주의 골격 유전자 절편에서 발생할 것으로 예상될 수 있다.

서열

서열 번호: 1 (PA, PR8-X)

AGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGGAAGATTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCGATGATTGTCGAGCTTGCGGAAAAAACAATGAAAGAGTATGGGGAGGACCTGAAAATCGAAACAAACAAATTTGCAGCAATATGCACTCACTTGGAAGTATGCTTCATGTATTCAGATTTTCACTTCATCAATGAGCAAGGCGAGTCAATAATCGTAGAACTTGGTGATCCAAATGCACTTTTGAAGCACAGATTTGAAATAATCGAGGGAAGAGATCGCACAATGGCCTGGACAGTAGTAAACAGTATTTGCAACACTACAGGGGCTGAGAAACCAAAGTTTCTACCAGATTTGTATGATTACAAGGAGAATAGATTTATCGAAATTGGAGTAACAAGGAGAGAAGTTCACATATACTATCTGGAAAAGGCCAATAAAATTAAATCTGAGAAAACACACATCCACATTTTCTCGTTCACTGGGGAAGAAATGGCCACAAAGGCAGACTACACTCTCGATGAAGAAAGCAGGGCTAGGATCAAAACCAGACTATTCACCATAAGACAAGAAATGGCCAGCAGAGGCCTCTGGGATTCCTTTCGTCAGTCCGAGAGAGGAGAAGAGACAATTGAAGAAAGGTTTGAAATCACAGGAACAATGCGCAAGCTTGCCGACCAAAGTCTCCCGCCGAACTTCTCCAGCCTTGAAAATTTTAGAGCCTATGTGGATGGATTCGAACCGAACGGCTACATTGAGGGCAAGCTGTCTCAAATGTCCAAAGAAGTAAATGCTAGAATTGAACCTTTTTTGAAAACAACACCACGACCACTTAGACTTCCGAATGGGCCTCCCTGTTCTCAGCGGTCCAAATTCCTGCTGATGGATGCCTTAAAATTAAGCATTGAGGACCCAAGTCATGAAGGAGAGGGAATACCGCTATATGATGCAATCAAATGCATGAGAACATTCTTTGGATGGAAGGAACCCAATGTTGTTAAACCACACGAAAAGGGAATAAATCCAAATTATCTTCTGTCATGGAAGCAAGTACTGGCAGAACTGCAGGACATTGAGAATGAGGAGAAAATTCCAAAGACTAAAAATATGAAGAAAACAAGTCAGCTAAAGTGGGCACTTGGTGAGAACATGGCACCAGAAAAGGTAGACTTTGACGACTGTAAAGATGTAGGTGATTTGAAGCAATATGATAGTGATGAACCAGAATTGAGGTCGCTTGCAAGTTGGATTCAGAATGAGTTTAACAAGGCATGCGAACTGACAGATTCAAGCTGGATAGAGCTCGATGAGATTGGAGAAGATGTGGCTCCAATTGAACACATTGCAAGCATGAGAAGGAATTATTTCACATCAGAGGTGTCTCACTGCAGAGCCACAGAATACATAATGAAGGGGGTGTACATCAATACTGCCTTGCTTAATGCATCTTGTGCAGCAATGGATGATTTCCAATTAATTCCAATGATAAGCAAGTGTAGAACTAAGGAGGGAAGGCGAAAGACCAACTTGTATGGTTTCATCATAAAAGGAAGATCCCACTTAAGGAATGACACCGACGTGGTAAACTTTGTGAGCATGGAGTTTTCTCTCACTGACCCAAGACTTGAACCACATAAATGGGAGAAGTACTGTGTTCTTGAGATAGGAGATATGCTTATAAGAAGTGCCATAGGCCAGGTTTCAAGGCCCATGTTCTTGTATGTGAGAACAAATGGAACCTCAAAAATTAAAATGAAATGGGGAATGGAGATGAGGCGTTGCCTCCTCCAGTCACTTCAACAAATTGAGAGTATGATTGAAGCTGAGTCCTCTGTCAAAGAGAAAGACATGACCAAAGAGTTCTTTGAGAACAAATCAGAAACATGGCCCATTGGAGAGTCCCCCAAAGGAGTGGAGGAAAGTTCCATTGGGAAGGTCTGCAGGACTTTATTAGCAAAGTCGGTATTCAACAGCTTGTATGCATCTCCACAACTAGAAGGATTTTCAGCTGAATCAAGAAAACTGCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGGGACAACCTTGAACCTGGGACCTTTGATCTTGGGGGGCTATATGAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCTTCTTGGTTCAACTCCTTCCTTACACATGCATTGAGTTAGTTGTGGCAGTGCTACTATTTGCTATCCATACTGTCCAAAAAAGTACCTTGTTTCTACT

서열 번호: 2 (PB1, PR8-X)

AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGACCTTACTTTTCTTAAAAGTGCCAACACAAAATGCTATAAGCACAACTTTCCCTTATACTGGAGACCCTCCTTACAGCCATGGGACAGGAACAGGATACACCATGGATACTGTCAACAGGACACATCAGTACTCAGAAAAGGGAAGATGGACAACAAACACCGAAACTGGAGCACCGCAACTCAACCCGATTGATGGGCCACTGCCAGAAGACAATGAACCAAGTGGTTATGCCCAAACAGATTGTGTATTGGAGGCGATGGCTTTCCTTGAGGAATCCCATCCTGGTATTTTTGAAAACTCGTGTATTGAAACGATGGAGGTTGTTCAGCAAACACGAGTAGACAAGCTGACACAAGGCCGACAGACCTATGACTGGACTCTAAATAGAAACCAACCTGCTGCAACAGCATTGGCCAACACAATAGAAGTGTTCAGATCAAATGGCCTCACGGCCAATGAGTCTGGAAGGCTCATAGACTTCCTTAAGGATGTAATGGAGTCAATGAACAAAGAAGAAATGGGGATCACAACTCATTTTCAGAGAAAGAGACGGGTGAGAGACAATATGACTAAGAAAATGATAACACAGAGAACAATGGGTAAAAAGAAGCAGAGATTGAACAAAAGGAGTTATCTAATTAGAGCATTGACCCTGAACACAATGACCAAAGATGCTGAGAGAGGGAAGCTAAAACGGAGAGCAATTGCAACCCCAGGGATGCAAATAAGGGGGTTTGTATACTTTGTTGAGACACTGGCAAGGAGTATATGTGAGAAACTTGAACAATCAGGGTTGCCAGTTGGAGGCAATGAGAAGAAAGCAAAGTTGGCAAATGTTGTAAGGAAGATGATGACCAATTCTCAGGACACCGAACTTTCTTTCACCATCACTGGAGATAACACCAAATGGAACGAAAATCAGAATCCTCGGATGTTTTTGGCCATGATCACATATATGACCAGAAATCAGCCCGAATGGTTCAGAAATGTTCTAAGTATTGCTCCAATAATGTTCTCAAACAAAATGGCGAGACTGGGAAAAGGGTATATGTTTGAGAGCAAGAGTATGAAACTTAGAACTCAAATACCTGCAGAAATGCTAGCAAGCATCGATTTGAAATATTTCAATGATTCAACAAGAAAGAAGATTGAAAAAATCCGACCGCTCTTAATAGAGGGGACTGCATCATTGAGCCCTGGAATGATGATGGGCATGTTCAATATGTTAAGCACTGTATTAGGCGTCTCCATCCTGAATCTTGGACAAAAGAGATACACCAAGACTACTTACTGGTGGGATGGTCTTCAATCCTCTGACGATTTTGCTCTGATTGTGAATGCACCCAATCATGAAGGGATTCAAGCCGGAGTCGACAGGTTTTATCGAACCTGTAAGCTACTTGGAATCAATATGAGCAAGAAAAAGTCTTACATAAACAGAACAGGTACATTTGAATTCACAAGTTTTTTCTATCGTTATGGGTTTGTTGCCAATTTCAGCATGGAGCTTCCCAGTTTTGGGGTGTCTGGGATCAACGAGTCAGCGGACATGAGTATTGGAGTTACTGTCATCAAAAACAATATGATAAACAATGATCTTGGTCCAGCAACAGCTCAAATGGCCCTTCAGTTGTTCATCAAAGATTACAGGTACACGTACCGATGCCATAGAGGTGACACACAAATACAAACCCGAAGATCATTTGAAATAAAGAAACTGTGGGAGCAAACCCGTTCCAAAGCTGGACTGCTGGTCTCCGACGGAGGCCCAAATTTATACAACATTAGAAATCTCCACATTCCTGAAGTCTGCCTAAAATGGGAATTGATGGATGAGGATTACCAGGGGCGTTTATGCAACCCACTGAACCCATTTGTCAGCCATAAAGAAATTGAATCAATGAACAATGCAGTGATGATGCCAGCACATGGTCCAGCCAAAAACATGGAGTATGATGCTGTTGCAACAACACACTCCTGGATCCCCAAAAGAAATCGATCCATCTTGAATACAAGTCAAAGAGGAGTACTTGAGGATGAACAAATGTACCAAAGGTGCTGCAATTTATTTGAAAAATTCTTCCCCAGCAGTTCATACAGAAGACCAGTCGGGATATCCAGTATGGTGGAGGCTATGGTTTCCAGAGCCCGAATTGATGCACGGATTGATTTCGAATCTGGAAGGATAAAGAAAGAAGAGTTCACTGAGATCATGAAGATCTGTTCCACCATTGAAGAGCTCAGACGGCAAAAATAGTGAATTTAGCTTGTCCTTCATGAAAAAATGCCTTGTTTCTACT

서열 번호: 3 (PB2, PR8-X)

AGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAATATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAAATCTAATGTCGCAGTCTCGCACCCGCGAGATACTCACAAAAACCACCGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAGTACACATCAGGAAGACAGGAGAAGAACCCAGCACTTAGGATGAAATGGATGATGGCAATGAAATATCCAATTACAGCAGACAAGAGGATAACGGAAATGATTCCTGAGAGAAATGAGCAAGGACAAACTTTATGGAGTAAAATGAATGATGCCGGATCAGACCGAGTGATGGTATCACCTCTGGCTGTGACATGGTGGAATAGGAATGGACCAATAACAAATACAGTTCATTATCCAAAAATCTACAAAACTTATTTTGAAAGAGTAGAAAGGCTAAAGCATGGAACCTTTGGCCCTGTCCATTTTAGAAACCAAGTCAAAATACGTCGGAGAGTTGACATAAATCCTGGTCATGCAGATCTCAGTGCCAAGGAGGCACAGGATGTAATCATGGAAGTTGTTTTCCCTAACGAAGTGGGAGCCAGGATACTAACATCGGAATCGCAACTAACGATAACCAAAGAGAAGAAAGAAGAACTCCAGGATTGCAAAATTTCTCCTTTGATGGTTGCATACATGTTGGAGAGAGAACTGGTCCGCAAAACGAGATTCCTCCCAGTGGCTGGTGGAACAAGCAGTGTGTACATTGAAGTGTTGCATTTGACTCAAGGAACATGCTGGGAACAGATGTATACTCCAGGAGGGGAAGTGAGGAATGATGATGTTGATCAAAGCTTGATTATTGCTGCTAGGAACATAGTGAGAAGAGCTGCAGTATCAGCAGATCCACTAGCATCTTTATTGGAGATGTGCCACAGCACACAGATTGGTGGAATTAGGATGGTAGACATCCTTAGGCAGAACCCAACAGAAGAGCAAGCCGTGGATATATGCAAGGCTGCAATGGGACTGAGAATTAGCTCATCCTTCAGTTTTGGTGGATTCACATTTAAGAGAACAAGCGGATCATCAGTCAAGAGAGAGGAAGAGGTGCTTACGGGAAATCTTCAAACATTGAAGATAAGAGTGCATGAGGGATATGAAGAGTTCACAATGGTTGGGAGAAGAGCAACAGCCATACTCAGAAAAGCAACCAGGAGATTGATTCAGCTGATAGTGAGTGGGAGAGACGAACAGTCGATTGCCGAAGCAATAATTGTGGCCATGGTATTTTCACAAGAGGATTGTATGATAAAAGCAGTCAGAGGTGATCTGAATTTCGTCAATAGGGCGAATCAGCGATTGAATCCTATGCATCAACTTTTAAGACATTTTCAGAAGGATGCGAGAGTGCTTTTTCAAAATTGGGGAGTTGAACCTATCGACAATGTGATGGGAATGATTGGGATATTGCCCGACATGACTCCAAGCATCGAGATGTCAATGAGAGGAGTGAGAATCAGCAAAATGGGTGTAGATGAGTACTCCAGCACGGAGAGGGTAGTGGTGAGCATTGACCGTTTTTTGAGAATCCGGGACCAACGAGGAAATGTACTACTGTCTCCCGAGGAGGTCAGTGAAACACAGGGAACAGAGAAACTGACAATAACTTACTCATCGTCAATGATGTGGGAGATTAATGGTCCTGAATCAGTATTGGTCAATACCTATCAATGGATCATCAGAAACTGGGAAACTGTTAAAATTCAGTGGTCCCAGAACCCTACAATGCTATACAATAAAATGGAATTTGAACCATTTCAGTCTTTAGTACCTAAGGCCATTAGAGGCCAATACAGTGGGTTTGTAAGAACTCTGTTCCAACAAATGAGGGATGTGCTTGGGACATTTGATACCGCACAGATAATAAAACTTCTTCCCTTCGCAGCCGCTCCACCAAAGCAAAGTAGAATGCAGTTCTCCTCATTTACTGTGAATGTGAGGGGATCAGGAATGAGAATACTTGTAAGGGGCAATTCTCCTGTATTCAACTATAACAAGGCCACGAAGAGACTCACAGTTCTCGGAAAGGATGCTGGCACTTTAACTGAAGACCCAGATGAAGGCACAGCTGGAGTGGAGTCCGCTGTTCTGAGGGGATTCCTCATTCTGGGCAAAGAAGACAAGAGATATGGGCCAGCACTAAGCATCAATGAACTGAGCAACCTTGCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTGCTAATTGGGCAAGGAGACGTGGTGTTGGTAATGAAACGGAAACGGGACTCTAGCATACTTACTGACAGCCAGACAGCGACCAAAAGAATTCGGATGGCCATCAATTAGTGTCGAATAGTTTAAAAACGACCTTGTTTCTACT

서열 번호: 4 (NP, PR8-X)

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서열 번호: 5 (M, PR8-X)

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서열 번호: 6 (NS, PR8-X)

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서열 번호: 7 (HA, PR8-X)

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서열 번호: 8 (NA, PR8-X)

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서열 번호: 9 (PA, 105p30)

AGCGAAAGCAGGTACTGAtTCgaAaTGGAAGATTTTGTGCGACAATGCTTCAATCCGATGATTGTCGAGCTTGCGGAAAAGGCAATGAAAGAGTATGGAGAGGACCTGAAAATCGAAACAAACAAATTTGCAGCAATATGCACCCACTTGGAAGTATGCTTCATGTATTCAGATTTTCATTTCATCAATGAGCAAGGCGAATCAATAATAGTAGAGCCTGAGGACCCAAATGCACTTTTAAAACACAGATTTGAGATAATAGAGGGGCGAGATCGTACAATGGCATGGACAGTTGTAAACAGTATTTGCAACACCACAGGAGCTGAGAAACCAAAGTTTCTGCCAGATCTGTATGATTACAAAGAGAATAGGTTCATCGAAATTGGAGTGACAAGGAGAGAAGTTCACATATACTATCTGGAAAAGGCCAACAAAATTAAATCTGAGAAGACACATATTCACATTTTCTCATTTACTGGCGAAGAAATGGCCACAAAGGCCGATTACACTCTCGATGAAGAAAGCAGGGCTAGAATTAAAACCAGACTATTCACCATAAGGCAAGAAATGGCAAGCAGAGGTCTTTGGGACTCCTTTCGTCAGTCCGAAAGAGGCGAAGAGACAATTGAAGAAAGGTTTGAAATCACAGGGACAATGCGCAGGCTCGCTGATCAAAGCCTTCCGCCGAACTTCTCCTGCATTGAGAATTTTAGAGCCTATGTGGATGGATTTGAACCGAACGGCTACATTGAGGGCAAGCTTTCTCAAATGTCCAAAGAAGTAAATGCTAAAATTGAGCCTTTTTTGAAAACAACACCTCGACCAATTAGACTTCCGAATGGGCCTCCTTGTTTTCAGCGGTCAAAATTCCTGCTGATGGATTCTTTAAAATTAAGCATTGAGGATCCAAATCATGAAGGGGAGGGAATACCACTATATGATGCAATCAAGTGTATGAGAACATTCTTTGGATGGAAAGAACCCACTGTTGTCAAGCCACACGAGAAGGGAATAAATCCGAATTATCTGCTGTCGTGGAAGCAGGTGTTGGAAGAGCTGCAGGACATTGAGAGTGAGGAGAAGATTCCAAGAACAAAAAACATGAAAAAAACGAGTCAGTTAAAGTGGGCACTTGGTGAGAACATGGCACCAGAGAAGGTGGATTTTGATGACTGTAAAGATATAAGCGATTTGAAGCAATATGATAGTGACGAACCTGAATTAAGGTCATTTTCAAGTTGGATCCAGAATGAGTTCAACAAGGCATGCGAGCTGACCGATTCAATCTGGATAGAGCTCGATGAGATTGGAGAAGATGTGGCCCCGATTGAACACATTGCAAGCATGAGAAGAAATTACTTCACAGCTGAGGTGTCCCATTGCAGAGCCACTGAATATATAATGAAAGGGGTATACATTAATACTGCTTTGCTTAATGCATCCTGTGCAGCAATGGATGATTTCCAACTAATTCCTATGATAAGCAAATGTAGAACTAAAGAGGGAAGGAGAAAGACCAATTTGTACGGCTTCATCATAAAAGGAAGATCTCACTTAAGGAATGATACCGATGTGGTAAACTTTGTGAGCATGGAGTTTTCCCTCACTGACCCAAGACTTGAGCCACACAAATGGGAGAAGTACTGTGTTCTTGAGATAGGAGATATGCTTCTAAGGAGTGCAATAGGCCAAGTGTCAAGGCCCATGTTCTTGTATGTAAGAACAAATGGAACCTCAAAAATTAAAATGAAATGGGGAATGGAGATGAGGCGTTGCCTCCTCCAATCCCTCCAACAAATAGAGAGCATGATTGAAGCTGAGTCCTCTGTCAAGGAGAAAGACATGACAAAAGAGTTTTTTGAGAATAGATCAGAAACATGGCCCATTGGAGAGTCACCAAAAGGAGTGGAAGAAGGTTCCATTGGGAAAGTATGCAGGACACTATTGGCTAAATCAGTATTCAATAGTCTGTATGCATCTCCACAATTAGAAGGATTTTCAGCTGAGTCAAGAAAGTTGCTCCTTATTGTTCAGGCTCTTAGGGACAATCTGGAACCTGGGACCTTTGATCTTGGGGGACTATATGAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATTAATGATCCCTGGGTTTTGCTTAATGCTTCTTGGTTCAACTCCTTCCTAAAACATGCATTGAGATAGCTGAGGCAATGCTACTATTTGTTATCCATACTGTCCAAAAAAGTA

서열 번호: 10 (PB1, 105p30)

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서열 번호: 11 (PB2, 105p30)

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서열 번호: 12 (NP, 105p30)

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서열 번호: 15 (HA, 105p30)

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서열 번호: 16 (NA, 105p30)

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참고문헌

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gagagtcagc aaaatgggtg tagatgaata ctccaatgct 1500 gaaagggtag tggtaagcat tgaccgtttt ttgagggtcc gggaccaaag aggaaatgta 1560 ttactgtctc cagaggaagt cagtgaaaca caaggaacag agaaactgac aataacttac 1620 tcttcatcat tgatgtggga gattaatggc cctgagtcag tgttgatcaa tacctaccaa 1680 tggatcatca gaaactggga gactgttaaa attcagtggt ctcagaaccc tacaatgcta 1740 tacaataaaa tggaatttga gccatttcaa tctctagtcc ccaaggccat tagaggccaa 1800 tacagtgggt ttgttagaac tctatttcaa caaatgaggg atgtgctcgg gacctttgac 1860 acaactcaga taataaaact tcttcccttt gcagccgctc caccaaagca aagtagaatg 1920 caattctcgt cattaactgt gaatgtgagg ggatcaggaa tgagaatact tgtaaggggt 1980 aattctccag tattcaacta caacaagacc actaagagac tcacaatcct cggaaaggat 2040 gctggcactt taactgaaga cccagatgaa ggcacagctg gagtggaatc tgctgtttta 2100 aggggattcc tcattctagg caaagaagat agaagatatg ggccagcatt aagcatcagt 2160 gaattgagca accttgcgaa aggggagaaa gctaatgtgc taattgggca aggggatgta 2220 gtgttggtaa tgaaacgaaa acgggactct agcatactta ctgacagcca gacagcgacc 2280 aaaagaattc ggatggccat 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tggatcaagt gagagaaagc 780 cggaacccag gaaatgctga gatcgaagat ctcacttttc tggcacggtc tgcactcata 840 ttgagaggat cagttgctca caagtcttgc ctgcctgctt gtgtgtatgg accagccgta 900 gccagtgggt atgacttcga aaaagaggga tactctttgg tgggagtaga ccctttcaaa 960 ctgcttcaaa ccagtcaggt atacagccta attagaccaa acgagaatcc cgcacacaag 1020 agccagttgg tgtggatggc atgcaattct gctgcatttg aagatctaag agtgtcaagc 1080 ttcatcagag ggacaagagt acttccaagg gggaagctct ccactagagg agtacaaatt 1140 gcttcaaatg aaaacatgga tgctattgtc tcaagtactc ttgaactgag aagcagatac 1200 tgggccataa gaaccagaag tggagggaac accaatcaac aaagggcctc tgcgggccaa 1260 atcagcacac aacctacgtt ttctgtgcag agaaacctcc catttgacaa aacaaccatc 1320 atggcagcat tcactgggaa tacagaggga agaacatcag acatgcgggc agaaatcata 1380 aagatgatgg aaagtgcaag accagaagaa gtgtccttcc agggacgggg agtctttgag 1440 ctctcggacg aaagggcaac gaacccgatc gtgccctcct ttgacatgag taatgaagga 1500 tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tacgacaatt aatgaaaaat acccttgttt 1560 ctact 1565 <210> 13 <211> 1027 <212> DNA <213> Influenza 105p30 <400> 13 agcaaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60 ctctatcgtc ccatcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtatt 120 tgctggaaag aataccgatc ttgaggctct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180 gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240 aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaatgggg atccaaataa 300 tatggacaag gctgtcaaac tgtatcgaaa gcttaagagg gagataacat tccatggggc 360 caaagaaata gcactcagtt attctgctgg agcacttgcc agttgtatgg gactcatata 420 caacaggatg ggggctgtga ccaccgaatc agcatttggc cttatatgtg caacctgtga 480 acagattgcc gactcccagc ataagtctca taggcaaatg gtaacaacaa ccaatccatt 540 aataagacat gagaacagaa tggttctggc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600 ggctggatcg agtgaacaag cagctgaggc catggaggtt gctagtcagg ccaggcagat 660 ggtgcaggca atgagagcca ttgggactca tcctagctct agcactggtc tgaaaaatga 720 tctccttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacgattcaa 780 gtgatcctct tgttgttgcc gcaagtataa ttgggattgt gcacctgata ttgtggatta 840 ttgatcgcct tttttccaaa agcatttatc gtatttttaa acacggttta aaaagagggc 900 cttctacgga aggagtaccg gagtctatga gggaagaata tcgagaggaa cagcagaatg 960 ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct agagtaaaaa actaccttgt 1020 ttctact 1027 <210> 14 <211> 889 <212> DNA <213> Influenza 105p30 <400> 14 agcaaaagca gggtggcaaa gacataatgg attcccacac tgtgtcaagc tttcaggtag 60 attgtttcct ttggcatgtc cgcaaacaag ttgcagacca agatctaggc gatgccccct 120 tccttgatcg gcttcgccga gatcagaagt ctctaaaggg acgaggcaac actctcggtc 180 tgaacatcga aacagccact tgtgttggaa agcaaatagt agagaggatt ctgaaagaag 240 aatccgatga gacatttaga atgaccatgg cctccgcact tgcttcgcgg tacctaactg 300 acatgactgt tgaagaaatg tcaagggact ggttcatgct catgcccaag cagaaagtgg 360 ctggccctct ttgtgtcaga atggaccagg cgataatgga taagaacatc atactgaaag 420 cgaacttcag tgtgattttt gaccggttgg agaatctgac attactaagg gctttcaccg 480 aagagggagc aattgttggc gaaatttcac cattgccttc ttttccagga catactaatg 540 aggatgtcaa aaatgcaatt ggggtcctca tcgggggact tgaatggaat gataacacag 600 ttcgagtctc tgaagctcta cagagattcg cttggagaag cagtaatgag actgggggac 660 ctccattcac tacaacacag aaacggaaaa tggcgggaac aattaggtca gaagtttgaa 720 gaaataagat ggctgattga agaagtgagg cataaattga agacgacaga gagtagtttt 780 gaacaaataa catttatgca agcattacag ctattgtttg aagtggaaca agagattaga 840 acgttctcgt ttcagcttat ttaatgataa aaacaccctt gtttctact 889 <210> 15 <211> 1775 <212> DNA <213> Influenza 105p30 <400> 15 agcgaaagca ggggaaaata aaagcaacca aaatgaaagt aaaactactg gttctgttat 60 gtacatttac agctacatat gcagacacaa tatgtatagg ctaccatgcc aacaactcaa 120 ccgacactgt tgacacagta cttgagaaga atgtaacagt gacacactct gtcaacctac 180 ttgaggacag tcacaatgga aaactatgtc tactaaaagg aatagcccca ctacaattgg 240 gtaattgcag cgttgccgga tggatcttag gaaacccaga atgcgaatta ctgatttcca 300 aggaatcatg gtcctacatt gtagaaacac caaatcctga gaatggaaca tgttacccag 360 ggtatttcgc cgactatgag gaactgaggg agcaattgag ttcagtatct tcatttgaaa 420 ggttcgaaat attccccaaa gagagctcat ggcccaacca caccgtaacc ggagtatcag 480 catcatgctc ccataacggg aaaagcagtt tttacagaaa 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gttctcactt ggaatgcaga accttttttc 420 tgacccaagg tgctctatta aatgacaaac attcaaatgg aaccgttaag gacagaagtc 480 cttatagggc cttaatgagc tgtcctctag gtgaagcccc gtcaccatac aattcaaagt 540 ttgaatcagt tgcatggtca gcaagcgcat gccatgatgg caagggctgg ttaacaatcg 600 gaatttctgg tccagacaat ggagctgtgg ctgtactaaa atacaacgga ataataactg 660 aaaccataaa aagttgggaa aagcgaatat tgagaacaca agagtctgaa tgtgtttgtg 720 tgaacgggtc atgtttcacc ataatgaccg atggcccgag taatggggcc gcctcgtaca 780 aaatcttcaa gatcgaaaag gggaaggtta ctaaatcaac agagttgaat gcacccaatt 840 ttcattatga ggaatgttcc tgttacccag acactggcac agtgatgtgt gtatgcaggg 900 acaactggca tggttcaaat cgaccttggg tatcttttaa tcaaaacttg gattatcaaa 960 taggatacat ctgcagtgga gtgttcggtg acaatccgcg tcccaaagat gggaagggca 1020 gctgtaatcc agtgactgtt gatggagcag acggagttaa ggggttttca tacaaatatg 1080 gtaatggtgt ttggatagga aggactaaaa gtaacagact tagaaagggg tttgagatga 1140 tttgggatcc taatggatgg acagataccg acagtgattt ctcagtgaaa caggatgttg 1200 tggcaataac tgattggtca gggtacagcg gaagtttcgt ccaacatcct gagttaacag 1260 gattggactg tataagacct tgcttctggg ttgagttagt cagaggactg cctagagaaa 1320 atacaacaat ctggactagt gggagcagca tttctttttg tggcgttgat agtgatactg 1380 caaattggtc ttggccagac ggtgctgagt tgccgttcac cattgacaag tagctcgttg 1440 aaaaaaactc cttgtttcta ct 1462

Claims (42)

1. 재배열 인플루엔자 바이러스의 생성 방법으로서,
   (i) 배양 숙주를 제1 헤마글루티닌 (HA) 유전자 및 제1 뉴라미니다제 (NA) 유전자를 포함하는 모 인플루엔자 바이러스 균주와 접촉시키는 단계;
   (ii) 하나 이상의 인플루엔자 유전자를 포함하는 하나 이상의 발현 작제물(들)을 상기 배양 숙주 내로 도입시키는 단계, 여기서 상기 인플루엔자 유전자는 제2 HA 유전자 또는 제2 NA 유전자를 포함하고;
   (iii) 상기 배양 숙주를 배양하여 재배열 바이러스를 제조하는 단계; 및
   (iv) 상기 제2 HA 유전자 또는 상기 제2 NA 유전자를 포함하는 재배열 바이러스를 선택하는 단계;
   를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제2 HA 유전자 또는 상기 제2 NA 유전자를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계 (v)를 추가로 포함하는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 분리된 인플루엔자 바이러스는 7:1 재배열 인플루엔자 바이러스인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 인플루엔자 유전자는 제2 HA 유전자 및 제2 NA 유전자를 포함하고, 단계 (iv)는 상기 제2 HA 유전자 및/또는 상기 제2 NA 유전자를 포함하는 재배열 바이러스를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
5. 제4항에 있어서, (i) 상기 제2 HA 유전자; 및/또는 (ii) 상기 제2 NA 유전자를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 분리시키는 단계 (v)를 추가로 포함하는, 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 분리된 재배열 인플루엔자 바이러스는 6:2 재배열 인플루엔자 바이러스인, 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 인플루엔자 유전자는 제2 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP를 포함하고, 단계 (iv)는 상기 제2 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자를 포함하는 재배열 바이러스를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
8. 제7항에 있어서, (i) 상기 제2 HA 유전자; 및/또는 (ii) 상기 제2 NA 유전자; 및 (iii) 상기 제2 PB1, PB2, PA, M, NS 또는 NP 유전자를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스를 분리시키는 단계 (v)를 추가로 포함하는, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 분리된 재배열 인플루엔자 바이러스는 5:3 재배열 인플루엔자 바이러스인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 작제물(들)은 7, 6, 5, 4 또는 3개 이하의 인플루엔자 유전자를 포함하는, 방법.
11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 작제물(들)은 2개 이하의 인플루엔자 유전자를 포함하는, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 작제물(들)은 하나 이상의 플라스미드(들), 하나 이상의 선형 DNA 분자(들), 또는 하나 이상의 RNA 분자(들)인, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 작제물(들)은 합성 핵산 분자, 예를 들어 합성 DNA 분자 또는 합성 RNA 분자를 포함하는, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 작제물(들)은 양방향성 발현 작제물(들)이고, 여기서 적어도 하나의 유전자가 상류(upstream)의 pol II 프로모터와 하류(downstream)의 비-내인성 pol I 프로모터 사이에 위치하는, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 작제물(들)은 상기 배양 숙주가 상기 모 인플루엔자 바이러스 균주와 접촉함과 동시에 상기 배양 숙주내로 도입되는, 방법.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 작제물(들)은 상기 배양 숙주가 상기 모 인플루엔자 바이러스 균주와 접촉하기 전 또는 후에 상기 배양 숙주 내로 도입되는, 방법.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 재배열 인플루엔자 바이러스를 단계 (iv) 이전에 상기 배양 숙주로부터 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (iv)는 상기 제1 HA에 대한 음성 선택을 포함하는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 음성 선택은 상기 배양 숙주 또는 상기 배양 숙주로부터 분리된 상기 재배열 인플루엔자 바이러스를 상기 제1 HA에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 음성 선택은 상기 배양 숙주를 상기 제1 HA의 전사 및/또는 번역을 감소시키거나 방지하는 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)는 상기 제1 NA에 대한 음성 선택을 포함하는, 방법..
22. 제21항에 있어서, 상기 음성 선택은 상기 배양 숙주 또는 상기 배양 숙주로부터 분리된 상기 재배열 인플루엔자 바이러스를 상기 제1 NA에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 음성 선택은 상기 제1 NA의 전사 및/또는 번역을 감소시키거나 방지하는 억제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)는 상기 제2 HA 또는 상기 제2 NA에 대한 양성 선택을 포함하는, 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 양성 선택은 상기 배양 숙주 또는 상기 배양 숙주로부터 분리된 상기 재배열 인플루엔자 바이러스를 상기 제2 HA 또는 상기 제2 NA에 특이적인 하나 이상의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iv)는 3개 이하의 선택 단계를 포함하는, 방법.
27. 제2항 내지 제3항, 제5항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재배열 바이러스의 분리는 제한된 희석 단계 및/또는 플라크 분리 단계를 포함하는, 방법.
28. 제2항 내지 제3항, 제5항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)에서 얻은 상기 바이러스를 정제하는 단계 (vi)를 추가로 포함하는, 방법.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 HA 유전자는 상기 제2 HA 유전자가 유래되는 야생형 인플루엔자 바이러스에 대한 하나 이상의 변형을 포함하는, 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 제2 HA 유전자의 변형은 다염기 절단 부위의 결실인, 방법.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제조되거나 분리된 상기 재배열 인플루엔자 바이러스는 상기 제2 HA 유전자 또는 상기 제2 NA 유전자가 유래되는 야생형 인플루엔자 바이러스보다 독성이 덜한, 방법.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 숙주는 부화된 조류 난(avian egg)인, 방법.
33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 숙주는 포유동물 세포 또는 조류 세포인, 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 배양 숙주는 MDCK, Vero, PerC6, CEF 또는 EB66 세포인, 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 세포는 착생하면서 성장하는, 방법.
36. 제34항에 있어서, 상기 세포는 현탁액에서 성장하는, 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 MDCK 세포는 세포주 MDCK 33016 (DSM ACC2219)인, 방법.
38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재배열 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인, 방법.
39. 제1항, 제4항, 제7항, 제10항 내지 제26항 또는 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 재배열 인플루엔자 바이러스의 집단.
40. 제2항 내지 제3항, 제5항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 분리된 재배열 인플루엔자 바이러스.
41. 백신의 제조 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 의해 재배열 인플루엔자 바이러스를 제조하는 단계, 및 (b) 상기 재배열 인플루엔자 바이러스로부터 백신을 제조하는 단계;
    를 포함하는, 방법.
42. 제41항의 방법에 의해 제조된 백신.

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