KR100797547B1 - 무혈청 배양 및 부유 배양에서 사용할 수 있는 세포 및상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 - Google Patents

무혈청 배양 및 부유 배양에서 사용할 수 있는 세포 및상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

우태아 혈청을 사용하지 않고 배양될 수 있고, 제조 스케일에 있어서 탱크 배양이 가능하도록 부유되고 부유 상태에서 담체를 필요로 하지 않는 신규한 MDCK 세포-도입 주(B-702); 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 경제적이고 고도로 안전하고 안정적으로 제조하는 방법.

Description

무혈청 배양 및 부유 배양에서 사용할 수 있는 세포 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법{Cell usable in serum-free culture and suspension culture and process for producing virus for vaccine by using the cell}
본 발명은 무혈청 배양 및 담체가 없는 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포주, 및 상기 세포주을 사용하여 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 혈청을 사용하기 않고 증식될 수 있고 세포가 어느 담체에도 부착될 필요없이 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포주의 수립, 및 상기 세포주를 사용하여 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 백신의 제조를 위해 발육중인 계란, 마우스 뇌, 또는 닭 또는 원숭이와 같은 다양한 동물로부터의 1차 세포 또는 확립세포주가 광범위하게 사용되고 있다. 그러나, 이 통상적인 기술은 하기에 언급되는 다양한 문제점을 포함한다.
첫째, 발육중의 계란을 사용하는 것은 닭의 사육 관리, 백신 제조 스케줄에 따라 조정되는 수정란의 관리, 및 제조시 계란 단백질로부터 유래된 성분을 완전히 제거하기 위한 추가의 정제를 포함하는 번거로운 과정을 필요로 한다. 또한 동물 보호 측면에서도 문제점을 갖고 있다.
또한, 확립세포주의 경우, 세포 증식 인자로서 우태아 혈청을 첨가하여야 한다. 그러나, 시판용 제품간의 품질이 다양할 수 있고 마이코플라스마, 바이러스, 또는 프리온과 같은 감염성 단백질에 의해 감염 위험성을 갖기 때문에 품질의 엄격한 관리가 요구된다. 따라서, 뉴질랜드에서 제조된 것과 같은 고품질의 우태아 혈청을 사용할 필요가 있지만 이는 매우 고가이기 때문에 공업용 수준에서 제조를 위해서는 부적절하다.
또한 다양한 종류의 바이러스가 증식할 수 있는 확립세포주중 MDCK(Madin Carby Canine Kidney) 세포는 실험용 수준으로 광범위하게 사용되고 있다(Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 122, pp.931-935(1996)). 그러나, MDCK 세포는 벽에 부착되는 성질이 강하다. 따라서, 공업용의 대규모 배양을 위해 MDCK 세포를 사용하는 것은 대량의 배양배지, 광범위한 면적의 배양을 위한 배양 용기 또는 담체를 필요로 하기 때문에 하기와 같은 단점을 안고 있다: 1) 설비 또는 담체에 대한 비용이 막대하고; 2) 담체에 부착된 세포를 제거하는 단계가 필요하고 이로 의해 회수시 일부 세포의 손실이 발생하고; 3) 배양 조건에 따라 담체(비드)사이의 접촉에 의한 세포의 손상이 있다. 따라서, 설비 또는 비용면에서 백신 제조를 위해 MDCK를 직접 사용하는 것은 비실용적이다.
따라서, 저렴하고, 매우 안전하며 안정적인 방법으로 백신을 제조하는 방법을 확립시키는 것이 요구되고 있다.
발명의 개시
이러한 환경하에서, 상기 언급된 선행 기술의 단점을 해결하기 위하여, 본 발명자는 연구를 계속하여 왔다. 결과, 본 발명자는 제조 스케일에 있어서 탱크 배양(tank culture)이 가능하도록 우태아 혈청없이 부유 배양에서 증식할 수 있고 부유 배양에서 아무런 담체도 필요로 하지 않는 신규한 세포주를 확립하였다. 본 발명자는 또한 우태아혈청 없이 백신을 제조함으로써 저렴하고 고도로 안전하게 백신을 제공할 수 있는 신규한 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따른 B-702의 증식성을 보여준다.
본 발명을 수행하는 최상의 모드
무혈청 배양 및 담체가 없는 부유 배양에서 증식할 수 있는 본 발명에 따른 MDCK-세포주를 하기 단계에 의해 제조하였다:
a) MDCK 세포를 무혈청 배양 배지에 순화시켜 무혈청 배양에서 증식할 수 있는 세포를 제조하고;
b) 무혈청 배양에서 증식할 수 있는 세포를 담체를 사용하는 부유 배양에 적용하여 담체를 사용하는 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포를 제조하고;
c) 담체를 사용하는 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포를 담체가 없는 부유 배양에 적용하여 담체를 필요로 하지 않고 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포를 제조한다.
더욱 특히, 본 발명의 MDCK-유래 세포주를 하기 방법에 의해 제조하였다.
10% 우태아혈청(이하, "FCS"로 언급함) 및 비필수아미노산(MEM Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco, Catalgue No. 11140-050)으로 보충된 둘베코 모디파이드 이글 배지를 포함하는 25cm2 배양 플라스크내 모노레이어에서 MDCK 세포를 배양하였다. 세포를 충분히 확장(expansion)시킨 후, 상기 세포를 25% 무혈청 배지를 포함하는 상기 배지에서 배양하고 세포내 이상이 없음을 확인하였을 때 계대배양하였다. 이하 사용되는 무혈청 배지는 바람직하게 안전성면에서 다른 동물종으로부터의 어느 성분도 포함하지 않는다. 예를 들면, VP-SFM(Gibco, Catalgue No. 11681-020)을 이하 사용하였다. 세포의 계대배양 및 충분한 확장 후, 배양 배지를 50% VP-SFM를 포함하는 D-MEM으로 대체하였다. VP-SFM의 함량을 75% 이어서 100%로 증가시키면서 상기 방법을 반복하여 세포를 무혈청 배양로 순화시켜 최종적으로는 무혈청 배양 배지에 순화된 세포를 수립하였다.
이후, 무혈청 배양 배지에 순화된 제조된 세포를 하기 두 접근법에 적용시켜 담체를 필요로 하지 않고 부유 배양에서 증식할 수 있도록 하였다.
제 1 접근법으로 무혈청 배양 배지에 순화된 세포를 배양내내 배양 배지로서 VP-SFM을 사용하여 40rpm에서 스피너 플라스크(Spinner Flask Complete, BELLCO, Catalogue No. 1965-00100)에서 직접 배양하였다. 배양 배지의 pH가 저하되었을 때, 세포는 남겨두고 배지의 반만을 신선한 배지로 교환하고 배양을 계속하였다. 약 2개월간의 배양한 후, 이 조건하에서 증식할 수 있는 세포 군집을 수득하였다. 그러나, 세포 밀도는 최고 5x105세포/㎖였지만, 공업화에 필요한 수준인 1x105세포/ ㎖에는 도달하지 않았다
제 2 접근법으로 무혈청 배양 배지에 순화된 세포를 비드 담체 Cytodex I(Pharmacia Biotec, Catalogue No. 17044801; 비드 농도, 1g(건조중량)/㎖)에 부착시킨 후 40rpm에서 스피너 플라스크(Spinner Flask Complete, BELLCO, Catalogue No. 1965-00100)에서 배양하여 회전식 쉐이킹 배양 조건하에서 증식할 수 있는 세포를 최초로 제조할 수 있었다. 결과 배양 개시 약 2개월 경과후, 비드 표면상에서 확장 및 증식할 수 있는 세포 군집을 수득하였다. 이후, 비드로부터의 분리를 위해 세포를 트립신으로 처리하지 않고 필요량의 VP-SFM 배지 및 Cytodex I를 첨가하면서 배양 규모를 250㎖, 500㎖ 및 1000㎖ 스핀 플라스크(Spinner Flask Complete, BELLCO, Catalogue No. 1965-00250, 1965-00500, 1965-00100)로 확장시켜 배양 규모로 확장될 수 있는 세포주를 수득하였다. 이후 세포주를 담체 Cytodex I의 부재하에 VP-SFM 배지와 함께 스핀 플라스크(Spinner Flask Complete, BELLCO, Catalogue No. 1965-00100)에서 배양하였다. 결과, 약 1개월 후, 담체 부재하에 증식할 수 있는 세포주를 수득하였다. 이 신규한 확립세포주를 "B-702"로 명명하였다. B-702는 대부분의 세포가 부유 배양에서 단일세포 상태로 존재한다는 것을 특징으로 한다. 본 출원인은 수탁 번호 FERM BP-7440하에 일본, 이바라키켄, 츠쿠바시, 히가시 1-초메, 1-3에 소재하는 츠우쇼상교쇼코교기쥬츠잉세메이코가쿠코교기쥬츠켄큐죠(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan)에 B-702를 기탁하였다(FERM P-17682로부터 이관됨(원 기탁일: 1999년 12월 22일); 국제 기탁변경일: 2001년 2월 9일).
이후 B-702의 증식능에 대하여 평가하였다. 대부부의 확립세포주 경우, 확장 배양을 위해서는 세포수의 약 3배 확장이 최적이라고 판단된다. 대조적으로, B-702의 경우에는 1 X 105세포/㎖의 초기 세포 밀도가 약 1주일내 1 x 106세포/㎖으로, 즉 10배 확장되는 것으로 판명되었다. 최종적으로 10배 확장을 수행한 후,본 세포주는 100㎖ 스피너 플라스크로부터 출발하여 1000㎖ 스피너 플라스크중 3 x 106세포/㎖로 확장될 수 있다.
이후, 바이러스를 제조할 수 있는 능력에 대하여 B-702를 평가하였다. 1998년 겨울부터 1999년 봄 시즌까지 사용된 3종의 상이한 인플루엔자 백신 균주(A/Beijing/262/95[H1N1], A/Wuhan/359/95[H3N2], B/Mie/1/93)를 각각 0.001, 0.00003 및 0.0002 M.O.I.로 100㎖ 스핀 플라스크중 1 x 106세포/㎖ 세포 농도로 증식된 B-702내로 접종하였다. 3일동안 34℃에서 배양한 후, 1 x 108 PFU의 바이러스를 각 배양 상층액에서 증식시키고, 여기서 바이러스 증식은 발육중인 계란 또는 10% 우태아혈청에서 배양된 MDCK 세포의 것과 동일하였다. 따라서, B-702가 세포를 위한 담체 또는 우태아혈청의 부재하에서 바이러스를 제조할 수 있음이 판명되었다.
또한, 인간 허피스 바이러스 1형 및 2형과 같은 DNA 바이러스, 및 홍역 바이 러스, 이하선염 바이러스 및 풍진바이러스과 같은 RNA 바이러스를 포함하는 바이러스를 제조하는 능력을 갖고 있고, 이로써 MDCK 세포로 순화될 수 있는 모든 바이러스가 B-702에 의해 제조될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 바이러스는 오르토믹소비리다에 (Orthomyxoviridae), 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae), 토가비리다에 (Togaviridae), 허피스비리다에 (Herpesviridae), 랍도비리다에(Rhobdoviridae), 레트로비리다에 (Retroviridae), 레오비리다에 (Reoviridae), 플라비비리다에 (Flaviviridae), 아데노비리다에 (Adenoviridae), 피코나비리다에 (Picornaviridae), 아레나비리다에 (Arenaviridae) 및 폭스비리다에 (Poxviridae)과의 동물 바이러스를 포함한다. 바람직한 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병 바이러스, RS 바이러스, 레오바이러스 3형, 황열 바이러스, 일본뇌염바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 폴리오바이러스, 라사(Lassa) 바이러스 및 백시니아바이러스를 포함한다. 가장 바람직한 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 인간 허피스 바이러스 1형 및 2형, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스 및 풍진 바이러스를 포함한다.
따라서, B-702가 바이러스 제조용 세포주로서 광범위한 유용성을 갖는다는 것이 발견되었다.
대표적으로 B-702인 MDCK-유래된 세포주에 의해 제조된 바이러스 또는 바이러스 항원을 백신 제조를 위한 원료로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 B-702는 세포에 대한 우태아 혈청 및 담체를 없이 증식할 수 있기 때문에 안정적이고 안정한 방법으로 저렴한 배지를 사용하여 백신을 포함한 다양한 유용한 물질을 제조할 수 있다. 특히 인플루엔자 바이러스의 제조와 관련하여 최근 전 세계적 관심사인 새로운 형태의 바이러스가 전세계적으로 유행하는 경우, 현재 일본에는 대량으로 필요량의 백신을 신속하게 제조하기 위한 기술 또는 장비는 제공되어 있지 않다. 따라서, B-702를 사용하여 백신을 제조하는 것이 본 목적을 위해 더욱 성공적인 방법이다.
본 발명을 더욱 잘 이해할 수 있도록 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 본 발명을 설명하지만, 이로써 제한하고자 하는 것은 아니다.
하기 배양 배지, 배양 온도 등의 조건하에서 대조군으로서 MDCK 세포(ATCC CCL-34)를 사용하여 B-702의 증식성에 대하여 평가하였다:
배양 배지: VP-SFM(Gibco, Catalogue No. 11681-020)
첨가물 : L-글루타민(Gibco, Catalogue No. 25030-081),
2%(v/v)
젠타마이신 용액(Sigma, Catalogue No. G-1397), 0.1%(v/v)
배양 조건 : 37℃, 5% CO2, 습윤하
스피너의 회전수 : 40rpm
배양 개시 당시의 세포 밀도 : 약 1 x 105 세포/㎖
계대확장조건 : 세포 밀도가 약 1 x 105 세포/㎖에 도달하였을 때, 배양을 100㎖ 내지 250㎖, 500㎖, 및 1000㎖으로 증가시켰다. 배양을 증가시키는 각 단계에서 개시 세포 밀도를 1 x 105 세포/㎖로 조정하였다.
세포를 위한 우태아 혈청 및 담체의 부재하에서 MDCK 세포를 배양하였을 때, 세포수의 증가는 관찰되지 않았고 3일째 살아있는 세포의 수가 급속도로 감소하였으며 6일째 모든 세포가 사멸하였으며, 상기 결과를 도 1에 나타낸다. 반대로, B-702는 증가된 부피의 스피너 플라스크로 배양를 증가시킨 후 세포수는 현저히 증가되었다.
실시예 2
B-702를 사용하여 바이러스를 증식시켰다. 본 시험에서 사용된 바이러스들은 1998년 겨울부터 1999년 봄까지 사용된, 표 1에 나타낸 바와 같은 M.O.I.를 갖는 3종의 상이한 인플루엔자 백신 균주였다.
표 1
균주 M.O.I
A/Beijing/262/95[H1N1] A/Wuhan/359/95[H3N2] B/Mie/1/93 0.001 0.00003 0.0002

배양 조건은 하기와 같다:
세포 밀도 : 1 x 105 세포/㎖
배양 규모: 100 ㎖ 스피터 플라스크
배양 배지 : 1% 트립신으로 보충된 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 동일(Gibco, Catalogue No. 25200-072)
스피너의 회전수 : 40rpm
배양 온도 등: 34℃, 5% CO2, 습윤하
배양 기간 : 3일
인플루엔자 바이러스의 배양에서 37℃보다 34℃에서 바이러스 증식이 더 잘된다는 것이 통상 공지되어 있고, 현재 백신 제조를 위해 사용되고 있는 배양 온도 또한 34℃이다. 따라서, 본 시험에서 바이러스 배양은 34℃에서 수행하였다. 또한, 확립세포주를 사용하는 인플루엔자 바이러스의 배양에서 헤마글루타민(HA)을 분해하는 프로테아제가 바이러스 감염에 필요하다고 공지되어 있다(미국 특허 제 4,500, 513 호). 따라서, 프로테아제로서 트립신이 배양 배지에 포함되었다. 인플루엔자 바이러스의 역가 측정을 위해 사용된 바와 같은 플라크 계수법에 따라 바이러스 역가를 측정하였다(Practice compendium in microbiology, 2nd ed., The university of Tokyo, The Institute of Medical Science, alumni associationed., Maruzen K.K., p. 205-206). 특히, 통상 사용되는 MDCK 세포(ATCC-CCL-34)를 6 웰 배양 플레이트상에서 배양하고, 상기 바이러스 배양 상층액의 1 x 106 희석액을 접종하였다. 접종후, 아가로스를 세포의 단층상에 중층(overlay)시키고 4일동안 CO2 인큐베이터내에서 정치 배양을 수행하였다. 배양 종료후, 포르말린을 가하여 세포를 고정시켰다. 아가로스층을 제거한 후, 세포를 트립판 블루로 염색하고 바이러스에 의해 형성된 플라크의 수를 계수하였다.
3일간의 배양 후, 모든 세포가 사멸하였다. 배양 상층액을 회수하고 바이러스 역가를 측정하였다. 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 바이러스를 발육중의 계란에서 번식시킨 경우 요막액중의 것과 동일하게 모든 3종의 백신 바이러스 균주는 1x108 초과의 바이러스 역가를 보였다.
표 2
바이러스 바이러스 역가(PFU/㎖)
A/Beijing/262/95[H1N1] 6.3x108
A/Wuhan/359/95[H3N2] 2.5x108
B/Mie/1/93 1.2x108

실시예 3
MDCK 세포는 본래 다양한 바이러스의 증식이 가능한 세포이다. B-702 세포주가 상기 감수성을 유지하는지 확인하기 위하여, DNA 바이러스로서 인간 허피스 바이러스 I형(HSV-1) 및 2형(HSV-2)를 사용하여 B-702를 접종하였다. 배양 조건은 트립신이 배양 배지에 포함되지 않는다는 점을 제외하고 실시예 2에 기재된 바와 같다. 배양을 5일간 계속하였다. 표 3에 기술된 바와 같이 접종을 수행하였다.
표 3
접종 바이러스 접종량
HSV-1 KOS 균주 0.01㎖
HSV-2 KOS 균주 0.01㎖

5일째 모든 세포가 사멸하였다. 배양 상층액을 회수하고 아프리카 그린 원숭이의 간으로부터 유래된 Vero 세포에 배양 상층액을 1000배로 희석시키고 형성된 플라크를 계수하여 바이러스 역가(PFU/㎖)를 측정하였다. 상기 결과를 통해 표 4에 나타낸 바와 같이 B-702가 DNA 바이러스를 증식시키는데 우수한 능력을 갖고 있다고 판명되었다.
표 4
접종 바이러스 접종역가(PFU/㎖)
HSV-1 1.2x106
HSV-2 1.3x106

실시예 4
MDCK 세포가 인플루엔자 바이러스이외의 다른 RNA 바이러스를 증식시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스 및 풍진 바이러스에 대하여 접종을 수행하였다. 배양 조건은 실시예 3에 기술된 바와 같고 배양을 5일동안 계속하였다. 표 5에 기술된 바와 같이 접종을 수행하였다.
표 5
접종 바이러스 접종량
홍역 바이러스 Ichinose 균주(105TCID50/0.1㎖) 0.01㎖
이하선염 바이러스 Enders 균주(104TCID50/0.1㎖) 0.01㎖
풍진 바이러스 M33 균주(107TCID50/0.1㎖) 0.01㎖

5일째, 모든 세포는 사멸하였다. 배양 상층액을 회수하고 바이러스 역가를 측정하였다. 바이러스 역가 측정을 위해, 1,000배, 10,000배 및 100,000배 희석된 각각의 배양 상층액을 24 웰 플레이트상의 배양된 Vero 세포의 6 웰에 각각 접종한 후, CO2 인큐베이터내에서 방치하였다. 2주동안 정치 배양한 후, 바이러스에 의해 세포가 퇴화된 웰, 즉 세포내 CPE로 출현되는 웰을 각 희석액에서 계수하고 50% 감염 역가(TCID50/0.1㎖)를 Kaerver's 산정 방법에 의해 산출하였다(Practice compendium in microbiology, 2nd ed., The university of Tokyo, The Institute of Medical Science, alumni associationed., Maruzen K.K., p. 205-206). 상기 결과를 통해 표 6에 나타낸 바와 같이 B-702가 RNA 바이러스을 증식시키는 우수한 능력을 갖는다고 판명되었다.
표 6
접종 바이러스 접종량
홍역 바이러스 104.5
이하선염 바이러스 106.8
풍진 바이러스 M33 106.6

Claims (16)

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  7. a) MDCK 세포를 무혈청 배양 배지에 순화시켜 무혈청 배양에서 증식할 수 있는 세포를 제조하고;
    b) 무혈청 배양에서 증식할 수 있는 세포를 담체를 사용하는 부유 배양에 적용시켜 담체를 사용하는 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포를 제조하고;
    c) 담체를 사용하는 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포를 담체가 없는 부유 배양에 적용시켜 담체를 필요로 하지 않고 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포를 제조하는 단계를 포함하는, MDCK 세포로부터 유래되고 무혈청 배양 및 담체를 필요로 하지 않고 부유 배양에서 증식할 수 있는 세포주를 제조하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 무혈청 배양을 위해 사용되는 무혈청 배양 배지가 동물종으로부터의 성분들을 포함하지 않는 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, MDCK 세포로부터 유래된 세포주가 B-702인 방법.
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