KR101707569B1 - 인플루엔자 백신 - Google Patents

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감마 백신즈 피티와이 리미티드
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Abstract

본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 백신{INFLUENZA VACCINES}
본 발명은 인플루엔자 바이러스에 의한 감염을 예방하고 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 인플루엔자 바이러스에 대한 교차반응 면역성을 유도하는 백신 조성물과 방법에 관한 것이다.
인플루엔자는 호흡기관의 인플루엔자 바이러스 감염으로 인해 유발되는 전염성이 높은 질병이다. 인플루엔자는 특히 유아와 노인들에게 생명을 위협할 수 있는 합병증을 유발할 수 있다.
동종의 바이러스에 의한 재감염의 방어는 우선적으로 중성화 항체에 의해 매개되지만, 인플루엔자 바이러스 감염으로부터의 회복은 세포독성 CD8+ T (Tc) 세포 반응을 필요로 한다. 현재 인플루엔자 바이러스의 백신은 대개 전(whole) 바이러스 또는 서브유닛제를 불활성화하며, 바이러스의 감염성을 화학적 처리에 의해 불활성화한다. 이러한 백신은 거의 대부분 빈번한 항원 변이(예를 들면, HA 및 NA)를 일으킬 수 있는 바이러스 표면 당단백질을 표적으로 하는 중성화 항체를 유도하여 작용한다. 바이러스 표면 당단백질에 의해 나타나는 빈번한 항원 변이는 이들에 대한 백신이 광범위한 교차반응 면역반응을 유도하지 못하며, 따라서 다수의 인플루엔자 바이러스 바이러스 서브타입과 균주를 방어할 수 없다는 의미이다. 그러므로, 항체를 포함하는 백신의 방제가는 인플루엔자 바이러스의 빈번한 항원 드리프트 및/또는 시프트로 인한 새로운 서브타입/균주에 대해 방어적 면역성을 거의 제공하지 않거나 제공하지 않는다는 점에서 제한된다. 또한, 이러한 백신에 의해 바이러스 표면 당단백질에 부과되는 선택적 압력은 백신을 비효율적이 되게 하는 항원 변이를 강화시키는 작용을 한다.
오늘날 인플루엔자 백신의 제형화는 현재 유행하고 있는 사람 인플루엔자 균주를 공지의 단리물과 비교하여 제조된 "경험상 추측"에 기초하고 있다. 그러나 해당 플루 시즌에 감염을 일으킬 수 있는 인플루엔자 균주(들)의 추정은 바이러스 돌연변이로 인해 발생하는 예상되는 항원 가변성을 수용할 수 없다. 또한, 진행중인 바이러스 돌연변이 및 관련 항원 변이는 백신의 효능을 감소시키지만, 부정확한 예측은 백신을 무력화한다. 2007년에서 2008년 동안의 북반구 플루 백신 제제(A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1)-유사 바이러스; A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)-유사 바이러스; 및 B/Malaysia/2506/2004-유사 바이러스)는 이러한 시나리오를 보여주고 있다. 미국의 질병통제예방센터에 따르면, 타입 A H3N2 Brisbane 균주와 타입 B Florida 균주는 그 플루 시즌의 병 대부분에 반응하였으나, 이들 균주는 백신에 결합되지 않아서 결과적으로 효과가 없었다.
인플루엔자의 심각성을 개선하는데 있어서 T 세포-매개 면역성을 유발하는 백신 접종의 유익한 영향은 대개 무시되고 있다. T 세포 반응은 인플루엔자로 인한 초기 감염으로부터 성공적으로 회복하는데 있어서 중요하며 감염 후에 조기에 바이러스를 저하시켜서 질병의 심각성을 줄일 수 있다. T 세포 면역성은 또한 지속적이며, T 세포 반응의 유도와 연관된 항원 결정인자는 통상 바이러스에 의해 면역 회피되지 않는 보존 단백질(예를 들면, 바이러스 핵단백질 및 매트릭스 단백질 등)에서 일반적으로 유도된다. 따라서, T 세포 매개 면역성을 유도할 수 있는 백신이 요구되며, 이러한 요구는 현재 시판되고 있는 불활성화된 인플루엔자 백신제에 의해 만족될 수 없다.
또한, 현재 시판되고 있는 인플루엔자 백신의 제조에 사용되는 방법에는 바이러스 항원의 온전성을 위태롭게 하는 조악한 처리가 포함되어 있다. 예를 들면, 원심분리방법은 통상적으로 감쇠 전에 바이러스를 정제하는데 사용되지만 바이러스 항원에 위해 작용을 가질 수 있다. 또한 화학적으로 불활성화된 인플루엔자 백신 제제는 동결되지 않은 바이러스 사용을 필요로 하여 물리적 시약과 화학적 시약이 항원 단백질을 손상시킨다. 그러므로, 동결 바이러스 제제에 효과적인 바이러스 불활성 방법은 면역원성을 증강하는 항원 분해를 제한하는 이점을 제공한다.
T 림프구 반응을 유발할 수 있는 인플루엔자 백신 또한 필요하다. 특히 항원 시프트 및/또는 드리프트로 빈번하게 발생하는 표면 항원 가변성과 상관없이 인플루엔자 바이러스에 대한 교차보호 면역성을 유발할 수 있는 인플루엔자 백신이 필요하다.
제1 양태에서, 본 발명은 대상의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
제2 양태에서, 본 발명은 대상의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 상기 대상에게 비강내로 투여하는 것을 포함한다.
제1 또는 제2 양태의 일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 A 서브타입 H5N1 감염이다.
제1 또는 제2 양태의 일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 A 서브타입 HPAI A(H5N1) 감염이다.
제1 또는 제2 양태의 일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 A 서브타입 HlNl 09 돼지 플루 감염이다.
제3 양태에서, 본 발명은 대상에서 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 교차반응 면역성을 유발하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 투여하는 것을 포함한다.
제4 양태에서, 본 발명은 대상에서 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 교차반응 면역성을 유발하거나 증강하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 비강내로 투여하는 것을 포함한다.
제3 또는 제4 양태의 일 구현예에서, 교차반응 면역성은 교차반응 세포 면역성을 포함한다. 상기 교차반응 세포 면역성을 다음 중 하나 또는 모두를 포함할 수 있다:
(i) 교차반응 헬퍼 T 세포 반응
(ii) 교차반응 세포독성 T 세포 반응.
제3 또는 제4 양태의 일 구현예에서, 교차반응 면역성은 교차반응 체액 면역성을 포함할 수 있다.
제3 또는 제4 양태의 일 구현예에서, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입은 사람, 조류, 돼지, 개 또는 말의 인플루엔자 바이러스 서브타입 중 하나 이상을 포함한다. 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5N1을 포함할 수 있다.
제3 또는 제4 양태의 일 구현예에서, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 A 서브타입 HPAI A(H5N1)을 포함한다.
제3 또는 제4 양태의 일 구현예에서, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 A 서브타입 HlNl 09 돼지 플루를 포함한다.
제5 양태에서, 본 발명은 대상에서 인플루엔자 바이러스에 대해 T 세포 면역 반응을 유발하거나 강화하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 투여하는 것을 포함한다. 인플루엔자 서브타입 H5N1에 대해 T 세포 면역 반응을 유발하거나 증강할 수 있다. T 세포 면역 반응은 다음 중 하나 또는 모두를 포함할 수 있다:
(i) 헬퍼 T 세포 면역 반응
(ii) 세포독성 T 세포 면역 반응.
제5 양태의 일 구현예에서, T 세포 면역 반응은 인플루엔자 A 서브타입 HPAI A(H5N1)에 대해 유발되거나 증강된다.
제5 양태의 일 구현예에서, T 세포 면역 반응은 인플루엔자 A 서브타입 HlNl 09 돼지 플루에 대해 유발되거나 증강된다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 일 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스이다. 상기 인플루엔자 A 바이러스는 A/WSN [HlNl], A/PR8 [HlNl], A/JAP [H2N2] 및 A/PC [H3/N2]로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 일 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 동물원성(zoonotic) 인플루엔자 바이러스이다. 상기 동물원성 인플루엔자 바이러스는 동물원성 인플루엔자 A 바이러스이다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 일 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 동결건조된 형태로 제조된다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 일 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 접선방향/교차류(tangential/cross-flow) 여과에 의해 정제된 바이러스 스톡으로부터 제조된다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 일 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 냉동된 바이러스 조제물을 감마선 조사하여 생성된다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 일 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 상기 바이러스를 총 조사량 약 6.5 X lO4 rad 내지 약 2 X 107 rad의 감마선에 노출하여 생성된다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 다른 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 상기 바이러스를 총 조사량 약 1 X 106 rad의 감마선에 노출하여 생성된다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 추가 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 다수의 별개 용량으로 투여된다. 다수의 별개 용량 중 하나 이상은 재접종을 목적으로 부스터로 투여될 수 있다.
제1, 제2, 제3, 제4 또는 제5 양태의 또다른 구현예에서, 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 첨가제와 함께 투여된다.
제6 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 백신의 제조방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 인플루엔자 바이러스 조제물을 감마선 조사에 의해 불활성화하는 것을 포함한다.
제6 양태의 일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 조제물은 상기한 감마선 조사에 의한 불활성화 이전에 접선방향/교차류 여과에 의해 정제된다.
제6 양태의 일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 조제물은 동결되는 동안 감마선 조사된다.
제6 양태의 일 구현예에서, 상기 방법은 감마선 조사에 의한 불활성화 후에 바이러스를 동결건조하는 추가 단계를 포함한다.
제6 양태의 일 구현예에서, 백신은 비강내 투여용으로 제형화된다.
제6 양태의 일 구현예에서, 인플루엔자 백신은 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 교차반응 면역성을 유발한다.
제6 양태의 일 구현예에서, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 A 서브타입 HPAI A(H5N1)를 포함한다.
제6 양태의 일 구현예에서, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 A 서브타입 HlNl 09 돼지 플루를 포함한다.
제6 양태의 일 구현예에서, 불활성화는 바이러스를 총 조사량 약 6.5 X lO4 rad 내지 약 2 X 107 rad의 감마선에 노출하는 것을 포함한다.
제6 양태의 일 구현예에서, 불활성화는 바이러스를 총 조사량 약 1 X 106 rad의 감마선에 노출하는 것을 포함한다.
제6 양태의 다른 구현예에서, 인플루엔자 백신은 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 교차반응 면역성을 유발한다. 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5N1을 포함할 수 있다.
제6 양태의 또다른 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 조제물은 인플루엔자 A 바이러스를 포함한다.
제7 양태에서 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 용도를 제공한다.
제7 양태의 일 구현예에서, 상기 약제는 비강내 투여용으로 제형화된다.
제7 양태의 다른 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 또는 예방은 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5N1 감염이다.
제7 양태의 다른 구현예에서, 약제는 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 교차반응 면역성을 유발한다. 상기 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 A 서브타입 HPAI A (H5N1)를 포함한다. 상기 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 바이러스 서브타입 HlNl 09 돼지 플루를 포함한다.
제7 양태의 일 구현예에서, 약제는 백신이다. 상기 백신은 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 교차반응 면역성을 유발할 수 있다.
제7 양태의 일 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스이다.
제8 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
제9 양태에서, 본 발명은 제6 양태의 방법에 따라 제조된 백신을 제공한다.
정 의
본원에서 사용된, 단수로 표시되는 용어는 다른 명백한 언급이 없는 한, 복수를 포함한다. 예를 들면, "식물 세포"라는 용어는 수많은 식물들의 세포들을 포함한다.
여기에서 사용된, "포함하는"이란 용어는 "함유하는"과 같은 의미로 사용될 수 있다. "포함하다"와 같은 "포함하는"이란 단어의 변형은 다양한 의미를 상응하여 가질 수 있다. 따라서, 예를 들면 단백질을 코딩하는 서열을 "포함하는" 폴리뉴클레오티드는 당해 서열만으로 구성되거나 또는 하나 이상의 추가 서열을 가질 수 있다.
"교차반응 면역성" 및 "교차보호 면역성"은 여기에서 상호 교환적으로 사용되며 동일한 의미를 가진다.
여기에서 사용된, "항체" 및 "항체들"이라는 용어는 IgG (IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4 등), IgA (IgAl, IgA2 등), IgD, IgE, 또는 IgM, 및 IgY, 단일 사슬 전항체를 포함하는 전체 항체, 및 이들의 항원 결합 절편을 포함한다. 항원 결합 항체 절편으로는, 제한적인 것은 아니나 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단일 사슬 Fvs (scFv), 단일 사슬 항체, 디설파이드-5 연결 Fvs (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인 중 하나를 포함하는 절편 등이 있다. 상기 항체들은 동물에서 기원할 수 있다. 단일 사슬 항체를 포함하는 항원 결합 항체 절편은 가변영역만을 포함하거나 또는, 힌지영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인 모두 또는 일부와 함께 포함할 수 있다. 또한, 가변영역과 힌지영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 조합물을 포함할 수 있다. 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메릭, 다중 특이성, 인간화된 그리고 생물 분자와 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날과 폴리클로날 항체일 수 있다.
여기에서 선행기술 문헌의 설명, 또는 이들 문헌에서 파생 또는 기초한 내용은 상기 문헌 또는 파생된 내용이 오스트레일리아 또는 기타 지역에서의 관련 기술의 통상적인 일반 지식의 일부임을 인정하지 않는다.
설명을 목적으로, 여기에서 언급된 모든 문헌은 다른 언급이 없는 한, 참조를 위해 포함되었다.
상세한 설명
최근 입수가능한 인플루엔자 백신은 대부분 체액 반응(B 세포에서 유도되는 항체 반응)을 유발한다. 이러한 반응은 우선적으로 바이러스 표면 당단백질 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)에 대해 특이적이며, 돌연변이로 인한 항원 변이가 빈번하다. 따라서, 빈번한 항원 드리프트 및/또는 시프트로 인한 새로운 인플루엔자 서브타입/균주에 대해 보호되지 않거나 거의 보호되지 않는 것은 시중 인플루엔자 백신의 명백한 단점이다.
반면, 인플루엔자 바이러스에 대한 T 세포 반응은 주로 내부 바이러스 단백질에 대해 특이적이다. 이러한 단백질은 모든 인플루엔자 바이러스 서브타입 중에서 잘 보존되며 돌연변이에 대한 감수성이 거의 없다. 그러므로, T 세포 반응을 유도하는 백신은 새롭게 발생하는 인플루엔자 서브타입/균주에 교차보호 면역성을 제공하기가 보다 더 용이하다. T 세포 반응은 또한 오래 지속되며 인플루엔자 감염에서 효과적인 회복에 중요하다. 따라서, T 세포 면역 유발능은 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신의 매우 바람직한 특성이다. 그럼에도 불구하고, 현재 시판되고 있는 인플루엔자 백신은 T 세포 면역을 유발할 수 없으며, 따라서 실질적으로 이들의 효능에는 제한이 있다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스의 보존된 단백질에 대해 특이적인 T 세포 면역성을 유발할 수 있는 인플루엔자 백신을 제공하여 상기한 단점을 극복하는 방법을 제공한다. 본 발명의 감마선 조사된(γ-조사된) 인플루엔자 백신은 또한 상이한 인플루엔자 바이러스 서브타입과 균주에 대하여 교차반응/교차보호 면역성을 유발하는 것으로 입증되었다.
특별한 메카니즘에 의해 제한되는 것은 아니나, 인플루엔자 바이러스 표면 단백질의 항원 구조와 생물학적 온전성에 대한 γ선 조사의 감소된 영향이 이들의 작용 도메인을 온전한 상태로 유지하여 숙주 면역 세포에 의한 바이러스 입자의 효율적인 흡수와 언코팅을 가능하게 하는 것으로 생각된다. 그리하여 이것이 항원의 세포질에 충분한 바이러스 항원(매트릭스 및 뉴클리오단백질)을 제공하여 세포가 T 세포 면역성의 효과적인 유도를 나타낼 수 있다. 또한, 불완전한 리보솜 생성물(예를 들면 조기 터미네이트된 및/또는 잘못 폴딩된)은 MHC 클래스 I 항원 제공을 위한 바이러스 항원의 주공급원이라고 간주되므로 절편된 게놈 인플루엔자 바이러스 RNA의 불현성(abortive) 복제/번역이 발생하여 바이러스 특이적 T 세포 면역성의 프라이밍이 가능하게 된다. 바이러스 입자의 항원 구조에 대한 감마선 조사의 감소된 영향은 현재 사용되는 백신 제제에 의해 유발되는 체액성 면역과 비교하여 백신 수용체에서의 체액성 면역의 강도 및/또는 질을 개선할 것으로 생각된다.
단백질의 가교와 상호작용하고 이를 유도하는 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신의 제조에서 현재 사용되고 있는 화학 처리(예를 들면, 포르말린 또는 β-프로피오락톤)와는 대조적으로, 감마선 조사는 유전 물질 내에서 가닥(strand) 분해를 생성하여 바이러스 감염성을 불활성화하는 것으로 보인다. 감마선 조사는 화학 물질에 비하여 생물학적 물질 내를 관통하는 높은 침투성을 이점으로 가진다. 또한, 감마선 조사는 인플루엔자 바이러스의 동결 제제를 불활성화하는데 사용할 수 있어서 백신을 제조하는 동안 바이러스 항원의 보존을 도울 수 있다.
조성 및 백신
본 발명은 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물과 백신을 제공한다. 상기 조성물과 백신은 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 서브타입 또는 균주를 포함할 수 있다. 또한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 2개 이상의 균주의 혼합물을 포함할 수 있다. 혼합물에서 사용되는 균주는 동일하거나 상이한 인플루엔자 바이러스 서브타입으로부터 유도된다.
본 발명의 조성물과 백신은 단일한 γ선 조사된 인플루엔자 균주 또는 상이한 γ선 조사된 인플루엔자 균주들의 혼합물을 포함할 수 있다. 인플루엔자 균주(들)는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae)과의 속으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 균주는 인플루엔자바이러스 A (타입 A)속, 인플루엔자바이러스 B (타입 B)속, 또는 인플루엔자바이러스 C (타입 C)속의 서브타입으로부터 유도될 수 있다.
인플루엔자바이러스 A의 바람직한 서브타입으로는, 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 HlNl (예를 들면, HlNl 09 돼지 플루), H1N2, H1N7, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H4N8, H5N1 (e.g. HPAI A(H5N1)), H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H6N5, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6, H14N5, 및 인플루엔자 A 바이러스 간의 재조합(re-assortment)에서 발생한 기타 서브타입이 있다.
여기에서 고려된 "HlNl 09 돼지 플루 바이러스"는 세계보건기구(WHO)에 의해 "범유행 인플루엔자 A (HlNl)"로 지칭되기도 하였다.
임의의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및/또는 백신은 감마선 조사된 인수공통(zoonotic) 인플루엔자 바이러스 균주(들)를 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스는 당 분야에서 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스는, Coico 등의 문헌, (Eds) "Current Protocols in Microbiology", (2007), John Wiley and Sons, Inc. (특히 Unit 15G.1 entitled "Influenza : Propagation , Quantification, and Storage" 참조) 등에 기술된 바와 같이 수정란에서의 연속 패시징(passaging)에 의해 유도될 수 있다. 이 기술의 간단한 요약을 하기하였다:
수정된 지 9 내지 12일의 수정란을 얻어서 기낭을 찾았다. 상기 수정란을 무균 조건 하에서 구멍을 내고 씨드(seed) 바이러스를 공기층 내에 주사기로 접종하였다. 이 공정은 수동으로 또는 기계에 의해 자동적으로 수행할 수 있다. 접종된 수정란은 습기 분위기에서 약 2 내지 3일 동안 항온처리할 수 있다. 이 기간의 말단에서 배아를 종료하고 요막액의 정화를 위해서 필요하다면, 수정란의 온도를 약 4 ℃로 유지할 수 있다. 이 후, 수정란의 상부를 제거하고 막을 뚫어서 요막액을 수집하였다. 이 과정 또한 수동으로 또는 자동 기계장치로 수행될 수 있다. 요막액은, 예를 들면 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하거나 및/또는 감마선 조사에 의한 인플루엔자 바이러스의 불활성화 전에 추가 정제하여 정화할 수 있다. 요막액은, 예를 들면 치킨 적혈구(CRBC)에 대한 온도 의존성 흡착, 슈크로스 그래디언트 또는 투석에 의해 정제할 수 있다.
인플루엔자 바이러스를 제조하는데 적합한 상기한 방법의 변형은, 예를 들면 미국 특허 제7270990호, PCT 국제공개 제WO02/067983호 및 PCT 국제공개 제WO 2005/113756호에 기술되어 있다.
추가적으로 또는 선택적으로, 본 발명의 조성물 및 백신에 사용가능한 인플루엔자 바이러스는 세포 배양물에서 생성할 수 있다(예를 들면, Furminger, "Vaccine Production", in Nicholson et al. (eds.), Textbook of Influenza, Chapter 24, pp. 324-332 and Merten et al., 1996, "Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation", in Cohen & Shafferman (eds.), Novel Strategies in Design and Production of Vaccines, pp. 141 151, 미국 특허 제5824536호 및 미국 특허 제6344354호 참조).
인플루엔자 바이러스의 성장을 위한 기질로서 사용될 수 있는 적합한 세포주의 비제한적 예로는 베로(vero) 세포, Madin Darby 개 신장 (MDCK) 세포, PERC6 세포(예를 들면, 미국 특허 제7192759호 참조), 치킨 배아세포(예를 들면 치킨 배아 섬유아세포) 및 조류 배아 세포주(예를 들면, PCT 국제공개 제WO 2006/108846호 참조) 등이 있다. 상기한 세포들의 변이체를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 미국 특허 제6825036호, 미국 특허 제6455298호 및 PCT 국제공개 제WO 2006/108846호에 기술되어 있다.
세포주를 사용한 인플루엔자 바이러스의 증식은 일반적으로 화학적으로 규정된 배지에서 세포를 원하는 양으로 팽창시키는 것을 포함한다. 배지는 혈청이 없는 배지가 바람직하다. 바이러스의 증식은 배지에 프로테아제를 첨가하여 도울 수 있다. 일반적으로, 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키고 원하는 수의 바이러스를 생성하는데 충분한 시간(예를 들면 여러 일) 동안 항온처리한다. 감염의 다중도, 항온처리 시간 및 온도 등의 매개변수는 일반적으로 사용되는 특이적 세포주 및/또는 증식하는 특이적 인플루엔자 균주에 대해 최적화하는 것이 필요하다. 위에서 언급한 것들을 포함하는 성장 매개변수들의 최적화는 당업자라면 과도한 실험 없이도 용이하게 결정할 수 있다. 항온처리한 후에 바이러스를 수확하여 필요하다면 정제한다.
세포 배양액에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는데 적합한 방법의 비제한적인 예는 미국 특허 제5698433호, 미국 특허 제5753489호, 미국 특허 제6146873호, 미국 특허 제6455298호 및 미국 특허 제6951752호에 기술되어 있다.
세포 배양액에서 인플루엔자 바이러스 생산 수율은, 예를 들면 단백질 키나제 PKR 또는 (2'-5') 올리고아데닐레이트 (2-5A) 신테타제 유전자를 코딩하는 세포 유전자(예를 들면, 미국 특허 제6673591호 및 미국 특허 제6686190호 참조)를 변성하거나, 또는 선택적 비구조(nonstructural) 단백질 1(NSl) 유전자를 가지는 바이러스 골격(예를 들면, PCT 국제공개 제2005/024039호 참조)을 변성하여 증강될 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 인플루엔자 바이러스 증식에 사용되는 세포주는 시알릴트랜스퍼라제(예를 들면, 미국 특허 제7132271호 참조)를 과발현시킬 수 있다.
상기한 방법(또는 다른 어떤 방법)을 사용하여 증식된 인플루엔자 바이러스를 감마선 조사 전에 정제하거나 및/또는 농축할 수 있다. 이러한 목적을 위해 당분야에서 알려진 적합한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스는 치킨 적혈구에 대한 온도 의존성 흡착에 의해 문헌, Laver (1969) "Purification of influenza virus", HKaS NP, (ed) New York and London: Academic Press, pp. 82-86에 기술된 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 임의로 인플루엔자 바이러스는 밀도 그래디언트 원심분리에 의해 정제할 수 있다(예를 들면, Sokolov et al, (1971), "Purification and concentration of influenza virus", Archiv fiir die gesarate Virusforschung, 35, 356-363 참조)
바람직하게, 인플루엔자 바이러스는 감마선 조사 전에 접선방향/교차유동 여과를 사용하여 정제하거나 및/또는 농축된다. 예를 들면, 바이러스를 함유하는 유동액을 적절한 기공 크기(예를 들면 약 80 nm 미만)를 가지는 막 등의 여과 장치에 적용할 수 있다. 유동액을 막의 표면을 따라 접선으로(즉, 표면을 가로질러) 펌프하고 막을 통과하는 유동액 일부를 여액쪽으로 압력을 적용한다. 상기 압력은 일반적으로 비리온 구조 및/또는 바이러스 항원의 온전성에 부작용을 주지 않는 정도로 적용된다. 바이러스 입자를 함유하는 여액은 막을 통과하고, 반면 막의 기공을 통과하기에는 너무 거대한 유동액 중의 미립자와 마크로분자들은 반대쪽에 남는다. 일반적으로, 잔류물(즉, 보유 성분)은 막의 표면에 구성되지 않으며, 대신 수평적 흐름을 따라 흐른다. 잔류물을 적절한 매질(덱스트란 및/또는 슈크로스를 함유하는 PBS 등)로 다시 희석되고, 필요하다면 여과과정을 반복한다.
감마선 조사에 사용되는 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위하여 접선방향/교차유동 여과를 사용하는 것은 바이러스 항원의 온전성이 잘 보존되기 때문에 인플루엔자 백신 제제에 현재 사용되는 정제기술(예를 들면, 초원심분리) 보다 이점이 있다. 이는 감마선 조사된 바이러스 제제의 면역원성을 증강하고, 특히 다중 인플루엔자 서브타입과 균주에 대해 교차반응/교차보호 면역을 유도하는 이들의 능력을 증강한다.
본 발명의 조성물과 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스는 감마선 조사된다. 감마선 조사에 적합한 어떠한 광원도 사용할 수 있다. 편리한 감마 에미터(emitter)는, 제한적인 것은 아니나 Ba137, Co60, Cs137, Ir192, U235, Se75 및 Yb169를 포함한다.
인플루엔자 바이러스에 대한 감마선 조사는 시중에서 구입가능한 장비를 사용하여 수행할 수 있는데, 예를 들면 캐나다, Atomic Energy of Canada Ltd.의 감마셀 조사장치(Gammacell irradiator)(예를 들면, Gammacell 40 Irradiator, Gammacell 220 Irradiator, Gammacell 1000 irradiator, Gammacell 3000 irradiator), J. L. Shepherd and Associates (San Fernando, California, USA)의 감마선 조사기, 또는 Nordion Inc. (Kanata, Ontario, Canada)의 Nordion Gamma CeIl-1000 조사기 등이다. 다른 적합한 장비는, 예를 들면 미국 특허 제3557370호와 미국 특허 제3567938호에 기술되어 있다.
바람직하게, 인플루엔자 바이러스는 이를 불활성화는데 충분한 감마선 조사량에 노출된다. 더욱 바람직하게는, 감마선은 바이러스 항원 구조의 실질적인 분해 없이, 특히 바이러스 표면 항원의 구조를 실질적으로 분해하지 않고 바이러스를 불활성화하는데 충분한 양으로 조사된다. 따라서, 항원 결정인자(들)의 면역원성은 감마선 조사된 바이러스에 의해 보유된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스는 그의 항원구조를 유지하면서 바이러스를 불활성화할 수 있는 감마선 조사량으로 처리된다. 바람직하게, 감마선 조사량은 처리 하의 모든 바이러스가 바이러스 항원 결정인자의 구조 온전성에 불리하게 영향을 받지 않고 노출되는 충분한 시간과 농도로 바이러스에 조사된다.
예를 들면, 인플루엔자 바이러스를 약 1 X lO3 rad 내지 약 2 X 109 rad (또는 약 10 Gy 내지 약 2x104 kGy) 범위의 감마선 총 조사량에 노출할 수 있다. 본 발명의 임의의 구현예에서, 인플루엔자 바이러스는, 약 1 X 103 rad 내지 약 2 X 109 rad, 약 1 X 103 rad 내지 약 1 X lO9 rad, 약 1 X lO3 rad 내지 약 1 X 108 rad, 약 1 X lO3 rad 내지 약 1 X 107 rad, 약 1 X 103 rad 내지 약 1 X 106 rad, 약 1 X lO3 rad 내지 약 1 X 105 rad, 약 1 X lO3 rad 내지 약 1 X lO4 rad, 약 1 X 103 rad 내지 약 2 X 109 rad, 약 1 X 104 rad 내지 약 2 X 109 rad, 약 1 X lO5 rad 내지 약 2 X 109 rad, 약 1 X lO6 rad 내지 약 2 X 109 rad, 약 1 X lO7 rad 내지 약 2 X 109 rad, 약 1 X lO8 rad 내지 약 2 X 109 rad 또는 약 1 X lO9 rad 내지 약 2 X 109 rad 범위의 감마선 총 조사량에 노출된다. 본 발명의 일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스는 약 6.5 X 104 rad 내지 약 2 X 107 rad (약 0.65 kGy 내지 약 200 kGy) 범위의 감마선 총 조사량에 노출된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스는 약 1.26 X 106 rad (12.6 KGy)의 감마선 총 조사량, 약 1 X lO6 rad (약 10 kGy)의 감마선 총 조사량, 또는 약 1 X 105rad (l KGy)의 감마선 총 조사량에 노출된다.
최적의 감마선 조사량은 바이러스가 존재하는 매질, 바이러스 처리량, 바이러스 존재 온도 및/또는 처리되는 바이러스의 서브타입 또는 균주 등의 인자에 의해 영향받을 수 있다. 따라서, 감마선 총 조사량, 노출되는 동안 적용되는 감마선 조사 시간 및/또는 농도를 최적화하여 처리 효율을 증강시킬 수 있다.
감마선 총 조사량을 해당 기간 동안 점증적으로 바이러스에 조사할 수 있다. 예를 들면, 감마선을 총 투여량의 수준 보다 낮은 수준에서 필요한 감마선 총 조사량을 얻는데 충분한 시간 동안 바이러스에게 조사할 수 있다.
일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 제제는 감마선 조사에 노출되면서 동결 상태로 유지될 수 있다. 이렇게 하므로써 생물학적 온전성의 보존을 촉진하고 바이러스 항원의 불필요한 손상을 방지하여 감마선 조사된 바이러스 제제의 면역원성, 특히 다중 인플루엔자 서브타입 및 균주에 대한 교차반응/교차보호 면역을 유도하는 이들의 능력을 강화할 수 있다. 일반적으로 10 내지 2O kGy의 감마선 조사량이 바이러스 동결 제제를 취급하는데 효과적이다.
상기한 바와 같이, 감마선 조사 처리는 바이러스 항원 구조를 실질적으로 파괴하지 않고 인플루엔자 바이러스를 충분히 불활성화하는 것이 바람직하다. 바이러스의 불활성화는 당분야에서 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 감염성은 감마선 조사 후에 수정란 및/또는 상기한 세포주를 접종하여 바이러스가 증식할 수 있는지를 결정하여 측정할 수 있다.
항원 결정인자의 온전성은, 예를 들면 감마선 조사 후의 혈집응구 활성에 대해 바이러스를 분석하여 평가될 수 있다. 헤마글루티닌 에세이 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 Coico 등, (Eds) "Current Protocols in Microbiology", (2007), by John Wiley and Sons, Inc. (특히 Unit 15G.1 "Influenza: Propagation, Quantification, and Storage" 참조) 및 Sato 등, (1983), "Separation and purification of the hemagglutinins from Bordetella pertussis ", Infect. Immun., 41, 313-320에 기술되어 있다. 추가로 또는 선택적으로, 뉴라미니다제(neuraminidase) 에세이를 바이러스 항원 결정인자의 온전성을 평가하는데 사용할 수 있다(예를 들면, Khorlin et al, (1970), "Synthetic inhibitors of Vibrio cholerae neuraminidase and neuraminidases of some influenza virus strains", FEBS Lett., 8:17-19 and Van Deusen et al, (1983), "Micro neuraminidase-inhibition assay for classification of influenza A virus neuraminidases" Avian Dis., 27:745-50 참조). 또한, 감마선 조사된 제제에 의해 유도될 수 있는 내부 단백질에 대한 세포독성 T 세포 반응을 단백질에 대한 표지로서 사용할 수 있다.
감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 적합한 조성물과 백신은 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있으며, 따라서 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제를 포함할 수 있다.
담체, 희석제 및 보조제는 조성물의 다른 성분과의 혼화성과 그의 수용체에 위해하지 않다는 점에서 "허용가능"하여야 한다.
보조제(들)는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 본 발명의 조성물 및 백신과 조합될 수 있으나, 여기에 제공된 실험 데이터는 유사한 수준의 면역원성이 보조제 없이도 감마선으로 불활성화된 인플루엔자 제제를 사용하여 얻어질 수 있음을 입증하고 있다. 그러므로, 보조제가 본 발명의 조성물과 백신에 보함될 수 있으나 일반적으로 필요한 것이 아님을 이해하여야 한다. 따라서 보조제를 사용하여 발생하는 안전성 문제를 피할 수 있다.
바람직하기로는, 보조제는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스에 의해 유도 및/또는 증강된 면역반응을 강화하여 보호 효능을 개선한다. 바람직하게, 보조제는 감소된 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 사용하여 보호 면역을 유발할 수 있게 한다.
어떠한 종류의 적합한 보조제도 본 발명의 조성물과 백신에 포함시킬 수 있다. 예를 들면, 알루미늄을 포함하는 보조제를 사용할 수 있다. 알루미늄을 포함하는 적합한 보조제로는, 제한적인 것은 아니나 수산화알루미늄, 인산 알루미늄 및 이들의 조합물이 있다. 사용가능한 알루미늄을 포함하는 보조제의 다른 특정예는 유럽 특허 제1216053호와 미국 특허 제6372223호에 기술되어 있다.
수중유 에멀젼을 본 발명의 조성물과 백신에 보조제로 사용할 수 있다. 수중유 에멀젼은 당분야에 이미 공지되어 있다. 일반적으로 수중유 조성물은 어유(fish oil), 식물성 오일 또는 합성 오일 등의 대사성 오일을 포함한다. 수중유 에멀젼의 적합한 예는 유럽 특허 제0399843호, 미국 특허 제7029678호 및 PCT 국제공개 제WO 2007/006939호에 기술되어 있다. 수중유 에멀전은 다른 보조제 및/또는 면역자극제와 함께 사용될 수 있다.
다른 적합한 보조제의 비제한적 예로는, 면역자극제, 예를 들면 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 모노포스포릴 지질 A (MPL), 콜레라 독소 (CT) 또는 그의 구성 서브유니트, 열 불안정성 엔테로톡신(LT) 또는 그의 구성 서브유니트, 톨-유사 수용체(toll like receptor) 리간드, 예를 들면 리포폴리사카라이드(LPS)와 그의 유도체(예를 들면, 모노포스포릴 리피드 A와 3-데아실레이티드 모노포스포릴 리피드 A 등), 뮤라밀 디펩티드(MDP) 및 Respiratory Syncytial Virus (RSV)의 F 단백질 등이 있다.
약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 예로는, 탈염수 또는 증류수; 식염수; 식물성 오일, 예를 들면 땅콩유, 홍화유, 올리브유, 면화유, 옥수수 기름, 참기름, 아라키스 오일 또는 코코넛 오일; 실리콘 오일, 예를 들면 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리실록산 등의 폴리실록산; 휘발성 실리콘; 미네랄 오일, 예를 들면 액체 파라핀, 연질 파라핀 또는 스쿠알렌; 셀룰로스 유도체, 예를 들면 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 또는 히드록시프로필메틸셀룰로스: 저급 알카놀, 예를 들면 에탄올 또는 이소프로판올; 저급 아르알카놀; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르, 예를 들면 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올리에이트; 폴리비닐피롤리돈; 아가; 카라기난; 트라가칸트 검 또는 아카시아 검 및 페트롤륨 젤리 등이 있다. 전형적으로, 담체 또는 담체들은 조성물 중 10 내지 99.9 중량%를 형성할 수 있다.
본 발명의 조성물과 백신은 표준 경로에 의해 투여될 수 있으며, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 비경구(정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내 등), 경구, 점막 내(예를 들면, 비강내), 또는 국소 경로 등이 있다.
본 발명의 조성물과 백신은 주사에 의한 투여에 적합한 형태, 경구 섭취용으로 적합한 형태(예를 들면, 캡슐, 정제, 당의정, 엘릭서 등), 국소 투여용으로 적합한 연고제, 크림제 또는 로션제 형태, 점안액으로 전달하는데 적합한 형태, 흡입에 의한 투여에 적합한 에어로졸 형태, 예를 들면 비강내 흡입 또는 경구 흡입 등, 또는 비경구 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 형태일 수 있다.
조성물과 백신의 비강내 투여는 점비액, 스프레이, 또는 흡입에 적합한 분말, 크림 또는 에멀젼으로 제형화될 수 있다.
주사가능한 용액 또는 현탁액으로 투여하기 위해서 비독성의 경구적으로 허용가능한 희석제 또는 담체로 링거액, 등장성 식염수, 인산염 완충 식염수, 에탄올 및 1,2-프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다.
경구 용도를 위한 적합한 담체, 희석제, 부형제 및 보조제의 일부 예로는, 땅콩유, 액체 파라핀, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트, 아카시아 검, 트라가칸트 검, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 젤라틴 및 레시틴 등이 있다. 또한 상기한 경구용 제제는 적합한 향미제와 착색제를 포함할 수 있다. 캡슐 형태로 사용되는 경우, 캡슐제는 붕해를 지연하는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트 등의 화합물로 코팅할 수 있다.
보조제는 전형적으로 완화제, 유화제, 증점제, 보존제, 살균제 및 완충제를 포함한다. 다른 종류의 '자가 보조제'는 면역성 펩티드를 수용성 리포펩티드 Pam3Cys 또는 그의 디팔미토일 유도체 Pam2Cys와 같은 지질에 컨쥬게이션하여 제공된다. 이러한 보조제는 면역성 펩티드를 항원 제공 세포(예를 들면, 수지상 세포)에 수반하는 이점을 가지므로 증강된 항원 제공과 세포의 활성화를 동시에 생성한다. 이러한 물질은 적어도 부분적으로 톨-유사 수용체 2에 의해서 작용한다.(참조 Brown LE and Jackson DC, Lipid based self adjuvanting vaccines. Current Drug Delivery, 23:83, 2005).
본 발명의 조성물과 백신은 적합한 보조제와 같은 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다. 적합한 보조제는 시중에서 입수할 수 있으며, 예를 들면 Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); 알루미늄염, 예를 들면 수산화알루미늄 겔(alum) 또는 인산 알루미늄; 칼슘, 철, 아연의 염; 아실레이트된 티로신의 불용성 현탁액; 아실레이트된 슈가; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어, 모노포스포릴 리피드 A 및 quil A 등이 있다. 또한, 사이토킨, 예를 들면 GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7, 또는 -12를 보조제로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 보조 조성물은 TH1 타입의 면역 반응을 주로 유발할 수 있다. 주로 TH1 타입 반응을 유발하는데 사용하기에 적합한 보조제는, 예를 들면 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는 3-데-O-아실레이트화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL), 및 알루미늄염의 조합물이 있다. 예를 들면, 조성물 또는 백신은 수산화알루미늄 (alum)과 3-0-데아실레이트화된 모노포스포릴 리피드 A (MPL)를 함유하는 보조제로 제형화될 수 있으며, 예를 들면 Thoelen, S., et al., "A prophylactic hepatitis B vaccine with a novel adjuvant system", Vaccine (2001) 19:2400-2403에 기술되어 있다. TH1 타입 면역 반응을 우선적으로 유도하는 다른 종래의 보조제로는 CpG를 함유하는 올리고뉴클레오티드가 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 CpG 디뉴클레오티드가 메틸레이트되지 않은 것을 특징으로 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 이미 알려져 있으며, 예를 들면 PCT 국제공개 제WO 1996/02555호에 기술되어 있다. 또한 면역촉진성(Immunostimulatory) DNA 서열은, 예를 들면 Sato et al., 1996, "Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization", Science, 273:352-354 등에 기술되어 있다. 다른 바람직한 보조제는 사포닌, 바람직하게는 QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.)이며, 단독으로 또는 다른 보조제와의 조합물로 사용될 수 있다. 예를 들면, 강화된 시스템으로는 모노포스포릴 리피드 A와 사포닌 유도체의 조합물, 예를 들면 PCT 국제공개 제WO 1994/00153호에 기술된 QS21과 3D-MPL의 조합물 또는 PCT 국제공개 제1996/33739호에 기술된 QS21이 콜레스테롤로 퀀칭된 다소 불안전한 조성물 등이 있다. 다른 바람직한 제제는 수중유(oil-in-water) 에멀젼과 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀젼 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 보조 제제는 PCT 국제공개 제1995/17210호에 기술되어 있다. 보조제 조성물은 PCT 국제공개 제1995/17210호에 기술되어 있는 바와 같은, 수중유 에멀젼에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 제제가 있다. 일 구현예에서 조성물은 천연 대사성 오일을 포함하는 보조제 Montanide ISA720 (M-ISA-720; Seppic, Fairfield, N.J.)을 포함한다.
본 발명의 백신과 조성물은 표준 방법에 따라 제조될 수 있으며, 상기 방법은 일반적으로 Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 "Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach", edited by Powell and Newman, Plenum Press, 1995, 및 "New Trends and Developments in Vaccines", edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Md., U.S.A. 1978에 기술되어 있다.
경구 투여를 위한 고체 제형은 사람 및 수의과 약학 실제에서 허용가능한 결합제, 감미제, 붕해제, 희석제, 향미제, 코팅제, 보존제, 윤활제 및/또는 서방제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제로는 아카시아 검, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸트 검, 소듐 알기네이트, 카복시메틸셀룰로스 또는 폴리에틸렌 글리콜 등이 있다. 적합한 감미제로는 슈크로스, 락토스, 글루코스, 아스파탐 또는 사카린 등이 있다. 적합한 붕해제로는 옥수수 전분, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 구아검, 잔탄검, 벤토나이트, 알긴산 또는 아가 등이 있다. 적합한 희석제로는 락토스, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로스, 카올린, 셀룰로스, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트 또는 디칼슘 포스페이트 등이 있다. 적합한 향미제로는 페퍼민트 오일, 동록유(wintergreen oil), 체리, 오렌지 또는 라스베리 향 등이 있다. 적합한 코팅제로는 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 이들의 에스테르의 폴리머 또는 코폴리머, 왁스, 지방산 알코올, 제인(zein), 쉘락 또는 글루텐 등이 있다. 적합한 보존제로는 소듐 벤조에이트, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 소듐 비설파이트 등이 있다. 적합한 윤활제로는 스테아린산 마그네슘, 스테아린산, 소듐 올리에이트, 염화나트륨 또는 탈크 등이 있다. 적합한 서방제로는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트 등이 있다.
경구 투여를 위한 액체 형태는, 상기한 물질 이외에 액체 담체를 포함할 수 있다. 적합한 액체 담체로는 물, 오일, 예를 들면 올리브유, 땅콩유, 참깨유, 해바라기씨유, 홍화유, 아라키스 오일, 코코넛 오일, 액체 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방산 알코올, 트리글리세리드 또는 이들의 혼합물 등이 있다.
경구 투여를 위한 현탁액은 또한 분산제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다. 적합한 현탁제로는 소듐 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 소듐 알기네이트 또는 아세틸 알코올 등이 있다. 적합한 분산제로는 레시틴, 스테아린산과 같은 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노- 또는 디-올리에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 디-올리에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트 등이 있다.
경구 투여를 위한 에멀젼은 또한 하나 이상의 에멀젼화제를 포함할 수 있다. 적합한 에멀젼화제로는 위에서 예시한 분산제 또는 구아검, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검 등의 천연 검이 있다.
비경구적으로 투여할 수 있는 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 자명하며, 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa에 보다 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 국소용 제제는 활성 성분과 하나 이상의 허용가능한 담체, 및 임의로 다른 치료 성분을 포함한다. 국소 투여를 위해 적합한 제형은 치료가 필요한 부위의 피부를 투과하는데 적합한 액체 또는 반(semi)액체 제제, 예를 들면 도포제, 로션제, 크림제, 연고제 또는 페이스트제, 및 눈, 귀 또는 코에 투여하는데 적합한 드롭제 등이 있다.
본 발명에 따른 드롭제는 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이 제형은 활성 성분을 살세균제 및/또는 살진균제 및/또는 다른 적합한 보존제의 수용액 중에, 임의로 계면활성제를 포함하여, 활성 성분을 용해하여 제조될 수 있다. 이 후, 얻어진 용액을 여과하여 정화하고, 적합한 용기에 옮겨 멸균한다. 멸균은, 90 ℃ 내지 100 ℃에서 90분 동안 유지 또는 오토클레이브하거나, 또는 여과한 다음, 멸균 방법에 의해 용기에 옮겨서 얻어질 수 있다. 드롭제에 포함시킬 수 있는 적합한 살세균제와 살진균제의 예로는 페닐머큐릭 나이트레이트 또는 아세테이트(0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드 (0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트 (0.01%) 등이 있다. 오일 용액제를 제조하는데 적합한 용매로는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로필렌 글리콜 등이 있다.
본 발명에 따른 로션제는 피부 또는 눈에 적용하는데 적합한 물질을 포함할 수 있다. 눈 로션제는 임의로 살세균제를 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있으며 드롭제 제조와 관련하여 상기한 바와 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 피부에 적용되는 로션제 또는 도포제는 또한 예를 들면 알코올 또는 아세톤 등의 피부 건조를 촉진하거나 냉각시키는 물질, 및/또는 글리세롤 등의 보습제 또는 캐스터 오일 또는 아라키스 오일 등의 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림제, 연고제 또는 페이스트제는 외용을 위한 활성 성분의 반고형 제형이다. 이들은 미세분되거나 분말화된 형태의 활성 성분을 단독으로 또는 수성 또는 비수성 액체의 용액 또는 현탁액으로, 지성 또는 비지성 기제(basis)와 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 기제는 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀납, 금속 비누 등의 탄화수소; 고무풀; 아몬드, 옥수수, 아라키스, 캐스터 또는 올리브 등의 천연 성분 오일; 양모 지방 또는 그의 유도체 또는 스테아린산 또는 올레산 등의 지방산을 프로필렌 글리콜 또는 마크로골 등의 알코올과 함께 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물과 백신은 음이온성, 양이온성의 적합한 계면활성제, 또는 소르비탄 에스테르 또는 이들의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 천연 검, 셀룰로스 유도체 또는 실리케이셔스 실리카와 같은 무기 물질, 및 라놀린 등의 기타 성분을 현탁제로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물과 백신은 또한 리포좀 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 일반적으로 포스포리피드 또는 다른 지질 기질로부터 유도되며, 수성 매질에서 분산되는 단일 층상 또는 다중 층상 수화된 액체 결정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는 비독성의 생리적으로 허용가능하고 대사가능한 지질을 사용할 수 있다. 리포좀 형태의 조성물은 안정화제, 보존제, 및 첨가제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은, 천연 또는 합성의, 포스포리피드와 포스파티딜 콜린(레시틴)이다. 리포좀을 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33을 참조할 수 있다.
약제 및 백신
또한 본 발명은 인플루엔자 감염을 예방하기 위한 백신의 제조방법에 관한 것이다. 상기 방법은 감마선 조사에 의해 인플루엔자 바이러스 제제를 불활성화하는 것을 포함한다. 백신 제조방법에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 제제는, 상기에서, 즉 "조성물과 백신" 부분에서 기술된 바와 같이 생성하여 감마선 조사될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 제제는 인플루엔자 A 바이러스를 포함할 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스 제제는 사람을 공통적으로 감염시키는 인플루엔자 A의 하나 이상의 서브타입으로부터의 균주(들)를 포함할 수 있다. 인플루엔자 A 균주는 현재 사람 개체 내에서 순환하는 것일 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 인플루엔자 백신은 대상의 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 교차반응 면역성을 유도 및/또는 증강한다. 가장 바람직하게는 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입은 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5N1 (HPAI A(H5N1) 등) 및/또는 HlNl (HlNl 09 돼지 플루 등)을 포함할 수 있다. 백신은 비강내 투여용으로 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 제제는 인수공통 인플루엔자 A 바이러스의 균주 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 인플루엔자 백신은 비강내 투여용으로 제형화된다.
일 구현예에서, 백신 제조방법은 감마선 조사에 의한 인플루엔자 바이러스 제제의 불활성화를 포함한다(상기 "조성물 및 백신" 부분 참조).
일 구현예에서, 백신 제조방법은 감마선 조사에 의한 불활성화 이전에 접선방향/교차유동 여과에 의해 인플루엔자 바이러스를 정제하는 것을 포함한다(상기 "조성물 및 백신" 부분 참조).
다른 구현예에서, 백신 제조방법은 인플루엔자 바이러스의 동결 제제를 감마선 조사하는 것을 포함한다(상기 "조성물 및 백신" 부분 참조).
다른 구현예에서, 백신 제조방법은 감마선 조사에 의한 불활성화 이후에 바이러스를 동결건조하는 단계를 포함한다(이하의 "투여 경로" 부분 참조).
다른 구현예에서, 백신 제조방법은 바이러스 제제를 약 6.5 X 104 rad 내지 약 2 X 107 rad 범위의 감마선 총 조사량에 노출하는 것을 포함한다.
다른 구현예에서, 여기에 기술된 제조방법에 따라 제조되는 백신은 백신접종에서 사용되거나 재백신접종(re-vaccination)의 용도로 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 백신 제조방법은 바이러스 제제를 약 1 X 106 rad의 감마선 총 조사량에 노출하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 백신은 재백신접종용으로 사용될 수 있다. 전형적으로, 재백신접종은 최초의 백신접종 후 적어도 6 개월, 적합하게는 최초의 백신접종 후 8 내지 14 개월, 적합하게는 최초의 백신접종 후 10 내지 12 개월에 실시된다. 재백신접종(또는 "부스터")은 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 첨가제와 함께 투여할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 여기에서 기술된 백신 제조방법에 따라 제조되는 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 인플루엔자 A 바이러스이다. 바람직하기로는, 약제는 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 교차반응 면역을 유발한다. 일 구현예에서, 약제는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5N1 (예를 들면, HPAI A(H5N1)) 및/또는 HlNl (예를 들면, HlNl 09 돼지 플루) 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다. 다른 구현예에서 약제는 백신이다. 바람직한 구현예에서 약제는 비강내 투여용으로 제형화된다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 감염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
치료 방법
본 발명은 대상의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 본 발명의 조성물 또는 백신 형태로 대상에게 투여될 수 있다(상기의 "조성물 및 백신" 부분 참조). 일반적으로, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 면역성이 된다. 전형적으로, 상기 방법은 인플루엔자 바이러스 감염에 대하여 대상을 면역화하는 것을 포함한다.
"대상"이란, 포유동물, 예를 들면 소, 말, 양, 영장류 및 설치류 등의 경제적, 사회적 또는 연구적으로 중요한 포유동물이다. 전형적으로 대상은 사람이다. 대상은 인플루엔자 바이러스로 감염되었거나, 인플루엔자 바이러스 감염이 의심되거나, 이전에 인플루엔자 바이러스로 감염되었거나 및/또는 인플루엔자 바이러스 감염의 위험에 있을 수 있다. 인플루엔자 바이러스로의 감염 위험이 있는 대상은, 예를 들면 인플루엔자 바이러스에 감염된 개인과 함께 일하거나 또는 돌보는 대상일 수 있다.
여기서 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 그 의미 내에 본 발명에서 사용하는 조성물 또는 백신의 비독성이나 원하는 치료 효과를 제공하는 충분한 양을 포함한다. 필요한 정확한 양은 처리되는 바이러스 서브타입/균주, 대상의 연령 및 일반적 상태, 치료될 상태의 중증도, 투여하고 있는 특정한 제제 및 투여 방법 등에 따라 대상 마다 다를 수 있다.
따라서, 정확한 "유효량"을 특정할 수는 없다. 그러나, 어떠한 경우에 있어서도, 적절한 "유효량"은 단지 일반적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물)의 치료학적으로 유효한 양은 대상에게 1회 또는 1회 이상 투여될 수 있다.
일반적으로, "치료학적으로 유효한 양"이란 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 면역 반응을 유발하거나 및/또는 강화할 수 있는 상기 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물)의 양을 의미한다. 바람직하게, 면역 반응은 인플루엔자의 하나 이상의 서브타입에서 균주에 대해 유도되거나 및/또는 증간된다. 전형적으로, 대상에게 투여시 치료학적으로 유효한 양은 상기 대상의 인플루엔자 바이러스에 대한 후속 노출 시에 감염의 중증도를 감소시키거나 또는 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상에게 투여 시에 인플루엔자 바이러스 감염 증상 하나 이상을 감소시키는데 충분한 환자의 면역 반응을 유발한다. 인플루엔자 감염에서 전형적으로 나타나는 하나 이상의 증상 감소는 그 의미 내에, 예를 들면 감염 지속기간의 감소, 발열, 두통, 기침, 목의 통증, 몸살, 근육 통증, 코막힘, 해소, 재채기, 눈, 피부, 입, 목 및 코 충혈, 설사, 구토 및 피로 등의 하나 이상의 증상의 지속기간 감소를 포함하는 것을 이해하여야 한다.
따라서, 본 발명은 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물)를 투여하여 인플루엔자 바이러스 감염과 연관된 상기한 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 적합한 서브타입이거나 균주일 수 있다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 2개 이상의 균주의 혼합물 투여가 또한 고려될 수 있다. 상기 균주는 상이한 인플루엔자 바이러스 서브타입에서 유도될 수 있다.
인플루엔자 균주(들)는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae)과의 속으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 균주는 인플루엔자바이러스 A (타입 A)속, 인플루엔자바이러스 B (타입 B)속, 또는 인플루엔자바이러스 C (타입 C)속의 서브타입으로부터 유도될 수 있다.
인플루엔자바이러스 A의 바람직한 서브타입으로는, 예를 들면, 제한적인 것은 아니나 HlNl (예를 들면, HlNl 09 돼지 플루), H1N2, H1N7, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H4N8, H5N1 (e.g. HPAI A(H5N1)), H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H6N5, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N6, H12N5, H13N6, H14N5, 및 인플루엔자 A 바이러스 간의 재조합(re-assortment)에서 발생한 기타 서브타입이 있다.
임의의 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 균주(들)는 감마선 조사된 인수공통 인플루엔자 바이러스 균주를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스는 당분야에 알려진 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스는 수정란에서의 연속 패시징에 의해서 생성하거나 및/또는 세포 배양물에서 생성될 수 있으며, 그 방법은 상기한 "조성물 및 백신" 부분에 기술되어 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스의 감마선 조사는 당 분야에서 알려진 방법에 의해 실시될 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 감마선 조사에 적합한 방법의 예는 상기 "조성물 및 백신" 부분에 기술하였다.
바람직하게, 대상은 사람이며, 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람을 감염시키는 것으로 알려진 인플루엔자 서브타입을 포함한다. 선택적으로, 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람을 감염시키는 것으로 알려지지 않은 인플루엔자 서브타입을 포함할 수 있다. 투여는 비강내 투여일 수 있다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 동결건조된 형태로 제조될 수 있다(이하의 "투여 경로" 부분 참조). 대상에게 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 상기한 "조성물과 백신" 부분에 기술된 바와 같이 접선방향/교차유동 여과에 의해 정제된 바이러스 스톡으로부터 제조될 수 있다. 대상에게 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위해 사용되는 바이러스 스톡은 감마선을 조사하는 동안 동결될 수 있다(상기 "조성물 및 백신" 부분 참조)
본 발명의 방법에 따라, 대상에게 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 투여하므로써 일반적으로 대상에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유발하거나 및/또는 증강하게 된다. 본 발명의 일 구현예에서, 면역 반응은 인플루엔자 바이러스에 이전에 노출되지 않은(또는 인플루엔자 바이러스에 대한 반응에 실패한) 면역적으로 프라임되지 않은 환자에서 유발될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 면역 반응은 투여된 균주가 유도하는 특정한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 서브타입(들)에 이전에 노출되지 않은(또는 인플루엔자 바이러스에 대한 반응에 실패한) 면역적으로 프라임되지 않은 환자에서 유발될 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 면역 반응은 투여된, 특정한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 균주(들)에 이전에 노출되지 않은(또는 인플루엔자 바이러스에 대한 반응에 실패한) 면역적으로 프라임되지 않은 환자에서 유발될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 면역 반응은 투여된 특정한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 균주(들)에 이전에 노출되어 면역 반응이 생성된 대상에서 증강될 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 면역 반응은 투여된 균주가 유도하는, 특정한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 서브타입(들)에 이전에 노출되어 면역 반응이 생성된 대상에서 증강될 수 있다.
바람직하게, 대상에서 유발되거나 및/또는 증강된 면역 반응은 교차반응 면역 반응이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 특정한 서브타입의 투여는 다른 추가 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 면역 반응을 유발하거나 및/또는 증강한다. 바람직한 구현예에서, 현재 유행하는 사람 인플루엔자 A 서브타입에서 유도된 균주의 감마선 조사된 제제 하나 이상을 투여하는 것은 조류 인플루엔자 서브타입 H5N1 (예를 들면, HPAI A(H5N1)) 및/또는 HlNl (예를 들면, HlNl 09 돼지 플루)에 대한 면역 반응을 유발하거나 및/또는 증강한다.
본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스의 다수 균주에 특이적인 대상에서 T 세포 반응을 유발하거나 및/또는 증강하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 균주는 인플루엔자 바이러스의 다수의 상이한 서브타입에서 유도된다. 일반적으로 T 세포 면역반응의 유도 및/또는 증강은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 활성 증강을 포함할 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포 (예를 들면, 헬퍼 CD4+ T 세포) 또는 세포독성 T 세포 (예를 들면, 세포독성 CD4+ T 세포, 세포독성 CD8+ T 세포)일 수 있다.
대상에서 T 세포 면역 반응의 유도 및/또는 증강은 당분야에서 알려진 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들면 인플루엔자 바이러스에 특이적인 T 세포의 증가된 수를 T 세포 면역 반응이 증강되거나 유발된 표지를 제공하여 측정할 수 있다. 바이러스 특이적인 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 열거화 및 특성화 방법과 기술은 당분야에 공지되어 있다. 인플루엔자에 특이적인 T 세포는 ELISpot 에세이, 예를 들면 Vogt 등, 2008, "Transcutaneous anti - influenza vaccination promotes both CD4 and CD8 T cell immune responses in humans", J. Immunol., 180: 1482-1489에 기술된 방법을 일반적으로 사용하여 검출할 수 있다. 추가로 또는 선택적으로, 인플루엔자 바이러스 특이성 T 세포는 인플루엔자 바이러스 및/또는 이들에서 유도되는 단백질 항원으로의 챌린지에 반응하는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포 비율을 측정하여 검출될 수 있다. 전형적으로, 반응성 T 세포는 인플루엔자 바이러스 항원(예를 들면, IL-2, IFN-γ, TNFα 및/또는 CD40L)에 노출되었을 때 하나 이상의 특이적인 사이토카인을 분비하며, 상기 인플루엔자 바이러스 항원은, 예를 들면 세포내 사이토카인 염색 에세이(예를 들면, Vogt et al., supra and Longhi et al., 2008, "Interleukin -6 Is Crucial for Recall of Influenza - Specific Memory CD4 + T Cells", PLoS Pathog., 4(2): el 000006 참조)를 사용하여 검출할 수 있다. 인플루엔자에 특이적인 T 세포를 검출하기 위한 다른 적합한 에세이의 예로는 테트라머를 포함하는 에세이(예를 들면, Longhi et al., supra and Flynn et al., 1999, "In vivo proliferation of naive and memory influenza - specific CD8 + T cells" PNAS, 96(15): 8597-8602 참조)를 들 수 있다.
추가적으로 또는 선택적으로, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스의 다수 균주에 특이적인 대상의 체액 면역 반응을 유발하거나 및/또는 증강할 수 있다. 바람직하게, 균주는 인플루엔자 바이러스의 다수의 상이한 서브타입에서 유도된다. 일반적으로, 체액성 면역 반응의 유발 및/또는 증강은 B 세포의 활성 증강을 포함할 수 있다. 이는 인플루엔자 바이러스 항원과 접하였을 때 항체를 분비하는 플라즈마 세포로 분화할 수 있는 말초혈액 B 림프구의 증가된 빈도에 의해 반영될 수 있다. 따라서, 체액성 면역 반응의 유도 또는 증강은 순환계에서 인플루엔자 바이러스에 특이적인 항체(예를 들면, IgA 및 IgG) 량의 증가와 연관될 수 있다. 인플루엔자에 특이적인 항체의 검출 방법은 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, Sasaki et al., 2007, "Comparison of the influenza virus -specific effector and memory B- cell responses to immunization of children and adults with live attenuated or inactivated influenza virus vaccines", J Virol. 2007; 81:215-28 and Cox et al., 1994, "An early humoral immune response in peripheral blood following parenteral inactivated influenza vaccination", Vaccine, 12:993-999 참조).
바람직한 구현예에서, 여기에서 기술된 방법에 따른 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 투여는 대상에서 인플루엔자 바이러스에 대한 T 세포 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 유발하거나 증강한다. 특히 바람직한 구현예에서, 감마선 조사된 사람 인플루엔자 A 바이러스의 균주 하나 이상을 투여하므로써 대상에서 조류 인플루엔자 H5N1 (예를 들면, HPAI A(H5N1)) 및/또는 HlNl (예를 들면 HlNl 09 돼지 플루)에 대한 T 세포 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응을 유발하거나 및/또는 증강할 수 있다. 감마선 조사된 사람 인플루엔자 A 바이러스는 비강내로 투여될 수 있다.
교차반응/교차보호성 면역
현재의 인플루엔자 백신은 돌연변이로 인하여 빈번한 항원 변이를 일으키는 매우 가변적인 바이러스 표면 당단백질을 목표로 한다. 따라서, 이들의 보호값은 매우 제한적이거나 다른 인플루엔자 바이러스 서브타입 및/또는 새로 발생한 서브타입에 대해서는 보호를 제공하지 못한다.
본 발명은 내부 인플루엔자 바이러스 단백질에 대한 면역 반응을 유발하거나 및/또는 증강하여 상기한 단점을 극복하였다. 이러한 단백질들은 모든 인플루엔자 바이러스 서브타입 중에서 잘 보존되며 돌연변이에 대해 거의 영향받지 않는다. 따라서, 본 발명은 대상에서 다수의 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 교차반응 면역을 유발하거나 및/또는 증강하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상에게 치료학적으로 유효한 양의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 투여하는 것을 포함한다. 교차반응 면역은 교차반응 T 세포 면역의 유발 및/또는 증강에서 발생할 수 있다. 추가적으로 또는 선택적으로, 교차반응 면역은 대상에서 교차반응 체액성 면역의 유도 및/또는 증강으로부터 발생할 수 있다.
바람직하게, 대상은 사람이며, 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람을 감염시키는 것으로 알려진 인플루엔자 서브타입을 포함한다. 선택적으로, 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람을 감염시키는 것으로 알려지지 않은 인플루엔자 서브타입을 포함한다.
일 구현예에서, 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 인수공통 인플루엔자 바이러스 균주를 포함한다.
투여는 비강내 투여일 수 있다. 바람직하게, 교차반응 면역은 보존된 인플루엔자 바이러스 항원에 대해 유도되거나 및/또는 증강된다. 가장 바람직하게는, 교차반응 면역은 항원 시프트 및/또는 드리프트가 일어나지 않는 보존된 인플루엔자 바이러스 항원, 또는 무시할 정도의 항원 시프트 및/또는 드리프트가 일어나는 인플루엔자 바이러스 항원에 대해 유발되거나 및/또는 증강된다. 무시할 정도의 항원 시프트 및/또는 드리프트는 일반적으로 숙주 면역세포가 항원을 인식하고 반응하는 능력을 변성하지 않는 항원 시프트 및/또는 드리프트 정도이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 인플루엔자 바이러스에 대한 면역을 포함하는 교차반응 면역은 대상에게 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 비강내 투여하여 유발되거나 또는 증강된다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 동결건조된 형태로 제조될 수 있다(이하의 "투여 경로" 부분 참조). 대상에게 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 상기한 "조성물 및 백신" 부분에서 기술한 바와 같은 접선방향/교차유동 여과에 의해 정제된 바이러스 스톡으로부터 제조될 수 있다. 대상에게 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 제조하는데 사용되는 바이러스 스톡은 감마선 조사 동안 동결될 수 있다(상기 "조성물 및 백신" 부분 참조)
본 발명의 바람직한 구현예에서, 교차반응 면역은 다수의 인플루엔자 바이러스 서브타입에 특이적인 교차반응 CD8+T 세포의 유도(및/또는 활성 증강)에서 발생한다.
일반적으로, 교차반응 면역 반응은 하나 이상의 상이한 인플루엔자 바이러스 서브타입과 동일하거나 실질적으로 유사한 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 항원에 대해 특이적이 된다. 따라서 교차반응 면역 세포는 다수의 바이러스 서브타입에 의해 공유된 실질적으로 유사하거나 동일한 바이러스 항원을 인식하고 반응한다.
여기에 기술된 방법에 따라 대상에게 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 투여하여 교차반응 면역 세포를 생성할 수 있다. 교차반응 면역 세포는 대상에게 투여된 인플루엔자 바이러스 서브타입의 균주를 인식하고 반응할 수 있다. 또한, 교차반응 면역세포는 대상에게 투여되지 않은 하나 이상의 다른 추가의 인플루엔자 바이러스 서브타입의 균주를 인식하고 반응할 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 대상에서 유발 및/또는 증강된 교차반응 면역은 교차반응 세포 면역을 포함할 수 있다. 교차반응 세포 면역은, 예를 들면 교차반응 헬퍼 T 세포 반응 및/또는 교차반응 세포독성 T 세포 반응을 포함할 수 있다. 바람직하게는 교차반응 세포 면역은 교차반응 세포독성 CD8+T 세포 반응을 포함한다. 특별한 메카니즘이 결합되어 있지는 않지만, 본 발명의 방법으로 유도 및/또는 증강된 교차반응 T 세포 면역은 감마선 조사에 의해 제공된 바이러스 표면 단백질의 작용성 도메인(예를 들면, 작용성 수용체 및 융합 도메인)의 보존된 온전성으로 인하여 항원을 제공하는 세포에 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 효과적인 흡수에서 발생할 수 있다. 이것은 다음으로 바이러스 입자의 보다 더 효과적인 흡수와 언코팅을 허용하여 항원을 제공하는 세포의 세포질에 충분한 바이러스 항원(예를 들면, 매트릭스 및 뉴클레오단백질)과 주조직적합성(MHC) 단백질에 바이러스 항원의 효과적인 표출(presentation)을 제공한다. 추가로 또는 선택적으로, 절편된 게놈 인플루엔자 바이러스 RNA의 불발 복제/번역을 발생하여 MHC 표출에 대한 바이러스 항원의 주공급원(즉, 조기 터미네이트되거나 및/또는 잘못 폴딩된 유전자 생성물)을 제공하므로써 바이러스 특이적 T 세포 면역을 프라임한다.
교차반응 세포 면역의 유발 및/또는 증강은 당 분야에서 공지된 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 교차반응 T 세포(예를 들면, 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포)는, (상기한 바와 같은) ELISpot 에세이, 세포내 사이토킨 염색 에세이 및 테트라머 포함 에세이 등의 검출 바이러스 특이적 T 세포에 사용되는 일반적 방법으로 검출되거나 정량될 수 있다.
대상에서 유발되거나 및/또는 증강된 교차반응 면역은 교차반응 체액성 면역을 포함할 수 있다. 교차반응 체책성 면역은 일반적으로 교차반응 B 세포 반응과 연관된다. 이는 결과적으로 대상의 순환계에서 교차반응 인플루엔자 바이러스 특이적 항체(예를 들면, IgA 및 IgG)의 양을 증가시킨다. 일반적으로, 교차반응 항체는 그의 생산을 자극하지 않는 인플루엔자 바이러스 항원과 반응하거나 및/또는 결합하는 능력을 가진다. 이들에서 유도된 교차반응 B 세포와 항체는 당분야에서 알려진 방법(예를 들면, 마이크로중화 (microneutralisation) 에세이, 유동세포계수법 또는 면역조직화학)을 사용하여 검출할 수 있다. 교차반응 인플루엔자 바이러스 특이적 항체를 검출하는데 적합한 기술의 특정 실시예는, 예를 들면 다음 문헌에 기술되어 있다: Rota et al., 1987 "Comparison of the immune response to variant influenza type B hemagglutinins expressed in vaccinia virus", Virology, 161:269-75, and Harmon et al., 1988, "Antibody Response in Humans to Influenza Virus Type B Host-Cell-Derived Variants after Vaccination with Standard ( Egg - Derived ) Vaccine or Natural Infection", J. Clin. Microbiol., 26:333-337.
본 발명의 방법에 따라, 주어진 인플루엔자 바이러스 서브타입의 감마선 조사된 균주를 투여하여 유도되거나 및/또는 증강된 교차반응 면역은 투여된 서브타입의 균주에 대한 교차보호를 제공한다. 바람직하게, 주어진 인플루엔자 바이러스 서브타입에서 유래한 감마선 조사된 균주의 투여는 또한 하나 이상의 추가 인플루엔자 바이러스 서브타입의 균주에 대한 교차 보호를 제공한다.
따라서, 사람을 감염시키는 것으로 알려진 하나의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입에서 유도된 주어진 감마선 조사된 균주의 치료학적으로 유효한 양을 사람에게 투여하여 상기 서브타입의 균주와 하나 이상의 다른 추가 인플루엔자 바이러스 서브타입의 균주에 대한 면역 반응을 유발하거나 및/또는 증강한다. 추가의 바이러스 서브타입은 인플루엔자 A 바이러스 서브타입, 인플루엔자 B 바이러스 서브타입 및/또는 인플루엔자 C 바이러스 서브타입일 수 있다. 추가의 인플루엔자 바이러스 서브타입은, 예를 들면 사람 개체에서 발견되는 독특한 인플루엔자 A 서브타입(예를 들면, HlNl (HlNl 09 돼지 플루 포함), H1N2, 및 H3N2)이다. 추가로 또는 선택적으로, 추가의 인플루엔자 바이러스 서브타입은 다른 종에서 공통적으로 발견될 수 있다. 예를 들면, 추가의 인플루엔자 바이러스 서브타입은 조류 (예를 들면, A 서브타입 H5N1 (예를 들면, HPAI A(H5N1)), H7N2, H7N3, H7N7 및 H9N2), 돼지 (예를 들면, A 서브타입 HlNl, Hl N2, H3N1, H3N2), 개 (예를 들면, A 서브타입 H3N8) 또는 말 (예를 들면, A 서브타입 H3N8, H7N7) 개체군에서 공통적으로 발견될 수 있다. 추가의 인플루엔자 바이러스 서브타입은 또한 서브타입 간의 유전적 재조합에서 유도된 재조합 바이러스 균주일 수 있다. 서브타입은 (즉, 감염성)상이한 종에서 유도될 수 있다.
인플루엔자 바이러스의 항원 시프트 및/또는 드리프트는 인플루엔자 유행성의 원인으로 알려져 있다. 여기에 기술된 방법에 따라 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 투여로 유도 및/또는 증강된 교차반응 면역은 백신접종에 의해 상기한 유행병을 예방하는 효과적 방법을 제공한다. 추가로 또는 선택적으로, 유행기간 동안 인플루엔자에 감염된 개인은 여기에서 기술된 방법에 따라 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스로 치료될 수 있다.
임의의 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 투여로 유발되거나 증강된 교차반응 면역은 인수공통 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 면역을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 투여로 유발되거나 증강된 교차반응 면역은 (조류) 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 H5N1 (예를 들면, HPAI A(H5N1))에 대한 면역을 포함한다. 통용되고 있는 사람 인플루엔자 A 바이러스는 하부 호흡기관에서 발현되는 α2,6 연결된 살리실산 수용체와 주로 결합한다. α2,6 연결된 수용체에 대한 결합은 일반적으로 저독성의 고전염성 인플루엔자 바이러스 감염과 연관되어 있다. 대조적으로, 조류 인플루엔자 H5N1은 하부 호흡기관에서 발현되는 α2,3 연결된 수용체와 결합한다. α2,3 연결된 수용체에 대한 결합은 일반적으로 낮은 전염성이나 높은 독성과 치명적 인플루엔자 바이러스 감염과 연관되어 있다. 그러므로 조류 H5N1 인플루엔자 유행병은 H5N1의 헤마글루티닌(HA) 단백질 내에서의 돌연변이와 연관되어 바이러스가 α2,6 연결된 수용체와 결합하는 것으로 예상된다. 최근 일반적인 H5N1 서브타입 단백질(즉, α2,3 연결 수용체)에 특이적인 백신은 α2,6 연결 수용체에 결합하는 H5N1 바이러스 돌연변이에 대해 면역성을 유발할 수 없다. 따라서, 이러한 백신에 의한 항체와 매개된 보호는 예상되는 조류 인플루엔자 유행병에 대해 본질적으로 무효하다.
사람 인플루엔자 A 바이러스에 특이적인 T 세포 개체에 의한 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스(예를 들면, HPAI A(H5N1))의 교차 인식은 상기한 문제를 극복하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라, 대상에게 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 투여하여 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스(예를 들면, HPAI A(H5N1))에 대해 대상에서 교차반응 면역을 유발 및/또는 증강한다. 대상에게 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 감마선 조사된 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스를 포함하지 않을 수 있다. 바람직하게, 대상은 사람이며, 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람을 감염시키는 것으로 알려진 인플루엔자 A 서브타입을 포함한다. 투여는 비강내 투여일 수 있다. 바람직하게, 교차반응 면역은, 제한적인 것은 아니나 HPAI A(H5N1) 바이러스 항원 등의 보존된 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스 항원에 대해 유도 및/또는 증강된다. 가장 바람직하게, 교차반응 면역은, 항원 시프트 및/또는 드리프트가 일어나지 않는 보존된 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스 항원, 또는 무시할 수 있는 정도의 항원 시프트 및/또는 드리프트가 일어나는 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스 항원에 대해 유도 및/또는 증강된다. 무시할 정도의 항원 시프트 및/또는 드리프트는 일반적으로 숙주 면역세포가 항원을 인식하고 반응하는 능력을 변성하지 않는 항원 시프트 및/또는 드리프트 정도이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, (조류) 인플루엔자 바이러스 서브타입 H5N1 (예를 들면, HPAI A(H5N1))에 대한 면역을 포함하는 교차반응 면역은 대상에게 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 비강내 투여하여 유도되거나 증강된다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 동결건조된 형태로 제조될 수 있다(이하의 "투여 경로" 부분 참조). 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람 개체에서 유도된 인플루엔자 A 바이러스 서브타입을 포함할 수 있다. 선택적으로, 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람을 감염시키는 것으로 알려지지 않은 인플루엔자 서브타입을 포함할 수 있다. 대상에게 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 상기의 "조성물과 백신" 부분에서 기술된 바와 같은 접선방향/교차유동 여과에 의해 정제된 바이러스 스톡으로부터 제조될 수 있다. 대상에게 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위해 사용되는 바이러스 스톡은 감마선 조사 동안 동결될 수 있다(상기 "조성물과 백신" 부분 참조).
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 투여로 유도되거나 증강된 교차반응 면역은 HlNl 09 돼지 플루(세계보건기구에 의해 "유행성 인플루엔자 A (HlNl)"으로 지칭됨)에 대한 면역을 포함한다. 대상에게 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 감마선 조사된 HiN1 09 돼지 플루 바이러스를 포함하지 않을 수 있다. 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람을 감염시키는 것으로 알려진 인플루엔자 A 서브타입을 포함할 수 있다. 선택적으로, 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람을 감염시키는 것으로 알려지지 않은 인플루엔자 서브타입을 포함할 수 있다. 투여는 비강내 투여일 수 있다. 바람직하게, 교차보호 면역은 보존된 HlNl 09 돼지 플루 바이러스 항원에 대해 유발 및/또는 증강된다. 가장 바람직하게, 교차보호 면역은 항원 시프트 및/또는 드리프트가 일어나지 않는 보존된 HlNl 09 돼지 플루 바이러스 항원, 또는 무시할 정도의 항원 시프트 및/또는 드리프트가 일어나는 HlNl 09 돼지 플루 바이러스 항원에 대해 유발 및/또는 증강된다. 무시할 정도의 항원 시프트 및/또는 드리프트는 일반적으로 숙주 면역세포가 항원을 인식하고 반응하는 능력을 변성하지 않는 항원 시프트 및/또는 드리프트 정도이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, HlNl 09 돼지 플루 바이러스에 대한 면역을 포함하는 교차반응 면역은 대상에게 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 비강내 투여하여 유발되거나 증강된다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 동결건조된 형태로 제조될 수 있다(이하의 "투여 경로" 부분 참조). 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사람 개체에서 유도된 인플루엔자 A 바이러스 서브타입을 포함할 수 있다. 대상에게 투여된 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 상기의 "조성물과 백신" 부분에서 기술된 바와 같은 접선방향/교차유동 여과에 의해 정제된 바이러스 스톡으로부터 제조될 수 있다. 대상에게 투여되는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위해 사용되는 바이러스 스톡은 감마선 조사 동안 동결될 수 있다(상기 "조성물과 백신" 부분 참조).
투여량
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물/백신)의 적절한 투여량은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 이러한 요인은, 예를 들면 제한적인 것은 아니나, 대상의 신체적 특징(예를 들면, 연령, 체중, 성별 등), 화합물이 단일 제제 또는 보조 요법제로서 사용되는지의 여부, 환자의 MHC 제한 타입, 인플루엔자 감염의 진행(즉, 병리적 상태) 및 당업자에게 인식될 수 있는 기타 요인 등이다. 일반적으로, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 제제(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 제제를 포함하는 조성물/백신)는 약 50 마이크로그램 내지 약 5 mg의 양으로 환자에게 투여될 수 있으며: 약 50 마이크로그램 내지 약 500 마이크로그램의 투여량이 특히 바람직하다.
당업자라면 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물/백신)의 적용가능한 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는데 필요한 비독성의 유효량을 일반적인 실험에 의해 결정할 수 있다.
일반적으로, 유효 투여량은 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 O.OOOlmg 내지 약 lOOOmg; 전형적으로, 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 O.OOlmg 내지 약 750mg ; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 O.Olmg 내지 약 500mg; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 O.lmg 내지 약 500mg; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 O.lmg 내지 약 250mg; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 1.Omg 내지 약 250mg의 범위인 것으로 예상된다. 더욱 전형적으로, 유효 투여량은 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 l.Omg 내지 약 200mg; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 l.Omg 내지 약 lOOmg; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 l.Omg 내지 약 50mg; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 l.Omg 내지 약25mg ; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 5.Omg 내지 약 50mg; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 5.Omg 내지 약 20mg; 24시간 마다 체중 1 kg 당 약 5.Omg 내지 약 15mg의 범위인 것으로 예상된다.
선택적으로, 유효 투여량은 약 500 mg/m2까지이다. 일반적으로, 유효 투여량은 약 25 내지 약 500 mg/m2, 바람직하게는 약 25 내지 약 350 mg/m2, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 약 300 mg/m2, 보다 더 바람직하게는 약 25 내지 약 250 mg/m2, 보다 더 바람직하게는 약 50 내지 약 250 mg/m2 및 가장 더 바람직하게는 약 75 내지 약 150 mg/m2의 범위인 것으로 예상된다.
전형적으로, 치료적 적용에서, 치료는 질환의 상태 또는 조건의 지속기간에 대한 것이다. 또한, 당업자들에게 개별적인 투여량의 최적량과 간격은 치료되는 질환 상태 또는 조건의 성격과 범위, 투여 형태, 경로 및 부위, 치료되는 특정 개인의 성격 등에 의해 결정되는 것은 자명하다. 또한, 이러한 최적 조건은 종래 기술에 의해 결정될 수 있다.
치료의 최적 경로를 치료 결정 시험의 일반적 경로을 사용하여 알아내는 것 또한 당업자들에게 자명하다.
2개 이상의 치료 단위가 대상에게 "결합(in conjunction)"하여 투여될 때, 이들은 단일 조성물로 동시에 투여되거나 또는 별개 조성물로 동시에 또는 다른 조성물로 다른 시간에 투여될 수 있다.
임의의 구현예에서, 본 발명의 방법은 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물/백신)의 다수의 별개 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법(즉, 백신접종) 및 여기에 기술된 인플루엔자 바이러스 감염의 치료는 대상에게, 예를 들면 규정된 시간 동안 다수의 별개 용량을 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 여기에 기술된 인플루엔자 바이러스 감염의 예방(즉, 백신접종) 및 치료는 본 발명의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물/백신)의 초회량(priming dose)을 투여하는 것을 포함한다. 초회량은 추가접종량에 의해 이어질 수 있다. 추가접종(booster)은 재백신접종용일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 조성물 또는 백신은 1회 이상, 2회, 3회 이상 투여된다.
본 발명의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물/백신)은 살아있는 바이러스, 감쇠 바이러스 또는 사멸 바이러스로의 접종 등과 같은 종래의 치료요법 이외에 단일 약물요법, 또는 인플루엔자 바이러스를 치료하는 당분야에서 알려진 기타 치료요법제로 투여될 수 있다. 예를 들면, 이들을 서브유니트 백신, 스플리트 인플루엔자 바이러스 또는 스플리트 인플루엔자 바이러스 항원 제제, 불활성화된 전바이러스 또는 살아있는 감쇠 인플루엔자 제제와 함께 투여할 수 있다.
투여 경로
본 발명은 대상에게 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물/백신)의 치료학적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 조성물/백신)는 약학적으로 허용가능한 담체, 보조제 또는 첨가제와 함께 투여할 수 있다.
투여는 적합한 경로에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 비경구(예를 들면, 정맥내, 피부내, 피하 또는 근육내), 점막(예를 들면, 경구 또는 비강내) 또는 국소 경로(상기의 "조성물 및 백신" 부분 참조) 등이다.
따라서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 이를 포함하는 조성물/백신)는 주사에 의한 투여에 적합한 형태, 경구 섭취에 적합한 제형 형태(예를 들면, 캡슐, 정제, 당의정, 엘릭서), 국소 투여에 적합한 연고, 크림 또는 로션 형태, 점안으로 전달하기에 적합한 형태, 비강내 흡입 또는 경구 흡입 등과 같은 흡입에 의한 투여에 적합한 에어로졸 형태, 비경구 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 등에 적합한 형태로 투여될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물/백신)는 대상에게 비강내 경로로 투여된다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 조성물/백신)를 대상에게 비강내 투여하므로써 다른 투여 경로보다 이점을 제공할 수 있다. 예를 들면, 비강내 투여는 혈청 IgG 보다 훨씬 효과적으로 교차 보호를 유도하는 점막 상피에서의 분비 IgA 생성을 유발한다. 특정한 메카니즘과 결합되어 있지는 않지만, 감마선 조사에 의한 인플루엔자 바이러스의 불활성화가 바이러스 입자의 항원 구조에 영향을 미치지 않으면서 바이러스 게놈의 가닥 분해를 유발하여 바이러스를 불활성화하는 것으로 생각된다. 따라서, 인플루엔자 바이러스의 감마선 조사와 비강내 투여의 조합은, 예를 들면 제한적인 것은 아니나 다음과 같은 이점을 제공할 수 있다: 1) 불활성화된 바이러스와 조직 특이성 수용체 결합 촉진, 2) 조직 특이성 면역 반응의 유도, 3) 전 바이러스 항원에 대한 전신 노출 감소 및 4) 전바이러스 백신과 연관된 부작용 제한.
일 구현예에서, 비강내 투여용 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 사용직전에 재구성할 수 있는 동결건조된 분말 형태로 제공된다. 본 발명의 백신과 조성물의 백신 분말 제제는 냉장 저장 및, 액체 베이스 백신 안정성 및 전달과 연관된 분배 요구를 극복하는 방법을 제공한다. 건조 분말 제제는 보다 안정한 이점을 제공하며, 또한 미생물의 성장을 허용하지 않는다.
여기에서 입증된 바와 같이, 감마선으로 불활성화된 인플루엔자 바이러스의 동결건조 제제는 동결건조되지 않은 제제와 유사한 헤테로서브타입 면역 수준을 유발한다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 당분야에서 알려진 적합한 방법으로 동결건조될 수 있다. 예를 들면, 감마선으로 불활성화된 인플루엔자 바이러스의 액체 제제를 드라이아이스-이소프로판올 슬러리에서 동결하고 적합한 시간 동안(예를 들면, 24시간) 동결건조기(예를 들면, Virtis Model 10-324 Bench, Gardiner, NY)로 동결건조할 수 있다.
일 구현예에서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 건조 분말 백신 비내용(nasal) 제제는 스프레이 동결건조(SFD) 입자를 생성하여 제조할 수 있다(예를 들면, Costantino et al, (2002), "Protein spray freeze drying . 2. Effect of formulation variables on particle size and stability", J Pharm Sci., 91:388-395; Costantino, et al., (2000), "Protein spray - freeze drying . Effect of atomization conditions on particle size and stability", Pharm Res.,17:1374-1383; Maa et al, (1999), "Protein inhalation powders : spray drying vs spray freeze drying", Pharm Res, 16:249-254; Carrasquillo et al, (2001); "Non-aqueous encapsulation of excipient-stabilized spray-freeze dried BSA into poly ( lactide - co - glycolide ) microspheres results in release of native protein", J Control Release,76: 199-208; Carrasquillo et al, (2001), "Reduction of structural perturbations in bovine serum albumin by non-aqueous microencapsulation", J Pharm Pharmacol., 53:115-120; 및 미국 특허 제6,569,458호). 예를 들면, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스와 10% 고체(예를 들면, 트레할로스)를 함유하는 수용액을 미립화 질소 가스가 있는 분무기를 통과시키고 액체 질소를 함유하는 트레이에 액적을 수집한 다음, Manifold 동결건조기에서 동결건조시킬 수 있다. 동결건조 제제는 사용 직전에 재구성될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 비내 투여는, 예를 들면 점비액, 스프레이 또는 흡입에 적합한 액체 형태, 분말제, 크림제 또는 에멀젼제로 제형화될 수 있다.
전형적으로, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 이를 포함하는 조성물/백신)를, 바람직하게는 폐에 흡입되지 않으면서 코점막에 의해 흡수하는 코인두 영역에 투여한다. 본 발명에 따른 비내 투여용으로 적합한 장비는 스프레이 장비를 포함한다. 상업적으로 입수할 수 있는 적합한 스프레이 장비를 사용할 수 있다. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(또는 이를 포함하는 조성물/백신)의 서브-용량을 함유하는 다용량 전달 장비를 이용할 수 있다.
당업자라면 광범위하게 기술된 본 발명의 사상 또는 범위 내에서 다양한 변형 및/또는 변성이 본 발명에 대하여 특정한 구현예에서 보여진 바와 같이 구성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 상기 구현예는 모든 측면에서 제한적인 것이 아니라 예시로서 고려되어야 한다.
본 발명의 바람직한 구현예를, 예를 들면 첨부된 하기와 같은 도면을 참조로 하여 설명하였다.
도 1은 A/JAP (50 HAU/마우스)를 비강내 감염시킨 동물의 정맥내 백신접종에 따른 체중 손실을 나타내는 막대 그래프이다. 표 5에 나타낸 그룹의 마우스에 대해 감염 6일 후에 체중을 측정하였다.
도 2는 무처리 마우스와 γ-플루 백신접종된 마우스에서 유도된 면역조직화학적으로 염색된 폐 조직의 대표적인 마이크로 사진이다. (A) 무처리 마우스, (B) A/WSN 6일 후의 무처리 마우스, (C) γ-플루로 백신접종하고 상동성 균주 A/WSN으로 시험된 마우스 및 (D) γ-플루로 백신접종하고 비상동성 균주 A/PC로 시험된 마우스에서 폐 염증에 대한 γ-플루(감마선 조사된 인플루엔자 바이러스)의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 CD8+ T 세포 침윤에 대한 γ-플루 백신접종의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 모의 또는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스(γ-A/WSN, γ- A/JAP, γ-A/Pc)를 사용하여 동물을 정맥내로 백신접종하였다. 4주 후에, 마우스를 A/WSN으로 비강내로 챌린지하였다. A/WSN 챌린지 6일 후에 각 그룹에서 3마리의 마우스를 치사시키고, 전체 폐 침윤물 내의 CD8+ T 세포 비율을 FACS로 계산하였다.
도 4는 γ-플루로 유발된 교차반응 세포독성 T 림프구(CTL)를 나타내는 막대 그래프 시리즈이다. BALB/c 마우스를 감염시키거나 A/WSN, γ-A/WSN, A/PC 또는 γ-A/Pc로 백신접종하여 그 비장세포를 (A) 모의, (B) A/WSN-감염, (C) A/PC-감염, 및 (D) NPP-표지된 P815 타겟에 대하여 치사 활성을 시험하였다.
도 5는 γ-플루로 유발된 교차반응 세포독성 T 세포반응을 나타내는 막대 그래프 시리즈이다. 감염되거나 A/PR8, γ-A/PR8, A/PC 또는 γ-A/PC로 백신접종된 BALB/c 마우스의 비장세포를 모의(데이터 표시 안함), (A) A/PC[H3N2]-감염, (B) A/PR8 [HlNl]-감염, (C) A/JAP [H2N2]-감염, 및 NPP-표지된 P815 타겟에 대한 그의 치사 활성을 시험하였다.
도 6은 치사량의 A/PR8로 챌린지한 후의 마우스 치사율을 나타낸 그래프들이다. (A) 온전한(naive) 마우스 그룹(백신접종되지 않은), (B) A/PR8 γ-플루 (n=10)를 비강내로 백신접종시킨 마우스 그룹, (C) A/PC γ-플루 (n=10)를 비강내로 백신접종시킨 마우스 그룹, 및 (D) 포르말린 불활성화된 A/PC (n=8)를 비강내로 백신접종시킨 마우스 그룹을 3 x 102 HAU (2 x 105 pfu/mouse)의 A/PR8로 챌린지하였다. 체중 손실과 치사율(E)을 챌린지 21일 후에 관찰하였다. 개개 마우스의 체중 추적은 동물이 폐사하면 종료한다.
도 7은 γ-플루에 의한 비강내 백신접종이 이종타입 바이러스 챌린지에 대해 강력한 보호를 제공하는 것을 나타내는 그래프들이다. 10 마리의 BALB/c 마우스 그룹을 모의 처리(A)하거나, γ-A/PC(3.2 x 106 PFU 등가물)로 정맥내(B) 또는 비강내(C)로 백신접종되었다. 마우스를 3주 후에 치사량(6 x 102 PFU)의 A/PR8로 비강내로 챌린지하고 21일 동안 매일 체중을 기록하였다. 생존은 모의 처리, 또는 비강내, 정맥내, 복강내 또는 피하로 백신접종된 마우스의 30% 체중손실(D)로 정의하고 (A-C)에 대해 챌린지하여 21일 동안 관찰하였다.
도 8은 H5N1 (A/Vietnam/1203/2004)로 비강내 감염시킨 후의 체중 손실을 나타내는 그래프들이다. 감염된 마우스는 체중 손실과 이병율을 관찰하였다. 개개 마우스의 체중 추적은 ~25% 체중 손실로 인한 치사 시에 종료하였다.
도 9는 H5N1으로의 챌린지 후의 BALB/c 마우스의 체중과 치사율을 나타낸 2개의 그래프이다. 10 마리의 마우스 그룹은 (A) 모의 처리되거나 (B) γ-A/PR8 [HlNl]로 비강내로 백신접종되었다. 체중을 21일 동안 매일 기록하였다.
도 10은 수동적 혈청 전달이 실패하여 온전한 마우스에게 감마선 조사된 A/PC로 유발된 헤테로서브타입 면역 전달을 나타내는 그래프들이다. (A, B & C) = 체중 손실; (D) = 치사율; 종료점: 25%의 체중 손실; * P < 0.05 vs. 대조 사전면역 혈청 그룹; 피셔스 정확검정법.
도 11은 B 세포 결핍 마우스에서 헤테로서브타입 보호의 결여를 나타내는 그래프들을 제공한다. (A) 온전한 마우스이 체중 손실; (B) 면역된 마우스의 체중 손실; (C) 온전한/면역된 마우스의 치사율.
도 12는 MHC II 결핍 마우스의 헤테로서브타입 보호의 결핍을 나타내는 그래프를 제공한다. (A) 온전한 마우스이 체중 손실; (B) 면역된 마우스의 체중 손실; (C) 온전한/면역된 마우스의 치사율.
도 13은 β2M 결핍 마우스의 헤테로서브타입 보호의 결핍을 나타내는 그래프를 제공한다. (A) 온전한 마우스이 체중 손실; (B) 면역된 마우스의 체중 손실; (C) 온전한/면역된 마우스의 치사율.
도 14는 B 세포가 아니라 입양전달된 T 세포가 헤테로서브타입 챌린지에 대해 마우스를 보호하는 것을 나타내는 그래프들을 제공한다. (A, B & C) = 체중 손실; (D) = 치사율; * P < 0.05 vs. 대조 제로(nil) 그룹; 피셔스 정확검정법.
도 15는 퍼포린(perforin) 결핍 마우스에서 헤테로서브타입 보호의 결여를 나타내는 그래프들을 제공한다. (A & B) = 체중 손실; (C) = 치사율.
도 16은 타입 II IFN 리셉터 넉아웃 마우스에서 헤테로서브타입 보호를 나타내는 그래프들을 제공한다.(A, B) = 체중 손실; (C) = 치사율; * P < 0.05 vs. 대조 제로(nil) 그룹; 피셔스 정확검정법.
도 17은 면역된 마우스의 혈정에서 교차중화 활성의 결여를 나타내는 2개의 그래프를 제공한다. (A) A/PC (H3N2)에 대한 바이러스 중화 활성; (B) A/PR8 (HlNl)에 대한 바이러스 중화 활성,
도 18은 감마선 조사된 A/PC에 의해 유발된 프라이머리 Tc 세포 반응의 투여량 의존성을 나타내는 2개의 그래프를 제공한다. (A, B) 면역 6일 후에 수집된 비장세포. 에러바(Error bar)는 평균 백분율 ± S.D.를 나타낸다. 특이적 용균값은 60:1의 이펙터:타겟비율로 회귀곡선으로부터 삽입되었다.
도 19는 2차적 생체 외 Tc 세포 반응을 나타내는 그래프이다. 특이적 용균값은 40:1의 이펙터:타겟비율로 회귀곡선으로부터 삽입되었다.
도 20은 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스 A/PC가 상동성 및 헤테로서브타입 챌린지에 대해 마우스를 보호하는 것을 나타내는 그래프들을 제공한다. (A, F) = 모의 처리; (B, G) = 포르말린으로 불활성화된 A/PC로 비강내 면역; (C, H) = UV로 불활성화된 A/PC로 비강내 면역; (D, I) = γ-선으로 불활성화된 A/PC로 비강내 면역; (E, J) = 20일 후의 생존율; * P < 0.05 vs. 온전한 대조 그룹; 피셔스 정확검정법.
도 21은 상동성 보호를 유발하기 위해서는 포르말린-불활성화 인플루엔자 바이러스 A/PC의 다중 면역화가 요구되는 것을 나타내는 그래프들을 제공한다.
(A, F) = 모의 처리; (B) = 포르말린으로 불활성화된 A/PC로 1회 면역; (C) = 포르말린으로 불활성화된 A/PC로 2회 면역; (D, G) = 포르말린으로 불활성화된 A/PC로 3회 면역; (E, H) = 20일 후의 생존율; * P < 0.05 vs. 온전한 대조 그룹; 피셔스 정확검정법.
도 22는 3가의 인플루엔자 백신이 드리프트된 균주에 대해 보호를 제공하지 못한 것을 나타내는 그래프들이다. (A,D) 온전한 그룹; (B, E) 면역된 그룹; (C, F) 20일 후의 생존율.
도 23은 상동성 챌린지 후 면역조직학적으로 염색된 폐 조직의 대표적인 현미경 사진들이다. (A) = 온전한 폐; (B) = 백신접종되지 않은 폐 (감염됨); (C) = γ-A/PC 백신접종 (챌린지); (D) = formalin-A/PC 백신접종 (챌린지);(E) = UV-A/PC 백신접종 (챌린지).
도 24는 헤테로서브타입 챌린지 후 면역조직학적으로 염색된 폐 조직의 대표적인 현미경 사진들이다. (A) = 온전한 폐; (B) = 백신접종되지 않은 폐 (감염됨); (C) = γ-A/PC 백신접종 (챌린지); (D) = formalin-A/PC 백신접종 (챌린지);(E) = UV-A/PC 백신접종 (챌린지).
도 25는 다양한 불활성화된 바이러스 제제가 인플루엔자 감염을 예방하지 않으나 감마선으로 불활성화된 A/PC가 조기 바이러스 소거를 유도하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 26은 살아있는 A/PC와 불활성화된 A/PC로 유발된 Tc 세포 반응의 비교를 나타내는 그래프이다. 그룹 당 2 마리 마우스의 평균값 ± SD로 나타내었다. 특이적 용균값이 50:1의 이펙터:표적 비율에서 회귀 곡선으로부터 보간되었다. N.D.: 검출되지 않음.
도 27은 감마선 조사된 A/PC로의 비강내 면역화가 고용량의 A/PR8 치명적 챌린지에 대해 보호를 제공하는 것을 나타내는 그래프들이다. (A, C) = LD50 A/PR8로 챌린지된 마우스; (B, D) = 5 x LD50 A/PR8로 챌린지된 마우스; (E) = 50 x LD50 A/PR8로 챌린지된 마우스. (F) = 20일 후의 생존률 및 체중 손실. * P< 0.05 vs. 대조용 온전 그룹; 피셔의 정확검증법.
도 28은 감마선 조사된 A/PC의 헤테로서브타입 보호 특성이 동결건조 과정 이후에 유지된 것을 나타내는 그래프들이다. (A) = 모의 처리; (B) = 헤테로서브타입 균주 A/PR8로 챌린지; (C) = 20일 후의 생존률 및 체중 손실. * P< 0.05 vs. 대조용 온전 그룹; 피셔의 정확검증법.
도 29는 감마선 조사된 A/PC의 헤테로서브타입 보호 특성이 동결건조 과정 이후에 유지된 것을 나타내는 그래프들이다. (A) = 모의 처리; (B) = 동결건조된 감마선으로 불활성화된 A/PR8로 챌린지; (C) = 20일 후의 생존률 및 체중 손실. * P< 0.05 vs. 대조용 온전 그룹; 피셔의 정확검증법.
실시예
본 발명을 특정한 실시예를 참조로 기술하였으며, 하기 실시예가 본 발명을 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
실시예 1: 감마선 조사된 인플루엔자 A 바이러스를 사용한 BALB/c 마우스의 정맥내 백신접종
(i) 재료 및 방법
동물
같은 성별과 같은 연령대(8 내지 12주령)의 BALB/c 마우스를 각 실험에서 사용하였다.
바이러스 및 면역
인플루엔자 바이러스 균주 A/WSN (HlNl), A/JAP (H2N2) 및 A/PC (H3N2)를 배양하고 Yap 등의 문헌, 1977, "Cytotoxic T cells specific for influenza virus-infected target cells ", Immunology, 32: 151에 기술된 바와 같이 적정하였다. 바이러스 적정물을 헤마글루티닌 단위(HAU)로서 발현하였다. A/JAP 인플루엔자 바이러스를 Co60 광원 (350 rad/min에서 60 시간)에서 1.26 X 106 rad (12.6 KGy)으로 조요막액(crude allantoic fluid)의 노출에 의해 또는 투석된, 감염성 요막액으로 UV 조사(320 μW/cm2)에 10분 동안 노출시켜서 불활성화하였다. 이 기간 동안의 γ 또는 UV 조사에 대한 노출은 수정란에서 시험하였을 때 감염성을 완전히 파괴하였다. 시험동물들을 103 HAU를 1회 정맥내 주사하여 면역시켰다.
표적 세포
P815 티오글리콜레이트로 유발된 복막 대식세포(TGM), 콘카나발린 A (con-A) 및 리포폴리사카라이드(LPS)로 유발된 림프아구를 수득하여, 준비하고 Yap 등의 문헌(Yap et al., 1977, "Cytotoxic T cells specific for influenza virus-infected target cells", Immunology, 32: 151, and Parish and Mullbacher, 1983, "Automated colorimetric assay for T cell cytotoxicity", J. Immunol Meth., 58: 225-237)에 기술된 바와 같이 감염시켰다.
이펙터 세포의 생성
2차 시험관내 인플루엔자 면역 Tc 세포의 생성을 위한 메모리 배양물을 Mullbacher, 1984, "Hyperthermia and the generation and activity of murine influenza-immune cytotoxic T cells in vitro", J. Virol., 52, 928-931에 기술된 방법을 사용하여 생성하였다. 요약하면, 3개월 이전에 인플루엔자 바이러스로 면역된 마우스의 비장 세포 8 X 107을 1 X 107의 바이러스로 감염된 자극제 세포와 5일 동안 시험관 내에서 동시 배양하였다. 자극제 세포를 감염성 또는 불활성화된 바이러스로 106 세포 당 약 103 HAU의 감염 다중도로 감염시켰다.
세포독성 에세이
종양세포와 대식세포 표적에 사용된 방법은 Yap et al., 1977, "Cytotoxic T cells specific for influenza virus-infected target cells", Immunology, 32: 151, Parish and Mullbacher, 1983, "Automated colorimetric assay for T cell cytotoxicity", J. Immunol Meth., 58: 225-237, and Mullbacher, 1984, "Hyperthermia and the generation and activity of murine influenza-immune cytotoxic T cells in vitro", J. Virol., 52, 928-931. 에세이는 6시간 지속되었다. 특이적 용균 백분율은 다음 식을 사용하여 계산되었다:
특이적 용균율 (%) = (실험적 방출 - 매질 방출)/(최대 방출 - 매질 방출) X 100
(ii) 결과
감염성 또는 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 사용한 메모리 Tc 세포에 대한 BALB/c 마우스의 프라이밍(priming)
BALB/c 마우스에게 감염성, γ-조사된 또는 UV로 불활성화된 A/JAP 바이러스 103 HAU를 주사하였다. 3개월 후에, 비장을 분리하고 세포를 시험관 내에서 감염성의 A/JAP로 감염된 자극제 비장 세포로 추가접종시키고 Tc 세포 반응을 5일 후에 3 이펙터:표적 세포 비율로 측정하였다. 표 1에는 감염된 P815 표적 세포의 특이적 용균 백분율의 대표적인 데이터를 나타내었다. 분명하게 감염성 바이러스는 γ선 조사되거나 UV 조사된 바이러스 보다 훨씬 효과적으로 Tc 세포 반응에 대해 프라임되었지만, γ선 조사된 바이러스는 UV 조사된 바이러스에 의한 미약해진 반응과 비교하여 모두 3개의 감염된 표적 세포(A/WSN, A/JAP 및 A/PC)를 사용하여 실질적 용균을 제공하였다. 제한 희석 조건 하의 전구체 빈도 분석으로부터 감염성 바이러스로 프라임된 동물은 γ선 조사된 바이러스로 프라임된 동물보다 비장에서 Tc 세포 전구체 빈도가 약 3배 더 높은 추정값을 나타내었다. 이것은 벌크 배양물에서 얻어진 용균값과 일치한다(표 1).
표 1 γ선 조사되거나 또는 UV 조사된 A/JAP 바이러스로 미리 면역된 마우스의 비장 세포에 대한 감염성 A/JAP 바이러스를 사용한 2차 시험관 내 자극
Figure 112011015185589-pct00001
* 주어진 특이적 용균율 값은 감염되지 않은 P815 세포에서 이펙터 세포에 의한 용균값을 제하여 얻어졌다. 3중 샘플의 평균 표준오차는 항상 8% 미만이었고, 일반적으로 4% 미만이었다. 자발적인 51Cr 방출은 16 내지 19% 범위였다.
메모리 인플루엔자-면역 Tc 세포를 부스팅(boosting)하는 불활성화된 바이러스의 작용성
감염성 A/JAP 바이러스 (103 HAU)로 3개월 전에 프라임된 마우스의 비장 세포를 시험관 내에서 A/JAP 처리된 자극제 세포로 감염성 바이러스, 감마선 조사된 또는 UV로 불활성화된 바이러스를 사용하여 부스팅하고 Tc 세포 활성 에세이를 수행하였다. 표 2에 나타낸 결과로부터 3가지 바이러스 모두 교차반응 Tc 메모리 세포를 재자극할 수 있으나, 감마선 조사된 바이러스가 UV 조사된 바이러스 보다 월등하다는 것이 입증되었다. UV로 불활성화된 바이러스로 부스팅된 세포는 상동성 바이러스로 감염된 표적 세포에 대해서만 상당한 용균을 나타내었다.
표 2 감염성 A/JAP 바이러스로 미리 면역된 마우스의 비장 세포에 대한 감염성 또는 불활성화된 A/JAP 바이러스를 사용한 2차 시험관 내 자극
Figure 112011015185589-pct00002
* 주어진 특이적 용균율 값은 감염되지 않은 P815 세포에서 이펙터 세포에 의한 용균값을 제하여 얻어졌다. 3중 샘플의 평균 표준오차는 항상 8% 미만이었고, 일반적으로 4% 미만이었다. 자발적인 51Cr 방출은 16 내지 19% 범위였다.
감염성 및 불활성화된 A/JAP 바이러스를 사용한 표적 세포의 민감화
불활성화된 인플루엔자 바이러스가 표적 세포를 민감화시킬 수 있는 지를 측정하기 위해서, P815 종양 세포, TGM, 및 LPS 및 con-A 림프아구를 106 세포(2 X 106 세포/ml) 당 103 HAU에서 2시간 동안 감염성, γ선 조사된 또는 UV 조사된 바이러스로 처리하였다. 이 후, 이 표적들을 2차 시험관내 인플루엔자 면역 Tc 세포에 의해 특이적 용균에 대해 시험하였다(표 3). 감염성 바이러스 만이 표적(특히 P815 와 TGM)을 민감화할 수 있어서 감염되지 않은 대조용 표적 이상의 상당한 용균을 나타내었다.
표 3 2차 인플루엔자 면역 Tc 세포에 의해 시험된 감염성 및 불활성화된 A/JAP 바이러스에 의한 표적 세포의 민감화
Figure 112011015185589-pct00003
* 주어진 특이적 용균율 값은 감염되지 않은 P815 세포에서 이펙터 세포에 의한 용균값을 제하여 얻어졌다. 3중 샘플의 평균 표준오차는 항상 8% 미만이었고, 일반적으로 4% 미만이었다. 자발적인 51Cr 방출은, P815에 대하여는 10 내지 12%, TGM에 대하여는 13 내지 17%, LPS에 대하여는 37 내지 40% 및 con-A 모세ㅍ포에 대하여는 22 내지 25% 범위였다.
불활성화된 바이러스를 사용한 치사 인플루엔자 바이러스 감염으로부터의 보호
상기한 불활성화된 바이러스 제제로 면역된 마우스가 치명적인 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 보호될 수 있는지를 연구하기 위해, 마우스를 동일하거나 상이한 서브타입의 살아있는 인플루엔자 바이러스의 치사량으로 챌린지하기 4 내지 5주 전에 감염성, γ선 조사된 또는 UV 조사된 A/JAP 바이러스로 프라임하였다. 2개 실험 중 하나의 결과를 표 4에 기재하였다. 3개 바이러스로 프라임시킨 마우스는 동종의 A/JAP와 이종 A/WSN 바이러스에 의한 챌린지를 통과하였으나, UV 조사된 바이러스로 프라임되고 A/WSN으로 챌린지된 마우스는 질병에 걸리고 하나는 죽었다. 관찰된 가장 큰 차이는 A/PC 바이러스에 의한 것이었다. UV 조사된 바이러스로 프라임된 마우스는 프라임되지 않은 동물만큼 감수성을 나타낸 반면, 감염성 바이러스로 프라임된 마우스뿐만 아니라 감마선 조사된 바이러스로 프라임된 마우스도 최소한 챌린지를 통과하였다. 감염성 또는 감마선으로 불활성화된 바이러스로 프라임된 동물에서의 면역 혈청 전이는 A/WSN으로 감염된 동물이 아니라 동종의 A/JAP 바이러스로 감염된 동물의 폐에서 바이러스 적정량을 상당히 감소시키기 때문에 항체가 관찰된 교차보호에 반응한 것 같지는 않다.
표 4 치사량의 감염성 A/WSN (HlNl), A/JAP (H2N2) 또는 A/PC (H3N2)로 연속 챌린지한 후의 감염성, 감마선 조사되거나 또는 UV 조사된 A/JAP를 사용한 마우스 예비면역의 생존률에 대한 효과
Figure 112011015185589-pct00004
*앞선 실험들에서는 프라임된 마우스가 항상 동종 바이러스에 의한 챌린지를 견디는 것으로 나타났다. BALB/c 마우스에게 103 HAU의 감염성, UV 조사된 또는 감마선 조사된 A/JAP 바이러스를 정맥내(i.v.) 주사하거나 아무것도 주사하지 않았다. 8주 후에, 마우스 그룹(그룹 당 8 마리)을 A/WSN (104 EID50), A/JAP (3 X 105 EID50) 또는 A/PC (1.5 X 108 EID50)의 치사량으로 비강내 접종시켰다. 20일 동안 마우스의 치사를 기록하였으며, 그 결과는 상기 표와 같다.
상기한 결과는 감마선으로 불활성화된 바이러스가 감염성 바이러스뿐만 아니라 적어도 이종 A 균주 바이러스에 의한 치명적인 감염에서 동물을 보호한다는 것을 증명한다. 반면에 UV로 불활성화된 바이러스는 보다 더 연관된 바이러스 A/PC (H3N2)에 대해 이러한 보호를 부여하지 않았다. 감마선 조사가 UV 조사 보다 바이러스의 감염성을 파괴하는데 있어서 교차반응 Tc 세포에 대한 프라임능을 유지하는데 더 효과적이라는 사실은 감마선 조사가 UV 조사와 비교하여 적어도 일부 내부 단백질의 항원 구조를 덜 손상할 수 있음을 시사한다. 놀라웁게도, 바이러스 또는 단백질에 대한 감마선 조사의 영향에 대한 이전의 공개는 거의 없다. 감염섬 바이러스와 비교하여, 감마선 조사되거나 UV 조사된 바이러스는 표적 세포(활성화 대식세포, 림프아세포 또는 P815 세포)를 민감화할 수 없어서 바이러스 특이적 Tc 세포에 의해 용균을 용이하게 한다. 그러나 정맥내 주사 후, 조사된 바이러스의 항원 제시와 주로 연관된 세포는 활성화된 대식세포 또는 림프아세포와는 상이한 특징을 가질 수 있다.
실시예 2 γ선 조사된 인플루엔자 A 균주 A/WSN [HlNl], A/PR8 [HlNl], A/JAP [H2N2] 및 A/PC [H3/N2]를 사용한 정맥내 백신접종
(i) 재료 및 방법
동물 및 바이러스
인플루엔자 A 바이러스(균주 A/WSN, A/Pr8 [HlNl]; A/JAP [H2N2]; A/PC [H3N2])의 스톡(stock)을 10일된 수정란에서 제조하였다. 바이러스 스톡을 요막액으로부터 제조하고 -70 ℃에서 분취량으로 저장하였다. 먼저, BALB/c와 C57B1/6 마우스를 비강내로 감염시키고, 플루 감염의 중증도를 치사율, 체중 손실, 폐 해부학 및 폐 침습 등에 대해 평가하였다.
인플루엔자 균주에 대한 γ선 조사
냉동 및 실온으로 유지된 바이러스 스톡의 감마선 조사량 반응 연구를 ANSTO/Lucas Heights/NSW에서 수행하여 최적의 면역원성을 가지는 멸균 바이러스 제제를 제공하는 조건을 규명하였다. 5x105 rad (5 KGy)의 조사량은 수정란에서 남아있는 감염성 바이러스를 증폭한 후 헤마글루티닌(HA) 에세이에 의해 결정된 멸균성을 유발하는데 충분하였다. 절대 비리온 불활성화를 보호하기 위해서 1x106 rad (10 KGy)의 감마선 조사량을 γ-플루(감마선 조사된 인플루엔자 바이러스) 제제에 대해 선택하여 감염성 인플루엔자로의 이들의 챌린지 이전에 마우스를 백신접종하는데 사용되었다. 바이러스 스톡은 조사하는 동안 드라이아이스 상에서 유지되었다.
정맥내 백신접종 및 비강내 챌린지
8마리의 BALB/c 마우스 그룹을 A/JAP를 사용한 치명적 비강내 챌린지 이전에 γ-플루로 4주 간격으로 2회 비강내 백신접종하였다. γ-A/WSN (6x103 헤마글루티닌 단위(HAU)/마우스), γ-A/PC (6x103 HAU/마우스), 및 γ- A/JAP (3x103 HAU/마우스)를 정맥 내로 주사하였다. 2번째 γ-플루를 투여하고 4주 후에, 마우스를 A/JAP (50 HAU/마우스)로 챌린지한 다음 20일 동안 관찰하였다.
면역조직화학
폐를 10% 중성의 완충된 포르말린에 1주일 동안 고정하고 파라핀에 담갔다. 조직 형태학을 시험하는 동안, 4마이크론 섹션을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다.
폐로부터 림프구 단리 및 FACS 분석
CD8+T 세포의 조직 침습에 대한 γ-플루를 사용한 백신접종의 효과를 평가하기 위해서 모의 및 백신접종된 마우스의 폐를 인플루엔자 바이러스로의 챌린지 6일 후에 5% FCS를 함유하는 빙냉 MEM에 수집하였다. 샘플을 37 ℃에서 진탕하면서 30분 동안 MEM/5% FCS 중에서 2 mg/mL의 콜라게나제 타입 1 (Gibco-Life Technologies)으로 분해하고, 100 μm 메쉬의 조직 체를 서서히 통과시켜 균질화하였다. 이 후, 균질물을 400 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 펠릿을 MEM/5% FCS 중의 2 mL 90% Percoll (Sigma-Aldrich)에 재현탁하였다. 현탁액을 15 mL 튜브에 옮기고 MEM 중의 60, 40, 및 10% Percoll로 서서히 덮어씌웠다. 그래디언트를 800 x g에서 45분 동안 원심분리하였다. 림프구를 40 내지 60% 계면으로부터 수집하여 MEM/5% FCS으로 2회 세척하였다. A/WSN으로 감염된(모의 및 백신접종) 마우스의 폐에서 즉시 단리된 림프구 상의 세포 표면 마커의 발현을 CD8에 특이적인 Ab(PharMingen)로 염색하여 측정하였다. 마우스 한 마리의 세포를 100 μL의 빙냉 MEM/5% FCS에 현탁하고 Fc Block (PharMingen)과 15분 동안 4 ℃에서 항온처리하였다. 세포를 세척하고 관련 Ab와 암소에서 30분 동안 4 ℃로 항온처리하고 2회 세척한 다음 2% w/v 파라포름알데히드로 고정하여 FACScan (Becton Dickinson)을 사용하는 분석까지 암소에서 4 ℃로 보관하였다.
γ- 플루로 유발된 교차반응 CTL 반응
γ-플루가 교차반응 Tc 세포 반응을 유도하는지를 시험하기 위해서, A/WSN 및 A/PC 및 이들의 상응하는 γ-플루 제제를 마우스를 정맥 내로 감염시키거나 백신접종하는데 사용하였다. 10주령 BALB/c 마우스를 A/WSN, γ-A/WSN, A/PC, 및 γ-A/Pc로 감염시키거나 또는 백신접종하였다. 5일 후에, 감염, 백신접종 및 모의 면역된 동물의 비장세포를 모의 세포, A/WSN 감염 세포, A/PC 감염 세포, 및 뉴클레오단백질 유도 펩티드를 제한시킨 적절한 Kd를 가지는 변성된 표적 세포(NPP-표지된 P815 표적)에 대한 그의 사멸 활성을 시험하였다. CTL 반응은 Cr51 방출 에세이를 사용하여 Mullbacher 등, 1993, "Spontaneous mutation at position 114 in H-2 Kd affects cytotoxic T cell responses to influenza virus infection" Eur. J. Immunol. 29, 1228-1234에 기술된 바와 같이 측정되었다.
통 계
모든 통계는 GraphPad InStat 소프트웨어를 사용하여 실시하였다. 원웨이 ANOVA 시험을 사용하여 MEAN과 체중 손실에 대한 백신처리된 및 백신처리되지 않은 그룹 중의 유의차에 대한 SEM을 비교하였다.
(ii) 결과
정맥 내 γ- 플루 백신접종의 인플루엔자 A/ JAP 를 사용한 치명적 챌린지로 부터의 보호
γ-플루 제제의 보호성 면역 유발능을 상동성 및 이종성 인플루엔자 바이러스를 사용하여 γ-플루 프라임된 마우스를 챌린지하여 시험하였다. 마우스에서 인플루엔자 A/JAP (H2N2)로의 호흡기 감염은 치사율과 연관되어 있으며, LD50은 10주령 암컷 BALB/c 마우스의 비강내(i.n.) 50 HAU/마우스이다(표 5).
표 5 상동성 또는 이종성 인플루엔자 A 감염에 대한 γ-플루 제제의 보호효과
Figure 112011015185589-pct00005
* 8마리의 BALB/c 마우스 그룹을 A/JAP를 사용한 치명적 챌린지 이전에 γ-플루로 4주 간격으로 2회 백신접종하였다. γ-플루를 2번째 투여하고 4주 후에 γ-A/WSN (6x103 HAU/마우스), γ-A/PC (6x103 HAU/마우스), 및 γ-A/JAP (3x103 HAU/마우스)를 정맥 내로 주사하고, 마우스를 A/JAP (50 HAU/마우스)로 비강내 챌린지한 다음 20일 동안 관찰하였다.
감마선으로 불활성화된 상동성 또는 이종성 인플루엔자 A 균주의 사전 정맥내(i.v.) 주사는 LD50 A/JAP로 챌린지된 마우스의 생존률을 증강하였다(표 5). 백신접종되지 않은 마우스와 비교 시에, 모든 백신접종된 그룹(A, B, 및 C)은 A/JAP로의 정맥 내 감염 후에 체중 손실이 상당히 감소된 것으로 나타났다(ANOVA 시험을 사용한 P 값 <0.01)(도 1). 온전한 백신접종되지 않은 동물은 A/JAP 챌린지 6일 후에 >30%의 체중 손실을 나타냈다. 비교에서 모든 백신접종된 동물들만이 <10% 정도의 약간의 체중 손실을 나타내었다(도 1).
인플루엔자 A/ WSN 으로 챌린지한 후 γ- 플루 백신접종의 폐 염증 감소
A/JAP 감염 후의 치사율과 체중 손실 이외에 A/WSN 감염 후의 폐 염증과 침윤을 평가하였다. A/WSN의 비강내 감염은 온전한 폐(도 2A)와 감염된 폐(도 2b)의 비교 조직학에서 분명히 나타나는, 심각한 염증 반응을 특징으로 한다. 염증은 상동성(도 2C) 또는 이종성(도 2D) 인플루엔자 바이러스로 챌린지된 γ-플루 백신접종된 동물에서 실질적으로 감소되었다. 전체적인 염증이 저하되었음에도 불구하고, CD8+T 세포는 바람직하게 γ-플루 백신접종된 동물의 폐(도 3)를 침윤하였다.
γ- 플루의 교차반응 세포독성 ( Tc ) 세포 반응의 유도
상동성 바이러스 감염에 대한 γ-플루의 보호 효과는 체액 및 세포 면역과 연관된 것으로 추측된다. 관찰된 교차보호 면역성(상동성 감염으로부터의 보호)에 반응하는 메카니즘은 적어도 부분적으로 세포독성 T(Tc) 세포와 매개될 수 있다. γ-플루가 교차반응 Tc 세포 반응을 유발하는 지를 시험하기 위해서, A/WSN와 A/PC, 및 이들의 상응하는 γ-플루 제제를 사용하여 마우스를 감염시키거나 백신접종하고, 비장 이펙터를 모의 세포, A/WSN로 감염된 세포, A/JAP로 감염된 세포 및 뉴클레오단백질 유도 펩티드(NPP)를 제한시킨 적절한 Kd를 가지는 변성된 표적 세포에 대해 사멸 활성을 시험하였다. 도 4에서 보이는 바와 같이, 감염되거나 백신접종된 동물의 이펙터 비장세포는 상동성 및 이종성 바이러스로 감염된 P815 표적을 용균하였다. 또한, 모의 감염된 마우스를 제외하고 모든 비장세포가 핵 단백질 펩티드 표지된 표적에 대해 사멸 활성을 나타냈다.
실시예 3: 감마선 조사된 인플루엔자 A 바이러스의 비강내 접종에 의한 H5N1(조류 플루)에 대한 보호
(i) 재료 및 방법
동물
10 주령 BALB/c 마우스를 사용하였다.
바이러스
2종의 인플루엔자 바이러스 A 균주(A/PR8 [HlNl] 및 A/PC[H3N2])의 바이러스 저장물을 암탉 수정란에서 배양하고 치킨 적혈구에 대해 온도 의존성 흡착에 의해 정제하여, 바이러스 적정물을 Madin-Darby 개 신장(MDCK)세포에서 표준 플라크 에세이로 평가하였고 적정물은 pfu/ml로 표시하였다.
인플루엔자 균주의 γ선 조사
정제된 스톡을 실시예 2에 기술된 바와 같이 1x106 rad (10 kGy)의 γ선 (ANSTO, Lucas Height, Australia)에 노출하였다. 조사된 스톡의 잔류 바이러스 감염성을 암탉의 수정란을 사용하여 시험하였다. 바이러스 스톡은 멸균하였으나 조사 후의 헤마글루티닌 활성을 유지하였다.
통 계
모든 통계 분석은 GraphPad InStat 소프트웨어를 사용하여 실시하였다. 피셔(Fisher)의 정확 및 카이 제곱 검정을 사용하여 유의차에 대한 생존율을 비교하였다.
BALB /c 마우스의 교차반응 세포독성 T 세포 반응
10주령의 BALB/c 마우스를 A/PR8, γ-A/PR8, A/PC, 또는 γ-A/PC로 감염시키거나 백신접종하였다. 6일 후, 상기 마우스들의 비장세포를 모의 세포, A/PC-, A/PR8-, A/JAP-감염 세포, 및 NPP-표지된 P815 표적 세포를 Cr51 방출 에세이를 사용하여 실시예 1과 2에 기술한 바와 같이 시험하였다.
γ- 플루를 사용한 비강내 백신 접종에 의한 상동성 및 이종성 보호
마우스 그룹을 3.2x106 pfu/마우스의 γ-A/PR8 (n=10), γ-A/PC (n=10), 포르말린으로 불활성화된 A/PC (n=8)로 백신접종하거나, 또는 모의 처리(n=10)하였다. 백신접종 4주 후에, 마우스를 2x105 pfu/마우스의 A/PR8로 비강내 챌린지하고 체중 손실과 치사율을 21일 동안 관찰하였다.
γ- 플루의 비강 내 접종 및 다른 투여 경로 비교
상이한 접종 경로(비강내(i.n.), 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.) 및 피하(S. c.)를 사용하여 3.2 X 106 pfu 등가물의 γ-A/PC로 BALB/c 마우스(그룹 당 10 마리)를 백신접종하였다. 백신접종 3주 후에 마우스를 살아있는 A/PR8(6x102 pfu)의 치사량으로 비강내 챌린지하고 30% 체중 손실을 종료점으로 하여 치사율과 임상 증상을 관찰하였다.
BALB /c 마우스의 치명적 H5N1 감염의 기본 매개변수
10주령의 BALB/c 마우스 그룹을 H5N1 바이러스 스톡의 10배 연속 희석물로 비강내 감염시켰다. 마우스들의 체중 손실과 이환율을 관찰하였다. 각각 마우스의 체중 추적 종료는 ~25% 체중 손실로 인한 치사를 나타낸다.
비강내 γ-플루(γ-A/ PR8 [ HlNl ]) 백신접종을 사용한 H5N1 에 대한 보호
H5N1의 치명적 챌린지에 대한 γ-플루의 보호 효과를 시험하였다. BALB/c 마우스(그룹 당 10 마리)를 모의 처리하거나 또는 γ-A/PR8 [HlNl]의 일회 투여 (3.2xlO6 pfu 등가물/마우스)로 비강내 백신접종하였다. 백신접종 4주 후에 마우스를 3x 마우스 감염량 50 (3 x MID50)의 A/Vietnam/1203/2004 [H5N1]으로 비강내 챌린지하고 20% 체중 손실을 종료점으로 하여 치사율과 임상증상을 21일 동안 매일 관찰하였다.
H5N1 유전자 부하에 대한 γ- 플루 백신의 효과를 측정하기 위한 실시간 PCR ( RT - PCR )
100 μl의 폐 또는 뇌 균질물을 600 μl의 RLT 완충액에 첨가한 후, RNA를 제조업체의 지시에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 각 샘플의 총 RNA 농도를 분광광도계로 측정하여 뉴클레아제가 없는 물로 40 ng μl-1으로 조절하였다. 이어서, 템플레이트의 표준화된 량(200 ng)을 제조업체의 지시에 따라 20 μl 반응액 중에서 TaqMan 역전사 시료 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 역전사하였다. 바이러스 cDNA를 정량하기 위하여 바이러스 매트릭스 유전자 내에서 생성물을 증폭하고 검출하는, 보편적인 인플루엔자 바이러스 타입 A-특이적인 프라이머와 TaqMan 프로브를 이전과 같이 사용하였다(Heine, H. G., et al, 2007 "Rapid detection of highly pathogenic avian influenza H5N1 virus by TaqMan reverse transcriptase - polymerase chain reaction" Avian Dis. 51: 370-372 참조).
반응을 3회 반복하고 12.5 μl의 TaqMan 2X Universal PCR Master Mix, 900 nM의 각 프라이머, 250 nM의 프로브, 2 μl의 cDNA 템플레이트 및 6.8 μl의 물을 포함시켰다. 18S rRNA (TaqMan Ribosomal Control Reagents, Applied Biosystems)를 정량하는 별도의 트리플리케이트 반응을 수행하여 모든 시험 샘플에서 PCR 억제제 존제를 제거하였다. 96웰 플레이트에서 7500 Fast 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems)과 다음 순환 변수를 사용하여 반응을 수행하였다: 50 ℃에서 2 분; 95 ℃에서 10 분; 95 ℃에서 15초 동안 및 60 ℃에서 1분 동안 45 사이클. 바이러스 유전자 부하의 상대적 정량을 위해 표준 곡선을 40 ng μl-1의 감염되지 않은 마우스 폐에서 제조한 RNA 중의 추출된 스톡 바이러스 RNA의 10배 연속 희석물을 템플레이트로서 사용하여 생성하였다. 데이터 해석을 위해서, 1 유니트(1 U)의 바이러스 RNA를 임의로, 역전사되고 실시간 PCR 수행 시에 CT값 38을 나타내는 RNA 분자의 수로 정의하였다.
(ii) 결과
BALB /c 마우스 에서 A/ PR8 γ- 플루 및 A/ PC γ- 플루 제제의 교차반응 세포독성 T 세포 반응 유도
교차반응 세포독성 T (Tc) 세포 반응의 유도를 γ-플루로 백신접종된 마우스에서 시험하였다. A/PR8, A/PC 및 이들의 사응하는 γ-플루 제제를 사용하여 마우스를 감염시키거나 백신접종하였다. 6일 후에 감염되거나 백신접종되거나 모의 면역된 동물의 비장세포를 모의 세포, A/PC-, A/PR8- 또는 A/JAP-감염 세포, 및 뉴클리오단백질 유도 펩티드(NPP)를 제한시킨 적절한 Kd를 가지는 표적 세포에 대해 Cr51 방출 에세이를 사용(실시예 2와 3에 기술한 바와 같이)하여 이들의 사멸 활성을 시험하였다. 도 5에서 보이는 바와 같이, 인플루엔자로 감염된 동물과 γ-플루 백신접종된 동물의 이펙터 비장세포는 사용된 바이러스 균주에 상관없이 모든 인플루엔자 감염된 P815 표적에 대해 사멸 활성을 유발하였다. 또한, 모의감염된 마우스의 비장세포 개체만을 제외하고, 모든 비장세포 개체가 인플루엔자 바이러스 핵단백질 펩티드 표지된 표적에 대해 사멸 활성을 나타내었다. 이러한 데이터는 마우스에서 γ-플루 제제의 교차반응 Tc 세포 반응 유도능을 나타낸다.
비강내 γ- 플루 백신접종의 치사량 인플루엔자 A/ PR8 에 대한 보호
바이러스 전백신(whole vaccine)이 그의 높은 안전성(reactogenicity)으로 인하여 합병증을 유도하고 감마선 조사가 바이러스 면역원성에 거의 영향을 미치지 않는 것(상기한 바와 같이)을 고려하여 γ-플루의 비강내 투여를 시험하였다. 비강내 γ-플루 백신 제형의 효능을 현재 사람 인플루엔자 바이러스 제제에서 사용되는 화학적 불활성 백신 제제와 비교하였다. 마우스를 동량의 3가지 불활성 바이러스 제제(포르말린 A/PC, γ-A/PC [H3N2] 또는 γ-A/PR8 [HlNl]) 중 하나로 비강내로 백신접종하였다. 이 실험에서 마우스는 1회 투여만으로 백신접종되고 4주 후에 A/PR8의 치사량(>300x 치사량 50)으로 챌린지되었다. 마우스의 체중을 측정하고 챌린지 후 3주 동안 치사율을 관찰하였다(도 6). γ-A/PR8로 백신접종된 마우스는 상동성 바이러스로 챌린지한 후에 체중 손실이 거의 없이 완전히 회복되었다(도 6B). γ-A/PC 백신접종된 동물의 A/PR8로의 챌린지는 일정 비율의 동물 체중 손실을 야기하여 메모리 Tc 세포 반응의 피크와 일치하는 4일(도 6C)까지 대부분 회복을 개시하였다(Mullbacher and Tha HIa, 1993, "In vivo administration of major histocompatibility complex class I- speciflc peptides from influenza virus induces specific cytotoxic T cell hyporesponsiveness", Eur. J. Immunol., 23, 2526-2531). γ-A/PC 백신접종된 동물의 생존율은 백신접종되지 않은 그룹(p<0.05 카이 제곱 검정 사용)과 상당히 비교된다. 포르말린으로 불활성화된 백신 제제로 접종된 마우스는 모두 급속하게 체중이 떨어졌다(도 6D). 치사율 데이터(도 6E)는 이환율 데이터를 뒷받침하며 γ-플루로의 비강내 백신접종이 상동성 및 이종성 인플루엔자 A 챌린지를 방어하는 것을 보여준다.
γ- 플루의 비강내 백신접종과 다른 투여경로의 비교
상이한 접종 경로(비내(i.n.), 정맥내, 복막내(i.p.) 및 피하(s.c.))를 사용하여 BALB/c 마우스(그룹 당 10 마리)를 γ-A/PC의 3.2 x 106 플라크 생성 단위(PFU) 등가물으로 접종하였다. 백신 접종 3주 후에 마우스를 치사량의 살아있는 A/PR8 (6x102 PFU)로 비강내 챌린지하고, 30% 체중 손실을 종료점으로 하여 치사율과 임상증상을 관찰하였다(도 7). 비강내로 백신접종된 동물들은 모두 충분히 회복되었고, 이종타입 바이러스로 챌린지후 체중 손실도 거의 없었다(도 7C). 반면에, 백신접종되지 않거나(도 7A), 정맥내로 백신접종되거나(도 7B) 및 복막내와 피하로 백신접종된(데이터 표시 안됨) 마우스 대부분은 계속 체중이 손실되어 감염 후 7일째와 8일째에 체중 손실이 30%까지 진행되었다. 생존룰 데이터(도 7D)는 부자연스러운 높은 챌린지 용량의 A/PR8을 사용하였음에도 불구하고 비강내로 백신접종된 마우스가 상당한 수준으로 이종타입 챌린지에서 생존한 것을 나타낸다(피셔의 정확검정법 사용 P<0.05).
BALB /c 마우스의 치명적 H5N1 감염의 베이스 매개변수
BALB/c 마우스의 체중 손실을 비강내로 H5N1 (A/Vietnam/I 203/2004)을 감염시킨 후에 평가하였다. 도 8에서 보이는 바와 같이, 5마리의 그룹을 희석물만(그룹 1)으로 또는 바이러스 스톡의 10배 희석물(그룹 2 내지 6, 접종물의 농도 증가순)로 챌린지하였다. 마우스들의 체중을 측정하고 이환율을 관찰하였으며 체중 손실이 >25%에 이르기 전에 치사하였다. 111 EID50 (그룹 3)과 11100 EID50 (그룹 5)으로 감염시킨 마우스 각각이 감염 6일과 2일 후에 체중 손실을 나타내기 시작하였다.
H5N1 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 보호
시험된 H5N1의 치명적 챌린지에 대한 γ-플루의 보호 효과. BALB/c 마우스 (10 마리/그룹)를 일회의 γ-A/PR8 [HlNl] (3.2x106 PFU 등가물/마우스)로 비강내 백신접종하였다. 백신접종 4주 후에 마우스를 3x 마우스 감염용량 50(3xMID50) 의 A/Vietnam/ 1203/2004 [H5N1]으로 비강내 챌린지하고 20% 체중 손실을 종료점으로 하여 치사율과 임상 증상을 관찰하였다(도 9). 대조그룹(모의 백신접종)의 마우스 10마리 모두 H5N1 감염과 일치하는 임상 징후를 나타내었고, AEC에 의해 확인된 실험 종료점(20% 이상의 체중손실 관찰, 신경학적 징후 검출 또는 감염에 의해 식/음이 불가능한 상태(예를 들면, 심한 만곡(hunching), 중증 탈수, 활동 불능)에 따라 감염 후 DPI 7일과 14일 사이에 안락사시켰다(도 9A). 일반적으로, 백신접종되지 않은 마우스는 감염 후 4일째부터 털이 끈적거리고 헝클어졌으며, 2마리의 마우스는 이들을 안락사할 시점에 비정상적인 뒷다리 보행과 허약으로 분류되는 신경 징후가 나타났으며, 다른 마우스들은 20%의 체중 손실(다양한 정도의 침울, 활동저하 및 탈수 동반)에 의해 안락사되었다.
반면, 백신접종된 마우스(gamma-A/PR8 [HlNl])는 모두 시험 내내 활동적이었으며, 감염 후 21일에 시험 판단에 따라 안락사되었다(도 9B). 1마리의 마우스가 감염 4일 후에 11%의 체중 손실을 나타내었으나 활동적이었으며 시험의 종료점까지 챌린지 이전의 체중을 회복하였다. 일반적으로, 모든 마우스가 H5N1을 사용한 치명적 챌린지를 극복하고 일부 동물은 체중이 증가하여 챌린지 이전의 체중을 넘어섰다.
γ- 플루의 비강내 백신접종에 의한 폐에서 H5N1 의 조기 정화
상기에서 보여진 바와 같이, 백신접종된 마우스는 모두 치명적인 H5N1 챌린지에서 생존하였다. 그러므로, 이 데이터는 비강내로 투여된 γ-플루 제제의 단일 투여가 H5N1 바이러스에 의한 치명적 챌린지에 대해 마우스에서 교차보호 면역을 유발한 것을 입증한다. 바이러스 감염성과 바이러스 유전적 부하의 정량은 조류 인플루엔자에 대한 γ-A/PR8[HlNl]의 보호 효과를 확인하였고 챌린지 6일 후까지 폐 조직에서 H5N1 바이러스의 소거를 나타내었다(표 6). 챌린지 후 6일에는 없었으나 3일째에 백신접종된 한 마리 마우스의 폐에서 바이러스 감염과 바이러스 RNA의 검출은 관찰된 교차보호 면역이 메모리 Tc 세포에 의해 매개될 수 있음을 나타내며, 이것은 앞서 기술한 바와 같이 온전한 Tc 세포보다 가속된 활성 동역학을 발현한다(Bennink et al, 1978, "Influenzal pneumonia : early appearance of cross - reactive T cells in lungs of mice primed with heterologous type A viruses", Immunology 35: 503-509).
표 6 폐와 뇌에서의 H5N1 감염성과 바이러스 유전적 부하
Figure 112011015185589-pct00006
바이러스 감염성과 상대적 바이러스 유전적 부하는 추출된 RNA(3회 반응의 기하평균± s.d.) 20 ng 당 log10 TCID50 g-1 및 log10 U로 각각 표시되었고, 여기에서 1 유니트(1 U)의 바이러스 RNA는 임의로 역전사되고 실시간 PCR을 실시하였을 때 38의 Cτ 값을 생산하는 RNA 분자의 수로 정의하였다.
* 감염 후 일 수
† 검출할 수 없음(< 103.2 TCID50 g-1 (감염성) 또는 20 ng of 추출된 RNA (유전적 부하) 당 < 1 U ).
실시예 4: 세포독성 T 세포에 의해 우선적으로 매개된 마우스에서 감마선 조사로 불활성화된 인플루엔자 A 바이러스로 유발된 교차보호 면역
(i) 재료 및 방법
세포 및 바이러스
P815 비만세포종과 Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포를 5% CO2를 포함하는 가습 분위기, 37 ℃에서 5% FCS를 가한 EMEM 중에서 유지시켰다. 인플루엔자 타입 A 바이러스, A/PR/8 [A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)] 및 A/PC [A/Port Chalmers/1/73 (H3N2)]를 10일령의 수정된 계란에서 배양하였다. 각각의 계란에 1 헤마글루티닌 단위(HAU)의 바이러스를 함유하는 0.1 ml 생리식염수를 주사하고, 48시간 동안 37 ℃에서 항온처리한 다음, 4 ℃에서 밤새 유지하였다. 양막/요막 액체를 수집하고 모아서 -80 ℃로 저장하였다. 적정물은 107 PFU/ml (A/PC) 및 2 x 108 PFU/ml (A/PR8)였고 MDCK 세포에 대한 플라크 에세이를 사용하였다. 바이러스를 하기 문헌에 기술된 바와 같이 백신 제제에 대한 치킨 적혈구를 사용하여 정제하였다: Sheffield, et al. (1954), "Purification of influenza virus by red - cell adsorption and elution", British journal of experimental pathology, 35:214-222. 간단히 요약하면, 감염성 요막액을 45분 동안 4 ℃에서 적혈구 세포와 항온처리하여 바이러스 헤마글루티닌이 적혈구와 결합하게 한 다음, 원심분리하여 요막액 상징액을 제거하였다. 펠릿을 생리식염수에 재현탁하고, 1시간 동안 37 ℃에서 항온처리하여 적혈구를 바이러스에서 유리시킨 다음, 원심분리하여 적혈구를 제거하고 상징액에서 바이러스를 모았다. 정제된 A/PC 스톡 적정물은 5 x 108 PFU/ml였다.
바이러스 불활성화
포르말린 불활성화을 위해 바이러스를 0.2% 포르말린과 4 ℃에서 일주일 동안 항온처리하였다. 이 후, 포르말린을 24시간 동안 4 ℃에서 생리식염수를 사용한 가압 투석에 의해 제거하였다. 투석 방법은 다음 문헌의 방법을 적용하였다: Andrew et al, (2001), "Dialysis and concentration of protein solutions", in Current protocols in immunology, Coligan et al., (eds), Appendix 3: Appendix 3H. UV 불활성화를 위해 바이러스를 10 mm의 용액이 채워진 60 mm 페트리디쉬에 옮겼다. 바이러스를 cm2 당 4000 ergs에 45분 동안 4 ℃에서 노광하였다. 감마선 불활성화를 위해서, 인플루엔자 바이러스를 60Co 광원(Australian Nuclear Science and Technology Organization - ANSTO)으로부터 10 kGy의 조사량으로 조사하였다. 감마선 조사 동안 바이러스 스톡은 드라이아이스 상에서 동결 상태를 유지하였다. 바이러스 감염성의 상실을 계란 내 불활성화된 바이러스 제제의 적정으로 확인하였다. 불활성화된 바이러스 스톡의 HAU 적정가는 감마선 불활성화된 A/PC에 대하여는 7.3 x 104 HAU/ml, 포르말린과 UV로 불활성화된 A/PC에 대하여는 2.4 x 104 HAU/ml였다.
보호 실험
BALB/c, C57BL/6, 129Sv/Ev, β2-마이크로글로불린 (β2m-/-), Ig μ-체인 (μMT-/-), 퍼포린 (Prf-/-), IFN-γ 수용체 (IFN-IIR-/-) 및 MHC-II-/- 마우스를 특정한 병원균이 없는 조건에서 사육하였다. 10 내지 14주령의 암컷을 사용하였다. 마우스를 불활성화된 바이러스 제제(3.2 xlO6 PFU 등가물)로 비강내 면역하였다. 치명적 챌린지에서, 면역한지 3주 후에 마우스에 A/PR8 (7 x 102 PFU)를 비강내 감염시켰다. 마우스들의 체중을 매일 측정하고 챌린지 후 20일 까지 치사율을 관찰하였다.
입양 면역 림프구 전이 실험
10주령 도너(donor) BALB/c 마우스를 감마선 조사된 A/PC (1 x 108 PFU 등가물)로 비강내 면역시켰다. 면역 후 3주차에 비장세포를 수집하였다. 단일 세포 현탁액을 제조하고 적혈구 세포를 용균하였다. 세포를 나일론 울 컬럼을 통과시켜서 비장 림프구를 B 및 T 세포 개체군으로 분리하였다. 2ml의 5 x 107 세포/ml를 컬럼에 올리고 2시간 동안 37 ℃에서 항온처리하였다. 이 컬럼을 따뜻한 (37 ℃) Hanks 균형 염용액 + 5% FCS로 세척하고, 최초 용출액 내의 고착되지 않은 T 세포를 수집하였다. 이 후, 나일론 울과 결합된 B 세포를 컬럼을 차가운(4 ℃) Hanks 균형 염용액으로 세척하여 수집하였다. T (82.8%, + 7.94% B 세포) 및 B (84.2%, + 8.3% T 세포) 세포 개체군의 순도를 유동 세포계수법 분석으로 확인하였다. 정제된 비장세포의 소량 샘플을 2% FCS와 PBS로 세척하였다. Fc 수용체를 마우스 CD16/CD32 (Fcγ III/II 수용체) Ab (BD Pharmingen)와 20분 동안 4℃에서 항온처리하여 블로킹하였다. 세포를 세척하고 형광물질과 컨쥬게이트된 안티-CD3, 안티-CD8, 안티-CD 19 (BD Pharmingen) Abs의 혼합물과 추가로 항온처리하였다. 죽은 세포를 7-아미노악티노마이신 D(Sigma-Aldrich)로 표지하였다. 염색된 세포를 FACS Calibur (Becton Dickinson)를 사용하여 정량하였다. 정제된 T 또는 B 세포(0.2 ml 중 1.1 x 107 세포)를 리시피언트 마우스에 정맥내로 주사한 다음, 입양 세포 전달 3시간 후에 A/PR8 (7 x 101 PFU)로 비강내 챌린지하였다. 마우스들의 체중 손실과 치사율을 챌린지 20일 후까지 관찰하였다.
수동적 혈청 전달 실험
γ선-조사된 A/PC로 비강내 면역된 마우스의 혈청을 면역 후 3주차에 수집하였다. 모아진 면역 혈청을 30분 동안 56℃에서 가열하여 보체를 불활성화하였다. 리시피언트 마우스에 200μL의 면역 혈철을 정맥 내로 투여하였다. 2시간 후에, 리시피언트 마우스를 A/PR8 (7 xlO2 PFU)로 챌린지하였다. 마우스를 체중과 치사율에 대해 챌린지 후 20일까지 관찰하였다.
플라크 감소 에세이
면역을 실시한 3주 후에 면역 혈청을 살아있는, 감마선 조사된, 포르말린 또는 UV로 불활성화된 A/PC로 백신접종된 마우스에서 수집하였다. 혈청 샘플을 56 ℃에서 30분 동안 가열 불활성화한 후, 190 μL의 연속적으로 희석된 (xlO, x30, x90, x270) 혈청을 약 100 PFU를 함유하는 바이러스 (A/PC 또는 A/PR8 균주) 현탁액 lOμL와 혼합하였다. 37 ℃에서 60분 동안 항온처리한 후, 잔류 바이러스 감염성을 MDCK 세포에서 플라크 에세이에 의해 측정하였다.
세포독성 T 림프구 ( Tc 세포) 에세이
인플루엔자 특이성 Tc 세포를 BALB/c 마우스에 살아있는 A/PC (~2 x 106 PFU) 또는 불활성화된 A/PC (감마선-, 포르말린-, 또는 UV에 의한 불활성화, ~1 x 108 PFU 등가물)를 정맥내로 주사하여 생성하였다. 비장을 면역 7일 후에 수거하여 적혈구-제거 세포 현탁액을 이펙터 세포로 사용하기 위해 제조하였다. P815 세포를 살아있는 A/PC로 감염 다중성(m.o.i) 1로 감염시켜서 표적 세포를 제조하고, 100 내지 200 μCi의 51Cr을 함유하는 배지에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세척한 후, 표적 세포를 8시간 크롬 방출 에세이에서 상이한 비율로 이펙터 세포와 혼합하였다. 상징액의 방사능 농도를 감마선 계수기로 측정하였다. 특이적 용균을 3중 웰의 평균 용균 백분율로 나타내었으며, 다음 식을 사용하여 값을 측정하였다: (실험적 cpm - 자발적 cpm)/(최대 유리 cpm - 자발적 cpm) xlOO. 2차 세포외 Tc 세포 반응을 위해서, 프라임된 마우스에게 처음 면역 후 3개월 차에 정맥내 2차 면역을 실시하고 비장세포를 면역처리 7일 후에 크롬 방출 에세이를 위해 수거하였다.
(ii) 결과
감마선 조사된 인플루엔자 바이러스로 유발된 헤테로서브타입 면역에서 면역 혈청과 B 림프구 및 T 림프구의 역할
교차보호 면역에서 항체의 역할을 측정하기 위해 마우스를 살아있는 A/PR8 (7 x 101 PFU) 또는 γ선 조사된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)로 비강내 면역시키고, 3주 후에 혈액을 모았다. 온전한 마우스 그룹에게 200μl의 γ선 조사된 A/PC 면역 혈청, 고도면역 혈청(3주 간격으로 살아있는 A/PR8을 2회 투여한 마우스에서 유래) 또는 사전(pre)면역 혈청을 정맥내 주사하고 혈청 전달 2시간 후에 치사량의 A/PR8 바이러스 (7 x 102 PFU)로 챌린지하였다.
도 10은 수동적 혈청 전달이 온전한 마우스에게 감마선 조사된 A/PC에 의해 유발된 헤테로서브타입 면역성을 전달하지 못한 것을 나타낸다. 혈청 샘플을 γ선 조사된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)의 1회 투여 또는 살아있는 A/PR8 (7 x 102 PFU)(고도면역)의 2회 투여로 면역된 도너 마우스에서 모았다. 리시피언트 마우스(그룹 당 9 내지 10 마리)에게 0.2 ml의 면역 혈청 또는 대조용 사전면역 혈청을 정맥내로 제공하였다. 혈청 전달의 2시간 후에, 마우스를 A/PR8 (7 x 102 PFU)을 사용하여 비강내로 챌린지하였다. 마우스의 체중 손실(도 10A, 10B 및 10C)과 치사율(도 10D)을 매일 관찰하였다. 감마선 조사된 A/PC 면역 혈청이 제공된 온전한 마우스는 사전면역 혈청이 제공된 마우스들과 마찬가지로 임상적 증상과 체중 손실을 나타내었다(도 10A, 10C 및 10D). 이 마우스들은 체중이 급격히 손실되어 종료점인 25% 체중 손실에 이르렀고, 따라서 헤테로서브타입 챌린지로부터 보호되지 않았다. 대조적으로, 고도면역 혈청이 제공된 마우스는 완전하게 보호되어 상동의 A/PR8 (7 x 101 PFU)로 챌린지하였을 때 거의 체중 손실이 없었다(도 1OB 및 10D). 이러한 데이터는 감마선 조사된 A/PC 유도 항체가 교차보호가 아닌 것을 나타낸다.
2차적으로, B 세포 결핍 μMT-/- 마우스를 사용하여 교차보호 면역에서 B 세포의 역할을 평가하였다. 10주령 μMT-/- 마우스를 감마선 조사된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)로 비강내 면역시키고, 면역 3주 후에 헤테로서브타입 균주 A/PR8 (7 x 102 PFU)로 챌린지하였다. 마우스의 체중 손실과 치사율을 20일 동안 매일 관찰하였다. 백신접종된 μMT-/- 마우스는 온전한 마우스와 유사한 생존율을 나타내었고(도 11A, 11B 및 11C), B 세포의 부재가 교차보호 면역의 전개를 손상시키는 것을 시사하였다. 또한, γ선 조사된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)로의 비강내 백신 접종은 A/PR8을 사용한 헤테로서브타입 챌린지에 대해 MHCII-/- 마우스를 보호하지 못하였다(도 12A, 12B 및 12C). MHCII-/- 마우스를 γ선 조사된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)로 비강내 면역하였다. 면역 3주 후에, 온전한 마우스와 면역된 마우스(그룹 당 9 내지 10 마리)를 헤테로서브타입 균주 A/PR8 (7 x 102 PFU)로 챌린지하였다. 마우스의 체중 손실과 치사율을 20일 동안 매일 관찰하였다. γ선 조사된 A/PC로의 백신접종은 A/PR8을 사용한 헤테로서브타입 챌린지에 대해 MHCII-/- 마우스를 보호하지 못하였다. 이것은 B 세포와 CD4+ T 세포가 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스에 의한 교차보호 면역의 유발에 관여한다는 증거이다.
CD8+ Tc 세포 반응에서 빠져있는 β2M-/- 마우스를 사용하여 γ선 조사된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)로 비강내 면역화하여 유발된 교차보호 면역에서 CD8+ T (Tc) 세포의 기여도를 평가하였다. A/PR8 (7 x 102 PFU)로의 헤테로서브타입 챌린지는 60%의 치사율을 야기하였고, 살아있는 마우스들은 10% 이상의 체중을 이들의 회복 전에 손실하였다(도 13B 및 13C). 동일한 바이러스 균주로 감염된 백신접종되지 않은 대조용 마우스는 치사율이 100%였다(도 13A 및 13C). 이것은 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 교차보호 면역에서 CD8+T 세포의 중요한 역할을 입증한다.
이러한 결과들이 인플루엔자에 대한 교차보호 면역에서 B, CD4+ T 및 CD8+ T 세포의 역할을 보여주고 있지만, 넉아웃(knock-out) 마우스에서 결손 1차면역반응은 체액성 및 세포의 메모리 반응의 교차보호 능력을 어렵게 할 수 있다. 이펙터 세포의 성질을 평가하는 대체 방법으로서, 도너 세포로서 3주에 일찍 정맥내로 γ선 조사된 A/PC (1 x 108 PFU 등가물) 면역된 마우스의 비장세포로 양자 전달 모델을 사용하였다. 비장 세포는 나일론 울이 강화된 T 세포(82.8% T 세포, 7.9% B 세포) 또는 B 세포 (84.2% B 세포, 8.3% T 세포)이며 정맥 내로 온전한 마우스에 전달된다. 전달한 지 3시간 후에 마우스를 0.1 x LD50 A/PR8 (7 x 10 PFU)로 챌린지하였다. 마우스를 체중 손실과 치사율에 대하여 20일 동안 매일 관찰하였다. T 세포 리시피언트는 A/PR8 챌린지에 대해 부분적으로 보호되었다(도 14A, 14B 및 14D). 대조적으로, B 세포 리시피언트 마우스에서 보호가 관찰되지 않았으며, A/PR8 챌린지 후의 대조용(림프구 전달이 없고 백신접종되지 않은)과 유사한 질병 증상이 나타났다(도 14A, 14C 및 14D). 이러한 입양 전달 시험은 또한 A/PR8 챌린지에 대한 교차보호 면역에서 B 세포가 아니라 T 세포의 중요 역할을 지지한다.
CD8+ T 세포는 바이러스에 감염된 세포를 직접 사멸시키거나 또는 IFN-γ 와 TNF 등의 사이토킨을 분비하여 항바이러스 효과를 발휘한다. T 세포의 이펙터 작용이 헤테로서브타입 면역성을 제공하는 것을 설명하기 위해 prf-/- 마우스(퍼포린 매개 용해 작용이 없는)와 IFN-IIR-/- 마우스(면역세포가 IFN-γ에 반응하지 않는)를 사용하였다. prf-/- 마우스를 감마선 조사된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)로 비강내 면역시켰다. 면역시킨 3주 후에, 온전한 마우스와 면역된 마우스(그룹 당 9 내지 10 마리)를 헤테로서브타입 균주 A/PR8 (7 x 102 PFU)로 챌린지하였다. 마우스를 체중 손실과 치사율에 대하여 20일 동안 매일 관찰하였다. 감마선 조사된 A/PC로의 백신접종은 prf-/- 마우스에 의미있는 교차보호를 제공하지 못하였다(도 15A, 15B 및 15C). 이는 감마선 조사된 A/PC로 유발된 교차보호가 퍼포린 매개 용해 작용을 요구하며 CD8+ T 및 NK 세포와 연관되어 있음을 강력하게 시사한다.
대조적으로, 감마선 조사된 A/PC로 면역된 IFN-IIR-/- 마우스(동일 조건)는 A/PR8을 사용한 치명적 챌린지에 대해 충분히 보호되었다(도 16A, 16B 및 16C). 그러므로 IFN-γ 작용은 교차보호 면역의 유발에 그다지 중요하지 않다.
γ선 조사된 A/ PC 로 면역된 마우스의 혈청에서 교차중화 활성의 부재
상기 실시예 3에 나타낸 바와 같이, γ선 조사된(포르말린이나 UV에 의한 불활성화가 아니라) 인플루엔자 바이러스로의 면역화는 교차보호 면역을 유발한다. 그러므로, 인플루엔자 A 바이러스의 상동성 및 헤테로서브타입 균주에 대해 다양하게 불활성화된 인플루엔자 제제에 의해 유발된 면역 혈청의 교차중화 활성을 시험하였다. A/PC (H3N2) 또는 A/PR8 (HlNl)에 대한 바이러스 중화 활성을 살아있거나, 또는 감마선 조사되거나, 포르말린 또는 UV로 불활성화된 A/PC로 면역화한 3주 후에 수집된 혈청에 대해 플라크 감소 에세이에 의해 측정하였다. 혈청 샘플을 56℃에서 30분 동안 열 불활성화한 후, 190 μl의 연속 희석된(xlO, x30, x90, x270) 혈청을 약 1xlO2 PFU를 함유하는 바이러스 현탁액 lOμl와 혼합하였다. 60분 동안 항온처리한 후, 바이러스/혈청 혼합물을 플라크 에세이용 6-웰 플레이트에 첨가하였다. 백신접종된 동물 모두에서 수집된 면역 혈청은 상동성 균주 A/PC (H3N2)에 대해 높은 수준의 중화 활성을 함유하였다(도 17A). 동일한 면역 혈청을 헤테로서브타입 균주 A/PR8 (HlNl)에 대해 시험하였을 때, 온전한 혈청과 유사한 중화 활성 수준을 나타냈다(도 17B). 이러한 데이터는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 포함한, 불활성화된 인플루엔자 바이러스 제제로의 면역이, 있다면 제한된 교차중화 활성을 가지는 매우 균주 특이적인 중화 항체를 유발하는 것을 입증하는 것이다.
용량 의존적인 감마선 조사된 A/ PC 에 의한 교차반응 Tc 세포 반응의 유도 및 크기
H3N2 및 HlNl 인플루엔자 바이러스 간의 혈청 교차중화 활성의 부재, 정의된 넉아웃 마우스에서 교차보호 면역의 결여 및 입양전달 실험 결과는 세포 면역이 헤테로서브타입 챌린지에 대해 마우스를 보호하는데 있어서 중추적 역할을 하는 것임을 시사한다. 백신접종된 마우스에서 T 세포의 세포용해 작용을 특성화하기 위해, 마우스를 살아있거나 또는 감마선 조사된 A/PC의 다양한 용량으로 정맥내 면역시키고 면역한 6일 후에 사멸하여 이들의 비장세포를 특이적 표적 세포에 대해 시험하였다. 2마리의 BALB/c 마우스 그룹을 살아있거나 또는 감마선 조사된 A/PC의 다양한 용량으로 정맥내 면역시키고, 면역한 후 6일째에 비장세포를 수거하였다. 비장세포를 모의 처리되었거나, A/PC 또는 A/PR8 감염된 P815 표적 세포에 대해 이펙터 세포로 사용하였다. 살아있는 A/PC는 광범위한 면역 용량에 대하여 강력한 Tc 세포 반응을 유발하였다(도 18A). 고용량(108 PFU 등가물)의 감마선 조사된 A/PC로의 면역화 또한 A/PC 및 A/PR8 감염된 표적에 대하여 강력한 Tc 세포 반응을 유발하였다(도 18B). 그러나, 낮은 용량을 사용한 면역화(1.6 x 105 PFU 등가물 미만)는 통계적으로 의미있는 교차반응 Tc 세포 반응을 유발하지 못하였다. 따라서 γ선 조사된 A/PC에 의한 Tc 세포 반응의 크기는 면역 용량과 연관되어 있다.
감마선 조사된 A/ PC 에 의한 메모리 Tc 세포의 유도
상기 실시예 3에서 언급된 바와 같이, 감마선 조사된 A/PC로의 면역은 적어도 3개월 동안 교차보호를 제공한다. 그러므로, 오래 지속되는 보호를 고려할 수 있는 메모리 T 세포의 장수를 연구하였다. 2마리의 BALB/c 마우스 그룹을 살아있는 A/PC (2 x 106 PFU), A/PR8 (1 x 107 PFU) 또는 γ선 조사된 A/PC (1 x 108 PFU 등가물)로 1회 또는 2회 정맥내로 면역시켰다. 2차 면역은 프라이밍의 3주 후에 실시되었다. 2차 면역 7일 후에 비장세포를 수거하고, 모의처리되거나, A/PC- 또는 A/PR8로 감염된 P815 표적 세포에 대한 이펙터 세포로 사용되거나 또는 Kd가 제한된 뉴클리오단백질 유도 펩티드(NPP)로 표지하였다. 살아있는 헤테로서브타입 균주 A/PR8을 사용한 2차 면역은 강력한 2차 Tc 세포 반응을 유도하였다(도 19). 대조적으로, 2차 면역으로서 살아있는 상동성 균주 A/PC가 주어진 마우스는 Tc 세포 포텐시가 증가하지 않았다(도 19).
(iii) 고찰
상기 실시예에서 언급한 바와 같이, 감마선으로 불활성화된 인플루엔자 A 바이러스는, 특히 비강내로 투여되었을 때, 독성 조류 H5N1 균주와 같은 치명적 상동성 및 헤테로서브타입 바이러스에 대해 강력한 보호를 제공한다. 이러한 데이터는 Tc 세포에 의해 주로 매개된 교차반응 세포 면역이, 체액성 면역이 아니고 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스에 의해 유도된 교차보호 면역에 반응하는 필수 성분인 것을 증명하는 것이다. 이런 결론은 몇 가지 독립적인 증거에 기초한다: 1) β2M-/- 마우스는 교차보호 면역반응을 나타내지 않았다; 2) 감마선으로 불활성화된 인플루엔자 면역 도너 마우스에서, B 세포 또는 면역 혈청이 아니라, 강화된 T 세포의 전달이 온전한 리시피언트에게 교차반응 면역을 제공하였다; 및 3) 이 제제로 유발된 교차보호 면역은 필수 세포용해 이펙터 분자 퍼포린에 의존한다.
후자의 관찰은, IFN IIR-/- 마우스에서 유발된 교차보호 면역의 유도와 함께, 세포용해성 Tc 세포가 세포독성에 대한 이들의 과립-세포외유출(exocytosis) 경로에 의해 바이러스 감염된 세포의 사멸을 통해 보호를 제공하는 것이며, CD8 + T 세포 IFN-γ 매개 바이러스 조절이 아니라는 것을 강력하게 나타내고 있다. 이에 부합하여, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스로의 면역은 살아있는 바이러스로 유발된 면역과 유사한 T 세포 반응을 이끌어 낼 수 있다. 이러한 교차반응 T 세포 포텐셜은 적어도 3개월 동안 지속되며 생체내 재면역에서 보다 강한 2차 Tc 반응을 이끌어냈다. 이것은 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스로 면역된 마우스가 3개월 이상 헤테로서브타입 챌린지에 대해 잘 보호된 관찰과 연관되어 있다. 그러나, 상동성 균주로의 면역화는 2차 Tc 반응을 증강하지 않았다. 이러한 관찰은 1차 면역화가 상동성 바이러스로의 2차 챌린지를 중화하는 균주 특이성 항체 반응을 매우 잘 유도하여 메모리 Tc 세포 활성화를 방지한 것을 나타낸다.
교차반응 Tc 세포 반응의 유도는 살아있는 복제 바이러스와 대조적으로 감마선 조사된 바이러스에 대해 매우 용량 의존적이다. Tc 세포는 헤테로서브타입 보호를 제공하는데 있어서 지배적 요인으로 확인되었으며, μMT-/- 마우스도 헤테로서브타입 챌린지에 대해 증가된 감수성을 나타내었으므로 상기한 보호 반응에 대한 B 세포에 의한 기여의 증거 일부가 여전히 존재한다. 전달된 혈청의 보호 효과의 결여뿐만 아니라 혈청에서 교차중화 항체 반응의 부재는 B 세포의 기여가 그의 기본 가용성 생성물, 항체에 독립적임을 나타낸다. 임의의 환경에서, 온전한 B 세포는 항체 독립적 방식으로 2차 감염에 대해 μMT-/- 마우스에서 면역을 회복시킬 수 있는 것으로 생각된다. 또한, B 세포는 이펙터 Tc 세포 작용을 촉진하는 역할을 한다. 그러므로, 교차보호 항체의 가능한 역할을 도외시할 수 없으며, 점막성 교차중화 항체는 또한 헤테로서브타입 면역성에 기여하는 것일 수 있다. 관찰된 부분적 교차보호는, 통계적으로 의미있는 것은 아니나, β2M-/- 및 prf-/- 마우스에서 이러한 개념을 뒷받침한다. 또한, T 세포 입양전달에 의해 얻어지는 수동적 면역은 독성 A/PR8의 준(sub)치사량에 대한 보호에서 단지 부분적으로 성공적이었다. 그러므로 Tc 세포와 항체는 모두 궁극적으로 최적 교차보호에 기여할 수 있다.
실시예 5: UV로 불활성화된 인플루엔자 백신 및 포르말린으로 불활성화된 인플루엔자 백신과 비교한 감마선으로 불활성화된 인플루엔자 백신의 우월성
(i) 재료 및 방법
마우스
9 내지 10주령의 암컷 BALB/c 마우스를 이 시험에서 일반적으로 사용하였다.
바이러스 및 세포
P815 비만세포종, Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포 및 어린 햄스터 신장(BHK) 세포를 5% CO2를 포함하는 가습 분위기, 37 ℃에서 5% FCS를 가한 EMEM 중에서 유지시켰다. 인플루엔자 타입 A 바이러스, A/PR/8 [A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)] 및 A/PC [A/Port Chalmers/1/73 (H3N2)]를 10일령의 수정된 계란에서 배양하였다. 각각의 계란에 1 헤마글루티닌 단위(HAU)의 바이러스를 함유하는 0.1 ml 생리식염수를 주사하고, 48시간 동안 37 ℃에서 항온처리한 다음, 4 ℃에서 밤새 유지하였다. 요막액을 수집하고 모아서 -80 ℃로 저장하였다. 적정물은 107 PFU/ml (A/PC) 및 2 x 108 PFU/ml (A/PR8)였고 MDCK 세포에 대한 플라크 에세이를 사용하였다. 바이러스를 하기 문헌에 기술된 바와 같이 백신 제제에 대한 치킨 적혈구를 사용하여 정제하였다: Sheffield, et al. (1954), "Purification of influenza virus by red - cell adsorption and elution", British journal of experimental pathology, 35:214-222. 간단히 요약하면, 감염성 요막액을 45분 동안 4 ℃에서 적혈구와 항온처리하여 헤마글루티닌이 적혈구와 결합하게 한 다음, 원심분리하여 요막액 상징액을 제거하였다. 펠릿을 생리식염수에 현탁하고, 1시간 동안 37 ℃에서 항온처리하여 적혈구 세포를 바이러스에서 유리시킨 다음, 원심분리하여 적혈구 세포를 제거하고 상징액에서 바이러스를 모았다. 정제된 A/PC 스톡 적정물은 5 x 108 PFU/ml였다.
바이러스 불활성화
포르말린 불활성화을 위해 바이러스를 0.2% 포르말린과 4 ℃에서 일주일 동안 항온처리하였다. 이 후, 포르말린을 24시간 동안 4 ℃에서 생리식염수를 사용한 가압 투석에 의해 제거하였다. 투석 방법은 다음 문헌의 방법을 적용하였다: Andrew et al, (2001), "Dialysis and concentration of protein solutions", in Current protocols in immunology, Coligan et al., (eds), Appendix 3: Appendix 3H. UV 불활성화를 위해 바이러스를 10 mm의 용액이 채워진 60 mm 페트리디쉬에 옮겼다. 바이러스를 cm2 당 4000 ergs에 45분 동안 4 ℃에서 노광하였다. 감마선 불활성화를 위해서, 인플루엔자 바이러스를 60Co 광원(Australian Nuclear Science and Technology Organization - ANSTO)으로부터 10 kGy의 조사량으로 조사하였다. 감마선 조사 동안 바이러스 스톡은 드라이아이스 상에서 동결 상태를 유지하였다. 바이러스 감염성의 상실을 계란 내 불활성화된 바이러스 제제의 적정으로 확인하였다. 불활성화된 바이러스 스톡의 HAU 적정가는 γ-A/PC에 대하여는 7.29 x 104 HAU/ml, 포르말린과 UV-A/PC에 대하여는 2.43 x 104 HAU/ml였다.
γ-선으로 불활성화된 인플루엔자의 동결 건조
동결건조를 위하여 0.5 ml의 감마선으로 불활성화된 A/PC를 함유하는 하나의 바이알을 Manifold Freeze-Dryer (FTS SYSTEMS, Dura-DryTM MP)에 배치하였다.
헤마글루티네이션(Hemagglutination) 에세이
살아있는 바이러스 제제와 불활성화된 바이러스 제제를 96웰 U-바닥 마이크로적정 플레이트에서 100 μl 부피로 연속적으로 희석하였다. 0.5%의 치킨 적혈구 현탁액을 모든 웰에 첨가하고 플레이트를 빙냉 하에 30분 동안 항온처리하였다. 이 방법은 다음 문헌의 방법에 따라 적용되었다: Szretter et al. (2006), "Influenza: propagation, quantification, and storage", in Current Protocols in Microbiology, Coico et al. (eds), Chapter 15: Unit 15G 11 참조.
보호 실험
BALB/c 마우스를 특정한 병원균이 없는 조건에서 사육하였다. 10 내지 14주령의 암컷을 사용하였다. 마우스를 불활성화된 바이러스 제제(3.2 xlO6 PFU 등가물) 또는 3가의 불활성화된 서브유니트 인플루엔자 백신(CSL fluvax vaccine; A/Solomon Islands/3/2006 H INl, A/Brisbane/I 0/2007 H3N2, B/Florida/4/2006; 3 mg hemagglutinin)으로 비강내 면역하였다. 포르말린 불활성화된 A/PC로 백신접종된 마우스를 2 내지 3주 후에 1회 또는 2회 재면역하였다. 치명적 챌린지에서, 면역한 1 내지 3주 후에 마우스를 50% 마우스 치사량(MLD50)으로 비강내 감염시켰다. MLD50을 측정한 결과, 예비 실험에서 A/PR8과 A/PC에 대하여 각각 7 x 102 PFU와 3.2 x 105 PFU를 나타내었다. 폐 바이러스 적정물 분석을 위해 3마리의 마우스를 챌린지한 후 3일과 6일에 안락사시켰다. 남아있는 마우스들의 체중과 치사율을 챌린지 후 20일까지 관찰하였다.
플라크 에세이
폐 조직 샘플을 비강내 챌린지한 후 3일과 6일에 수집하였다. 제거한 후, 전제 폐를 생리식염수에 균질화하였다. 세포분쇄액을 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상징액을 수집하여 -20 ℃에 저장하였다. 샘플의 연속 희석물을 6 웰 조직 배양 플레이트에서 배양된 MDCK 세포에 접종하였다. 1시간 흡착 후에 세포를 1.8% Bacto-Agar를 함유하는 EMEM 배지로 덮어씌웠다. 2 내지 3일 항온처리한 후, 세포 단일층을 2.5% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하여 플라크를 열거하였다.
폐 조직학
폐 조직 샘플을 10% 중성 완충 포름알데히드 중에서 최소 24시간 동안 고정하였다. lOμm 조각을 Haemtoxilin-Eosin으로 염색하고 라이트 마이크로스코피로 평가하였다.
세포독성 T 림프구 (Tc 세포) 에세이
인플루엔자 특이성 Tc 세포를 BALB/c 마우스에 살아있는 A/PC 또는 불활성화된, 108 PFU 등가물, A/PC (감마선 조사된, 포르말린-, 또는 UV에 의해 불활성화된 형내)를 정맥내로 주사하여 생성하였다. 비장을 면역 7일 후에 수거하여 적혈구-제거 세포 현탁액을 이펙터 세포로 사용하기 위해 제조하였다. P815 세포를 살아있는 A/PC에 대하여는 감염 다중성(m.o.i)을 1, 불활성화된 A/PC에 대하여는 10으로 감염시켜서 표적 세포를 제조하고, 100 내지 200 μCi의 51Cr을 함유하는 배지에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세척한 후, 표적 세포를 8시간 크롬 방출 에세이에서 상이한 비율로 이펙터 세포와 혼합하였다. 상징액의 방사능 농도를 감마선 계수기로 측정하였다. 특이적 용균을 3중 웰의 평균 용균 백분율로 나타내었으며, 다음 식을 사용하여 값을 측정하였다: (실험적 cpm - 자발적 cpm)/(최대 유리 cpm - 자발적 cpm) xlOO.
(ii) 결과
헤마글루티네이션 활성에 대한 바이러스 불활성화 효과
바이러스 불활성화 후의 헤마글루티네이션 활성은 멸균 처리의 변성 효과에 대한 표지를 제공한다. 정제된 인플루엔자 스톡을 배치로 분액하여 포르말린, UV 또는 감마선 조사로 처리하였다. 수정란에서 바이러스 성장 부재로 입증되는 감염성의 완전한 불활성화에 이어서, 살아있는 바이러스와 불활성화된 바이러스의 헤마글루티네이션을 비교하였다(표 7).
표 7 불활성화된 인플루엔자 바이러스 A/PC 제제의 헤마글루티네이션 활성
Figure 112011015185589-pct00007
헤마글루티네이션 활성을 γ선 조사된 바이러스에 대해 3배까지 감소시킨 반면, 포르말린과 UV 불활성화는 헤마글루티네이션 적정가를 9배 감소시켰다. 이러한 결과는 상기 3종의 바이러스 멸균 방법 중에서 감마선 조사가 바이러스 단백질 구조를 최소한으로 변성하는 증거이다.
감마선 조사되었으나 포르말린 또는 UV로 불활성화되지 않은 바이러스 제제의 헤테로서브타입 면역 유도
감마선 조사되거나, 포르말린 또는 UV로 불활성화된 인플루엔자 바이러스 제제의 상동성 서브타입 및 헤테로서브타입 살아있는 바이러스 챌린지에 대한 보호 효능을 비교하였다. 9 내지 10 마리의 BALB/c 마우스 그룹을 모의 처리하거나 또는 포르말린, UV 또는 감마선으로 불활성화된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)로 비강내로 면역시키고, 면역한 3주 후에 온전한 마우스와 면역된 마우스(그룹당 9 내지 10마리)를 A/PC (MLD50; 3.2 x 105 PFU) 또는 A/PR8 (MLD50; 7.0 x 102 PFU)로 비강내 감염시켰다. 감염된 마우스의 생존율을 20일 동안 매일 관찰하였다. 도 20A, 20E, 20F 및 20J에서 보이는 바와 같이, A/PC 또는 A/PR8로의 온전한 마우스의 비강내 감염은 급격한 체중 손실을 야기하여 90 내지 100% 치사율을 나타내었다(25% 체중 손실을 기준한 종료점). 포르말린으로 불활성화된 A/PC (도 2OB & 20E) 또는 UV로 불활성화된 A/PC (도 2OC & 20E)로 면역된 마우스도 상당한 체중 손실이 진행되어 살아있는 상동성 바이러스로 챌린지하였을 때 ~70% 치사율을 나타내었다. 유사하게 백신접종된 마우스들을 헤테로서브타입 균주 A/PR8로 챌린지한 경우, 동물들은 실질적인 체중이 손실되어 90 내지 100%의 치사율을 나타내었다(도 2OG, 20H, & 20J). 상동성 및 헤테로서브타입 챌린지, 두 가지 경우에서, 유발된 보호는 백신으로 사용되는데 적절하지 않은 것으로 생각된다(P 값 > 0.05, 피셔의 정확검정법). 대조적으로, 감마선으로 불활성화된 A/PC의 단일 투여로 면역된 마우스는 상동성 바이러스 챌린지뿐만 아니라 헤테로서브타입 챌린지에 대해서도 보호되었으며, 마우스의 체중은 평균적으로 5%만이 손실되었다(도 2OD, 20E, 20I & 20J). 그러므로, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 상동성 및 헤테로서브타입 인플루엔자 바이러스 챌린지에 대해 보호 면역성을 유발하는 가장 효과적인 백신 제제인 것이 입증되었다(P < 0.05).
포르말린으로 불활성화된 인플루엔자 바이러스 제제의 다중 투여가 보호 효과를 증강할 수 있는지에 대한 확인
γ선으로 불활성화된 A/PC는 단 1회의 비강내 투여 후에 포르말린으로 불활성화된 제제의 다중 비강내 투여 보다 훨씬 효과적이었다. 이에 포르말린으로 불활성화된 A/PC의 약한 보호 효능이 상이한 면역화 스케쥴을 시험하여 개선될 수 있는지를 측정하였다. 9 내지 10마리의 BALB/c 마우스의 그룹을 모의 처리하거나 또는 포르말린으로 불활성화된 A/PC로 1회, 2회 또는 3회 면역하였다(9.6 x 106 PFU 등가물 또는 감마선으로 불활성화된 A/PC와 등가의 HAU 투여량; 2300 HAU). 모의 처리되거나 또는 단일 투여 면역된 마우스를 면역 3주 후에 A/PC(MLD50; 3.2 x 105 PFU)로 챌린지하였다. 이중 또는 3중 용량 면역된 마우스를 최종 면역 1주 후에 A/PC (MLD50; 3.2 x 105 PFU) 또는 A/PR8 (MLD50; 7 x 102 PFU)로 비강내 면역하였다. 면역된 마우스의 생존을 20일 동안 매일 관찰하였다. 일회 면역된 마우스 그룹은 백신접종되지 않은 마우스의 생존율과 비교하여 개선되지 않았다(도 21A, 21B & 21E). 반면, 마우스 대부분이 여전히 상당한 체중 손실을 나타내고 중증 질환을 겪었지만, 이중 면역은 생존율을 60%까지 개선하였다(P < 0.05). 포르말린으로 불활성화된 A/PC로 3중 면역처리된 마우스는 치사율이 없는 완전한 보호를 나타내었고 체중 손실도 거의 없었다(도 21D & 21E). 3중 면역은 헤테로서브타입 챌린지에서 부분적인 보호를 제공하였다(P < 0.05) (도 21F, 21G & 21H). 따라서, 포르말린으로 불활성화된 A/PC는 더 많은 투여를 요구하며 교차보호를 유도하지 못하여, 유도된 면역성이 정량적으로 뿐만 아니라 정성적으로 감마선으로 불활성화된 A/PC에 의해 유발된 것보다 실질적으로 하위인 것으로 나타났다.
드리프트된 균주에 대해 효과적이지 않은 3가 플루 백신
직접 비교를 위해서, 상업적으로 입수가능한 3가의 인플루엔자 백신의 보호 효능을 여기에 기술된 실험방법으로 시험하였다. 마우스를 3가의 인플루엔자 백신(CSL fluvax vaccine; A/Solomon Islands/3/2006 HlNl, A/Brisbane/10/2007 H3N2, B/Florida/4/2006; 3μg hemagglutinin)으로 1회 비강내로 면역시키고, 면역한 3주 후에 온전한 마우스와 면역된 마우스를 A/PC (3.2 x 105 PFU/마우스) 또는 A/PR8 (7 x 102 PFU)로 비강내 챌린지하였다. 감염된 마우스의 생존을 20일 동안 매일 관찰하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 마우스의 1회 비강내 면역은 A/PC (3.2 xlO5 PFU) (도 22A, 22B & 22C) 및 A/PR8 균주 (7 x 102 PFU) (도 22D, 22E & 22F)에 대해 통계적으로 의미있는 보호(P > 0.05)를 제공하지 못하였다. 이는 현재의 인플루엔자 백신이 동일한 서브타입 내의 균주에 대해서 조차 단일 투여 이후에 주목할 만한 교차보호를 제공하지 못하는 것을 나타낸다.
감마선으로 불활성화된 A/PC 백신접종 후에 최소 인플루엔자 감염으로 유발된 폐 염증
γ선 조사, 포르말린 처리 및 UV-A/PC로 백신접종(3.2 x 106 PFU 등가물)한 3주 후에 마우스를 살아있는 바이러스의 A/PC (상동성) 또는 A/PR8 균주(헤테로서브타입)로 챌린지하였다. 살아있는 마우스의 폐를 챌린지하고 21일 후에 수거하여 폐를 조직검사하였다. 폐 샘플은 주어진 면역의 종류에 따라 현저한 조직학적 차이를 나타내었다. 도 23에 보이는 바와 같이, 제한된 염증 반응이 백신접종된 마우스가 상동성 바이러스 A/PC로 챌린지되었을 때 나타났다. 3개의 백신접종된 그룹(감마선 조사되거나, 포르말린 또는 UV로 불활성화된 A/PC)의 폐 일부를 온전한 조직의 모양과 비교하였다(도 23A, 23C, 23D, & 23E). 대조적으로, 백신접종되지 않은, A/PC로 챌린지된 마우스의 폐 조직은 광범위한 염증 반응을 보였다(도 23B). 헤테로서브타입 챌린지는 다양한 백신접종된 그룹 중에서 뚜렷한 차이를 나타냈다.
포르말린- 및 UV-A/PC로 백신접종된 동물의 염증반응은 강하였고, 백신접종하고 21일 후에 A/PR8 챌린지를 실시한 백신접종되지 않은 동물과 유사하였다(도 24B, 24D & 24E). 대조적으로, 감마선 조사된 A/PC로 백신접종된 마우스의 폐 염증은 A/PR8로의 헤테로서브타입 챌린지를 따라 제한되었다(도 24C). 폐들이 약한 림프구 침습을 가지는 국소화된 염증을 나타내었지만 전체 상태는 온전한 폐와 유사하였다(도 24A)
감마선으로 불활성화된 A/PC 백신은 감염을 예방하지 않으나 바이러스 소거를 촉진한다
폐의 바이러스 로드에 대한 백신접종 효과를 A/PR8에 의한 헤테로서브타입 챌린지를 실시한 3일과 6일 후에 평가하였다. BALB/c 마우스를 감마선 조사되거나, 포르말린 또는 UV로 불활성화된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물)로 비강내 면역시키고, 면역시킨지 3주 후에 온전한 마우스와 면역된 마우스를 A/PR8 바이러스 (MLD50)로 비강내 챌린지하였다. 감염 후 3일과 6일에, 그룹당 3마리의 마우스를 치사하고 폐의 바이러스 적정물을 상기한 바와 같이 MDCK 세포를 사용하여 플라크 에세이로 측정하였다. 감염 후 3일과 6일에서 107과 106 PFU/폐에 달하는 높은 바이러스 적정가가 백신접종되지 않은 마우스에서 검출되었다(도 25). 포르말린과 UV로 불활성화된 A/PC 면역된 마우스의 폐 중의 바이러스 적정가는 백신접종되지 않은 대조용 마우스에서 검출된 것과 비교할만 하다. 대조적으로, 감마선 조사된 A/PC로 백신접종된 그룹은 백신접종되지 않은 대조용 마우스에서 나타난 결과와 비교하여 챌린지(Student's T test를 사용하여P < 0.05 ) 후 3일과 6일 모두에서 A/PR8 폐 바이러스 적정가의 >100 배 감소를 나타내었다.
포르말린으로 불활성화되거나 또는 UV로 불활성화된 바이러스가 아닌, 감마선 조사된 바이러스의 Tc 세포 면역성 보유
살아있는 A/PC와 불활성화된 A/PC(감마선 조사, 포르말린- 및 UV)에 의한 인플루엔자 면역 세포독성 T(Tc) 세포 반응을 생성하는 능력을 비교하였다. BALB/c 마우스를 살아있는 A/PC, 감마선 조사된 A/PC, 포르말린으로 불활성화된 A/PC 또는 UV로 불활성화된 A/PC로 정맥내 면역시켰다. 면역시킨 7일 후에 비장세포를 수거하고 A/PC로 감염된 P815 표적 세포에 대한 이펙터 세포로 사용하였다. 살아있는 바이러스 감염에 따른 Tc 세포 반응의 피크가 면역 후 7일에 검출되었다(데이터 표시되지 않음). 정맥내 면역 후 7일에 각 그룹 중의 마우스 2마리를 평가하였다. 살아있는 A/PC(107 PFU) 또는 감마선으로 불활성화된 A/PC(108 PFU 등가물)로 면역된 마우스에서 수거된 이펙터 비장세포는 A/PC로 감염된 표적 세포를 용균하였고, 반면 포르말린- 또는 UV-로 불활성화된 A/PC로 면역된 마우스로부터 유래한 이펙터 세포는 그렇지 않았다(도 26).
고용량 헤테로서브타입 챌린지에 대해 보호를 제공하는 감마선으로 불활성화된 A/PC를 사용하는 비강내 면역
헤테로서브타입 챌린지에서 마우스를 보호하는 감마선 조사된 A/PC의 우수한 보호능을 고려하여 보호의 한계를 증가된 인플루엔자 바이러스 용량으로 챌린지하여 시험하였다(도 27). 9 내지 10 마리의 BALB/c 마우스 그룹을 모의 처리하거나 또는 감마선으로 불활성화된 A/PC (3.2 x 106 PFU/ml 등가물)로 비강내로 면역시키고, 면역을 실시한 3주 후에 마우스들을 LD50 A/PR8, 5 x LD50 A/PR8, 또는 50 x LD50 A/PR8로 비강내 챌린지하였다. 감염된 마우스의 생존과 체중 손실을 20일 동안 관찰하였다. 1 x LD50의 헤테로서브타입 챌린지가 수행된 면역 마우스는 모두 생존하였고 체중 손실은 거의 없거나 없었다(도 27C & 27F). 5 x LD50의 챌린지 용량이 주어진 면역된 마우스는 초기에 챌린지 후 처음 7일 동안 체중이 손실되었으나 심각하지 않았고 모두 충분히 회복되었다(도 27D & 27F). 50 x LD50으로 처리된 마우스는 평균적으로 8%의 체중이 손실되었으나, 역시 모두 충분히 회복되었다(도 27E & 27F). 1 x LD50 또는 5 x LD50으로 처리된 온전한 마우스는 점점 체중이 손실되어 챌린지에서 생존하는데 실패하였다(도 27A, 27B & 27F).
감마선으로 불활성화된 제제에 의해 제공되는 장기 지속성 헤테로서브타입 보호
효과적인 인플루엔자 백신에 대한 핵심 요구사항은 지속적인 헤테로서브타입 면역성의 유발이다. 9 내지 10 마리의 BALB/c 마우스 그룹을 모의 처리하거나 또는 감마선으로 불활성화된 A/PC (3.2 x 106 PFU/ml 등가물)로 비강내로 면역시키고, 면역을 실시한 3개월 후에 마우스들을 MLD50 A/PR8 (7 x 102 PFU)로 비강내 챌린지하였다. 감염된 마우스의 생존과 체중 손실을 20일 동안 관찰하였다. 1 x LD50 A/PR8로 챌린지된 백신접종된 마우스는 평균적으로 단지 10% 정도의 체중이 손실되었고 충분히 회복되었다(도 28B & 28C). 대조적으로, 챌린지된 온전한 마우스 대부분은 실질적 체중을 손실하여 챌린지 후 7일 정도에 전체 체중 25%를 손실한 종료점에 이르렀다(도 28A & 28C).
동결건조는 감마선 조사로 불활성화된 A/PC의 면역원성을 파괴하지 않는다
최근의 액체를 기본으로 하는 인플루엔자 백신의 단점은, 특히 개발도상국에서 백신 유통에 문제를 발생시키는 냉장 보관이 요구된다는 점이다. 최근의 인플루엔자 백신의 이러한 제한적인 저장 요구성을 극복하기 위한 시도에서, 감마선으로 불활성화된 동결건조 인플루엔자 바이러스는 냉장 요구를 축소시키는 방법으로 평가되었다. 감마선으로 불활성화된 A/PC 스톡은 동결건조되고 비강내 투여(3.2 x 106 PFU 등가물) 전에 즉시 증류수로 재현탁된다. 9 내지 10 마리의 BALB/c 마우스 그룹을 모의 처리하거나 또는 감마선으로 불활성화된 동결건조 A/PC로 면역시키고, 면역을 실시한 3주 후에 헤테로서브타입 균주 A/PR8 (7 x 102 PFU)로 챌린지하였다. 마우스의 생존과 체중 손실을 20일 동안 매일 관찰하였다. 대부분의 마우스는 전체 체중의 10% 미만이 손실되었고, 10마리 중 2마리 만이 10% 이상의 체중 손실과 경미한 증상을 나타내었다. 온전한 마우스가 10% 생존한데 반하여, 백신접종된 마우스는 모두 A/PR8 (7 x 102 PFU)의 헤테로서브타입 챌린지에서 생존하였다(도 29A, 29B & 29C). 이 데이터는 동결건조 공정이 헤테로서브타입 면역성을 유발하는 감마선으로 불활성화된 A/PC의 능력을 현저하게 저하시키지 않는 것을 의미한다.
분할 백신과 비교한 감마선으로 불활성화된 인플루엔자의 우수성
시중에서 구입할 수 있는 플루 백신, Flu-vax의 교차보호 효능을 마우스에 비강내 백신접종한 후 감마선 조사된 정제된 인플루엔자 바이러스와 비교한 결과를 다음에 기재하였다:
Figure 112011015185589-pct00008

따라서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스는 등가물의 바이러스 용량을 기준으로 시판되고 있는 플루 백신 보다 30 내지 100 배 이상 효과적이며 질적으로도 월등히 우수하다.
(iii) 고찰
1945년 이래로 사용되어 현재까지 사용되는 화학적 불활성화 방법이 인플루엔자 백신 제제에 가장 적합한 선택인지를 평가하기 위해서, 본 시험에서는 세 종류의 불활성 요법의 보호 효능을 비교 세팅에서 평가하였다: 감마선 조사, 포르말린 불활성화 또는 UV 불활성화. 감마선으로 불활성화된 A/PC (3.2 x 106 PFU 등가물, 2300 HAU)가 다른 멸균 방법과 비교하여 가장 우수한 면역원성을 가졌으며, 상동성과 헤테로서브타입 챌린지에 대해 가장 높은 수준의 보호를 제공하는 것으로 확인되었다. 이러한 우수한 보호는 100% 생존율과 낮은 수준의 체중 손실에서 반영되며, 감염 후의 폐 조직의 조직학적 평가 뿐만 아니라 온전한 마우스와 포르말린- 또는 UV로 불활성화된 바이러스 백신접종된 마우스와 비교하여 감소된 폐 바이러스 부하와도 연관된다. 마찬가지로, 현재 사용되는 2가 인플루엔자 백신의 단일 투여는 A/PC 또는 A/PR8 챌린지에 대해 보호를 제공하지 못한다.
감마선으로 불활성화된 A/PC로 얻어지는 보호 수준을 얻기 위해서는 3배 이상 용량의 포르말린 불활성화 A/PC (9.6 x 106 PFU 등가물, 2300 HAU)와 다중 면역이 필요하였다. 또한, 포르말린 불활성화 A/PC는 상동성 (헤테로서브타입에 대해서가 아니라) 바이러스 챌린지에 대해서만 보호를 제공한다. 그러므로, 면역의 용량과 빈도의 증가 만이 포르말린으로 불활성화된 바이러스의 균주 특이성 면역을 개선한다. 균주 특이성 면역성을 얻기 위해 감마선 조사된 A/PC를 위한 단일 프라이밍과는 대조적으로, 포르말린으로 불활성화된 바이러스 제제는 비교할 만한 HAU 용량과 3중 면역을 위해 3배 이상의 PFU를 필요로 하기 때문에, 불활성화된 바이러스 입자에 있어서, 감마선으로 불활성화된 바이러스가 포르말린으로 불활성화된 바이러스 보다 더 면역원성이 있다는 것에 주목하여야 한다. 이러한 사실은 감마선 불활성화가 다른 방법과 관련하여 우수한 항원성과 면역원성을 유지하는 것을 입증하는 것이다. 따라서 감마선 불활성화된 바이러스는 정량적으로 뿐만 아니라 정성적으로도 포르말린 처리 또는 UV 조사에 의해 불활성화된 바이러스 제제 보다 월등한 면역성을 유발할 수 있다.
유행성 전염병의 경우에, 감마선 조사된 바이러스에 의해 확신되는 단일 투여 요법은 보조제까지 필요한, 다중의, 고용량 포르말린 불활성화된 인플루엔자 백신 면역 요법 보다 비교할 수 없이 바람직하다. 또한, 감마선으로 불활성화된 인플루엔자에서는 보조제가 필요없다는 사실은 안정성 문제가 거의 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 명반(Alum)은 사람 백신에 가장 빈번하게 사용되는 보조제이지만 인플루엔자 백신 항원의 면역원성을 증강하는데 비효과적인 것으로 입증되었다. 또한, 명반은 감마선으로 불활성화된 바이러스의 효능을 감소시킬 수 있는 T 헬퍼 (Th) 타입 2-지지된 체액 면역 반응에 대한 면역 반응을 왜곡하며, 후자는 헤테로서브타입 보호와 연관된 Tc 세포 반응 등의 Th1-타입 세포 면역 반응을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 또한, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 효능은 단일 투여의 비강내 프라이밍 후에 면역된 마우스가 50 x LD50까지의 헤테로서브타입 챌랜지 용량을 강력한 면역성을 유발하면서 3개월까지 지속할 수 있다는 사실에 의해 주목되었다.
감마선 조사된 바이러스에 의해 유발된 교차보호는 점막 Tc 세포 반응에 의해 매개되는 것으로 추측된다. 임의의 가설은 내부 바이러스 단백질에 대한 교차반응 분비 IgA 항체의 유도이다. 일부 분비성 IgA 항체는 감염된 상피세포에 트랜스사이토시스(transcytosis)되는 동안 인플루엔자 바이러스의 세포내 중성화할 수 있고, 본 발명의 데이터는 교차보호 Tc 세포가 불활성화된 인플루엔자 바이러스의 다른 형태로서 여기에서 관찰된 교차보호에 반응할 수 있고 인플루엔자 면역 Tc 세포 반응에 프라임할 수 없음을 시사한다. 또한, 감마선 불활성화는 포르말린 또는 UV 불활성화 보다 헤마글루티네이션에 대한 영향이 거의 없다. 감마선 조사된 바이러스는 그의 자연 형태와 유사한 항원을 유지하면서 적어도 부분적으로 그의 우수한 항원성을 차지하는 것으로 보인다. 비강내 투여는 호흡기관에서 면역성을 유발하는 림프기관과 연관된 폐 점막을 목표로 한다. 그러나, 이전에 판매된 비강내 투여되는 인플루엔자 백신은 수많은 벨 마비(Bell's palsy)-안면마비 증가와 연관되어 (Mutsch, et ai, (2004), "Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland", The New England journal of medicine, 350: 896-903 참조), 결국 이 백신 제제는 판매가 중지되었다. 이러한 부작용은 사용된 점막 보조제에서 기인되었다: Escherichia coli 열 불안정성 독소. 이러한 안전성에 대한 우려는 백신 제형에 잠재적으로 유해한 보조제를 포함할 필요가 없는 감마선 불안정화된 인플루엔자 백신에서는 일어나지 않는다.
관찰된 강한 보호 효능 이외에, 몇가지 추가 요인이 인플루엔자 백신에 대한 감마선 조사의 매력에 기여한다. 첫 째로, 동결건조된 감마선 불안정화 A/PC는 그의 교차보호 특성을 유지한다. 건조 분말 제형은 다양한 저장 조건 하에서 액체 제형과 비교하여 안정성을 개선하여 유행성 전염병의 백신 배포에서 상당한 이점을 제공한다. 두 번째로, 거의 연습이나 의료 전문가를 필요로 하지 않는 비강내 전달 경로는 개발도상국에서 다른 이점을 제공할 수 있다. 세 번째로, 감마선으로 불활성화된 인플루엔자 백신은 다른 백신 제조 공적과 비교하여 제조가 비교적 용이하고 비용이 높지 않다. 가장 중요하게 제조 방법과 입수성과 관련하여, 감마선으로 불활성화된 인플루엔자로 유발된 강력한 헤테로서브타입 보호가 인플루엔자 백신의 연례 재처방을 구식화할 수도 있다.
실시예 6 감마선 조사를 위한 인플루엔자 바이러스 제제
현재 인플루엔자 백신에서 사용되는 바이러스는 일반적으로 바이러스 항원의 손실 및/또는 비리온 구조의 파괴와 관련된 초원심분리를 사용하여 감쇠 전에 정제된다. 감마선 조사된 인플루엔자 백신에 의한 세포독성 T 세포 반응 유도는 비리온 구조의 온전성을 보존하는 감마선 조사 이전에 선택적인 바이러스 정제 방법(분별/접선방향 여과)에서 유리하다.
바이러스 스톡은 저속(~3000rpm)의 원심분리를 사용하여 정화하고 크기 배제 원심분리를 사용하는 것으로 예상된다. 정화된 스톡은 50 내지 80 nm의 기공 크기를 가지는 필터 장치로 스핀된다. 일반적으로 인플루엔자 바이러스의 크기는 80 내지 120 nm이다. 그러므로, 저속 원심분리(4000-10000 rpm)(가변적인 속도를 사용 가능)에서 인플루엔자 바이러스를 정제하기 위해 가변적인 기공 크기(예를 들면, 80nm 미만)가 4 ℃에서 필터를 통과하는 액체를 얻는데 필요한 만큼 동안 사용된다. 필터의 상부에서 초기 바이러스 스톡 액체의 흐름 경로는 필터 표면에 접선방향이거나 또는 교차한다. 원심분리에서 액체의 대부분이 필터를 통과(투과액)하게 되고 소량이 농축물로서 중심 저장소에 남게된다(모든 바이러스 함유).
농축물은 삼투압을 유지하고 결과적으로 바이러스 온전성을 유지하기 위해 당(덱스트란, 슈크로스)를 포함하는 PBS(생리 식염수 또는 다른 매질)로 다시 희석된다. 이렇게 희석된 제제는 필요하다면 다시 여과된다. 최종 원심분리 단계에서 농축된 바이러스를 상기한 실시예에 기술된 바와 같이 감마선 조사 처리한다. 감마선을 조사하는 동안 바이러스 게놈을 불활성화하면서 바이러스 단백질에 가능한 손상을 줄이기 위해 조사 전에 정제된 바이러스 스톡에 Ascorbate와 같은 자유 래디컬 스캐빈저를 추가할 수 있다. 예를 들면 감마선 조사에 사용되는 완전한 인플루엔자 바이러스의 정제를 위해 다음과 같은 방법을 사용할 수 있다:
1. 인플루엔자 바이러스 스톡을 수정란 또는 시험관내 조직 배양물에서 수거할 수 있다.
2. 300 Kd의 기준을 가지는 필터 장비를 사용하여, 바이러스 스톡을 4 ℃에서 30분 동안 300 g으로 원심분리하여 인플루엔자 바이러스와 요막액(또는 조직 배양 매질)의 단백질을 유발하여 필터를 통과시켜 정화할 수 있다.
3. 100 Kd의 기준을 가지는 필터 장비를 사용하여, 정화된 바이러스 스톡을 4 ℃에서 30분 동안 300 g으로 원심분리하여 정제할 수 있다. 이 단계에서 인플루엔자 바이러스는 필터의 한쪽 면에서 필터를 통과하지 않는다(그리하여 바이러스를 농축).
4. 농축된 바이러스를 생리식염수(또는 완충된 매질)로 세척하여 남아있는 난단백질을 제거한다(세척은 필요하다면 여러 회 수행할 수 있다. 농축된 바이러스를 식염수로 희석하고 상기 단계 3에 기술된 바와 같이 원심분리하여 세척을 수행할 수 있다.
5. 최종 바이러스 농축물은 온전한 비리온을 포함한다.
일반적으로, 상기 기술에서 사용되는 필터 장치의 기공 크기는 비리온 크기 80 내지 120 nm에 적합하도록 설계될 수 있다. 모든 과정은 4 ℃에서 실시될 수 있으며 한외여과는 필요하지 않다. 바이러스 감염성은 원래의 스톡과 최종 생성물에 대해 시험할 수 있다. 바이러스 적정가와 부피에 대한 사전 지식은 농축 수준을 추정하는데 도움이 될 수 있다. 최종 생성물의 순도는 생화학적 표준 분석으로 측정될 수 있다.
참고 문헌
본 출원은 2008년 8월 1일자로 출원된 미국 가 특허출원 제61/085,802호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 출원은 여기에 참조를 위해 포함되어 있다.

Claims (34)

  1. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스가 대상에게 비강내 투여하기 위해 제제화된, 대상에서 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약학적 제제.
  2. 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스가 대상에게 비강내 투여하기 위해 제제화된, 대상에서 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 교차반응 면역성을 유발하거나 증강하는 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스의 치료학적으로 유효한 양을 포함하는 약학적 제제.
  3. 제2항에 있어서, 교차반응 면역성이 교차반응 세포 면역성과 교차반응 체액 면역성을 포함하는 약학적 제제.
  4. 제3항에 있어서, 교차반응 세포 면역성이 다음 중 하나 또는 모두를 포함하는 약학적 제제:
    (i) 교차반응 헬퍼 T 세포 반응
    (ii) 교차반응 세포독성 T 세포 반응.
  5. 제1항에 있어서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스가 접선방향/교차유동 여과에 의해 정제된 바이러스 스톡으로부터 제조된 약학적 제제.
  6. 제1항에 있어서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스가 동결된 바이러스 제제를 감마선 조사하여 생성된 약학적 제제.
  7. 제1항에 있어서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스가 동결건조된 형태로 제조된 약학적 제제.
  8. 제1항에 있어서, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입이 하나 이상의 사람, 조류, 돼지, 개 또는 말의 인플루엔자 바이러스 서브타입을 포함하는 약학적 제제.
  9. 제1항에 있어서, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입이:
    (i) 인플루엔자 A 서브타입 HPAI A(H5N1); 또는
    (ii) 인플루엔자 A 서브타입 H1N1 09 돼지 플루를 포함하는 약학적 제제.
  10. 제1항에 있어서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스가 A/WSN [H1N1], A/PR8 [H1N1], A/JAP [H2N2] 및 A/PC [H3/N2]로 구성되는 군에서 선택된 약학적 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스가 총 조사량 6.5 X lO4 rad 내지 2 X 107 rad의 감마선에 바이러스를 노출하여 생성된 약학적 제제.
  12. 인플루엔자 바이러스 제제를 감마선 조사에 의해 불활성화시키는 것을 포함하는, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대해 교차반응 면역성을 유발할 수 있는 비강내 인플루엔자 백신의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 제제가 감마선 조사에 의한 불활성화 이전에 접선방향/교차유동 여과에 의해 정제되는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 제제가 동결 상태에서 감마선 조사되는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 감마선 조사에 의한 불활성화 후에 바이러스를 동결건조하는 추가 단계를 포함하는 방법.
  16. 제12항에 있어서, 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입이:
    (i) 인플루엔자 A 서브타입 HPAI A(H5N1); 또는
    (ii) 인플루엔자 A 서브타입 H1N1 09 돼지 플루를 포함하는 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화가 총 조사량 6.5 X lO4 rad 내지 2 X 107 rad의 감마선에 바이러스를 노출하는 것을 포함하는 방법.
  18. 치료학적으로 유효량의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 대상에게 비강내 투여하는 것을 포함하는, 비인간 대상에서 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 의한 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
  19. 치료학적으로 유효량의 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스를 대상에게 비강내 투여하는 것을 포함하는, 비인간 대상에서 다중 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 교차반응 면역성을 유발하거나 증강하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 감마선 조사된 인플루엔자 바이러스가:
    (i) 접선방향/교차유동 여과에 의해 정제된 바이러스 스톡으로부터 제조되거나;
    (ii) 동결된 바이러스 제제를 감마선 조사하여 생성되거나;
    (iii) A/WSN [H1N1], A/PR8 [H1N1], A/JAP [H2N2] 및 A/PC [H3/N2]로 구성되는 군에서 선택되거나; 또는
    (iv) 총 조사량 6.5 X lO4 rad 내지 2 X 107 rad의 감마선에 바이러스를 노출하여 생성된 방법.
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