CN102170902B

CN102170902B - 流感疫苗

Info

Publication number: CN102170902B
Application number: CN200980138757.4A
Authority: CN
Inventors: 穆罕默德·阿尔沙利费; 阿诺·穆立巴彻尔
Original assignee: Gamma Vaccines Pty Ltd
Current assignee: Gamma Vaccines Pty Ltd
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: KR101707569B1; CA2733356C; US10251947B2; US20110150926A1; MY172788A; JP2011529856A; JP5689796B2; US20150283224A1; WO2010012045A8; WO2010012045A1; EP2318044B1; RU2011107757A; AU2009276304B2; ZA201100962B; EP2318044A4; KR20110053345A; CN102170902A; CA2733356A1; EP2318044A1; AU2009276304A1

Abstract

本发明涉及用于治疗或预防个体流感病毒感染的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的γ-照射的流感病毒。

Description

流感疫苗

发明领域

本发明涉及用于预防和治疗流感病毒感染的组合物和方法。更具体地，本发明涉及用于引发对流感病毒的交叉反应性免疫的疫苗组合物和方法。

发明背景

流感是由呼吸道感染流感病毒导致的高接触性传染病。它能够导致潜在性的威胁生命的并发症，特别是在婴幼儿和老年人。

防止由同源病毒引起的再次感染主要通过中和抗体来介导，但从流感病毒感染中恢复需要细胞毒性CD8+T(Tc)细胞应答。对抗流感病毒的目前的疫苗主要是灭活全病毒或亚单位制剂，其中病毒的感染性通过化学处理灭活。这些疫苗几乎全部都是通过诱导中和抗体靶向易于发生频繁的抗原性变异(诸如HA和NA)的病毒表面糖蛋白起作用。病毒表面糖蛋白呈现出的频繁的抗原性变异表明，直接针对它们的疫苗没有引起广泛的交叉反应性免疫应答，因此不能预防多种流感病毒亚型和病毒株。由于提供较少的或没有提供对抗由流感病毒的频繁的抗原性漂移和/或转移产生的新亚型/病毒株的保护性免疫，基于抗体的疫苗的保护价值是受限的。此外，这种疫苗给予病毒表面糖蛋白的选择性压力促进了使疫苗失效的抗原性变异。

目前的流感疫苗的配制基于“有根据的推测”，该“有根据的推测”通过比较目前流行的人类流感病毒株和已知的分离的病毒株建立。然而，可以在特定流感季节导致感染的流感病毒株预测并不适合预计的由病毒突变引起的抗原变异性。此外，虽然发生病毒突变和与之相关的抗原性变异会降低疫苗的功效，但错误的预测会使疫苗失效。2007-2008年度流感季的北半球流感疫苗制剂(A/SolomonIslands/3/2006(H IN1)-样病毒；A/Wisconsin/67/2005(H3N2)-样病毒；以及B/Malaysia/2506/2004-样病毒)说明了这种推测。根据美国疾病预防控制中心，在那次流感季，A型H3N2布里斯班病毒株和B型佛罗里达病毒株是大部分疾病的致病原因，但那些病毒株并未成为疫苗的一部分，疫苗因此失效。

由T-细胞介导的免疫诱导的疫苗接种在减轻流感严重性方面的有益影响已经被大大忽略了。T细胞反应对于从初次流感病毒感染顺利恢复是关键的，以及通过减少感染初期病毒负荷降低疾病严重性。T细胞免疫也是长效的，并且参与激发T细胞反应的抗原决定簇一般来自保守性蛋白(例如，病毒核蛋白和基质蛋白)，其通常不进行病毒的免疫逃避。因此，能够引发T细胞介导的免疫的疫苗是理想的，这种需要不能被目前可用的灭活流感疫苗制剂满足。

而且，用于制备目前可用的流感疫苗的方法包括损害病毒抗原完整性的粗糙处理。例如，超速离心法对病毒抗原具有有害的影响，但常用于在减活前纯化病毒。此外，化学灭活的流感疫苗制剂需要使用解冻的病毒，从而使物理和化学试剂损害抗原性蛋白。因此，对冷冻病毒制剂有效的病毒灭活方法提供了限制抗原降解的优势，这增强了免疫原性。

对能够诱发T淋巴细胞反应的流感疫苗存在需要。特别地，对能够诱发对流感病毒的交叉保护免疫的流感疫苗存在需要，与经常由抗原转移和/或漂移导致的表面抗原变异性无关。

发明概述

在第一方面，本发明提供了治疗或预防个体流感病毒感染的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的经γ-照射的流感病毒。

在第二方面，本发明提供了用于治疗或预防个体流感病毒感染的方法，该方法包括经鼻内给予个体治疗有效量的经γ-照射的流感病毒。

在第一或第二方面的一个实施方案中，流感病毒感染是流感A亚型H5N1感染。

在第一或第二方面的一个实施方案中，流感病毒感染是流感A亚型HPAI A(H5N1)感染。

在第一或第二方面的一个实施方案中，流感病毒感染是流感A亚型H1N1 09猪流感感染。

在第三方面，本发明提供了用于诱发个体针对多种流感病毒亚型的交叉反应性免疫的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的经γ-照射的流感病毒。

在第四方面，本发明提供了用于诱发或增强个体针对多种流感病毒亚型的交叉反应性免疫的方法，该方法包括经鼻内给予个体治疗有效量的经γ-照射的流感病毒。

在第三或第四方面的一个实施方案中，交叉反应性免疫包括交叉反应性细胞免疫。交叉反应性细胞免疫可以包括下述中的一者或两者：

(i)交叉反应性辅助T细胞反应

(ii)交叉反应性细胞毒T细胞反应。

在第三或第四方面的一个实施方案中，交叉反应性免疫可以包括交叉反应性体液免疫。

在第三或第四方面的一个实施方案中，多种流感病毒亚型包括人、禽、猪、犬或马流感病毒亚型的一种或多种。禽流感病毒亚型可以包括流感病毒亚型H5N1。

在第三或第四方面的一个实施方案中，多种流感病毒亚型包括流感A亚型HPAI A(H5N1)。

在第三或第四方面的一个实施方案中，多种流感病毒亚型包括流感A亚型H1N1 09猪流感。

在第五方面，本发明提供了诱发或增强个体针对流感病毒的T细胞免疫反应的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的经γ-照射的流感病毒。可以诱发或增强针对流感亚型H5N1的T细胞免疫反应。T细胞免疫反应可以包括下述中的一者或两者：

(i)辅助性T细胞免疫反应

(ii)细胞毒性T细胞免疫反应。

在第五方面的一个实施方案中，诱发或增强针对流感A亚型HPAI A(H5N1)的T细胞免疫反应。

在第五方面的一个实施方案中，诱发或增强针对流感A亚型H1N109猪流感的T细胞免疫反应。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的一个实施方案中，经γ-照射的流感病毒是流感A病毒。流感A病毒可以选自A/WSN[H1N1]，A/PR8[H1N1]，A/JAP[H2N2]和A/PC[H3/N2]。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的一个实施方案中，经γ-照射的流感病毒是人畜共患流感病毒。人畜共患流感病毒可以是人畜共患流感A病毒。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的一个实施方案中，经γ-照射的流感病毒以冻干形式制备。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的一个实施方案中，经γ-照射的流感病毒从通过切向/错流过滤纯化的病毒储备物制备。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的一个实施方案中，经γ-照射的流感病毒通过γ-照射冷冻的病毒制剂来产生。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的一个实施方案中，经γ-照射的流感病毒通过将所述病毒暴露于总剂量为约6.5X 10⁴拉德(拉德)至约2X 10⁷拉德的γ射线来产生。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一个实施方案中，经γ-照射的流感病毒通过将所述病毒暴露于总剂量为约1X 10⁶拉德的γ射线来产生。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的另外实施方案中，经γ-照射的流感病毒以多次分别的剂量给予。出于再接种的目的，多次分别剂量的一次或多次可以作为加强剂给予。

在第一、第二、第三、第四或第五方面的另一实施方案中，将治疗有效量的经γ-照射的流感病毒与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂一起给予。

在第六方面，本发明提供了制备流感疫苗的方法，该方法包括通过γ-照射灭活流感病毒制剂。

在第六方面的一个实施方案中，流感病毒制剂在通过γ-照射灭活前通过切向/错流过滤来纯化。

在第六方面的一个实施方案中，流感病毒制剂在冷冻同时进行γ-照射。

在第六方面的一个实施方案中，该方法包括通过γ-照射灭活后冻干所述病毒的另外步骤。

在第六方面的一个实施方案中，疫苗配制为鼻内给药。

在第六方面的一个实施方案中，流感病毒诱发针对多种流感病毒亚型的交叉反应性免疫。

在第六方面的一个实施方案中，多种流感病毒亚型包括流感A亚型HPAI A(H5N1)。

在第六方面的一个实施方案中，多种流感病毒亚型包括流感A亚型H1N1 09猪流感。

在第六方面的一个实施方案中，灭活包括将上述病毒暴露于总剂量为约6.5X 10⁴拉德至约2X 10⁷拉德的γ射线。

在第六方面的一个实施方案中，灭活包括将上述病毒包括于总剂量为约1X 10⁶拉德的γ射线。

在第六方面的另一实施方案中，流感疫苗诱发针对多种流感病毒亚型的交叉反应免疫。流感病毒亚型可以包括流感病毒亚型H5N1。

在第六方面的另一实施方案中，流感病毒的制剂包括流感A病毒。

在第七方面，本发明提供了经γ-照射的流感病毒制备用于治疗或预防流感病毒感染的药物的用途。

在第七方面的一个实施方案中，药物配制为用于鼻内给药。

在第七方面的另一实施方案中，治疗或预防的流感病毒感染是流感病毒亚型H5N1感染。

在第七方面的一个实施方案中，药物诱发针对多种流感病毒亚型的交叉反应性免疫。多种流感病毒亚型包括流感A亚型HPAI A(H5N1)。多种流感病毒亚型包括流感病毒亚型H1N1 09猪流感。

在第七方面的一个实施方案中，药物是疫苗。疫苗可以诱发针对多种流感病毒亚型的交叉反应性免疫。

在第七方面的一个实施方案中，经γ-照射的流感病毒是流感A病毒。

在第八方面，本发明提供了用于治疗或预防流感感染的经γ-照射的流感病毒。

在第九方面，本发明提供了按照第六方面的方法制备的疫苗。

附图简要说明

下面将仅通过实施例的方式，结合附图描述本发明的优选实施方案，在这些附图中：

图1是柱状图，显示了鼻内感染A/JAP(50HAU/小鼠)后经静脉接种疫苗的动物的体重降低。来自显示在表5中的组别的小鼠在感染后6天称重。

图2显示了来自未接触抗原的和γ-flu疫苗接种的小鼠的肺组织经免疫组化染色的代表性显微照片。显示了γ-flu(γ-照射的流感病毒)接种对以下小鼠的肺部炎症的影响：(A)未接触抗原的小鼠，(B)A/WSN后第6天的未接触抗原的的小鼠，(C)接种γ-flu并用同源株A/WSN攻击的小鼠，以及(D)接种γ-flu并用异源株A/PC攻击的小鼠。

图3是柱状图，说明了γ-flu接种对CD8+T浸润的影响。模拟的或γ-照射的流感病毒(γ-A/WSN，γ-A/JAP，γ-A/Pc)用于静脉接种动物。四周后，小鼠经鼻内用A/WSN攻击。A/WSN攻击后6天，处死来自每组的3只小鼠，并通过FACS评估总肺浸润中的CD8+T细胞的百分比。

图4提供了一系列的柱状图，显示了由γ-flu诱发的交叉反应性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。BALB/c小鼠用A/WSN，γ-A/WSN，A/PC，或γ-A/Pc感染或接种，并检测它们的脾细胞针对A)模拟的，(B)A/WSN-感染的，(C)A/PC-感染的和(D)NPP-标记的P815靶标的杀伤活性。

图5提供了一系列的柱状图，显示了由γ-flu诱发的交叉反应性细胞毒T细胞反应。检测了来自感染了或接种了A/PR8，γ-A/PR8，A/PC或γ-A/PC的BALB/c小鼠的脾细胞对模拟的(数据未显示)，(A)A/PC[H3N2]-感染的，(B)A/PR8[H1N1]-感染的，(C)A/JAP[H2N2]-感染的和NPP-标记的P815靶标的杀伤活性。

图6显示了一系列的图，显示了小鼠用致死剂量的A/PR8攻击后的死亡率。以下组别的小鼠经鼻用3x10²HAU(2x 10⁵pfu/小鼠)的A/PR8攻击：(A)未接触抗原的(未接种疫苗的)，(B)用A/PR8γ-flu鼻内接种疫苗的(n＝10)，(C)用A/PC γ-flu鼻内接种疫苗的(n＝10)以及(D)用福尔马林灭活的A/PC鼻内接种疫苗的(n＝8)。攻击后21天监测体重降低和死亡率(E)。个别小鼠体重追踪的结束提示动物死亡。

图7显示了一系列图，显示了用γ-flu的鼻内疫苗接种对异型病毒攻击提供了更好的保护。10只BALB/c小鼠的组别模拟处理(A)或用γ-A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)静脉内接种(B)或鼻内接种(C)。3周后，小鼠用致死剂量(6x 10²PFU)的A/PR8鼻内攻击，每天记录体重，记录21天。模拟处理的或鼻内、静脉、腹腔或皮下接种疫苗并如(A-C)被攻击的小鼠的30％体重降低确定的存活率(D)，以及监测21天。

图8显示了一系列图，显示了鼻内感染H5N1(A/越南/1203/2004)后的体重降低。监测感染的小鼠的体重降低和死亡率。个别小鼠的体重追踪的结束提示由于体重降低约25％被处死。

图9示出了两张图，显示了BALB/c小鼠用H5N1攻击后的体重和死亡率。10只小鼠的组别(A)模拟处理或(B)用γ-A/PR8[H1N1]鼻内接种。每天记录体重，记录21天。

图10提供了一系列图，显示了被动血清转移未能将由γ-照射的A/PC诱发的异亚型免疫转移到未接触抗原的小鼠。(A，B & C)＝体重降低；(D)＝死亡率；终点：25％重量减低；^*P＜0.05vs.对照预免疫血清组；Fisher′s精确检验。

图11提供了一系列的图，显示了在B细胞缺陷的小鼠中，异亚型保护的缺乏。(A)＝未接触抗原的小鼠的重量降低；(B)＝免疫的小鼠的重量降低；(C)＝死亡率未接触抗原的/免疫的小鼠。

图12提供了一系列的图，显示了在MHC II缺陷的小鼠中，异亚型保护的缺乏。(A)＝未接触抗原的小鼠的重量降低；(B)＝免疫的小鼠的重量降低；(C)＝死亡率未接触抗原的/免疫的小鼠。

图13提供了一系列的图，显示了在β2M缺陷的小鼠中，异亚型保护的缺乏。(A)＝未接触抗原的小鼠的重量降低；(B)＝免疫的小鼠的重量降低；(C)＝死亡率未接触抗原的/免疫的小鼠。

图14提供了一系列图，显示了过继性转移的T细胞而非B细胞保护小鼠免受异亚型攻击。(A；B & C)＝体重降低；(D)＝死亡率；^*P＜0.05vs.对照nil组；Fisher′s精确检验。

图15提供了一系列的图，显示了在穿孔素缺陷的小鼠中，异亚型保护的缺乏。(A&B)＝重量降低；(C)＝死亡率。

图16提供了一系列图，显示了在II型IFN受体敲除的小鼠中的异亚型保护。(A，B)＝体重降低；(C)＝死亡率；^*P＜0.05vs.对照nil组；Fisher′s精确检验。

图17提供了两幅图，显示了在免疫的小鼠的血清中，没有交叉中和活性(A)＝针对A/PC(H3N2)的病毒中和活性(B)＝针对A/PR8(H1N1)的病毒中和活性。

图18提供了两幅图，显示了由γ-照射的A/PC诱发的初级Tc细胞反应的剂量依赖。(A，B)＝免疫后6天收获的脾细胞。误差棒代表平均百分比+S.D。特异性溶解值从效应器：靶标比为60∶1的回归线内插。

图19是显示再次离体Tc细胞反应的图。特异性溶解值从效应器：靶标比为40∶1的回归线内插。

图20提供了一系列图，显示了经γ-照射的流感病毒A/PC保护小鼠抵抗同源和异亚型的攻击。(A，F)＝模拟处理的；(B，G)＝用福尔马林灭活的A/PC鼻内免疫；(C，H)UV灭活的A/PC鼻内免疫；(D，I)＝γ-射线灭活的A/PC鼻内免疫；(E，J)＝20天后的存活率；^*P＜0.05vs.对照未接触抗原的组；Fisher′s精确检验。

图21提供了一系列图，显示了福尔马林灭活的流感病毒A/PC的多重免疫对于诱发同源保护是必需的。(A，F)＝模拟处理的；(B)＝用福尔马林灭活的A/PC免疫一次；(C)用福尔马林灭活的A/PC免疫两次；(D，G)＝用福尔马林灭活的A/PC免疫三次；(E，H)＝20天后的存活率；^*P＜0.05vs.对照未接触抗原的组；Fisher′s精确检验。

图22提供了一系列图，显示了三价流感疫苗不能提供针对漂移株的保护。(A，D)＝未接触抗原的(B，E)＝免疫的；(C，F)＝20天后的存活率。

图23提供了同源攻击后的免疫组化染色的肺组织的代表性显微照片。(A)＝未接触抗原的肺；(B)＝未接种疫苗的(感染的)；(C)＝γ-A/PC接种的(攻击的)；(D)＝福尔马林-A/PC接种的(攻击的)；E＝UV-A/PC接种的(攻击的)。

图24提供了异亚型攻击后的免疫组化染色的肺组织的代表性显微照片。(A)＝未接触抗原的肺；(B)＝未接种疫苗的(感染的)；(C)＝γ-A/PC接种的(攻击的)；(D)＝福尔马林-A/PC接种的(攻击的)；E＝UV-A/PC接种的(攻击的)。

图25是显示了多种灭活的病毒制剂不预防流感病毒感染的图，但用γ-射线灭活的A/PC的免疫导致早期的病毒清除。

图26是显示了由活的和灭活的A/PC诱发的Tc细胞反应的比较的图。显示了两组小鼠的平均值±SD。特异性溶解值从效应器∶靶标比为50∶1的回归线内插。N.D.：未检测到。

图27提供了一系列的图，显示了用γ-照射的A/PC的鼻内免疫提供了针对高剂量A/PR8致死攻击的保护。(A，C)＝用LD50A/PR8攻击的小鼠；(B，D)＝用5x LD50A/PR8攻击的小鼠；(E)＝用50xLD50A/PR攻击的小鼠.(F)＝20天后的存活率和体重降低。^*P＜0.05vs.对照未接触抗原的组；Fisher′s精确检验。

图28提供了一系列的图，显示了γ-照射的A/PC的异亚型保护特性在干燥冷冻过程后保持。(A)＝模拟处理的；(B)＝用异亚型株A/PR8攻击的；(C)＝20天后的存活率和体重降低。^*P＜0.05vs.对照未接触抗原的组；Fisher′s精确检验。

图29提供了一系列图，显示了γ-照射的A/PC的异亚型保护特性在干燥冷冻过程后保持。(A)＝模拟处理的；(B)＝用冻干的γ-射线灭活的A/PR8攻击的；(C)＝20天后的存活率和体重降低。^*P＜0.05vs.对照未接触抗原的组；Fisher′s精确检验。

定义

如本申请所用的，单数形式的“a”，“an”和“the”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“a植物细胞”还包括多个植物细胞。

如本文所用的，术语“包括(comprising)”意指“包括(including)”。单词“包括(comprising)”的变体，诸如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”具有对应的各种含义。因此，例如，“包括(comprising)”编码蛋白序列的多核苷酸可以专有地由该序列组成，或者可以包括一种或多种另外的序列。

术语“交叉反应性免疫”和“交叉保护性免疫”在本文中可互换使用，具有相同的意指含义。

如本文使用的，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”包括IgG(包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD，IgE，或IgM，以及IgY、完整抗体，包括单链完整抗体和其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括，但不限于Fab，Fab′和F(ab′)2，Fd，单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键-5连接的Fvs(sdFv)和包括VL或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物来源。抗原结合抗体片段，包括单链抗体，可以包含单独的可变区或与以下完整的或部分的铰链区、CH1，CH2和CH3结构域组合的可变区。还包括可变区和铰链区、CH1，CH2和CH3结构域的任一组合。抗体可以是单克隆的、多克隆的、嵌合的、多特异性的、人源化的、和人单克隆的以及多克隆的抗体，其特异性地结合生物分子。

本文现有技术文件的描述或本文来自或基于这些文件的陈述不是承认文件或衍伸的陈述在澳大利亚或其他地方是本领域公知常识的一部分

出于描述的目的，本文引用的所有文件都通过引用的方式并入本文，除非特别声明。

详细描述

目前可用的流感疫苗主要诱发体液反应(来自B细胞的抗体反应)。那些反应主要针对病毒表面的糖蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)，其由于突变经历频繁的抗原变异。因此，现有流感疫苗的显著缺点是几乎没有或没有提供针对新流感病毒亚型/株的保护，所述亚型/株源自频繁的抗原漂移和/或转移。

相比之下，针对流感病毒的T细胞反应主要针对内部病毒蛋白。这些蛋白在所有流感病毒亚型中是高度保守的，对突变较不敏感。因此，诱导T细胞反应的疫苗更可能提供对新产生的流感亚型/株的交叉保护性免疫。T细胞反应还是长效的，并且对于从流感感染的有效康复是关键的。因此，诱发T细胞免疫的能力是对灭活流感病毒疫苗的主要期望特性。尽管如此，目前利用的流感疫苗不能诱发T细胞免疫，因此在功效方面实质上是有限的。

本发明通过提供能够诱发针对流感病毒保守性蛋白的T细胞免疫的流感疫苗，提供了克服这些缺点的方法。本发明经γ-照射(γ-照射)的流感疫苗还显示了诱导对不同流感病毒亚型和株的交叉反应性/交叉保护性免疫。

不局限于特定的机制，认为γ-照射对流感病毒表面蛋白的抗原结构和生物完整性的降低的影响使它们的功能结构域是完整的，由此允许宿主免疫细胞对病毒颗粒有效的摄取和脱壳。这进一步可以提供足够的病毒抗原(基质和核蛋白)进入到抗原呈递细胞的细胞质中用于T细胞免疫的有效诱导。此外，可以存在片段化的基因组流感病毒RNA的中途失效的复制/翻译，允许病毒特异性T细胞免疫的触发，因为缺陷性核糖体产物(例如，过早终止和/或错误折叠)被认为是用于MHC I类抗原呈递的病毒抗原的主要来源。γ-照射对病毒颗粒的抗原结构降低的影响还被认为相对于目前使用的疫苗制剂诱发的体液免疫，改善了疫苗受体的体液免疫的幅度和/或质量。

目前在灭活流感病毒疫苗产生中使用的化学治疗(例如，福尔马林或β-丙内酯)与蛋白相互作用并诱导蛋白的交联，与之相比，γ-照射被认为通过在遗传物质中产生链断裂来灭活病毒感染性。γ-照射与化学剂相比，还具有进入和穿过生物材料的高渗透性的优点。此外，γ-照射能够用于灭活流感病毒的冷冻制剂，促进疫苗生产期间病毒抗原的保存。

组合物和疫苗

本发明提供了组合物和疫苗，包括经γ-照射的流感病毒。组合物和疫苗可以包括经γ-照射的流感病毒的任何亚型或株。还可以包括两种或更多种株的γ-照射的流感病毒的混合物。用于混合物的株可以来自相同或不同的流感病毒亚型。

本发明的组合物和疫苗可以包括单一的经γ-照射的流感病毒株，或者不同γ-照射的流感株的混合物。流感株可以衍生自正粘病毒(Orthomyxoviridae)科的任何属。例如，流感株可以来自流感病毒A属(A型)，流感病毒B属(B型)或流感病毒C属(C型)的亚型。

流感病毒A的优选亚型包括但不限于H1N1(例如，H1N1 09猪流感)，H1N2，H1N7，H2N2，H3N1，H3N2，H3N8，H4N8，H5N1(例如HPAI A(H5N1))，H5N2，H5N3，H5N8，H5N9，H6N5，H7N1，H7N2，H7N3，H7N4，H7N7，H8N4，H9N2，H10N7，H11N6，H12N5，H13N6，H14N5，以及任何来自流感A型病毒间重排的其他亚型。

本文包括的“H1N1 09猪流感病毒”还被世界卫生组织称为“大流行性流感A(H1N1)”。

在一些实施方案中，本发明的组合物和/或疫苗包括经γ-放射的人畜共患流感病毒株。

用于本发明的流感病毒可以利用本领域已知的方法产生。例如，流感病毒可以通过含胚卵的系列传代衍生，例如，如Coico et al，(Eds)″Current Protocols in Microbiology″，(2007)，John Wiley and Sons，Inc.(特别参见题目为“Influenza：Propagation，Quantification，andStorage(流感：繁殖、量化和储存)”的15G.1单元)中描述的。下文提供了该技术的简单描述。

含胚卵可以在受精后9-12天获得，并用光检查找出气囊孔。然后该卵可以在无菌状态下穿孔，用注射器将种子病毒接种在气囊空隙中。这一操作可以手人工实施或通过机器自动实施。然后可以在湿润的环境中孵育接种的卵大约2至3天。这一阶段结束时，可以将卵维持在约4℃，如果需要的话，以便终止胚胎和辅助尿囊液的澄清。可以去除卵的顶层，刺穿膜，收集尿囊液。同样这可以手工实施，或通过自动化的机器实施。尿囊液可以澄清，例如通过离心以去除细胞碎片和/或在通过γ-照射灭活流感病毒之前或之后进行另外的纯化。可以实现尿囊液的纯化，例如通过温度依赖性吸附到鸡红血细胞(CRBC)、蔗糖梯度分离或者透析。

也适用于制备流感病毒的上述方法的改进，例如，在美国专利号7270990、PCT公开号WO02/067983和PCT公开号WO 2005/113756中有描述。

额外地或可选地，用于本发明的组合物和疫苗的流感病毒可以在细胞培养中产生(参见，例如Furminger，″Vaccine Production″，inNicholson et al.(eds.)，Textbook of Influenza，Chapter 24，pp.324-332and Merten et al.，1996，″Production of influenza virus in cell culturesfor vaccine preparation″，in Cohen & Shafferman(eds.)，NovelStrategies in Design and Production of Vaccines，pp.141 151，UnitedStates Patent No.5824536 and United States Patent 6344354)。

可以用作流感病毒生长的基质的合适细胞系的非限定性实例包括vero细胞、Madin Darby犬肾(MDCK)细胞、PERC6细胞(参见，例如，美国专利号7192759)，鸡胚细胞(例如，鸡胚成纤维细胞)和禽胚细胞系(参见，例如，PCT公开号WO 2006/108846)。可以使用这些细胞系的变体，包括但不限于在美国专利号6825036、美国专利号6455298和PCT公开号WO 2006/108846中描述的那些。

使用细胞系繁殖流感病毒通常会包括在化学限定的培养基中将细胞扩增到所需的量。优选地，培养基是无血清培养基。可以通过将蛋白酶添加到培养基来辅助病毒繁殖。一般地，细胞用流感病毒感染，并孵育一段时间以足以产生所需数目的病毒(例如，几天)。诸如感染复数、孵育时间和温度的参数通常需要被优化用于使用的特定细胞系和/或被繁殖的特定的流感病毒株。本领域普通技术人员可以容易地确定包括上面提及的那些的生长参数的最优化，不需要过度的实验。在孵育期后，如果需要的话，可以收获和纯化病毒。

适于在细胞培养中产生流感病毒的方法的非限定性实例包括美国专利号5698433、美国专利号5753489、美国专利号6146873、美国专利号6455298和美国专利号6951752中描述的那些。

可以增加流感病毒在细胞培养中的产量，例如，通过修饰编码蛋白激酶PKR的细胞基因或(2′-5′)寡腺苷酸(2-5A)合成酶基因(参见，例如，美国专利号6673591和美国专利号6686190)，或者用可选的非结构性蛋白1(NS1)基因修饰病毒骨架(参见，例如PCT公布号WO2005/024039)。另外地或可选地，用于流感病毒增殖的细胞系可以过表达唾液酸转移酶(参见，例如，美国专利号7132271)。

利用上述方法(或者通过任何其他方法)繁殖的流感病毒可以在γ-照射前纯化和/或浓缩。本领域已知的任何适合的方法可以用于该目的。例如，可以通过温度依赖性吸附到鸡红细胞来纯化流感病毒，利用Laver(1969)″Purification of influenza virus″，HKaS NP，(ed)NewYork and London：Academic Press，pp.82-86描述的方法。可选择地，流感病毒可以通过密度梯度离心来纯化(参见，例如，Sokolov et al，(1971)，″Purification and concentration of influenza virus″，Archiv fiirdie gesarate Virusforschung，35，356-363)。

优选地，流感病毒在用γ-照射前利用切向/错流过滤来纯化和/或浓缩。例如，包含病毒的流体可以加载到过滤装置，诸如具有适合孔径(例如，小于约80nm)的膜。流体沿着膜的表面切向用泵汲送(即跨过表面)以及施用压力以强迫一部分流体通过膜到达滤液侧。施用的压力的程度通常是不会负面影响病毒体结构和/或病毒抗原的完整性。包含病毒颗粒的滤液穿过膜，然而流体中的颗粒和大分子太大以至于不能通过膜孔径，被保留在对侧。总之，滞留物(即滞留的组分)不会在膜的表面上聚集，而是通过切向流被冲走。滞留物可以用合适的介质重稀释(例如，含有右旋糖苷和/或蔗糖的PBS)，以及如果需要的话，重复过滤过程。

使用切向/错流过滤纯化用于γ-照射的流感病毒提供了优于目前用于流感疫苗制备的纯化技术(例如，超离心)的优势，因为病毒抗原的完整性被较好地保存。这进一步增强了γ-照射的病毒制剂的免疫原性，以及特别是它们激发针对多种流感亚型和株的交叉反应/交叉保护性免疫的能力。

用于本发明的组合物和疫苗的流感病毒是经γ-照射的。可以使用任何合适的γ-照射来源。方便的γ激发器包括但不限于Ba¹³⁷，Co⁶⁰，Cs¹³⁷，Ir¹⁹²，U²³⁵，Se⁷⁵和Yb¹⁶⁹。

可以利用商购的装置进行流感病毒的γ-照射，例如由AtomicEnergy of Canada Ltd.，Canada生产的Gammacell辐照仪(例如Gammacell 40辐照仪，Gammacell 220辐照仪，Gammacell 1000辐照仪，Gammacell 3000辐照仪)，由J.L.Shepherd and Associates(SanFernando，California，USA)生产的辐照仪，或者Nordion Inc.(Kanata，Ontario，Canada)生产的Nordion γCell-1000辐照仪。其他合适的装置描述于例如美国专利号3557370和美国专利号3567938。

优选地，将流感病毒暴露于足以灭活它的γ-照射剂量。更优选地，γ-照射剂量足以灭活病毒，而基本上不会破坏病毒抗原的结构，特别是基本上不会破坏病毒表面抗原的结构。因此抗原决定簇的免疫原性可以被γ-照射的病毒保留。

因此，在本发明优选的实施方案中，流感病毒用能够灭活病毒γ-照射的剂量处理，同时保持它的抗原结构。优选地，将γ-照射的剂量给予病毒一段时间，给予的水平足以确保所有处理的病毒都被照射，而不会不利地影响病毒抗原决定簇的结构完整性。

例如，流感病毒可以暴露于γ-照射为约I X 10³拉德至约2X 10⁹拉德(或者约10Gy至约2x10⁴kGy)的总剂量。在本发明的某些实施方案中，流感病毒暴露于γ-照射为约1X 10³拉德至约2X 10⁹拉德的总剂量，约1X 10³拉德至约I X 10⁹拉德，约I X 10³拉德至约1X 10⁸拉德，约I X 10³拉德至约1X 10⁷拉德，约1X 10³拉德至约1X 10⁶拉德，约I X 10³拉德至约1X 10⁵拉德，约I X 10³拉德至约I X 10⁴拉德，约1X 10³拉德至约2X 10⁹拉德，约1X 10⁴拉德至约2X 10⁹拉德，约I X 10⁵拉德至约2X 10⁹拉德，约I X 10⁶拉德至约2X 10⁹拉德，约I X 10⁷拉德至约2X 10⁹拉德，约I X 10⁸拉德至约2X 10⁹拉德或约I X 10⁹拉德至约2X 10⁹拉德。在本发明的一个实施方案中，流感病毒暴露于γ-射线为约6.5X 10⁴拉德至约2X10⁷拉德(约0.65KGy至约200kGy)的总剂量。在本发明的优选的实施方案中，流感病毒暴露于γ-照射为约1.26X 10⁶拉德(12.6KGy)的总剂量，γ-照射为约I X 10⁶拉德γ-射线(约10kGy)的总剂量，或γ-照射为约1X 10⁵拉德(1KGy)的总剂量。

γ-照射的最佳剂量可以受诸如病毒存在的介质、待处理的病毒的量、存在的病毒温度和/或处理的病毒的亚型或株等因素的影响。因此，可以最优化γ-照射的总剂量、γ-照射的暴露时间和/或暴露期施用的γ-照射水平以最优化处理的效力。

γ-照射的总剂量可以在一段时间累积给予病毒。例如，可以给予病毒低于总剂量水平的γ-照射一段时间以足以实现所需的γ-照射的总剂量。

在一个实施方案中，流感病毒制剂维持在冷冻状态，同时暴露于γ-照射。这可以有助于保存生物完整性，并且避免病毒抗原不必要的损害，从而增强γ-照射的病毒制剂的免疫原性，具体地，它们激发针对多重流感病毒亚型和株的交叉反应/交叉保护免疫的能力。一般地，10-20kGy的γ-照射剂量对于处理冷冻病毒制剂可以是有效的。

如上提及的，优选用γ-照射处理足以灭活流感病毒，而基本上不破坏病毒抗原的结构。病毒的灭活可以利用本领域公知的方法来评价。例如，病毒感染性可以在γ-照射后测量，通过如上所述的接种胚卵和/或细胞系以确定病毒能否增殖。

抗原决定簇的完整性能够例如通过测定病毒在γ-照射后的血细胞凝集活性来评价。进行血细胞凝集测定的方法是本领域已知的，并且在例如Coico et al，(Eds)″Current Protocols in Microbiology″，(2007)，by John Wiley and Sons，Inc.(具体参见Unit 15G.1 entitled″Influenza：Propagation，Quantification，and Storage″)and Sato et al.，(1983)，″Separation and purification of the hemagglutinins fromBordetella pertussis″，Infect.Immun.，41，313-320中描述过。另外地或任选地，神经酰胺酶测定可以用于评价病毒抗原决定簇的完整性(参见，例如，Khorlin et al，(1970)，″Synthetic inhibitors of Vibrio choleraeneuraminidase and neuraminidases of some influenza virus strains″，FEBS Lett.，8：17-19 and Van Deusen et al，(1983)，″Microneuraminidase-inhibition assay for classification of influenza A virusneuraminidases″Avian Dis.，27：745-50)。另外地，针对可被γ-照射的制剂诱导的内部蛋白的细胞毒T细胞反应可以用作蛋白完整性的指示剂。

包含γ-照射的流感病毒的合适的组合物和疫苗可以按照本领域技术人员已知的方法来制备，并因此可以包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。

在与组合物的其他成分相兼容方面，载体、稀释剂和佐剂必须是“可接受的”，并且对其受体是无害的。

尽管佐剂可以与包括γ-照射的流感病毒的本发明的组合物和疫苗组合，本文提供的实验数据证实，在缺乏佐剂的情况下，相似水平的免疫原性可以利用γ-射线灭活的流感制剂来获得。因此，会理解，尽管佐剂可以包括在本发明的组合物和疫苗中，它们通常是不需要的。因此，可以避免使用佐剂带来的反应原性(reactogenicity)问题。

优选地，佐剂会增强γ-照射的流感病毒诱发和/或增强的免疫反应，由此提高保护性功效。优选地，利用较低剂量的γ-照射的流感病毒，佐剂会能够诱发保护性免疫。

任何合适的佐剂可以包括在本发明的组合物和疫苗中。例如，基于铝的佐剂可以利用。合适的基于铝的佐剂包括，但不限于氢氧化铝，磷酸铝和其组合。其他可以利用的铝基佐剂的特定实例描述于欧洲专利No.1216053和美国专利No.6372223。

水包油乳剂可以用作本发明的组合物和疫苗的佐剂。水包油乳剂是本领域公知的。一般地，水包油组合物包含可代谢的油，例如，鱼油、植物油或合成油。合适的水包油乳剂的实例包括欧洲专利No.0399843、美国专利No.7029678和PCT公布No.WO 2007/006939描述的那些。水包油乳剂可以与其他佐剂和/或免疫刺激剂一起使用。

其他合适的佐剂的非限定性实例包括免疫刺激剂诸如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、单磷脂脂质A(MPL)、霍乱毒素(CT)或其组成亚单位、热不稳定肠毒素(LT)或其组成性亚单位、钟样受体配体佐剂诸如脂多糖(LPS)和其衍生物(例如，单磷酰基脂质A和3-脱酰基单磷酰基脂质A)、胞壁酰二肽(MDP)和呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白。

药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括去离子或蒸馏水，盐水溶液，植物油诸如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅油包括聚硅氧烷，诸如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲苯基聚硅氧烷，挥发性硅酮；矿物油诸如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇(lower aralkanols)；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯诸如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮，琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或阿拉伯胶，以及凡士林。通常，载体或多种载体会形成组合物重量的10％至99.9％。

本发明的组合物和疫苗可以通过标准途径给药，所述途径包括但不限于胃肠外(例如，静脉内、椎管内的、皮下或肌肉内)、口服、粘膜(例如鼻内)或局部途径。

本发明的组合物和疫苗可以为适于通过注射给药的形式，适于口服摄取的制剂形式(诸如例如胶囊、片剂、囊剂、酏剂)，适于局部给药的膏、霜或洗剂形式，适于作为滴眼液递送的形式，使用通过吸入给药的气溶胶形式，诸如通过鼻内吸入或经口吸入，或者为适于胃肠外给药的形式，即皮下、肌肉内或静脉注射。

组合物和疫苗的鼻内给药可以配制为例如作为滴鼻液的液体形式、喷剂，或者适于吸入、作为粉末、作为霜剂、或者作为乳化剂。

对于作为可注射的溶液或悬浮液的给药，无毒的胃肠外可接受的稀释剂或载体可以包括林格氏溶液、等渗盐水、磷酸缓冲盐、乙醇和1，2丙二醇。

用于口服的合适的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、黄蓍胶、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。此外，这些口服制剂可以包含合适的调味剂和着色剂。当用于胶囊形式，胶囊可以包被有延迟崩解的诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的化合物。

佐剂通常包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。另一类型的“自身佐剂”通过将免疫原性肽与脂质偶联来提供，所述脂质诸如水溶性脂肽Pam3Cys或它的二棕榈酰衍生物Pam2Cys。这种佐剂具有伴随免疫原性肽进入抗原呈递细胞(诸如树突状细胞)的优势，由此产生了增强的抗原呈递和同时活化了细胞。这些试剂至少部分通过钟样受体2来发挥作用。(参考文献：Brown LE and JacksonDC，Lipid based self adjuvanting vaccines.Current Drug Delivery，23：83，2005)。

本发明的组合物和疫苗可以包括药学上可接受的赋形剂，诸如合适的佐剂。合适的佐剂可以商购，诸如，例如Freund′s不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，Mich.)；Merck佐剂65(Merckand Company，Inc.，Rahway，N.J.)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，Pa.)；铝盐诸如氢氧化铝胶(alum)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；乙酰化酪氨酸的难溶性悬液；乙酰化糖；阳离子或阴离子衍生的脂多糖；聚磷腈；生物可降解的微球；单磷脂酰脂质A和quil A。诸如GM-CSF或白介素-2，-7或-12的细胞因子也可以用作佐剂。

在本发明的一个实施方案中，佐剂组合物可以包括主要是TH1型的免疫反应。用于激发主要是TH1型反应的合适佐剂包括例如单磷脂酰脂质A，优选3-de-O-乙酰化单磷脂脂质A(3D-MPL)与铝盐一起的组合。例如，组合物或疫苗可以与佐剂AS04一起配制，AS04包含氢氧化铝(alum)和3-O-去乙酰的单磷脂酰脂质A(MPL)，诸如Thoelen，S.，et al.，″A prophylactic hepatitis B vaccine with a noveladjuvant system″Vaccine(2001)19：2400-2403中描述的。其他优先诱发TH1型免疫反应的已知佐剂包括含有寡核苷酸的CpG。寡核苷酸的特征在于CpG二核苷酸是未甲基化的。这种寡核苷酸是公知的，并描述于例如PCT公布号WO 1996/02555中。免疫刺激DNA序列也描述于例如Sato et al.，1996，″Immunostimulatory DNA sequencesnecessary for effective intradermal gene immunization″，Science，273：352-354中。另一优选的佐剂是皂素，优选是QS21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.，Framingham，Mass.)，其可以单独利用或与其他佐剂联合利用。例如，增强的系统包括单磷脂酰脂质A和皂素衍生物的组合，诸如PCT公布号WO 1994/00153描述的QS21和3D-MPL的组合，或者PCT公布号WO 1996/33739中描述的反应原性较差的组合物，其中QS21用胆固醇淬灭。其他优选的制剂包括水包油乳剂和生育酚。PCT公布号WO 1995/17210中描述了包括水包油乳剂中的QS21，3D-MPL和生育酚的佐剂配制。佐剂组合可以包括涉及水包油乳剂中的QS21，3D-MPL和生育酚的制剂，诸如PCT公布号WO 1995/17210中所描述的。在一个实施方案中，组合物包括佐剂Montanide ISA720(M-ISA-720；Seppic，Fairfield，N.J.)，一种基于中性可代谢油的佐剂。

本发明的疫苗和组合物可以根据标准的方法制备，例如，如由Powell和Newman编辑的Pharmaceutical Biotechnology，Vol.61″Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach″，PlenumPress，1995和由Voller等编辑的″New Trends and Developments inVaccines″，University Park Press，Baltimore，Md.，U.S.A.1978所一般描述的。

用于口服的固体形式可以包含人和脊椎动物药学实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、涂布剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、白明胶、玉米淀粉、黄芪胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、胍尔豆胶、黄原胶、皂土、褐藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、鹿蹄草油、樱桃、橙或山莓调味剂。合适的涂布剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物、石蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、苯甲酸甲脂，苯甲酸丙脂或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括甘油单硬酸酯或甘油二硬酸酯。

除上述试剂外，用于口服的液体形式可以包含液体载体。合适的液体载体包括水、油诸如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、落花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙烯醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。

用于口服的悬浮液还可以包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰醇。合适的分散剂包括卵磷脂、诸如硬脂酸的脂肪酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯山梨醇单-或双-油酸酯、硬脂酸或月硅酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单-或双-油酸酯、-硬脂酸或月硅酸酯等。

用于口服的乳剂还可以包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上所示的分散剂或者诸如胍尔豆胶、阿拉伯树胶或黄芪胶的天然胶。

用于制备肠胃外可注射的组合物的方法对本领域技术人员是显然的，并更为详细地描述于，例如，Remington′s Pharmaceutical Science，15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa。

本发明的局部制剂包括活性成分以及一种或多种可接受的载体，以及任选地任何其他的治疗成分。适合用于局部给药的制剂包括液体或半液体制剂，其适用于渗透皮肤到需要治疗的部位，诸如擦剂、洗液、霜剂、软膏或糊剂以及适用于给药至眼睛、耳朵或鼻的滴剂。

根据本发明的滴剂可以包含无菌水性或油性溶液或悬液。这些可以通过将活性成分溶解在杀菌剂和/或真菌剂和/或任何其他合适的防腐剂的水性溶液中来制备，以及任选地包括表面活性剂。得到的溶液可以通过过滤澄清、转移至合适的容器并进行灭菌。灭菌可以通过以下实现：高压灭菌或维持在90℃-I00℃半小时，或者通过过滤，随后通过无菌技术转移至容器。适于包括在滴剂中的杀菌剂和真菌剂的实例是硝酸苯汞或醋酸(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用于制备油性溶液的合适的溶剂包括甘油、稀释的乙醇和丙烯醇。

本发明所述的洗液包括适用于皮肤或眼睛的那些。眼睛洗液可以包含无菌水性溶液，任选地包含杀菌剂，并且可以通过与以上描述的制备滴剂的方法类似的方法来制备。应用于皮肤的洗剂或擦剂还可以包括加速干燥和冷却皮肤的药剂，诸如乙醇或丙酮，和/或润湿剂诸如甘油或诸如蓖麻油或花生油的油。

本发明的霜剂、软膏或糊剂是外用的活性成分的半固体制剂。可以通过将活性成分与油基或非油基混合来制备它们，所述活性成分为单独的精细分割或粉状形式或者在水性或非水性流体的溶液或悬浮液中。基材可以包括烃类，诸如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂、粘液、天然来源(诸如杏仁、玉米、落花生、蓖麻或橄榄油)的油、羊毛脂或其衍生物、脂肪酸诸如硬脂酸或油酸以及诸如丙二醇或macrogol的醇类。

本发明的组合物和疫苗可以包括任何合适的表面活性剂诸如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂诸如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包括悬浮剂诸如中性胶、纤维素衍生物或无机材料诸如硅石，以及其他成分诸如羊毛脂。

本发明的组合物和疫苗还可以以脂质体的形式给药。脂质体一般来自磷脂或其他脂质物质，并且通过分散在水性介质中的单或多-层含水液晶形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学上可接受的和可代谢的液体。脂质体形式的组合物可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，可以是天然的和合成的。形成脂质体的方法是本领域已知的，关于这方面具体参考Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，AcademicPress，New York，N.Y.(1976)，p.33 et seq。

药物和疫苗

本发明还包括用于生产预防流感病毒感染的疫苗的方法。该方法包括通过γ-照射灭活流感病毒制剂。可以生产用于疫苗生产方法的流感病毒制剂，并将其进行γ-照射，如在本节上面中所述的(即″组合物和疫苗″)。

流感病毒制剂可以包含流感A病毒。流感A病毒制剂可以包含来自一种或多种流感A亚型的株，其通常感染人类。流感A株可以在人群中循环。

优选地，本发明的流感疫苗诱发和/或增强针对个体多种流感病毒亚型的交叉反应免疫。最优选地，多种流感病毒亚型包含流感病毒亚型H5N1(例如HPAI A(H5N1))和/或H1N1(例如H1N1 09猪流感)。疫苗可以配制为经鼻给药。

在一个实施方案中，流感病毒制剂包含一种或多种人畜共患流感A病毒株。

在另一实施方案中，流感疫苗配制为经鼻给药。

在一个实施方案中，疫苗制备方法包含通过γ-照射灭活流感病毒制剂(参见，题目为“组合物和疫苗”的上节)。

在一个实施方案中，疫苗制备方法包括通过γ-照射灭活前通过切向/错流过滤纯化流感病毒(参见题目为“组合物和疫苗”的上节)。

在另一实施方案中，疫苗制备方法包括γ-照射冷冻的流感病毒制剂(参见题目为“组合物和疫苗”的上节)。

在另一实施方案中，疫苗制备方法包括通过γ-照射灭活后冻干病毒的步骤(参见题目为“给药途径”的下节)。

在另一实施方案中，疫苗制备方法包括将病毒制剂暴露于总剂量为约6.5X 10⁴拉德至约2X 10⁷拉德的γ射线。

在另一实施方案中，根据本文所述的生产方法产生的疫苗可以用于疫苗接种或用于再接种的目的。

在另一个实施方案中，疫苗生产方法包括将病毒制剂暴露于总剂量为约1X 10拉德的γ射线。

在本发明的一个实施方案中，疫苗可以用于再接种。通常地，再接种在第一次接种后至少6个月进行，适宜地在第一次接种后8至14个月，适宜地在第一次接种后约10至12个月。再接种(或“加强”)可以与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂一起给药。

在一方面，本发明提供了根据本文所述的疫苗生产方法生产的疫苗。

本发明还提供了γ-照射的流感病毒制备用于治疗和/或预防流感病毒感染的药物的用途。γ-照射的的流感病毒可以是任何流感病毒，包括但不限于流感流感A病毒。优选地，药物诱发针对多种流感病毒亚型的交叉反应免疫。在一个实施方案中，药物用于治疗和/或预防流感病毒亚型H5N1(例如，HPAI A(H5N1))和/或H1N1(例如H1N1 09猪流感)感染。在另一实施方案中，药物是疫苗。在优选的实施方案中，药物配制为用于鼻内给药。

本发明还提供了用于治疗或预防流感病毒感染的γ-照射的流感病毒。

治疗方法

本发明提供了治疗或预防个体流感病毒感染的方法。该方法包括给予个体治疗有效量的γ-照射的流感病毒。

经γ-照射的流感病毒可以以本发明的组合物或疫苗的形式给予个体(参见题目为“组合物和疫苗”的上节)。一般地，γ-照射的流感病毒会是免疫原性的。通常地，该方法包括使个体针对流感病毒感染产生免疫。

“个体”是哺乳动物，诸如具有经济的、社会的或研究重要性的任何哺乳动物，包括牛、马、绵羊、灵长类和啮齿类动物。一般地，个体是人。个体可以感染流感病毒，疑似感染流感病毒，以前感染过流感病毒，和/或具有患流感病毒感染的风险。具有流感病毒感染风险的个体可以是例如与感染流感病毒的个体一起工作或照料感染流感病毒的个体的个体。

本文使用的术语“治疗有效量”在其意义内包括无毒的但足够量的用于本发明的组合物或疫苗以提供所需的治疗效应。需要的确切量会在个体间不同，这取决于以下因素：诸如被治疗的病毒亚型/株、个体的年龄和一般状况、被治疗的疾病状态的严重性、被给药的特定药剂和给药的方式等。因此，不可能指定准确的“有效量”。然而，对于任何给定病例，本领域技术人员可以仅利用常规试验来确定合适的“有效量”。

按照本发明的方法，γ-照射的流感病毒(或者包含γ-照射的流感病毒的组合物)的治疗有效量可以以一次剂量给予个体，或者可以以多次剂量给予个体。

一般地术语“治疗有效量”指能够诱发和/或增强针对一种或多种流感病毒株的免疫反应的所述γ-照射的流感病毒(或包含γ-照射的流感病毒的组合物)的量。优选地，针对一种或多种不同亚型流感株诱发和/或增强免疫反应。一般地，治疗有效量给予个体时会在个体诱发免疫反应，以足以在将所述个体随后暴露于流感病毒时减弱感染严重性，或者足以在给予流感病毒感染的个体时减弱一种或多种流感病毒感染症状。会理解，在流感病毒感染时通常观察到的任何一种或多种症状的减弱包括在该含义中，例如，感染持续时间的减少、一种或多种症状持续时间的减少、所述症状诸如发热、头疼、咳嗽、咽喉痛、身体疼痛、肌肉疼痛、鼻塞、咳嗽、喷嚏、发红的眼睛、皮肤、口、喉和鼻，腹泻、呕吐和虚弱。

因此，本发明提供了通过给予治疗有效量的γ-照射的流感病毒(或者包含γ-照射的流感病毒的组合物)治疗所述疾病状态的方法，其中所述疾病状态与流感病毒感染有关。经γ-照射的流感病毒可以是任何合适的γ-照射的流感病毒亚型或株。还包括两种或更多种γ-照射的流感病毒株的混合物的给药。所述株可以来自不同的流感病毒亚型。

流感株可以衍生自正粘病毒(Orthomyxoviridae)科的任何属。例如，流感病毒株可以衍生自流感病毒A属(A型)、流感病毒B属(B型)或流感病毒C属(C型)的亚型。

流感病毒A优选的亚型包括但不限于H1N1(例如H1N1 09猪流感)，H1N2，H1N7，H2N2，H3N1，H3N2，H3N8，H4N8，H5N1(例如HPAI A(H5N1))，H5N2，H5N3，H5N8，H5N9，H6N5，H7N1，H7N2，H7N3，H7N4，H7N7，H8N4，H9N2，H10N7，H11N6，H12N5，H13N6，H14N5，以及来自流感病毒A间重排的任何其他亚型。

在某些实施方案中，本发明的方法中利用的γ-照射的流感病毒株包括经γ-照射的人畜共患流感病毒株。

用于本发明的方法的流感病毒可以利用本领域已知的方法来制备。例如，流感病毒可以通过在含胚卵中连续传代来产生和/或在细胞培养物种产生，该技术在题目为“组合物和疫苗”的上节中被描述。

用于本发明的方法的流感病毒的γ-照射可以通过本领域已知的方法来实施。用于流感病毒γ-照射的合适的方法的实例提供在题目为组合物和疫苗”的上节中。

优选地，个体是人，并且施用的经γ-照射的流感病毒包括已知感染人的流感亚型。可选地，施用的经γ-照射的流感病毒可以包括未知感染人的流感亚型。给药可以是鼻内给药。经γ-照射的流感病毒可以制备为冻干形式(参见，题目为“给药途径”的下节)。给予个体的经γ-照射的流感病毒可以从通过如题目为“组合物和疫苗”的上节中描述的切向/错流过滤纯化的病毒储存物中制备。给予个体的用于制备经γ-照射的流感病毒的病毒储存物可以是在γ-照射期间冷冻的(参见题目为“组合物和疫苗”的上节)。

按照本发明的方法，将经γ-照射的流感病毒给予个体通常会在个体诱发和/或增强抗流感病毒的免疫反应。在本发明的一个实施方案中，可以在之前未暴露于(或未能应答于)流感病毒的未经免疫激发的患者中诱发免疫反应。

在本发明的另一实施方案中，可以在未经免疫激发的患者中诱发免疫反应，所述患者之前未暴露于(或未能应答于)施用的病毒株衍生的特定γ-照射的流感病毒亚型。另外地或可选地，可以在未经免疫激发的患者中诱发免疫反应，所述患者之前未暴露于(或未能应答于)施用的特定γ-照射的流感病毒株。

在本发明的另一实施方案中，可以在个体中增强免疫应答，所述个体之前接触过特定的施用的经γ-照射的流感病毒株，并产生针对该流感病毒株的免疫反应。另外地或可选地，可以在个体增强免疫反应，所述个体之前接触过施用的病毒株衍生的特定经γ-照射的流感病毒亚型，并产生针对该亚型的免疫反应。

优选地，在个体诱发和/或增强的免疫反应是交叉反应性免疫反应。因此，在本发明的优选实施方式中，经γ-照射的流感病毒的特定亚型的给药诱发和/或增强针对其他另外的流感病毒亚型的免疫反应。在优选的实施方案中，一种或多种经γ-照射的病毒株制剂的给药诱发和/或增强针对禽流感亚型H5N1(例如HPAI A(H5N1))和/或H1N1(例如，H1N1 09猪流感)的免疫反应，所述病毒株衍生自目前流通的人流感A亚型。

本发明的方法可以用于诱发和/或增强个体特异于多种流感病毒株的T细胞反应。优选地，所述株衍生自多种不同亚型的流感病毒。一般地，T细胞免疫反应的诱发和/或增强可以包括增强CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的活性。T细胞可以是辅助T细胞(例如，辅助CD4+T细胞)或细胞毒T细胞(例如，细胞毒CD4+T细胞、细胞毒CD8+T细胞)。

T细胞免疫反应在个体的诱导和/或增强可以利用本领域已知的方法来检测。例如，能够测量增加数目的流感病毒特异性T细胞以提供T细胞免疫反应增强或诱导的指示。用于计数和表征病毒特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的方法和计数是本领域已知的。可以利用ELISpot分析方法来检测流感病毒特异性T细胞，利用通常在例如Vogt et al.，2008，″Transcutaneous anti-influenza vaccination promotesboth CD4 and CD8 T cell immune responses in human″，J.Immunol.，180：1482-1489中描述的方法。另外地或可选地，可以通过测量对用流感病毒和/或衍生其的蛋白抗原攻击应答的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞比例来检测流感病毒特异性T细胞。一般地，反应性T细胞在暴露于流感病毒抗原(例如，IL-2，IFN-γ，TNFα和/或CD40L)时分泌一种或多种特异性细胞因子，其可以通过例如细胞内细胞因子染色分析来检测(参见，例如，Vogt et al.，supra and Longhi et al.，2008，″Interleukin-6 Is Crucial for Recall of Influenza-Specific Memory CD4⁺T Cells″，PLoS Pathog.，4(2)：el 000006)。其他用于检测流感病毒特异性T细胞的合适分析方法的实例包括基于四聚物的分析(参见，例如，Longhi et al.，supra and Flynn et al.，1999，″In vivo proliferation ofnaive and memory influenza-specific CD8⁺ T cells″PNAS，96(15)：8597-8602)。

另外地或任选地，本发明的方法可以诱发和/或增强个体对多种流感病毒株特异的体液免疫反应。优选地，病毒株衍生自多种不同亚型的流感病毒。一般地，体液免疫反应的诱发和/或增强可以包括B细胞的活性的增强。这可以通过遇到流感病毒抗原时能够分化为抗体分泌性浆细胞的外周血B淋巴细胞频数的增加来反映。因此，体液免疫的诱发或增强可以包括流感病毒特异性抗体(例如IgA和IgG)在循环中数量的增加。用于检测流感特异性抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Sasaki et al.，2007，″Comparison of the influenzavirus-specific effector and memory B-cell responses to immunization ofchildren and adults with live attenuated or inactivated influenza virusvaccines″，J Virol.2007；81：215-28 and Cox et al.，1994，″An earlyhumoral immune response in peripheral blood following parenteralinactivated influenza vaccination″，Vaccine，12：993-999)。

在优选的实施方案中，按照本文描述的方法，经γ-照射的流感病毒的给药诱发和/或增强个体针对流感病毒的T细胞免疫反应和/或体液免疫反应。在特别优选的实施方案中，一种或多种经γ-照射的人流感A病毒株的给药诱发和/或增强个体针对禽流感H5N1(例如，HPAIA(H5N1))和/或H1N1(例如，H1N1 09猪流感)的T细胞免疫反应和/或体液免疫反应。经γ-照射的人流感A病毒可以经鼻给药。

交叉反应性/交叉保护性免疫

目前流感病毒疫苗靶向高度可变的病毒表面糖蛋白，其由于诱变经历常见的抗原变异。因此，它们保护值显著受限，因为很少或没有提供针对其他流感病毒亚型和/或新产生的亚型的保护。

本发明通过诱发和/或增强针对内部流感病毒蛋白的免疫应答克服了这些缺，。这些蛋白在所有流感病毒亚型中是高度保守的，对变异较不敏感。因此，本发明提供了诱发和/或增强个体针对多种流感病毒亚型的交叉反应性免疫的方法。本方法包括给予个体治疗有效量的γ-照射的流感病毒。交叉反应性免疫可以由交叉反应性T细胞免疫的诱发和/或增强产生。另外地或可选地，交叉反应性免疫可以来自个体交叉反应性体液免疫的诱发和/或增强。

优选地，个体是人，以及施用的经γ-照射的流感病毒包括已知感染人的流感病毒亚型。可选地，施用的经γ-照射的流感病毒可以包括未知感染人的流感亚型。

在一个实施方案中，施用的经γ-照射的流感病毒包括人畜共患流感病毒株。

给药可以是鼻内给药。优选地，诱发和/或增强针对保守性流感病毒抗原的交叉保护性免疫。最优选地，诱发和/或增强的交叉保护性免疫针对没有经历抗原转移和/或漂移的保守性流感病毒抗原，或者针对经历了可忽略水平的抗原转移和/或漂移的流感病毒抗原。可忽略水平的抗原转移和/或漂移一般是不改变宿主免疫细胞识别和应答抗原能力的程度的抗原转移和/或漂移。

在本发明的优选实施方案中，包括针对流感病毒免疫的交叉反应性免疫通过经鼻内给予个体γ-照射的流感病毒来诱导或增强。经γ-照射的流感病毒可以制备为冻干形式(参见，题目为“给药途径”的下节)。给予个体的经γ-照射的流感病毒可以从通过如题目为“组合物和疫苗”的上节所描述的切向/错流过滤纯化的病毒储备中制备。用于制备给予个体的经γ-照射的流感病毒的病毒储备可以在γ-照射期间是冷冻的(参见，题目为“组合物和疫苗”的上节)。

在本发明优选的实施方案中，交叉反应性免疫产生于多种流感病毒亚型特异的交叉保护性CD8+T细胞的诱发(和/或活性的增强)。

一般地，交叉反应性免疫反应针对在一种或多种不同流感病毒亚型中相同或基本上类似的流感病毒抗原。交叉反应性免疫细胞因此识别由多种病毒亚型共有的基本上相似或相同的病毒抗原，并对其进行应答。

按照本文描述的方法，给予个体经γ-照射的流感病毒可以因此产生交叉反应性免疫细胞。交叉反应性免疫细胞能够识别或应答给予个体的流感病毒亚型株。此外，交叉反应性免疫细胞能够识别和应答没有给予个体的至少一种其他的流感病毒亚型株。

按照本发明的方法，在个体诱发和/或增强的交叉反应性免疫可以包括交叉反应性细胞免疫。交叉反应性细胞免疫可以包含，例如交叉反应性辅助T细胞反应和/或交叉反应性细胞毒T细胞反应。优选地，交叉反应性细胞免疫会涉及交叉反应性细胞毒CD8+T细胞反应。不希望受特定机制约束，认为由本发明的方法诱发和/或增强的交叉反应性T细胞免疫可以产生于经γ-照射的流感病毒有效摄取入抗原呈递细胞，由于γ-照射提供的病毒表面蛋白(例如，功能受体和融合域)的保守的功能域完整性。这进一步还可以允许更有效的病毒颗粒摄取和脱壳，提供了充足的病毒抗原(例如，基质和核蛋白)进入抗原呈递细胞的胞质和主要组织相容性(MHC)蛋白上的病毒抗原的有效呈递。另外地或可选地，片段化的基因组流感病毒RNA的无效复制/翻译可以发生，这提供了用于MHC呈递的病毒抗原的主要来源(即，缺陷性核糖体产物包括过早终止和/或错误折叠的基因产物)，由此触发了病毒特异性T细胞免疫。

利用本领域已知的方法，可以检测交叉反应性细胞免疫的诱发和/或增强。例如，交叉反应性T细胞(例如，辅助T细胞和细胞毒T细胞)可以利用用于检测病毒特异性T细胞的通用方法来检测或定量，所述通用方法包括ELISpot分析，细胞内细胞因子染色分析和基于四聚物的分析(如上所述)。

在个体诱发和/或增强的交叉反应性免疫可以包括交叉反应性体液免疫。交叉反应性体液免疫通常会涉及交叉反应性B细胞反应。这进一步可以导致交叉反应性流感病毒特异性抗体(例如IgA和IgG)量在个体循环中增加。一般地，交叉反应性抗体具有与流感病毒抗原反应的能力，和/或与其结合的能力，所述抗原不刺激它的产生。交叉反应性B细胞和由其衍生的抗体可以利用本领域已知的方法来检测(例如，通过微中和作用，流式细胞术或免疫组化)。用于检测交叉反应性流感病毒特异性抗体的合适技术的具体实例描述于例如Rota etal.，1987″Comparison of the immune response to variant influenza typeB hemagglutinins expressed in vaccinia virus″，Virology，161：269-75，and Harmon et al.，1988，″Antibody Response in Humans to InfluenzaVirus Type B Host-Cell-Derived Variants after Vaccination withStandard(Egg-Derived)Vaccine or Natural Infection″，J.Clin.Microbiol.，26：333-337.。

按照本发明的方法，由来自给定流感病毒亚型的经γ-照射的株的给药诱发和/或增强的交叉反应性免疫会提供针对给药的亚型株的交叉保护。优选地，来自给定流感病毒亚型的经γ-照射的株的给药还提供针对来自至少一种另外的流感病毒亚型的株的交叉保护。

因此，给予人个体治疗有效量的给定的γ-照射株会诱发和/或增强免疫应答，所述γ-照射株衍生自一种已知感染人的流感A病毒亚型，所述免疫应答针对来自上述亚型的株和至少一种另外的流感病毒亚型的株。该另外的病毒亚型可以是流感A病毒亚型，流感B病毒亚型和/或流感C病毒亚型。另外的流感病毒亚型可以是，例如，在人群中发现的截然不同的流感A亚型(例如，H1N1(包括H1N1 09猪流感)，H1N2和H3N2)。另外地或可选地，另外的流感病毒亚型可以通常在其他物种中存在。例如，另外的流感病毒亚型可以通常在禽(例如，A亚型H5N1(例如HPAI A(H5N1))，H7N2，H7N3，H7N7和H9N2)、猪(例如，A亚型H1N1，H1 N2，H3N1，H3N2)、犬(例如A亚型H3N8)或马(例如，A亚型H3N8，H7N7)群中发现。另外的流感病毒亚型还可以是来自亚型间基因重组的重组病毒株。亚型可以衍生自(即感染)不同的物种。

流感病毒的抗原转移和/或漂移是流感流行的已知因素。通过本文所述方法的γ-照射的流感病毒给药诱发和/或增强的交叉反应性免疫提供了通过疫苗接种预防这种流行的有效措施。另外地或可选地，流行期间感染流感的个体可以用本文所述方法的γ-照射的流感病毒处理。

在某些实施方案中，通过给予γ-照射的流感病毒诱发或增强的交叉反应性免疫包括对人畜共患流感病毒株的免疫。

在本发明的优选实施方案中，由γ-照射的流感病毒的给药诱发或增强的交叉反应性免疫包括对禽流感A病毒亚型H5N1(例如HPAIA(H5N1))的免疫。目前的人流感A病毒主要结合表达在上呼吸道的α2，6连接的唾液酸受体。与α2，6连接的受体结合通常与低毒力的高传播性流感病毒感染有关。相比之下，禽流感H5N1结合表达在下呼吸道的α2，3连接的受体。结合α2，3连接的受体通常与低传播性，但高毒力和致死性流感病毒感染有关。因此预期禽H5N1流感大流行与H5N1的血细胞凝集素(HA)蛋白的变异有关，从而允许病毒结合α2，6连接的受体。针对目前流行性H5N1亚型蛋白(即，α2，3连接的受体)的疫苗不能诱导允许与α2，6连接的受体结合的抗H5N1病毒突变的免疫。因此，通过这些疫苗的抗体介导的保护本质上对抗可能的禽流感流行是无效的。

针对人流感A病毒的T细胞群对禽H5N1流感病毒(例如，HPAIA(H5N1))的交叉识别代表了克服上述问题的手段。按照本发明的方法，给予个体经γ-照射的流感病毒诱发和/或增强个体抗禽H5N1流感病毒(例如，HPAI A(H5N1))的交叉保护性免疫。给予个体的经γ-照射的流感病毒可以或可以不包括经γ-照射的禽H5N1流感病毒。优选地，个体是人，并且给药的经γ-照射的流感病毒包括已知感染人类的流感A亚型。给药可以是鼻内给药。优选地，诱发和/或增强针对保守性禽H5N1流感病毒抗原的交叉保护免疫，所述抗原包括但不限于HPAI A(H5N1)病毒抗原。最优选地，诱导和/或增强针对没有经历抗原转移和/或漂移的保守性禽H5N1流感病毒抗原或经历了可忽略程度的抗原转移和/或漂移的禽H5N1流感病毒抗原的交叉保护性免疫。可忽略程度的抗原转移和/或漂移通常是不改变宿主免疫细胞识别和应答抗原能力的程度的抗原转移和/或漂移。

在本发明的优选实施方案中，包括针对(禽)流感病毒亚型H5N1(例如HPAI A(H5N1))免疫的交叉反应性免疫通过鼻内给予个体经γ-照射的流感病毒来诱导或增强。经γ-照射的流感病毒可以制备为冻干形式(参见题目为“给药途径”的下节)。给药的γ-照射的流感病毒可以包括来自人群的流感A病毒亚型。可选地，给药的γ-照射的流感病毒可以包括未知感染人的流感病毒亚型。给予个体的经γ-照射的流感病毒可以从病毒储存中制备，所述病毒储备通过如题目为“组合物和疫苗”的上节中所述的切向/错流过滤来纯化。用于制备给予个体的经γ-照射的流感病毒的病毒储备物可以在γ-照射期间是冷冻的(参见题目为“组合物和疫苗”的上节)。

在本发明的另一优选实施方案中，通过给予γ-照射的流感病毒诱发或增强的交叉反应性免疫包括对H1N1 09猪流感病毒的免疫(另外地被世界卫生组织称为“大流行性流感A(H1N1)”)。给予个体的经γ-照射的流感病毒可以或可以不包含经γ-照射的H1N1 09猪流感病毒。施用的经γ-照射的流感病毒可以包括已知感染人类的流感A亚型。可选地，施用的经γ-照射的流感病毒可以包括未知感染人类的流感亚型。给药可以是鼻内给药。优选地，诱发和/或增强针对保守性H1N1 09猪流感病毒抗原的交叉保护免疫。最优选地，诱发和/或增强针对没有经历过抗原转移和/或漂移的保守性H1N109猪流感病毒抗原或经历过可忽略程度的抗原转移和/或漂移的H1N109猪流感病毒抗原的交叉保护免疫。可忽略程度的抗原转移和/或漂移通常是不改变宿主免疫细胞识别和应答抗原能力的程度的抗原转移和/或漂移。

在本发明的优选实施方案中，包括对H1N1 09猪流感病毒的免疫的交叉反应性免疫通过鼻内给予个体经γ-照射的流感病毒来诱发或增强。经γ-照射的流感病毒可以制备为冻干形式(参见，题目为“给药途径”的下节)。给药的经γ-照射的流感病毒可以是来自人群的流感A病毒亚型。给药的经γ-照射的流感病毒可以从病毒储备物中制备，所述病毒储备物通过如题目为“组合物和疫苗”的上节所述的切向/错流过滤来纯化。用于制备给予个体的经γ-照射的流感病毒的病毒储备物可以在γ-照射期间冷冻(参见，题目为“组合物和疫苗”的上节)。

剂量

用于本发明的方法的经γ-照射的流感病毒(或包含经γ-照射的流感病毒的组合物/疫苗)的合适剂量可以依赖于多种因素。这些因素可以包括，但决不局限于个体的身体特征(例如，年龄、体重、性别)，化合物是否被用于单一试剂或辅佐治疗，患者的MHC限制类型、流感感染的进展(即，病理状态)，以及本领域技术人员可以识别的其他因素。一般地，γ-照射的流感病毒制剂(或者包含经γ-照射的流感病毒制剂的组合物/疫苗)可以给予患者，给予的量为约50微克至约5mg；特别优选的剂量为约50微克至约500微克。

本领域的技术人员能够通过常规试验来确定对于治疗合适的流感病毒感染所必需的有效无毒性量的经γ-照射的流感病毒(或者包含经γ-照射的流感病毒的组合物/疫苗)。

一般地，预期有效剂量为约0.0001mg至约1000mg/kg体重每24小时；一般地，约0.001mg至约750mg/kg体重每24小时；约0.01mg至约500mg/kg体重每24小时；约0.1mg至约500mg/kg体重每24小时；约0.1mg至约250mg/kg体重每24小时；约1.0mg至约250mg/kg体重每24小时。更一般地，有效剂量范围被期望在约1.0mg至约200mg/kg体重每24小时；约1.0mg至约100mg/kg体重每24小时；约1.0mg至约50mg/kg体重每24小时；约1.0mg至约25mg/kg体重每24小时；约5.0mg至约50mg/kg体重每24小时；约5.0mg至约20mg/kg体重每24小时，约5.0mg至约15mg/kg体重每24小时。

可选地，有效剂量可以高达约500mg/m²。一般地，预期有效剂量为约25至约500mg/m²，优选约25至约350mg/m²，更优选地约25至约300mg/m²，仍更优选地约25至约250mg/m²，甚更优选地约50至约250mg/m²，以及仍更优选地约75至约150mg/m²。

典型地，在治疗应用中，治疗应该针对疾病状态或状况的持续期。此外，对本领域技术人员显而易见的是，个体给药的最佳量和间隔时间由所治疗的疾病状态或状况的性质和程度、给药的形式、途径和部位、以及被治疗的特定个体的性质来决定。此类最优条件还可以通过常规技术来确定。

对本领域技术人员显而易见的是，最佳疗程能够利用常规的疗程确定测验来确定。

如果两种或多种治疗实体“联合”给予个体，它们可以在单个组合物中同时给药，或者在分开的组合物中同时给药，或者在分开的组合物中在分开的时间给药。

在一些实施方案中，本发明的方法包括在多个分开的剂量中给予γ-照射的流感病毒(或者包含γ-照射的流感病毒的组合物/疫苗)。因此，用于预防(即疫苗接种)和治疗本文所述的流感病毒感染的方法包括给予个体多个分开的剂量，例如，在确定的时间段。因此，用于预防(即，疫苗接种)和治疗本文公开的流感病毒感染的方法包括给予初始免疫剂量的本发明经γ-照射的流感病毒(或包括经γ-照射的流感病毒的组合物/疫苗)。初始免疫剂量可以随后是加强剂量。加强可以出于再接种疫苗的目的。在多种实施方案中，组合物或疫苗至少给药一次、两次、三次或更多。

本发明经γ-照射的流感病毒(或包含γ-照射的流感病毒的组合物/疫苗)可以作为单一药剂治疗给药，或者附加于已建立的治疗，诸如用活的、减活的或杀灭的病毒接种，或者本领域已知的治疗流感病毒的任何其他治疗。例如，它们可以与亚单位疫苗、裂解流感病毒或裂解流感病毒抗原制剂、接种的全病毒或活减弱的流感制剂联合给药。

给药途径

本发明包括给予个体治疗有效量的经γ-照射的流感病毒(或包含γ-照射的流感病毒的组合物/疫苗)。经γ-照射的流感病毒(或组合物/疫苗)可以与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂一起给药。

可以通过任何合适的途径进行给药，包括但不限于胃肠外(例如，静脉内、皮内、皮下或肌肉内)、粘膜(例如经口或鼻内)或局部途径(参见，题目为“组合物和疫苗”的上节)。

因此，经γ-照射的流感病毒(或者包含流感病毒的组合物/疫苗)可以下述形式给药：适于通过注射给药的形式、适于口服摄入的制剂形式(诸如例如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适于局部给药的膏剂、霜剂或洗液形式、适于作为滴眼液递送的形式、适于通过吸入给药的气雾剂形式，诸如通过鼻内吸入或口服吸入，适于胃肠外给药的形式，即皮下、肌肉内或静脉内注射。

在优选的实施方案中，经γ-照射的流感病毒(包含经γ-照射的流感病毒的组合物/疫苗)通过鼻内途径给予个体。给予个体γ-照射的流感病毒(包含经γ-照射的流感病毒的组合物/疫苗)提供优于其他给药途径的优势。例如，鼻内给药在粘膜上皮诱导分泌性IgA产生，引发了比血清IgG更有效的交叉保护。没有受到特定机制约束，通过γ-照射的流感病毒灭活被认为通过导致病毒基因组的链断裂灭活病毒，而不影响病毒颗粒的抗原结构。因此，流感病毒的γ-照射与随后鼻内给药的组合据认为提供了几个优势，包括但不限于：1)促进灭活的病毒与组织特异性受体的结合，2)允许组织特异性免疫反应的诱导；3)减少对全病毒抗原的系统暴露以及4)限制与全病毒疫苗有关的副作用。

在一个实施方案中，用于鼻内给药的γ-照射的流感病毒以冻干粉状形式提供，所述形式能够在使用前立刻复原。本发明的疫苗和组合物的粉状疫苗制剂提供了克服冷藏和分配需求的方法，这种需求与液体疫苗稳定性和递送有关。干粉制剂提供了更稳定的优势，还不支持微生物生长。

如本文所显示的，γ-射线灭活的流感病毒的冻干制剂诱发与非冻干制剂相似的异亚型免疫。经γ-照射的流感病毒可以利用任何本领域已知的合适技术来冻干。例如，γ-射线灭活的流感病毒的液体制剂可以在干冰-异丙醇浆中冷冻并在冻干仪(例如，Virtis Model 10-324Bench，Gardiner，NY)中冻干合适的时间段(例如24小时)。

在一个实施方案中，γ-照射的流感病毒的干燥粉状鼻疫苗制剂通过产生喷雾冷冻干燥(SFD)颗粒来制备(参见，例如Costantino et al，(2002)，″Protein spray freeze drying.2.Effect of formulation variableson particle size and stability″，J Pharm Sci.，91：388-395；Costantino，etal.，(2000)，″Protein spray-freeze drying.Effect of atomizationconditions on particle size and stability″，Pharm Res.，17：1374-1383；Maa et al，(1999)，″Protein inhalation powders：spray drying vs sprayfreeze drying″，Pharm Res，16：249-254；Carrasquillo et al，(2001)；″Non-aqueous encapsulation of excipient-stabilized spray-freeze driedBSA into poly(lactide-co-glycolide)microspheres results in release ofnative protein″，J Control Release，76：199-208；Carrasquillo et al，(2001)，″Reduction of structural perturbations in bovine serum albumin bynon-aqueous microencapsulation″，J Pharm Pharmacol.，53：115-120；和美国专利号6,569,458)。例如，包含γ-照射的流感病毒和10％固体(例如海藻糖)的水性溶液可以通过喷雾剂，雾化氮气和小滴收集在含有液氮的托盘中，然后在复式冻干仪中冻干。冻干制剂可以就在使用前立复原。

用于按照本发明的鼻内给药可以配制为，例如液体形式，如滴鼻剂、喷剂，或者适用于吸入，作为粉剂、作为霜剂或作为乳化剂。

典型地，将经γ-照射的流感病毒(或者包含该流感病毒的组合物/疫苗)给予鼻咽部位用于鼻粘膜吸收，优选不被吸入肺。用于按照本发明的方法鼻内给药的合适装置包括喷雾装置。合适的可商购的喷雾装置可以使用。可以利用包含亚剂量γ-照射的流感病毒(或者包含该流感病毒的组合物/疫苗)的多重剂量递送装置。

本领域技术人员会认识到，可以对具体实施方案所示的本发明作出多种改变和/或修饰，而不偏离如广泛描述的本发明的精神或范畴。因此本发明的实施方案在所有方面都被视为示例性的，而非限定性的。

实施例

现在结合具体实施例来描述本发明，这些实施例不应理解为任何方式的限制。

实施例1：用γ-照射的的流感A病毒对BALB/c小鼠进行静脉接种

(i)材料和方法

动物

在每一实验中使用相同性别并且在相似年龄组(8-12周龄)的BALB/c小鼠。

病毒和免疫

如Yap et al.，1977，″Cytotoxic T cells specific for influenzavirus-infected target cells″，Immunology，32：151所描述的，对流感病毒株A/WSN(H1N1)，A/JAP(H2N2)和A/PC(H3N2)进行培养和用滴定法进行测量。病毒滴度表示为血细胞凝集单位(HAU)。通过将粗制尿囊液暴露于Co⁶⁰来源的1.26X 10⁶拉德(12.6KGy)(以350拉德/min暴露60小时)，或者通过将透析的感染性尿囊液暴露于UV照射(320μW/cm²)10分钟来灭活A/JAP流感病毒。如在含胚卵中测试的，暴露于γ或UV照射这些时间段后完全破坏了感染性。通过单次静脉注射10³HAU免疫动物。

靶细胞

如在Yap et al.，1977，″Cytotoxic T cells specific for influenzavirus-infected target cells″，Immunology，32：151以及Parish andMullbacher，1983，″Automated colorimetric assay for Tcell cytotoxicity″，J.Immunol Meth.，58：225-237中所述的，获得、制备和感染P815巯基乙酸酯-诱导的腹腔巨噬细胞(TGM)、伴刀豆蛋白A(con-A)和脂多糖(LPS)诱导的淋巴母细胞。

效应细胞的产生

利用Müllbacher，1984，″Hyperthermia and the generation andactivity of murine influenza-immune cytotoxic T cells in vitro″，J.Virol.，52，928-931所述的方法，产生了用于产生再次体外流感-免疫的Tc细胞的记忆培养物。简而言之，将来自3个月前用流感病毒免疫的小鼠的8X 10⁷脾细胞与1X 10⁷个病毒感染的刺激细胞(stimulator cells)在体外共培养5天。刺激细胞用感染性或灭活的病毒以每10⁶细胞约10³HAU的感染复数感染。

细胞毒性测定

用于肿瘤细胞核和巨噬细胞靶标的方法详细地记载于Yap et al.，1977，″Cytotoxic T cells specific for influenza virus-infected target cells″，Immunology，32：151，Parish and Müllbacher，1983，″Automatedcolorimetric assay for T cell cytotoxicity″，J.I mmunol Meth.，58：225-237以及Mullbacher，1984，″Hyperthermia and the generation andactivity of murine influenza-immune cytotoxic T cells in vitro″，J.Virol.，52，928-931。测定的持续时间为6小时。利用下式计算指定溶解的百分比：

(ii)结果

用具感染性和灭活的流感病毒对BALB/c小鼠进行对于记忆性Tc细胞的初免(priming)

BALB/c小鼠注射10³HAU的具感染性的、γ-照射的或UV灭活的A/JAP病毒。三个月后，取出脾脏并将细胞在体外用具感染性的A/JAP感染的刺激脾细胞加强，5天后以3∶1的效应器：靶细胞比测量Tc细胞反应。表1显示了感染的P815靶细胞的特异性溶解百分比的代表性数据。清楚地，具有感染性的病毒对于触发Tc细胞反应比γ-照射的或UV照射的病毒更有效，但利用所有三种感染的靶细胞(A/WSN，A/JAP and A/PC)，γ-照射的病毒都产生了显著的溶解，与UV照射的病毒弱得多的反应相比。从在限定稀释条件下的前体频数分析中，与用γ-照射的病毒初免的动物相比，用具感染性病毒初免的动物在脾脏中给出了约三倍高的Tc细胞前体频数估值。这与大体积培养获得的溶解值是一致的(表1)。

表1.用具感染性的A/JAP病毒再次体外刺激小鼠的脾细胞，所述小鼠预先用具感染性的、γ-照射的或UV照射的A/JAP病毒免疫。

^*通过减去效应器细胞对未感染的P815细胞的溶解值获得给出的特异性溶解百分比的值。一式三份样本的平均值的标准误总是小于8％，并通常小于4％。自发的⁵¹Cr释放的范围为16％至19％。

灭活的病毒加强记忆性流感免疫的Tc细胞的能力

预先3个月用具感染性的A/JAP病毒(10³HAU)初免的小鼠的脾细胞在体外用A/JAP处理的刺激细胞加强，利用具有感染性的病毒、γ-照射的或UV-灭活的病毒，并进行Tc细胞活性测定。显示在表2中的结果表明所有三种病毒都能够再激活交叉反应性Tc记忆细胞，但γ-照射的的病毒优于UV-照射的病毒。用UV-灭活的病毒加强的细胞仅对用同源的病毒感染的靶细胞给出了显著的裂解。

表2.用具有感染性的或灭活的A/JAP病毒再次体外刺激小鼠的脾细胞，所述小鼠预先用具有感染性的A/JAP病毒免疫。

^*通过减去效应细胞对未感染的P815细胞的溶解值获得给出的特异性溶解百分比的值。一式三份样本的平均值的标准误总是小于8％，并通常小于4％。自发的⁵¹Cr释放的范围为8％至10％。

靶细胞用具感染性和灭活的A/JAP病毒的敏化

为了确定是否灭活的流感病毒能够致敏靶细胞，P815肿瘤细胞、TGM以及LPS和con-A淋巴母细胞用感染性的、γ-照射的或UV-灭活的病毒处理2小时，每10⁶细胞10³HAU(2X 10⁶细胞/ml)。然后检测这些靶标通过再次体外流感免疫的Tc细胞的特异性裂解(表3)。只有感染性病毒能够致敏靶标(特别是P815和TGM)以给出高于未感染的对照靶标的显著的裂解。

表3通过感染性和灭活的A/JAP病毒致敏靶细胞，通过再次流感病毒免疫的Tc细胞进行测试。

^*通过减去效应细胞对未感染的P815细胞的溶解值获得给出的特异性溶解百分比的值。一式三份样本的平均值的标准误总是小于8％，并通常小于4％。自发的⁵¹Cr释放的范围：P815为10％至12％，TGM为13-17％，LPS为37-40％以及Con-A纤维母细胞为22-25％。

用灭活的病毒保护免于致死性流感病毒感染

为了研究是否用上述灭活的病毒制剂免疫的小鼠会被保护免于致死性流感病毒感染，用相同或不同亚型的致死剂量的活流感病毒攻击前4-5周，小鼠用感染性的、γ-照射的或UV-照射的A/JAP病毒初免。来自一次或两次实验的结果显示于表4中。用三种病毒任一种初免的小鼠存活于同源A/JAP和异源A/WSN病毒的攻击，尽管用UV-照射的病毒初免并用A/WSN攻击的小鼠生病，且有一只死亡。观察到的主要差异是用A/PC得到的。用UV-灭活的病毒初免的小鼠与没有初免的动物一样易感，而用γ-照射的病毒初免的小鼠存活于攻击至少与用感染性病毒初免的小鼠一样。抗体不可能负责观察到的交叉保护，因为免疫血清从用感染性或γ-灭活病毒初免的动物的转移显著降低了同源性A/JAP病毒感染的动物肺脏的病毒滴度，但没有在A/WSN感染的动物中降低病毒滴度。

表4.用具感染性的、g-照射的或UV-照射的A/JAP预免疫动物对存活的影响，预免疫后用致死剂量的感染性A/WSN(H1N1)、A/JAP(H2N2)或A/PC(H3N2)攻击。

^*以前的实验表明初免的小鼠总是经受住同源病毒的攻击。给BALB/c小鼠静脉注射(i.v.)10³HAU的感染性的、UV-照射的或g-照射的A/JAP病毒，或者什么也不注射。8周后，小鼠各组(每组8只小鼠)鼻内接种致死剂量的A/WSN(10⁴EID₅₀)、A/JAP(3X 10⁵EID₅₀)或A/PC(1.5X 10⁸EID₅₀)。小鼠的死亡记录20天，结果如上。

这些结果表明γ-照射的病毒保护动物对抗由同源A株病毒导致的致死性感染，至少与传染性病毒一样有效。另一方面UV-照射的病毒没有将这种保护提供给更远缘的病毒A/PC(H3N2)。发现了γ-照射比UV-照射在破坏病毒感染性时保留触发交叉反应性Tc细胞的能力方面更有效，这提示γ-照射比UV-照射较不损伤至少一些内部蛋白的抗原结构。出乎意料地，以前关于γ-照射对病毒或蛋白影响发表的工作很少。与感染性病毒相比，γ-照射和UV-照射的病毒都不能致敏靶细胞(活化的巨噬细胞、淋巴母细胞或P815细胞)，促进通过病毒特异性Tc细胞的溶解。然而，可能的是，静脉注射后主要参与照射的病毒的抗原呈递的细胞可能具有不同于活化的巨噬细胞或淋巴细胞的特征的特征。

实施例2：γ-照射的流感A株A/WSN[H1N1]，A/PR8[H1N1]，A/JAP[H2N2]和A/PC[H3/N2]的静脉接种

(i)材料和方法

动物和病毒

在10日龄含胚卵中制备流感A病毒(株A/WSN，A/Pr8[H1N1]；A/JAP[H2N2]；A/PC[H3N2])的储存物。病毒储存物从尿囊液制备，并以等分部分储存于-70℃。最初地，BALB/c和C57B1/6小鼠鼻内感染，在死亡率、体重降低、肺脏组织学和肺脏浸润方面评价流感病毒感染的严重性。

流感病毒株的γ-照射

在NSTO/Lucas Heights/NSW进行冷冻的和保持在室温的病毒储存物的γ-射线剂量反应研究，以确定产生具有最佳免疫原性的灭活病毒制剂的条件。5x 10⁵拉德(5KGy)的照射剂量足以诱导灭活，这通过残余的感染性病毒在含胚卵中扩增后的血细胞凝集(HA)分析来确定。为了保证绝对的病毒粒子的灭活，选择1x10⁶拉德(10KGy)的γ-射线剂量用于γ-流感病毒(γ-照射的流感病毒)制剂，这用于在小鼠用感染性流感病毒攻击前对小鼠进行免疫接种。病毒储存物在整个放射过程中置于在干冰上。

静脉接种和鼻内攻击

8只ALB/c小鼠的各组用γ-流感病毒静脉接种两次，两次间隔4周，然后用A/JAP进行致死性鼻内攻击。静脉注射γ-A/WSN(6x10³血细胞凝集单位(HAU)/小鼠)、γ-A/PC(6x10³HAU/小鼠)和γ-A/JAP(3x 10³HAU/小鼠)。给予第二次剂量的γ-流感病毒后4周，小鼠用A/JAP(50HAU/小鼠)攻击，然后监测20天。

免疫组织化学

在10％的中性缓冲福尔马林中固定肺脏1周，然后包埋在石蜡中。对于组织形态学检测，4张微米切片用苏木精和伊红(H&E)染色。

从肺脏分离淋巴细胞和FACS分析

为了评价接种γ-流感病毒对CD8+T细胞组织浸润的影响，在用流感病毒攻击后的第6天，将来自模拟的和免疫接种的小鼠的肺脏收集在冰冷的含有5％FCS的MEM中。将样品用MEM/5％FCS中的2mg/mL的1型胶原酶(Gibco-Life Technologies)在37℃摇动消化30分钟，并通过轻压穿过100μm网孔组织筛匀浆。然后将匀浆液在400xg离心10分钟，沉淀团重悬在2mL MEM/5％FCS中的90％Percoll(Sigma-Aldrich)中。悬浮液转移到15mL管并用MEM中的60，40和10％的Percoll轻覆。梯度用800x g离心45分钟。从40-60％的界面收集淋巴细胞并用MEM/5％FCS洗涤两次。通过用CD8特异性Ab染色来确定新鲜分离的淋巴细胞上的细胞表面标志物的表达，所述淋巴细胞来自A/WSN感染的(模拟的和接种的)小鼠的肺脏。将来自单只小鼠的细胞重悬在100μL冰冷的MEM/5％FCS，并用Fc Block(PharMingen)在4℃孵育15分钟。洗涤细胞并将细胞用相关抗体在4℃避光孵育30分钟，然后再洗涤两次，用2％w/v的多聚甲醛固定，并在4℃避光孵育直至利用FACScan(Becton Dickinson)分析。

γ-flu诱导的交叉反应性CTL反应

为了检测是否γ-flu诱导交叉反应性Tc细胞反应，A/WSN和A/PC以及它们对应的γ-flu制剂被用于静脉感染或免疫接种小鼠。将10周龄的BALB/c小鼠感染或接种A/WSN，γ-A/WSN，A/PC和γ-A/Pc。5天后，检测来自感染的、接种的和模拟免疫的动物的脾细胞对模拟的、A/WSN-感染的、A/PC-感染的和靶标细胞的杀伤活性，所述靶标细胞用适当的Kd限制性核蛋白衍生肽(NPP-标记的P815靶标)修饰。利用Cr⁵¹释放检测测量CTL反应，所述检测如在et al.，1993，″Spontaneous mutation at position 114 in H-2Kd affects cytotoxic T cellresponses to influenza virus infection″Eur.J.Immunol.29，1228-1234中所描述的。

统计学

利用GraphPad InStat软件进行所有的统计学分析。利用One-Way-ANOVA检验来比较接种组和未接种组在体重减少方面的MEAN和SEM的显著差异。

(ii)结果

静脉γ-flu免疫接种保护抵抗流感病毒A/JAP的致死性攻击

γ-flu制剂诱导保护性免疫的能力通过用同源和异源的流感病毒攻击γ-flu初免的小鼠来检测。小鼠用流感病毒A/JAP(H2N2)的呼吸道感染与致死率有关，且LD₅₀是10周龄雌性BALB/c小鼠中经鼻50HAU/小鼠(表5)。

表5.γ-flu制剂抵抗同源或异源流感病毒A感染的保护效应

组别^*	1^stγ-flu(i.v.)	2^ndγ-flu(i.v.)	攻击(i.n.)	存活率
					未免疫接种的	-	-	A/JAP	4/8
A	γ-A/JAP	γ-A/JAP	A/JAP	8/8
					B	γ-A/WSN	γ-A/PC	A/JAP	6/8
C	γ-A/PC	γ-A/WSN	A/JAP	4/8

^*8只BALB/c小鼠的每组在用A/JAP进行致死攻击前被免疫接种两次γ-flu，两次间隔4周。在第二次剂量的γ-flu后4周静脉注射γ-A/WSN(6x10³HAU/小鼠)、γ-A/PC(6x10³HAU/小鼠)和γ-A/JAP(3x10³HAU/小鼠)，小鼠用A/JAP进行鼻内攻击(50HAU/小鼠)，并且监测小鼠20天。

先前静脉注射(i.v.)γ-射线灭活的同源或异源的流感病毒A株增强了LD₅₀A/JAP攻击的小鼠的存活率(表5)。当与未进行免疫接种的小鼠比较时，所有接种组(A，B和C)在静脉注射A/JAP后显示了体重降低的显著减少(P值＜0.01，利用ANOVA检验)(图1)。未接触抗原的未接种的动物在A/JAP攻击后的第6天，表现出了＞30％的体重降低。相比之下，所有接种的动物仅显示了小于＜10％的轻度体重下降(图1)。

γ-flu免疫接种降低了用流感病毒A/WSN攻击后的肺部炎症

除了A/JAP感染后的死亡率和体重降低，还评估了A/WSN感染后的肺部炎症和浸润。A/WSN鼻内感染的特征在于严重的炎症反应，在未接触抗原的(图2A)与感染的(图2B)肺脏的比较组织学中是明显的。炎症在用同源(图2C)或异源(图2D)流感病毒攻击的γ-flu接种动物中显著降低。尽管较低的总体炎症，CD8+T细胞优先浸润γ-flu接种的动物的肺脏(图3)。

γ-flu诱发交叉反应性细胞毒(Tc)细胞反应

预期γ-flu针对同源病毒的感染的保护效应涉及体液和细胞免疫。负责观察到的交叉保护性免疫(保护免于异源感染)的机制可以至少部分是细胞毒T(Tc)细胞介导的。为了检测γ-flu是否诱发交叉反应性Tc细胞反应，A/WSN和A/PC以及它们对应的γ-flu制剂用于感染或接种动物，然后检测脾效应细胞对模拟的、A/WSN-感染的、A/JAP-感染的和靶标细胞的杀伤活性，所述靶标细胞用合适的K^d限制性核蛋白衍生肽(NPP)修饰。如图4所示，来自感染的和接种的动物的效应器脾细胞溶解同源和异源的病毒感染的P815靶标。此外，所有脾细胞，除了来自模拟感染的小鼠的那些，都显示了对核蛋白肽标记的靶标的杀伤活性。

实施例3：用γ-照射的流感A病毒的鼻内接种保护抵抗H5N1(禽流感)。

(i)材料和方法

动物

在本次试验中利用10周龄的BALB/c小鼠。

病毒

两种流感病毒A株(A/PR8[H1N1]和A/PC[H3N2])的病毒储存物生长于含胚鸡卵中并通过温度依赖性吸附到鸡红细胞来纯化，以及通过Madin Darby犬肾(MDCK)细胞的标准空斑检测来评估病毒滴度，并将滴度表示为pfu/mls。

流感株的γ-照射

将纯化的储存物暴露于1x10⁶拉德(10kGy)的γ-射线(ANSTO，Lucas Height，Australia)，如在上面的实施例2所述的。在照射的储存物中残余的病毒感染性通过利用含胚鸡卵来检测。病毒储存物是灭活的，但照射后保持全血细胞凝集活性。

统计学

利用GraphPad InStat软件进行所有的统计学分析。Fisher′s精确和Chi平方检验用于比较存活率的显著差异。

BALB/c小鼠中的交叉反应性细胞毒T细胞反应

10周龄BALB/c小鼠感染或接种A/PR8，γ-A/PR8，A/PC，或γ-A/PC。6天后，利用如上实施例1和2中所述的Cr⁵释放检测方法，检测来自这些小鼠的脾细胞对模拟的、A/PC-，A/PR8-，A/JAP-感染的、以及NPP-标记的P815靶标的杀伤活性。

用于同源和异源保护的γ-flu的鼻内疫苗接种

小鼠各组接种3.2x10⁶pfu/小鼠的γ-A/PR8(n＝10)，γ-A/PC(n＝10)，福尔马林灭活的A/PC(n＝8)，或者模拟处理的(n＝10)。接种后4周，小鼠经鼻内用2x 10⁵pfu/小鼠的A/PR8攻击，并检测体重降低和死亡率21天。

鼻内γ-flu疫苗接种与其他途径的给药

不同途径(鼻内的(i.n.)、静脉内的(i.v.)、腹腔(i.p.)和皮下(S.c.))的接种用于给BALB/c小鼠(10只小鼠/组)接种3.2X 10⁶pfu当量的γ-A/PC。接种后3周，小鼠用致死剂量的活A/PR8(6X 10²pfu)攻击，并监测死亡率和临床症状，利用30％的体重降低作为终点。

BALB/c小鼠的致死H5N1感染的基线参数

10周龄的BALB/c小鼠的各组鼻内感染H5N病毒储存物的10倍系列稀释液。监测小鼠的体重降低和发病率。个别小鼠体重追踪的结束表明小鼠由于-25％的体重减低被处死。

利用γ-FLU(γ-A/PR8[H1N1])的鼻内接种保护抵抗H5N1

检测了γ-flu针对H5N1的致死攻击的保护效应。BALB/c小鼠(每组10只小鼠)被模拟处理或经鼻内接种单一剂量的γ-A/PR8[H1N1](3.2x10⁶pfu当量/小鼠)。接种疫苗后4周，小鼠用3x小鼠感染剂量50(3xMID50)的A/Vietnam/1203/2004[H5N1]鼻内攻击，并每天监测死亡率和临床症状21天，利用20％的体重降低作为终点。

评估γ-flu疫苗对H5N1遗传负荷影响的实时PCR(RT-PCR)

将100μl肺或脑匀浆液加入到600μl RLT缓冲液中后，按照生产商的说明书，利用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取RNA。通过分光光度法确定每一样本的总RNA浓度并用无核酸酶的水调整到40ngμl^-1，随后按照生产商的推荐，在20μl反应中，利用TaqMan ReverseTranscription Reagents试剂盒(Applied Biosystems)逆转率标准量(200ng)的模板。对于定量病毒cDNA，从病毒矩阵基因中扩增和检测产物的通用的流感病毒A型特异性引物和TaqMan探针如以前所描述的使用(参见，Heine，H.G.，et al，2007“Rapid detection of highly pathogenicavian influenza H5N1 virus by TaqMan reversetranscriptase-polymerase chain reaction″Avian Dis.51：370-372)。

反应一式三份进行，并包含12.5μl的TaqMan 2X Universal PCRMaster Mix、900nM的每种引物、250nM探针、2μl cDNA模板和6.8μl水。还可以进行定量18S rRNA(TaqMan Ribosomal ControlReagents，Applied Biosystems)的分开的一式三份的反应以排除在所有检测的样品中存在PCR抑制剂。反应在96-孔板中进行，利用7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)以及以下的循环参数：50℃进行2min；95℃进行10min；95℃进行15sec的45个循环和60℃进行1min。对于病毒遗传负荷的相对定量，利用在40ngμl^-1的从未感染的小鼠肺脏制备的RNA中提取的储存病毒RNA的10倍系列稀释液作为模板产生标准曲线。为了易化数据解释，1单位(1U)的病毒RNA被任意地定义为RNA分子的数目，其被逆转录和进行实时PCR时产生了38的C_T值。

(ii)结果

A/PR8γ-flu和A/PC γ-flu制剂在BALB/c小鼠诱导交叉反应性细胞毒T细胞反应

在γ-flu接种的小鼠中检测交叉反应性细胞毒T(Tc)细胞反应的诱导。A/PR8和A/PC和它们对应的γ-flu用于感染或接种小鼠。6天后，检测来自感染的、接种的和模拟免疫的动物的脾细胞对模拟的、A/PC-，A/PR8-或A/JAP-感染的以及靶标细胞的杀伤活性，所述靶标细胞用适当的K^d限制性核蛋白衍生肽(NPP)修饰，利用Cr⁵¹释放检测方法(如上面实施例2和3所述)。如图5所示，来自流感病毒感染的和γ-flu接种的动物的效应器脾细胞诱发针对所有流感病毒感染的P815靶标的杀伤活性，与所使用的病毒株无关。此外，所有脾细胞群，除了来自模拟感染的小鼠的那些，显示了对流感病毒核蛋白肽标记的靶标的杀伤活性。这些数据说明了γ-flu制剂诱导小鼠的交叉反应性Tc细胞的能力。

鼻内γ-flu疫苗接种保护抵抗致死剂量的流感病毒A/PR8

考虑到全病毒疫苗引发由高反应原性导致的并发症，以及γ-照射对病毒免疫原性的极少影响(如上所述)，检测了γ-flu的鼻内给药。将鼻内γ-flu疫苗制剂的功效与用于目前人流感病毒制剂的化学灭活的疫苗制剂的功效相比。小鼠经鼻内接种等剂量的三种灭活的病毒制剂的一种(福尔马林A/PC，γ-A/PC[H3N2]或γ-A/PR8[H1N1])。在这些实验中，给小鼠仅接种单一剂量，4周后，用致死剂量的A/PR8(＞300x的致死剂量50)攻击。小鼠称重，并在攻击后3周观察死亡率(图6)。γ-A/PR8接种的动物在用同源病毒攻击后完全恢复，体重几乎没有降低(图6B)。γ-A/PC接种的动物用A/PR8(即用异源性病毒)攻击导致一部分动物体重降低，大部分到第4天(图6)开始恢复，与记忆性Tc细反应的峰值一致(and Tha HIa，1993，″In vivoadministration of major histocompatibility complex class I-speciflcpeptides from influenza virus induces specific cytotoxic T cellhyporesponsiveness″，Eur.J.Immunol.，23，2526-2531)。与未接种组相比，γ-A/PC接种的动物的存活率是显著的(p＜0.05，利用Chi-平方检验)。所有用福尔马林灭活的疫苗制剂接种的小鼠体重迅速降低(图6D)。死亡率数据(图6E)证实了发病率数据并且表明用γ-flu鼻内接种保护免于同源和异源流感病毒A攻击。

鼻内γ-flu疫苗接种与其他给药途径

不同途径(鼻内的(i.n.)、静脉内的(i.v.)、腹腔(i.p.)和皮下(S.c.))的接种用于给BALB/c小鼠(10只小鼠/组)接种3.2X 10⁶空斑形成单位(plaque forming units，PFU)当量的γ-A/PC。接种后3周，小鼠用致死剂量的活A/PR8(6X 10²pfu)鼻内攻击，并监测死亡率和临床症状，利用30％的体重降低作为终点(图7)。用异型病毒(图7c)攻击后，所有鼻内接种疫苗的动物完全恢复，只有少数(如果有的话)体重降低。相比之下，未接种疫苗的(图7A)、静脉接种疫苗的(图7B)、腹腔和皮下接种疫苗的(数据未显示)小鼠的大多数体重渐进性降低以至在感染后第7天和第8天达到30％的体重降低。存活率数据(图7D)表明，尽管使用了非天然的高攻击剂量的A/PR8，鼻内接种疫苗的小鼠以显著水平存活于异型攻击(P＜0.05，利用Fisher精确检验)。

BALB/c小鼠中致死性H5N1感染的基线参数

鼻内感染H5N1(A/Vietnam/I 203/2004)后评价了BALB/c小鼠的体重降低。如图8所示，5只小鼠的各组被用单独的稀释剂(组1)或储存病毒的10倍系列稀释液(组别2-6，以渐增浓度接种物的次序)攻击。将小鼠称重，并观察发病率，以及在达到体重降低大于25％时处死小鼠。感染了111 EID50(组3)的小鼠以及感染了11100 EID50(组5)的小鼠分别到感染后第6天和第2天开始显示出体重降低。

针对H5N1禽流感病毒的保护

检测了γ-flu针对H5N1致死攻击的保护效应。BALB/c小鼠(10只小鼠/组)鼻内接种单一剂量的γ-A/PR8[H1N1](3.2x10⁶PFU当量/小鼠)。接种后四周，小鼠用3x小鼠感染剂量50(3xMID50)的A/Vietnam/1203/2004[H5N1]鼻内攻击，并监测死亡率和临床症状，利用20％体重降低作为终点(图9)。对照组(模拟接种的)的所有10只小鼠发展了与H5N1感染一致的临床体征并在感染后DPI 7和14天间按照AEC批准的实验终点(如果观察到20％或更多的体重降低，如果检测到任何神经病学体征或者如果感染导致了不能进食/饮水(例如，严重的隆起物、严重的脱水、不活动))(图9A)被施以安乐死。总之，未接种疫苗的小鼠从感染后4天起出现油腻的/有褶皱的皮毛，两只小鼠出现神经病学体征，分类为异常的后肢步态和后肢无力，这时它们被施以安乐死，以及所有其他的小鼠在-20％体重降低时被施以安乐死(不同程度的抑郁、不活动和脱水)。

与之相比，所有接种疫苗的小鼠(γ-A/PR8[H1N1])仍是欢快的，并在整个研究期间是活跃的，并在感染后第21天的试验完结时被实施安乐死(图9B)。一只动物在感染后第4天失去了11％的体重，但是欢快的和活跃的，并且在试验结束时重新达到了攻击前的体重。总之，所有小鼠存活于H5N1的致死量攻击，并且一些动物获得了更多的体重以至于超出了它们被攻击前的体重。

鼻内γ-flu接种导致H5N1从肺脏的早期清除

如上所述，所有接种疫苗的小鼠存活于H5N1的致死攻击。因此，数据证实了单一剂量的γ-flu制剂鼻内给药在小鼠中诱导了针对H5N1病毒的致死攻击的交叉保护免疫。病毒感染性的定量和病毒遗传负荷证实了γ-A/PR8[H1N1]对禽流感的保护效应，并且显示了H5N1病毒到攻击后第6天从肺组织的清除(表6)。一只接种疫苗的动物肺脏的病毒感染性和病毒RNA在攻击后第3天检测到，但第6天没有检测到，这表明，观察到的交叉保护免疫极有可能是通过记忆性Tc细胞介导的，其表达加速的激活动力学优于天然Tc细胞，如之前所描述的(Bennink et al，1978，″Influenzal pneumonia：early appearanceof cross-reactive T cells in lungs of mice primed with heterologous typeA viruses″，Immunology 35：503-509)。

表6 肺和脑的H5N1感染性以及病毒遗传负荷

病毒感染性和相对病毒遗传负荷分别表达为log₁₀T CID_50g ^-1和log₁₀U/20ng提取的RNA(一式三份反应的几何平均值±s.d.)，其中1单位(1U)的病毒RNA被任意定义为RNA分子的数目，其当被逆转录和进行实时PCR时，产生的C_T值为38。

^*感染后天数

未检测到(＜10^3.2TCID₅₀g^-1(感染性)或＜1U/20ng提取的RNA(遗传负荷))

实施例4：γ-射线灭活的流感A病毒在小鼠中诱发主要由细胞毒性T细胞介导的交叉保护性免疫

(i)材料和方法

细胞和病毒

P815肥大细胞瘤和Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞于37℃维持在添加5％FCS的EMEM中，在含5％CO²的湿润环境中。流感A型病毒、A/PR/8[A/Puerto Rico/8/34(H1N1)]和A/PC[A/PortChalmers/1/73(H3N2)]生长在10日龄的含胚鸡卵中。每一个卵注射0.1ml含有1血细胞凝集素单位(HAU)病毒的生理盐水，在37℃孵育48小时，然后置于4℃过夜。收获羊膜/尿囊液，将其合并并储存于-80℃。利用MDCK细胞上的空斑检测方法，滴度为10⁷PFU/ml(A/PC)和2x 10⁸PFU/ml(A/PR8)。利用用于疫苗制剂的鸡红血细胞，纯化病毒，如在(Sheffield，et al.(1954)，″Purification of influenza virus byred-cell adsorption and elution″，British journal of experimentalpathology，35：214-222)中所述。简言之，感染性的尿囊液与红血细胞在4℃孵育45分钟，从而允许病毒的血细胞凝集素结合红细胞，然后离心以去除尿囊液上清。将沉淀团重新悬浮在生理盐水中，在37℃孵育1小时以从病毒释放红细胞，然后离心以去除红细胞，并收集上清中的病毒。纯化的A/PC储存物滴度为5x 10⁸PFU/ml。

病毒灭活

对于福尔马林灭活，将病毒用0.2％的福尔马林在4℃孵育1周。然后通过压力透析去除福尔马林，所述压力透析利用生理盐水在4℃进行24小时。透析方法改编自免疫学通用技术(see Andrew et al，(2001)，″Dialysis and concentration of protein solutions″，in Currentprotocols in immunology，Coligan et al.，(eds)，Appendix 3：Appendix3H)。对于UV灭活，将病毒置于60-mm培养皿中，液体的深度为10mm。将病毒在4℃暴露于4000ergs/cm²45分钟。对于γ射线灭活，流感病毒接受来自⁶⁰Co来源(Australian Nuclear Science andTechnology Organization-ANSTO)的10kGy的剂量。病毒储存液在γ照射期间在干冰上保持冷冻。通过灭活的病毒制剂在卵中的滴度来验证病毒感染性的丢失。灭活的病毒储存液的HAU滴度被确定为对于γ灭活的A/PC为7.3x 10⁴HAU/ml，对于福尔马林-和UV-灭活的A/PC为2.4x 10⁴HAU/ml。

保护实验

BALB/c，C57BL/6，129Sv/Ev，β2-微球蛋白(β2m^-/-)，Igμ-链(μMT^-/-)，穿孔素(Prf^-/-)，IFN-γ受体(IFN-IIR^-/-)和MHC-II^-/-小鼠饲养于特定的无病原菌条件。使用10-14周龄的雌性鼠。小鼠用灭活的病毒制剂(3.2x10⁶PFU当量)进行鼻内免疫。对于致死性攻击，在免疫后3周，小鼠鼻内感染A/PR8(7x 10²PFU)。小鼠每天称重，并监测死亡率直至攻击后20天。

过继免疫淋巴细胞转移试验

10周龄供体BALB/c小鼠用γ-照射的A/PC(1x 10⁸PFU当量)进行静脉免疫。在免疫后3周收集脾细胞。制备单细胞悬液并裂解红血细胞。通过使细胞通过尼龙棉柱，将脾淋巴细胞分成B和T细胞群。将2ml 5x 10⁷细胞/ml加载至柱上并在37℃孵育2小时。柱用温(37℃)Hanks平衡盐溶液+5％FCS洗涤，并收集第一洗脱液中的非粘附T细胞。然后通过用冷(4℃)Hanks-平衡盐溶液洗涤来收集尼龙棉-结合的B细胞。通过流式细胞技术分析来验证T(82.8％，+7.94％B细胞)和B(84.2％，+8.3％T细胞)细胞群的纯化。在含有2％FCS的PBS中洗涤小样本的纯化的脾细胞。通过与小鼠CD16/CD32(FcγIII/II受体)Ab(BD Pharmingen)在4℃孵育20分钟来阻断Fc受体。洗涤细胞并进一步与荧光偶联的抗CD3，抗-CD8，抗-CD19(BD Pharmingen)Abs的混合物孵育。死细胞用7-氨基放线菌素D(Sigma-Aldrich)标记。染色的细胞利用FACS Calibur(Becton Dickinson)来量化。纯化的T或B细胞(1.1x 10⁷个细胞在0.2ml体积中)经静脉注射入受体小鼠中，这些小鼠在过继性细胞转移后3小时用A/PR8(7x 10¹PFU)鼻内攻击。监测小鼠体重降低和死亡率直至攻击后20天。

被动血清转移试验

在免疫后3周，收集来自用γ-照射的A/PC鼻内免疫小鼠的血清。收集的免疫血清在56℃加热30分钟以灭活补体。受体小鼠静脉接受200μL的免疫血清。两小时后，受体小鼠用A/PR8(7x10²PFU)攻击。监测小鼠体重和死亡率直至攻击后20天。

空斑减少分析法

免疫后3周，从接种活的、γ-照射的、福尔马林或UV-灭活的A/PC的小鼠收集免疫血清。在56℃对血清样品进行热灭活30分钟，将190μL的系列稀释的(x10，x30，x90，x270)血清与含有约100PFU的10μL病毒(A/PC或A/PR8株)悬浮液混合。在37℃孵育60分钟后，通过MDCK细胞上的空斑检测法测量残余病毒感染性。

细胞毒T淋巴细胞(Tc细胞)检测

通过给BALB/c小鼠静脉注射活A/PC(～2x 10⁶PFU)或者灭活的A/PC(γ-，福尔马林-或UV-灭活的，～1x 10⁸PFU当量)产生流感特异性的Tc细胞。在免疫后7天收获脾脏，并制备红血细胞耗竭的细胞悬液用作效应细胞。通过用感染复数(m.o.i)为1的活A/PC感染P815细胞来制备靶细胞，随后在含有100-200μCi ⁵¹Cr的培养基中孵育1小时。洗涤后，在8小时的铬释放检测中将靶细胞与效应细胞以不同比例混合。在γ计数器中测量上清中的放射性程度。特异性溶解表示为一式三份孔的平均溶解百分比，利用下式来计算值：试验cpm-自发cpm)/(最大释放cpm-自发cpm)x100。对于再次离体Tc细胞反应，初免的小鼠在初次免疫后3月接受静脉第二次免疫，并在免疫后7天收获脾细胞用于铬释放检测。

(ii)结果

免疫血清以及B和T淋巴细胞在由γ-照射的流感病毒诱导的异型免疫中的作用

为了确定抗体在交叉保护免疫中的作用，小鼠用活的A/PR8(7x10¹PFU)或γ-照射的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)鼻内免疫，3周后，收集血液。未接触过抗原的小鼠的组静脉注射200μl γ-照射的A/PC免疫血清、高免疫血清(来自在3周的间隔接受两次剂量的活A/PR8的小鼠)或者预免疫血清，并且在血清转移后2小时用致死剂量的A/PR8病毒(7x 10PFU)攻击。

图10说明了被动型血清转移不能将由γ-照射的A/PC诱发的异亚型免疫转移至未接触抗原的小鼠。血清样品从用单次剂量的γ-照射的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)或两次剂量的活A/PR8(7x 10²PFU)(高免疫)免疫的供体小鼠收集。受体小鼠(每组9到10只)静脉给予0.2ml免疫血清或预免疫血清作为对照。在血清转移后2小时，小鼠用A/PR8(7x 10²PFU)鼻内攻击。每天监测小鼠体重降低(图10A，B&C)和死亡率(图10D)。接受γ-照射的A/PC免疫血清的未接触抗原的小鼠发生的临床体征和体重降低与接受了预免疫血清的小鼠相似(图10A，C&D)。这些小鼠体重迅速降低至25％体重降低的终点，因此不被保护免于异亚型攻击。与之相比，接受了高免疫血清的小鼠受到了完全保护，当用同源性A/PR8(7x 10¹PFU)攻击时几乎没有体重降低(图10B&D)。这些数据表明γ-照射的A/PC诱导的抗体不是交叉保护的。

其次，B细胞缺陷的μMT^-/-小鼠用于评价B细胞在交叉保护免疫中的作用。10周龄的μMT^-/-小鼠经鼻内用γ-照射的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)免疫，并且在免疫后3周用异亚型株A/PR8(7x 10²PFU)攻击。每天监测小鼠体重降低和死亡率，监测20天。接种疫苗的μMT^-/-小鼠显示了与未接触抗原小鼠相似的存活率(图11A，B&C)，这意味着B细胞缺乏的确有损发生交叉保护性免疫。而且，用γ-照射的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)的鼻内疫苗接种不能保护MHC-II^-/-小鼠抵抗A/PR8的异亚型攻击(图12A，B&C)。MHCII^-/-小鼠用γ-照射的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)进行鼻内免疫。免疫后3周，未接触过抗原的和免疫的小鼠(每组9-10只小鼠)用异亚型株A/PR8(7x 10²PFU)攻击。每天监测小鼠体重降低和死亡率，监测20天。用γ-照射的A/PC的免疫接种不能保护MHC-II^-/-小鼠抵抗A/PR8的异亚型攻击。这提供了以下证据：B和CD4+T细胞参与了γ-照射的流感病毒对交叉保护性免疫的诱导。

CD8+Tc细胞反应缺陷的β2M^-/-小鼠用于评价CD8+T(Tc)细胞在由用γ-照射的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)鼻内免疫诱导的交叉保护免疫中的贡献。用A/PR8(7x 10²PFU)的异亚型攻击导致了60％的死亡率，存活的小鼠在恢复前减少了超过10％的体重(图13B&C)。感染了相同病毒株的对照、未接种疫苗的小鼠经历了100％的死亡率(图13A&C)。这表明CD8+T细胞在由γ-照射的流感病毒诱导的交叉保护免疫中起到了关键作用。

尽管这些结果显示了B，CD4+T和CD8+T细胞在抵抗流感的交叉保护免疫中的作用，但在敲除小鼠中的缺陷性初次免疫应答可能阻碍体液和细胞记忆应答的交叉保护潜力。作为评价效应器细胞的性质的另一可选方法，我们利用了过继性转移模型，利用来自3周前经静脉用γ-照射的A/PC(1x 10⁸PFU当量)免疫的小鼠的脾细胞作为供体细胞。脾细胞是尼龙棉-富集的T细胞(82.8％T细胞，7.9％B细胞)或B细胞(84.2％B细胞，8.3％T细胞)，并通过静脉转移至未接触过抗原的小鼠。转移后3小时，小鼠用0.1x LD50A/PR8(7x 10PFU)攻击。每天监测小鼠的体重降低和死亡率，监测20天。T细胞接受者被部分保护抵抗A/PR8攻击(图14A，B&D)。与之相比，在B细胞接受者小鼠中没有观察到保护，A/PR8攻击后，这些小鼠发生了与对照(未接种疫苗的，没有淋巴细胞转移)相似的疾病症状(图14A，C&D)。这些过继性转移研究进一步支持了T细胞而不是B细胞在抵抗A/PR8攻击的交叉保护免疫中的作用。

CD8+T细胞展示了抗病毒效应，通过直接杀伤病毒感染的细胞或分泌诸如IFN-γ和TNF的细胞因子。为了阐明T细胞的哪一效应器功能提供了异亚型免疫，使用prf^-/-小鼠(其缺乏穿孔素介导的溶解功能)和IFN-IIR^-/-小鼠(其免疫细胞对IFN-γ无反应)。prf^-/-小鼠用γ-照射的A/PC(3.2x 10PFU当量)进行鼻内免疫。免疫后3周，未接触过抗原的和免疫的小鼠(每组9-10只小鼠)用异亚型株A/PR8攻击(7x10²PFU)。每天监测小鼠的体重降低和死亡率，监测20天。用γ-照射的A/PC的疫苗接种不能提供给prf^-/-小鼠显著的交叉性保护(图15A，B&C)。这有力地表明，γ-照射的A/PC诱导的交叉性保护需要穿孔素介导的溶解功能，其与CD8+T和NK细胞有关。

与之相比，用γ-照射的A/PC免疫(相同条件)的IFN-IIR^-/-小鼠被充分保护抵抗A/PR8的致死性攻击(图16A，B&C)。因此，IFN-γ功能对于交叉保护性免疫的诱导不是必需的。

交叉中和性活性在γ-照射的A/PC免疫的小鼠血清中的缺乏

如以上实施例3所提及的，用γ-照射的(但不是福尔马林-或UV-灭活的)流感病毒的免疫诱发交叉保护性免疫。因此，检测了由不同灭活的流感制剂诱导的免疫血清抵抗同源和异亚型流感A病毒株的交叉中和性活性。对于用活的、γ-照射的、福尔马林或UV-灭活的A/PC免疫后3周收集的血清，通过空斑减少测定法来确定抵抗A/PC(H3N2)或A/PR8(H1N1)的病毒中和活性。血清样品在56℃热灭活30分钟后，将190μl系列稀释的(x10，x30，x90，x270)的血清与含有约1x10²PFU的10μl病毒悬浮液混合。孵育60分钟后，病毒/血清混合物添加至6孔板中用于空斑检测。从所有接种疫苗的动物收集的免疫血清含有高水平的抗同源株A/PC(H3N2)的中和活性(图17A)。当针对异亚型株A/PR8(H1N1)进行测试时，相同的免疫血清显示了与未接触过抗原的血清相似的中和活性水平(图17B)。这些数据表明，用任一灭活的流感病毒制剂(包括γ-照射的流感病毒在内)的免疫诱发了高的株特异性中和抗体，如果有的话，其具有有限的交叉中和活性。

通过γ-照射的A/PC的交叉反应性Tc细胞反应的诱导和幅度是剂量依赖性的

H3N2和H1N1流感病毒间的血清交叉中和活性的缺乏、在确定的敲除小鼠中的交叉保护性免疫的缺乏，以及来自过继性转移试验的结果表明，细胞免疫在保护小鼠抵抗异亚型攻击中起关键作用。为了表征T细胞在接种疫苗的小鼠中的溶细胞作用，小鼠经静脉用不同剂量的活的或γ-照射的A/PC免疫，并在免疫后6天检测它们的脾细胞的特异性靶细胞杀伤活性。两只BALB/c小鼠的各组经静脉用不同剂量的活的或γ-照射的A/PC免疫，并在免疫后6天收获脾细胞。脾细胞用作针对模拟处理的或A/PC或A/PR8感染的P815靶细胞的效应细胞。活的A/PC在宽范围的免疫剂量引发强Tc细胞反应(图18A)。用高剂量(10⁸PFU当量)的γ-照射的A/PC的免疫也引发针对A/PC和A/PR8感染的靶标的强Tc细胞反应(图18B)。然而，低剂量(1.6x 10⁵PFU当量或更少)的免疫没有诱发统计学上显著的交叉反应性Tc细胞反应。因此，通过γ-照射的A/PC的Tc细胞反应的幅度与免疫剂量相关。

记忆性Tc细胞通过γ-照射的A/PC的诱导

如以上实施例3所述，用γ-照射的A/PC的免疫提供了至少3个月的交叉保护。因此，研究了可以负责长效保护的记忆性T细胞的寿命。两只BALB/c小鼠的各组经静脉用活的A/PC(2x 10⁶PFU)，A/PR8(1x 10⁷PFU)或γ-照射的A/PC(1x 10⁸PFU当量)免疫一次或两次。初免后3周给予再次免疫。再次免疫后7天收获脾细胞，并将其用作针对模拟的、A/PC-或A/PR8感染的P815靶细胞的或者用Kd限制性核蛋白衍生肽(NPP)标记的靶细胞的效应细胞。用活的异亚型株A/PR8的再次免疫诱发强的再次Tc细胞反应(图19)。与之相比，接受活的同源株A/PC作为再次免疫的小鼠在Tc细胞功效方面没有显示增加。

(iii)讨论

如以上实施例所提及的，γ-射线灭活的流感A病毒，特别是当鼻内给药时，提供了针对致死性同源和异亚型病毒攻击，包括强毒力的禽H5N1株的有力保护。这些数据表明，主要由Tc细胞介导的交叉反应性细胞免疫，而不是体液免疫是负责γ-照射的流感病毒诱导的交叉保护免疫的必要因素。这一结论是基于以下几种独立的证据线索：1)β2M^-/-小鼠不产生交叉保护性免疫反应；2)富集的T细胞而不是B细胞或免疫血清从被赋予交叉反应免疫的γ-灭活的流感免疫供体小鼠转移至未接触过抗原的接受体；以及3)由制剂诱导的交叉保护性免疫依赖于必需的溶细胞效应分子穿孔素。

后一发现，以及在IFN IIR^-/-小鼠诱导的交叉保护性免疫的诱导有力地表明，溶细胞性Tc细胞提供的保护是通过经由它们的细胞毒性的颗粒胞吐途径对病毒感染的细胞的杀伤，而不是通过CD8+T细胞IFN-γ-介导的病毒控制。与上述一致，用γ-照射的流感病毒的免疫能够引发与由活病毒诱导的T细胞反应相似的T细胞反应。这种交叉反应性T细胞潜力持续至少3个月，并且当体内再免疫时导致更强的再次Tc反应。这与以下观察到的结果相关：用γ-照射的流感病毒免疫的小鼠被很好地保护抵抗异亚型攻击至少3个月。然而，用同源株的免疫没有增强再次Tc反应。这一观察结果表明，初次免疫引发了高的株特异性抗体反应，其中和了用同源病毒的再次攻击，由此防止了记忆性Tc细胞活化。

交叉反应性Tc细胞反应的诱导对γ-照射的病毒是高度剂量依赖的，相比于复制的活病毒。Tc细胞被鉴定为提供异源亚型保护的优势因素，仍有一些证据表明B细胞对这种保护反应有作用，因为μMT^-/-小鼠也显示了对异亚型攻击增加的敏感性。交叉中和抗体反应在血清中的缺乏以及转移的血清的保护效应的缺乏表明B细胞的贡献独立于它们主要的可溶性产物，即抗体。在一些情形下，未接触过抗原的B细胞被认为能够在μMT^-/-小鼠中以独立于抗体的方式恢复针对再次感染的免疫。此外，B细胞可以具有促进效应器Tc细胞功能的作用。因此，交叉保护性抗体的可能作用不能被忽视，以及粘膜交叉中和抗体也可以有助于异亚型免疫。在β2M^-/和prf^-/-小鼠中观察到部分交叉保护，尽管不是统计学上显著的，支持这一观点。而且，通过过继性T细胞转移获得的被动免疫在保护抵抗亚致死剂量的强毒力A/PR8中仅是部分成功的。因此，两种抗体以及Tc细胞可以最终有助于最优交叉保护。

实施例5：γ-射线灭活的流感疫苗与UV-灭活的和福尔马林-灭活的流感疫苗相比的优势

(i)材料和方法

小鼠

9至10周龄雌性BALB/c小鼠常规用于这些研究中。

病毒和细胞

P815肥大细胞瘤、Madin-Darby犬肾(MDCK)和幼仓鼠肾(BHK)细胞生长并维持在添加5％FCS的EMEM中，置于37℃含有5％CO₂的湿润环境中。流感A型病毒，A/PR/8[A/Puerto Rico/8/34(H1N1)]和A/PC[A/Port Chalmers/1/73(H3N2)]生长在10日龄的含胚鸡卵中。每个卵用含有1血细胞凝集素单位(HAU)病毒的0.1ml生理盐水注射，在37℃孵育48小时，然后置于4℃过夜。收获尿囊液，将其合并并储存于-80℃。利用MDCK细胞上的空斑检测方法，滴度为10⁷PFU/ml(A/PC)和2x 10⁸PFU/ml(A/PR8)。利用用于疫苗制剂的鸡红血细胞，纯化病毒，如在(Sheffield，et al.(1954)，″Purification of influenza virusby red-cell adsorption and elution″，British journal of experimentalpathology，35：214-222)中所述。简言之，感染性的尿囊液与红血细胞在4℃孵育45分钟，从而允许血细胞凝集素结合红血细胞，然后离心以去除尿囊液上清。将沉淀团悬浮在生理盐水中，在37℃孵育1小时以从病毒释放红血细胞，然后离心以去除红血细胞，并收集上清中的病毒。纯化的A/PC储存病毒滴度为5x 10⁸PFU/ml。

病毒灭活

对于福尔马林灭活，将病毒用0.2％的福尔马林在4℃孵育1周。然后通过压力透析去除福尔马林，所述压力透析利用生理盐水在4℃进行24小时。透析方法改编自免疫学通用技术(参见，Andrew et al，(2001)，″Dialysis and concentration of protein solutions″，in Currentprotocols in immunology，Coligan et al.，(eds)，Appendix 3：Appendix3H)。对于UV灭活，病毒置于60-mm培养皿中，液体的深度为10mm。将病毒在4℃暴露于4000ergs/cm²45分钟。对于γ射线灭活，流感病毒接受来自⁶⁰Co来源(Australian Nuclear Science and TechnologyOrganization-ANSTO)的10kGy的剂量。病毒储存液在γ照射期间在干冰上保持冷冻。通过灭活的病毒制剂在卵中的滴度来验证病毒感染性的丢失。灭活的病毒储存液的HAU滴度被确定为对于γ-A/PC为7.29x 10⁴HAU/ml，对于福尔马林-和UV-A/PC为2.43x 10⁴HAU/ml。

γ-射线灭活的流感病毒的冻干

对于冻干，含有0.5ml γ-射线灭活的A/PC的一个小瓶置于Manifold Freeze-Dryer(FTS SYSTEMS，Dura-DryTM MP)中。

血细胞凝集检测

活的和灭活的病毒制剂在96孔U-底微量滴定板中连续稀释在100μl体积中。将0.5％的鸡红血细胞悬液添加至所有孔，并将板在冰上孵育30分钟。该方法改编自微生物学通用技术(参见，Szretter et al.(2006)，″Influenza：propagation，quantification，and storage″，in CurrentProtocols in Microbiology，Coico et al.(eds)，Chapter 15：Unit 15G 11)。

保护实验

BALB/c小鼠饲养于无特定病原菌条件。使用10-14周龄的雌性鼠。小鼠用灭活的病毒制剂(3.2x10⁶PFU当量)或三价灭活的亚单位流感疫苗(CSL fluvax疫苗；A/Solomon Islands/3/2006 H1N1，A/Brisbane/10/2007 H3N2，B/Florida/4/2006；3mg血细胞凝集素)经鼻内进行免疫。2和3周后，福尔马林灭活的A/PC接种的小鼠再免疫一次或两次。对于致死性攻击，在免疫后1-3周，小鼠经鼻内感染50％小鼠致死剂量(MLD50)。在初步试验中，对于A/PR8和A/PC，MLD50被分别确定为7x10²PFU和3.2x 10⁵PFU。低于肺脏病毒滴度的分析，3只小鼠在攻击后第3天和第6天被实施安乐死。监测其余动物的体重和死亡，直至攻击后的20天。

空斑检测

经鼻内攻击后3天和6天收集肺脏组织样品。取出后，将整个肺脏在生理盐水中匀浆。匀浆液在1500rpm下离心5分钟。收集上清液并储存于-20℃。将样品的连续稀释液接种在培养于6孔组织培养板的MDCK细胞上。1小时吸附后，在细胞上覆盖含有1.8％Bacto-琼脂的EMEM培养基。孵育2-3天后，细胞单层用2.5％结晶紫溶液染色，并计数空斑。

肺脏组织学

肺脏组织样品在10％的中性缓冲甲醛固定最少24小时。10μm切片用苏木精-伊红染色，并且通过光学显微镜评价。

细胞毒T淋巴细胞(Tc细胞)检测

通过给BALB/c小鼠静脉注射活A/PC或者灭活的10⁸PFU当量的A/PC(γ-照射的，福尔马林-或UV-灭活的)产生流感特异性的Tc细胞。在免疫后7天收获脾脏，并制备红血细胞耗竭的细胞悬液用作效应器细胞。通过感染P815细胞来制备靶细胞，对于活的A/PC，感染复数(m.o.i)为1，对于灭活的A/PC，感染复数为10，随后在含有100-200μCi ⁵¹Cr的培养基中孵育1小时。洗涤后，在8小时的铬释放检测中将靶细胞与效应器细胞以不同比例混合。在γ计数器中测量上清中的放射活性水平。特异性溶解表示为一式三份孔的平均溶解百分比，利用下式计算值：试验cpm-自发cpm)/(最大释放cpm-自发cpm)x100。

(ii)结果

病毒灭活对血细胞凝集活性的影响

病毒灭活后的血细胞凝集活性提供了关于杀灭处理的变性效应的一个指标。纯化的流感病毒储存物被等分为几批，用福尔马林、UV或γ-照射处理。感染性完全灭活后，比较活的和灭活的病毒的血细胞凝集活性(表7)，感染性的完全灭活通过在含胚卵中不存在病毒生长来验证。

表7.灭活的流感病毒A/PC制剂的血细胞凝集活性

对于γ-照射的病毒，血细胞凝集活性降低3倍，而福尔马林和UV灭活导致血细胞凝集滴度9倍的降低。这些结果提供了以下证据：在这三种病毒杀灭方法中，γ-照射使病毒蛋白结构变性最小。

γ-照射的而不是福尔马林或UV-灭活的病毒制剂诱发异亚型免疫

比较了γ-照射的、福尔马林-或UV-灭活的流感病毒制剂针对同-和异亚型活病毒攻击的保护功效。9-10只BALB/c小鼠的各组被模拟处理或经鼻内用福尔马林-或UV-或γ-射线灭活的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)免疫，以及在免疫后3周，未接触过抗原的和免疫的小鼠(9-10只小鼠每组)用A/PC(MLD50；3.2x 10⁵PFU)或A/PR8(MLD50；7.0x10²PFU)经鼻内感染。每天监测感染的小鼠的存活，监测20天。如图20A，E，F&J所显示的，未接触过抗原的小鼠经鼻内感染A/PC或A/PR8导致迅速的体重降低，死亡率为90-100％(基于25％体重降低作为终点)。用福尔马林灭活的A/PC(图20B&E)或UV-灭活的A/PC(图20C & E)免疫的小鼠在用活的同源病毒攻击时也发生了显著的体重降低，并产生了约70％的死亡率。当相似疫苗接种的小鼠用异亚型株A/PR8攻击时，动物丢失的体重显著，死亡率为90-100％(图20G，H，& J)。在同源和异亚型攻击两种情况下，诱导的保护被认为不足以用作疫苗(P值＞0.05，Fisher′s精确检验)。与之相比，用单一剂量的γ-灭活的A/PC免疫的小鼠不仅保护抵抗同源病毒攻击，还抵抗异亚型攻击，小鼠平均只丢失了5％的体重(Figure 20D，E，I&J)。因此，到目前为止，γ-照射的流感病毒被证明是诱发抗同-和异亚型流感病毒攻击的保护免疫的最有效疫苗制剂(P＜0.05)。

多次剂量的福尔马林灭活的流感病毒制剂能够增强保护效应吗？

γ-射线灭活的A/PC在仅有一次鼻内剂量后明显比多次鼻内给药福尔马林灭活的制剂更有效。接下来通过测试不同免疫方案来确定是否福尔马林灭活的A/PC的弱保护功效能够被改善。9-10只BALB/c小鼠的各组被模拟处理或用福尔马林灭活的A/PC免疫一次、两次或三次(9.6x 10⁶PFU当量或相当于γ-射线灭活的A/PC的HAU剂量；2300HAU)。在免疫后3周，模拟处理的或单次剂量免疫的小鼠用A/PC(MLD50；3.2x 10⁵PFU)攻击。两次或三次剂量免疫的小鼠在末次免疫后一周，用A/PC(MLD50；3.2x 10⁵PFU)或A/PR8(MLD50；7x10²PFU)经鼻内感染。每天监测感染的小鼠的存活，监测20天。接受单次免疫的小鼠组与未进行疫苗接种的小鼠相比，没有改善的存活率(图21A，B&E)。与之相比，两次免疫改善存活率至60％(P＜0.05)，尽管大多数小鼠仍显示出显著的体重降低，这表明它们经历了严重的疾病(图21C&E)。接受三次福马林灭活的A/PC免疫的小鼠显示出完全的保护，没有死亡率，几乎没有体重降低(图21D&E)。三次免疫提供了对于异亚型攻击的部分保护(P＜0.05)(图21F，G&H)。因此，福尔马林灭活的A/PC需要更多次剂量，并且不能引发交叉保护，这提示诱发的免疫不仅在量上而且在质上都显著弱于γ-射线灭活的A/PC诱发的免疫。

三价流感疫苗抗漂移株(drifted strain)无效

对于直接的比较，在本文描述的试验方法中测试了商购的三价流感疫苗的保护功效。小鼠用三价流感疫苗(CSL fluvax疫苗；A/Solomon Islands/3/2006 H1N1，A/Brisbane/10/2007H3N2，B/Florida/4/2006；3μg血细胞凝集素)经鼻内免疫一次，在免疫后3周，未接触过抗原的和免疫的小鼠用A/PC(3.2x 10⁵PFU/小鼠)或A/PR8(7x 10²PFU)经鼻内攻击。每天监测感染的小鼠的存活，监测20天。如图22所示，小鼠的单次鼻内免疫针对A/PC(3.2x10⁵PFU)(图22A，B&C)和A/PR8株(7x 10²PFU)(图22D，E&F)没有提供统计上显著的保护。这清楚地表明，目前的流感疫苗在单次剂量后没有提供相当的交叉保护，即便针对同一亚型内的株。

γ-射线灭活的A/PC接种后，最低限度的流感感染诱发的肺部炎症

用γ-照射的、福尔马林-和UV-A/PC疫苗接种(3.2x 10⁶PFU当量)后3周，小鼠用A/PC(同源的)或A/PR8株(异亚型)活病毒攻击。攻击后21天收获存活小鼠的肺脏，并将肺脏处理用于组织学。肺脏样品显示了显著的组织学差异，与给予的免疫类型相对应。如图23所示，当接种疫苗的小鼠用同源病毒A/PC攻击时观察到有限的炎症反应。来自所有三组接种疫苗小鼠(γ-照射的、福尔马林-和UV-灭活的A/PC)的肺脏切片在它们表观上与未接触过抗原的组织相当(图23A，C，D，&E)。相反，来自未接种疫苗的肺组织，用A/PC攻击后，小鼠显示出广泛的炎症反应(图23B)。异亚型攻击导致不同疫苗接种组的明显差异。

疫苗接种后21天，A/PR8攻击后，福尔马林和UV-A/PC疫苗接种的动物的炎症反应是强烈的，并且与未接种动物的反应相似(图24B，D&E)。相比之下，用A/PR8异亚型攻击后，γ-照射的A/PC接种的小鼠的肺脏炎症是局限的(图24C)。尽管这些肺脏显示出局域化的炎症以及弱淋巴细胞浸润，总体情况与未接触过抗原的肺脏相似(图24A)。

γ-射线灭活的A/PC疫苗没有预防感染，但促进了病毒清除

用A/PR8异亚型攻击后第3天和第6天，评价了疫苗接种对肺脏病毒负荷的影响。BALB/c小鼠用γ-照射的、福尔马林或UV灭活的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)经鼻内免疫，以及在免疫后3周，未接触过抗原的和免疫的小鼠用A/PR8病毒(MLD50)经鼻内攻击。在感染后第3天和第6天，每组处死三只小鼠，如上所述通过利用MDCK细胞的空斑检测法确定肺脏的病毒滴度。在感染后第3天和第6天，在未接种疫苗的小鼠中分别检测到达10⁷和10⁶PFU/肺脏的高病毒滴度(图25)。福尔马林或UV灭活的A/PC免疫的小鼠的肺脏中的病毒滴度与在未接种疫苗的对照小鼠中检测到的滴度相当。相反，与在未接种疫苗的对照小鼠中观察到的相比，γ-照射的A/PC接种组在攻击后第3天和6天显示了大于100倍降低的A/PR8肺脏病毒滴度(P＜0.05，利用Student′s T检验)。

γ-照射的而不是福尔马林或UV-灭活的病毒保留Tc细胞免疫原性

比较了通过活A/PC和灭活的A/PC(γ-射线，福尔马林-和UV)产生流感免疫细胞毒T(Tc)细胞反应的能力。BALB/c小鼠用活的、γ-照射的、福尔马林-、或UV-灭活的A/PC经静脉免疫。免疫后7天收获脾细胞，并将其作为抗A/PC感染的P815靶细胞的效应细胞。免疫后第7天，检测活病毒感染后的Tc细胞反应峰值(数据未显示)。静脉免疫后第7天，评估了每组的两只小鼠。从用活的(10⁷PFU)或γ-射线灭活的A/PC(10⁸PFU当量)免疫的小鼠收获的效应脾细胞溶解A/PC感染的靶细胞，而来自福尔马林-或UV-灭活的A/PC免疫的小鼠的效应细胞则不能(图26)。

用γ-射线灭活的A/PC的鼻内免疫提供了抗高剂量异亚型攻击的保护

考虑到γ-照射的A/PC保护小鼠免于异亚型攻击的出色的保护能力，通过用增加的流感病毒剂量攻击检测了保护的极限(图27)。9-10只BALB/c小鼠的各组被模拟处理，或用γ-射线灭活的A/PC(3.2x 10⁶PFU/ml当量)鼻内免疫，以及在免疫后第3天，小鼠用LD50A/PR8，5x LD50A/PR8或50x LD50A/PR8鼻内攻击。感染的小鼠的存活和体重降低被监测20天。接受1x LD50异亚型攻击的免疫的小鼠全部存活，有很少或没有体重降低(图27C&F)。给予5x LD50攻击剂量的免疫小鼠在攻击后的前7天期间最初减少重量，但并不显著，并且全部小鼠完全恢复(图27D&F)。接受50x LD50的小鼠平均降低了8％的体重，但全部小鼠同样完全恢复(图27E&F)。接受1x LD50或5xLD50的未接触过抗原的小鼠进行性降低重量，并且不能存活于攻击(图27A，B&F)。

γ-射线灭活的制剂提供的长久异亚型保护

对有效流感疫苗的关键需求是诱导持久性异亚型免疫。9-10只BALB/c小鼠的各组被模拟处理或用γ-射线灭活的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量)经鼻内免疫。免疫后3个月，小鼠用MLD50A/PR8(7x 10²PFU)鼻内攻击。监测感染的小鼠的存活和体重降低，监测20天。用1x LD50A/PR8攻击的接种疫苗的小鼠仅平均减少了多达10％的体重，并且完全恢复(图28B&C)。相反，受到攻击的未接触过抗原的小鼠的大多数体重显著降低，在攻击后约7天达到25％总体重降低的终点(图28A&C)。

冻干不破坏γ-射线灭活的A/PC的免疫原性

目前液体流感疫苗的已知缺点是需要冷冻保藏，这对疫苗的配送带来了问题，特别是在发展中国家。试图克服目前流感疫苗严格的保藏条件，评价了作为简略冷冻条件手段的冻干的γ-射线灭活的流感病毒。γ-射线灭活的A/PC储存液被冷冻干燥并在鼻内给药前立即重悬在蒸馏水中(3.2x 10⁶PFU当量)。9-10只BALB/c小鼠的各组被模拟处理，或用冻干的γ-射线灭活的A/PC免疫，以及在免疫后第3周，小鼠用异亚型株A/PR8(7x 10²PFU)鼻内攻击。监测感染的小鼠的存活和体重降低，监测20天。大多数小鼠降低了不到10％的总体重，仅有2/10的小鼠降低了超过10％的总体重，显示了轻度的症状。所有接种疫苗的小鼠在用A/PR8(7x 10²PFU)异亚型攻击后存活，这与未接触抗原的小鼠10％的存活率相反(图29A，B&C)。这些数据表明冻干过程没有明显降低γ-射线灭活的A/PC诱发异亚型免疫的能力。

γ-射线灭活的流感疫苗与裂解疫苗相比的优势

比较了商购的流感疫苗，Flu-vax，与γ-照射的纯化流感病毒在小鼠鼻内疫苗接种后的交叉保护功效，显示在下面：

因此，基于等价的病毒剂量，γ-照射的流感疫苗至少比商购的流感疫苗有效30-100倍，并且在质量方面优于目前商购的流感疫苗。

(iii)讨论

本研究在比较情形下评估了三种类型的灭活方案(γ-照射、以及福尔马林或UV-灭活)的保护功效以评价是否自1945一直使用的目前使用的化学灭活方法是用于流感疫苗制备的最合适的选择。据显示，γ-射线灭活的A/PC(3.2x 10⁶PFU当量，2300HAU)与其他灭活方法相比具有更优的免疫原性，并且提供对同源和异亚型攻击的高水平保护。这种更好的保护反映在100％存活率和较低的体重降低中，其与感染后肺组织的组织学评价相关，以及与未接触抗原的和福尔马林-或UV-灭活的病毒接种小鼠相比降低的肺脏病毒负荷。类似地，单次剂量的目前使用的三价流感疫苗没有提供针对A/PC或A/PR8攻击的保护。

需要三倍高剂量的福尔马林灭活的A/PC(9.6x 10⁶PFU当量，2300HAU)和多次免疫以达到由γ-射线灭活的A/PC提供的保护水平。此外，福尔马林灭活的A/PC提供的保护仅针对同源(不针对异亚型)病毒攻击。因此，免疫剂量和频率的增加仅改善了福尔马林灭活的病毒的株特异性免疫。重要的是，注意到对于每一灭活的病毒颗粒，γ-射线灭活的病毒比福尔马林灭活的病毒更具免疫原性，因为福尔马林灭活的病毒制剂对于可比较的HAU剂量需要三倍高的PFU和三次免疫，相反对于γ-照射的A/PC需要单次初免(priming)就获得株特异性免疫。这些发现证实了γ-射线灭活相对于其他操作维持较好的抗原性和免疫原性。因此γ-射线灭活的病毒能够诱导免疫，其不仅在量上，而且在质上都优于通过福尔马林处理或UV照射灭活的病毒制剂。

在大流行情况下，如通过γ-照射的病毒有希望的单次剂量方案会比需要佐剂的多次、大剂量的福尔马林灭活的流感疫苗免疫方案更无比地可取。而且，γ-射线灭活的流感病毒不需要佐剂这一事实表明反应原性问题较不可能发生。Alum是最常用的人类疫苗佐剂，但它已被证实在增强流感疫苗抗原的免疫原性方面是无效的。此外，alum将免疫反应倾向针对T辅助(Th)2型支持的体液免疫反应，这降低了γ-射线灭活的病毒的有效性，因为已知后者诱导Th1-型细胞免疫应答，包括与异亚型保护相关的Tc细胞应答。此外，γ-照射的流感病毒的功效通过以下事实被突出：单次剂量的鼻内初免后，免疫的小鼠能够抵抗高达50x LD50的异亚型攻击剂量多达3个月的时间，这强调了诱发的强效免疫。

据推测，由γ-照射的病毒诱导的交叉保护通过粘膜Tc细胞反应来介导。另外的假设有针对内部病毒蛋白的交叉反应性分泌IgA抗体的诱导。一些分泌性IgA抗体能够在反向摄入感染的上皮细胞时，在细胞内中和流感病毒，并且本数据表明，交叉反应性Tc细胞可以负责本文观察到的交叉保护，因为其他形式的灭活流感病毒不能引发流感-免疫Tc细胞应答。而且，γ-射线灭活对血细胞凝集活性具有较少影响，与福尔马林或UV灭活相比，保留与其天然形式相似抗原看起来的确至少部分负责它较好的免疫原性。鼻内给药靶向肺脏粘膜相关的淋巴器官用于诱发呼吸道免疫。然而，之前在市场上销售的鼻内给药的流感疫苗与贝尔氏麻痹(Bell′s palsy)病例-面神经麻痹有关(参见，Mutsch，et ai，(2004)，″Use of the inactivated intranasal influenzavaccine and the risk of Bell′s palsy in Switzerland″，The New Englandjournal of medicine，350：896-903)，结果导致了该疫苗制剂的市场收回。这一负面事件归因于使用的粘膜佐剂；大肠杆菌不耐热毒素。这种安全关注对γ-射线灭活的流感疫苗不是问题，因为它不需要在其疫苗制剂中添加潜在地有害的佐剂。

除去观察到的强保护功效，几种额外的因素有助于γ-照射对流感疫苗的吸引力。第一，冻干的γ-射线灭活的A/PC维持它的交叉保护特性。干粉制剂相对于液体制剂在多种储存条件下会改善稳定性，从而在大流行事件中在疫苗的分配中提供了显著的优势。第二，几乎不需要培训和医学人才的经鼻内的递送途径会为发展中国家提供另外的优势。第三，γ-射线灭活的流感疫苗制造相对容易和廉价，当与其他疫苗生产方法相比。对于生产考虑因素和可利用性最重要的，由γ-射线灭活的流感疫苗诱导的强效异亚型保护可以提供用过的流感疫苗的年度再形成。

实施例6：用于γ-照射的流感病毒的制备

用于目前流感疫苗的病毒通常在减活前利用超离心纯化，这与病毒抗原的丢失和/或病毒粒子结构的破坏有关。通过γ-照射的流感疫苗诱发的细胞毒T细胞反应受益于γ-照射前的病毒纯化的替代方法(差异/切向过滤)，其保存了病毒粒子结构的完整性。

根据设想，病毒储备物利用低速(约3000rpm)离心进行澄清，并用于基于尺寸排阻离心。使澄清的储备物旋转通过孔径为50-80nm过滤装置。一般地，流感病毒的尺寸为80-120nm。因此，可变的孔径(例如，小于80nm)会用于以低离心速度(4000-10000rpm)(可以利用可变的速度)在4℃纯化流感病毒足够长时间以使液体通过滤器。在滤器上游侧的初始病毒储备物液体流路径是切向的或横越滤器表面。离心时，大多数液体会通过滤器(渗透)，而小部分会作为滞留物(包含所有病毒)保留在中心储库。

滞留物用可以包含糖(右旋糖苷、蔗糖)的PBS(生理盐水或任何其他介质)再稀释以维持渗透压力以及因此的病毒完整性。这些稀释的制剂可以再次过滤，如果需要的话。来自末次离心步骤的浓缩的病毒用上述实施例描述的γ-照射来处理。自由基清除剂，诸如抗坏血酸能够在照射前添加到纯化的病毒储备物中以在γ-照射期间灭活病毒基因组时降低对病毒蛋白可能的损伤。

例如，可以利用下述方案用于纯化用于γ-照射的完整流感病毒：

1.能够从含胚卵或体外组织培养物中收获流感病毒储备物。

2.利用截止(cut off)为300Kd的过滤装置，病毒储备物能够通过在4℃以300g离心30分钟来澄清，导致流感病毒和尿囊液(或组织培养基)的蛋白通过滤器。

3.利用截止为100Kd的过滤装置，澄清的病毒储备物能够通过在4℃以300g离心30分钟来纯化。在该步骤中，流感病毒不通过滤器(由此浓缩病毒)在滤器的一侧。

4.浓缩的病毒能够用生理盐水(或任何缓冲介质)来洗涤以移除任何剩余的卵蛋白(洗涤可以根据需要进行多次)。能够通过用盐水稀释浓缩的病毒和如以上步骤3中所描述的离心来进行洗涤。

5.最后的病毒浓缩液会包含完整的病毒粒子。

一般地，用于上述技术中的过滤装置的孔径截止水平能够设计为匹配80-120nm的病毒粒子孔径。可以在4℃进行所有操作，不需要超速离心法。可以测试原始储备物和终产物的病毒感染性。病毒滴度和体积的现有知识能够有助于浓缩水平的评估。能够利用标准的生物化学分析来确定终产物的纯度。

通过引用的并入

本申请要求于2008年8月1日提交的美国临时专利申请号61/085,802的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。

Claims

1.经γ-照射的流感病毒在制备治疗或预防个体中多种流感病毒亚型感染的药物中的用途，所述药物被配制成用于鼻内给药。

2.经γ-照射的流感病毒在制备诱发或增强个体中针对多种流感病毒亚型的交叉反应性免疫的药物中的用途，所述药物被配制用于鼻内给药。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述交叉反应性免疫包括交叉反应性细胞免疫和交叉反应性体液免疫。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述交叉反应性细胞免疫包括下述之一或两者：

(i)交叉反应性辅助性T细胞反应

(ii)交叉反应性细胞毒T细胞反应。

5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述经γ-照射的流感病毒从通过切向/错流过滤纯化的病毒储备物中制备。

6.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述经γ-照射的流感病毒通过γ-照射冷冻的病毒制剂来产生。

7.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述经γ-照射的流感病毒制备为冻干形式。

8.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述多种流感病毒亚型包括人、禽、猪、犬或马流感病毒亚型的一种或多种。

9.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述多种流感病毒亚型包括流感A亚型HPAI A(H5N1)。

10.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述多种流感病毒亚型包括流感A亚型HlNl 09猪流感。

11.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述经γ-照射的流感病毒选自A/WSN[HlNl],A/PR8[HlNl],A/JAP[H2N2]和A/PC[H3/N2]。

12.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述经γ-照射的流感病毒通过将所述病毒暴露于总剂量为6.5X l0⁴拉德至2X 10⁷拉德的γ射线来产生。

13.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述经γ-照射的流感病毒通过将所述病毒暴露于总剂量为1X10⁶拉德的γ射线来产生。

14.制备鼻内流感疫苗的方法，所述疫苗能够诱发针对多种流感病毒亚型的交叉反应性免疫，所述方法包括通过γ-照射灭活流感病毒制剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述流感病毒制剂在通过γ-照射进行所述灭活前通过切向/错流过滤来纯化。

16.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述流感病毒制剂是在冷冻同时进行γ-照射。

17.如权利要求14或权利要求15所述的方法，包括在通过γ-照射进行所述灭活后冻干所述病毒的额外步骤。

18.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述多种流感病毒亚型包括流感A亚型HPAI A(H5N1)。

19.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述多种流感病毒亚型包括流感A亚型HlNl 09猪流感。

20.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述灭活包括将所述病毒暴露于总剂量为6.5X 10⁴拉德至2X 10⁷拉德的γ射线。

21.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述灭活包括将所述病毒暴露于总剂量为1X 10⁶拉德的γ射线。