KR20100082825A - 유행성 인플루엔자 바이러스에 대항하여 면역 반응을 유발하는 방법 - Google Patents

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Abstract

인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하는 방법은,
(i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

Description

유행성 인플루엔자 바이러스에 대항하여 면역 반응을 유발하는 방법{METHOD OF ELICITING AN IMMUNE RESPONSE AGAINST PANDEMIC INFLUENZA VIRUS}
본 발명은 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 면연 반응을 유발하거나 유도하는 방법에 관한 것으로, 특히, 인간 내에서 감염을 일으키는 조류 인플루엔자 A (H5N1)와 같은 인플루엔자 A의 병원성, 유행성 아류형의 이후 공격에 대항하여 대상체를 보호하는 대상체 내에서 면역 반응을 유발하거나 유도하는 방법에 관한 것이다.
인플루엔자는 인간에게 있어서 질병의 주요한 원인이며 중요한 병적 상태 및 사망의 근원으로, 매년 전세계적으로 많은 인간 집단에 영향을 주었다. 인플루엔자 바이러스는 아류형 A, B 및 C로 분류될 수 있다. 인간 집단 내에서 퍼지는 대다수의 바이러스는 인플루엔자 A 및 B이다.
연간 백신접종은 감염을 방지하기 위한 주된 전략이다. 인플루엔자의 A 균주는, 두개의 바이러스성 표면 막횡단 단백질(surface transmembrane proteins)의 항원 차이에 기초하여, 해마글루티닌(Haemagglutinin, HA) 및 뉴라미니다제(Neuraminidase, NA)인 아류로 더 분류될 수 있다. 지금까지 인플루엔자 A 바이러스의 16 HA (HA1-16) 및 9 NA (NA1-9) 당단백질 아류형이 확인되었다. 현재, 인플루엔자 A의 두 아류형이 인간 내에 펴져 있다(H1N1 및 H3N2)[1].
종종, 사람들에게 면역력이 거의 없거나 전혀 없는 새로운 인플루엔자 바이러스가 출현할 때 인플루엔자 유행이 일어날 수 있다. 지난 세기에는, 세 개의 인플루엔자 A 균주 유행이 발생하여 상당 수의 인간 인플루엔자-관련 사망자가 생겼다(1918, H1N1; 1957, H2N2; 1968, H3N2)[2]. 1997년 홍콩에서는, 고병원성 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스가 닭에서 인간에게 직접 전염되어, 18명의 감염 확인자 중에서 6명이 죽었다[3;4]. 그 이후로, 인플루엔자 유행병에 대한 관심이 병원성 H5N1 바이러스의 산발적인 발생에 의하여 고조되었다. 이러한 발생들은 아시아에서부터 유럽에 이르기까지(캄보디아, 중국, 인도네시아, 태국, 터키 및 베트남) 일어나서, 6 대륙에 걸쳐 258 명의 사례를 만들었으며 그 중 153명이 죽었다[5].
1997년 이후, H2N2, H9N2, H7N7, H7N3 및 H10N7을 포함하여, 몇 개의 다른 아류형의 바이러스도 인간 감염에 포함되었으며, 결과적으로 이러한 아류형 역시 상당한 정도로 유행병의 위협이 된다. 인플루엔자 바이러스의 어떤 아류형이 다음 유행병을 일으킬지 예측하는 것이 가능하지 않기 때문에, 이상적인 백신접종은, 광범위한 범위의 인플루엔자 바이러스에 대항하여 숙주를 보호하는 면역 반응을 동일한거나 상이한 아류형으로부터 유발시킴으로써, 몇가지의 질병 또는 죽음으로부터 숙주를 보호하는 것일 것이다. 그러나, 하기에 개략적으로 기술된 이유들 때문에, 중화 항체 반응(neutralising antibody response)(주로 HA 및 NA에 대항하여)의 유도에 의존하는, 유효한 백신은 고도로 인플루엔자 균주-특이적이다.
인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 당단백질은 숙주 면역 반응을 회피하기 위한 수단으로서 항원 변이를 한다[6]. 전신 또는 점막 부위에서 HA 당단백질에 특이적인 바이러스 중화 항체(virus neutralising antibodies)의 존재는 인플루엔자에 의한 감염을 방어한다. 그러나, 항원 가변성의 결과로, HA에 대한 항체 반응은 고도의 균주-특이적이며, HA를 상이한 아류형의 인플루엔자 바이러스, 또는 심지어 동일한 아류형내에서 매우 이질적인 균주로부터 인식하지 못한다[7]. 다른 한편으로는 세포-매개성 면역, 특히 CD8+ 세포독성 T 세포(CD8+ cytotoxic T cells, CD8+ CTL)는 바이러스-감염성 세포를 제거하는 데 주로 기능하고 있으며, 따라서 감염의 심각도에 제한을 주고, 감염으로부터의 회복을 촉진한다[8]. HA와는 대조적으로, 세포-매개성 면역 반응의 내부 단백질 타겟-핵심적인 것은 PB2, PA, 핵단백질(Nucleoprotein, NP) 및 기질 단백질(Matrix protein, M)임-은 항원 소변이(antigenic drift)를 일으키기 쉽지 않으며 그 결과 매우 보존적이다. 예를 들어, H5N1 균주 A/인도네시아/5/05 및 A/베트남/1194/04의 NP 및 M 단백질은 A/푸에르토리코/8/34와는 대략 94%의 아미노산 동일성을 공유한다(도 1에 보임). A/ 푸에르토리코/8/34는 1934년에 분리된 H1N1 바이러스이며, 전통적으로는 재-분류에 의하여 그리고 좀 더 최근에는 역전사 유전에 의하여 제조되는, 조작된 백신 균주(engineered vaccine strains)의 구조 단백질의 원천이다. 또한, 이러한 상이한 인플루엔자 아류형들 사이에는 고도의 CTL 에피토프(epitopes)의 보존성이 있다. 이 분석을, 잠재적 유행병 위협을 또한 제기하는, H7N7 및 H9N2를 포함하여, 다른 바이러스 아류형을 포함하도록 확장하면, 모든 A-균주 바이러스에 걸쳐 고도의 CTL 에피토프의 보존성을 입증한다. 그러므로, 고도로 균주-특이적인 HA 항체 반응과는 달리, 인플루엔자 A-균주 아류형에 관계없이, CTL 반응은 광범위하게 효과적일 가능성을 가진다[9]. 그러므로, 강한 CTL 반응을 유도하는 능력은 유행성 인플루엔자 백신에 있어서 매우 바람직한 특징이다.
CD8+ CTL의 유도는, 특히 인간에게 있어서, 백신 개발의 커다란 장애물임이 밝혀졌다. DNA 및 바이러스 벡터와 같은 운반 시스템은 어느 정도의 희망을 주었으나, 잠재적으로 안전성에 대한 우려가 있으며, DNA의 경우에서는, 일반적으로 세포 반응, 특히 CD8+ CTL 반응을 약하게 유발한다. 추가적으로, 바이러스 벡터는 중화 항체를 벡터에 유도하는 문제를 가지는데, 이는 반복 사용을 제한한다. DNA와 생바이러스 벡터 운반의 프라임-부스트(prime-boost) 조합이 현재 평가받고 있으며, 결과가 동물 모델에서는 전망이 밝지만 인간에서는 아직 입증되지 않고 있다. ISCOM™ 백신은, 자연적으로 발생하는 면역원 및 재조합 단백질을 포함하여, 다양한 항원에 대한 T-헬퍼(CD4+) 및 CTL(CD8+) T 세포 반응 둘 다의 잠재적 유도체임이 많은 동물 모델에서 밝혀졌다[10]. H1N1 인플루엔자 ISCOM™ 백신은 H2N2, H3N2, H5N1 및 H9N2 바이러스를 포함하여, 이종 바이러스의 치명적 공격에 대항하여 마우스에서 교차 방어(cross protection)를 제공하는 것으로 밝혀졌다[11]. 또한, 방어는 CD8+ T 세포 및 항체 둘 다에 의존적인 것으로 밝혀졌다[11].
강한 CD8+ CTL 반응을 유도하는 ISCOM™ 백신의 능력은, 항원이 ISCOM™ 입자에 결합된다는 사실에 주로 기인하는 것으로 일반적으로 인정되고 있는데[12], 이 입자는 세포성 흡수 및 MHC 클래스 I 프로세싱 기구에 대한 항원의 후속 접근을 효율적으로 진행시킨다[13]. 그러나, ISCOM™ 백신의 제조는 규모를 확대하기가 복잡하고 어려우며, 제조 제어 및 일관성과 관련된 커다란 문제점이 있다. 그러므로 ISCOM™ 백신은, 다양한 동물 종에서 병원체 종류에 대항한 방어를 입증함에도 불구하고, 특히 짧은 시간에 수 억 투여량의 생산을 요구하는 유행성 인플루엔자 백신과 같은 대량의 제품에서, 상품 잠재성(product potential)을 제한한다.
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본 발명에 이르는 연구에서, 발명자들은, ISCOM™ 백신과 동일한 조성물 및 구조를 본질적으로 가지나 결합된 항원이 없어서, "면역원이 없는", 예비(preform) ISCOMATRIX™ 보조제[12;14]가 아래 기술된 바와 같은 표준 삼-가 계절성 인플루엔자 백신(standard tri-valent seasonal influenza vaccine)과 같은 인플루엔자 면역원(들)과 조합되거나 혼합되는, 백신 제형(vaccine formulation)을 개발하였다. 이렇게 해서, ISCOM™ 백신과는 대조적으로, 본 발명의 백신 제형 내의 인플루엔자 면역원(들)은 ISCOMATRIX™ 보조제 구조에 결합되지 않는다. 따라서, 본 발명의 백신 제형의 생산은 간단하며, 견고하며, 재생산이 가능하고, 대규모로 실시될 수 있다.
또한, 본 발명에 이르는 연구는, 동물 모델로서 페럿(ferret)을 이용하여, 인플루엔자 A 바이러스의 고병원성, 유행성의 (H5N1) 아류형에 의한 치명적인 공격에 대항하여 방어하는 표준 풍토성(endemic) 인플루엔자 면역원(들)을 포함하는 백신 제형의 능력을 입증하였다.
본 명세서 및 뒤이은 청구항들을 통하여, 문맥이 다른 것을 요구하지 않는 한, 용어 "포함한다"과, "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은, 언급된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 내포하는 것으로 이해되나, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
이전의 공지물(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지의 임의 내용에 대하여 본 명세서 내의 참조 문헌은, 이전의 공지물(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지 내용이 본 명세서와 관련된 내용의 분야에서 통상의 일반적인 지식의 일부를 형성하는 것이라고, 인식 또는 승인 또는 임의의 형태의 제안이 아니며 또한 그렇게 여겨져서는 안된다.
<발명의 개요>
본 발명은 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응(protective immune response)을 유발하거나 유도하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은,
(i) 적어도 하나의 풍토성(endemic) 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
다른 관점에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위하여 상기 대상체에 투여하기 위한 약제의 제조에 있어서,
(i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물의 이용을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은, 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위하여,
(i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물의 이용을 제공한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위한 제제를 제공하는데, 상기 제제는,
(i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물이다.
도 1은 A/푸에르토리코/8/34(H1N1), A/인도네시아/5/05(H5N1) 및 A/베트남/1194/04(H5N1)의 핵단백질(NP)(도 1A)과 기질 단백질(M)(도 1B)의 아미노산 서열 비교이다. 굵은 문자는 인간 CTL 에피토프(Suzanne L. Epstein, Jonathan W. Yewdell, Jack R. Bennink, http://www.flu.lanl.gov/review/epitopes.html 으로부터 채택됨)를 나타낸 것이다. A/인도네시아/5/05 및 A/베트남/1194/04의 NP 및 M 단백질은 A/푸에르토리코/8/34와는 대략 93%의 아미노산 동일성을 공유한다.
도 2는 (i) ISCOMATRIX™ 보조제(60㎍)와 조합한 삼-가 계절성 인플루엔자 백신(15㎍의 A/뉴칼레도니아/20/99, A/위스콘신/67/2005 및 B/ 말레이시아/2506/2004를 함유함); 또는 (ii) ISCOMATRIX™ 보조제(60㎍)와 조합한 A/베트남/1194/2004; 또는 (iii) ISCOMATRIX™ 보조제 단독(보조제 대조군)이 접종된 페럿의 혈청의 HI 항체 역가(도 2A) 및 바이러스 중화 역가(Virus Neutralisation titres)(도 2B)를 보여 준다. 혈청은 A/베트남/1203/2004 및 A/인도네시아/5/2005에 대한 2차 백신접종 및 적정 후 28일에 수집하였다. 데이터가 그룹당 4마리의 동물의 평균값으로 제시되어 있다. 표준편차가 나타내어져 있다.
도 3은, 지시된 바와 같이 (i) ISCOMATRIX™ 보조제(60㎍)와 조합한 삼-가 계절성 인플루엔자 백신(15㎍의 A/뉴칼레도니아/20/99, A/위스콘신/67/2005 및 B/ 말레이시아/2506/2004를 함유함); (ii) ISCOMATRIX™ 보조제(60㎍)와 조합한 A/베트남/1194/2004; 또는 (iii) ISCOMATRIX™ 보조제 단독(보조제 대조군)으로 면역처리한 후 106 EID50(50% 란감염가(50% egg infectious dose))의 A/베트남/1203/2004으로 처리된 페럿의 생존률(도 3A), 체온 변화(도 3B-E) 및 체중 변화(도 3F)를 보여 준다. 데이터는 그룹당 4마리 동물의 대표값들이다. 도 3A에서, 후-바이러스 처리 페럿의 무게를 매일 측정하였고 물리적으로 검사하였다. 체중의 10% 이상이 줄어들었거나 경련 또는 복부 불쾌감과 같은 고통의 신호를 보였던 페럿들을 윤리상 안락사시켰다. 도 3B-E에서, 페럿의 온도를 피하 이식성 온도 트랜스폰더(transponder)를 사용하여 매일 모니터하였다. 세로선은 처리의 시간을 나타낸다. 감염되지 않은 페럿의 평균 체온은 38.8℃이다. 데이터는 그룹당 4마리 동물의 대표값들이다. 도 3F에서, 페럿 무게는 처리 시에 동물의 무게의 백분율로써 나타내었다. 데이터는 그룹당 4마리 동물의 대표값들이다.
도 4는 표기된 바와 같이 (i) ISCOMATRIX™ 보조제(60㎍)와 조합한 삼-가 계절성 인플루엔자 백신(15㎍의 A/뉴칼레도니아/20/99, A/위스콘신/67/2005 및 B/ 말레이시아/2506/2004을 함유함); (ii) ISCOMATRIX™ 보조제(60㎍)와 조합한 A/베트남/1194/2004; 또는 (iii) ISCOMATRIX™ 보조제 단독(보조제 대조군)으로 면역처리된 페럿에서 얻은 이병률 지수(mobidity scores)를 보여 준다. 페럿을 106 EID50(50% 란감염가)의 A/베트남/1203/2004으로 처리한 후에, 페럿의 행태를 모니터하였고 다음 수치를 기준으로 이병률 지수를 얻었다. 재료 및 방법에 기술된 바와 같이, 0 = 활기차고 기민함, 1 = 기민하나 유도할 때만 활기참, 2 = 기민하나 자극을 줄 때에도 활기차지 않음, 3 = 기민하지도 활기차지도 않음, 4 = 안락사를 요하는 신체 증상을 보임.
한 관점에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하는 방법을 제공하는데, 이는
(i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 대상체는 인간이다. 그러나, 본 발명의 방법은 또한 가축 동물이나 조류, 실험실 실험 동물이나 조류, 동반자 동물이나 조류, 또는 야생 동물이나 조류와 같은 비-인간 동물 또는 조류 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하는 것으로도 확장한다.
본 발명에 따르면, 상기 대상체에 투여되는 조성물은 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원을 포함한다. 상기에 주지된 바와 같이, 인간 내에 현재 퍼져 있는 "풍토성" 인플루엔자 A 아류형은 H1N1 및 H3N2 아류형들이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 이러한 아류형들의 하나 또는 둘 다의 면역원(들)을 포함한다. 본 발명의 한 특별한 구체예에서, 상기 조성물은, Fluvax® 분할 비리온(split virion), 비활성화 인플루엔자 백신(CSL사, Melbourne, Australia)과 같은, 비활성화 풍토성 인플루엔자 바이러스 타입 A (H1N1 및 H3N2) 및 B를 포함하는 표준 삼-가 인플루엔자 백신을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는, 인플루엔자 바이러스의 "유행성" 아류형에 대한 언급은, 이전의 백신접종 또는 이전의 노출의 결과로서 저항이 없거나 거의 없는 대상체 집단, 특히 인간 집단이 감염된 적이 없는 것으로 여겨지는 아류형에 대한 언급으로서 이해될 수 있다. 상기에 주지된 바와 같이, 그러한 유행성 아류형은 특히, H5N1, H2N2, H9N2, H7N7, H7N3 및 H10N7 아류형들을 포함한다.
본 발명에 따른 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원(들)을 포함하는 조성물의 투여가 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 이종성(heterologous) 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하는 것으로 밝혀졌다.
본 명세서에 사용되는, "면역 반응"에 대한 언급은 체액 반응(바이러스 중화 항체의 유도와 같은) 및 세포-매개성 면역 반응(CD8+ 세포독성 T 세포의 유도와 같은) 둘 다를 광범위하게 언급하는 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서에서 "방어 면역 반응"에 대한 언급은, 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형의 처리 시에 또는 노출 시에, 후속 감염으로부터 대상체를 보호하거나, 후속 감염의 가능성을 줄이는 면역 반응을 포함하며, 임의의 후속 감염의 증상을 개선하는 것은 물론 임의의 후속 감염의 중증도를 줄이는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 대상체에 투여되는 조성물은, 인플루엔자 면역원(들)과 조합되거나 혼합되는, 보조제로서의 면역원이 없는 면역촉진 복합체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는, 용어 "면역원이 없는"은, 임의의 면역원 또는 항원이 복합체의 구조에 결합됨이 없이 면역촉진 복합체가 형성된다는 것을 의미한다. 바람직하게, 이러한 보조제는 사포닌, 스테롤(콜레스테롤과 같은), 및 선택적으로는 인지질(포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린과 같은)을 포함하는 사포닌-기반 면역원이 없는 면역촉진 복합체이며, 약 40nm의 직경이 측정되는 일반적으로 단단하고, 속인 빈, 구형의, 새장-같은 입자로서 형성되고, "빈 ISCOMs", ISCOM 기질, 또는 가장 최근에는 ISCOMATRIX™ 보조제로서 알려져 있다[23]. 더욱 바람직하게, 면역원이 없는 면역촉진 복합체는 ISCOMATRIX™ 보조제이다.
통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 완충제 또는 희석제가 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 조성물은, 하나 이상의 통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제와 결합하여, 보조제와 혼합된 면역학적으로 유효한 양의 인플루엔자 면역원(들)을 포함할 것이다. 본 명세서에 사용되는 "약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"은 모든 용매, 분산 매질, 수성 용액, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 등등을 포함한다. 약학적으로 활성있는 기질에서의 그러한 매질 및 제제의 이용은 당해 분야에서 잘 알려져 있으며, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18판, Mack 출판사, Pennsylvania, U.S.A에서의 예에 의하여 설명되어 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 인플루엔자 면역원(들)은 유요한 양으로 투여된다. "유효한 양"은 원하는 면역 반응, 특히 원하는 방어 면역 반응을 적어도 부분적으로 얻는 데에 필요한 양을 의미한다. 상기 양은 치료할 개개인의 연령, 건강 및 신체 상태, 치료할 개개인의 인종 배경, 원하는 방어의 정도, 조성물의 제형, 의학적 상황의 평가, 및 다른 관련 요소들에 따라 변한다. 정기적인 시험을 통하여 결정될 수 있는 상기 양은 상대적으로 넓은 범위 내로 떨어질 것이다. 필요하다면, 유효한 양의 투여가 한 번 또는 여러 번 반복될 수 있다. 투여되는 실제 양은 원하는 방어 면역 반응의 성질에 의하여 그리고 활성 면역원이 투여되는 속도에 의하여 결정될 것이다.
본 발명에 따르면, 조성물은 바람직하게는 비경구성 투여 경로에 의하여 대상체에 투여된다. 비경구성 투여는, 주사, 주입, 등등에 의한 투여를 포함하여, 소화관을 통하지 않는 임의의 투여 경로(즉, 장관이 아님)를 포함한다. 주사에 의한 투여는, 실시예에 의하여, 정맥(정맥 내의), 동맥(동맥 내의), 근육(근육 내의)으로 및 피부 밑에(피하의) 주사를 포함한다. 조성물은, 원하는 면역 반응을 얻는 데 충분한 용량으로, 바람직하게는 피하로, 피내로(intradermally), 또는 근육내로 투여된다.
비경구성 투여에 적합한 조성물은 수용체(recipient)의 혈액과 바람직하게 등장성인 활성 성분의 멸균 수성 조제물을 편의상 포함한다. 이 수성 조제물은 적절한 분산 또는 침윤 제제 및 현탁제를 이용하여 공지된 방법에 따라 제형될 수 있다. 또한, 멸균 주입가능 조제물은 비-독성 비경구적으로-허용가능한 희석제 또는 용매 내의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 및 락트산 내의 용액일 수 있다. 채용될 수 있는 허용가능한 비이클(vehicles) 및 용매 중에는 물, 링거액(Ringer's solution), 적절한 탄수화물(예, 슈크로스, 말토스, 트레할로스, 글루코스) 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이 있다. 덧붙여, 멸균, 고정유(fixed oils)가 용매 또는 현탁 매질로서 편의상 채용될 수 있다. 이 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 임의의 무자극 고정유(bland fixed oil)가 채용될 수 있다. 덧붙여, 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 조제물에 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위하여 상기 대상체에 투여하기 위한 약제의 제조에 있어서,
(i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물의 이용을 제공한다.
또한 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위하여,
(i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물의 이용을 제공한다.
덧붙여, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위한 제제를 제공하는데, 상기 제제는,
(i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
(ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
를 포함하는 조성물이다.
본 발명에 따르면, 면역원이 없는 ISCOMATRIX™ 보조제가 혼합된, A/뉴칼레도니아/20/99 (H1N1), A/위스콘신/67/2005 (H3N2) 및 B/말레이시아/2506/2005를 함유한 표준 삼-가 계절성 인플루엔자 백신(이하 본 명세서에서 "인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신"이라 지칭됨)으로 면역처리하면 야생형 A/베트남/1203/04 (H5N1)에 의한 치명적 공격을 방어할 수 있음이 밝혀져 있다.
인플루엔자 ISCOM™ 백신은 인간을 포함하는 다양한 종 내에 CD8+ CTL 반응을 유도하는 것으로 보여졌다[10;15;16]. 그러나, 지금까지 어떠한 동물 모델에서도 ISCOMATRIX™-함유성 백신이 치명적 공격에 대항하여 방어한다는 것이 보고되지 않았다. ISCOMATRIX™ 백신 내의 항원이 ISCOMATRIX™ 보조제 구조와 단순하게 혼합되고 결합되지 않기 때문에, CD8+ CTL 반응의 유도는 동일한 양의 결합된 항원을 포함하는 ISCOM™ 백신과 있을 때보다 덜 효과적인 것으로 일반적으로 믿어지고 있다[12;17-20].
이러한 이유로, 단백질을 예비제형된 ISCOMATRIX™ 보조제에 결합시켜 결합성 ISCOMATRIX™ 백신을 생산하는 기술이 개발되었다. 이러한 것들은, 정전기적 상호작용과 같은 ISCOMATRIX™ 보조제의 물리적 성질을 이용하는 방법을 포함하는데, 여기에서는 양으로 하전된 단백질이 음으로 하전된 보조제와 결합할 것이다. 이러한 타입의 결합을 극대화하기 위하여 단백질 또는 보조제를 개질하기 위한 과정 또한 개발되었다[21]. 결합을 달성하기 위한 다른 방법들은 ISCOMATRIX™ 보조제의 성분을 개질하여 단백질을 다양한 노출성 화학기에 결합시키는 것을 포함한다. 이러한 타입의 개질의 예는 킬레이팅 ISCOMATRIX™ 보조제인데, 여기에서 금속 킬레이트기가 그 구조에 결합되고 이어서 헥사히스티딘과 같은 금속 친화성 태그를 함유하는 단백질에 결합할 수 있다[18].
그러므로, 세포성 면역 반응의 최적의 유도를 위한 ISCOMATRIX™ 보조제(ISCOM™ 백신에서와 같이)에 결합되는 항원의 예상 조건을 고려하면, 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신(면역원이 없는 ISCOMATRIX™ 보조제와 간단히 혼합된 A/뉴칼레도니아/20/99 (H1N1), A/위스콘신/67/2005 (H3N2), 및 B/ 말레이시아/2506/2004를 함유하는 표준 삼-가 계절성 인플루엔자 백신)에 의한 페럿의 면역처리가 야생형 A/베트남/1203/04 (H5N1)에 의한 치명적 공격에 대항하여 방어하였다는 것은 매우 놀랍다. 또한, 이러한 방어가 H5N1에 대한 탐지가능한 중화 항체 반응이 없는 상태에서 관찰되었는데, 이것은 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신에 의하여 유도된 세포성 면역 반응(대부분 아마도 CD8+ CTLs)이 고병원성 H5N1 인플루엔자 바이러스에 의한 치명적 공격 이후의 심각한 질환 및 사망으로부터 감염이 없었던 동물을 보호할 수 있다는 것을 알려준다.
페럿은 인간 인플루엔자의 연구에 관심이 있는 많은 바이러스학자가 선택하는 실험 동물이었다. 페럿은 다음의 연구를 위하여 특히 유용하다: (i) H5N1 분리체를 포함하는 인플루엔자의 발병; /(ii) 백신 후의 감염 위협에 대한 반응; (iii) 항바이러스의 효능; (iv) 항바이러스 약물-내성 돌연변이의 유전성; (v) 바이러스 쉐딩(viral shedding) 및 (vi) 인플루엔자에 대한 열적 반응. 대체적인 모델은 마우스이며, 풍부한 상이한 유전 변형된 마우스 종과 면역 반응의 분석을 위하여 넓은 범위의 쉽게 구입할 수 있는 시약은 이것을 강력한 모델로 만들었고, 그것을 사용하여 많이 알게 되었다. 그러나, 마우스는 인간 인플루엔자 바이러스에 의하여 자연적으로 감염되지 않으며 마우스의 인플루엔자 바이러스는 알려져 있지 않다. 이러한 자연적 내성은 인플루엔자(인간이 아닌 마우스에서의)에 대항하여 유형 1 인터페론-의존성 방어를 제공하는 Mx 유전자의 존재에 기인하며 그리고 또한 쥐 분비물 내의 바이러스의 독특한 억제 유전자의 존재에 기인한 것일 수 있다[22]. 마우스에서 성장에 적합한 인플루엔자 바이러스는 제한되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들은 이 숙주 내에서 블라인드계 대접종(blind passage)에 의하여 "마우스-적합적(mouse-adapted)"이었다. 대조적으로, 페럿은 인간 인플루엔자에 본래 민감하여서 연구가능한 바이러스 종에 대한 제한은 없다.
본 발명의 추가적 특징은 다음의 실시예에서 더 자세히 기술된다. 그러나, 이러한 상세한 설명은 본 발명을 예시하는 목적으로만 포함되도록 이해되며, 어떠한 방식으로든지 상기 서술된 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로서 이해되어서는 안된다.
<실시예>
A. 물질 및 방법
페럿: 약 700-1500g의 체중을 갖는 어린 암컷 또는 수컷 페럿(3-5 월령)을 IMVS(SA)에서 얻었다. 페럿은 현재 퍼져 있는 인플루엔자(H1N1, H3N2, B 바이러스)에 대하여 혈청 반응 음성이었다. 혈액 샘플을 각 백신접종 직전에 그리고 바이러스 처리 직전에 채취하였다. 바이러스 처리에 대한 항체 반응을 체크하기 위한 추가의 혈액 샘플을 바이러스에 노출한 후 14일에 또는 안락사 시에 채취하였다. 페럿의 크기에 따라 19 내지 23 게이지 바늘을 이용하여, 경정맥 또는 겨드랑이 정맥, 4 개 위치에서, 각각 1ml씩, 마취된(케타민(Ketamine)/메데토미딘(Medetomidine) 50:50 0.1 ml/kg, 길항제로 아티파메졸(Atipamezole)을 사용) 동물에 대하여 출혈을 실시하였다. 10% 체중이 손실되거나, 다른 기관계(organ systems)의 관여에 합치된 신호, 예를 들어 경련 또는 복부 불쾌감을 보이는 즉시, 임상적으로 손상된 동물을 안락사시켰다.
백신: 주사에 사용되는 계절성 인플루엔자 항원의 혼합물은 동량(15㎍)의 A/뉴칼레도니아/20/99 (H1N1), A/위스콘신/67/2005 (H3N2) 및 B/ 말레이시아/2506/2004(CSL사, Melbourne, Australia)을 포함하였다. 유행성 균주에서, 단가 항원(A/베트남/1194/2004)을 계절성 균주와 동일한 방식으로 제조하였다. 간단히 하면, 바이러스를 부화 알에서 번식시키고, β-프로피오락톤(ICN 제약사, Costa Mesa, CA)으로 비활성화하고, 슈크로스 구배(sucrose gradient)로 띠 원심분리하고, 소듐 타우로디옥시콜레이트(Sigma, St. Louis, MI)로 처리하여, 정제되고 비활성화되고 손상된 항원 조제물을 생산했다. 바이러스 항원의 농도를 해마글루티닌(haemagglutinin, HA) 단백질에 의하여 표시하였는데, 이것을 표준 단일원 면역 확산법(standard single radial immunodiffusion)에 의하여 결정하고 관련 균주의 공지된 표준에 비교하였다. PBS pH 6.2[23] 내의 ISCOMATRIX™ 보조제를 투여 직전에 인플루엔자 항원에 첨가하였다.
백신 투여: 27 게이지 바늘을 갖는 1ml 주사기를 이용하여, 두 번 0.5 ml 용량(21일 간격)을 뒷다리의 사두근(quadriceps) 또는 후방 근육으로 근육내 전달하였다.
바이러스: H5N1 인간 인플루엔자 바이러스: A/베트남/1203/04(야생형) A/베트남/1194/04(역조작된 백신 균주), 및 A/인도네시아/5/2005(야생형)을 세계 건강 기구 인플루엔자 공동 연구소(World Health Organisation Influenza Collaborating Laboratories)에서 얻었다. 모 바이러스(stock viruses)를 10-일령의 부화된 닭 알의 뇨 막강(allantoic cavity)에서 35 ℃에서 24-36시간동안 번식시키고 -70 ℃에서 저장하였다. 고병원성 바이러스에 대한 모든 실험을 BSL 3+ 차폐 시설(AAHL, CSIRO Geelong)에서 실시하였다.
바이러스 처리: 두 번째 투여 후 삼 주일, 페럿을 Govorkova 등에 의하여 기술된 바와 같이 106 EID50(50% 란감염가)의 야생형 처리 바이러스(A/베트남/1203/2004)로 경비적으로(intra-nasally)(둘 다 비강)으로 예방접종시켰다[24].
면역성 테스트: 해마글루티네이션 억제(haemagglutination inhibition, HI), 그리고 혈청의 2-배 희석 및 HA 항원의 단일 모액 원천을 이용한 바이러스 중화(virus neutralisation, VN)(인플루엔자를 위한 WHO 공동 센터, 표준 작업 지침서에서 기술됨)에 의하여 면역성을 평가하였다. 기하 평균 역가(Geometric mean titres)를 결정하였으며 혈청방어(seroprotection)는 예비-백신접종 역가 이상의 항체 역가에서 4-배 이상의 증가로 정의되었다. 바이러스 역가 및 이병률 데이터의 통계적 유의성을 양측-꼬리, 대응 t-검증(two-tailed, paired Student' t-test)을 이용하여 결정하였다. 사망률 데이터의 통계적 유의성을 카이 제곱 검정(Chi squared analysis)에 의하여 결정하였다.
임상 평가:
관찰: 연구 기간에 걸쳐 동물을 매일 시각적으로 모니터하였으며, 동물이 질환의 신호를 보이는지 바이러스 처리 후에 매일 두번 모니터하였다. 기침 이나 재채기와 같은 임의의 호흡기 증상의 특이한 기록이 있기 전까지 일반적인 임상 관찰을 실시하였다. 반응 부위 관찰(예, 홍진, 부종)을 각각의 백신접종 후 2, 24 및 48 시간에 기록하였다. 바이러스 처리 후에, 활성 수치를 매일 모니터하였다.
무게: 진정제를 맞는 동안 투여 및 처리 시에(0일), 그리고 바이러스 처리 후 3, 5, 7 및 14일에 동물의 무게를 측정하였다.
온도: 디지털 온도측정기를 이용하여 진정제 투여 시에 수동으로 온도를 측정하였으며, 바이러스 처리 전 약 10일동안 22 게이지 바늘의 보조물을 갖는 피하로 삽입되는 온도 트랜스폰더를 이용하여 계속해서 측정하였다.
생물학적 샘플: 바이러스 분리를 위하여 바이러스 처리-후 3, 5 및 7일에 비강, 구강 면봉을 취하였다.
B. 결과
인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신: 항체 반응
페럿 면역성 및 바이러스 처리 연구의 개시 전에, 혈청을 페럿으로부터 수집하였으며, A/뉴칼레도니아/20/1999 (H1N1), A/위스콘신/67/2005 (H3N2) 및 B/ 말레이시아/2506/2004에 대한 항체의 존재에 대하여 표준 방법을 이용하여, 효소면역측정법(Enzyme Linked Immunoassay, ELISA)으로 테스트하였다. 테스트된 모든 페럿은 3 종 모두에 대항하는 항체에 대하여 음성이며, 따라서 인플루엔자에 대하여 감염이 없는 것으로 여겨졌다.
면역성 및 바이러스 처리 연구를 위하여, 페럿을 ISCOMATRIX™ 보조제(60㎍)가 혼합된 A/베트남/1194/2004으로부터의 3.75㎍ 또는 15㎍의 HA, 또는 ISCOMATRIX™ 보조제(60㎍)가 혼합된 A/뉴칼레도니아/20/1999 (H1N1), A/위스콘신/67/2005 (H3N2) 및 B/말레이시아/2506/2004 각각으로부터의 15㎍의 HA를 함유하는, 현재의 계절성 삼-가 인플루엔자 백신으로 두 번(0일, 21일) 면역처리하였다. 대조군 동물의 그룹에 ISCOMATRIX™ 보조제를 단독으로 유사하게 투여하였다. 두번째 투여 후 28일에 채취한 혈청을 인플루엔자-특이적 항체의 존재에 대하여 해마글루티네이션 억제 (HI)(도 1A) 및 바이러스 중화(VN)(도 1B) 분석을 이용하여 평가하였다. 도 2에 보인 바와 같이, 두 항원 투여(3.75㎍ 및 15㎍) 때에 A/베트남/1194/2004 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리된 페럿은 A/베트남/1203/2004 (H5N1, 계통 1) 및 A/인도네시아/5/2005 (H5N1, 계통 2) 둘 다에 대하여 강한 항체 반응을 유발하였으며, 이 것은 상이한 H5N1 계통에도 불구하고, A/베트남/1203/2004 및 A/인도네시아/5/2005이 항원적으로 그리고 혈청적으로 밀접한 관련이 있다는 것을 입증한다.
대조적으로, 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리된 페럿으로부터 얻은 혈청은 A/베트남/1203/2004 및 A/인도네시아/5/2005 둘 다에 대항하는 HI 및 VN에 의하여 음성적이다. 예상된 바와 같이, ISCOMATRIX™ 보조제 단독으로 2번 투여 받은 대조군 페럿 또한 두 분석에서 음성적이었다.
인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신: 치명적 공격에 대한 방어
두 번째 백신 투여 후 4주에, 페럿에 Govorkova 등에 의하여 기술된 바와 같이 106 EID50(50% 란감염가)의 처리 바이러스(A/베트남/1203/2004)를 경비적으로(둘 다 비강)으로 예방접종시켰다[24]. 그리고 나서, 페럿의 온도를 계속해서 모니터하였고, 매일 체중, 신체적 외관 및 이병률을 모니터하였다.
도 3A에 보인 바와 같이, 두 HA 항원 레벨(3.75㎍ 및 15㎍)로 A/베트남/1994/2004 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리한 동물 모두는 야생형 (A/베트남/1203/2004) 바이러스에 의한 치명적 공격에도 살아남았다. 도 2에 보인 바와 같이, 이러한 동물들이 이러한 백신에 대한 반응에서 고 역가 A/베트남/1203/2004-특이적 항체를 전개시킨 것을 고려한다면, 이 결과는 놀라운 것이 아니다. 그러나, 놀랍게도, 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리된 페럿 또한, 탐지가능한 중화 항체가 없음에도 불구하고, 치명적 공격에서 살아남았다. 예상된 바와 같이, 대조군 페럿 모두 바이러스 공격에 쓰러졌으며, 10% 이상의 체중 손실을 가졌기 때문에 또는 경련이나 복부 불쾌감과 같은 질환의 신호를 보여서 윤리상 안락사시켜야했다.
기준선을 설정하기 위하여 3일의 예비-처리 동안, 그리고나서 처리 후 추가로 7일동안, 피하 온도 트랜스폰더를 이용하여 페럿의 온도를 계속해서 모니터하였다. 도 3B-E에 보인 바와 같이, 대조군 페럿의 온도는 처리-후 12-24 시간동안 2.5-3.0 ℃로 가파르게 올라갔으며 페럿이 윤리적인 이유로 안락사될 때까지 이러한 경사 수준을 유지하였다. 유사하게, 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리된 페럿의 온도는 처리-후 12-24 시간동안 2.5-3.0 ℃로 가파르게 올라갔으나, 이러한 상승은 일시적이었고 온도는 24시간 후에 기준선으로 되돌아갔다. 이 그룹의 한 동물은 온도에 있어서 두 번째 매우 낮은 순간 스파이크를 경험하였는데, 24시간 후에 기준선으로 다시 돌아갔다. 대조적으로, 고 항원 투여 그룹에서의 한 마리의 동물을 제외하고는, A/베트남/1994/2004 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리된 모든 페럿의 처리-후 온도는 어떤 단계에서든지 예비-처리 기준선 수준 이상으로 상승하지 않았다.
연구 기간에 걸쳐서 페럿의 체중을 매일 모니터하였다(도 3F). 대조군 그룹에서 모든 동물의 체중은 3일의 처리 내에 약 10% 정도 떨어졌다. A/베트남/1994/2004 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리된 페럿의 통계 온도 프로파일과 일치하게, 이러한 동물들의 체중은 처리-후 꾸준히 증가하였다. 대조적으로, 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리된 페럿의 체중은 7일의 처리-후 관찰 기간 내내 변하지 않고 유지되었다.
체중 및 온도 데이터와 일치하게, 두 항원 수준(3.75㎍ 또는 15㎍ HA)으로 A/베트남/1994/2004 ISCOMATRIX™ 백신 또는 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신으로 면역처리된 모든 페럿은 야생형 H5N1 바이러스(A/베트남/1203/2004)에 의한 치명적 공격 후에도 생기있고 기민한 상태로 존재하였다. 대조적으로, ISCOMATRIX™ 보조제을 단독으로 받은 대조군 동물은 사망의 이병(morbidity)의 신호를 보였으며, 처리-후 3일까지 생기있거나 기민하지 않았으며, 5-7일까지 그들의 신체적 상황은 안락사를 요하는 수준으로 약화되었다(도 4).
C. 검토
연구 동안에 이루어진 중요하고 놀라운 관찰은, ISCOMATRIX™ 보조제와 조합한 A/뉴칼레도니아/20/1999 (H1N1), A/위스콘신/67/2005 (H3N2) 및 B/ 말레이시아/2506/2004 각각으로부터의 15㎍의 HA를 함유하는, 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신이 A/베트남/1203/2004에 대한 탐지가능한 중화 항체 반응(HI 및 VN)이 없는 상태에서 고병원성 H5N1 바이러스(A/베트남/1203/2004)에 의한 치명적 공격에 대항하여 페럿을 보호하였다는 것이다. 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신 그룹에서 페럿의 온도의 일시적 증가는, 처리 후 이러한 동물들이 감염되었으나, 바이러스 감염의 정도가 바이러스의 급격한 제거 및 감염으로부터의 회복으로 이르는 비-중화-항체-매개성 면역학적 기구(non-neutralising-antibody-mediated immunological mechanisms )에 의하여 제한되었다는 것을 알려준다.
이러한 동물들이 체중을 잃지 않았고 활동적이고 기민한 상태를 유지하였다는 관찰이 이러한 결론을 뒷받침한다. 대조적으로, ISCOMATRIX™ 보조제를 단독으로 두번 투여받은 대조군 동물은 급격하고 장기적인 온도 상승을 경험하였으며 그들의 건강 상태가 안락사를 요구하였을 정도로 급격하게 악화되었다.
현재, 페럿 세포성 면역 반응, 특히 CD8+ CTL 반응을 평가하기 위한 분석이 존재하지 않기 때문에, H5N1 바이러스에 의한 치명적 공격에 대항하는 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신에 의한 방어에 대한 면역학적 기반을 정의하는 것이 가능하지 않다. 인플루엔자 ISCOM™ 백신은 인간을 포함한 다양한 종에서 CD8+ CTL 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다[10;15;16]. 또한, H1N1 ISCOM™ 백신은 마우스에서 부분적으로는 교차-보호성 CD8+ CTL 반응의 유도로 인하여 이종 공격에 대항하여 방어하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기에 언급된 바와 같이, 최적 CD8+ CTL 반응의 유도는 ISCOM™ 또는 ISCOMATRIX™ 보조제에 결합되는 항원을 요구하는 것으로 광범위하게 받아들여지고 있다[17-19]. 그러므로, 탐지가능한 중화 항체 반응이 없는 상태에서, 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신이, 아마도 CD8+ CTL 반응을 형식적으로 증명하지 않을지라도, 고병원성 H5N1 바이러스에 의한 치명적 공격에 대항하여 페럿을 충분히 보호할 정도로 강력한, 세포성 면역 반응을 유도하였다는 것을 이 연구에서 관찰한다는 것은 놀라운 일이다. 또한, 모든 A-균주 인플루엔자 바이러스의 내재성 단백질(확인된 CD8+ CTL 에피토프를 포함함) 사이에서 높은 정도의 서열 보존성을 고려한다면, 인플루엔자 ISCOMATRIX™ 백신이, H7N7, H7N3, H9N2 및 H10N7을 포함하나 이에 한정되지 않는, 기타 잠재성 유행성 균주에 대항하여 유사하게 방어할 것이라는 것이 논리적으로 추측된다.

Claims (10)

  1. 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응(protective immune response)을 유발하거나 유도하는 방법으로서,
    (i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
    (ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
    를 포함하는 조성물을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 인간인 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 풍토성 인플루엔자 A H1N1 및/또는 H3N2 아류형의 면역원(들)을 포함하는 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역원이 없는 면역촉진 복합체는 사포닌, 스테롤 및 선택적으로는 인지질을 포함하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 면역원이 없는 면역촉진 복합체는 ISCOMATRIX™ 보조제를 포함하는 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형은 인플루엔자 A H5N1, H7N7, H7N3, H9N2 및 H10N7 아류형들에서 선택되는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 유행성 아류형은 인플루엔자 A H5N1 아류형인 방법.
  8. 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위하여 대상체에 투여하기 위한 약제의 제조에 있어서,
    (i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
    (ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
    를 포함하는 조성물의 이용.
  9. 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위하여,
    (i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
    (ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
    를 포함하는 조성물의 이용.
  10. 인플루엔자 바이러스의 유행성 아류형에 대항하여 대상체 내에 방어 면역 반응을 유발하거나 유도하기 위한 제제로서, 상기 제제는,
    (i) 적어도 하나의 풍토성 인플루엔자 아류형의 면역원, 및
    (ii) 보조제로서 면역원이 없는 면역촉진 복합체
    를 포함하는 조성물인 제제.
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