CN101820904A - 引起针对大流行性流感病毒的免疫应答的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的方法，包括给予受试者一种组合物，该组合物包括：(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。

Description

引起针对大流行性流感病毒的免疫应答的方法
技术领域
本发明涉及在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的免疫应答的方法，并且更具体地涉及在受试者体内引起或诱导免疫应答的方法，该免疫应答保护该受试者对抗随后的甲型流感的致病性的、大流行性亚型(如，已经在人体内造成感染的甲型禽流感(H5N1))的攻击。
背景技术
流行性感冒是人类疾病的主要病因，并且在世界范围内是显著的发病率和死亡率的来源，每年有大量的人类群体受到影响。流感病毒可以被细分为甲型、乙型和丙型。在人类群体中传播的病毒主要是甲型流感和乙型流感。
每年接种疫苗是预防感染的主要策略。甲型流感菌株基于血细胞凝集素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)这两种病毒表面跨膜蛋白的抗原性差异可进行进一步的分型。到目前为止，已鉴定出甲型流感病毒的16种HA(HA1-16)和9种NA(NA1-9)的糖蛋白亚型。目前，两种甲型流感的亚型在人类中传播(H1N1和H3N2)[1]。
有时，当一种新型流感病毒出现而人类对其的免疫力很低或没有免疫力时可发生流感大流行。在上世纪，三种甲型流感菌株大流行的爆发造成了人类大量的与流感相关的死亡(1918，H1N1；1957，H2N2；1968，H3N2)[2]。1997年在香港，一种高致病性H5N1禽流感病毒直接从鸡传给人类，造成18例确认的感染中的6例死亡[3；4]。从那时起，对流感大流行的关注经由致病性H5N1病毒的零星爆发得到加强。这些爆发导致了258个病例、其中导致153例死亡，带来在从亚洲横贯欧洲遍及六个国家的爆发(柬埔寨、中国、印度尼西亚、泰国、土耳其以及越南)[5]。
自从1997年以来，几种其它亚型的病毒(包括H2N2、H9N2、H7N7、H7N3以及H10N7)也已牵涉到人类的感染，并且因此这些亚型也代表着重大的大流行性威胁。由于不可能预测哪种亚型的流感病毒会造成下一次大流行，所以一种理想的疫苗将通过引起免疫应答来保护宿主免受严重疾病或死亡，这种免疫应答保护该宿主针对宽范围的流感病毒(来自相同亚型或不同亚型)。然而，由于以下所列原因，依靠诱导中和抗体应答(主要对抗HA和NA)的可供使用的疫苗是流感菌株高度特异的。
流感病毒的HA和NA糖蛋白经历抗原变异作为逃避宿主的免疫应答的手段[6]。在全身位点或黏膜位点上存在对HA糖蛋白特异的病毒中和抗体保护不受病毒的感染。然而，由于抗原的变异性，针对HA的抗体应答是菌株高度特异的，并且从不同亚型的流感病毒中并未识别出这种HA，或甚至在相同的亚型中也未识别出高度相异的菌株[7]。另一方面，细胞介导的免疫，特别是CD8+细胞毒性T细胞(CD8+CTL)主要负责清除病毒感染的细胞，并且由此限制了感染的严重程度，并促进感染恢复[8]。与HA相反，细胞介导的免疫应答的内部蛋白靶-关键的是PB2、PA、核蛋白(NP)以及基质蛋白(M)-并不倾向于抗原性漂移，并因此是高度保守的。例如，H5N1甲型菌株/印度尼西亚/5/05和甲型/越南/1194/04的NP和M蛋白与甲型/波多黎各/8/34共享了大概94％的氨基酸同一性(如在图1中所示)。甲型/波多黎各/8/34是1934年分离的一种H1N1病毒，并且是工程疫苗菌株的结构蛋白的来源，这些工程疫苗菌株传统上通过重配(reassortment)进行制备，而最近更多通过反向遗传学进行制备。此外，在这些不同的流感亚型之间还存在着高度保守的CTL表位。这种分析延伸至包括同样构成潜在的大流行性威胁的其它病毒亚型(包括H7N7和H9N2)，它证实在所有甲型菌株病毒中都具有高度保守的CTL表位。因此，与高度菌株特异的HA抗体应答不同，不论甲型流感菌株的亚型，CTL应答都具有广泛有效的潜力[9]。因此，诱导有力的CTL应答对大流行性流感疫苗而言是高度希望的特性。
诱导CD8+CTL，特别在人类中进行诱导，到目前已证明是疫苗研制的重要障碍。多种递送系统(如DNA和病毒载体)提供了一些希望，但却具有潜在的安全性顾虑，并且就DNA而言，通常引起不良的细胞应答，特别是CD8+CTL应答。另外，病毒载体具有诱导对于该载体的中和抗体的问题，这限制了重复性使用。目前正在对DNA以及活的病毒载体递送的初免-加强组合进行评价，并且尽管结果在动物模型中是有希望的，但它们仍然有待在人类中证实。ISCOMTM疫苗在许多动物模型中已显示是T-辅助细胞(CD4+)和CTL(CD8+)的有力的诱导剂。T细胞对多种抗原发生应答，包括自然发生的免疫原以及重组蛋白[10]。一种H1N1流感ISCOMTM疫苗已显示在小鼠中给予交叉保护来针对异源病毒(包括H2N2、H3N2、H5N1以及H9N2病毒)的致死性攻击[11]。此外，还显示保护依赖于CD8+T细胞和抗体[11]。
普遍接受的是ISCOMTM疫苗诱导有力的CD8+CTL应答的能力大部分是由于事实上抗原被结合到ISCOMTM颗粒之中[12]，这导致了有效的细胞摄取以及随后抗原进入MHC I类处理机制[13]。然而，ISCOMTM疫苗的制造是很复杂的，难以按比例放大，并且存在着与生产控制以及一致性相关的显著问题。因此，ISCOMTM疫苗(尽管在多种动物物种中证实了针对一系列病原的保护)具有有限的产品潜力，特别是对于大批量的产品，如大流行性流感疫苗，这将要求在短时间内生产出数亿剂量。
在引起本发明的工作中，本发明人已研制出一种疫苗制品，其中预先形成的ISCOMATRIXTM佐剂(它是“无免疫原的”，原因是它实质上具有与ISCOMTM疫苗相同的组成和结构，但却没有结合的抗原[12；14])，与流感免疫原(例如，如以下所说明的标准的三价季节性流感疫苗)相组合或混合。因此，与ISCOMTM疫苗相反，本发明的疫苗制品中的流感免疫原没有结合到ISCOMATRIXTM佐剂结构中。因此，本发明的疫苗制品的生产是简单、稳健并且可重现的，并且可以大规模进行。
此外，引起本发明的工作使用雪貂作为动物模型，证实了疫苗制品(包括标准的地方性流感免疫原)保护以对抗甲型流感病毒的高致病性大流行性(H5N1)亚型的致死性攻击的能力。
贯穿本说明书及其跟随的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”以及变体如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应当被理解成是指包含了提及的元素或步骤或者元素或步骤的组，但不排除任何其它元素或步骤或者元素或步骤的组。
本说明书中提及任何在先公开文件(或从其中所获得的信息)或者提及任何已知事物不是、并且不应该被当成是承认或准许或以任何形式建议该在先公开文件(或从其中获得的信息)或已知的事物形成在本说明书所涉及的研究领域内共同的一般知识的一部分。
发明内容
本发明提供了用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的方法，该方法包括给予该受试者一种组合物，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
在另一方面，本发明提供了一种组合物在制备用于给予受试者以便在该受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的药物中的用途，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
在又另一方面，本发明提供了一种组合物用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的用途，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
在又一方面，本发明提供了用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的药剂，其中所述药剂是一种组合物，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
附图说明
图1是来自甲型/波多黎各/8/34(H1N1)、甲型/印度尼西亚/5/05(H5N1)以及甲型/越南/1194/04(H5N1)的(A)核蛋白(NP)、以及(B)基质蛋白(M)的氨基酸序列比较。粗体字母是所说明的人类CTL表位(改编自Suzanne L.Epstein、Jonathan W.Yewdell、Jack R.Bennink，http://www.flu.lanl.gov/review/epitopes.html)。甲型/印度尼西亚/5/05和甲型/越南/1194/04的NP和M蛋白与甲型/波多黎各/8/34共享了大概93％的氨基酸同一性。
图2显示了来自雪貂的血清的HI抗体(A)以及病毒中和滴度(B)，这些雪貂接种了(i)三价季节性流感疫苗(包含15μg的甲型/新喀里多尼亚群岛/20/99、甲型/威斯康辛州/67/2005以及乙型/马来西亚/2506/2004)结合ISCOMATRIXTM佐剂(60μg)；(ii)甲型/越南/1194/2004结合ISCOMATRIXTM佐剂(60μg)；或(iii)单独的ISCOMATRIXTM佐剂(佐剂对照)。在第二次接种疫苗后的第28天收集血清，并且针对甲型/越南/1203/2004以及甲型/印度尼西亚/5/2005进行滴定。数据显示为每组四只动物的平均值。指明了标准差。图3显示了在用(i)三价季节性流感疫苗(包含15μg的甲型/新喀里多尼亚群岛/20/99、甲型/威斯康辛州/67/2005以及乙型/马来西亚/2506/2004)结合ISCOMATRIXTM佐剂(60μg)；(ii)甲型/越南/1194/2004结合ISCOMATRIXTM佐剂(60μg)；或(iii)单独的ISCOMATRIXTM佐剂(佐剂对照)免疫之后，用106个半数鸡胚感染量(EID50)的甲型/越南/1203/2004攻击的雪貂的存活率(A)、体温变化(B)以及体重变化(C)，如所显示。数据是每组四只动物的代表性数值。在图3A中，对病毒攻击后的雪貂进行称重，并且每天进行身体检查。出于伦理原因，对损失超过10％体重或显示出痛苦迹象(如震颤或腹部不适)的雪貂进行安乐死。在图3B中，使用可植入皮下的温度转发器每天监测雪貂的温度。垂直线代表攻击的时间。未感染的雪貂的平均体温是38.8℃。数据是每组四只动物的代表性数值。在图3C中，雪貂的体重被表示为在攻击时该动物体重的百分数。数据是每组四只动物的代表性数值。
图4显示了用以下任一物质进行免疫的雪貂的发病率得分：(i)三价季节性流感疫苗(包含15μg的甲型/新喀里多尼亚群岛/20/99、甲型/威斯康辛州/67/2005以及乙型/马来西亚/2506/2004)结合ISCOMATRIXTM佐剂(60μg)；(ii)甲型/越南/1194/2004结合ISCOMATRIXTM佐剂(60μg)；或(iii)单独的ISCOMATRIXTM佐剂(佐剂对照)，如所显示。在用106个半数鸡胚感染量(EID50)的甲型/越南/1203/2004攻击之后，监测了雪貂的行为，并且基于以下尺度给出发病率得分(0＝爱动且警觉，1＝警觉但只有在诱导活动时才爱动，2＝警觉但当刺激时不爱动，3＝既不警觉也不爱动，4＝显示出有必要进行安乐死的身体症状)，如材料与方法所说明。
具体实施方式
一方面，本发明提供了用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的方法，该方法包括给予该受试者一种组合物，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
优选地，受试者是人。然而，本发明的方法也扩展至在非人类的动物或鸟类受试者(如家畜动物或鸟，实验室试验用的动物或鸟、宠物或鸟，或者野生的动物或鸟)体内引起或诱导保护性免疫应答。
根据本发明，给予受试者的组合物包括地方性流感亚型的至少一种免疫原。如以上所指出，这种目前在人类中传播的“地方性”甲型流感亚型是H1N1和H3N2亚型。因此，本发明的组合物优选地包括这些亚型中的一种或两种的免疫原。在本发明的一个具体的实施方式中，组合物可包括标准的三价流感疫苗，该疫苗包括灭活的地方性甲型流感病毒(H1N1和H3N2)以及乙型流感病毒，如
Figure GPA00001088720900061
分裂病毒体、灭活的流感疫苗(CSL Limited，Melbourne，Australia)。
如在此所使用的，提及流感病毒的“大流行性”亚型应当被理解为提及这样的亚型，即受试者群体(特别是人类群体)被认为对这些亚型是首次接触的，也就是说没有或很少由作为先前的疫苗接种或先前的暴露的结果而带来的抵抗力。如以上所指出，此类大流行性亚型具体包括H5N1、H2N2、H9N2、H7N7、H7N3和H10N7的亚型。
给予根据本发明的包括地方性流感亚型的免疫原的组合物已显示引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的异源性的保护性免疫应答。
如在此所使用，提及“免疫应答”应当被理解为泛指体液应答(如诱导病毒中和抗体)以及细胞介导的免疫应答(如诱导CD8+细胞毒性T细胞)。在此提及“保护性免疫应答”包括这样的免疫应答，一旦攻击或暴露于流感病毒的大流行性亚型，该应答保护受试者免受随后的感染、或降低随后感染的可能性，并且包括缓解任何随后感染的症状连同减轻任何随后感染的严重性。
根据本发明给予至受试者的组合物包括无免疫原的免疫刺激复合物作为佐剂，它与流感免疫原相组合或混合。如在此所使用，术语“无免疫原”是指形成这种免疫刺激复合物但没有任何免疫原或抗原被结合至该复合物的结构之中。优选地，这种佐剂是基于皂苷的无免疫原的免疫刺激复合物，包括皂苷、甾醇(如胆固醇)，以及可选地包括磷脂(如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱)，该复合物被形成为典型是坚硬、中空、球状、类似笼子的颗粒，直径测量为大约40nm，并且被称为“空ISCOM”、ISCOM基质、或者最近更多地被称为ISCOMATRIXTM佐剂[23]。最优选地，无免疫原的免疫刺激复合物是ISCOMATRIXTM佐剂。
常规的药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂或稀释剂，可包含在本发明的组合物之中。通常，根据本发明的组合物将包括与该佐剂相混合的免疫有效量的流感免疫原，连同一种或多种常规的药学上可接受的载体和/或稀释剂。如在此所使用，“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何以及所有溶剂、分散介质、水性溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及类似物。此类针对药学活性物质的介质和试剂的使用在本领域内是熟知的，并且在Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Edition，Mack Publishing Company，Pennsylvania，U.S.A.中通过举例进行了说明。
包含在本发明的组合物之中的流感免疫原是以有效量给予的。“有效量”是指至少部分地达到所希望的免疫应答(特别是所希望的保护性免疫应答)必要的量。该量值依据以下因素而变化：有待治疗的个体的年龄、健康以及身体情况、有待治疗的个体的种族背景、所希望的保护程度、组合物的配方、医疗状况的评价、以及其它相关因素。预期的是该量值会落在可通过例行试验确定的一个相对宽的范围之内。若有必要，可一次或多次重复给予有效量。所给予的实际量值将由所希望的保护性免疫应答的性质并且由给予活性免疫原的速率来确定。
根据本发明，该组合物优选通过胃肠外给药途径给予受试者。胃肠外给药包括不通过消化道(即不是肠道)的任何给药方式，包括通过注射、输注等方式进行给药。通过注射进行给药包括，例如进入静脉(静脉内)、动脉(动脉内)、肌肉(肌内)以及皮肤以下(皮下)。组合物优选以足以获得所希望的免疫应答的剂量进行皮下、皮内或肌内给药。
适合胃肠外给药的组合物方便地包括优选地与接受者的血液等渗的活性组分的无菌水性制剂。这种水性制剂可使用适宜的分散剂或润湿剂以及助悬剂根据已知的方法进行配制。这种无菌可注射的制剂也可以是处于无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或混悬液，例如作为处于聚乙二醇和乳酸中的溶液。在可被采用的可接受的运载体(vehicle)和溶剂之中的是水、林格氏溶液、适宜的碳水化合物(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖)、以及等渗的氯化钠溶液。此外，方便地采用无菌的、非挥发油类作为溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可采用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(如油酸)可用于注射的制剂中。
本发明还提供了一种组合物在制备用于给予受试者以便在该受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的药物中的用途，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
本发明还提供了一种组合物用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的用途，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
此外，本发明提供了用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的药剂，其中所述药剂是一种组合物，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
根据本发明，已显示用标准的三价季节性流感疫苗(含有甲型/新喀里多尼亚群岛/20/99(H1N1)、甲型/威斯康辛州/67/2005(H3N2)以及乙型/马来西亚/2506/2004，与无免疫原的ISCOMATRIXTM佐剂相混合)(在此称为“流感ISCOMATRIXTM疫苗”)进行免疫接种提供了针对野生型甲型/越南/1203/04(H5N1)的致死性攻击的保护。
流感ISCOMTM疫苗已显示在多个物种(包括人类)中诱导CD8+CTL应答[10；15；16]。然而，到目前还没有关于包含ISCOMATRIXTM的疫苗在任何一种动物模型中针对致死性攻击提供保护的报道。因为在ISCOMATRIXTM疫苗中抗原简单地与ISCOMATRIXTM佐剂结构相混合并且没有结合到其中，所以诱导CD8+CTL应答通常被认为有效性小于使用包含相同量的结合抗原的ISCOMTM疫苗[12；17-20]。
出于这一原因，已研究出一系列的策略以便将蛋白质与预先配制的ISCOMATRIXTM佐剂相关联以产生关联的ISCOMATRIXTM疫苗。这些策略包括利用这种ISCOMATRIXTM佐剂的物理特性的方法，如静电作用，其中带正电荷的蛋白质将与带负电荷的佐剂相关联。还研究出用于修饰蛋白质或佐剂以便使这类关联最大化的程序[21]。其它用于获得关联的方法包括修饰ISCOMATRIXTM佐剂的组分，以便能够将蛋白质偶联至不同的暴露的化学基团上。这类修饰的一个例子被称为螯合ISCOMATRIXTM佐剂，其中金属螯合基团被掺入到该结构之中，然后该结构可结合包含金属亲和标签(如六组氨酸标签)的蛋白质[18]。
因此，由于对抗原结合到ISCOMATRIXTM佐剂(如，在ISCOMTM疫苗中)之中用于细胞免疫应答的最佳诱导的预期要求，高度出乎意料的是用流感ISCOMATRIXTM疫苗(标准的三价季节性流感疫苗，含有甲型/新喀里多尼亚群岛/20/99(H1N1)、甲型/威斯康辛州/67/2005(H3N2)以及乙型/马来西亚/2506/2004，与无免疫原的ISCOMATRIXTM佐剂简单混合)对雪貂进行免疫接种，保护免受野生型甲型/越南/1203/04(H5N1)的致死性攻击。此外，在不存在可检测的针对H5N1的中和抗体应答的条件下观察到这种保护，这表明由流感ISCOMATRIXTM疫苗所诱导的细胞免疫应答(最可能是CD8+CTL)能够保护首次接触的动物在用高致病性H5N1流感病毒进行致死性攻击之后抵抗严重的疾病和死亡。
对于许多喜欢研究人类流感的病毒学家来说，雪貂是试验用动物的选择。雪貂对以下研究特别有用：(i)流感(包括H5N1分离物)的发病机理；(ii)接种疫苗之后对攻击性感染的应答；(iii)抗病毒物质的疗效；(iv)抗病毒的药物抗性突变体的传播性；(v)病毒的脱离以及(vi)对流感的发热反应。替代模型是小鼠，并且不同的遗传学改良的小鼠品系以及大量的用于分析免疫应答的容易获得的试剂的丰富资源使其成为一种令人信服的模型，并且从其使用中已获得大量信息。然而，小鼠自然情况下不感染人类流感病毒，并且不存在已知的小鼠流感病毒。这种天然的抵抗力可能是由于Mx基因存在的缘故，这种基因提供了1型干扰素依赖的保护来抵抗流感(在小鼠而非人类中)，并且还由于在鼠类分泌物中独特的病毒抑制剂的存在[22]。适宜在小鼠体内生长的流感病毒是有限的，并且那些常规使用的流感病毒已经在这种宿主中通过盲传而变得“小鼠适应”。相反，雪貂自然情况下易感染人类流感，所以对可进行研究的病毒菌株不存在限制。
本发明的其它特点在以下实施例中进行更为彻底的说明。然而，应当理解的是，这种详细的说明仅仅是出于对本发明进行例证的目的而包括在此，并且不应当以任何方式将其理解为是对如以上给出的本发明的广阔范围的限制。
实施例
A.材料与方法
雪貂：幼年的雌性或雄性雪貂(3至5个月大)，体重大概是700至1500g，来源于IMVS(SA)。雪貂对目前正在传播的流感(H1N1、H3N2，乙型病毒)血清反应呈阴性。在紧临每次接种疫苗之前以及病毒攻击之前收集血液样品。在暴露至病毒之后14天或者在安乐死时再次采集血液样品以检查对攻击的抗体响应。在麻醉过的(氯胺酮/美托咪定50∶50 0.1ml/kg，用Apitemazole逆转)动物上从颈静脉或腋静脉的4个位置使用19号至23号计量注射针(取决于雪貂的大小)进行抽血，每个位置1ml。临床上受到影响的动物在体重损失10％或显示出符合涉及到其它器官系统的迹象(例如震颤或腹部不适)之后立即进行安乐死。
疫苗：用于注射的季节性流感抗原的混合物包括等量(15μg)的甲型/新喀里多尼亚群岛/20/99(H1N1)、甲型/威斯康辛州/67/2005(H3N2)以及乙型/马来西亚/2506/2004(CSL Limited，Melbourne，Australia)。对于大流行性菌株，通过与季节性菌株相同的方式制备单价抗原(甲型/越南/1194/2004)。简言之，在鸡胚中繁殖病毒，用β-丙内酯(ICNPharmaceuticals Inc.，Costa Mesa，CA)灭活，经受蔗糖梯度的区带离心，并且用牛磺脱氧胆酸钠(Sigma，St.Louis，MI)进行处理以得到纯净、灭活并破坏的抗原制备物。病毒抗原的浓度用血细胞凝集素(HA)蛋白来表示，它是由标准的单向辐射免疫扩散确定并与已知的相关菌株的标准进行比较。紧临给药之前将PBS(pH 6.2)中的ISCOMATRIXTM佐剂[23]加到流感抗原之中。
疫苗给药：使用带有27号计量注射针的1ml注射器经肌内将两个0.5mL剂量(间隔21天)递送到后腿的四头肌或后部肌肉之中。
病毒：H5N1人类流感病毒：甲型/越南/1203/04(野生型)、甲型/越南/1194/04(经反向工程处理的疫苗菌株)以及甲型/印度尼西亚/5/2005(野生型)获自世界卫生组织流感合作实验室。将储存病毒在35℃在10天大的鸡胚的尿囊腔中繁殖24至36小时，并将其保存在-70℃。所有使用高致病性病毒的实验都在BSL 3+防护装置中进行(AAHL，CSIRO Geelong)。
病毒攻击：在第2剂之后三周，将这些雪貂鼻内(两个鼻孔)接种106个半数鸡胚感染量(EID50)的野生型攻击病毒(甲型/越南/1203/2004)，如Govorkova等人所描述[24]。
免疫原性测试：使用两倍稀释的血清以及HA抗原的单一储存源通过血细胞凝集抑制(HI)、以及病毒中和(VN)对免疫原性进行评估(如WHO流感协作实验室标准操作步骤中所描述)。确定几何平均滴度，并且血清保护定义为抗体滴度高出接种疫苗之前的滴度4倍或更高。使用双尾配对Student’s t检验来确定病毒滴度和发病率数据的统计学显著性。通过卡方分析来确定死亡率数据的统计学显著性。
临床评价：
观察：在整个研究中每天对动物进行目测，并且若这些动物在攻击之后表现出疾病的迹象则每天目测两次。一般的临床观察是在攻击之前进行的，其中保存了任何呼吸症状(如咳嗽或喷嚏)的具体记录。在每次接种疫苗之后2、24和48hr时记录反应位点的观察(即，红斑、水肿)。攻击之后，每天监测活动得分。
体重：在给药和攻击时(第0天)以及攻击后第3、5、7以及14天在镇静状态下对动物进行称重。
温度：在病毒攻击之前大概十天，在镇静状态下使用数字温度计、并且连续使用插入皮下的温度转发器在22号计量注射针的协助下手动确定温度。
生物样品：在攻击之后第3、5以及7天采集鼻拭子、口拭子用于病毒分离。
B.结果
流感ISCOMATRIXTM疫苗：抗体应答
在雪貂免疫原性以及攻击研究开始之前，从这些雪貂收集血浆，并且使用标准方法用酶联免疫测定(ELISA)测试甲型/新喀里多尼亚群岛/20/99(H1N1)、甲型/威斯康辛州/67/2005(H3N2)以及乙型/马来西亚/2506/2004的抗体的存在。测试的所有雪貂对于针对全部3种菌株的抗体是阴性的，并且因此对被认为是首次接触流感。
对于免疫原性以及攻击的研究，使用3.75μg或15μg的来自甲型/越南/1194/2004的HA与ISCOMATRIXTM佐剂(60μg)相混合、或者目前的季节性三价流感疫苗(包含15μg来自以下各项之一的HA：甲型/新喀里多尼亚群岛/20/1999(H1N1)、甲型/威斯康辛州/67/2005(H3N2)以及乙型/马来西亚/2506/2004)与ISCOMATRIXTM佐剂(60μg)相混合(称为流感ISCOMATRIXTM疫苗)免疫雪貂两次(第0、21天)。类似地单独将ISCOMATRIXTM佐剂给予一组对照动物。使用血细胞凝集抑制(HI)(图1A)以及病毒中和(VN)(图1B)测定法来评价在第二次给药之后28天所收集的血清的流感特异性抗体的存在。如在图2中所示，用甲型/越南/1194/2004 ISCOMATRIXTM疫苗以两种抗原剂量(3.75μg和15μg)所免疫的雪貂引起了针对甲型/越南/1194/2004(H5N1，分化枝1)以及甲型/印度尼西亚/5/2005(H5N1，分化枝2)二者的有力的抗体应答，证明尽管来自不同的H5N1分化枝，但是甲型/越南/1203/2004和甲型/印度尼西亚/5/2005在抗原和血清学方面是紧密关联的。
相反，通过针对甲型/越南/1203/2004和甲型/印度尼西亚/5/2005的HI和VN，用流感ISCOMATRIXTM疫苗所免疫的雪貂的血清是阴性的。如所预期，单独接受了2个剂量的
Figure GPA00001088720900131
佐剂的对照雪貂在两个测定中也是阴性的。
流感ISCOMATRIXTM疫苗：抗致死性攻击的保护
在第2次疫苗给药之后四周，雪貂在鼻内(两个鼻孔)接种106个半数鸡胚感染量(EID50)的攻击病毒(甲型/越南/1203/2004)，如Govorkova等人所描述[24]。然后，连续监测这些雪貂的温度，并且每天监测体重、身体外表以及发病率。
如在图3A中所显示，用甲型/越南/1994/2004ISCOMATRIXTM疫苗以两个HA抗原水平(3.75μg和15μg)所免疫的动物中所有动物用野生型(甲型/越南/1203/2004)病毒进行致死性攻击后都存活下来。这一结果并不出乎意料，因为这些动物已形成响应于这些疫苗的高滴度的甲型/越南/1203/2004特异性抗体，如在图2中所示。然而，出乎意料的是，用流感ISCOMATRIXTM疫苗所免疫的雪貂在致死性攻击后也存活，尽管不存在可检测的中和抗体。如所预期，对照雪貂全部屈服于病毒攻击，并且出于伦理原因已被安乐死，因为它们已经损失了超过10％的体重或显示出痛苦的迹象，如震颤或腹部不适。
在攻击之前，使用皮下温度转发器连续监测这些雪貂的温度持续3天以建立基线，并接着在攻击之后再监测7天。如在图3B中所显示，对照雪貂的温度在攻击之后12至24小时急剧上升2.5至3.0℃，并且保持在这种升高的水平直到出于伦理原因将它们安乐死。类似地，用流感ISCOMATRIXTM疫苗所免疫的雪貂的温度在攻击之后12至24小时急剧上升2.5至3.0℃，然而这种增加是短暂的并且24小时后温度回到基线。在这组中有一只动物经历了第二次稍微降低的短暂温度峰值，温度在24小时后又再次回到基线。相反，在高抗原剂量组中除了一只动物之外，用甲型/越南/1994/2004ISCOMATRIXTM疫苗所免疫的所有雪貂在攻击后温度在任何阶段并未超出攻击前的基线水平。
在整个研究期间每天监测雪貂的重量(图3C)。在对照组中所有动物的重量在攻击3天之内下降大概10％。与用甲型/越南/1994/2004ISCOMATRIXTM疫苗所免疫的雪貂的静态温度曲线相一致，在攻击之后这些动物的体重稳定增加。相反，用流感ISCOMATRIXTM疫苗所免疫的雪貂的温度在攻击之后的整个7天观察期内保持不变。
与体重和温度的数据相一致，用甲型/越南/1994/2004ISCOMATRIXTM疫苗以两个抗原水平(3.75μg或15μg HA)免疫或用流感ISCOMATRIXTM疫苗所免疫的全部雪貂在用野生型H5N1病毒(甲型/越南/1203/2004)进行致死性攻击之后依然爱动并且警觉。相反，单独接受ISCOMATRIXTM佐剂的对照动物显示出发病的迹象，并且到攻击后第3天既不爱动也不警觉，并且到第5至7天它们的身体状况已恶化到必须进行安乐死的水平(图4)。
C.讨论
在研究期间所做的关键性且出乎意料的观察是流感ISCOMATRIXTM疫苗(包含15μg的来自以下各项中之一的HA：甲型/新喀里多尼亚群岛/20/1999(H1N1)、甲型/威斯康辛州/67/2005(H3N2)以及乙型/马来西亚/2506/2004与ISCOMATRIXTM佐剂相结合)在不存在响应于甲型/越南/1203/2004(HI和VN)的可检测的中和抗体的情况下保护雪貂免受高致病性H5N1病毒(甲型/越南/1203/2004)的致死性攻击。在流感ISCOMATRIXTM疫苗组中的雪貂温度的短暂提高提示，在攻击之后这些动物被感染，但病毒感染的程度被非中和抗体介导的免疫机制所限制，由此导致病毒的快速清除并且从感染中恢复。
这些动物没有损失体重并且在攻击之后依然活跃且警觉的这种观察支持这项结论。相反，单独接受2个剂量的ISCOMATRIXTM佐剂的对照动物经历了快速、延长的温度提高，并且它们的健康状况快速恶化至必须进行安乐死的程度。
目前，由于不存在评价雪貂细胞免疫应答(特别是CD8+CTL应答)的测定法，所以不可能鉴定出由流感ISCOMATRIXTM疫苗针对H5N1病毒的致死性攻击提供保护的免疫基础。流感ISCOMTM疫苗已显示在多个物种(包括人类)中诱导CD8+CTL应答[10；15；16]。此外，H1N1 ISCOMTM疫苗在小鼠中已显示出针对异源攻击的保护，这部分地由于诱导交叉保护的CD8+CTL应答的缘故。然而，如以上所提及，广泛接受的是诱导最佳的CD8+CTL应答要求将该抗原结合到ISCOMTM或ISCOMATRIXTM佐剂之中[17-19]。因此，出乎意料的是在本研究中观察到在不存在可检测的中和抗体应答时，流感ISCOMATRIXTM疫苗诱导细胞免疫应答(尽管没有正式地证实但最可能是CD8+CTL应答)，这种细胞免疫应答足够有力地保护雪貂抵抗高致病性H5N1病毒的致死性攻击。此外，由于在所有甲型菌株流感病毒的内部蛋白质(包括经鉴定的CD8+CTL表位)之间高度的序列保守性，合理的是假设流感ISCOMATRIXTM疫苗会同样地针对其它潜在的大流行性菌株(包括但不限于：H7N7、H7N3、H9N2以及H10N7)进行保护。
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Claims (10)

1.一种用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的方法，该方法包括给予受试者一种组合物，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中受试者是人。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中组合物包括地方性甲型流感H1N1和/或H3N2亚型的免疫原。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中无免疫原的免疫刺激复合物包括皂苷、甾醇和可选的磷脂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中无免疫原的免疫刺激复合物包括ISCOMATRIXTM佐剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中流感病毒的大流行性亚型选自甲型流感的H5N1、H7N7、H7N3、H9N2或H10N7亚型。
7.根据权利要求6所述的方法，其中大流行性亚型是甲型流感H5N1亚型。
8.一种组合物在制备用于给予受试者以便在该受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的药物中的用途，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
9.一种组合物用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的用途，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
10.一种用于在受试者体内引起或诱导针对流感病毒的大流行性亚型的保护性免疫应答的药剂，其中所述药剂是一种组合物，该组合物包括：
(i)地方性流感亚型的至少一种免疫原，以及
(ii)作为佐剂的无免疫原的免疫刺激复合物。
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