CN106029686A

CN106029686A - 单价h5疫苗

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Publication number: CN106029686A
Application number: CN201480076083.0A
Authority: CN
Inventors: F·何; H-S·J·光; P·木根
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2034-12-12
Also published as: GB2547494B; CN106029686B; GB2547494A; SG11201604996XA; GB201612451D0; US20170000877A1; WO2015099609A1; US9694067B2

Abstract

本发明涉及单价H5N1疫苗。更具体地，本发明涉及单价H5疫苗株的开发，使用工程化成引发进化枝交叉保护的血凝素(HA)。本发明还涉及表位‑嵌合H5和表达表位‑嵌合H5的反向遗传学(RG)流感病毒。

Description

单价H5疫苗

相关申请的交叉参考

本申请涉及2013年12月23日提交的美国临时专利申请序列号61/920,187并要求其权益。各申请通过引用纳入本文。

序列提交

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表命名为2577234PCTSequenceListing.txt，2014年12月4日创建，且大小为53kb。电子格式的序列表中的信息通过引用全文纳入本文。

背景技术

本发明涉及单价H5N1疫苗。更具体地，本发明涉及单价H5疫苗株的开发，使用工程化成引发进化枝交叉保护的血凝素(HA)。本发明还涉及表位-嵌合H5和表达表位-嵌合H5的反向遗传学(RG)流感病毒。

本文用于阐明本发明背景和提供关于实践的额外细节的出版物和其它材料通过引用纳入，为了方便起见在参考书目中各自分组。

高致病性禽流感(HPAI)病毒亚型H5N1在人和家禽中的重现依然是公共健康的严重问题(concern)。自从其十年前在亚洲出现，高致病性禽流感H5N1病毒已传播到3大洲超过60个国家，并在东南亚和非洲的家禽中间流行(endemic)(Peiris等,2007)。其导致包括人在内的数种哺乳动物疾病，通常带来致命后果。迄今，H5N1导致全球641个人类病例，包括380例死亡(http,2013)。尽管迄今没有观察到病毒持续的人际间传播，仍然忧虑的是如果获得人传播，会导致严重流行性疾病(Guan等，2004；Imai等，2012)。

疫苗接种仍是最有效和经济上节俭的策略以抗击有大流行潜质的禽流感病毒带来的威胁(Baz等.2013)。然而，如果流行性疾病突然出现并迅速蔓延，生产有效疫苗是一项挑战。因此，正努力以开发普遍的疫苗，其使用更少的抗原并诱导交叉保护反应。评估高度保守的流感病毒离子通道蛋白(M2)(Wu等,2007)及核蛋白(NP)，所述评估关于诱导交叉保护性细胞免疫和病毒清除(Chen和Subbarao,2009)。然而，这些蛋白的特异性抗体是弱免疫原性且允许感染。因此，开发基于流感病毒血凝素(HA)的疫苗仍是预防HPAI流感病毒感染的最有利选择，所述HA是流感病毒免疫的主要决定簇(Gambotto等,2008)。H5N1病毒由于血凝素序列不同而在抗原性上可区分，产生不同H5N1谱系或进化枝(Aubin等,2005；WHO等,2008)。由于HA序列尤其是中和表位区内的变化，常规基于HA的H5N1疫苗看来对H5N1的异源株或系统发育上变异的进化枝无效(Shore等,2013)。因此，开发采用抗原性不同的三重或更多病毒株混合物的策略以引起广泛保护。然而，个体疫苗毒种的传播或共表达重组疫苗的开发耗时、对技术要求高且昂贵。

因此，重要的是开发大流行前的单价疫苗，所述疫苗诱导进化枝交叉保护抵御抗原性不同的H5N1株。

发明内容

因此，在第一方面，本发明提供禽流感病毒株的修饰的H5蛋白、经分离的修饰的H5蛋白或纯化的修饰的H5蛋白。在一个实施方式中，禽流感病毒株是A/印尼/CDC669/2006(H5N1)。此毒株的天然全长H5蛋白示于GenBank登录号ABI36428并由具有GenBank登录号CY014481所示核苷酸序列的核酸编码。此核酸的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1。此毒株的天然全长H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。此毒株的天然、成熟H5蛋白(即没有信号肽的H5蛋白)由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸编码。天然、成熟H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。在一个实施方式中，修饰的、成熟H5蛋白具有S155N、T156A和R189K修饰。这些修饰分别对应全长H5蛋白中残基171、172和205的修饰。修饰的、成熟H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:6，其由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的核酸编码。修饰的、全长H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:8，其由具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的核酸编码。修饰的H5有时也在本文中称为表位-嵌合H5(EC H5)。

在第二方面，本发明提供含本文所述修饰的H5蛋白的重组禽流感病毒。重组禽流感病毒可包括在禽流感病毒遗传背景中的修饰的H5蛋白。禽流感病毒可以是主要病毒株。在一个实施方式中，所述重组禽流感病毒可用作疫苗。该重组禽流感病毒可纳入免疫试剂盒。在另一个实施方式中，所述重组禽流感病毒可用作血凝素抑制(HI)试验中的诊断参照病毒。该重组禽流感病毒可纳入血凝素抑制(HI)试验试剂盒。在一些实施方式中，所述重组禽流感病毒通过反向遗传学过程产生。

在第三方面，本发明提供单价H5疫苗以预防对象中的疾病，其中所述疾病与禽流感病毒H5N1亚型相关。根据此方面，所述单价H5疫苗包括预防有效量的免疫原性剂。在一个实施方式中，所述免疫原性剂包括本文所述修饰的H5蛋白或其抗原性部分或者编码本文所述修饰的H5蛋白的核酸或其抗原性部分。在另一个实施方式中，所述抗原性部分包括本文所述修饰的H5蛋白的表位。在另外一个实施方式中，所述对象可以是人、家养动物(狗、猫、猴等)；牲畜(马、牛、绵羊、山羊、猪等)、野鸟(大雁、野鸭等)和家养禽类(鸡、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，所述免疫原性剂是含本文所述修饰的H5蛋白的病毒或是本文所述重组病毒。在另一个实施方式中，所述病毒或重组病毒失活。在另一个实施方式中，所述病毒或重组病毒是减毒病毒。在另一个实施方式中，所述病毒或重组病毒采用病毒体或病毒样颗粒的形式。在另一个实施方式中，所述病毒或重组病毒是蛋衍生或细胞培养物衍生。在另一个实施方式中，所述免疫原性剂是含本文所述修饰的H5蛋白的裂解病毒或是裂解病毒抗原性制备物。在一个实施方式中，所述免疫原性剂是修饰的H5蛋白或其抗原性部分。在另一个实施方式中，所述修饰的H5蛋白或其抗原性部分已分离。在另一个实施方式中，所述修饰的H5蛋白或其抗原性部分通过表达系统产生。在一个实施方式中，所述表达系统是任何表达系统，如病毒表达载体，其中修饰的H5蛋白或其抗原性部分在病毒表面呈现或展示。在一个实施方式中，所述病毒表达载体是任何病毒表达载体，如修饰的痘苗病毒表达载体、腺病毒表达载体、痘病毒表达载体、杆状病毒表达载体等。在一个实施方式中，所述表达载体是杆状病毒表达载体，呈现或展示修饰的H5蛋白或其抗原性部分的病毒是杆状病毒。在另一个实施方式中，所述免疫原性剂是编码修饰的H5蛋白或其抗原性部分的核酸，其能在对象中表达。

在第四方面，本发明提供产生针对禽流感病毒的保护性免疫的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的本文所述的单价H5疫苗。

在第五方面，本发明提供预防或治疗禽流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的本文所述的单价H5疫苗。在一个实施方式中，所述预防或治疗可延迟禽流感发作或减缓发展速度。

在第六方面，本发明提供本文所述的单价H5疫苗用于刺激针对禽流感病毒的免疫应答的应用。

在第七方面，本发明提供本文所述的重组禽流感病毒用于制备引起对象中的保护性免疫应答的药物的应用。

在第八方面，本发明提供本文所述的重组禽流感病毒用于制备预防对象患上H5N1亚型禽流感的药物的应用。

在第九方面，本发明提供本文所述重组禽流感病毒用于制备药物的应用，所述药物用于延迟H5N1亚型禽流感感染对象中的H5N1亚型禽流感发作或减缓所述疾病的速度。

在第十方面，本发明提供制备疫苗的方法，包括使用本文所述修饰的H5蛋白或本文所述重组禽流感病毒。

在第十一方面，本发明提供本文所述修饰的H5蛋白或本文所述重组禽流感病毒用于疫苗开发的应用。

在第十二方面，本发明提供本文所述修饰的H5蛋白或本文所述重组禽流感病毒，用于疫苗开发。

附图简要说明

图1A和1B显示在不同进化枝的抗原性表位中鉴定可变氨基酸。比对不同主要进化枝的H5蛋白序列。H5N1HA进化枝的氨基酸共有序列(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5)在等同于H1抗原性位点Ca(氨基酸残基136-141、165-169、202-204、220-221和234-236处的框内)和Cb(氨基酸残基69-75处的框内)、Sa(氨基酸残基120-121和152-163处的框内)和Sb(183-194处的框内)的位置处突出。图2A和2B显示用免疫的小鼠血清进行的进化枝交叉测试。在第28天(最终免疫后14天)从小鼠中收集血清样品，小鼠分别用RG-EC H5、A/越南/1203/2004、A/印尼/CDC669/2006免疫。图2A：针对不同H5N1进化枝的HI效价。图2B：针对不同H5N1进化枝的病毒中和效价。进化枝号列于相应各病毒名前。各点表示算术平均值(n＝10)±SD。

图3A-3H显示保护小鼠抵御用进化枝1.0、进化枝2.1、进化枝2.2或进化枝2.3H5N1病毒的致死攻击(challenge)。结果分别以存活百分比(图3A、3C、3E和3G)和体重百分比(图3B、3D、3F和3H)形式表示(在试验开始时)。各小鼠组(n＝8)分别用RG-EC H5、A/越南/1203/2004,A/印尼/CDC669/2006或PBS皮下免疫。最终疫苗接种后3周，以5MLD50的进化枝1.0(A/越南/1203/2004)(图3A、3B)、进化枝2.1A/印尼/CDC669/2006(图3C、3D)、进化枝2.3.4A/安徽/1/05(图3E、3F)或进化枝2.2.1.1A/埃及/3300-NAMRU3/2008(图3G、3hH)HPAI H5N1病毒株鼻内感染小鼠。在14天观察期中监测小鼠。

图4显示接种疫苗的小鼠中肺组织的组织病理学。显示用进化枝2.3.4A/Anhui/1/05或进化枝2.2.1.1A/埃及/3300-NAMRU3/2008H5N1株攻击后5天，苏木精和伊红染色的小鼠肺切片显微照片。小鼠分别用RG-EC H5、A/越南/1203/2004、A/印尼/CDC669/2006或PBS免疫。免疫株和攻击株相应显示。

图5显示接种小鼠肺中病毒感染滴度的测量结果。小鼠分别用RG-EC H5、A/越南/1203/2004、A/印尼/CDC669/2006或PBS皮下免疫。用5MLD50的进化枝1.0(A/越南/1203/2004)、进化枝2.1A/印尼/CDC669/2006、进化枝2.3.4A/安徽/1/05或进化枝2.2.1.1A/埃及/3300-NAMRU3/2008攻击后5天，从小鼠中收集肺样品。肺中病毒负荷的结果以log₁₀TCID₅₀均值形式表示。各点表示算术平均值(n＝2)±SD。

发明详述

本发明涉及单价H5N1疫苗。更具体地，本发明涉及单价H5疫苗株的开发，使用工程化成引发交叉进化枝保护的血凝素(HA)。本发明还涉及表位-嵌合H5和表达表位-嵌合H5的反向遗传学(RG)流感病毒。

除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语应具有与发明所属领域技术人员通常理解相同的含义。

术语“约”或“大致”指在某一值的统计意义范围内。这种范围可以在一数量级内，优选给定值或范围的50％内，更优选20％内，更加优选10％内，甚至更优选5％内。术语“约”或“大致”涵盖的允许偏差取决于研究的特定系统，且能由本领域普通技术人员容易理解。

术语“佐剂”指提高对抗原免疫应答的化合物或混合物。佐剂能用作缓慢释放抗原的组织储存库，且也用作非特异性增强免疫应答的淋巴系统激活因子(Hood等,1984)。通常，没有佐剂情况下用单独抗原进行初级攻击无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，皂苷，矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、匙孔戚血蓝蛋白，以及可能用于人的佐剂如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-s-n-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺、BCG(卡介苗)和厌氧短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。所述佐剂优选是药学上可接受的。

本文所用的“施用”指用本领域技术人员已知的任意多种方法和递送系统传递。例如，施用可腹腔内、脑内、静脉内、口服、透粘膜、皮下、透皮、皮内、肌肉内、外用、肠胃外、经植入物、鞘内、淋巴内、病变内、心包或硬膜外进行。药剂或组合物还可在气溶胶中施用，如用于肺和/或鼻内递送。例如，施用可进行一次、多次和/或在一个或多个延长期中进行。

术语“运载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂(vehicle)。这种药物运载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水性溶液盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液优选用作运载体，尤其用于可注射溶液。合适的药物运载体描述于《雷明顿：药物科学和实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第21版,D.B.Troy编,巴尔的摩的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins),2006，在此通过引用纳入本文。

本文所用的短语“H5N1亚型禽流感病毒相关疾病”指由H5N1亚型禽流感病毒导致或与其相关的任何疾病、疾病状态或紊乱。

本文所用的术语“有效量”或“预防有效量”包括提供所需效果的无毒但充足量的药剂或化合物。例如，用于调整免疫应答的预防有效量是提供调整对象免疫应答的所需效果的药剂或化合物量。类似地，用于治疗或预防禽流感病毒相关疾病的预防有效量是提供治疗或预防对象疾病的所需效果的药剂或化合物量。所需实际量因对象而异，取决于因素如所治疗物种、对象的年龄和一般情况、所治疗病症的严重性、施用的具体药剂和施用模式等。因此，不能指定确切“有效量”。然而，对于任何给定情况，合适的“有效量”可由本领域普通技术人员仅通过常规实验确定。

本文所用的术语“血凝素5(H5)”或“禽流感病毒的H5”或“H5蛋白”指A/印尼/CDC669/2006(H5N1)的天然产生H5蛋白。

术语“修饰的血凝素5”或“禽流感病毒的修饰的H5”或“修饰的H5”或“表位-嵌合H5”指A/印尼/CDC669/2006(H5N1)的H5蛋白，其修饰成包含S155N、T156A和R189K修饰。

本文所用H5蛋白的氨基酸位置编号指SEQ ID NO:4中示范性给出的氨基酸位置。SEQ ID NO:4代表毒株A/印尼/CDC669/2006(H5N1)的血凝素氨基酸序列，但没有氨基末端信号肽。换言之，如果参照位置155的氨基酸(氨基酸155)，所述氨基酸残基意味着对应于SEQ ID NO:4的氨基酸155。术语“S155N”或“T156A”或“R189K”分别示范性指位置155、156和189的氨基酸-根据SEQ ID NO:4氨基酸位置编号-在氨基酸155处是氨基酸天冬酰胺(N)而不是天然丝氨酸(S)，氨基酸156处是丙氨酸(A)而不是天然苏氨酸(T)，氨基酸189处是赖氨酸(K)而不是天然精氨酸(R)。

“免疫原性组合物”或“免疫组合物”指包括至少一种抗原的物质组合物，所述抗原在宿主中引发免疫应答，即对感兴趣组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下效应的一个或多个：产生或激活抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞，特异性针对纳入感兴趣组合物或疫苗的一个或多个抗原。所述宿主优选展示治疗或保护性免疫应答，从而提高对新感染的抗性和/或减少疾病的临床严重性。这种保护如下证明：受感染宿主正常展示的症状减少或缺乏，受感染宿主的恢复时间更快和/或病毒效价降低。

本文所用的“个体”或“对象”或“动物”指支持负链RNA病毒感染的脊椎动物，特别是流感病毒感染，包括但不限于鸟(如水禽和鸡)以及哺乳动物成员如犬、猫、狼、鼬、啮齿动物(racine、鼠等)、马、牛、绵羊、山羊、猪和灵长类，后者包括人。在一个实施方式中，所述对象是人。

术语“分离的”指参照材料从其天然环境如细胞或病毒中移出。因此，分离的生物材料可没有一些或所有细胞组分，即其中天然出现天然材料的细胞组分(如细胞质或膜组分)。如果材料在细胞提取物或上清中存在，其应视作分离的。在核酸分子的情况中，分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA或限制性片段。在另一个实施方式中，分离的核酸优选从发现其的染色体中切除，更优选不再连接或毗邻非编码区(但可连接其天然调控区或其部分)，或者在染色体中发现时位于分离核酸分子所含基因上游或下游的其它基因。在另一个实施方式中，分离的核酸缺少一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入质粒、粘粒、人工染色体等的序列，即当其形成部分嵌合重组核酸构建体时。因此，在一个特定实施方式中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白可与其在细胞中相关联的其它蛋白或核酸或两者相关联，或与细胞膜(如果是膜相关蛋白)相关联。分离的细胞器、细胞或组织从生物体中发现其的解剖位置中移出。分离的材料可以但不必纯化。

术语“主要病毒株”指用于构建高生长或减毒疫苗株的病毒株。这些主要病毒株通常向疫苗病毒贡献6个基因区段(PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS)。主要病毒株可以是也用作疫苗组分的毒株，包括病毒株A/PR/8/34。

本文所用的术语“调节”用于免疫应答时，指直接或间接地增加或减少针对抗原的免疫应答。疫苗一般增强针对抗原的免疫应答。

短语“药学上可接受”指生理上可耐受的分子实体和组合物，且通常在施用人时不产生过敏或类似的不良反应，如胃不舒服、头晕等。

本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”可互换使用，且指定含一个或多个核苷酸或寡核苷酸或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核苷酸或其组合。

术语“多肽”指氨基酸聚合物且不指特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白包括在多肽定义内。此术语不指或排除多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。

本文所用的术语“纯化的”指在减少或消除不相关材料即污染物存在的条件下分离材料，所述不相关材料包括从中获得该材料的天然材料。例如，纯化的病毒颗粒优选基本没有宿主细胞或培养物组分，包括组织培养物或卵蛋白、非特定病原体等。本文所用的术语“基本没有”在分析测试材料的背景下操作性使用。基本没有污染物的纯化材料优选至少约50％纯；更优选至少约90％纯，更加优选至少约99％纯。纯度可通过色谱、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定和本领域已知其它方法评估。

纯化方法为本领域熟知。病毒颗粒能通过超滤或超离心纯化，优选连续离心。其它纯化方法可行且本文也考虑。纯化材料可包含小于约50％，优选小于约75％，最优选小于约90％的细胞组分、介质、蛋白或与之初始相关的其它不需要组分或杂质(根据上下文的需要)。术语“基本纯”指示用本领域已知常规纯化技术能实现的最高纯度。

本文所用的术语“反向遗传学系统”指通过遗传工程方法产生流感病毒颗粒、多肽、病毒体(viron)或核酸的方法。这些方法包括但不限于“质粒系统”，如Hoffmann(2002),美国专利申请公开号2002/0164770和美国专利号8,293,247所述，各通过引用全文纳入本文。一般而言，反向遗传系统能通过本领域技术人员已知的遗传工程方法用特异序列产生病毒颗粒、多肽和/或核酸。

术语“治疗有效量”指给人或动物施用时足以在所述人或动物中产生治疗效果的药剂量。有效量易由本领域技术人员根据常规过程确定。

本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(traetment)”指以任何方式治愈病症或症状，防止病症或疾病建立，或另外预防、阻碍、延迟、减轻或逆转病症或疾病发展或者其它不需要症状的任何和所有应用。

本文所用的单价H5疫苗株基于HA序列开发，所述序列工程化成引发进化枝交叉保护。来自印尼株(A/印尼/CDC669/2006)的H5用作骨架序列。3个氨基酸突变成表达来自骨干中其它循环H5N1的免疫原性表位。表达表位-嵌合H5的反向遗传学(RG)流感病毒能用多个H5单抗中和，所述抗体无法中和野生型A/印尼/CDC669/2006。在针对不同进化枝的HI和病毒中和中检测到高效价，使用来自表位-嵌合H5N1免疫小鼠的血清。有RG-表位-嵌合H5N1的单价疫苗保护小鼠免于不同进化枝的H5N1致死攻击，包括来自三价通用H5疫苗的3个毒株。这些结果表明此单一H5N1病毒引起的广泛免疫应答使该单一病毒能用作单价H5通用疫苗。

因此，在第一方面，本发明提供禽流感病毒株的修饰的H5蛋白、经分离的修饰的H5蛋白或纯化的修饰的H5蛋白。在一个实施方式中，禽流感病毒株是A/印尼/CDC669/2006(H5N1)。此毒株的天然全长H5蛋白示于GenBank登录号ABI36428并由具有GenBank登录号CY014481所示核苷酸序列的核酸编码。此核酸的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1。此毒株的天然全长H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。此毒株的天然、成熟H5蛋白(即缺乏信号肽的H5蛋白)由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸编码。天然、成熟H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。在一个实施方式中，修饰的、成熟H5蛋白具有S155N、T156A和R189K修饰。这些修饰分别对应全长H5蛋白中残基171、172和205的修饰。修饰的、成熟H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:6，其由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的核酸编码。修饰的、全长H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:8，其由具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的核酸编码。修饰的H5有时也在本文中称为表位-嵌合H5(EC H5)。

近期开发的反向遗传系统能用于操作流感病毒基因组(Palese等,1996；Neumann和Kawaoka,1999；Neumann等,1999；Fodor等,1999；美国专利申请公开号2004/0029251)。例如，已证明质粒驱动表达来自pol I启动子的8个流感vRNA和来自polII启动子的所有mRNA可引起传染性甲型流感病毒形成(Hoffmann等2000；美国专利申请公开号2002/0164770，通过引用纳入以参考其关于最小质粒反向遗传系统的描述和关于遗传工程方法的描述)。这些重组方法允许特定产生流感病毒类型，所述类型具有多肽氨基酸序列的特定改变。含所需取代的HA分子可以是重组流感病毒的一部分。重组流感病毒可通过本领域技术人员已知的任何方式制备，包括基因工程法如“仅质粒”系统(Hoffmann等,2002)。重组流感病毒可获自H5N1病毒。重组流感病毒可具有疫苗开发所用H1N1病毒的遗传背景，如A/PR/8/34病毒或任何甲型流感病毒，包括冷适应株和减毒株。对应于HA分子序列的核酸可分离自病毒并测序。

分析和修饰特异性核酸及蛋白的技术为本领域技术人员熟知。根据本发明，可采用本领域技术范围内的传统分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中已充分解释。参见例如Green和Sambrook,2012,《分子克隆》(Molecular Cloning),第4版.(纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Glover,1985,《DNA克隆》(DNA Cloning)(牛津的IRL出版社(IRL Press))；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编.1984)；《核酸杂交》(Nucleic AcidHybridization)(B.D.Hames&S.J.Higgins编.1984)；《转录和翻译》(Transcription AndTranslation)(B.D.Hames&S.J.Higgins编.(1984))；《培养动物细胞》(Culture Of AnimalCells)(R.I.Freshney,Alan R.Liss公司(Alan R.Liss,Inc.),1987)；《固定化细胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)(IRL出版社,1986)；B.Perbal,《分子克隆实践指南》(APractical Guide To Molecular Cloning)(1984)；Ausubel等,1992,《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰威利父子出版公司(JohnWiley&Sons)，包括定期更新)。这些技术包括定点突变，采用有经改变核苷酸的寡核苷酸以产生带突变的PCR产物(如Stratagene生产的“Quikchange”试剂盒)。

在第三方面，本发明提供单价H5疫苗，用于预防对象中的疾病，其中所述疾病与禽流感病毒H5N1亚型相关。根据此方面，所述单价H5疫苗包括预防有效量的免疫原性剂。在一个实施方式中，所述免疫原性剂包括本文所述修饰的H5蛋白或其抗原性部分或者编码本文所述修饰的H5蛋白的核酸或其抗原性部分。在另一个实施方式中，所述抗原性部分包括本文所述修饰的H5蛋白的表位。在另外一个实施方式中，所述对象可以是人、家养动物(狗、猫、猴等)；牲畜(马、牛、绵羊、山羊、猪等)、野鸟(野鹅、野鸭等)和家养禽类(鸡、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，所述免疫原性剂是含本文所述修饰的H5蛋白的病毒或是本文所述重组病毒。在另一个实施方式中，所述病毒或重组病毒失活。在另一个实施方式中，所述病毒或重组病毒是减毒病毒。在另一个实施方式中，所述病毒或重组病毒采用病毒体或病毒样颗粒的形式(美国专利号8,592,197)。在另一个实施方式中，所述病毒或重组病毒是蛋衍生或细胞培养物衍生。在另一个实施方式中，所述免疫原性剂是含本文所述修饰的H5蛋白的裂解病毒或是裂解病毒抗原性制备物。

在一个实施方式中，所述免疫原性剂是修饰的H5蛋白或其抗原性部分。在另一个实施方式中，所述修饰的H5蛋白或其抗原性部分已分离。在另一个实施方式中，所述修饰的H5蛋白或其抗原性部分通过表达系统产生。在一个实施方式中，所述表达系统是任何表达系统，如病毒表达载体，其中修饰的H5蛋白或其抗原性部分在病毒表面呈现或展示。在一个实施方式中，所述病毒表达载体是任何病毒表达载体，如改良痘苗病毒表达载体、腺病毒表达载体、痘病毒表达载体、杆状病毒表达载体等。在一个实施方式中，所述表达载体是杆状病毒表达载体，呈现或展示修饰的H5蛋白或其抗原性部分的病毒是杆状病毒。在另一个实施方式中，所述免疫原性剂是编码修饰的H5蛋白或其抗原性部分的核酸，其能在对象中表达。这类载体或表达系统的产生和应用为本领域熟知。参见例如美国专利号8,592,558。

在另一个实施方式中，所述免疫原性剂是含修饰的H5蛋白的病毒或重组病毒。所述病毒或重组病毒可以是含本文所述修饰的H5蛋白的灭活病毒，含本文所述修饰的H5蛋白的活病毒致病形式，以及病毒制品和/或片段，其中所述制品和/或片段包括本文所述修饰的H5蛋白。这种免疫原性剂的产生和应用为本领域熟知。参见例如美国专利号8,592,558。

提高流感疫苗效力的策略包括使用佐剂(Wood和Williams,同上)，共施用免疫刺激分子(Salgaller和Lodge,199)和粘膜免疫策略。粘膜免疫策略包括在微胶囊中包封病毒(美国专利号5,075,109、5,820,883和5,853,763)和使用免疫增强的膜运载体(WO 98/0558)。另外，口服施用的免疫原的免疫原性能用红血球(rbc)或rbc影泡(美国专利号5,643,577)或用蓝舌抗原(美国专利号5,690,938)增强。也参见美国专利号8,592,558。

若必要，免疫原性剂可一中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)，其用无机酸例如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成。与游离羧基形成的盐还可获自无机基础如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，有机基础如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

本发明所述药物组合物的配制能根据本领域技术人员已知的标准方法学完成。一般，合适的组合物可根据本领域普通技术人员已知方法制备且包括药学上可接受稀释剂、佐剂和/或赋形剂。所述稀释剂、佐剂和赋形剂必须在与其它组合物成分相容方面是“可接受的”且对其受体无害。参见例如《雷明顿：药物科学和实践》,第21版,D.B.Troy编,巴尔的摩的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司,2006，在此通过引用纳入本文。还参见美国专利号8,592,558。

药学上可接受稀释剂的示例是软化水或蒸馏水；盐溶液；基于植物的油如花生油、红花油、橄榄油、棉花籽油、玉米油、芝麻油如花生油、红花油、橄榄油、棉花籽油、玉米油、芝麻油、落花生油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，如聚甲基硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；黄蓍胶或阿拉伯树胶和凡士林。一种或多种运载体通常形成1％-99.9％重量的组合物。所述稀释剂最优选盐水。

对于作为注射溶液或悬液施用，无毒肠胃外可接受稀释剂或运载体能包括林格氏溶液、中链甘油三酯(MCT)、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2丙二醇。口服用的合适运载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些示例花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、藻酸钠、阿拉伯树胶、黄蓍胶、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服制剂可包含合适的调味剂和着色剂。用于胶囊形式时，胶囊可包被有化合物如延迟分解的单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯。

佐剂通常包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。用于组合物制备的佐剂或免疫刺激组分包括但不限于铝盐、矿物油、分枝杆菌产物(如弗氏完全或不完全佐剂)或载剂如植物糖苷皂苷、胆固醇和磷脂酰胆碱的混合物，其提供载剂用于在笼状结构上呈现数个蛋白拷贝。出于本说明书目的，佐剂是加强、增加、缓和或提高对免疫原或抗原的免疫应答的物质。佐剂通常增强体液和细胞免疫应答，但对其中之一的反应增加而缺乏另一种能够定义佐剂。此外，佐剂和其应用为免疫学家熟知并一般用于增强免疫应答，此时免疫原剂量受限、免疫原为弱免疫原性或施用途径是次佳的。因此，术语“辅佐量(adjuvatingamount)”是能增强对给定免疫原或抗原的免疫应答的佐剂量。等于“辅佐量”的质量可变且取决于多种因素，包括但不限于免疫原特征、所施用免疫原的量、宿主种类、施用途径和免疫原施用操作。“辅佐量”能通过施用特定环境组的常规实验容易定量。这在普通技术人员范围内且通常采用常规剂量反应测定不同量的所施用免疫原和佐剂。反应如下测量：测定对免疫原的血清抗体效价或细胞介导反应，用酶联免疫吸附测定、放射免疫分析、血凝试验等。佐剂的应用为本领域熟知。参见例如美国专利号8,592,558。

在一个实施方式中，所述佐剂加入的量为每剂约100μg-约10mg。在另一个实施方式中，所述佐剂加入的量为每剂约500μg-约10mg。在另一个实施方式中，所述佐剂加入的量为每剂约500μg-约5mg。在另一个实施方式中，所述佐剂加入的量为每剂约750μg-约2.5mg。在另一个实施方式中，所述佐剂加入的量为每剂约1mg。

用于口服施用的固体形式可包含人和兽医药物实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、涂层剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔豆胶、黄原胶、皂土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸氢钙。合适的调味剂包括薄荷油，冬青、樱桃、橙或覆盆子味的油。合适的涂层剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质的聚合物或共聚物。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E5α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。

除了上述试剂，用于口服施用的液体形式可包含液体运载体。合适的液体运载体包括水，油如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、落花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。

用于口服施用的悬液还可包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠或乙酰醇。合适的分散剂包括卵磷脂、脂肪酸聚氧乙烯酯如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇单或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯等。用于口服施用的乳剂还可包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上面所示例的分散剂或天然树胶如瓜尔豆胶、阿拉伯树胶或黄蓍胶。

本领域技术人员清楚了解制备肠胃外可施用组合物的方法，并更详细描述于例如《雷明顿：药物科学和实践》,第21版,D.B.Troy编,巴尔的摩的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司,2006，在此通过引用纳入本文。

所述组合物可纳入任何合适的表面活性剂如阴离子、阳离子或非离子型表面活性剂例如山梨酸酯或其聚氧乙烯衍生物。还可纳入悬浮剂如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料如火成硅石以及其它成分如羊毛脂。

组合物制备使用本领域技术人员已知的常规方法。这种组合物通常制备为注射剂，作为液体溶液或悬液；也可制备适合溶于或悬于注射前液体的固体形式。所述制剂还可乳化。活性免疫原性成分通常与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的且与活性成分相容。

在第四方面，本发明提供产生针对禽流感病毒的保护性免疫的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的本文所述单价H5疫苗。

本发明的组合物可采用固体、液体或气溶胶形式以合适的药物有效剂量给对象施用。固体组合物示例包括药丸、乳膏和植入式剂量单位。药丸可口服施用。治疗性乳膏可外用施用。植入式剂量单位可局部施用，例如在肿瘤位点，或可植入以系统性释放治疗组合物，例如皮下。液体组合物示例包括适于肌肉内、皮下、静脉内、动脉内注射的制剂以及用于外用和眼内施用的制剂。气溶胶制剂示例包括用于肺施用的吸入制剂。

所述组合物可通过标准施用途径施用。待用于任何给定环境的具体施用途径取决于多种因素，包括待治疗疾病性质、疾病的严重性和程度、待递送的特定化合物所需剂量以及所需疫苗或组合物的潜在副作用。例如，在要求合适浓度的所需疫苗或组合物直接递送到待治疗位点的情况下，施用可以是区域性的而不是全身。区域施用提供递送极高局部浓度的所需疫苗或组合物到需要位点的能力，并因而适合实现所需治疗或预防效果而同时避免其它身体器官暴露于疫苗或组合物且由此可能降低副作用。施用策略为本领域熟知。参见例如美国专利号8,592,558。

一般，所述组合物可通过外用、口服、直肠、经鼻、皮内、腹腔内或肠胃外(例如静脉内、皮下或肌肉内)途径施用。另外，所述组合物可纳入持续释放基质如生物可降解聚合物，将聚合物植入需要递送位置如肿瘤位点附近。所述方法包括单一剂量施用，以重复剂量在预定时间间隔施用，持续施用预定时间段。本文所用的持续释放基质是由材料构成的基质，通常是可由酶或酸/碱水解或者通过溶解来降解的聚合物。一旦插入体内，酶和体液对基质起作用。所述持续释放基质理想上由生物相容性材料选择，如脂质体、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-乙交酯(乳酸和乙醇酸共聚物)、聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、多聚氨基酸、氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。优选的生物降解性基质是聚丙交酯、聚乙交酯或聚丙交酯-乙交酯(乳酸和乙醇酸共聚物)之一的基质。

若需要，含适合持续或间歇性释放的免疫原性剂的装置或组合物能实际植入体内或局部应用以相对缓释这类材料到体内。

施用表达载体或宿主细胞可包括经直接口服、全身注射递送，或递送到选定组织或细胞，或经递送到分离自对象或相容供体的细胞来间接递送。关于基于核酸的组合物，本发明考虑这类组合物的所有递送模式。

所述组合物还可以脂质体形式施用。脂质体一般获自磷脂或其它脂质，并通过分散于水介质的单或多层水化液晶形成。能使用任何无毒、生理上可接受和可代谢液体，所述液体能形成脂质体。采用脂质体形式的组合物可包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的液体是中性和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法为本领域熟知。

就任何特定对象而言所施用化合物的有效剂量水平取决于多种因素，包括：所治疗疾病类型和疾病阶段；所用化合物的活性；所用组合物；对象的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用时间；施用途径；化合物隔离速率；治疗持续时间；与治疗联用或一致的药物，以及本领域熟知的其它相关因素。

蛋白质性质的药物活性物质可存在的量为每剂1ng-10mg。一般，根据本发明，施用方案的范围应为0.1μg-10mg抗体，特别是1.0μg-1.0mg范围，更特别是1.0μg-100μg范围，所有落入这些范围内的个体数字也是发明的一部分。如果施用通过连续输注发生，更合适的剂量范围可为每小时0.01μg-10mg单位/千克体重，所有落入这些范围内的个体数字也是发明的一部分。

施用一般是肠胃外，如静脉内。肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性溶剂可选自水、醇/水性溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载剂包括液体和营养物补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)等。防腐剂也可存在，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。

所述药物组合物还可包括蛋白质运载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，尤其是人来源的。其它生物活性剂可根据预期用途存在于本发明的药物组合物中。

在第五方面，本发明提供预防或治疗禽流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的单价H5疫苗。在一个实施方式中，所述预防或治疗可延迟禽流感发作或减缓发展速度。单价H5疫苗如上所述。合适的组合物、施用和剂量如上所述。

在第六方面，本发明提供单价H5疫苗用于刺激针对禽流感病毒的免疫应答的应用。单价H5疫苗如上所述。

在第七方面，本发明提供本文所述修饰的H5蛋白或本文所述重组禽流感病毒用于制备引发对象中的保护性免疫应答的药物的应用。

在第八方面，本发明提供本文所述修饰的H5蛋白或本文所述重组禽流感病毒用于制备预防对象患上H5N1亚型禽流感的药物的应用。

在第九方面，本发明提供本文所述修饰的H5蛋白或本文所述重组禽流感病毒用于制备药物中的应用，所述药物用于延迟H5N1亚型禽流感感染的对象中的H5N1亚型禽流感发作或减缓所述疾病的速度。

在第十方面，本发明提供制备疫苗的方法，包括采用本文所述修饰的H5蛋白或本文所述重组禽流感病毒。

如本文所示，基于表位工程化以开发广泛免疫原性的H5以呈现来自不同主要H5N1株的代表性表位。在小鼠模型中显示表达针对多个H5N1进化枝的表位-嵌合H5的单价疫苗应用，所述模型用系统发育变异的H5N1株攻击。

除非另有说明，本发明实践采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的传统技术，其在本领域技术范围内。参见例如Maniatis等,《分子克隆》(Molecular Cloning)(纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社)；Sambrook等,1989,《分子克隆》,第2版(纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社)；Sambrook和Russell,2001,《分子克隆》,第3版(纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社)；Green和Sambrook,2012,《分子克隆》,第4版(纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社)；Ausubel等,1992,《新编分子生物学实验指南》(约翰威利父子出版公司，包括定期更新)；Glover,1985,《DNA克隆》(牛津的IRL出版社)；Russell,1984,《植物分子生物学：实验室课程手册》(Molecular biology of plants:a laboratory course manual)(纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社)；Anand,《复杂基因组的分析技术》(Techniques for the Analysis ofComplex Genomes),(纽约的学术出版社(Academic Press),1992)；Guthrie和Fink,《酵母遗传学和分子生物学指南》(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)(纽约的学术出版社,1991)；Harlow和Lane,1988,《抗体》(Antibodies),(纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社)；《核酸杂交》(B.D.Hames&S.J.Higgins编.1984)；《转录和翻译》(B.D.Hames&S.J.Higgins编.1984)；《培养动物细胞》(R.I.Freshney,Alan R.Liss公司,1987)；《固定化细胞和酶》(IRL出版社,1986)；B.Perbal,《分子克隆实践指南》(1984)；专著《酶学方法》(Methods In Enzymology)(纽约的学术出版社)；《酶学方法》,卷154和155(Wu等编),《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology)(Mayer和Walker编,伦敦的学术出版社,1987)；《实验免疫学手册》(Handbook OfExperimental Immunology),卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,1986)；Riott,《基础免疫学》(Essential Immunology),第6版,牛津的布莱克威尔出版公司(BlackwellScientific Publications),1988；Fire等,《RNA干扰技术：从基础科学到药物开发》(RNAInterference Technology:From Basic Science to Drug Development),剑桥的剑桥大学出版社(Cambridge University Press),2005；Schepers,《RNA干扰实践》(RNAInterference in Practice),威利–VCH出版公司(Wiley–VCH),2005；Engelke,《RNA干扰(RNAi):siRNA技术的螺栓与螺母》(RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNATechnology),DNA出版社(DNA Press),2003；Gott,《RNA干扰、编辑和修饰：方法和操作(分子生物学方法)》(RNA Interference,Editing,and Modification:Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology)),新泽西州托托华的胡马纳出版社(HumanPress),2004；Sohail,《通过RNA干扰的基因沉默：技术和应用》(Gene Silencing by RNAInterference:Technology and Application),CRC,2004。

实施例

本发明通过参考以下实施例阐明，所述实施例以举例方式提供且不意在以任何方式限制本发明。采用本领域熟知的标准技术或以下具体描述的技术。

实施例1、材料和方法

道德声明：所有动物实验依据日本国立传染病研究所(NIID)动物实验指南完成。实验操作由新加坡的新加坡国立大学淡马锡生命科学研究院机构动物护理和使用委员会评估并批准。(IACUC批准号TLL-12-01)。

涉及人H5N1株的所有实验在生物安全3级(BSL-3)密闭度的实验室中进行，遵照CDC/NIH和WHO建议并由新加坡粮农与兽医局(AVA)批准。

病毒和细胞系：H5N1人流感病毒A/印尼/CDC669/2006获自印度尼西亚共和国卫生部(MOH)。来自不同系统发育进化枝或亚进化枝的H5N1病毒通过反向遗传学拯救。简言之，H5N1病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因在NCBI流感病毒数据库的序列基础上合成(金斯瑞(GenScript))，所述病毒来自进化枝1.0(A/越南/1203/2004)、进化枝2.2.1.1(A/埃及/3300-NAMRU3/2008)、进化枝2.2(A/斑头雁/青海/12/05)、2.3.2.1(A/秋田市/1/08)、2.3(A/安徽/1/05和A/江苏/2/07)、4(A/鹅/贵阳/337/06)、7.0(A/鸡/山西/2/06)和7.1(A/越南/NCVD-03/08)。合成的HA和NA基因克隆到双启动子质粒以用于甲型流感病毒反向遗传学(Prabakaran等,2009a)。双启动子质粒获自佐治亚州亚特兰大的美国疾病控制与预防中心。重配病毒如下拯救：将含HA和NA以及剩余6个流感病毒基因的质粒转染到共培养的293T和MDCK细胞，所述流感病毒基因获自高生长主要毒株A/波多黎各/8/34(H1N1)，使用脂质体2000(英杰公司(Invitrogen Corp.))。转染后72h，培养基接种到鸡胚或MDCK细胞中。来自第二传代的重配病毒的HA和NA基因进行测序以确认所引入HA和NA基因的存在以及没有突变。病毒储液在10天大鸡胚的尿囊腔中繁殖，收获含尿囊液的病毒并在80℃等分保存。病毒含量通过前述标准血凝试验测定(He等,2008)。

MDCK细胞维持于含10％胎牛血清(FBS；美国生命技术公司(Life Technologies))的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM；美国生命技术公司)。293T维持于含5％FBS的Opti-MEMI(美国生命技术公司)。48h后，收集转染的上清并通过标准血凝试验测定病毒效价。然后，通过Muench-Reed法(Reed和Muench,1938)计算重配病毒的组织培养物感染剂量50(TCID₅₀)。

mAb的生产和表征：使用不同H5中和性mAb组(panel)。mAb如前所述产生。简言之，BALB/c小鼠免疫2次(隔2周)，这是通过皮下注射个体BEI-灭活H5N1病毒(A/印尼/CDC669/2006、A/越南/1203/2004或A/安徽/1/05)进行的，所述病毒混合有Montanide ISA563佐剂(法国赛比克(Seppic))。小鼠在脾细胞与SP2/0细胞融合前3天接受额外静脉注射同一病毒抗原。杂交瘤细胞培养上清通过免疫荧光测定筛选。产生特异性mAb的杂交瘤通过有限稀释、扩增和进一步继代培养来克隆。使杂交瘤细胞培养上清澄清并如下所述测试血凝抑制活性。

血凝抑制试验：血凝抑制(HI)试验如前所述进行(Prabhu等,2009)。简言之，mAb或受体破坏酶(RDE)处理的血清在V形底96孔板中连续稀释(2倍)并混合4HA单位的H5病毒。平板室温孵育30分钟，向各孔加入1％鸡RBC。血凝抑制终点是其中未观察到血凝的最高抗体稀释。

微量中和试验：mAb或血清针对H5株的中和活性通过前述微量中和试验分析(He等,2013)。简言之，抗体样品连续2倍稀释并与100TCID50的不同H5株进化枝一起室温孵育1h，一式两份接种于96孔板中生长的MDCK细胞。中和效价评价为其中未通过光学显微镜观察到细胞病变效应的最高抗体稀释。

免疫和攻击：无特异性病原体的雌性BALB/c小鼠(6周龄)获自新加坡国立大学实验动物中心。每实验组10只小鼠，用100ul(HA效价，128)携带通用HA的灭活RG H5N1病毒或其它灭活H5N1病毒(A/印尼/CDC669/2006和A/越南/1203/2004)，与佐剂MontanideISA563(油包水乳剂；法国赛比克)一起皮下接种疫苗2次，定期间隔14天。有相同佐剂的PBS用作参照疫苗对照。在第28天从每实验组10只小鼠收集血清。测量血凝抑制活性和血清进化枝交叉中和抗体的水平。

最终疫苗接种后3周，小鼠转至动物BSL-3防范设施。每组8只小鼠用5个50％小鼠致死剂量(MLD50)的进化枝1.0(A/越南/1203/2004)、进化枝2.1(A/印尼/CDC669/2006)、进化枝2.3(A/安徽/1/05)和进化枝2.2.1.1(A/埃及/3300-NAMRU3/2008)HPAI H5N1病毒株鼻内攻击。定鼻内攻击实验所需的流感病毒的MLD50是预先确定的。每日观察小鼠以监测体重和死亡率。连续监测，直至动物死亡或直至攻击后14天。

病理组织学分析：解剖小鼠，肺保存在10％(wt/vol)中性缓冲福尔马林中，石蜡包埋，切片。切片用Hist-choice(Amersco)脱蜡，并在顺序渐进乙醇浴中再水合。载玻片用苏木精和伊红染色，通过光学显微镜(英国的奥林巴斯(Olympus))进行病理学评价。通过数字成像系统(美国的尼康(Nikon))捕捉图像。

统计分析：数据表示为算术平均值±标准偏差(SD)或标准误差(SE)。进行非配对双尾学生t检验以确定2组均值之间差异的显著性水平。单向方差分析(ANOVA)还用于检验组间差异，Tukey真实显著差异(HSD)事后检验用于确定哪些组显著与众不同。所有统计分析用SigmaStat 2.0(Jandel公司(Jandel Corporation))软件完成。显著性水平表示为0.05的P值。

实施例2、来自单一H5上不同进化枝的主要H5表位组合

分离自2006年人致死病例的A/印尼/CDC669/06是来自进化枝2的代表性株之一，进化枝2是H5系统发育树中最大的进化枝(Shore等,2013)。此研究中，CDC669的H5选作表位嵌合H5(EC H5)的骨架。等同于H1结构中的那些(Caton等,1982)的主要抗原位点的蛋白序列在来自不同进化枝的H5N1中比对(图1)。氨基酸位置155、156和189被示为H5上所有抗原区的一些最大变化位点。3个氨基酸突变成其它进化枝位置上的其它主要形式，其不同于野生型CDC669上初始的那些。3个突变单独表示为S155N、T156A和R189K。涉及表位的剩余氨基酸保持未变以维持进化枝2.1CDC669的抗原特性。因此，不同进化枝的代表性表位在单一H5上共同展示以引发进化枝交叉免疫。

实施例3、鉴定表位-嵌合H5

表位-嵌合H5在有PR8背景的RG H5N1病毒中表达。H5在受感染MDCK细胞中的表达用mAb 2D9测定，mAb 2D9是广泛识别H5的mAb(Prabakaran等,2009b)。血凝活性用EC H5在HA试验中检测。中和性mAb组如前在小鼠中产生，小鼠单独用进化枝1.0(A/越南/1203/2004)、进化枝2.1(A/印尼/CDC669/2006)或进化枝2.3(A/安徽/1/05)免疫。进行用这些mAb的HI试验以比较EC H5与野生型CDC669之间的抗原性。如表1所示，EC H5能通过所有测试的H5mAb来识别及中和，除了进化枝1特异性mAb即11G12(He和Kwang,2013)。CDC669无法与许多产生自其它H5N1的mAb相互作用。一些能中和CDC669的mAb在HI试验中显示针对EC H5的更高效价。观察表明EC H5从CDC669呈现不同抗原特性。表位中的突变允许EC H5易受用变异单抗中和的影响。

实施例4、血清中的交叉进化枝中和抗体效价

血凝抑制(HI)效价测量抑制HA功能的抗体应答的功效。如图2A所示，在第28天，来自RG-EC单价疫苗免疫小鼠的血清有效诱导针对不同进化枝异源病毒的HAI效价。相较于来自其它异源单价株的血清，用来自RG-EC组的血清观察到针对进化枝1、进化枝2、进化枝4和进化枝7的所有所测试的毒株的更高效价。RG-EC H5接种小鼠的样品针对进化枝1.0(A/越南/1203/2004)或进化枝2.1(A/印尼/CDC669/2006)的HI效价低于同源疫苗接种组。进行病毒中和以确定负责针对流感的保护性免疫的功能性抗体(图2B)。在HI和病毒中和试验中都观察到类似的比较结果，证实表位-嵌合H5显示提高的进化枝交叉免疫原性并表明EC H5相比其它单价株能引起更广泛的针对多个H5N1进化枝的保护。

实施例5、接种疫苗后的攻击研究

最终免疫后3周，所有小鼠组用5MLD50的HPAI H5N1病毒株鼻内攻击，所述病毒株来自进化枝1.0(A/越南/1203/2004)、进化枝2.1(A/印尼/CDC669/2006)、进化枝2.3(A/安徽/1/05)和进化枝2.2.1.1(A/埃及/3300-NAMRU3/2008)。用RG-EC H5免疫的小鼠组获得100％针对进化枝2.1、进化枝2.2和进化枝2.3病毒的保护(图3C、3E和3G)以及针对进化枝1.0的87.5％存活率(图3A)。然而，用其它单价H5N1疫苗免疫的小鼠仅分别显示针对任何异源攻击的50％-75％存活率。

不同组的多种体重下降趋势指示感染进程。在用RG-EC H5株免疫的小鼠组中，不同异源H5N1分别攻击后没有观察到小鼠体重的显著降低(≤13.3％)(图3B、3D、3F和3G)。然而，接种有其它单一H5N1株的小鼠针对任何异源攻击显示至少17％的体重减少，尽管体重在攻击后6天逐步恢复。RG-EC H5组在CDC669同源攻击后呈现与CDC669组(<1.9％)类似的体重减少，而在其它异源攻击后相较于CDC669疫苗接种显示防止体重减少方面有显著改进。

对接种有不同单价H5N1株并用进化枝2.3(A/安徽/1/05)或进化枝2.2.1.1(A/埃及/3300-NAMRU3/2008)HPAI H5N1病毒攻击的小鼠进行组织病理学研究。在感染后第5天，接种有进化枝1.0(A/越南/1203/2004)、进化枝2.1(A/印尼/CDC669/2006)或PBS的小鼠的肺在异源攻击后有肺损伤，由中度到重度坏死性支气管炎和带相关肺水肿的组织细胞性肺泡炎组成(图4)。RG-EC H5免疫小鼠在进化枝2.3(A/安徽/1/05)攻击后没有损伤且针对进化枝2.2.1.1(A/埃及/3300-NAMRU3/2008)H5N1病毒攻击仅有极少支气管炎。

此外，通过测量小鼠肺中的病毒效价，在病毒攻击后于H5接种小鼠内评估肺中的病毒负荷(图5)。在病毒攻击后第4天收集肺，此时在感染但未治疗小鼠中检测到大于10⁶的高病毒效价，所述小鼠在次日内死亡。RG-EC H5免疫小鼠在进化枝2.3(A/安徽/1/05)或进化枝2.2.1.1(A/埃及/3300-NAMRU3/2008)攻击后相较其它单价疫苗接种显示最低病毒负荷。进化枝1.0(A/越南/1203/2004)攻击后，RG-EC H5接种小鼠肺的病毒效价比进化枝2.1(A/印尼/CDC669/2006)免疫组低至少10倍，尽管接种同源株的组呈现甚至更低效价。

所有这些结果表明RG-EC H5免疫相较其它单价疫苗提供更有效保护抵御变异的异源攻击。

实施例6、讨论

流感A/H5N1病毒的新亚谱系快速进化被认为是下一次大流行最有可能的根源(Watanbe等,2011)。考虑到目前批准用于H5N1病毒的疫苗在其生产时间线和诱导进化枝交叉保护性免疫应答能力方面的限制，需要针对这些病毒的更新的流感预防疫苗方法(Prieto-Lara和Llanos-Mendez,2010)。此研究中呈现的表位-嵌合H5满足作为单价广谱疫苗的需求，其针对可变的循环性H5N1。开发的单一H5N1对多种针对不同H5N1进化枝的单抗和抗血清具有广泛反应性，在小鼠中引起有效的针对致死的H5N1攻击的进化枝交叉保护。

HA抗原性位点内的显著氨基酸变化导致出现抗原性不同的流感H5N1病毒(Plotkin等,2002)。各进化枝内的H5N1持续进化已产生多个第二、第三和第四级进化枝，这由其系统发育聚类和遗传距离定义，尤其是进化枝2(Shore等,2013；Sun等,2013；Younan等,2013)。目前，全球传播并导致人感染的大部分病毒在进化枝1和2中鉴定，如进化枝1.1、2.1.3.2、2.2.1和2.3.4(Forrest等,2009；Yang等,2009)。因此，来自这些进化枝的不同疫苗组合由不同研究组和管理机构选择以生产通用H5N1疫苗。近期，进化枝2.2.1A/埃及/N03072/2010、进化枝2.3.2.1A/湖北/1/2010和进化枝2.3.4A/安徽/1/2005由WHO根据其涉及人致命病例的历史选择为疫苗候选。在实验室的先前研究中，含进化枝1.0A/越南/1203/2004、进化枝2.1.3.2A/印尼/CDC669/2006和进化枝2.3.4A/安徽/1/2005的H5的疫苗制剂被证实有效抵御多个H5N1进化枝(Prabakaran等,2010)。鉴于所有这些推荐，为了产生能引起交叉保护抵御所有这些主要H5N1(引起人感染)的单价H5，优选来自进化枝2代表性循环株的H5。许多H5mAb在实验室中用不同抗原产生。应注意从CDC669产生的针对所有H5N1进化枝的广谱H5mAb多于任何其它H5N1株(HJe等,2010；Ho等,2009；Prabakaran等,2009a；Prabakaran等,2009b)，表明CDC 669的交叉进化枝免疫原性。总之所述研究中，进化枝2.1.3.2的A/印尼/CDC669/2006被选为单价通用H5的骨架。如结果所示，表位中进一步突变后，来自CDC669的EC H5获得对那些先前无反应mAb的反应性并维持对CDC669mAb的初始反应性。此发现为该单一EC H5应用于潜在通用H5N1疫苗创造条件。

在抗原位点的所有氨基酸变化中，在Sa(155,156aa)、Sb(189aa)和Ca(138-141)位点发现3个明显变化(Kaverin等,2002)。Sa和Sb中的3个氨基酸突变成其它主要形式以产生表位-嵌合H5。Ca中的可变区保持与野生型CDC669相同，有助于进化枝2.1的抗原特性。作为受体结合位点的一部分，130环的氨基酸在不同进化枝中高度可变(Hensley等,2009；Stevens等,2006)。例如，在第140个氨基酸上鉴定了超过7个氨基酸选择。与相邻位点的其它变化一起，130环的可能氨基酸组合数极高。可能需要筛选以确定通用H5疫苗的最合适形式。因此，此研究中的该区域未变。在未来的工作中，突变能引入此位点以提高和扩增EC H5疫苗的免疫原性谱。

EC-H5无法与进化枝1特异性单抗mAb 11G12反应(He和Kwang,2013)，指示对进化枝1的免疫原性相对较弱。通过第189个氨基酸上突变成进化枝1.0的同一形式，87.5％的RG-EC H5免疫小鼠在进化枝1.0的VN1203攻击后存活。尽管未实现100％保护，RG-EC H5的表现比野生型CDC669好很多，后者针对VN1203的存活率为50％。这能进一步通过诱导Sa区的其它突变来改善，如由mAb 11G12靶向的表位152aa。有靶向不同表位的多个单抗的试验能用作动物试验前预测H5抗原性的快速方法并且也提供改善线索。

表位的抗原性差异使得现有疫苗难以胜任全球流感预防(Fouchier和Smith,2010)。采用多价疫苗会显著增加疫苗成本并延迟针对突然流感爆发的疫苗开发进展。就流感H5N1而言简单和广泛防护性疫苗的可用性是防范未来流感大流行的高优先级问题。研究不仅提供广谱的单价疫苗候选，而且还有助于新流感疫苗开发方法。不再使用来自大爆发或严重病例的毒株，在单一HA上产生表位嵌合H5的表位改造可避免病毒株适应和多种抗原共表达中的困难。针对全球H5N1的广谱单价H5疫苗大幅降低疫苗开发和生产的成本。单一HA的新表位组合能容易设计并测试以预防新出现H5N1所介导的感染。

在描述本发明的上下文(尤其是以下权利要求的上下文)中使用术语“a”和“an”和“the”以及类似指代被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”作为开放式术语解释(即意味着“包括但不限于”)，除非另有说明。列举本文值的范围仅意在用作单独指所述范围内各单独值的快捷方法，除非本文另有说明，且各单独值纳入本说明书，就好像本文单独引用的那样。例如，如果公开了范围10-15，则也公开11、12、13和14。本文所述全部方法以任何合适顺序进行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。使用本文提供的任何和所有实施例或示范性语言(例如“如”)仅意在更好阐明本发明且不对发明范围构成限制，除非另外要求权利。本说明书的语言不应被解释为指示任何非要求权利的元素对本发明实施关键。

应理解本发明的方法和组合物能纳入多种实施方式形式，其中仅一些在本文中公开。本文描述本发明的实施方式，包括发明者已知完成本发明的最佳模式。本领域普通技术人员阅读前面描述后可清楚了解这些实施方式的变化。发明者预期技术人员会酌情采用这类变化，且发明者希望本发明通过本文特定所述以外的方式实施。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括所附权利要求中引用主题的所有修改和等价物。此外，本发明涵盖其上述元素在其所有可能变化中的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。

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Claims

1.一种分离的修饰的H5蛋白，其选自具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的修饰的H5蛋白和具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的修饰的H5蛋白。

2.如权利要求1所述的分离的修饰的H5蛋白，其是具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的修饰的H5蛋白。

3.如权利要求1所述的分离的修饰的H5蛋白，其是具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的修饰的H5蛋白。

4.一种编码权利要求1所述的修饰的H5蛋白的核酸分子。

5.如权利要求4所述的核酸分子，具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

6.如权利要求4所述的核酸分子，具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

7.一种包含权利要求4-6中任一项所述的核酸分子的载体。

8.一种包含权利要求7所述的载体的宿主细胞。

9.一种包含权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白的重组禽流感病毒。

10.如权利要求9所述的重组禽流感病毒，包含编码所述修饰的H5蛋白的核酸分子。

11.如权利要求10所述的重组禽流感病毒，具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。

12.如权利要求10所述的重组禽流感病毒，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列。

13.一种包含权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白的组合物。

14.一种包含权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒的组合物。

15.如权利要求13或14所述的组合物，其还包含药学上可接受运载体。

16.如权利要求13-15中任一项所述的组合物，其还包含佐剂。

17.如权利要求13-16中任一项所述的组合物，其是疫苗。

18.一种在对象中引起针对禽流感病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的权利要求13-17中任一项所述的组合物。

19.一种治疗或预防禽流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用权利要求13-17中任一项所述的组合物。

20.一种治疗或预防禽流感病毒感染的方法，所述方法包括给需要这种治疗的对象施用治疗有效量的权利要求13-17中任一项所述的组合物。

21.一种预防对象患上禽流感相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用预防、治疗或免疫有效量的权利要求13-17中任一项所述的组合物。

22.一种在禽流感感染对象中延迟禽流感相关疾病发作或减缓所述疾病的速度的方法，所述方法包括给对象施用预防、治疗或免疫有效量的权利要求13-17中任一项所述的组合物。

23.一种疫苗，包含(i)一种或多种选自如下一组的免疫原性剂：(a)如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，(b)如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，(c)如权利要求7所述的载体，(d)如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒和(e)其组合，以及(ii)药学上可接受运载体和/或赋形剂。

24.如权利要求23所述的疫苗，其中所述赋形剂是一种或多种佐剂。

25.一种在对象中引起针对禽流感病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的权利要求22或23所述的疫苗。

26.一种治疗或预防禽流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用权利要求23或24所述的疫苗。

27.一种治疗或预防禽流感病毒感染的方法，所述方法包括给需要这种治疗的对象施用治疗有效量的权利要求23或24所述的组合物。

28.一种预防对象患上禽流感相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用预防、治疗或免疫有效量的权利要求23或24所述的疫苗。

29.一种在禽流感感染对象中延迟禽流感相关疾病发作或减缓所述疾病的速度的方法，所述方法包括给对象施用预防、治疗或免疫有效量的权利要求23或24所述的疫苗。

30.如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，如权利要求7所述的载体，如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒，如权利要求13-17中任一项所述的组合物或如权利要求23或24所述的疫苗，用于在对象中引起保护性免疫应答。

31.如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，如权利要求7所述的载体，如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒，如权利要求13-17中任一项所述的组合物或如权利要求23或24所述的疫苗，用于防止对象患上禽流感相关疾病。

32.如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，如权利要求7所述的载体，如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒，如权利要求13-17中任一项所述的组合物或如权利要求23或24所述的疫苗，用于在禽流感感染对象中延迟禽流感相关疾病发作或减缓所述疾病的速度。

33.如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，如权利要求7所述的载体，如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒，如权利要求13-17中任一项所述的组合物或如权利要求23或24所述的疫苗用于制备引起对象中的保护性免疫应答的药物的应用。

34.如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，如权利要求7所述的载体，如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒，如权利要求13-17中任一项所述的组合物或如权利要求23或24所述的疫苗用于制备治疗或预防对象中的禽流感病毒相关疾病的药物的应用。

35.如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，如权利要求7所述的载体，如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒，如权利要求13-17中任一项所述的组合物或如权利要求23或24所述的疫苗用于制备延迟禽流感感染对象中的禽流感相关疾病发作或减缓所述疾病的速度的药物的应用。

36.一种用于针对禽流感免疫对象的试剂盒，包含(i)一种或多种选自如下一组的免疫原性剂：(a)如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，(b)如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，(c)如权利要求7所述的载体，(d)如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒，(e)如权利要求23或24所述的疫苗和(f)其组合，以及(ii)其应用的说明材料。

37.如权利要求36所述的试剂盒，还包含施用器。

38.一种制备疫苗的方法，所述方法使用一种或多种选自如下一组的免疫原性剂：(a)如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，(b)如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，(c)如权利要求7所述的载体，(d)如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒和(e)其组合。

39.一种或多种免疫原性剂用于疫苗开发的应用，所述免疫原性剂选自(a)如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，(b)如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，(c)如权利要求7所述的载体，(d)如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒和(e)其组合。

40.选自(a)如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，(b)如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，(c)如权利要求7所述的载体，(d)如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒和(e)其组合的一种或多种免疫原性剂，用于疫苗开发。

41.一种或多种免疫原性剂的应用，所述免疫原性剂选自(a)如权利要求1-3中任一项所述的修饰的H5蛋白，(b)如权利要求4-6中任一项所述的核酸分子，(c)如权利要求7所述的载体，(d)如权利要求9-12中任一项所述的重组禽流感病毒和(e)其组合。