CN102869379A

CN102869379A - H5n1谱系的通用疫苗

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Publication number: CN102869379A
Application number: CN2011800217662A
Authority: CN
Inventors: P·木根; F·和; H-S·J·光
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2011-02-09
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2031-02-09
Also published as: EP2563389B1; US9555093B2; EP2563389A1; US20130052223A1; JP5815676B2; JP2013525428A; EP2563389A4; SG184804A1; CN102869379B; WO2011136738A1

Abstract

本发明涉及通用H5N1疫苗。本发明更特别涉及三种H5N1毒株的鉴别，它们覆盖大多数H5N1谱系中血凝素的中和表位中的全部变体。本发明进一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三种H5N1毒株或者这三种毒株每一毒株的血凝素肽。

Description

H5N1谱系的通用疫苗

相关申请的交叉参考

本申请涉及并要求2010年4月30日申请的美国临时申请系列号61/329,802的优先权，其援引加入本文。

序列提交

本申请与电子形式序列表一起提交。序列表名称为2577-201PCT_ST25.txt，创建于2011年1月13日，大小为54kb。电子形式序列表的信息是本申请一部分并且以其全文援引加入本文。

发明背景

本发明涉及通用H5N1疫苗。本发明更特别涉及三种H5N1毒株的鉴别，其覆盖大多数H5N1谱系中血凝素的中和表位中的全部变体。本发明进一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三种H5N1毒株或者包含这三种毒株每一毒株的血凝素肽。

本文中用于例证本发明背景或者提供关于实施的其它详细描述的出版物及其它材料均援引加入本文，为方便起见在“参考文献”中分别列出。

流感病毒通过随机改变抗原决定簇如存在于血凝素球形头部区域中的主要中和表位而逃避免疫系统。在感染时，宿主应答的主要特征在于诱导针对这种中和表位的抗体，其阻断病毒血凝素对于靶细胞受体的附着。然而，这些HA的中和表位内相当多的氨基酸变化导致抗原性独特的流感H5N1病毒的出现。事实上，已报道季节性流感病毒在人群中通过抗原性漂移能有效逃避疫苗诱导的免疫性。此外，HA1可变区中几个关键氨基酸的突变足以使得病毒逃避疫苗诱导的抗体应答。先前鉴别逃避单克隆抗体的中和作用的变体的HA序列内的氨基酸取代的尝试揭示了HA的中和表位位点(Kaverin et al.,2002；Kaverin et al.,2007)。

流感病毒随机突变及进化为具有多样抗原性决定簇的新类型的性质在流感感染控制中是重要的挑战(Plotkin et al.,2002)。通过近年来H5N1禽流感的爆发及目前H1N1猪源性甲型流感病毒(S-OIV)的大流行局面已经清楚地认识到这点。事实上，在文献中已经充分记录了H5N1已经获得感染人体组织的能力，这主要由于突变事件发生所致(Ayora-Talavera et al.,2009)。高致病性禽流感(HPAI)H5N1由于血凝素(HA)序列中的差异而是抗原性可区别的，由此产生H5N1的不同谱系或进化枝，HA是流感免疫性的主要决定簇(Lam et al.,2008；WHO,2005)。使用目前的H5N1疫苗控制感染看起来对于异源毒株或H5N1的系统发生变体进化枝不是有效的，这部分是由于HA序列、特别是中和表位区域中的变化所致。由于现有疫苗仅基于诱导针对这些表位的中和抗体，因此这些序列中的差异可导致目前的疫苗不能胜任预防全球性流感。事实上，目前的H5N1疫苗候选物持续提供对于相应进化枝内大多数分离株的良好的抗原性覆盖，近年来认识到进化枝1、2.2及2.3自身内一些病毒示出抗原性异质性的迹象。

为克服这种限制及完全了解世界范围的疫苗潜力，近年来提出了基于保守病毒蛋白质的通用疫苗的观念。已经对流感病毒的高度保守的离子通道蛋白(M2)或者核蛋白(NP)诱导交叉保护性细胞免疫性和病毒清除进行了评估(Wu et al.,2007；Chen and Subbarao,2009)。一种类似的使用血凝素的保守的融合肽的方法是抑制病毒与宿主细胞膜融合的另一选项(Gerhard etal.,2006)。针对这些保守蛋白产生的抗体可以降低病毒传播及促进从流感中康复。然而，特异于这些蛋白质的抗体的免疫原性不佳且发现是感染容许的（infection permissive）。因此，基于流感病毒血凝素的疫苗的开发看起来是预防HPAI如H5N1感染的唯一可行选项。然而，H5亚型中主要抗原性中和表位区域内的氨基酸改变限制了针对不同H5N1谱系的这种通用疫苗的开发。

因此，需要开发一种通用疫苗，其提供对于不同H5N1谱系的一定程度的保护性免疫性。

发明概述

本发明涉及通用H5N1疫苗。本发明更特别涉及三种H5N1毒株的鉴别，其覆盖大多数H5N1谱系中血凝素中和表位中的全部变体。本发明进一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三种H5N1毒株或者包含这三种中每一毒株的血凝素肽。

因此，第一方面，本发明提供了预防对象疾病的通用H5N1疫苗，其中所述疾病与禽流感病毒的H5N1亚型相关。在一个实施方案中，所述通用H5N1疫苗包含预防有效量的第一免疫原性物质，预防有效量的第二免疫原性物质以及预防有效量的第三免疫原性物质。在另一实施方案中，每种免疫原性物质均包含血凝素或其抗原性部分或者编码所述血凝素或其抗原性部分的核酸。在另一实施方案中，所述抗原性部分包括血凝素的表位。在进一步的实施方案中，所述对象可以是人、家畜(狗、猫、猴等)、牲畜(马、牛、绵羊、山羊、猪等)、野禽(野鹅、野鸭等)以及家禽(鸡、鸭、鹅等)。在一个实施方案中，免疫原性物质是包含血凝素的病毒。在另一实施方案中，所述病毒是失活的。在另一实施方案中，所述病毒是减毒的病毒。在另一实施方案中，所述病毒是病毒体形式。在进一步的实施方案中，所述病毒衍生自卵或者衍生自细胞培养物。在另一实施方案中，所述免疫原性物质是包含血凝素的裂解病毒或者裂解病毒抗原性制备物。在一个实施方案中，所述免疫原性物质是血凝素或其抗原性部分。在另一实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分已经被分离。在另一实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分是通过表达系统产生的。在一个实施方案中，所述表达系统是任何表达系统，如病毒表达载体，其中血凝素或其抗原性部分呈递或展示在所述病毒表面。在一个实施方案中，所述病毒表达载体是任何病毒表达载体，如修饰的痘苗病毒表达载体，腺病毒表达载体，痘病毒表达载体，杆状病毒表达载体等。在一个实施方案中，所述表达载体是杆状病毒表达载体，呈递或展示血凝素或其抗原性部分的病毒是杆状病毒。在另一实施方案中，所述免疫原性物质是编码血凝素或其抗原性部分的核酸，其能在对象中表达。

第二方面，本发明提供了一种对禽流感病毒产生保护性免疫性的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。

第三方面，本发明提供了一种预防或治疗与禽流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。

第四方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在刺激对于禽流感病毒的免疫应答中的应用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。

第五方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在预防与禽流感病毒相关疾病中的应用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。

第六方面，本发明提供了通用H5N1疫苗，其用于医药中。

第七方面，本发明提供了通用H5N1疫苗，其用于调节对象体内的免疫应答。

第八方面，本发明提供了通用H5N1疫苗，其用于治疗或预防对象中与禽流感病毒相关的疾病。

第九方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在生产调节对象体内免疫应答的药物中的应用。

第十方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在生产治疗或预防对象中与禽流感病毒相关的疾病的药物中的应用。

附图简述

图1示出血清血细胞凝集抑制效价。将小鼠组在第0天和第28天用BacHA(BacHA-VN)的Tri-BacHA(BacHA-mix)或Mono-BacHA(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))或者失活的全病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。每个点表示算术平均值(n＝10)±SD。

图2A和2B示出小鼠中交叉进化枝血清微量中和实验。将小鼠组在第0天和第28天用BacHA(Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA(Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在这项研究中使用来自进化枝1.0(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))、进化枝2.1(A/Indonesia/CDC1031/2007(H5N1))、进化枝2.2 A/turkey/Turkey1/05*(H5N1)、进化枝4.0(clade 4.0 A/goose/Guiyang/337/06(H5N1))、进化枝7.0(A/chicken/Shanxi/2/06(H5N1))及进化枝8.0(A/chicken/Henan/12/04(H5N1))的病毒。进化枝1、2.1和2.2在图2A中示出，进化枝4、7和8在图2B中示出。来自峰值应答当天的血清及在最终免疫后14天的血清用于该测定。每个点表示算术平均值(n＝10)±SE。

图3示出小鼠免于致死性H5N1病毒攻击的保护作用。将小鼠组在第0天和第28天用BacHA(Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA(Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在最终免疫接种后三周，将小鼠用5MLD50(50%小鼠致死剂量)的进化枝1.0(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))HPAI H5N1毒株经鼻内感染。在14天观测期间监测小鼠存活情况。结果以存活率百分比表示。

图4示出小鼠免于致死性H5N1病毒攻击的保护作用。将小鼠组在第0天和第28天用BacHA(Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA(Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在最终免疫接种后三周，将小鼠用5MLD50(50%小鼠致死剂量)的进化枝2.1(A/Indonesia/TLL013/2006(H5N1))HPAIH5N1毒株经鼻内感染。在14天观测期间监测小鼠存活情况。结果以存活率百分比表示。

图5示出小鼠免于致死性H5N1病毒攻击的保护作用。将小鼠组在第0天和第28天用BacHA(Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA(Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))或者失活的全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在最终免疫接种后三周，将小鼠用5MLD50(50%小鼠致死剂量)的进化枝7.0(A/chicken/Shanxi/2/06(H5N1))HPAIH5N1毒株经鼻内感染。在14天观测期间监测小鼠体重减轻情况。结果以体重百分比表示(在实验开始时)。

图6示出小鼠免于致死性H5N1病毒攻击的保护作用。将小鼠组在第0天和第28天用BacHA(Tri-BacHA)的三种毒株或者BacHA(Mono-BacHA)的单一毒株(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))或者失活的完全H5N1病毒疫苗(WT-H5N1)在皮下免疫两次。在最终免疫接种后三周，将小鼠用5MLD50(50%小鼠致死剂量)的进化枝7.0(A/chicken/Shanxi/2/06(H5N1))HPAIH5N1毒株经鼻内感染。在14天观测期间监测小鼠存活情况。结果以存活率百分比表示。

发明详述

本发明涉及通用H5N1疫苗。本发明更特别涉及三种H5N1毒株的鉴别，其覆盖大多数H5N1谱系中血凝素中和表位的全部变体。本发明进一步涉及通用H5N1疫苗，其包含所述三种H5N1毒株或者其包含这三株中每一株的血凝素肽。

除非特别定义，本文使用的所有技术和学术术语均具有与本发明所属领域技术人员通常了解的相同含义。除非特别指出，本文中提及的所有专利、专利申请、公布的申请及出版物、Genbank序列、网站及及其它公开的材料均以其全部内容援引加入本文作参考。

虽然目前H5N1疫苗候选物继续提供对于相应进化枝内大多数分离株的良好的抗原性覆盖，但是近年来已经认识到进化枝1、2.2及2.3自身内的一些病毒示出抗原性异质性的迹象。由于H5N1病毒已经分为许多亚系或进化枝，因此本发明提供了代表H5亚型特别是在中和表位区域中的变化的疫苗毒株的分析和选择。根据本发明的这种疫苗毒株选择提供了对于大多数H5N1谱系的广泛保护作用。

如本文所示，如果可以鉴别一些HPAI H5N1进化枝中中和表位的变化或保守性，则完全基于流感病毒HA的通用疫苗的开发是可行的。了解这种中和表位的分布模式有助于通过在疫苗组合物中掺入两或更多个理想的H5N1毒株而设计通用疫苗。选择的病毒毒株的中和表位覆盖大多数H5亚型中的变化，以获得针对大多数H5N1亚型的广泛的保护性免疫性。先前鉴别逃避单克隆抗体中和作用的变体的HA序列内的氨基酸取代的尝试揭示了HA的中和表位位点(Kaverin et al.,2002；Kaverin et al.,2007)。结合先前的发现，本发明提供了通过使用中和性单克隆抗体对其氨基酸序列作图鉴别H5N1的其它主要中和表位。对H5亚型中所有鉴别的中和表位的分布进行的分析表明来自人和禽来源的H5N1亚型的抗原性决定簇中的变化。基于这些结果，本发明提供了三种疫苗毒株，其包含HA的主要中和表位以覆盖H5N1谱系内全部变体。为了检测证实在体内的广泛保护作用，将选择的疫苗毒株的HA蛋白在杆状病毒表面上表达并在用系统发生变体H5N1毒株攻击的小鼠模型中评估疫苗配制物的效力。

根据本发明，所述通用疫苗开发策略包括三个步骤：(i)使用中和性单克隆抗体(n-mAb)对H5N1病毒血凝素的中和表位作图；(ii)分析所有H5N1谱系中中和表位的分布；及(iii)选择理想的疫苗毒株以覆盖全部H5N1病毒的中和表位内的变化。根据本发明，使用一组5个n-mAb(6B8、4C2、2D9、4F8和3H11)作图H5N1病毒的中和表位。使用n-mAb对中和表位作图表明在第138或155或189或223位置的氨基酸参与H5N1病毒血凝素的主要中和表位的形成。此外，作为主要中和表位的一部分而被鉴别的其它氨基酸(140，159，194和218)(Kaverin et al.,2007)也被考虑用于随后的分析。如本文所示，将H5N1病毒的主要中和表位序列与流感病毒研究数据库对比揭示了所有人和禽H5N1病毒血凝素的表位区域内的变化。见下表2。

基于本文描述的表位分布分析，选择三种不同毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)(进化枝2.1)、A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)(进化枝1.0)和Anhui/1/2005(H5N1)(进化枝2.3)共同代表所有H5N1亚型中的变化。通过病毒中和作用和HI效价证实选择的疫苗毒株与不同中和性mAb的反应性模式。如下表4A和4B所示，n-mAb 4C2和4F8仅识别A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)毒株，与A/Vietnam/1203/2004(H5N1)和A/Anhui/1/2005(H5N1)毒株不反应。这种反应性模式可能是由于在第189位置的氨基酸改变所致，因为A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)毒株在第189位具有“Arg”，而在A/Vietnam/1203/2004(H5N1)和A/Anhui/1/2005(H5N1)毒株的相同位置是“Lys”。另一方面，n-mAb 6B8与A/Vietnam/1203/2004(H5N1)和A/Anhui/1/2005(H5N1)毒株均反应，可能是由于在第189位存在共同残基“Lys”所致。相似地，也已经发现在第155位的氨基酸对于H5N1毒株的抗体识别具有显著影响。此外，如下表2所示，150的环有两个变体，63.4%的人H5N1分离株具有氨基酸“Ser”，而剩余34.4%在这个位置具有氨基酸“Asn”。同样，位于HA的受体结合位点内的第189位的氨基酸，在64.26%的所有人H5N1毒株中含有氨基酸“Arg”，剩余的34.65%在此位置具有氨基酸“Lys”。因此，合理推测根据本发明选择的疫苗毒株应代表几乎99%的所有H5N1谱系包括人和禽病毒的主要抗原性表位内的变化。

将选择的毒株的HA蛋白分别在杆状病毒表面上表达，并在小鼠模型中评估疫苗配制物。构建具有WSSV的立即早期启动子1(ie1)的重组杆状病毒以促进流感病毒H5血凝素在昆虫和哺乳动物细胞中的高水平表达。ie1作为立即早期启动子的性质支持在杆状病毒生命周期的早期阶段的蛋白质表达，导致杆状病毒包膜上的功能性血凝素展示增强。由于寡聚化是HA蛋白质有效转运至宿主细胞膜所必需的(Copeland et al.,1986)，这是杆状病毒获得该蛋白质的先决条件，因此推定在杆状病毒表面上展示的HA应以其寡聚形式呈递。因此，这个模型将帮助模拟蛋白质的天然结构，因此模拟野生型流感病毒。通过血凝活性及HA0真正裂解为HA1和HA2证实，在杆状病毒表面上展示的HA保持其天然结构(数据未示出)。虽然表达流感病毒血凝素(HA)的杆状病毒在昆虫细胞中通常不裂解，但是在裂解位点具有多个碱性氨基酸的高致病性禽流感病毒(如H5和H7)的HA已经示出在不存在胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶条件下被裂解为HA1和HA2亚基(Kuroda et al.,1986)。目前的研究中HA0的部分裂解可能是由于昆虫细胞中枯草杆菌蛋白酶样前蛋白(proprotein)转变酶(PC)的存在所致(Cieplik et al.,1998)，其底物特异性和抑制剂谱与哺乳动物PC相同。

如本文所示，用展示A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)、A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)或A/Anhui/1/2005(H5N1)的HA的每种杆状病毒的佐剂化（adjuvanted）混合物(Tri-BacHA)进行皮下免疫接种，当与其未佐剂化对应物相比时显著增强血清HI效价。此外，用佐剂化Tri-BacHA接种的小鼠的HI效价与用佐剂化完全RG-H5N1病毒或展示H5N1-A/VietNam/1203/2004(H5N1)的HA的佐剂化杆状病毒(Mono-BacHA)接种的那些小鼠(针对A/Vietnam/1203/2004(H5N1))的相当。此外，佐剂化Tri-BacHA诱导较高的中和抗体效价，与未佐剂化Tri-BacHA相比，其有效地中和来自各个进化枝(进化枝1.0，进化枝2.1，进化枝2.2，进化枝4.0，进化枝7.0及进化枝8.0)的100 TCID50的异源H5N1毒株。仅含有佐剂化Mono-BacHA或失活的RG-H5N1疫苗的疫苗配制物能中和进化枝1(同源)、进化枝2.1和进化枝8.0，但是不有效中和来自其它进化枝(进化枝2.2、进化枝4.0和进化枝7.0)的H5N1病毒。佐剂化Tri-BacHA疫苗配制物的强交叉-进化枝免疫性可能是由于覆盖H5N1谱系的中和表位内的变化所致。

疫苗的保护性效力通过用来自进化枝1、进化枝2.1和进化枝7的H5N1毒株攻击接种的小鼠进行评估。如本文所示，在用针对进化枝1.0和进化枝2.1的佐剂化Tri-BacHA或Mono-BacHA或者失活的全病毒疫苗接种的组中获得100%存活率。此外，佐剂化Tri-BacHA提供针对进化枝7.0 H5N1病毒100%的保护作用，无任何感染症状。然而，佐剂化失活的全病毒疫苗和Mono-BacHA针对进化枝7.0 H5N1感染仅分别提供66.6%和83.3%的保护作用。同样，在不同组中感染的进展通过体重降低的不同倾向表示。用佐剂化Mono-BacHA或者佐剂化全病毒疫苗接种的小鼠针对进化枝7.0示出在第6天直至17%的较高的体重降低。这表明一价疫苗不能赋予针对不同H5N1亚型的保护作用，这也许是由于不同病毒亚型的抗原性决定簇(如中和表位)内的变化所致。

总的来说，用展示来自三种选择的疫苗毒株的血凝素的杆状病毒对小鼠进行皮下免疫诱导了系统性免疫应答，并呈现出针对无任何临床症状的H5N1病毒感染的交叉保护作用。同样，揭示了基于亚型中中和表位内的变化选择疫苗毒株的发现将有助于预防由新出现的H5N1突变体介导的感染。用于这项研究的疫苗配制物不用顾虑任何生物安全性而快速生产。展示HA的杆状病毒在大流行和大流行前情形是作为疫苗的理想选择，并加速完成疫苗技术而不需要高生物防护设备或冗长的蛋白质纯化过程。

如本文所用，术语“治疗”是指以任何方式治愈病症或症状、预防病症或疾病建立或者以其他方式预防、阻碍、延迟、改善或逆转病症或疾病或其它不希望的症状进展的任何及所有应用。

如本文所用，术语“有效量”或者“预防有效量”是指一种物质或化合物提供所希望的作用所需的无毒性但足够的量。例如，调节免疫应答的预防有效量是所述物质或化合物在对象体内提供希望的调节免疫应答作用的量。相似地，治疗或预防与禽流感病毒相关疾病的预防有效量是所述物质或化合物在所述对象体内提供希望的治疗或预防所述疾病作用的量。所需的精确量根据对象如治疗物种、对象年龄和健康状况、治疗病症的严重性、施用的特定药物以及施用模式等因素而不同。因此，不可能指定精确的“有效量”。然而，对于任何指定情况，合适的“有效量”可以由本领域技术人员仅使用常规实验确定。

如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其片段、变体、类似物、直系同源物或者同系物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是合成的非天然发生的氨基酸，如相应天然发生的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然发生的氨基酸聚合物。

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”可互换使用，是指包含一或多个核苷酸的分子，或者寡核苷酸，或者其片段，包括但不限于RNA或DNA核苷酸或者其组合。

如本文所用，短语“与H5N1亚型禽流感病毒相关疾病”是指由H5N1亚型禽流感病毒导致的或者与其相关的任何疾病、疾病状态或失调。

如本文所用，术语“调节”当用于与免疫应答相关时是指直接或间接增加或降低针对抗原的免疫应答。疫苗典型增加对于抗原的免疫应答。

因此，第一方面，本发明提供了治疗或预防对象疾病的通用H5N1疫苗，其中所述疾病与禽流感病毒H5N1亚型相关。在一个实施方案中，所述通用H5N1疫苗包含预防有效量的第一免疫原性物质，预防有效量的第二免疫原性物质及预防有效量的第三免疫原性物质。在另一实施方案中，所述对象可以是人、家畜(狗、猫、猴等)、牲畜(马、牛、绵羊、山羊、猪等)、野禽(野鹅、野鸭等)以及家禽(鸡、鸭、鹅等)。

在一个实施方案中，每种免疫原性物质均包含血凝素或其抗原性部分或编码血凝素或其抗原性部分的核酸。如本文所用，血凝素的抗原性部分是指包括中和表位的血凝素的一部分。在另一实施方案中，所述抗原性部分包括血凝素的表位。在进一步的实施方案中，免疫原性物质是包含血凝素的病毒。在另一实施方案中，所述病毒是失活的。在另一实施方案中，所述病毒是减毒的病毒。在另一实施方案中，所述病毒是病毒体形式。在进一步的实施方案中，所述病毒衍生自卵或衍生自细胞培养物。在另一实施方案中，免疫原性物质是包含血凝素的裂解病毒或裂解病毒抗原性制备物。在一个实施方案中，所述免疫原性物质是血凝素或其抗原性部分。在另一实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分已经被分离。在另一实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分是通过病毒表达载体产生的，由此其被呈递或展示在该病毒表面上。在一个实施方案中，所述病毒表达载体是杆状病毒表达载体，呈递或展示血凝素或其抗原性部分的病毒是杆状病毒。在另一实施方案中，所述病毒表达载体如修饰的痘苗病毒表达载体、腺病毒表达载体、痘病毒表达载体等。在一个实施方案中，所述免疫原性物质是能在对象体内表达的编码血凝素或其抗原性部分的核酸。

在一个实施方案中，所述免疫原性物质可以是相同类别，例如其可以均是失活的呈递或展示血凝素或其抗原性部分的病毒或杆状病毒。在另一实施方案中，所述免疫原性物质可以是不同类别，例如第一免疫原性物质可以是失活的病毒，第二免疫原性物质可以是呈递或展示血凝素或其抗原性部分的杆状病毒，第三免疫原性物质可以与这两类之一相同或者是不同类别。

根据本发明，制备通用H5N1疫苗，其中第一免疫原性物质包含病毒毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)的血凝素或其抗原性肽，第二免疫原性物质包含病毒毒株A/Vietnam1203/2004(H5N1)的血凝素或其抗原性肽及第三免疫原性物质包含病毒毒株A/Anhui/1/2005(H5N1)的血凝素或其抗原性肽。如本文所述，每种免疫原性物质可以是病毒、蛋白质、肽、核酸等，其包含或编码指定病毒的血凝素或其抗原性肽。

所述免疫原性物质可以配制成中性或盐形式组合物。药物可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基基团形成)，其是与无机酸如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，及衍生自有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

通常，可以根据本领域技术人员已知的方法制备合适的组合物，所述组合物可包括药物可接受的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。所述稀释剂、佐剂和赋形剂必须是“可接受的”，与组合物的其它成分是相容的，且对其受体无害。

药物可接受的稀释剂的实例是去矿物质水或蒸馏水；盐水溶液；植物油如花生油(peanut-oil)，红花油，橄榄油，棉籽油，玉米油，芝麻油如花生油，红花油，橄榄油，棉籽油，玉米油，芝麻油，花生油(arachis oil)或椰子油；硅酮油，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷，苯基聚硅氧烷及methylphenyl polysolpoxane；挥发性硅酮；矿物油如液体石蜡，软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物如甲基纤维素，乙基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇，丙二醇，1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯如异丙基棕榈酸酯，异丙基肉豆蔻酸酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜聚糖；西黄芪胶或阿拉伯树胶，以及凡士林油。典型地，所述一或多种载体形成所述组合物重量的1%-99.9%。最优选地，所述稀释剂是盐水。

对于作为注射溶液或悬浮液施用，无毒性胃肠外可接受的稀释剂或载体可包括Ringer溶液，中链甘油三酯(MCT)，等渗盐水，磷酸盐缓冲盐水，乙醇及1,2-丙二醇。口服应用的合适载体、稀释剂、赋形剂及佐剂的一些实例包括花生油，液体石蜡，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，海藻酸钠，阿拉伯树胶，西黄芪胶，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，明胶和卵磷脂。除了这些之外，口服配制物可含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，所述胶囊可以用化合物如延迟崩解的单硬脂酸甘油酯或者二硬脂酸甘油酯包覆。

佐剂典型包括润滑剂，乳化剂，增稠剂，防腐剂，杀菌剂和缓冲剂。可用于制备所述组合物的佐剂或免疫刺激性成分包括但不限于铝盐，矿物油，分支杆菌产物(如弗氏完全或不完全佐剂)或者载体如植物糖苷皂苷、胆固醇和磷脂酰胆碱的混合物，其提供在笼样（cage-like）结构上呈递一些蛋白质拷贝的载体。对于本说明书而言，佐剂是强调、增加、适度或增强对于免疫原或抗原的免疫应答的物质。佐剂典型同时增强体液和细胞免疫应答，但是增强一种免疫应答而不增强另一种也定义为佐剂。此外，佐剂及其应用为免疫学者熟知并且当免疫原的剂量受限时、当免疫原的免疫原性不佳时或者当施用途径是次最佳时典型用于增强免疫应答。因此，术语“佐剂量（adjvating amount）”是能增强对于指定免疫原或抗原的免疫应答的佐剂的量。等于“佐剂量”的物质是变化的，依赖于多种因素，包括但不限于免疫原的特性、施用的免疫原的数量、宿主物种、施用途径以及施用免疫原的方案。“佐剂量”可易于根据指定特定环境通过常规实验量化。这为技术人员熟知，典型使用常规剂量应答确定以改变施用的免疫原和佐剂的量。应答可以使用酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、血凝测定等通过确定针对免疫原产生的血清抗体效价或者细胞介导的应答而测量。

口服施用的固体形式可含有在人和兽药物学实践中可接受的结合剂，甜味剂，崩解剂，稀释剂，调味剂，包覆剂，防腐剂，润滑剂和/缓释剂。合适的结合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、西黄芪胶、藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔豆胶、黄原胶、皂土、褐藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬绿油、樱桃、橘子或覆盆子调味剂。合适的包覆剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠，维生素E5α-生育酚，抗坏血酸，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯或者亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁，硬脂酸，油酸钠，氯化钠或滑石。

口服施用的液体形式除了上述物质之外，可含有液体载体。合适的液体载体包括水，油如橄榄油、花生油(peanut oil)、芝麻油、葵花籽油、红花油、花生油(arachis oil)，椰子油，液体石蜡，乙二醇，丙二醇，聚乙二醇，乙醇，丙醇，异丙醇，甘油，脂肪醇，甘油三酯或其混合物。

口服施用的悬浮液可进一步包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，藻酸钠或乙酰基醇(acetyl alcohol)。合适的分散剂包括卵磷脂，脂肪酸如硬脂酸的聚氧乙烯酯，聚氧乙烯山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯等。口服施用的乳状液可进一步包含一或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上述举例的分散剂或者天然胶如瓜尔豆胶，阿拉伯树胶或西黄芪胶。

制备胃肠外施用组合物的方法为本领域技术人员熟知，在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.,Ed.D.B.Troy，Lippincott,Williams & Wilkins,Baltimore,2006中更详细描述，所述文献援引加入本文。

所述组合物可掺入任何合适的表面活性剂，如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包含悬浮剂，如天然胶，纤维素衍生物或无机材料如silicaceous silicas，及其它成分如羊毛脂。

所述组合物的制备使用本领域技术人员已知的常规方法进行。典型地，这种组合物制备为注射形式，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备为适于在注射前在液体中成为溶液或悬浮液的固体形式。所述制备物也可以是乳化的。活性免疫原性成分通常与赋形剂混合，所述赋形剂是药物可接受的及与所述活性成分是相容的。

第二方面，本发明提供了调节对于禽流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。尽管优选所述通用H5N1疫苗作为单一组合物施用，但是也考虑到疫苗的各个成分可以单独但同时施用给对象。

根据本发明的方法，疫苗和组合物可以通过任何合适途径施用，全身性、区域性(regionally)或局部(locally)施用。在任何指定情况中使用的特定施用途径依赖于多种因素，包括治疗疾病的性质、疾病的严重性和程度、要输送的特定化合物的需要剂量以及希望的疫苗或组合物的潜在副作用。

例如，在需要将适当浓度的希望的疫苗或组合物直接输送至治疗部位的情况中，施用可以是区域性而不是全身性的。区域性施用模式提供了将希望的疫苗或组合物以极高的局部浓度输送至需要的部位的能力，因此适于达到希望的治疗或预防作用，同时避免了机体的其它器官暴露于该疫苗或组合物，从而潜在地降低副作用。例如，根据本发明的实施方案，施用可以通过任何标准途径完成，包括腔内、膀胱内、肌肉内、动脉内、静脉内、皮下、表面或口服。腔内施用可以是腹膜内或胸膜内。

如果需要，适于持续释放或间歇释放的含有免疫原性物质的装置或组合物可以植入在体内或表面应用以相对缓慢地将这种材料释放至体内。

表达载体或宿主细胞的施用可包括通过直接口服、系统注射输送，或者输送至选择的组织或细胞，或者通过输送至分离自对象或相容供体的细胞而间接输送。关于基于核酸的组合物，这种组合物的所有输送模式均涵盖在本发明内。

所述组合物可以脂质体形式施用。脂质体通常衍生自磷脂或其它脂质物质，是通过在水相介质中分散的单层或多层水合的液体结晶形成的。可以使用能形成脂质体的任何无毒性的生理学可接受的及可代谢的脂质。脂质体形式的组合物可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选脂质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，天然及合成的均可。形成脂质体的方法为本领域熟知。

施用的化合物对于任何特定对象的有效剂量水平依赖于多种因素，包括治疗的疾病的类型及疾病的阶段，应用的化合物的活性，应用的组合物，所述对象的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，施用时间，施用途径，化合物螯合速度，治疗持续时间，治疗中组合或同时使用的药物，及本领域熟知的其它相关因素。

第三方面，本发明提供了预防或治疗与禽流感病毒相关疾病的方法，所述方法包括给对象施用预防有效量的通用H5N1疫苗。所述通用H5N1疫苗如上文所述。合适的组合物、施用及剂量如上文所述。

第四方面，本发明提供了通用H5N1疫苗调节对禽流感病毒的免疫应答的应用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。

第五方面，本发明提供了通用H5N1疫苗在治疗与禽流感病毒相关疾病中的应用。所述通用H5N1疫苗如上文所述。

制备及施用疫苗的方法为本领域熟知，如美国专利7,510,719、7,537,768、7,666,439及7,691,368；美国专利申请公开2008/0187557、2009/0136532、2009/0263422、2009/0304730、2010/0047271、2010/0074916和2010/0086485；及国际申请公开WO 2007/129984、WO 2008/048984、WO 2008/115314、WO 2009/069447、WO 2009/115917、WO 2010/021289及WO 2010/036948例证，所述文献均援引加入本文。

除非特别指出，实施本发明使用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养及转基因生物学技术，这些为本领域技术人员已知。见例如Maniatis et al.,1982,Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook and Russell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York)；Ausubel et al.,1992),Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley & Sons,including periodic updates)；Glover,1985,DNACloning(IRL Press,Oxford)；Russell,1984,Molecular biology of plants:alaboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie and Fink,Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology(Academic Press,New York,1991)；Harlow and Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss,Inc.,1987)；ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；Methods In Enzymology,Vols.154 and 155(Wu et al.eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；Riott,EssentialImmunology,6th Edition,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988；Fireet al.,RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development,Cambridge University Press,Cambridge,2005；Schepers,NRA Interference inPractice,Wiley–VCH,2005；Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts &Bolts of siRNA Technology,DNA Press,2003；Gott,RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Human Press,Totowa,NJ,2004；Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application,CRC,2004所述。

实施例

本发明通过如下实施例进行描述，所述实施例只是例证本发明而不意图以任何方式限制本发明。利用本领域熟知的标准技术或在下文特别描述的技术。

实施例1

材料和方法

病毒：来自进化枝2.1A/Indonesia/CDC669/2006、A/Indonesia/TLL013/2006及一个禽毒株A/Indonesia/TLL014/2006的H5N1人流感病毒得自印度尼西亚卫生部(MOH)。禽H5N2亚型得自新加坡农业食品与兽医管理局(AVA)。来自不同的系统发生进化枝/亚进化枝的H5N1病毒(表1)通过反求遗传学拯救[WHO,2004]。简言之，基于来自NCBI流感病毒数据库的序列合成来自进化枝1、2.1、2.2、2.3、4、7和8的H5N1病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因(GenScript,USA)。将合成的HA和NA基因克隆进双启动子质粒中以进行甲型流感病毒反求遗传学(Prabakaran et al.,2009)。所述双启动子质粒得自美国佐治亚州亚特兰大的疾病控制与预防中心。再造病毒（reassortant virus）通过将含有HA和NA以及衍生自高度生长的主要毒株(master strain)A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的其余六个流感病毒基因的质粒使用Lipofectamine 2000(Invitrogen Corp.)转染进共培养的293T和MDCK细胞中进行拯救。在转染72小时后，将培养基接种于含胚卵或者MDCK细胞。对来自第二次传代的再造病毒的HA和NA基因进行测序，以证实导入的HA和NA基因的存在及不存在突变。将原种病毒在11天龄的含胚卵的尿囊腔中增殖，收获含有病毒的尿囊液并在-80℃等份贮存。病毒含量通过标准血凝测定(HA)确定。使用高致病性病毒的所有试验均在符合CDC/NIH和WHO建议的生物安全水平3级(BSL-3)的防范设施中进行。

表1：产生自反求遗传学的再造甲型流感病毒

序号	病毒名称(亚型)	进化枝	宿主
				1	A/Vietnam1203/04(H5N1)	1	人
2	A/Indonesia/CDC1031/07(H5N1)	2.1	人
				3	A/turkey/Turkey1/05^*(H5N1)	2.2	禽
4	A/Anhui/1/05^*(H5N1)	2.3	人
				5	A/chicken/Shanxi/2/06(H5N1)	7	禽
6	A/goose/Guiyang/337/06(H5N1)	4	禽
				7	A/chicken/Henan/12/04(H5N1)	8	禽

中和性单克隆抗体(n-mAb):选择针对H5N1病毒HA的一组五个不同的中和性mAb以鉴定逃逸突变体。简言之，将BALB/c小鼠间隔两周通过皮下注射免疫两次，使用与佐剂(SEPPIC,France)混合的纯化的福尔马林失活的A/Indonesia/CDC669/2006或A/Indonesia/TLL014/2006或A/Chicken/Singapore/98 H5N2抗原。在脾细胞与SP2/0细胞融合之前3天，小鼠接受另外的静脉内注射相同病毒抗原(Yokoyama,2004)。

通过使用n-mAb作图H5HA中和表位：H5的主要中和表位通过用五种不同的中和单克隆抗体(6B8、4C2、2D9、4F8和3H11)鉴定逃逸突变体而作图(Kaverin et al.,2007)。简言之，将H5N1病毒与过量的n-mAb保温1小时，将该混合物接种于11天龄的含胚鸡卵。将所述卵在37°C保温48小时。收获病毒并用于在含胚鸡卵中以限制稀释克隆，通过噬斑纯化逃逸突变体。然后通过测序及与亲代病毒序列对比鉴别HA基因中的突变。

表位分布分析：将由Kaverin et al.(2007)鉴别的H5HA的中和表位以及在这项研究中鉴别的主要表位一起进行序列分析。为分析H5N1病毒中的中和表位的分布，将全长HA序列与来自NCBI流感病毒数据库的禽和人H5N1病毒进行对比。H5N1的蛋白质多态性使用Influenza ResearchDatabase(Fludb.org)进行分析，在这项研究中排列对比了多达317个人毒株及2028个禽毒株。为评估表位中的变化，从每个H5N1病毒的多个序列排列对比中产生位置频率表。

疫苗毒株的选择：选择三种不同的H5N1毒株以覆盖大多数H5N1谱系中HA的中和表位内的变化。进一步地，选择的疫苗毒株的反应性使用合适的中和性单克隆抗体通过血凝抑制测定及微量中和测定证实。

重组杆状病毒的产生：为产生重组杆状病毒载体，如前所述，将WSSVie1启动子控制的HA表达盒插入穿梭载体pFastBac1中，并根据Bac-To-Bac系统(Invitrogen)的方案整合进在DH10BAC^TM内的杆状病毒基因组中。简言之，在标准PCR方法(94°C 20秒，55°C 30秒及72°C 2分钟，30次循环)中，从三个不同的流感病毒毒株扩增全长HA基因。H5HA序列使用如下引物扩增：H5FSal 5’ACGCGTCGACATGGAGAAAATAGTGCTTCT 3’(SEQ ID NO:1)和H5RNot 5’ATAAGGCGGCCGCTTAAATGCAAATTCTGCATTG 3’(SEQ ID NO:2)，来自H5N1病毒-：A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)(GenBank登记号CY014481和ABI36428；SEQ ID NO:3(核苷酸序列)和SEQ ID NO:4(氨基酸序列)；A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)(GenBank登记号EU122404和ABW90135；SEQ ID NO:5(核苷酸序列)和SEQ ID NO:6(氨基酸序列)；及A/Anhui/1/2005(H5N1)(GenBank登记号DQ371928和ABD28180；SEQ ID NO:7(核苷酸序列)及SEQ ID NO:8(氨基酸序列)。将WSSV ie1启动子插入具有SnabI和SalI位点的载体中，将HA基因插入具有NotI-SalI位点的pFastBac1载体中。在将转移载体转化进DH10BAC中之后，将重组杆粒转染进Sf9细胞中，在转染后4天收获释放进培养基中的出芽的杆状病毒颗粒。

疫苗试验：无特异病原的雌性BALB/c小鼠(6周龄)得自国立新加坡大学实验动物中心，并维持在Temasek生命科学实验室的Animal Holding Unit中。将每个实验组24只小鼠(n=24/组)间隔28天通过皮下注射接种两次，使用100μl展示H5N1-A/VietNam/1203/2004的HA的杆状病毒(Mono-BacHA)或者展示来自A/Indonesia/CDC669/2006-H5N1、A/Viet Nam/1203/2004-H5N1、A/Anhui/1/2005-H5N1的HA的每种杆状病毒的混合物(Tri-BacHA)接种，有或无佐剂Montanide ISA563(油包水乳状液)(SEPPIC,France)。失活的RG-H5N1病毒(A/VietNam/1203/2004-H5N1)也用作参考疫苗对照。在第14、28和42天，从每个实验组十只小鼠中收集血清。进行血凝抑制测定及间接ELISA以评估HA特异性抗体应答。此外，血清交叉-进化枝中和能力通过微量中和测定测量。疫苗的效力通过宿主对抗来自不同进化枝的HPAI H5N1流感病毒毒株的攻击进行评定。所有动物实验均根据Guides for Animal Experiments of the National Institute of InfectiousDiseases(NIID)进行，实验方案参见并由新加坡国立新加坡大学的Temasek生命科学实验室的动物管理与使用委员会许可。

血凝抑制测定：如前所述进行血凝抑制测定(Webster et al.,1991)。将受体破坏性酶(RDE)-处理的血清在V形底的96孔平板中系列稀释(2-倍)。将大约4个HA单位的病毒抗原与该血清在室温保温30分钟，随后加入1%鸡红细胞(RBC)，在室温保温40分钟。

微量中和测定：根据先前所述方案进行微量中和测定(Suguitan et al.,2006)。简言之，将MDCK细胞种于96孔培养板中，在37°C培养形成单层。将系列2倍稀释的热失活(56°C，45分钟)血清样品与来自不同进化枝的100 50%组织培养感染剂量(TCID50)的H5N1病毒单独混合，在室温保温1小时，将该混合物以一式三份孔加入MDCK细胞单层中。计算稀释度倒数的完全阻止任何致细胞病变作用的小鼠抗血清的中和效价。

抗H5N1病毒感染的疾病攻击试验：在最终接种之后3周，将小鼠转移至动物BSL3防范设施中。每组六只小鼠用5MLD50(50%小鼠致死剂量)的同源(A/Vietnam/1203/2004(H5N1)进化枝1.0)和异源进化枝2.1(A/Indonesia/TLL13/2006(H5N1))及进化枝7.0(A/chicken/Shanxi/2/06)HPAIH5N1毒株进行鼻内攻击。预先确定鼻内攻击试验需要的流感病毒的50%小鼠致死剂量(MLD50)。每天观测小鼠以监测体重和死亡率。持续监测直至所有动物死亡或者直至攻击后14天。为了进行组织病理学研究，将小鼠进行尸检，将肺贮存在10%(wt/vol)中性缓冲的福尔马林中，及在石蜡中包埋并切片。将切片用苏木精和曙红(H/E)染色，之后使用光学显微镜检测，评估肺病理学。所有攻击实验均在动物生物安全水平3级防范设施中进行。

实施例2：使用n-mAb鉴别和鉴定H5HA的中和表位

之前在我们的实验室中产生抗流感病毒血凝素(HA)的一组五个不同的中和性mAb(6B8、4C2、2D9、4F8和3H11)。所有n-mAb均识别H5的构象表位并具有在体外中和流感病毒感染的能力。也已经证实这些n-mAb具有血凝抑制活性(数据未示出)。使用病毒逃逸突变体分析涉及形成n-mAb的表位的氨基酸。对分离自多个逃逸变体的完整HA基因进行测序，(a)n-mAb 6B8在氨基酸位置189(Lys突变为Asn)或者155(Asn突变为Asp)具有单一点突变，(b)n-mAb 4F8在氨基酸位置155(Asn突变为Asp)具有单一点突变，及(c)n-mAb 2D9在氨基酸位置189(Arg突变为Trp)或223(Ser突变为Arg)具有单一点突变。对n-mAb 4C2的相似分析揭示在形成表位中涉及氨基酸155(Ser突变为Ile)或189(Arg突变为Lys)，而n-mAb 3H11在氨基酸位置138“Leu”、139“Gly”和140“Ser”具有单一点突变。在此所示所有氨基酸位置均不包括HA的信号肽。SEQ ID NO:9-11分别表示A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)、A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)和A/Anhui/1/2005(H5N1)的成熟HA蛋白的氨基酸序列。

实施例3：表位分布分析

禽和人H5N1病毒的全长HA序列得自National Center forBiotechnology Information的流感病毒数据库。将人和禽H5N1分离株的HA序列与主要中和表位序列(HA1区域的氨基酸位置138、140、155、189、159、194和218)对比。结果表明在人及禽H5N1谱系中大多数主要抗原性表位区域含有明显的变化(表2)。高度变体140环(140 aa)的分析表明在所有H5N1人分离株中在这个位置氨基酸“Lys”(22.5%)和“Ser”(28.5%)以优势存在，在位置140仅较少存在“Thr”(6%)(表2)。进一步地，150环的155 aa仅具有两个变体(在这个位置，63.4%的人H5N1分离株具有氨基酸“Ser”，剩余的34.4%具有氨基酸“Asn”)。同样，在流感病毒血凝素第189位的、位于受体结合位点内的氨基酸，在这个位置，在64.26%的所有H5N1人毒株中含有氨基酸“Arg”，剩余的34.65%具有氨基酸“Lys”(表2)。

表2：H5N1毒株中表位频率

实施例4：疫苗毒株的选择

基于中和表位内的氨基酸序列分析，分析一组H5N1病毒(317个人毒株和2028个禽毒株)的HA主要中和表位内氨基酸变化频率。选择三种不同的H5N1毒株(A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)(进化枝2.1)、A/VietNam/1203/2004(H5N1)(进化枝1.0)和A/Anhui/1/2005(H5N1)(进化枝2.3))，由此这些毒株的组合将覆盖H5HA的中和表位的所有主要氨基酸变化(表3)。例如，A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)和A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)毒株在第155位含有“Ser”，而A/Anhui/1/2005(H5N1)毒株在相同位置具有“Asn”。进一步地，A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)和A/Anhui/1/2005(H5N1)毒株在第189位含有“Lys”，而A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)毒株在相同位置具有氨基酸“Arg”(表3)。

表3：三种毒株中免疫原性表位

实施例5：通过n-mAb区别性识别选择的疫苗毒株

选择的疫苗毒株(A/Vietnam/1203/2004(H5N1)(进化枝1.0)、A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)(进化枝2.1)和A/Anhui/1/2005(H5N1)(进化枝2.3))中的变化基于用不同的n-mAb获得的病毒中和作用及血凝抑制(HI)测定的结果证实。疫苗毒株暴露于n-mAb导致与n-mAb的不同反应性模式。如表4A和4B所示，通过血凝抑制测定和微量中和测定示出，n-mAb6B8示出优先结合A/Vietnam/1203/2004(H5N1)和A/Anhui/1/2005(H5N1)毒株，而相同n-mAb对于A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)的中和作用则不存在。然而，n-mAb 4C2仅中和A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)毒株。使用其它n-mAb观测到相似的识别模式差异。这些发现也表明在A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)与A/Vietnam/1203/2004(H5N1)毒株之间存在显著抗原性变异(表4A和4B)。此外，疫苗组合物中包含A/Anhui/1/2005(H5N1)覆盖了在疫苗毒株第155位(Asn)的氨基酸变化，其包含34%的人H5N1分离株。

表4A：使用n-mAb(1mg/ml)针对三种H5N1毒株的血凝抑制测定

表4B：使用n-mAb(1mg/ml)针对三种H5N1毒株的病毒微量中和测定

实施例6：血清血凝抑制(HI)测定

还获得了血凝抑制效价，其测量抑制HA(A/Vietnam/1203/2004(H5N1))的功能性能力的抗体应答效力。所述HI效价结果示出与未佐剂化Tri-BacHA相比，用佐剂化Tri-BacHA免疫的小鼠在第28和42天显著增强血清HI效价(图1)。

此外，用佐剂化Tri-BacHA接种的小鼠的HI效价与用佐剂化RG-H5N1病毒或者佐剂化Mono-BacHA任一接种的小鼠的HI效价相当(图1)。

实施例7：血清交叉-进化枝中和抗体效价

在第42天针对100 TCID50的不同进化枝的H5N1毒株的血清中和抗体效价示出，与用未佐剂化Tri-BacHA接种的小鼠相比，用佐剂化Tri-BacHA接种显著中和来自不同进化枝(进化枝1.0、进化枝2.1、进化枝2.2、进化枝4.0、进化枝7.0和进化枝8.0)的病毒(图2A和2B)。

此外，当与用佐剂化疫苗RG-H5N1或Mono-BacHA疫苗接种的小鼠相比时，用佐剂化Tri-BacHA免疫的小鼠显著增强针对进化枝2.2、进化枝4和进化枝7的中和效价(图2A和2B)。进一步地，用Seppic佐剂化的含有Mono-BacHA或RG-H5N1的疫苗组合物能中和进化枝1(同源)、进化枝2.1和进化枝8.0，但是未导致有效中和其它进化枝(进化枝2.2、进化枝4.0和进化枝7.0 H5N1毒株)。

实施例8：接种后的攻击研究

在最终免疫后3周，将所有组的小鼠用5 MLD₅₀的来自进化枝1.0或进化枝2.1或进化枝7.0的HPAI H5N1毒株鼻内攻击。用佐剂化Tri-BacHA或Mono-BacHA或RG-H5N1免疫的小鼠组获得针对进化枝1.0和进化枝2.1的100%保护作用(图3和图4)。此外，佐剂化Tri-BacHA提供针对进化枝7.0 H5N1感染的100%保护作用。然而，用佐剂化RG-H5N1疫苗和Mono-BacHA免疫的小鼠分别仅提供66.6%和83.3%的针对进化枝7.0H5N1感染的保护作用(图6)。

感染进展通过在不同组中小鼠体重下降的不同倾向表明。在用H5N1进化枝7.0(A/chicken/Shanxi/2/06(H5N1))攻击的小鼠组中，在用佐剂化Tri-BacHA接种的小鼠中观测到在攻击后体重无明显降低(图5)。然而，用具有佐剂的Mono-BacHA接种的小鼠示出直至12%的体重降低，但是在攻击后6天后体重逐步恢复。用佐剂化RG-H5N1疫苗接种的组示出在第6天直至17%的较高的体重下降，然后在攻击后第14天缓慢恢复(图5)。

在描述本发明(特别是在如下权利要求书中)中，除非在文中特别指出或清楚限定，术语“一个…”及“所述…”及相似用语的使用应解释为包括单数和复数。除非特别指出，术语“包含”、“具有”、“包括”及“含有”应解释为是开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。本文中对数值范围的引用仅是意图表示该范围内每个单独数值的简便方法，除非本文有不同指示，并且每个单独数值掺入说明书中就像其单独在本文中引用一样。例如，如果公开的范围是10-15，则也公开了11、12、13和14。除非特别指出或另外清楚限定，本文所述所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非特别要求，本文提供的任何及所有实例或举例的语言(如“例如”)的使用仅是为了更好地说明本发明，而无限制本发明范围之意。在本说明书中无语言应被解释为表示是实施本发明必需的任何没有请求保护的元素。

应意识到本发明的方法和组合物可以掺入本发明的各种实施方案，本文仅揭示了一小部分实施方案。本发明的实施方案在本文进行了描述，包括为本发明人已知的实施本发明的最佳模式。这些实施方案的变化为本领域技术人员在阅读前述说明书后显而易见。本发明人期望技术人员适当地应用这种变化，且本发明人希望以与本文特别描述不同的方式实施本发明。因此，本发明包括在所附权利要求书中列举的由适用法律许可的所述主题的所有修饰和等同方案。此外，除非特别指出或另外清楚限定，上述元素的所有可能变化的任何组合均涵盖在本发明内。

参考文献

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Claims

1.一种通用H5N1疫苗组合物，其包含预防有效量的第一免疫原性物质或者编码所述第一免疫原性物质的核酸、预防有效量的第二免疫原性物质或者编码所述第二免疫原性物质的核酸、预防有效量的第三免疫原性物质或者编码所述第三免疫原性物质的核酸以及药物学可接受的载体，其中所述第一免疫原性物质包含病毒毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)的血凝素或其抗原性肽，所述第二免疫原性物质包含病毒毒株A/Vietnam1203/2004(H5N1)的血凝素或其抗原性肽，及所述第三免疫原性物质包含病毒毒株A/Anhui/1/2005(H5N1)的血凝素或其抗原性肽或者编码所述第三免疫原性物质的核酸。

2.权利要求1的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含血凝素。

3.权利要求1的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含血凝素的抗原性肽。

4.权利要求1的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含编码血凝素的核酸。

5.权利要求1的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含编码血凝素的抗原性肽的核酸。

6.权利要求1的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含呈递或展示血凝素的病毒。

7.权利要求6的组合物，其中每种病毒均是杆状病毒。

8.权利要求1的组合物，其中所述第一、第二和第三免疫原性物质的每一个均包含呈递或展示血凝素的抗原性肽的病毒。

9.权利要求8的组合物，其中每种病毒均是杆状病毒。

10.一种调节对象中对禽流感病毒的免疫应答的方法，包括给对象施用预防有效量的权利要求1-9任一项的组合物。

11.一种治疗或预防与禽流感病毒相关疾病的方法，包括给对象施用权利要求1-9任一项的组合物。

12.权利要求1-9任一项的组合物在对象中调节免疫应答的应用。

13.权利要求1-9任一项的组合物在治疗或预防对象中与禽流感病毒相关疾病的应用。

14.权利要求1-9任一项的组合物，用作药物。

15.权利要求1-9任一项的组合物，用于调节对象中的免疫应答。

16.权利要求1-9任一项的组合物，用于治疗或预防对象中与禽流感病毒相关的疾病。

17.权利要求1-9任一项的组合物在制备用于调节对象中免疫应答的药物中的应用。

18.权利要求1-9任一项的组合物在制备用于治疗或预防对象中与禽流感病毒相关疾病的药物中的应用。