CN101636177A

CN101636177A - 用于禽流感的基于重组改良型痘苗病毒安卡拉(mva)的疫苗

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Publication number: CN101636177A
Application number: CN200780049450A
Authority: CN
Inventors: 亚瑟米恩·苏泽尔; 约翰尼斯·洛尔; 格尔德·苏特尔; A·D·M·E·奥斯特豪; G·F·瑞米埃尔兹万; 尤斯特·科瑞特兹
Original assignee: Paul-Ehrlich-Institut
Current assignee: Paul-Ehrlich-Institut
Priority date: 2006-11-20
Filing date: 2007-11-16
Publication date: 2010-01-27
Also published as: WO2008061939A1; US20110020391A1; JP2010510281A; EP1925318A1; EP2094299A1; KR20090117697A

Abstract

本发明涉及包含异源核酸的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)在制备药物特别是疫苗中的用途，其中异源核酸的序列来自甲型流感病毒H5类的抗原。本发明另一方面涉及包含异源核酸的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中(a)将异源核酸并入MVA基因组内的非必需位点，(b)异源核酸受疫苗病毒启动子或正痘病毒启动子或痘病毒特异性启动子的调控，以及(c)异源核酸选自编码来自甲型流感病毒H5类的基因或该基因的一部分的核酸。

Description

用于禽流感的基于重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)的疫苗

发明背景

自从1997年第一例人类H5N1感染病例出现以来，这种亚型的流感病毒连续引起世界范围内鸡瘟的爆发，这与鸟类向人类传播的数目逐渐积累有关。到9月14日，已经记录了246例人类病例，其中144例证明是致命的(WHO disease alert 2006.Confirmed human cases ofavian influenza H5N1(证实的人禽流感H5N1病例)-http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2007_10_17/en/index.html，accessed October 17th，2007)。另外，H5N1病毒感染已从东南亚传播到世界的其他大陆(WHO.2007.Affectedareas with confirmed cases of H5N1 avian influenza since 2003(自2003年起证实的H5N1流感病毒病例的侵袭地区)，status as of 08.10.2007)。由于这些病毒不但感染鸟类还可以感染各种哺乳动物(Vahlenkamp，T.W.，and T.C.Harder.2006.Influenza virus infections in mammals(哺乳动物的流感病毒感染).Berl Munch Tierarztl Wochenschr 119：123-31)，包括人类(Beigel，J.H.，J.Farrar，A.M.Han，et al.2005.Avian influenzaA(H5N1)infection in humans.N Engl J Med 353：1374-85)，因此，通过鸟类病毒对在哺乳动物种类中复制的适应性以及通过与正常的流行性甲型流感病毒的基因节段的交换，存在形成新的流行性毒株的风险。

鉴于以数量不断渐增的方式从感染的家禽传播到人类的流感H5N1病毒引起的大流行病的威胁，能够提供足够数量的安全有效的疫苗是优先考虑的事(WHO.2007.Antigenic and genetic characteristicsof H5N1 viruses and candidate H5N1 vaccine viruses developed forpotential use as pre-pandemic vaccines(H5N1病毒的抗原特征和遗传特征以及为作为疫情前疫苗的潜在用途而研发的候选H5N1疫苗病毒)-http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/summaryH520070403.pdf)。

然而，这类疫苗的研发以及足够数量的疫苗剂量的生产并不容易：目前，所有制造商联合的疫苗生产能力不足以及时地为世界范围内的疫苗接种活动作好准备。显然需要有助于克服这种问题的可选的疫苗送递系统和生产技术。

由于最近已经鉴定了H5N1病毒的抗原性不同的不同进化枝(clades)，因此理想的疫苗也应当诱导针对这些抗原变体的交叉保护性免疫。最近，已经评估了类似全灭活疫苗(whole inactivated virus，WIV)和分裂病毒粒子疫苗(split virion vaccines)的常规灭活疫苗制剂(Nicholson，K.G.，A.E.Colegate，A.Podda，et al..2001.Safety andantigenicity of non-adjuvanted and MF59-adjuvanted influenzaA/Duck/Singapore/97(H5N3)vaccine：a randomised trial of two potentialvaccines against H5N1 influenza(非辅佐的和MF59辅佐的流感病毒A/Duck/Singapore/97(H5N3)疫苗的安全性和抗原性：两种针对H5N1流感病毒的疫苗的随机试验).Lancet 357：1937-43)。这些制剂具有缺陷，即这种疫苗需要与可能的保存期相关的相当数量的其他产品特征。此外，疫苗生产者实施这种新方法不一定是成功的，并且需要再次进行有效性检测。鉴于大流行病的危害，这些缺陷是显著的。安全有效的佐剂可改善常规疫苗的免疫原性，因而可以减少诱导足够的抗体应答所需的抗原特性(剂量节省)。本文的结果加强了这种可能性(

辅佐的NIBRG-14全病毒制剂)。然而，目前，此类有效的辅助剂型被认为不适宜制备和应用于人类，因而不需要用于增强其免疫原性的佐剂的疫苗，是未来疫苗研发的有利候选者。

已经检测了基于杆状病毒所表达的重组HA的疫苗(Treanor，J.J.，B.E.Wilkinson，F.Masseoud，et al.2001.Safety and immunogenicity ofa recombinant hemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans.Vaccine19：1732-7)。在天然免疫原性个体中，这些疫苗是适度免疫原性的，然而，更为重要的是，当高剂量使用或与如同明矾的佐剂联合使用时，这些疫苗仅诱导可检测的抗体应答(Nicholson，K.G.，A.E.Colegate，A.Podda，et al.2001.Safety and antigenicity of non-adjuvanted andMF59-adjuvanted influenza A/Duck/Singapore/97(H5N3)vaccine：arandomised trial of two potential vaccines against H5N1 influenza.Lancet357：1937-43)。

显然，急需新疫苗来克服疫苗的灾难性不足，特别是在H5N1流感大流行病的情况下。为了避免大流行病所招致的后果，必须尽快克服上文所概述的缺陷。

发明概述

本发明涉及治疗学领域，特别是疫苗领域，更特别是甲型流感疫苗更特别是H5N1疫苗领域。

甲型流感病毒在病毒分类中是称为正粘液病毒科(Orthomyxoviridae)的病毒科内的一个属。甲型流感病毒属仅有一个种；该种称为“甲型流感病毒”。甲型流感病毒引起“禽流感(avianinfluenza)”(也称为禽流感(bird flu)、禽流感(avian flu)、甲型流感病毒流感、甲型流感或甲型属流感(genus A flu))。其以鸟类为宿主，但是可以感染数种哺乳动物。所有已知的亚型是鸟类特有的。

本发明解决了上文所概述的问题。本发明教导包含分离的异源核酸的重组改良型痘苗病毒安卡拉(modified vaccinia virus Ankara，MVA)在制备药物特别是疫苗中的用途，其中异源核酸的序列来自甲型流感病毒H5类的抗原。

“分离的DNA”或者是(1)根据本发明，包含与任何天然存在的序列不相同的序列的DNA，或是(2)在具有天然存在的序列(如cDNA或基因组DNA)的DNA背景下，不含至少一种这样的基因的DNA，该基因在有机体基因组中位于包含目的DNA的基因的侧翼，在所述有机体基因组中，包含目的DNA的基因天然存在。该术语因而包括并入载体、自主复制质粒或病毒或原核或真核基因组DNA的重组DNA。该术语也包括诸如cDNA的个别分子，其中相应的基因组DNA具有内含子，因而具有不同的序列；缺少至少一种侧翼基因的基因组片段；聚合酶链式反应(PCR)产生的且缺少至少一种侧翼基因的cDNA或基因组DNA的片段；缺少至少一种侧翼基因的限制片段；编码诸如融合蛋白、突变蛋白或给定蛋白的片段的非天然存在的蛋白的DNA；以及为cDNA或天然存在的核酸的简并变体的核酸。另外，该术语包括重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列是杂合基因(hybrid gene)即编码非天然存在的融合蛋白的基因的一部分。由上述可见，分离的DNA并非意指这样的DNA，该DNA属于cDNA或基因组DNA文库或例如限制消化反应混合物或电泳凝胶切片中的基因组DNA限制消化物(genomic DNA restriction digests)中的数百到数百万的其他DNA分子。

重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)包含异源核酸，其中(a)将异源核酸并入MVA基因组的非必需位点，(b)异源核酸受痘苗病毒启动子或正痘病毒(Orthopoxvirus)启动子或痘病毒特异性启动子的调控，以及(c)异源核酸选自编码来自甲型流感病毒H5类的基因或该基因的一部分的核酸。

术语“载体”指能被导入细胞或能将所包含的蛋白和/或核酸导入细胞的蛋白或多核苷酸或其混合物。优选一旦导入载体，导入的多核苷酸所编码的蛋白在细胞中表达。

“用于制备药物特别是疫苗的优选核酸”，即SEQ ID NOs.1-3和11-15，在本文中也指此类核酸，其与本文所明确列出的那些核酸具有95％、优选98％、最优选99％的同一性。利用Karlin和Altschul(Karlin&Altschul(1993)PNAS.90：5873-5877)的数学算法，实现两条序列间百分比同一性的测定。将这种算法并入Altschul等的BLASTN和BLASTP程序(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。用BLASTN程序，评分＝100，字长＝12，进行BLAST核苷酸搜索，以获得与EPO变体多肽编码核酸同源的核苷酸序列。用BLASTP程序，评分＝5，字长＝3，进行BLAST蛋白搜索，以分别获得与EPO变体多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的有空位的比对，利用Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述的空位BLAST(Gapped BLAST)。当利用BLAST和空位程序时，使用各程序的缺省参数。

发明的详细描述

本发明人已经发现，包含异源核酸的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)在制备药物特别是疫苗中的用途解决了上文概述的问题，其中异源序列来自甲型流感病毒H5类的抗原。特别是，用产生流感H5N1病毒HA的MVA接种，甚至在单次接种后，诱导了有效的抗体应答，所述有效的抗体应答与针对同源和异源激发感染的保护有关。最令人惊讶的是，本发明人证明，用产生来自特异性第一H5N1毒株(香港/156/97)的抗原的MVA接种，诱导了针对有关感染异源第二H5N1毒株(越南/1194/04)的疾病的理想保护。令人非常惊讶的是，这种保护在缺少针对所述第二毒株的可检测抗体的情况下发生。本发明涉及包含异源核酸的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)在制备用于治疗人类和其他动物的特别是禽流感的药物特别是疫苗中的用途，其中异源核酸的序列来自甲型流感病毒H5类的抗原。

MVA作为特别安全的、针对人类天花的疫苗，最初在超过12,000个体中进行了测试(Mayr，A.，and K.Danner.1978.Vaccination againstpox diseases under immunosuppressive conditions(在免疫抑制条件下针对痘病的疫苗接种).Dev Biol Stand 41：225-34)。

使用MVA载体疫苗的优势包括，已经在人类中建立了它们的安全性特征、在临床检测中它们高效送递异源抗原，以及在满足GMP条件下用于大规模生产疫苗的技术的可用性。

本发明人已经构建了不同的重组MVA病毒，它们也表达H5N1流感病毒A/香港/156/97(A/HK/156/97)或A/越南/1194/04(A/VN/1194/04)的血凝素(HA)基因序列。这些病毒作为小鼠模型的候选疫苗，评估针对三种不同H5N1病毒的保护性免疫的诱导。双剂量免疫化治疗方案诱导了与异源H5N1病毒部分交叉反应的强烈的抗体应答；诱发的抗体应答与针对同源和异源流感病毒的激发感染有关。

本发明的疫苗(MVA)可诱导广泛的免疫应答，该免疫应答甚至在引起感染的毒株尚未完全匹配疫苗抗原时，保护个体免于严重的临床体征和呼吸道组织病理学变化。本发明的重组MVA载体具有许多使它们成为用于人类的有利疫苗候选者的特征。

首先，由于本发明重组MVA在哺乳动物细胞中独特的复制缺陷以及它们已经完全确立的体内无毒性，包括MVA在免疫抑制的短尾猿中的安全性(Stittelaar，K.J.，T.Kuiken，R.L.de Swart，et al.2001.Safety of modified vaccinia virus Ankara(MVA)in immunesuppressedmacaques(改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)在免疫抑制的短尾猿中的安全性).Vaccine 19：3700-9.)，或对HIV感染个体的高剂量重组MVA的无害应用(Harrer，E.；M.Bauerle，B.Ferstl，et al.2005.Therapeuticvaccination of HIV-1-infected patients on HAART with a recombinantHIV-1 nef-expressing MVA：safety，immunogenicity and influence onviral load during treatment interruption(用重组HIV-1nef表达MVA对接受HAART的HIV-1-感染的患者的治疗性接种：安全性、免疫原性和对治疗间断期病毒负荷的影响).Antivir Ther 10：285-300；Goonetilleke，N.，S.Moore，L.Dally，et al.2006.Induction ofmultifunctional human immunodeficiency virus type 1(HIV-1)-specific Tcells capable of proliferation in healthy subjects by using a prime-boostregimen of DNA-and modified vaccinia virus Ankara-vectored vaccinesexpressing HIV-1 Gag coupled to CD8+T-cell epitopes.J Virol80：4717-28)，因此可以认为本发明的重组MVA是非常安全的病毒载体。

其次，按照为研发作为抗正痘病毒相关生物威胁的第三代疫苗的MVA所付出的努力，MVA疫苗的工业规模制造看起来非常可行(Vollmar，J.，N.Arndtz，K.M.Eckl，et al.2006.Safety andimmunogenicity of IMVAMUNE，a promising candidate as a thirdgeneration smallpox vaccine(第三代天花疫苗的有前景的候选物IMVAMUNE的安全性和免疫原性).Vaccine 15；24：2065-70)。

第三，本发明的MVA载体疫苗可以送递多种异源抗原并且允许同时诱导高水平的体液免疫和细胞免疫，因而提供了研发多价疫苗的可能性。

此外，基于MVA的疫苗的生产，不依赖于常规流感疫苗的现有生产能力。在此情况下，基于MVA的疫苗的生产，可以在发生大流行病时有助于减少可预见的疫苗剂量的不足。另一个优势是，这些疫苗的极好免疫原性不依赖于佐剂的使用。

改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)是痘苗病毒的鸡细胞适应毒株(chicken cell adapted strain)。由于将其接种到动物时所发现的无毒性以及其在哺乳动物来源的大多数细胞中产生大量新病毒子代的显著缺陷，MVA可以在生物安全级别为1的实验室条件下使用。MVA可用作表达重组基因的高效载体病毒(Sutter，G.，and B.Moss.1992.Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes(非复制痘苗载体有效表达重组基因).PNAS 89：10847-51.)，并且可用作具高安全性特征的候选重组疫苗(Moss，B.，M.W.Carroll，L.S.Wyatt，et al.1996.Host range restricted，non-replicating vaccinia virus vectors asvaccine candidates(作为疫苗候选物的宿主域限制的非复制痘苗病毒载体).Adv Exp Med Biol 397：7-13)，因为已在超过100000例接种了抗天花疫苗的人中检测了MVA的预免疫，而没有引起显著的副作用。几种MVA载体疫苗已经进入了临床评估(McConkey，S.J.，W.H.Reece，V.S.Moorthy，et al.2003.Enhanced T-cell immunogenicity of plasmidDNA vaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara inhumans.Nat Med 9：729-35；Cosma，A.，R.Nagaraj，S.Bühler，et al.2003.Therapeutic vaccination with MVA-HIV-1 nef elicits Nef-specificT-helper cell responses in chronically HIV-1 infected individuals.Vaccine22：21-9)。最近，作为候选的二代抗天花疫苗，再次评估了MVA。根据本发明，将本发明的异源核酸并入MVA基因组的非必需区域。根据本发明，可以使用任何MVA毒株。

WO 03/097844 A1在第四页公开了许多MVA毒株。可以根据本发明使用的一种毒株是MVA-BN毒株或其衍生物(WO 02/42480)。本发明的非必需区域可以选自(i)有关痘苗病毒毒株Copenhagen基因组的MVA基因组的天然存在的缺失侧，或(ii)MVA基因组的基因间区域(intergenic regions)。术语“基因间区域”优选指位于两个邻近基因间的病毒基因组的那些部分，其既不包含编码序列也不包含调节序列。然而，并未将用于并入本发明的异源核酸的插入侧(非必需区域)限制为这些优选的插入侧，因为可在病毒基因组的任何地方整合，只要整合能获得在至少一种细胞培养体系如鸡胚胎成纤维细胞(ChickenEmbryo Fibroblasts，CEF细胞)中可以扩增和繁殖的重组体，这位于在本发明的范围内。因此，非必需区域也可以是一个或多个非必需基因，其功能可由用于繁殖MVA的细胞体系来补充。

在优选的实施方案中，将异源核酸并入MVA基因组的非必需位点。

在特别优选的实施方案中，将本发明的异源核酸在缺失(III)位点并入MVA基因组。本发明的异源核酸的并入优先通过所谓转移载体的侧翼区域的同源重组进行，所述转移载体在并入MVA基因组之前最初包含本发明的异源核酸。一旦进行同源整合，进行重组病毒的选择。选择重组病毒的一种此类方法是表达宿主域基因K1L(host rangegene K1L)(参阅图5和图7)。

在优选的实施方案中，将异源核酸在缺失III位点并入MVA基因组。

根据本发明，异源核酸受痘苗病毒或正痘病毒或痘病毒特异性启动子的调控。许多启动子可以用于本发明。对于本发明异源核酸的表达，几种启动子为，诸如30K和40K启动子(美国专利5,747,324，AStrong Synthetic Early-Late Promoter(效力强大的合成的早晚期启动子)；Sutter，G.，L.S.Wyatt，P.L.Foley，et al.1994.A recombinant vectorderived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strainof vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus(来自宿主域限制的和高减毒痘苗病毒MVA株的重组载体刺激小鼠体内的对流感病毒的保护性免疫).Vaccine 12：1032-1040)、P7.5启动子(Endo，A.，S.Itamura，H.Iinuma，et al.1991.Homotypic and heterotypicprotection against influenza virus infection in mice by recombinantvaccinia virus expressing the haemagglutinin or nucleoprotein ofinfluenza virus.J Gen Virol 72：699-703)、PmH5、P11和衍生于牛痘病毒A型包含物(A-type inclusion，ATI)基因的启动子(Li，Y.，R.L.Hall，S.L.Yan，R.W.Moyer.1998.High-level expression of Amsacta mooreientomopoxvirus spheroidin depends on sequences within the gene.J GenVirol 79：613-22)。根据本发明，可以使用所有这些启动子。在一个实施方案中，理想的是，异源核酸大量表达。WO 03/097844 A1公开了P7.5这种启动子，PmH5和P11是优选的。

根据本发明，异源核酸的序列选自H5N1、H5N3、H5N2、H5N7、H7N1、H7N7、H7N3以及H9N2序列。优选地，异源核酸序列来自H5N1。

如果异源核酸来自H5N1，则其优选选自具以下称谓的毒株：A/越南/1203/04、A/越南/1194/04、A/越南/3046/04、A/香港/156/97、A/香港/212/03、A/香港/213/03、A/印度尼西亚/5/05、A/Ck/印度尼西亚/BL03/03、A/苍鹭/HK/793.1/02、A/红嘴鸥/HK/12.1/03、A/DK/越南/11/04、A/Ck/越南/33/04、A/Ck/越南/C-58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06以及A/Ck/HK/947/06。

优选地，H5N1的异源核酸选自以下毒株：A/越南/1194/04、A/印度尼西亚/5/2005、A/斑头雁/青海/1A/2005、A/大天鹅/蒙古/244/2005、A/火鸡/土耳其/1/2005以及A/安徽/1/2005。

最优选地，H5N1的异源核酸是毒株A/越南/1194/04的异源核酸。

优选地，异源核酸的序列包括血凝素基因的序列或该序列的一部分。在优选的实施方案中，异源核酸的序列包括血凝素基因1-1500位核苷酸的序列或该序列的部分。在更优选的实施方案中，是1-1100位核苷酸，以及在最优选的实施方案中，为40-1100位核苷酸。在最优选的实施方案中，异源核酸包括选自SEQ ID NO.1、SE ID NO.2和SEQ ID NO.3的A/越南/1194/04血凝素基因的序列或该序列的一部分。SEQ ID NO.3是最优选的(参阅表1)。

来自A/越南/1194/04的H5N1的血凝素基因(SEQID NO.1)的1-1500位核苷酸

5’-atggagaaaatagtgcttctttttgcaatagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaagacacacaatgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttgagagattgtagtgtagctggatggctcctcggaaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaaggccaatccagtcaatgacctctgttacccaggggatttcaatgactatgaagaattgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtccagtcatgaagcctcattgggggtgagctcagcatgtccataccagggaaagtcctcctttttcagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtacatacccaacaataaagaggagctacaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtgggggattcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaacccaaccacctatatttccgttgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaagaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaaaccgaatgatgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctcca

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		来自H5N1的血凝素基因(SEQ ID NO.2)的1-1100位核苷酸	5’-atggagaaaatagtgcttctttttgcaatagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaagacacacaatgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttgagagattgtagtgtagctggatggctcctcggaaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaaggccaatccagtcaatgacctctgttacccaggggatttcaatgactatgaagaattgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtccagtcatgaagcctcattgggggtgagctcagcatgtccataccagggaaagtcctcctttttcagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtacatacccaacaataaagaggagctacaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtgggggattcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaacccaaccacctatatttccgttgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaagaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaaaccgaatgatgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcaacaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagcatgccattccacaatatacaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactgggctcagaaatagccctcaaagagagagaagaagaaaaaagagaggattatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttg-3’
来自H5N1的血凝素基因(SEQ ID NO.3)的40-1100位核苷酸	5’-gttaaaagtgatcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatggaaaagaacgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaagacacacaatgggaagctctgcgatctagatggagtgaagcctctaattttgagagattgtagtgtagctggatggctcctcggaaacccaatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaaggccaatccagtcaatgacctctgttacccaggggatttcaatgactatgaagaattgaaacacctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtccagtcatgaagcctcattgggggtgagctcagcatgtccataccagggaaagtcctcctttttcagaaatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtacatacccaacaataaagaggagctacaataataccaaccaagaagatcttttggtactgtgggggattcaccatcctaatgatgcggcagagcagacaaagctctatcaaaacccaaccacctatatttccgttgggacatcaacactaaaccagagattggtaccaagaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaaggatggagttcttctggacaattttaaaaccgaatgatgcaatcaacttcgagagtaatggaaatttcattgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcaacaattatgaaaagtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctagcatgccattccacaatatacaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactgggctcagaaatagccctcaaagagagagaagaagaaaaaagagaggattatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttg-3’	来自H5N1的血凝素基因(SEQ ID NO.2)的1-1100位核苷酸

血凝素(HA)是在流感病毒(以及许多其他细菌和病毒)的表面发现的抗原糖蛋白。其负责使病毒与被感染的细胞结合。血凝素这一名称来自该蛋白能使红细胞聚集在一起的能力(Nelson D.L.and Cox M.M.，2005.Principles of Biochemistry(生物化学原理)，4th edition(第四版)，FreemanPublishers，New York)。

至少存在16种不同的HA抗原。这些亚型被归为H1-H16。最后一个亚型A16仅是最近在分离于来自瑞典和挪威的红嘴鸥的甲型流感病毒中发现的(Fouchier RA，Munster V，Wallensten A，et al.2005.Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype(H16)obtained from black-headed gulls(获得自红嘴鸥的新甲型流感病毒血凝素亚型(H16)的表征).J Virol 79：2814-22.)。最初三个血凝素即H1、H2和H3都在人类流感病毒中发现。

已经在人类患者中发现禽病毒H5型血凝素中的单氨基酸变化，这种变化可显著改变禽H5N1病毒的受体特异性，从而为它们提供了与人类流感病毒的最佳受体结合的能力(Gambaryan，A，A.Tuzikov，G.Pazynina，et al.2005.Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A(H5)viruses(甲型流感病毒(H5)的受体结合显型的进化).Virology 344：432-8)。这种发现看起来可以解释通常不感染人类的H5N1病毒如何突变以及如何变得能有效感染人类细胞的。显然由于易于通过蛋白水解转变成活性形式，H5N1病毒的血凝素与这种流感病毒的高致病性有关(Hatta，M.，P.Gao，P.Halfmann，et al.2001.Molecular Basis for High Virulence of HongKong H5N1 Influenza A Viruses(香港H5N1甲型流感病毒高毒力的分子机制).Science 293：1840-1842)。

优选地，核酸包括HA1和HA2的亚基。HA是完整的同源三聚体膜蛋白。它的形状如同圆柱体，长度约为

(埃)。组成HA的三个相同的单体被构建成中央的α螺旋圈；三个球形头部包含唾液酸结合位点。合成HA单体作为前体，随后将其糖基化并切割成两个较小的多肽：HA1和HA2亚基。每个HA单体由长的、螺旋状链组成，该链通过HA2锚定于细胞膜上，并通过大HA1球状体位于顶端。

在另一个实施方案中，异源核酸包括编码核酸序列区域的序列，所述核酸序列区域选自：氨基酸1-351、氨基酸352-500、氨基酸15-351、氨基酸120-160、氨基酸180-230以及氨基酸120-230。下述氨基酸是最优选的：氨基酸120-160、氨基酸180-230以及氨基酸120-230。非常优选的区域是120-160。最优选地，异源核酸编码选自SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10的氨基酸序列。

表2


		来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸15-351(SEQ ID NO.4)	ksdqicigyhannsteqvdtimeknvtvthaqdilekthngklcdldgvkplilrdcsvagwllgnpmcdefinvpewsyivekanpvndlcypgdfndyeelkhllsrinhfekiqiipksswssheaslgvssacpyqgkssffrnvvwlikknstyptikrsynntnqedllvlwgihhpndaaeqtklyqnpttyisvgtstlnqrlvpriatrskvngqsgrmeffwtilkpndainfesngnfiapeyaykivkkgdstimkseleygncntkcqtpmgainssmpfhnihpltigecpkyvksnrlvlatglrnspqrerrrkkrglfga
来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸352-500(SEQ ID NO.5)	iagfieggwqgmvdgwygyhhsneqgsgyaadkestqkaidgvtnkvnsiidkmntqfeavgrefnnlerrienlnkkmedgfldvwtynaellvlmenertldfhdsnvknlydkvrlqlrdnakelgngcfefyhkcdnecmesvrn	来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸15-351(SEQ ID NO.4)
来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸352-500(SEQ ID NO.5)		来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸120-160(SEQ ID NO.6)	llsrinhfekiqiipksswssheaslgvssacpyqgkssff
来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸120-230(SEQ ID NO.7)	llsrinhfekiqiipksswssheaslgvssacpyqgkssffrnvvwlikknstyptikrsynntnqedllvlwgihhpndaaeqtklyqnpttyisvgtstlnqrlvpria	来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸120-160(SEQ ID NO.6)	llsrinhfekiqiipksswssheaslgvssacpyqgkssff
来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸120-230(SEQ ID NO.7)		来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸180-230(SEQ ID NO.8)	ynntnqedllvlwgihhpndaaeqtklyqnpttyisvgtstlnqrlvpria
来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸1-351(SEQ ID NO.10)	mekivllfaivslvksdqicigyhannsteqvdtimeknvtvthaqdilekthngklcdldgvkplilrdcsvagwllgnpmcdefinvpewsyivekanpvndlcypgdfndyeelkhllsrinhfekiqiipksswssheaslgvssacpyqgkssffrnvvwlikknstyptikrsynntnqedllvlwgihhpndaaeqtklyqnpttyisvgtstlnqrlvpriatrskvngqsgrmeffwtilkpndainfesngnfiapeyaykivkkgdstimkseleygncntkcqtpmgainssmpfhnihpltigecpkyvksnrlvlatglrnspqrerrrkkrglfga	来自A/越南/1194/04 H5N1的血凝素基因的氨基酸180-230(SEQ ID NO.8)	ynntnqedllvlwgihhpndaaeqtklyqnpttyisvgtstlnqrlvpria

在特别优选的实施方案中，异源核酸编码两个或多个序列，所述序列来自(a)单一H5N1毒株的不同基因或其部分，和/或(b)不同的H5N1毒株。对我们来说特别优选的是，两个或更多、三个或更多、四个或更多HA序列来自不同的H5N1毒株。此外，两个或更多个不同的序列可以来自HA和病毒的另一个基因。

在优选的实施方案中，异源核酸的序列包括血凝素基因1-1500位核苷酸(SEQ ID NO.1)的序列或该序列的部分。在更优选的实施方案中，1-1100位核苷酸(SEQ ID NO.2)，以及在最有效的实施方案中，40-1100位核苷酸(SEQ ID NO.3)。

优选的序列是神经氨酸酶(NA)。NA编码神经氨酸酶，神经氨酸酶是在流感病毒表面发现的抗原糖蛋白酶。其有助于子代病毒从感染的细胞中释放。NA被认为是引发流感病毒特异性免疫应答的可能的靶标抗原，即引发可有助于抗不同病毒变体或亚型的交叉保护的抗体和T细胞。SEQID NO.15(神经氨酸酶；越南/1194/2004)是特别优选的。

优选的序列是基质序列(matrix sequence)。基质编码基因节段(Matrixencoding gene segments)是基质蛋白，所述基质蛋白与两个表面蛋白(血凝素和神经氨酸酶)一起构成病毒壳体(保护性包膜)。M1是与病毒RNA结合的蛋白。SEQ ID NO.13(M1，越南/1194/2004)是优选的。

M2是打开病毒包膜从而使病毒内容物(8个RNA节段)暴露于宿主细胞细胞质的蛋白。M2跨膜蛋白是有效感染所需的离子通道(Robert B.Couch，Orthomyxoviruses，Baron S.(ed.)in Medical Microbiology(医学微生物学)，Fourth Edition(第四版)，The University of Texas Medical Branch atGalveston.1996.ISBN 0-9631172-1-1)。H5N1基因型M2中的氨基酸取代(Ser31Asn)与金刚烷胺抗性有关(Guan，Y.，L.L.Poon，C.Y.Cheung，et al.2004.H5N1 influenza：A protean pandemic threat PNAS 108：8156-8161；Lee，C.-W.，D.L.Suarez，T.M.Tumpey，et al.2005.Characterization of HighlyPathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea.JVirol，79：3692-3702，以及Pandemic Influenza Center for Infectious DiseaseResearch & Policy Academic Health Center--University of Minnesota)。SEQID NO.14(越南/1194/2004；M2)是优选的。M1和M2被认为是引发流感病毒特异性免疫应答的可能的靶标抗原，即引发可有助于抗不同流感病毒变体或亚型的交叉保护的抗体和T细胞。

因此，在一个实施方案中，使用两种或多种HA抗原。在一个实施方案中，将一种或多种HA抗原与NA、M1或M2进行组合。在优选的实施方案中，组合M1、M2、NA、NP和HA。在非常优选的实施方案中，这些抗原由SEQ ID NO：11(NP；香港/156/97)、SEQ ID NO：12(NP；越南/1194/04)、SEQ ID NO：13(M1；越南/1194/04)、SEQ ID NO：14(M2；越南/1194/04)和/或SEQ ID NO.15(NA；越南/1194/04)编码。

在特别优选的实施方案中，两种或多种序列编码血凝素或血凝素的一部分，并且来自A/越南/1203/04、A/越南/1194/04、越南/3046/04、A/斑头雁/青海/1A/2005、A/大天鹅/蒙古/244/2005、A/火鸡/土耳其/1/2005、A/安徽/1/2005和/或A/IND/5/05。

SEQ ID NO.12(来自H5N1毒株越南1194/04的NP的核苷酸1-1496)	atggcgtctcaaggcaccaaacgatcttatgaacagatggaaactggtggggaacgccagaatgctactgagatcagggcatctgttgggagaatggttagtggcattgggaggttctacatacagatgtgcacagaactcaaactcagtgactatgaagggaggctgatccagaacagcataacaatagagagaatggtactctctgcatttgatgaaagaaggaacagatacctggaagaacaccccagtgcgggaaaggacccgaagaagactggaggtccaatttatcggaggagagacgggaaatgggtgagagagctaattctgtacgacaagaggagatcaggaggatttggcgtcaagcgaacaatggagaggacgcaactgctggtcttacccacctgatgatatggcattccaatctaaatgatgccacatatcagagaacgagagctctagtgcgtactggaatggacccaaggatgtgctctctgatgcaagggtcaactctcccgaggagatctggagctgccggtgcagcagtaaagggggtagggacaatggtgatggagctgattcggatgataaaacgagggatcaacgacgccaatttctggagaggcgaaaatggaagaagaacaaggattgcatatgagagaatgtgcaacatccttaaagggaaattccaaacagcagcacaaagagcaatgatggatcaagtgcgagagagcagaaatcctgggaatgctgaaattgaagatctcatttttctggcacggtctgcactcatcctgagaggatcagtggcccataagtcctgcttgcctgcttgtgtgtacggacttgcagtggccagtggatatgactttgagagagaagggtactctctggttggaatagatcctttccgcctgcttcaaaacagccaggtctttagtctcattagaccaaatgagaatccagcacataagagtcaattagtgtggatggcatgccactctgcagcatttgaggaccttagagtctcaagtttcatcagagggacaagagtggtcccaagaggacagctatccaccagaggggttcaaattgcttcaaatgagaacatggaggcaatggactccaacactcttgaactgagaagcagatattgggctataagaaccagaagcggaggaaacaccaaccagcagagggcatctgcaggacagatcagcgttcagcccactttctcggtacagagaaaccttcccttcgaaagagcgaccattatggcagcatttacaggaaatactgagggcagaacgtctgacatgaggactgaaatcataagaatgatggaaagtgccagaccagaagatgtgtcattccaggggcggggagtcttcgagctctcggacgaaaaggcaacgaacccgatcgtgccttcctttgacatgaataatgaaggatcttatttcttcggagacaatgcagaggagtatgacaattaa
SEQ ID NO.12(来自H5N1毒株越南1194/04的NP的核苷酸1-1496)		越南/1194/04 H5N1的基质基因M1的核苷酸1-759(SEQ ID NO.13)	atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcatcccgtcaggccccctcaaagccgagatcgcgcagaaacttgaagatgtctttgcaggaaagaacaccgatctcgaggctctcatggagtggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaagggattttgggatttgtattcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccagaatgccctaaatggaaatggagatccaaataatatggatagggcagttaagctatataagaagctgaaaagagaaataacattccatggggctaaggaggtcgcactcagctactcaaccggtgcacttgccagttgcatgggtctcatatacaacaggatgggaacggtgaccacggaagtggcttttggcctagtgtgtgccacttgtgagcagattgcagattcacagcatcggtctcacagacagatggcaactatcaccaacccactaatcagacatgagaacagaatggtgctggccagcactacagctaaggctatggagcagatggcgggatcaagtgagcaggcagcggaagccatggagatcgctaatcaggctaggcagatggtgcaggcaatgaggacaattgggactcatcctaactctagt

	gctggtctgagagataatcttcttgaaaatttgcaggcctaccagaaacgaatgggagtgcagatgcagcgattcaagtga
		越南/1194/04 H5N1的膜离子通道基因M2的核苷酸1-982(SEQ ID NO.14)	atgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcatcccgtcaggccccctcaaagccgagatcgcgcagaaacttgaagatgtctttgcaggaaagaacaccgatctcgaggctctcatggagtggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaagggattttgggatttgtattcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccagaatgccctaaatggaaatggagatccaaataatatggatagggcagttaagctatataagaagctgaaaagagaaataacattccatggggctaaggaggtcgcactcagctactcaaccggtgcacttgccagttgcatgggtctcatatacaacaggatgggaacggtgaccacggaagtggcttttggcctagtgtgtgccacttgtgagcagattgcagattcacagcatcggtctcacagacagatggcaactatcaccaacccactaatcagacatgagaacagaatggtgctggccagcactacagctaaggctatggagcagatggcgggatcaagtgagcaggcagcggaagccatggagatcgctaatcaggctaggcagatggtgcaggcaatgaggacaattgggactcatcctaactctagtgctggtctgagagataatcttcttgaaaatttgcaggcctaccagaaacgaatgggagtgcagatgcagcgattcaagtgatcctattgttgttgccgcaaatatcattgggatcttgcacttgatattgtggattcttgatcgtcttttcttcaaatgcatttatcgtcgccttaaatacggtttgaaaagagggcctgctacggcaggggtacctgagtctatgagggaagagtaccggcaggaacagcagagtgctgtggatgttgacgatggtcattttgtcaacatagaattggagtaa
越南/1194/04 H5N1的神经氨酸酶基因的核苷酸1-1350(SEQ ID NO.15)	atgaatccaaatcagaagataataaccatcggatcaatctgtatggtaactggaatagttagcttaatgttacaaattgggaacatgatctcaatatgggtcagtcattcaattcacacagggaatcaacaccaatctgaaccaatcagcaatactaatttgcttactgagaaagctgtggcttcagtaaaattagcgggcaattcatctctttgccccattaacggatgggctgtatacagtaaggacaacagtataaggatcggttccaagggggatgtgtttgttataagagagccgttcatctcatgctcccacttggaatgcagaactttctttttgactcagggagccttgctgaatgacaagcactccaatgggactgtcaaagacagaagccctcacagaacattaatgagttgtcctgtgggtgaggctccctccccatataactcaaggtttgagtctgttgcttggtcagcaagtgcttgccatgatggcaccagttggttgacaattggaatttctggcccagacaatggggcggtggctgtattgaaatacaatggcataataacagacactatcaagagttggaggaacaacatactgagaactcaagagtctgaatgtgcatgtgtaaatggttcttgctttactgtaatgactgacggaccaagtaatggtcaggcatcacataagatcttcaaaatggaaaaagggaaagtggttaaatcagtcgaattggatgctcctaattatcactatgaggaatgctcctgttatcctgatgccggcgaaatcacatgtgtgtgcagggataattggcatggttcaaatcggccatgggtatctttcaatcaaaatttggagtatcaaataggatatatatgcagtggagttttcggagacaatccacgccccaatgatggaacaggtagttgtggtccggtgtcctctaacggggcaggtggggtaaaagggttttcatttaaatacggcaatggtgtctggatcgggagaaccaaaagcactaattccaggagcggcttcgaaatgatttgggatccaaatgggtggactgaaacggacagcagcttttcagtgaaacaagatatcgtagcaataactgattggtcaggatatagcgggagttttgtccagcatccagagctgacaggactagattgcataagaccttgtttctgggttgagttgatcagagggcggcccaaagagagcacaatttggactagtgggagcagcatatctttttgtggtgtaaatagtgacactgtgggttggtcttggccagacggtgctgagttgccattcaccattgacaagtag	越南/1194/04 H5N1的膜离子通道基因M2的核苷酸1-982(SEQ ID NO.14)

本发明的另一方面涉及包含异源核酸的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中(a)将异源核酸并入MVA基因组的非必需位点，(b)异源核酸受痘苗病毒启动子或正痘病毒启动子或痘病毒特异性启动子的调控，以及(c)异源核酸选自编码甲型流感病毒H5类的基因或该基因的一部分的核酸。改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)是痘苗病毒的鸡细胞适应毒株。由于将其接种到动物时所发现的无毒性以及在哺乳动物来源的大多数细胞中产生大量新病毒子代的显著缺陷，MVA可以在生物安全级别为1的实验室条件下使用。MVA可用作表达重组基因的有效载体病毒(Sutter，G.，and B.Moss.1992.Nonreplicating vaccinia vectorefficiently expresses recombinant genes(非复制的痘苗载体有效表达重组基因).PNAS 89：10847-51.)，以及用作具有高安全性特征的候选重组疫苗(Moss，B.，M.W.Carroll，L.S.Wyatt，et al.1996.Host rangerestricted，non-replicating vaccinia vifus vectors as vaccine candidates(作为疫苗候选物的宿主域限制的非复制痘苗病毒载体).Vaccine Adv ExpMed Biol 397：7-13)，因为已经在超过100000例接种了抗天花疫苗的人中检测了MVA的预免疫，而没有引起显著的副作用。几种MVA载体疫苗已经进入了临床评估(McConkey，S.J.，W.H.Reece，V.S.Moorthy，et al.2003.Enhanced T-cell immunogenicity of plasmid DNAvaccines boosted by recombinant modified vaccinia virus Ankara inhumans(由人类重组的改良型痘苗病毒安卡拉促进的质粒DNA疫苗的增强的T细胞免疫原性).Nat Med 9：729-35；Cosma，A.，R.Nagaraj，S.Bühler，et al.2003.Therapeutic vaccination with MVA-HIV-1 nef elicitsNef-specific T-helper cell responses in chronically HIV-1 infectedindividuals(用MVA-HIV-1 nef的治疗性免疫接种在慢性HIV-1感染的个体体内激发Nef特异的T辅助细胞反应).Vaccine 22：21-9)。最近，，再次评估了作为候选的二代抗天花疫苗的MVA。根据本发明，将本发明的异源核酸并入MVA基因组的非必需区域。根据本发明，可以使用任何MVA毒株。

WO 03/097844 A1在第四页公开了许多MVA毒株。可以根据本发明使用的一种毒株是MVA-BN毒株或其衍生物(WO 02/42480)。本发明的非必需区域可以选自(i)有关痘苗病毒毒株Copenhagen基因组的MVA基因组的天然存在的缺失侧，或(ii)MVA基因组的基因间区域。术语“基因间区域”优选指位于两个邻近基因间的病毒基因组的那些部分，其既不包含编码序列也不包含调节序列。然而，并未将用于并入本发明的异源核酸的插入侧(非必需区域)限制为这些优选的插入侧，因为可在病毒基因组的任何地方整合，只要整合能获得在至少一种细胞培养体系如鸡胚胎成纤维细胞(Chicken Embryo Fibroblasts，CEF细胞)中可以扩增和繁殖的重组体，这在本发明的范围内。因此，非必需区域也可以是一个非必需基因或多个非必需基因，其功能可由用于繁殖MVA的细胞体系来补充。

在优选的实施方案中，异源核酸包含M1、M2、NA、NP和HA，其中M1、M2和NA位于缺失II中，NP位于缺失VI中，以及HA位于缺失III中。

最优选的是，异源核酸来自下列毒株：香港/156/97和越南/1194/2004。在特别优选的实施方案中，这些异源核酸具有序列SEQ IDNO.11、12、13、14和15。

优选地，异源核酸选自H5N1、H5N3、H5N2、H7N7、H3N2以及H7N3的基因组序列。

异源核酸优选来自H5N1，且选自具以下称谓的毒株：A/越南/1203/04、A/越南/1194/04、A/越南/3046/04、A/香港/156/97、A/香港/212/03、A/香港/213/03、A/印度尼西亚/5/05、A/Ck/印度尼西亚/BL03/03、A/苍鹭/HK/793.1/02、A/红嘴鸥/HK/12.1/03、A/Dk/越南/11/04、A/Ck/越南/33/04、A/Ck/越南/C-58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06、A/Ck/HK/947/06。

在另一个实施方案中，异源核酸来自H5N1，且选自具以下称谓的毒株：A/越南/1194/04、A/印度尼西亚/5/2005、A/斑头雁/青海/1A/2005、A/大天鹅/蒙古/244/2005、A/火鸡/土耳其/1/2005以及A/安徽/1/2005。

最优选地，H5N1的异源核酸是毒株A/越南/1194/04的异源核酸。

在一个实施方案中，异源核酸的序列包括血凝素基因的序列或该序列的一部分(参阅上文)。在另一个实施方案中，异源核酸包括编码氨基酸序列区域的序列，所述氨基酸序列区域选自：氨基酸1-351、氨基酸352-500、氨基酸15-351、氨基酸120-160、氨基酸180-230以及氨基酸120-230。下述氨基酸区域是最优选的：氨基酸120-160、氨基酸180-230以及氨基酸120-230。最优选的区域是120-160。

此外，第三H5N1变异毒株A/IND/5/05用于小鼠的激发感染，该株在抗原性上不同于其它两种病毒。重组MVA-HA-HK/97是高免疫原性的。单次免疫已诱导了针对流感病毒A/HK/156/97的有效抗体应答，这可由第二次接种进一步加强。这些抗体在A/VN/1194/04或A/IND/5/05的HI和VN检测中不是交叉反应的。MVA-HA-VN/04具较少的免疫原性，但两次免疫后，可观察到不但针对同源病毒也针对A/HK/156/97的大量抗体应答，以及针对A/IND/5/05的较低程度的抗体应答。所观察到的抗体反应模式与用感染后的雪貂血清所观察到的模式相似。因此，在用MVA-HA接种所诱导的抗体观察到的这种抗体识别模式中的不对称性完全与在最初流感病毒感染后诱导的抗体观察到的不对称性相似。

将全病毒抗原NIBRG-14疫苗制剂，作为阳性对照，包括于实验中，所述制剂与

油包水佐剂组合时是高免疫原性的，所述佐剂也称为Specol，用于研究抗原特异性抗体在试验动物内的产生。这种实验疫苗不但诱导了针对同源流感病毒A/VN/1194/04的强烈抗体应答，也诱导了针对其他两种H5N1毒株的强烈抗体应答。针对三种H5N1毒株所测量的HI和VN抗体的效价，直接与抗激发感染的保护相关。

MVA-HA-HK/97免疫的小鼠仅受到抗同源激发感染的保护。疫苗接种完全预防病毒复制，且作为结果，在这些小鼠中即没有观察到组织病理学变化也没有观察到临床体征。尽管MVA-HA-HK/97诱导的抗体不与流感病毒A/VN/1194/04交叉反应，但是，使这种病毒的复制降低，且使免疫的动物免于临床体征(表1)。

相反，未观察到针对流感病毒A/IND/5/05激发感染的保护性作用。尽管已知MVA接种可以诱导有助于保护的强CTL应答(3)，但是目前尚不知H-2b限制的交叉反应的CTL表位是否存在于流感H5N1病毒的HA分子中。用MVA-HA-VN/04的免疫诱导了针对同源毒株的杀菌免疫性。另外，观察到针对抗原不同的流感病毒A/HK/156/97和A/IND/5/05的强保护性作用。在大多数免疫的动物中，这些病毒的复制大量降低，其与呼吸道内感染的细胞缺失以及临床体征缺失相关。保护很可能是基于病毒中和HA特异性血清抗体，该抗体从循环中渗入到肺泡上皮细胞(Ito，R.，Y.A.Ozaki，T.Yoshikawa，H.Hasegawa，Y.Sato，Y.Suzuki，R.Inoue，T.Morishima，N.Kondo，T.Sata，T.Kurata，and S.Tamura.2003.Roles of antihemagglutinin IgA and IgG antibodiesin different sites of the respiratory tract of vaccinated mice in preventinglethal influenza pneumonia(在预防致死性流感肺炎中，抗血凝素IgA和IgG抗体在预防接种的小鼠的呼吸道的不同部位的作用).Vaccine21：2362-71)。

HA序列以及其他序列并不需要以完整的形式存在。例如，它们可以是为了例如更好地得以表达而优化的密码子。

对本发明的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)而言，优选的是，核酸包括HA1和HA2亚基。

在一个实施方案中，本发明的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)的核酸，编码两个或多个序列，该序列来自(a)单一H5N1毒株的不同基因或所述不同基因的一部分；(b)不同的H5N1毒株。此类实施方案已经在上文详细地概述。

在优选的实施方案中，两个或多个序列编码血凝素或血凝素的一部分，并且来自A/越南/1203/04、A/越南/1194/04、A/越南/3046/04、A/香港/156/97、A/香港/212/03、A/香港/213/03、A/印度尼西亚/5/05、A/Ck/印度尼西亚/BL03/03、A/苍鹭/HK/793.1/02、A/红嘴鸥/HK/12.1/03、A/Dk/越南/11/04、A/Ck/越南/33/04、A/Ck/越南/C-58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06或A/Ck/HK/947/06。

在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明上文概述的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)的核酸。

在另一个实施方案中，本发明涉及将本发明的重组MVA导入靶细胞的方法，包括用本发明的重组MVA感染所述靶细胞。

本发明也涉及免疫包括人在内的有生命的动物体的方法，所述方法包括给予需要免疫的所述有生命的动物体包括人治疗有效量的本发明的MVA。

在另一个实施方案中，本发明涉及将本发明的MVA导入靶细胞的方法，包括用本发明的MVA感染所述靶细胞。

用标准的方法学使病毒繁殖，并用滴定法测定病毒。为了产生疫苗制剂，经由蔗糖超速离心，以常规方式纯化病毒，并在例如pH 9.0、1mM Tris/HCl中重建。可将兔肾细胞(RK13，ATCC CCL-37^TM)培养于添加了10％胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的极限必需培养基(minimalessential medium，MEM)中，并维持于37℃和5％ CO₂中。将CEF细胞培养于6孔组织培养板中，并用多种20感染单位的MVA感染。

为了测定低或高多样性生长特征(multiplicity growth profiles)，必须分别用每细胞0.05感染单位(infectious units，IU)或10IU的MVA或本发明的MVA感染汇合的CEF单细胞层(培养于6孔板上)。37℃吸收病毒60分钟后，必须除去接种体。将细胞用RPMI 1640洗涤两次，并用包含2％FCS的新鲜RPMI 1640培养基在37℃和5％ CO₂下孵育。可在多个时间点收获感染后(p.i.)感染的细胞，且通过冻融随后进行短暂的超声波降解，释放病毒。必须将所得裂解物的连续稀释液接种于在6孔板中培养的汇合的CEF单细胞层上，两次重复，且孵育48小时后，可以将单细胞层简单地固定于冰冷的丙酮∶甲醇(1∶1)中，并可将细胞与多克隆兔抗痘苗抗体(IgG部分，Biogenesis Ltd.，Pool，England)一起孵育60分钟(min)，随后与辣根过氧化物酶偶联的多克隆山羊抗兔抗体(Dianova，Hamburg)一起孵育45分钟。在用PBS洗涤后，利用邻联茴香胺(o-Dianisidine，Sigma，Taufkirchen，Germany)底物溶液，使抗体标记的细胞显影，对染色细胞的转化灶(foci)进行计数，并可将病毒效价计算为IU/ml。

根据本发明的一个实施方案，本发明涉及免疫有生命的动物体包括人的方法，所述方法包括给予需要免疫的所述有生命的动物体包括人治疗有效量的本发明的MVA。本发明的所述方法可以包含组合物，所述组合物也可以包含(除了成分和载体外)稀释剂、普通填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂以及本领域公知的其他物质。它们必须是药学上可接受的。

术语“药学上可接受的”意指不干扰本发明MVA生物活性的效力的非毒性物质。载体的特征取决于给药途径。药物组合物还可以包含增强活性或用于治疗的其他药剂。可将此类附加的因子和/或药剂包括于药物组合物中，以应用于本发明的用于免疫的方法，产生协同效应或使副作用最小化。配制和给予本发明MVA的技术可见于“Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)”，(MuckPublishing Company，Easton，PA，最新版)。

本发明用于免疫的方法利用治疗有效量的MVA。治疗有效剂量还指足以使症状改善如治疗、治愈、预防或改善此类状态的化合物/成分的量。为了制备疫苗，将根据本发明产生的MVA痘苗病毒转化为生理学上可接受的形式。基于多年制备对天花进行接种免疫的疫苗的经验(Kaplan C.1969.Immunization against smallpox(抗天花免疫).BrMed Bull.25：131-135)，可实现这种转化。通常，将约10⁶-10⁷重组MVA的颗粒在安瓿优选玻璃安瓿内的100ml硫酸盐缓冲盐(PBS)中、在2％蛋白胨和1％人白蛋白存在的情况下冷冻干燥。冻干粉(lyophilisate)可包含增补剂，如甘露醇、葡聚糖、糖、糖胶、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidole)或适宜肠胃外给药的其他辅助物质(如抗氧化剂、稳定剂等)。随后将玻璃安瓿密封，并优选在低于-20℃的温度下贮藏数月。为了进行疫苗接种，可以将冻干粉溶解于0.1-0.2ml的水性溶液中，优选生理盐水，且例如通过皮内接种胃肠外给药。优选皮内注射本发明的疫苗。在注射部位可见轻微肿胀、变红，有时也会发痒。本领域技术人员可以以已知的方式优化给药模式、剂量以及给药的次数。为了获得针对外源抗原的高水平免疫应答，在长时段内适当地给予几次疫苗，是有利的。在优选的实施方案中，免疫可以是预防性的和/或治疗性的。

本发明也涉及带有疫苗的接种试剂盒、预填充有疫苗的注射器以及贮藏和应用的其他模式。

在一个实施方案中，有生命的动物体是哺乳动物，在一个实施方案中，有生命的动物体是鸟类。在优选的实施方案中，有生命的动物体是鸡或人。

在一个实施方案中，所述免疫可以使预防性的和/或治疗性的。

实施例

疫苗的制备

在MDCK细胞中繁殖H5N1病毒，并利用高纯度RNA分离试剂盒(Roche，Almere，the Netherlands)，从培养物上清液中提取病毒RNA。随后利用Superscript反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)和作为引物的5’-AGCAAAAGCAGG-3’(SEQ ID NO.9)寡核苷酸(Eurogentec，Seraing，Belgium)，由vRNA合成cDNA。接下来，利用Pfu(强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)，Stratagene，La Jolla，California，USA)作为热稳定DNA聚合酶，通过聚合酶链式反应，扩增HA基因序列。利用NotI和XhoI限制位点延伸引物序列，以促进向克隆质粒pBluescriptSK+(Stratagene，La Jolla，California，USA)的定向克隆。

通过NotI/XhoI消化，从这些质粒中制备HA基因序列，用Klenow聚合酶处理，以产生粘末端，并克隆至MVA表达质粒pIIIΔHR-PsynII的PmeI位点，以产生MVA载体质粒pIII-HA-HK/97和pIII-HA-VN/04。

通过在MVA感染的细胞中转染，这些质粒指导外源基因插入MVA基因组的缺失位点III(Sutter，G.，and B.Moss.1992.Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes(非复制的痘苗载体有效表达重组基因).PNAS 89：10847-51.)，并允许HA靶基因在痘苗病毒特异性启动子PsynII的调控下转录(Wyatt，L.S.，P.L.Earl，J.Y.Liu，et al.2004.AIDS Res Hum Retr 20：645-653)。通过用1μg质粒DNA转染、用0.05感染单位/细胞的MVA分离物F6感染(Sutter，G.，and B.Moss.1992.Nonreplicating vaccinia vector efficientlyexpresses recombinant genes.PNAS 89：10847-51.)，并通过在RK-13细胞上进行空斑选择(Staib，C.，I.Drexler，and G.Sutter.2004.Construction and isolation of recombinant MVA(重组MVA的构建和分离).Methods Mol Biol 269：77-100)，在原代鸡胚成纤维细胞(primarychicken embryo fibroblasts，CEF)中产生重组病毒MVA-HA-HK/97和MVA-HA-VN/04。通过PCR，分析重组MVA基因组，以验证HA基因的插入和遗传稳定性(数据未显示)。用MVA-HA-HK/97或MVA-HA-VN/04感染后，对在各种时间点收获的CEF细胞裂解物进行的Western印迹分析证实，MVA载体病毒产生了HA抗原(数据未显示)。在CEF中进行的一步或多步生长分析证明，与非重组MVA相比，MVA-HA-HK/97和MVA-HA-VN/04的复制能力接近相同(数据未显示)。

为了产生疫苗制剂，在CEF中扩增病毒，经由蔗糖超速离心进行纯化，并在pH 9.0、1mM Tris/HCl中重建。以在100μl PBS中稀释的10⁸PFU剂量，使用MVA疫苗。

全失活NIBRG-14病毒，其是基于通过反向遗传学制备的流感病毒A/越南/1194/04的重组疫苗毒株(reassortant vaccine strain)，用作阳性对照。以2μgHA/50μl的浓度，在蒸馏水中重建冻干的全病毒抗原，并与佐剂

(Cedi-Diagnostics，Lelystad，The Netherlands)1∶1混合。用PBS接种对照小鼠。

流感病毒

将流感病毒A/HK/156/97、A/VN/1194/04和A/印度尼西亚/5/05(A/IND/5/05)接种于11日龄的含胚鸡卵的尿囊腔中。3天后，收获尿囊液。如先前所述的(Rimmelzwaan，G.F.，M.Baars，E.C.Claas，et al.1998.Comparison of RNA hybridization，hemagglutination assay，titration of infectious virus and immunofluorescence as methods formonitoring influenza virus replication in vitro.J Virol Methods 4：57-66)，在肾小管上皮细胞(Madin-Darby Canine Kidney，MDCK)细胞中，测定感染性病毒的效价。

小鼠

无特定病原体的6-8周龄C57BL/6J雌性小鼠购自Charles River(Sulzfeld，Germany)。将动物(90只)分为5组，每组18只小鼠，并用PBS、MVA-HA-HK/97、MVA-HA-VN/04、wtMVA或

-辅助的NIBRG-14免疫。

进行肌内免疫，左后腿50μl，右后腿50μl。四周后，以眼窝穿刺(orbital puncture)的方式，采集血液，并如上文所述，将动物再次免疫。再过四周后，采集血液，并将5个疫苗组(n＝18)中的每个组分成3个亚组，每组6只动物。

每个疫苗组的亚组通过鼻内途径，接种50μl PBS中的10³TCID₅₀的流感病毒A/HK/156/97、A/VN/1194/04或A/IND/5/05。用6只非免疫动物作为阴性对照，并接种50μl PBS。每天称量动物的体重，直到感染后的第4天，随后放血处死。

在处死小鼠后，切除下列器官：脑、肺(注入福尔马林)、脾和肠。在激发感染的时间点，所有组中的动物都是完全地年龄匹配的。

在实验开始前，实验方案获得独立动物伦理委员会(independentAnimal ethics committee)的许可。肌内免疫、鼻内感染、眼窝穿刺以及安乐死都是在吸入异氟烷麻醉的情况下进行的。将动物圈养于滤盖饲养笼(filter-top cages)中，并且可以随意地接触食物和水。在感染H5N1流感病毒5天的时间内，将动物置于生物安全级别为3的安全壳设备(containment facilities)内的滤盖饲养笼内。对于每种病毒，利用一个BSL-3隔离单元(isolator unit)。

器官组织中的病毒效价

用乙醇在干冰上快速冷冻器官，并储存于-70℃。用Polytron均质器(Kinematica AG，Littau-Lucerne，Switzerland)将器官在运输培养基(transport medium，Hanks培养基(Hanks medium，MEM)、甘油、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、多粘菌素B、制霉菌素、庆大霉素、7.5％NaHCO3、1M Hepes)中进行均质化。用这些样品的一式五份的十倍连续稀释液在肾小管上皮细胞(MDCK细胞)的汇合层上测定病毒的效价。

血清学

在用霍乱滤液处理和56℃热失活后，检测血清中抗HA抗体的存在。为此目的，采用标准的实验方案，利用1％火鸡红细胞和4个HA单位的流感病毒A/HK/156/97、A/VN/1194/04或A/IND/5/05进行血凝抑制试验(hemagglutination inhibition assay，HI)(Palmer，D.F.，M.T.Coleman，W.R.Dowdle，et al.1975.Advanced laboratory techniques forinfluenza diagnosis(用于流感诊断的高级实验室技术)，p.51-52.InImmunology series No.6.United States Department of Health，Educationand Welfare，Washington，D.C)。为此目的，产生除去了碱基切割位点的反向遗传病毒。验证这些反向遗传病毒的使用，并且将所获得的效价与针对野生型毒株的效价进行比较(数据未显示)。利用100 TCID₅₀的各自病毒进行微量病毒中和试验(micro virus neutralisation(VN)assay)(Frank，A.L.，J.Puck，B.J.Hughes，et al.1980.Microneutralization test for influenza A and B and parainfluenza 1 and 2viruses that uses continuous cell lines and fresh serum enhancement.JClin Microbiol 12：426-32)，检测血清中对三种流感病毒具特异性的病毒中和抗体的存在。用从天鹅获得的超免疫血清作为3种不同的甲型流感病毒的阳性对照，所述天鹅用失活的H5N2流感病毒A/鸭/波茨坦/1402/86(Intervet，Boxmeer，the Netherlands)进行了两次免疫。

组织病理学

将注入福尔马林的肺固定于中性的缓冲福尔马林中，用石蜡包埋，按4μm进行切割，并用苏木精和曙红染色，进行组织学评估。此外，用针对甲型流感病毒核蛋白的单克隆抗体(克隆HB65 IgG2a(美国典型培养物保藏中心))，采用免疫过氧化物酶方法，使载玻片染色。用山羊-抗-小鼠IgG2a HRP(Southern Biotech，Birmingham，Alabama，USA)作为二抗。二氨基联苯胺作为底物，显示过氧化物酶，导致在甲型流感病毒感染的细胞的细胞核中出现深红色沉淀，细胞质染成较不强烈的红色。用苏木精对切片进行复染色。

统计分析

利用双边斯氏t检验(two-sided Student’s t test)，分析病毒效价和抗体效价的数据，当P＜0.05时，认为差异显著。

临床体征

从感染后第2天起，用PBS或wtMVA免疫的小鼠出现了如同驼背(hunched posture)、呼吸加快、毛皮起皱(ruffled fur)和肌肉强度降低等与用于感染的流感H5N1病毒无关的临床体征。用MVA-HA-HK/97或MVA-HA-VN/04、MVA-HA-VN/04接种后，为在用流感病毒A/HK/156/97或A/VN/1194/04感染的小鼠中未发现这些临床体征。MVA-HA-VN/04接种也预防感染流感病毒A/IND/5/05引起的临床体征的出现。所观察到的防止临床体征的保护与感染后体重降低的减少相关(图1)。在PBS和wtMVA免疫的小鼠中，用流感病毒A/HK/156/97感染后，所观察到的体重的平均降低分别为16.2％和11.5％(图1A)，或用流感病毒A/VN/1194/04感染后，分别为16.9％和10.4％(图1B)。接种MVA-HA-HK/97或MVA-HA-VN/04，显著地减少了体重的这种降低(图1)。用流感病毒A/IND/5/05感染(图1C)也在PBS免疫的对照小鼠或wtMVA接种的小鼠中引起严重的体重降低(分别为16.9％和18.6％)，通过接种MVA-HA-VN/04而不是接种MVA-HA-HK/97，使这种降低显著减少。

器官中的病毒复制

在感染流感病毒A/HK/156/97(图2A)、A/VN/1194/04(图2B)或A/IND/5/05(图2C)后第4天，测定脑、肠、肺和脾中感染性病毒的效价。

对于随后分别用流感病毒A/HK/156/97、A/VN/1194/04或A/IND/5/05感染的未受保护的PBS接种小鼠，感染后，在肺中，观察到最高的病毒复制，平均肺病毒效价为10^7.9、10^7.8和10^8.9TCID₅₀/克组织。用wtMVA接种的小鼠也未受到保护，并在感染小鼠的肺中发现了相似的平均病毒效价。在两组未受保护小鼠的一些动物中，在呼吸组织外包括脑、肠和脾中证实了病毒复制(表1)。

表1

表1表示感染性病毒的检测和在个别小鼠中观察到的体重降低。由于与实验无关的因素所导致的死亡，使组数＜6。

用于激发感染的病毒

A/HK/156/97 A/VN/1194/04 A/IND/5/05

接种MVA-HA-HK/97完全防止了流感病毒A/HK/156/97在肺和其他器官中的复制，而用MVA-HA-VN/04接种，在6只小鼠的4只中，观察到肺中病毒复制的减少。

在用流感病毒A/VN/1194/04激发感染后，情况相反：接种MVA-HA-VN/04完全防止了复制，而接种MVA-HA-HK/97仅部分减少了病毒复制。

与PBS接种的小鼠相比，减少具有统计学意义(p＜0.05)，尽管对于wtMVA接种小鼠，未观察到这种差异。

接种MVA-HA-VN/04也在6只小鼠中4只的肺中防止了流感病毒A/IND/5/05的复制，导致与PBS和wtMVA接种的小鼠相比，平均肺病毒效价减少。接种MVA-HA-HK/97未防止流感病毒A/IND/5/05的肺内复制，且所有的6只小鼠均检测为阳性(参阅上文的表1)。接种

辅佐的失活的病毒疫苗NIBRG-14，不但防止了同源毒株流感病毒A/VN/1194/04的复制，也防止了A/HK/156/97和A/IND/5/05的复制。

血清学

单次接种MVA-HA-HK/97，小鼠显示出了针对同源病毒毒株的强烈抗体应答，然而，抗体未与流感病毒毒株A/VN/1194/04或A/IND/5/05交叉反应，如通过HI和VN检测所测量的(图3)(GMT分别为1629和239)。在加强接种后，HI和VN试验中同源抗体的效价分别为1370和744GMT。仍未观察到与其他H5N1毒株的交叉反应。MVA-HA-VN/04疫苗制剂具有较少的免疫原性，且在一只动物中仅接种一次，可在VN试验中，检测到抗同源毒株的抗体。一旦加强接种，所有的动物都产生应答，且GMT增加到HI和VN试验所分别测量的20和64。MVA-HA-VN/04接种诱导的抗体与H5N1毒株A/HK/156/97交叉反应，且以有限的程度，与毒株A/IND/5/05交叉反应。辅佐的NIBRG-14疫苗制剂，其包括于本实验中作为阳性对照，诱导了针对同源A/VN/1194/04的强烈抗体应答，在HI和VN两种试验中，所述抗体与毒株A/HK/156/97和A/IND/5/05两者交叉反应。

肺中的病理学变化和病毒复制

用三种HPAI病毒中的任何一种感染4天后，处死小鼠，向它们的肺注入福尔马林，并进行组织学和免疫组织化学检查。用流感病毒A/香港/156/97接种wtMVA和PBS免疫的小鼠，导致支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的多病灶感染，伴有适度的细支气管周渗入物(peribroncheal infiltrate)和适度的细支气管壁坏死(图4A、E)。在MVA-HA-HK/97和MVA-HA-VN/04免疫的小鼠的肺中，感染后的第4天，未检测到病毒，并且，未观察到组织病理学变化(图4B、C)。流感病毒A/VN/1194/04感染在PBS和wtMVA两者免疫的小鼠中导致更强的细支气管周和肺泡上皮细胞多病灶感染(图A、F、J)。此外，基于细支气管上皮细胞的丧失、强烈的支气管周渗透和肺泡损伤，这些小鼠患有适度的间质性肺炎(interstitial pneumonia)。MVA-HA-HK/97免疫小鼠的肺泡上皮细胞的感染看起来较轻，然而，肺泡渗透更显著(图4G)。在MVA-HA-VN/04免疫小鼠的肺中，未检测到病毒复制，且形态正常(图4H)。感染流感病毒A/IND/5/05，在wtMVA、PBS和MVA-HA-HK/97免疫小鼠中，都引起细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的广泛感染(图4K、L、O)。此外，继细支气管上皮细胞丧失和细支气管内细胞残余存在后，在细支气管和肺泡两者中都观察到适度渗入物。MVA-HA-VN/04免疫小鼠具有小量细支气管周流感病毒A/IND/5/05感染的细胞，伴有适度细支气管周渗入物(图4M)。用辅佐的NIBRG-14免疫的小鼠具有正常的肺，且用三种流感H5N1病毒中的任一种感染后，未观察到病毒复制(图4D、I、N)。

附图简要说明

图1用10³TCID₅₀的流感病毒A/香港/156/97(A)、A/越南/1194/04(B)或A/印度尼西亚/5/05(C)鼻内感染的小鼠的体重降低。平均体重降低表达为感染前最初体重的百分比。(*)表示p＜0.05的具统计学意义的差异。

图2用流感病毒A/香港/156/97(A)、A/越南/1194/04(B)或A/印度尼西亚/5/05(C)感染后第4天，器官组织中的病毒效价。显示了wtMVA、MVA-HA-HK/97、MVA-HA-VN/04、

-辅佐的NIBRG-14以及PBS免疫的小鼠的结果。测量了脑

肠肺和脾

中的效价，并表示为每克组织的TCID50(Log 10)。(*)表示检测到至少一只动物的所示器官是阳性的。

图3接种所诱导的抗体应答。针对三种激发病毒的抗体效价：通过HI试验(A+B)，测量流感病毒A/香港/156/07

A/越南/1194/04

以及A/印度尼西亚/5/05

第一次免疫后28天(A)和第二次免疫后28天(B)。效价表示为GMT(Log 2)。针对三种不同激发病毒的二抗效价：通过VN-试验(C+D)，测量流感病毒A/香港/156/07A/越南/1194/04和A/印度尼西亚/5/05

第一次免疫(C)和第二次免疫(D)后28天。效价表示为GMT(Log 2)。

图4如所示的，在感染流感病毒A/香港/157/97、A/越南/1194/04或A/印度尼西亚/5/05的小鼠的肺中，细支气管和肺泡的组织病理学和免疫组织化学。流感病毒A/香港/156/97感染在wtMVA(A)和PBS(E)免疫小鼠细支气管壁中导致病毒阳性细胞，伴有适度支气管渗透，然而，在MVA-HA-HK/97(B)、MVA-HA-VN/04(C)以及-辅佐的NIBRG-14(D)免疫小鼠的肺中，未检测到病毒。感染流感病毒A/越南/1194/04在wtMVA(F)、MVA-HA-HK/97(G)以及PBS(J)免疫小鼠的细支气管壁中导致病毒阳性细胞，也伴有中度支气管渗透(除了PBS免疫的小鼠)。在MVA-HA-VN/04(H)和

辅佐的NIBRG-14免疫的小鼠(I)中未检测到病毒复制和形态变化。接种流感病毒A/印度尼西亚/5/05导致wtMVA(K)、MVA-HA-HK/97(L)以及PBS(O)免疫小鼠细支气管严重感染，伴有中度支气管渗透。但是，MVA-HA-VN/04(M)免疫小鼠细支气管壁中仅有最小量的细胞受到感染，伴有中度渗透。在感染流感病毒A/印度尼西亚/5/05后，未在

-辅佐的NIBRG-14(N)免疫小鼠的肺中检测到病毒。

图5构建本发明的重组MVA

在痘苗启动子的调控下，将基因导入MVA转移载体pIIIΔHR，通过侧翼区域(侧翼1和侧翼2)的同源重组，将基因插入MVA基因组的缺失III。通过宿主域基因K1L的表达，选择重组病毒。

图6构建多价VA-H5N1疫苗的示意图

按如下方式，将H5N1抗原编码序列导入MVA基因组：将A/越南/1194/2004(H5N1亚型)的基质蛋白(M1)、离子通道蛋白(M2)以及神经氨酸酶(NA)基因序列靶向缺失II位点，该位点受痘苗特异性启动子P7.5、PmH5、P11的转录调控。A/越南/1194/2004和A/香港/156/97(都是H5N1亚型)核蛋白(NP)的基因序列受PmH5启动子的调控，将其导入MVA基因组的缺失IV处(详情参阅图7)。在痘苗启动子PsynII的调控下，将A/越南/1194/2004和A/香港/156/97(都是H5N1亚型)的血凝素基因型序列插入缺失III的位点。

图7两种不同MVA-H5N1-NP疫苗的构建

将MVA转移载体质粒pVIdHR-NP-VN04或pVIdHR-NP-HK97的DNA转染到MVA感染的细胞，允许产生重组病毒MVA-NP-VN04和MVA-NP-HK97。通过利用侧翼区(侧翼VI₁和侧翼VI₂)，同源重组于缺失VI位点，将NP基因整合于MVA基因组。利用宿主域基因K1L的瞬时表达进行生长选择，分离重组病毒。

图8重组MVA-H5N1-NP病毒多步骤生长分析

在鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物中，分析携带来自流感病毒A/香港/156/97(MVA-NP-HK97)或A/越南/1194/04(MVA-NP-VN04)的NP基因的重组MVA的复制能力。两种重组病毒的生长能力和生长动力学，与所测定的非重组MVA(wtMVA)的生长能力和生长动力学极为相似。

图9MVA-H5N1-NP构建体表达NP抗原

通过CEF感染MVA-NP-HK/97和MVA-NP-VN04重组病毒，证实流感病毒核蛋白的合成。伪感染的CEF和含有A/PuertoRico/08/34(亚型H1N1)的尿囊液作为对照。利用针对流感病毒核蛋白的小鼠单克隆抗体HB-65(ATCC号HB-65)，检测NP蛋白。

序列表

<110>保罗-埃利希尔-研究所

<120>用于禽流感的基于重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)的疫苗

<130>N 1249 PCT BLN

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1500

<212>DNA

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>1

atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60

attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120

actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta 180

gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240

ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300

ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360

ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420

catgaagcct cattgggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480

agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540

aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600

gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660

ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720

aggatggagt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780

ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840

atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900

ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960

tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020

agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080

cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca acgagcaggg gagtgggtac 1140

gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200

attattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa caacttagaa 1260

aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat 1320

aatgctgaac ttctagttct catggaaaac gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380

gtcaagaacc tttacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440

aacggttgtt tcgagttcta tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaac 1500

<210>2

<211>1100

<212>DNA

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>2

atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60

attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120

actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatcta 180

gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240

ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300

ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360

ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420

catgaagcct cattgggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480

agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540

aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600

gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660

ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720

aggatggagt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780

ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840

atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900

ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccatcgggga atgccccaaa 960

tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020

agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080

cagggaatgg tagatggttg 1100

<210>3

<211>1061

<212>DNA

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>3

gttaaaagtg atcagatttg cattggttac catgcaaaca actcgacaga gcaggttgac 60

acaataatgg aaaagaacgt tactgttaca catgcccaag acatactgga aaagacacac 120

aatgggaagc tctgcgatct agatggagtg aagcctctaa ttttgagaga ttgtagtgta 180

gctggatggc tcctcggaaa cccaatgtgt gacgaattca tcaatgtgcc ggaatggtct 240

tacatagtgg agaaggccaa tccagtcaat gacctctgtt acccagggga tttcaatgac 300

tatgaagaat tgaaacacct attgagcaga ataaaccatt ttgagaaaat tcagatcatc 360

cccaaaagtt cttggtccag tcatgaagcc tcattggggg tgagctcagc atgtccatac 420

cagggaaagt cctccttttt cagaaatgtg gtatggctta tcaaaaagaa cagtacatac 480

ccaacaataa agaggagcta caataatacc aaccaagaag atcttttggt actgtggggg 540

attcaccatc ctaatgatgc ggcagagcag acaaagctct atcaaaaccc aaccacctat 600

atttccgttg ggacatcaac actaaaccag agattggtac caagaatagc tactagatcc 660

aaagtaaacg ggcaaagtgg aaggatggag ttcttctgga caattttaaa accgaatgat 720

gcaatcaact tcgagagtaa tggaaatttc attgctccag aatatgcata caaaattgtc 780

aagaaagggg actcaacaat tatgaaaagt gaattggaat atggtaactg caacaccaag 840

tgtcaaactc caatgggggc gataaactct agcatgccat tccacaatat acaccctctc 900

accatcgggg aatgccccaa atatgtgaaa tcaaacagat tagtccttgc gactgggctc 960

agaaatagcc ctcaaagaga gagaagaaga aaaaagagag gattatttgg agctatagca 1020

ggttttatag agggaggatg gcagggaatg gtagatggtt g 1061

<210>4

<211>337

<212>PRT

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>4

Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu

1 5 10 15

Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln

20 25 30

Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly

35 40 45

Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu

50 55 60

Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr

65 70 75 80

Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp

85 90 95

Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His

100 105 110

Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu

115 120 125

Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser

130 135 140

Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro

145 150 155 160

Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val

165 170 175

Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu

180 185 190

Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn

195 200 205

Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln

210 215 220

Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala

225 230 235 240

Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr

245 250 255

Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu

260 265 270

Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn

275 280 285

Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys

290 295 300

Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg

305 310 315 320

Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly

325 330 335

Ala

<210>5

<211>149

<212>PRT

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>5

Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp

1 5 10 15

Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp

20 25 30

Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn

35 40 45

Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu

50 55 60

Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu

65 70 75 80

Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu

85 90 95

Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn

100 105 110

Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu

115 120 125

Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met

130 135 140

Glu Ser Val Arg Asn

145

<210>6

<211>41

<212>PRT

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>6

Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys

1 5 10 15

Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys

20 25 30

Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

35 40

<210>7

<211>111

<212>PRT

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>7

Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys

1 5 10 15

Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys

20 25 30

Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile

35 40 45

Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr

50 55 60

Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp

65 70 75 80

Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser

85 90 95

Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala

100 105 110

<210>8

<211>51

<212>PRT

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>8

Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His

1 5 10 15

His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr

20 25 30

Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro

35 40 45

Arg Ile Ala

50

<210>9

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

agcaaaagca gg 12

<210>10

<211>351

<212>PRT

<213>禽流感病毒

<400>10

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala

340 345 350

<210>11

<211>1542

<212>DNA

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>11

agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca acatcatggc gtctcaaggc 60

accaaacgat cttatgaaca gatggaaact ggtggagaac gccagaatgc cactgagatc 120

agggcatccg ttggaagaat ggttggtgga attgggaggt tttacataca gatgtgcact 180

gaactcaaac tcagcgacca ggaaggaagg ttgatccaga acagtataac aatagagaga 240

atggttctct ctgcatttga tgaaaggagg aacaggtacc tagaggaaca tcccagtgcg 300

gggaaggacc cgaagaagac cggaggtcca atctaccgaa gaagagacgg gaaatgggtg 360

agagagctga ttctgtatga caaagaggag ataaggagaa tttggcgcca agcgaacaat 420

ggagaagacg caactgctgg tctcactcac atgatgatct ggcattccaa cctaaatgat 480

gccacatacc agagaacaag agccctcgtg cggactggaa tggaccccag aatgtgctct 540

ctgatgcaag gatcaaccct cccgaggaga tctggagctg ctggtgcagc aataaaggga 600

gtcgggacga tggtaatgga actaattcgg atgataaagc gaggcattaa tgaccggaac 660

ttctggagag gcgagaatgg acgaagaaca aggattgcat atgagagaat gtgcaacatc 720

ctcaaaggga aatttcaaac ggcagcacaa aaagcaatga tggatcaggt gcgagaaagc 780

agaaatcctg ggaatgctga aattgaagat ctcatttttc tggcacggtc tgcactcatc 840

ctgagaggat ccgtagccca taagtcctgc ttgcctgctt gtgtgtacgg actcgctgtg 900

gccagtggat atgattttga gagggaaggg tactctctgg ttgggataga tcctttccgt 960

ctgcttcaga acagtcaggt cttcagtctc attagaccaa aagagaattc agcacataaa 1020

agtcaattgg tatggatggc atgccattct gcagcatttg aggacctgag agtctcaagt 1080

ttcattagag gaacaagagt aatcccaaga ggacaactat ccactagagg agttcagatt 1140

gcttcaaatg agaacgtgga agcaatggac tccagcactc ttgaactgag aagcagatat 1200

tgggctataa ggaccaggag tggaggaaac accaaccaac agagagcatc tgcaggacaa 1260

atcagtgtac agcccacttt ctcagtacag agaaatcttc ccttcgaaag agtgaccatt 1320

atggccgcgt ttaaggggaa taccgagggc agaacatctg acatgaggac tgaaatcata 1380

agaatgatgg aaagtgccag accagaagat gtgtctttcc aggggcgggg agtcttcgag 1440

ctctcagacg aaaaggcaac gaacccgatc gtgccttcct ttgacatgag taatgaagga 1500

tcttatttct tcggagacaa tgcagaggaa tatgacaatt ga 1542

<210>12

<211>1496

<212>DNA

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>12

atggcgtctc aaggcaccaa acgatcttat gaacagatgg aaactggtgg ggaacgccag 60

aatgctactg agatcagggc atctgttggg agaatggtta gtggcattgg gaggttctac 120

atacagatgt gcacagaact caaactcagt gactatgaag ggaggctgat ccagaacagc 180

ataacaatag agagaatggt actctctgca tttgatgaaa gaaggaacag atacctggaa 240

gaacacccca gtgcgggaaa ggacccgaag aagactggag gtccaattta tcggaggaga 300

gacgggaaat gggtgagaga gctaattctg tacgacaaga ggagatcagg aggatttggc 360

gtcaagcgaa caatggagag gacgcaactg ctggtcttac ccacctgatg atatggcatt 420

ccaatctaaa tgatgccaca tatcagagaa cgagagctct agtgcgtact ggaatggacc 480

caaggatgtg ctctctgatg caagggtcaa ctctcccgag gagatctgga gctgccggtg 540

cagcagtaaa gggggtaggg acaatggtga tggagctgat tcggatgata aaacgaggga 600

tcaacgacgc caatttctgg agaggcgaaa atggaagaag aacaaggatt gcatatgaga 660

gaatgtgcaa catccttaaa gggaaattcc aaacagcagc acaaagagca atgatggatc 720

aagtgcgaga gagcagaaat cctgggaatg ctgaaattga agatctcatt tttctggcac 780

ggtctgcact catcctgaga ggatcagtgg cccataagtc ctgcttgcct gcttgtgtgt 840

acggacttgc agtggccagt ggatatgact ttgagagaga agggtactct ctggttggaa 900

tagatccttt ccgcctgctt caaaacagcc aggtctttag tctcattaga ccaaatgaga 960

atccagcaca taagagtcaa ttagtgtgga tggcatgcca ctctgcagca tttgaggacc 1020

ttagagtctc aagtttcatc agagggacaa gagtggtccc aagaggacag ctatccacca 1080

gaggggttca aattgcttca aatgagaaca tggaggcaat ggactccaac actcttgaac 1140

tgagaagcag atattgggct ataagaacca gaagcggagg aaacaccaac cagcagaggg 1200

catctgcagg acagatcagc gttcagccca ctttctcggt acagagaaac cttcccttcg 1260

aaagagcgac cattatggca gcatttacag gaaatactga gggcagaacg tctgacatga 1320

ggactgaaat cataagaatg atggaaagtg ccagaccaga agatgtgtca ttccaggggc 1380

ggggagtctt cgagctctcg gacgaaaagg caacgaaccc gatcgtgcct tcctttgaca 1440

tgaataatga aggatcttat ttcttcggag acaatgcaga ggagtatgac aattaa 1496

<210>13

<211>759

<212>DNA

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>13

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcgcagaa acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatctcgag 120

gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg 180

ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240

cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat 300

aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca 360

accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgaccacg 420

gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg 480

tctcacagac agatggcaac tatcaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtg 540

ctggccagca ctacagctaa ggctatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagcg 600

gaagccatgg agatcgctaa tcaggctagg cagatggtgc aggcaatgag gacaattggg 660

actcatccta actctagtgc tggtctgaga gataatcttc ttgaaaattt gcaggcctac 720

cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtga 759

<210>14

<211>982

<212>DNA

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>14

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcgcagaa acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatctcgag 120

gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg 180

ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240

cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat 300

aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca 360

accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgaccacg 420

gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg 480

tctcacagac agatggcaac tatcaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtg 540

ctggccagca ctacagctaa ggctatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagcg 600

gaagccatgg agatcgctaa tcaggctagg cagatggtgc aggcaatgag gacaattggg 660

actcatccta actctagtgc tggtctgaga gataatcttc ttgaaaattt gcaggcctac 720

cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtgat cctattgttg ttgccgcaaa 780

tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtcttttct tcaaatgcat 840

ttatcgtcgc cttaaatacg gtttgaaaag agggcctgct acggcagggg tacctgagtc 900

tatgagggaa gagtaccggc aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960

tgtcaacata gaattggagt aa 982

<210>15

<211>1350

<212>DNA

<213>禽流感病毒(H5N1)

<400>15

atgaatccaa atcagaagat aataaccatc ggatcaatct gtatggtaac tggaatagtt 60

agcttaatgt tacaaattgg gaacatgatc tcaatatggg tcagtcattc aattcacaca 120

gggaatcaac accaatctga accaatcagc aatactaatt tgcttactga gaaagctgtg 180

gcttcagtaa aattagcggg caattcatct ctttgcccca ttaacggatg ggctgtatac 240

agtaaggaca acagtataag gatcggttcc aagggggatg tgtttgttat aagagagccg 300

ttcatctcat gctcccactt ggaatgcaga actttctttt tgactcaggg agccttgctg 360

aatgacaagc actccaatgg gactgtcaaa gacagaagcc ctcacagaac attaatgagt 420

tgtcctgtgg gtgaggctcc ctccccatat aactcaaggt ttgagtctgt tgcttggtca 480

gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg ttgacaattg gaatttctgg cccagacaat 540

ggggcggtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag acactatcaa gagttggagg 600

aacaacatac tgagaactca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggttc ttgctttact 660

gtaatgactg acggaccaag taatggtcag gcatcacata agatcttcaa aatggaaaaa 720

gggaaagtgg ttaaatcagt cgaattggat gctcctaatt atcactatga ggaatgctcc 780

tgttatcctg atgccggcga aatcacatgt gtgtgcaggg ataattggca tggttcaaat 840

cggccatggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtatcaaa taggatatat atgcagtgga 900

gttttcggag acaatccacg ccccaatgat ggaacaggta gttgtggtcc ggtgtcctct 960

aacggggcag gtggggtaaa agggttttca tttaaatacg gcaatggtgt ctggatcggg 1020

agaaccaaaa gcactaattc caggagcggc ttcgaaatga tttgggatcc aaatgggtgg 1080

actgaaacgg acagcagctt ttcagtgaaa caagatatcg tagcaataac tgattggtca 1140

ggatatagcg ggagttttgt ccagcatcca gagctgacag gactagattg cataagacct 1200

tgtttctggg ttgagttgat cagagggcgg cccaaagaga gcacaatttg gactagtggg 1260

agcagcatat ctttttgtgg tgtaaatagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1320

gctgagttgc cattcaccat tgacaagtag 1350

Claims

1.包含异源核酸的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)在制备药物特别是疫苗中的用途，其中所述异源核酸的序列来自甲型流感H5类抗原。

2.如权利要求1所述的用途，其中将所述异源核酸并入MVA基因组的非必需位点。

3.如权利要求2所述的用途，其中将所述异源核酸在缺失III处并入MVA的基因组。

4.如权利要求1-3所述的用途，其中所述异源核酸受痘苗病毒启动子或正痘病毒启动子或痘病毒特异性启动子的调控。

5.如权利要求1-4所述的用途，其中所述异源核酸的序列选自H5N1、H5N3、H5N2、H5N7、H7N1、H7N7、H7N3以及H9N2的序列。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述异源核酸的序列来自H5N1，且选自具有以下称谓的毒株：A/越南/1203/04、A/越南/1194/04、A/越南/3046/04、A/香港/156/97、A/香港/212/03、A/香港/213/03、A/印度尼西亚/5/05、A/Ck/印度尼西亚/BL03/03、A/苍鹭/HK/793.1/02、A/红嘴鸥/HK/12.1/03、A/Dk/越南/11/04、A/Ck/越南/33/04、A/Ck/越南/C-58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06、A/Ck/HK/947/06。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述的H5N1异源核酸序列是毒株A/越南/1194/04、A/印度尼西亚/5/2005、A/斑头雁/青海/1A/2005、A/大天鹅/蒙古/244/2005、A/火鸡/土耳其/1/2005以及A/安徽/1/2005的异源核酸序列。

8.如权利要求1-7所述的用途，其中所述异源核酸的序列包括血凝素基因的1-1500位核苷酸、1-1100位核苷酸或40-1100位核苷酸的序列或所述序列的部分。

9.如权利要求6或7所述的用途，其中所述核酸包括HA1和HA2亚基。

10.如权利要求6-9所述的用途，其中所述核酸编码以下来源的两个或多个序列：

a.单一H5N1毒株的不同基因或所述不同基因的部分，和/或

b.不同的H5N1毒株。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述两个或多个序列编码血凝素或血凝素的一部分且来源于A/越南/1203/04、A/越南/1194/04、越南/3046/04、A/斑头雁/青海/1A/2005、A/大天鹅/蒙古/244/2005、A/火鸡/土耳其/1/2005以及A/安徽/1/2005和/或A/IND/5/05。

12.包含异源核酸的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中：

a.将所述异源核酸并入MVA基因组的非必需位点，

b.所述异源核酸受痘苗病毒启动子、正痘病毒启动子或痘病毒特异性启动子的调控，以及

c.所述异源核酸选自编码来自甲型流感病毒H5类的基因或基因的一部分的核酸。

13.如权利要求12所述的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中所述异源核酸选自H5N1、H5N3、H5N2、H5N7、H7N1、H7N7、H7N3和H9N2的基因组序列。

14.如权利要求13所述的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中所述异源核酸来自H5N1，且选自具以下称谓的毒株：A/越南/1203/04、A/越南/1194/04、A/越南/3046/04、A/香港/156/97、A/香港/212/03、A/香港/213/03、A/印度尼西亚/5/05、A/Ck/印度尼西亚/BL03/03、A/苍鹭/HK/793.1/02、A/红嘴鸥/HK/12.1/03、A/Dk/越南/11/04、A/Ck/越南/33/04、A/Ck/越南/C-58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06、A/Ck/HK/947/06。

15.如权利要求14所述的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中所述H5N1的异源核酸选自毒株A/越南/1194/04、A/印度尼西亚/5/2005、A/斑头雁/青海/1A/2005、A/大天鹅/蒙古/244/2005、A/火鸡/土耳其/1/2005以及A/安徽/1/2005。

16.如权利要求15所述的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中所述异源核酸的序列包括血凝素基因的序列或所述序列的部分。

17.如权利要求16所述的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中所述核酸包括HA1和HA2亚基。

18.如权利要求12-16所述的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中所述核酸编码以下来源的两个或多个序列：

a.单一H5N1毒株的不同基因或所述不同基因的部分，和/或

b.不同的H5N1毒株。

19.如权利要求18所述的重组改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)，其中所述两个或多个序列编码血凝素或血凝素的一部分，且选自以下来源的序列：A/越南/1203/04、A/越南/1194/04、A/越南/3046/04、A/香港/156/97、A/香港/212/03、A/香港/213/03、A/印度尼西亚/5/05、A/Ck/印度尼西亚/BL03/03、A/苍鹭/HK/793.1/02、A/红嘴鸥/HK/12.1/03、A/Dk/越南/11/04、A/Ck/越南/33/04、A/Ck/越南/C-58/04、A/Dk/TH/D4AT/04、A/Gs/TH/G7CS/04、A/Dk/FJ/1734/05、A/Ck/GX/463/06以及A/Ck/HK/947/06。

20.编码如权利要求12-19中任一项所述的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)的核酸。

21.将如权利要求12-20中任一项所述的重组MVA导入靶细胞的方法，包括用如权利要求16-25中任一项所述的重组MVA感染所述靶细胞。

22.免疫包括人在内的有生命的动物体的方法，所述方法包括给予需要免疫的所述包括人在内的有生命的动物体治疗有效量的权利要求16-20所述的MVA。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述免疫可以是预防性的和/或治疗性的。