KR20120096874A

KR20120096874A - 재조합 변형된 백시니아 앙카라 바이러스에 기반한 보편적 인플루엔자 백신

Info

Publication number: KR20120096874A
Application number: KR1020117030091A
Authority: KR
Inventors: 라제쉬 제인; 비렌데르 쿠마르 비나야크; 니디 슈클라; 니라즈 아가왈; 라잔 메타
Original assignee: 파나세아 바이오테크 리미티드
Priority date: 2009-05-18
Filing date: 2010-05-17
Publication date: 2012-08-31
Also published as: CA2762044A1; EP2432503A1; JP2012527232A; EP2432503A4; EP2550974A3; WO2010134094A9; CN102740880A; AR076690A1; US20120141525A1; EA201171436A1; EP2550974A2; MX2011012312A; BRPI1011034A2; WO2010134094A1; AU2010250780A1; CL2011002913A1

Abstract

본 발명은 신규 인플루엔자 백신, 이것을 제조하기 위한 신규 플라스미드 및 이것을 포함하는 신규 제형에 관한 것이다. 본 발명은 특히 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 조류 인플루엔자 바이러스로부터 적어도 4개의 외래 유전자의 카세트를 포함하고 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스에 관한 것이며, 상기 유전자는 MVA 게놈내에서 비-필수 자리에 삽입되고, 단, 적어도 하나의 외래 유전자는 PB2 또는 M2e 중 하나이다. 본 발명은 또한 조성물 및 보편적 인플루엔자 백신의 제조방법을 제공한다.

Description

재조합 변형된 백시니아 앙카라 바이러스에 기반한 보편적 인플루엔자 백신{UNIVERSAL INFLUENZA VACCINE BASED ON RECOMBINANT MODIFIED VACCINIA ANKARA VIRUS}

본 발명은 신규의 보편적 인플루엔자 백신 및 그것을 포함하는 신규 제형에 관한 것이다. 본 발명은 특히 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스의, 바람직하게는 하나의 카세트에서 외래 유전자의 신규 조합을 포함하고 발현시킬 수 있는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae) 과에 속하고 3가지의 속(genera) A, B 및 C로 나누어진다. 인플루엔자 A 바이러스는 포유동물 뿐만 아니라 조류를 감염시킬 수 있는 반면, 인플루엔자 B 및 C 바이러스는 단지 사람만을 감염시킬 수 있다. 이것들은 8개의 단일-가닥 네거티브 RNA 절편으로 만들어지는 분절된 게놈을 가지는 외피보유 바이러스(enveloped viruses)이다. 물새들은 인플루엔자 A 바이러스의 자연 보균자이다(Webster et al., 1992). 이들 바이러스는 종의 장벽을 초월하고, 일시적인 감염을 야기하거나 사람을 포함하는 포유동물에서 영구적인 계통을 확립하는 것으로 알려져 있다(Ludwig et al., 1995). 20세기의 가장 파괴적인 독감 바이러스인, 1918년의 스페인 독감 유행(H1N1), 1957년에 조류 독감 유행(H2N2) 및 1968년에 홍콩 독감 유행(H3N2)은 모두 조류 기원이다(Lipatov et al, 2004).

흔히 "조류 독감"으로 불리는 것을 야기하는, 서브타입 H5N1의 매우 병원성인 조류 인플루엔자 바이러스는 매우 전염성이고, 가금류에서 치명적인 병원균이다. 2003년 후반 이래로, H5N1은 가금류에서 유행성 질병 수준에 도달하였고, 전세계의 거의 절반을 쓸어버렸다. 그러나, 사람 모집단에 전파는 지금까지는 제한적이었다. 사람에서 H5N1 감염의 첫 번째 경우가 홍콩에서 1997년에 보고되었다(Claas et al., 1998; Subbarao et.al., 1998). 태국에서 직접적인 사람-대-사람 전염을 나타내는 한번의 보고가 있지만, 지금까지 보고된 거의 모든 경우에 증거는 조류-대-사람 전염을 나타낸다(Ungchusak et al, 2005).

인플루엔자 유행은 HA/NA 또는 두 유전자 모두에서 주된 변화가 현재 사람에서 순환하지 않는 새로운 인플루엔자 A 서브타입의 형성을 야기하는 것을 의미하는, "항원대변이(antigenic shift)"에 의해 야기된다. 혈구응집소(HA)는 숙주 세포 수용체에서 결합을 초래하며, 중요한 단백질 중 하나인 주된 바이러스 단백질인데, 이것의 변화는 사람에서 감염을 확립하기 위해 H5N1 바이러스에 대해 생겨야 한다(Gambaryan et al., 2006; Stevens et al .2006; Yamada et al., 2006). 이후에, 돌연변이는 바이러스에 대해 바이러스 폴리머라아제 복합체의 단백질에서 일어나야 하고, 따라서 감염은 영구화될 수 있다(Almond, 1977; Subbarao et al., 1993; Hatta et al., 2001; Maines et al, 2005; Li Z et al, 2005; Subbarao et al, 1998; Katz et al, 2000). 사람에서 복제 가능성과 결합된 H5N1 바이러스의 수용체 특이성의 변화 또는 이미 순환하는 사람 인플루엔자 바이러스와의 재교배가 일어난다면, 영구적인 사람 혈통의 확립은 제외될 수 없다. 새로운 인플루엔자 유행의 떠오르는 위험이 있다면, 유행 전 방어를 위한 수단을 사용하는 것도 일리가 있다. 이는 효과적인 백신을 개발하기 위한 노력을 포함한다. 독감에 대한 현재 백신은 비경구 경로로써 또는 비강내 경로로써 사용된다.

비경구 인플루엔자 백신

1940년대에 감염된 발육란(embryonated egg)으로부터 불활성화된 바이러스 물질을 함유하는 불활성화된 인플루엔자 백신의 도입 이래로, 노인에게서 감염의 위험 및 과정뿐만 아니라 사망률이 떨어졌다. 3부류의 불활성화 백신이 있다: 전체, 스플리트(에테르 또는 트리부틸 포스페이트에 의해 화학적으로 방해됨) 및 서브유닛(정제된 표면 글리코단백질). 이 백신들은 근육 내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 전체 불활성화된 인플루엔자 백신은 높은 수준의 부작용 때문에 현재 사용되지 않는다. 계절적 인플루엔자 백신(스플리트 및 서브유닛)은 3가이며, H3N2, H1N1 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스의 균주 각각을 포함한다. 지난 수년에 걸쳐, 성분들 중 적어도 하나는 항원대변이 때문에 매년 변화되어야 했다. BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품들은 스플리트 백신이다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 서브유닛 백신이다. 불활성화 인플루엔자 백신은 이환율과 사망률을 예방하는데 60% 내지 100% 효과적이지만, 영아와 노인에게서 더 낮은 비율의 효능이 관찰된다.

2003년 6월에, FDA는 5-17세의 건강한 어린이와 청소년 및 18-49의 건강한 성인에서 계절적 인플루엔자에 대해 Medimmune Inc.에 의해 개발된 저온적응 약독된 인플루엔자 생바이러스 백신, Flumist™의 사용을 승인하였다.

최근의 연구들은 독성을 약화시키기 위해 변형된 유전자들을 함유하는 백신 균주를 만들기 위한 역 유전학 유전자 조작의 사용을 보고하였다(Subbarao etal.2003).

비강내 인플루엔자 백신:

M.L.Clements et al 1986은 이전에 분비형 IgA와 혈청 IgG는 둘다 인플루엔자 바이러스에 대한 면역에 참여한다는 것을 보고하였다. 게다가, 마우스에서, 다수의 공개된 연구들은 인플루엔자 감염에 대한 보호를 위한 호흡 IgA의 중요성을 증명하였다. 인플루엔자에서 국소 IgA 반응을 자극하는 것의 이점은, 혈청 반응보다 더 넓은 특이성이 있고, 따라서 백신에 존재하는 것과 다른 혈구응집소 분자를 소유하는 바이러스에 대해 교차-보호를 제공할 수 있다는 것이 또한 발견되었다. 따라서, 국소 IgA와 혈청 항-혈구응집소 반응을 일으키는 인플루엔자 백신들은 현재 백신에 대해 뛰어난 면역을 제공해야 한다. 그러나, 이전의 점막 노출(예를 들어, 감염)이 없었다면, 비경구 백신접종(근육내, 피하 등)은 국소 IgA 생성을 유발하기에 효과적이지 않다. 점막 면역 시스템을 자극하기 위해서, 백신은 국소적으로 점막 표면에 적용되어야 한다.

인플루엔자 백신의 점막 투여는 전통적인 비경구 면역 섭생 이상의 다수의 이점들을 가진다. 이것들 중에서도 최고는 호흡관의 국소 점막 면역 시스템의 더 효과적인 자극과, 주사와 관련된 두려움과 불편함의 감소 때문에 백신 흡수율이 증가될 가능성이다. 따라서, 점막 인플루엔자 백신을 개발하기 위한 다수의 시도가 있었다. 그러나 불활성화 백신들이 점막에 주어질 때 종종 불량하게 면역원성이라는 단점이 있다. 이 문제점을 극복하기 위해서, 다른 접근들은 경구로 또는 비강내로 주어지는 독감 백신의 면역원성을 개선시키는 것으로 평가된다. 이들 노력 중 일부는 면역증강제(adjuvant)로서 콜레라 독소(CTB)의 B 서브유닛의 사용, 다양한 마이크로스피어에서 백신의 캡슐화, 및 약독된 생 인플루엔자 균주의 사용을 포함한다.

계절적 독감에 대해 상업적으로 이용가능한 비강내 백신 Flumist는 2003년 9월에 미국에서 출시되었다. Medlmmune의 FluMist는 5 내지 49세의 환자에게 비강 스프레이에 의해 투여되는 약독된 생백신이다. 이 백신은 "위험에 있는" 모집단에서 용도로 허가되지 않았다. 이 백신에 대한 바이러스는 또한 발육 계란에서 성장되고, 비강 스프레이에 의해 전달되는 약독된 생 조제물이다. 매년 제조될 수 있는 투여량의 제한에 더하여, 이 백신은 인플루엔자로부터 보호가 가장 필요한 영아와 노인 모집단에서의 용도로 허가되지 않는다.

현재 임상적 평가 하에서 비강내 투여를 위한 다수의 다른 후보자 백신들이 있다. 그러나, 이 선행기술 기준들은 항원들의 조합과 본 발명에 따르는 과정을 약간조차도 제안하지 않는다. GlaxoSmithKline Pharmaceuticals에 의한 특허 번호 EP1214054B1은 특히 사균 스플리트, 비강내 인플루엔자 백신에 관한 것이다. Sanofi Pasteur는 Avant Immunotherapeutics와 공동 작업하여 비강내 인플루엔자 백신의 개발을 위한 Micromer 전달 시스템을 사용한다. Micromer는 백신의 마이크로 캡슐화 및 점막 전달을 위해 폴리포스파젠을 이용하는 수성폴리머이다. 현재 이것은 임상전 단계이다. Symbigene Inc.에 의한 특허 번호 WO2003063785는 인플루엔자의 잠재적 치료를 위한 재조합 효모 기반 백신을 청구한다. 이 백신은 경구 또는 비강내로 투여될 수 있다. 백신의 임상전 연구는 미국에서 계속 진행중이다. Acambis는 인플루엔자 예방에 대한 평가하에 있었던 비강내 백신의 개발을 중단하였다. 백신은 불활성화된 인플루엔자 항원과 키토산을 혼입하였다. Biovector 전달 기법을 사용하여 인플루엔자에 대한 비강내 점막 백신을 개발하기 위한 Biovector Therapeutics의 프로그램은 중단되었다. BioSante Pharmaceuticals는 H5N1 인플루엔자 바이러스 감염의 치료를 위해, BioSante의 칼슘 포스페이트 나노입자 기반 백신 면역증강제와 조합된 인플루엔자 바이러스의 H5N1 균주로부터 항원을 함유하는 주사 가능하지 않은 비강내 백신을 개발한다. NanoBio Corporation은 NB006, 인플루엔자에 대한 점막 백신을 개발한다. NB006의 임상전 연구는 계속 진행중이고 IND(investigational new drug)는 2007년 1사분기에 제출되었다. 제I상 시험은 2007년의 4사분기에 시작되었다. Archimedes Pharma(이전에 West Pharmaceutical Services Inc.)에 의한 특허번호 US7323183은 이 회사의 소유의 ChiSys 비강 전달 기술을 사용하는, 인플루엔자에 대해 표적화된 백신에 관한 것이다. 영국에서 수행된 제I상 평가(West, 2004년 3월)는 완료되었다. Green Hills Biotechnology (GHB)에 의한 PCT 출원 WO2009007244는 FluVacc, 약독된 복제결함 인플루엔자 생바이러스 백신을 다룬다. 이 백신은 병원성 인자 NS1이 없으며, 베로세포에서 만들어지고, 스프레이 장치에 의해 비강내로 투여된다. FluVacc의 제I상 시험은 오스트리아에서 시작되었다. ID Biomedical Corp.는 인플루엔자의 잠재적 치료를 위한 비강내 백신, FluINsure를 개발 중이다(특허 번호 US6743900). 백신은 혈구응집소를 포함하는 인플루엔자 단백질의 정제된 제제와 조합하여, ID Biomedical 소유의 백신 전달/면역증강제 기술, Proteosomes을 기반으로 한다. 제I상 연구는 사람에서 그것의 비강 프로테오좀 인플루엔자 백신의 안전성과 면역원성을 연구하기 위해서 캐나다에서 시작되었다. NasVax Ltd.는 CCS, 그것 소유의 다양이온성 액체 기법을 이용하는 인플루엔자의 예방을 위한 백신을 개발 중이다. CCS는 면역증강제로서 작용하고, 또한 백신의 비강내 투여를 허용한다. 140명의 건강한 지원자에서 제I/II상 시험은 이스라엘에서 완료되었고, 이 회사는 2007년 중반기에 유럽 제III상 시험을 시작하기 위한 적용 탐구 승인서(application seeking permission)를 제출하는 것을 계획하였다. BioDiem Ltd.는 계절적 인플루엔자 바이러스 감염을 위해, 비강내로 전달된 1회 투여량의, 저온 적용된 약독된 인플루엔자 생바이러스 백신을 개발 중이다. 이 백신은 러시아 상트 페테르부르크의 실험의학협회(Institute of Experimental Medicine)에 의해 1993년 이래로, 러시아와 CIS에서 시판된 백신을 기반으로 한다. 이 백신의 임상전 평가는 유럽과 미국에서 계속 진행중이다.

H5N1 백신을 개발하기 위한 노력:

Medimmune Inc.는 저온적응된 H5N1 백신을 개발 중이다. Medlmmune사는 역유전학 및 고전적인 재교배와 같은 방법들을 사용하여, 전염 가능성이 있는 혈구응집소 유전자를 약독된 사람 독감 바이러스에 넣는다. Medlmmune Inc. 연구 팀은 악성 H5N1 독감 바이러스로부터 유래된 변형된 단백질들을 역유전학을 사용하여 인공적으로 약화된(약독된) 독감 균주로부터의 단백질과 조합함으로써 3가지의 후보자 백신들을 만들었다. 1997년과 2003년에 홍콩, 및 2004년에 베트남(A/Vietnam/ 1203/04)에서 사람의 경우로부터 악성 H5N1 바이러스를 분리하였다. 또한 Medlmmune의 FluMist? 인플루엔자 백신에 대한 기초로서 작용하는 약독된 인플루엔자 백신 균주는 계속해서 더 차가운 온도에서 실험실-성장하여, 결과 백신 바이러스가 상대적으로 차가운 상부 호흡관을 넘어서 퍼지도록 초래하는 것을 방지한다. 많은 양의 결과의 저온-적응된 바이러스가 계란에서 성장하였다. 2006년 6월에, Medlmmune사는 약독된 H5N1 생백신의 안전성과 면역원성을 평가하기 위해 제1상 사람 지원자 연구를 시작하였다. 연구로부터 결과는 아직 이용가능하지 않다. (www.medicalnewstodav.com/articles/51701.php)

2007년 4월 Sanofi Pasteur에 의해 도입된 USFDA 허가 H5N1 백신은 불활성화된 백신이고 응급의 경우에만 사용되도록 의도된다 (www.fda.gov/bbs/topics/NEWS). Sanofi Pasteur에 의해 사용된 재교배 후보자 백신 균주 NIBRG-14는 역유전학을 사용하여 이 균주를 개발한 영국의 NIBSC(National Institute for Biological Standard)로부터 얻었다. Sinovac Biotech Ltd. (중국)는 영국의 NIBSC(National Institute for Biological Standard)로부터 얻은 재교배 후보자 백신 균주 NIBRG-14를 사용하여 불활성화된 H5N1 백신을 개발중이다(www.medicalnewstoday.com/articles/51392.php). 바이러스는 난 중에서 성장하고, 불활성화 후 면역증강제와 함께 주어진다. 이 백신은 제II상 임상 시험 중이다(//www.bio-medicine.org/medicine-technology-1). 이탈리아의 Chiron Vaccines/Novartis Vaccines는 Vietnam 2004 균주를 사용하여 난 기반 MF59 면역증강된 불활성화 백신을 개발중이다. Chiron Corporation은 그것의 시판 인플루엔자 백신 Fluvirin에 대해 사용된 동일한 생산 공정을 사용하여 백신을 만들 것이다. 백신의 제II상 임상 시험을 2006년에 끝냈다(www.ifpma.org/Influenza/content/pdfs/Table Avian Pandemic Influenza RnD 17 Oct06.pdf). DelSite Biotechnologies Inc.는 그것 소유의 GelVac 전달 시스템을 사용하여 H5N1 바이러스 균주에 대해 불활성화된, 비강 분말 백신을 개발 중이다. Gel Vac 비강 분말 백신 전달 시스템은 백신 항원의 조절된 방출과 증가된 비강 체류 시간을 야기하는, 이 회사의 GelSite 폴리머 기술인, 비강 유체와 접촉 시 분말에서 겔로 바뀌는 신규 다당류를 기반으로 한다. DelSite Biotechnologies Inc는 Invitrogen Corporation의 PD-Direct 서비스와 협력하여 비강 전달을 위해 사용되는 세포 기반 H5N1 전체 비리온 항원을 가능하게 하는 과정을 개발한다.(www.biospace.com/news_story.aspx?NewsEntitvId=34335)

현재 백신의 제한:

불활성화/스플리트/저온 적응된 백신의 많은 제한이 있다 - 주된 제한은 순환하는 균주에 의존하여 후보자 균주가 그때 매년 변경되어야 한다는 것이다. 추가로, 확인 균주는 발육란에서 높은 역가로 성장하도록 채택되어야 한다. 후자의 사용은 특정 검사, 예컨대 고품질의 특이적 무 병원균 난의 연중 계속되는 공급의 이용가능성을 야기한다. 난 내의 우연한 약제의 존재가 인플루엔자 바이러스 백신의 제조를 위태롭게 할 수 있기 때문에 이러한 난의 사용은 필수이다. 조류에서 독감 유행의 경우에, 인플루엔자 바이러스를 배양하기 위해 특이적 무 병원균 난의 공급은 드물게 되었다. 이는 사람 역경에서 사용을 위한 백신의 이용가능성에 영향을 미친다. 추가적으로, 난 단백질에 기인하는 과민반응이 중요한 모집단에서 일어난다. 포르말린에 의한 바이러스의 불활성화는 또한 항원성 에피토프의 변성을 야기하고, 따라서 덜 효율적으로 될 가능성이 있다. 게다가, 국소 IgA 및 세포독성 T 세포 반응을 유발하는 제한된 능력 때문에 이 백신들의 효능은 차선이다. 따라서 전통적인 스플리트/서브유닛 백신의 보호 효과는 매우 제한된다.

대안의 인플루엔자 백신:

현재 제조되는 인플루엔자 백신의 단점들을 완화하기 위한 노력에서, 백신을 만들기 위한 몇몇 대안적인 접근들이 현재 개발되고 있다.

세포 배양물 기반 백신:

세포 배양물 기반 시스템의 사용은 아마도 조사가 가장 많이 추구된 영역이다. 시험 되어야 하는 2가지의 주된 셀 라인은 MDCK (Palache etal., 1999) 및 Vero (Halperin etal. 2002 및 Nicolson, 2005)이다. Baxter International Inc.는 2007년에 그것의 H5N1 (A/Vietnam/1203/04) 불활성화된 전체 세포 백신의 제III상 임상 시험을 시작하였다. 이는 바이러스의 배양을 위해 그것의 소유의 Vero 세포 기술을 사용한다(www.medicalnewstoday.com/articles/66602.php). 백신에서 사용을 위한 이들 세포에서 성장된 바이러스의 불활성화 과정은 난 생성 바이러스로 사용된 것과 같다. 따라서, 바이러스는 또한 항원 상의 에피토프를 손상시킬 가능성이 있는 화학물질로 불활성화된다. 세포 배양물 방법의 사용이 발육란의 사용을 회피하는 반면, 본 과정에서 유사점에 기인하여 전통적으로 생성된 난 백신의 제한에 따라서 새로운 규제의 난관이 있다(우연한 약제의 클리어런스).

재조합 백신:

인플루엔자 바이러스의 HA 및 NP를 암호화하는 DNA 백신은 마우스 시험감염(challenge) 모델에서 평가되었다(Williams et al., 2002; Kemble and Greenberg, 2003). NP 유전자를 암호화하는 DNA로 백신접종은 이종성 인플루엔자 균주에 의한 시험감염으로부터 보호를 야기하였다(Montgomery et al., 1993). 상동 바이러스 시험감염으로부터 보호는 HA를 암호화하는 DNA로 백신접종 후 마우스에서 수행되었다. DNA로 백신접종에 의해 유발된 항체 반응들은 마우스에서 오래가는 역가를 야기하였다(Ulmer etal., 1993). 미국 특허 4,357,421호는 주어진 특이적 인플루엔자 vRNA의 이중-가닥 상보적 DNA(cDNA) 복제물이고, 유전자 조작된 박테리아 플라스미드에 삽입되어 삽입 DNA를 통한 번역과 인플루엔자 백신으로서 작용할 폴리펩티드의 발현을 보장하는 합성 인플루엔자 혈구응집소 유전자의 생성을 개시한다.

DNA 백신은 난 또는 포유동물 세포 배양물에 명백하게 의존하지 않는다. 그러나, 대부분의 연구들은 마우스에서만 유망한 결과를 나타내었다(Montgomery etal., 1993; Ulmer etal., 1993; and Williams etal., 2002). 더 큰 동물들에서 믿음직한 결과의 보고는 매우 찾기 힘들다. 마우스에서 제대로 작용한 M2-NP DNA는 돼지 모델에서 시험감염 후 질병을 더욱 악화시켰다(Heinen etal. 2002). 인플루엔자에 대한 DNA 백신에 대해 가능성이 존재하는 반면, 백신접종에서 이 접근들에 의해 지속될 문제인 안전성 문제가 여전히 존재한다. DNA 기반 백신의 일부 예는 하기와 같다:

● VGX는 VGX-3400을 개발하였다, 가변 인플루엔자 HA 유전자를 표적화하는 DNA 기반 보편적 독감 백신: NA 및 M2e-NP 유전자의 상보적 영역에 따라 [H1, H2, H3, 및 H5 (조류)]. 모든 구성체는 SynCon™ 기술을 사용하여 만들어졌다. 임상전 평가를 University of Pennsylvania (USA)에서 시작하였고 IND 적용을 2008년 5월에 제출하였다.

● Vical에 부여된 특허 WO2005116270은 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스 A/Vietnam/1203/04의 혈구응집소 유전자를 함유하는 DNA 백신 및 돌연변이 -- 핵단백질, NP 및 기질 단백질, 또는 M2e를 받지 않는 유전자를 개시한다. Vicals의 VAXFECTIN 기술을 사용하여 조제된다. 2007년 8월에, Vical은 미국에서 건강한 지원자들에게 백신의 제I상 시험을 시작하였다. 이 특허는 유전자 구성체에서 PB2 유전자의 사용을 제안하지 않는다.

● Novartis는 그것 소유의 약물 전달 기술을 사용하여 인플루엔자의 예방을 위한 유전자 기반 백신을 개발 중이다(이 기술은 PowderJect에 의해 이전에 개발된 것이다. 이는 유전자 물질로 코팅된 입자들을 표적안으로 가속화하기 위한 가스 구동 장치를 가진다, 특허 US5865796). 백신은 가변 및 상보적 유전자 항원을 모두 암호화하는 다벡터 전략을 이용할 것이다. 이는 현재 임상전 단계에 있다.

● Pfizer에 부여된 특허 WO2005035771는 포유동물 숙주 세포에서 이종성 암호화 서열의 향상된 발현을 제공하는 핵산 구성체들(벡터들)을 다룬다(앞서 PowderMed에 의해 개발된 것). Pfizer는 계절적 인플루엔자 바이러스 감염의 예방을 위해 DNA 기반 백신, PF 4522625를 개발 중이다. 이 백신은 PowderMed의(현재 Pfizer 소유) 백신 벡터, pPJV1671으로 클로닝된 A/Panama/2007/99 인플루엔자 균주로부터의 HA 유전자를 포함하고, PowderMed의(현재 Pfizer 소유) 소유인 무 바늘 입체 매개 표피 전달 시스템을 사용하여 투여되도록 설계된다. 제I상 평가는 진행중이다. 제한은 백신이 HA 유전자만을 함유한다는 것이다.

● Dynavax Tech Corp에 부여된 특허 US7479285는 보편적 인플루엔자 백신을 개시한다. 면역촉진 폴리뉴클레오티드와 함께 다른 항원을 투여함으로써 한 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법이 존재한다. 백신은 면역촉진 DNA 서열(ISS)을 중요한 인플루엔자 항원 뉴클레오단백질(NP), 즉, 매년 바이러스 균주들 사이에서 거의 변하지 않는 항원에 연결한다. NP-ISS는 매트릭스 단백질 2, M2e의 세포 밖 도메인에 연결된다. 임상전 연구들이 미국에서 진행중이다.

● Lipoxen에 부여된 WO2004004758는, 리포솜에 관련 단백질과 함께 플라스미드 DNA를 혼입하는 이 회사 소유의 리포솜 기술, ImuXen을 사용하여 생성되는 인플루엔자 백신을 개시한다. 인플루엔자 백신 리포좀은 동일 입자 내에서 공동-조제되는 인플루엔자 단백질 + 항원의 단백질 형태를 발현시키는 DNA를 함유한다. 각 리포좀이 1가 백신으로서 작용하는 경우, 조제물은 다가 백신 균주의 전달을 가능하게 한다. 임상전 평가는 영국에서 진행 중이다.

재조합 서브유닛 단백질 백신은 다수의 종래 백신에 대해 용액으로서 제안되었다. 재조합 단백질 생성은 모든 백신 성분들의 엄격한 품질 조절과 로트 대 로트(lot-to-lot) 변화의 더 간단한 정량화를 허용한다. 이 기술 기반을 인플루엔자 백신에 대해 조사하였다. E.coli, 효모, 곤충세포 및 포유동물 세포에 기반한 발현 시스템이 이용되었다. 바이러스를 성장시킬 필요가 없기 때문에, 인플루엔자에 대한 재조합 서브유닛 단백질 백신의 개발은 매력적인 선택이다. 재조합 서브유닛 단백질 백신 후보자의 시험에 관해 수많은 연구들이 보고되었고, 사람 임상 시험에 대해 단지 몇 가지가 시험되었다. 2가지의 주된 문제는 재조합 단백질에 기반한 인플루엔자 백신의 개발을 방해하였다. 단백질을 그것의 본래의 형태로 발현시키는 것은 어렵고, 발현 수준 또한 낮다. 예를 들어, 인플루엔자 백신의 주된 성분, HA는 재조합체로서 단백질을 발현시키는 것이 어렵게 된다고 증명되었다. 막 불안정 HA 분자의 Pichia의 발현이 보고되었다(Saelens et al., 1999). 발현된 HA 단백질이 항체 결합에 기반한 적절한 구조를 가지고 마우스의 부분적 보호를 야기하는 반면, 생성물은 자연에서 완전히 균일하지 않다. N-말단은 가변 과정 때문에 변할 수 있고, 글리코실화 패턴은 또한 이종성이다. Pichia 발현된 HA 단백질이 백신 후보자로서 가능성을 가진다는 언급에도 불구하고, 이런 노력이 사람에서 시험을 위해 수행되었는지를 나타내지는 않는다.

배큘로바이러스(baculovirus) 발현 시스템은 또한 재조합 인플루엔자 단백질 백신의 생성을 위한 시스템으로서 조사되었다. 배큘로바이러스 발현 시스템을 사용하는 전장 HA의 발현에서 초기 보고는 곤충 세포의 표면에서 편재된 HA를 초래하였다(Kuroda etal., 1986). 추가 연구는 배큘로바이러스 발현 시스템으로부터 가용성 HA의 발현을 보고하였다(Valandschoot etal., 1996)). 이것은 가용성 배큘로바이러스 발현된 HA를 보고하며, 단백질이 일부 본래와 유사 특성을 가지지만, 주로 응집되어 있었다는 것을 결정하였다. 따라서, 마우스 모델에서 임의의 보호를 제공하지 못했다. Protein Sciences Corporation (PSC Meriden, US patent US6224882)에 의한 개발하에서 재조합 배큘로바이러스 발현된 HA 단백질은 현재까지 가장 진보된 재조합 인플루엔자 단백질 백신을 나타낸다(Flubloc). PSC에 의해 발현된 HA는 전장 분자를 나타내고, 숙주 곤충 세포에서 HA 단백질의 편재화를 초래한다. HA는 막으로부터 추출 후 일련의 단계들을 통해 정제된다. 이 방법에 기반한 H5-HA 백신은 사람의 임상 시험에서 평가되었다(Treanor etal. 2001). 재조합 H5 백신은 높은 용량에서 보통의 면역원성이었다. 이 연구의 결과는 배큘로바이러스-발현된 H5 HA가 H5 바이러스에 노출 전 가지지 않았던 개체에 있는 작용 항체들을 유발할 수 있다는 것을 제안하였지만, 백신의 면역원성을 개선시키기 위한 추가 연구들이 필요하다.

독감 항원들의 바이러스 기반 전달이 또한 조사되었다. University of Pittsburg에 부여된 PCT 출원 WO2006063101는 A/Vietnam/1203/2004 인플루엔자 바이러스로부터 코돈-최적화된 HA 유전자를 발현시키는 E1/E3 결실 아데노바이러스 혈청형-5 기반 벡터를 제공한다. 이는 현재 임상전 단계에 있다. 그러나, 이 구성체는 단지 HA 유전자를 함유한다.

광범위하게 평가된 다른 바이러스 발현 벡터는 백시니아 바이러스이다. WO2008061939 (Paul Ehrlich)는 가장 구체적으로는 H5N1 균주로부터의 인플루엔자 백신을 제조하기 위한 MVA의 사용을 개시한다. 이 발명은 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스의 A/Vietnam/1194/04 균주의 HA, NA, M1, M2 및 NP 유전자를 바람직하게 포함하는 인플루엔자 백신에 속한다. A/Vietnam/1203/04에 대해 청구된다. 바람직한 구체예 중 하나에서, DelIII에서 MVA 내 이종성 유전자 서열은 HA, NA, NP, M1, M2의 임의의 조합일 수 있다. P11 프로모터는 본 발명에서 사용되는 바람직한 프로모터 중 하나이다. 그러나 이 출원은 구성체 내 인플루엔자 폴리머라아제 유전자의 사용을 개시하지 않고, 또한 MVA의 DelIII에서 클로닝되는 모든 유전자의 구체적 개시가 없다.

인플루엔자 백신에 대한 또 다른 접근은 다음을 포함한다:

● 배큘로바이러스 발현 시스템에서 생성된 바이러스-유사 입자(VLP)가 보고되었다(Latham and Galzara, 2001). 이 방법은 현재 Novavax에 의해 소유되는 것이다. Novavax에 부여된 특허 US20070184526는 인플루엔자 M1, HA 및 NA 단백질을 포함하는 VLP 및 그것의 조제물을 다룬다. Novavax는 H5N1 A/Indonesia/05/2005 바이러스에 대한 VLP 기반 백신을 개발하였고, 호의적인 결과를 나타내는 제I/제IIa 사람 임상 시험을 완료하였다.

● Vaxinnate에 부여된 특허 WO2006/069262는 A/Vietnam/1203/04로부터의 M2e 사이의 융합 단백질 및 TLR5 (Toll-유사 수용체 5)에 대한 리간드인 살모넬라 티피쿠리움 플라겔린(Salmonella typhimurium flagellin)(fljB)을 청구한다. 임상전 연구가 미국에서 진행 중이다. 그러나, 백신 면역증강제로서 TLR 작용제의 사용은 적어도 T 세포 반응의 발생에 관해서 실망적이었다.

● Antigen Express에 부여된 특허 US7179645는 혼성 폴리펩티드를 향상시키는 항원 존재와 함께 특이적 인플루엔자 HA(H5N1) 항원들을 발현시키는 단계를 개시한다. 백신은 재조합 H5 혈구응집소 단백질에 대한 T-헬퍼 세포 반응을 준비시키기 위해 사용될 수 있었고 또는 표준 단독 백신으로서 사용될 수 있다. 이것은 현재 임상전 단계에 있다. 제약은 백신이 단지 HA 유전자를 함유한다는 것이다.

● Acambis는 ACAM-FLU-A으로 칭해진 보편적 독감 백신을 개발중이다. 이는 M2e, 이온 채널 단백질 M2e의 세포밖 도메인을 전달하기 위해 B형 간염 코어 단백질을 사용하는 재조합 백신이다. 백신은 Antigenics Inc., QS21 면역증강제를 함유한다. 건강한 피험자에서 백신의 미국 제I상 시험은 2007년 7월에 시작되었다.

● Alphavax Inc.에 부여된 WO2008085557은 동시에 투여된 HA 항원에 대한 면역계의 반응을 향상시키기 위한 알파바이러스 레플리콘 입자(ARP)를 개시한다. AlphaVax는 그것의 알파 백신(알파 바이러스 벡터) 기술을 사용하여 인플루엔자 백신을 개발 중이다. 프로그램 내 백신은 하나의 인플루엔자 균주로부터 혈구응집소 유전자를 함유한다. 이 회사는 인플루엔자에 대해 알파백신을 평가하는 우선적인 몇 가지 임상 시도를 시작하였다. 인플루엔자에 대한 제1 알파백신은 인플루엔자의 A/Wyoming H3N2 균주로부터 혈구응집소 유전자를 함유한다. 이후의 시도들은 인플루엔자의 잠재적으로 유행성인 균주에 대한 추가적인 백신 후보자들을 시험할 것이다.

● VLP Biotech는 보편적 인플루엔자 백신을 개발 중이다. 백신은 그 소유의 VLP 백신 플랫폼과 조합하여 인플루엔자 M2 단백질을 기반으로 한다. 임상전 연구는 미국에서 진행중이다.

● NIAID(National institute of Allergy and Infectious Disease)는 임상전 조사에서, 인플루엔자 A에 의한 감염을 예방하는 백신을 개발 중이다. 백신은 돌연변이 폴리머라아제 염기성 2(PB2) 유전자를 함유하는 약독된 생 재교배 인플루엔자 A 바이러스이다.

● Vaxin Inc.는 비-복제성 아데노바이러스 벡터를 통해 비강 점막에 HA 유전자를 전달하는 비강내 H5N1 독감 백신을 개발 중이다. Vaxin은 아데노바이러스-벡터 백신의 생성을 위한 기질을 제조하기 때문에, 네덜란드 biotechnology사 Crucellⓒ 셀 라인으로부터 허가받은 PER.C6ⓒ 셀라인을 사용한다. 이 H5N1 인플루엔자 백신에 대한 제I상 임상 시험은 완료되었다.(www.curevents.com/vb/showpost php?p=616437&postcount=107) 이러한 아데노바이러스 기반 백신의 제약은 그때 순환하는 균주에 따라서 매년 클로닝된 HA 유전자를 계속해서 변화시키는 것이다. 또한, a) 아데노바이러스는 이종성 DNA를 취하는 제한된 능력을 가지고, 따라서 몇몇 항원들을 수용할 수 없고, b) 아데노바이러스에서 60-80%의 모집단에서 사전에 존재하는 면역력은 아데노벡터화된 벡신의 효능을 제한한다.

모든 이러한 노력에도 불구하고, 그러나, 표면 단백질(HA 및 NA)에 완전히 기반한 종래의 인플루엔자 백신을 핵단백질 또는 기질 단백질과 같은 내부 바이러스 단백질에 기반한 인플루엔자 백신으로 완전히 치환하는 것이 가능할지 여부는 불명확하다. 이는 주로 바이러스 표면 단백질에서 항체들을 중화하는 것이 감염의 확립을 예방하는데 중요한 역할을 하는 반면, 바이러스 내부 단백질에서 세포독성 T 림프구는 이미 감염된 세포를 정화할 것이기 때문이다. 따라서, 백신 구성체에서 바이러스 표면과 내부 단백질을 모두 포함하는 것은 적절할 것이다. 백신 구성체에서 크게 보존된 PB2 항원 사용의 이전의 보고가 있지만, 선행기술은 본 발명의 항원 조합과 과정을 제안하지 않는다. 다음 세대 인플루엔자 백신의 시험감염을 충족시키기 위해, 발명자들은 용이하게 이용가능한 세포 배양물 시스템에서 생성될 수 있는 바이러스 벡터 내에서 표면과 보존된 내부 바이러스 단백질을 조합할 새로운 인플루엔자 백신을 개발하였다. 현재 발명의 백신의 선행 기술 이상의 일부 중요한 이점은 다음과 같다:

1. 바이러스의 순환 균주로부터 1년 기준으로 항원의 혼입은 필요로 되지 않는데, 본 발명이 다른 인플루엔자 균주에 대해 보호할 수 있는 계절적 및 유행성 독감에 대해 "보편적 백신"을 만들기 때문이다. 이 목적을 위해, 조류 독감 바이러스의 2가지 내부 유전자, M2 엑토도메인 유전자 및 PB2 유전자는 MVA에 혼입되었다. M2 단백질의 세포밖 부분은 현저하게 보존된다. 1933년에 첫번째 사람 인플루엔자 A 균주가 분리된 이래로, M2 단백질의 세포밖 도메인에서 아미노산 변화는 주목되지 않았다.

2. 재조합 MVA 바이러스가 난보다는 오히려 BHK21 세포에서 성장되기 때문에, MVA 기반 백신은 난 기반 백신의 모든 단점들을 극복할 것이다.

3. 본 발명에 따라서, 복제 결함 벡터가 사용되며; 항원 에피토프의 포르말린 불활성화 및 변성 문제는 회피되었다.

4. MVA 기반 백신의 전달은 비강내 경로에 의해 프라이밍되고, 근육내 경로에 의해 추진되거나 또는 그 반대로써, 비강내 및 근육내 경로에 의해 행해져서 전신성 및 점막 면역 반응을 만든다.

본 발명은 보편적 인플루엔자 백신을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스에 기반한 보편적 인플루엔자 백신에 관한 것이다.

이들 및 다른 목적에 따라서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 조류 인플루엔자 바이러스로부터 적어도 4개의 외래 유전자의 카세트를 포함하고 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스에 관한 것이며, 상기 유전자는 MVA 게놈 내에서 비-필수 자리, 바람직하게는 DelIII에 삽입되고, 상기 외래 유전자 각각은 동일한 프로모터 또는 다중 프로모터의 개개의 단일 복제 또는 다중 복제의 전사 조절하에 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스, 구체적으로 조류 인플루엔자 바이러스로부터 적어도 2개의 외래 유전자의 카세트를 포함하고, 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스에 관한 것이며, 상기 유전자는 MVA 게놈 내에서 비-필수적 자리, 바람직하게는 DelIII에 삽입되고, 상기 외래 유전자는 단일 프로모터의 개개의 복제물의 전사 조절하에 있으며, 단, 적어도 하나의 외래 유전자는 PB2 또는 M2e 중 하나다.

본 발명은 추가로 프로모터를 포함하는 인플루엔자 유전자(들) 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터뿐만 아니라 약제학적 조성물에 관한 것이다.

도 1: 플라스미드 P8, 4, 7에서 상업적으로 합성된 HA, NA 및 PB2 유전자의 존재를 나타내는 1% 아가로오스 겔(중복 제한(Double digestion)).
도 2: 플라스미드 P5 및 6에서 상업적으로 합성된 M2e 및 EGFP 유전자의 존재를 나타내는 1% 아가로오스 겔(중복 제한).
도 3: MVA 게놈 DNA의 밴드를 나타내는 1% 아가로오스 겔.
도 4: 트랜스퍼 플라스미드, p2.BRC/V/A9의 구성의 다이아그램 표현.
도 5: 트랜스퍼 플라스미드에서 클로닝된 HA, NA, M2e, PB2, EGFP, 우측, 좌측 유전자의 존재 및 SnaBI로 분해에 의한 독감 유전자 카세트의 절제(excision)를 나타내는 1% 아가로오스 겔.
도 6: 트랜스펙션 후 얻어진 혼합된 프로제니 바이러스에서 재조합 MVA(H5N1의 HA, NA, M2e, PB2 유전자를 가짐)의 존재에 대해 PCR에 의한 확인. (레인 1: 1Kb 래더(ladder); 레인 2, 4, 6, 8: 각각 야생헝 MVA로부터 HA, NA, M2e, PB2의 PCR; 레인 3, 5, 7, 9: 각각 재조합 MVA로부터 HA, NA, M2e, PB2의 PCR)
도 7: 이 도면은 마우스에 1.0 x 10⁸ pfu/마우스로 Rec MVA의 근육내 접종 후 제28일, 제43일, 제71일, 제85일에 혈청 샘플 중 항인플루엔자 바이러스 IgG의 역가를 나타낸다.
도 8: 이 도면은 마우스에 1.0 x 10⁸ pfu/마우스로 Rec MVA의 비강내 접종 후 제43일, 제71일, 제86일에 혈청 샘플 중 항인플루엔자 바이러스 IgG의 역가를 나타낸다.
도 9: 이 도면은 마우스에 1.0 x 10⁸ pfu/마우스로 Rec MVA의 접종 후 기관지 폐포 세척(bronchoalveolar lavage)에서 항인플루엔자 바이러스 IgA를 나타낸다.
도 10: 마우스에 1.0 x 10⁸ pfu/마우스로 Rec MVA의 접종 후 세포 매개 면역을 위한 림프증식 분석.

본 발명은 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스의 게놈에서 인플루엔자 유전자의 조합의 혼입으로부터 유래되는 인플루엔자 백신에 관한 것이다. 본 발명의 구성체는 당업계에 아직 알려져 있지 않다.

본 발명은 본원에 개시되는 특정 공정 단계들 및 재료로 제한되지 않지만, 관련 분야에서 당업자에 의해 인식되는 바와 같은 그것의 동등물까지 확장된다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 목적을 위해 사용되며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.

정의

변형된 백시니아 앙카라( MVA ) 바이러스

변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스는 177kb dsDNA 오르소폭스바이러스(orthopoxvirus)이다. 이는 총 31000개의 염기 쌍의 6가지의 주된 DNA 결실(즉, 결실 I, II, III, IV, V, 및 VI)이 있는 동안 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 > 570 연속 계대에 의해 발현된 백시니아 바이러스의 크게 약독된 균주이다(Antoine et al., 1998). 결실 III(DelIII) 자리는 외래 서열의 삽입과 발현을 위해 사용되는 MVA 게놈에서 가장 흔한 자리이다. 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스의 완전한 게놈 서열 및 다른 오르토믹소바이러스와 비교는 Virology 244:365-396에서 찾을 수 있다. 연속 계대의 결과로서, MVA 바이러스는 엄격하게 조류 세포에 제한된 숙주세포가 되었고 사람 및 대부분의 다른 포유동물 세포에서 불량하게 복제한다. 극심한 약독화 때문에, MVA의 높은 투여량이 면역결핍 비-사람 영장류에 주어졌을 때조차 부작용은 보고되지 않았다(Stittelaar et al., 2001). 천연두에 대해 120,000명 이상의 사람의 1차 백신 접종을 위한 MVA를 사용하는 철저한 임상적 경험이 있다. 고 위험 환자를 포함하는 광범위한 분야의 연구 동안 MVA 백신의 사용과 관련된 부작용은 없었다(Mayr et al., 1987; Stickl et al., 1974). MVA가 크게약독되었지만, 여전히 양호한 면역원성을 유지한다(Meyer et al., 1991).

성숙한 전염성 비리온의 조립이 감염 후에 일어나지 않기 때문에, 사람 세포에서 MVA 복제는 주목되지 않았다. 그럼에도 불구하고, MVA는 비-허용세포(포유동물 셀 라인)에서 조차 높은 수준으로 바이러스와 재조합 유전자를 발현시키는 것으로 나타났고, 따라서 효율적이고 특별히 안전한 유전자 발현 벡터로서 생각되었다(Sutter and Moss, 1992). MVA의 사용을 추가로 이용하기 위해서, 외래 유전자들은 MVA 바이러스의 게놈을 변경하지 않고 MVA 균주로 DNA 재조합에 의해 도입되었다.

Blu - MVA

Blu-MVA는 그것의 게놈에서 Del III 자리에 삽입된 β-gal 유전자를 가지는 재조합 MVA 바이러스이다.

아기 햄스터 신장 셀 라인( BHK21 )

본원에서 사용되는 BHK21 셀 라인 (Baby hamster Kidney cells)은 햄스터의 신장으로부터 유래되고, 1961년에 I. A. Macpherson 및 M. G. P. Stoker에 의해 확립된 섬유아세포 셀 라인이다. BHK21 셀 라인은 백시니아 바이러스, 수포성 구내염(Vesicular stomatitis) 바이러스, 사람 아데노바이러스 25, 레오바이러스 3 및 사람 폴리오바이러스 2에 민감하다. 이 라인은 원하는 유전자와 마커 DNA를 함유하는 발현 벡터로 트랜스펙션을 위한 숙주로서 사용되었다.

향상된 녹색 형광 단백질

본원에서 사용된 EGFP는 향상된 녹색 형광 단백질, 유전자 발현을 모니터링하기 위해 사용되는 강력한 보고 분자, 단백질 편재화 및 단백질-단백질 상호작용을 말한다. GFP의 몇몇 돌연변이 변이체는 흡수, 방출 스펙트럼 및 양자 수율에 관해서 다르게 이용가능하다. 향상된 GFP (EGFP)는 Phe-64-Leu 및 Ser-65-Thr 돌연변이를 함유하는 GFP 중 하나의 이러한 돌연변이이다. 야생형 GFP에 관해 청색광 여기 후 높은-강도 방출을 제공하기 때문에, 이는 광범위하게 사용된다. EGFP는 형광-활성화된 세포 분류 및 기타 연구를 위한 동일한 분자로서 나타났다(Canella etal. 2000)

프로모터

프로모터는 특정 유전자의 전사를 가능하게 하는 DNA의 영역이다. 프로모터는 동일 가닥과 위쪽에서 그것들이 조절하는 유전자 근처에 전형적으로 위치한다(센스 가닥의 5' 영역에 대해). 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스에서 이종성 유전자의 발현을 위해, 세포 및 다른 바이러스 프로모터가 MVA 전사 장치에 의해 인식되지 않기 때문에 폭스바이러스 프로모터를 사용하는 것을 필수적이다. 높은 수준의 발현이 MVA에서 요망될 때 p11 또는 pCAE와 같은 강한 후기 프로모터가 바람직하다.

Kozak 서열

Kozak 서열은 척추동물에서 번역의 개시 동안 공통서열이다. mRNA 분자 내 이 서열은 단백질이 mRNA 분자에 의해 코딩되는 번역의 시작 자리로서 리보좀에 의해 인식된다.

변형된 백시니아 앙카라( MVA ) 바이러스의 비 필수 영역

본 발명에 따르는 비 필수 영역은 (i) 백시니아 바이러스의 게놈에 대해 MVA 게놈에서 자연적으로 발생하는 결실 자리 또는 (ii) MVA 게놈의 유전자간 영역으로부터 선택될 수 있다. 용어 유전자간 영역은 바람직하게는 코딩서열도 조절서열도 포함하지 않는 2개의 인접한 유전자 사이에 위치된 바이러스 게놈의 그 부분들을 말한다. 그러나, 본 발명에 따르는 이종성 핵산의 혼입을 위한 삽입 자리(비-필수 영역)는 이들 바람직한 삽입 자리를 제한하지 않는데, 그것이 적어도 하나의 세포 배양물 시스템에서 증폭되고 전파될 수 있는 재조합체를 얻을 수 있다면, 바이러스 게놈 어디에서나 통합이 있을 수 있다는 것은 본 발명의 범주 내에 있기 때문이다. 따라서, 비-필수 영역은 비-필수 유전자 또는 유전자들일 수 있고, 이것의 작용은 MVA의 전파를 위해 사용되는 세포 시스템에 의해 보충될 수 있다.

보편적 인플루엔자 백신

보편적 인플루엔자 백신은 계절적 뿐만 아니라 유행성 독감을 야기하는 바이러스에 대한 보호를 제공하도록 의도되는 인플루엔자 백신을 말한다. 따라서, 조류 독감 바이러스의 2개의 내부 유전자, M2 엑토도메인 유전자 및 PB2는 MVA 게놈의 비-필수 영역에 혼입되었다. 이 재조합 바이러스는 보편적 인플루엔자 백신의 제조를 위해 사용된다. 이 백신 덕분에, 독감 백신의 제조에 사용되는 재교배를 위한 바이러스의 현재 순환하는 균주로부터 1년 기준으로 항원의 혼입은 필요로 되지 않는다.

본 발명

다음 세대 인플루엔자 백신의 시험감염을 충족시키기 위해, 본 발명자들은 용이하게 이용가능한 셀 라인에서 생성될 수 있는 재조합 바이러스 벡터에서 표면과 보존된 내부 바이러스 단백질을 합하는 새로운 인플루엔자 백신을 개발하였다.

본 발명에 사용되는 셀 라인

MVA는 닭 배아 섬유아세포, BHK21 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 셀 라인 CV-1 및 MA 104에서 전파될 수 있다. MVA의 가장 높은 역가는 닭 배아 섬유아세포로부터 획득되었지만, CEF의 제조는 다루기 힘들고, 특정 세포 배양물 경험을 필요로 한다. CV-1 및 MA 104 세포는 CEF 세포와 비교하여 바이러스의 약 10분의 1에서 최상으로 만들어졌다. BHK21 세포는 CV-1 및 MA104보다 MVA 전파에 대해 훨씬 더 관대하다. BHK21 (C13)은 본 발명에 따르는 가장 바람직한 셀 라인이다.

백신

본 발명에 따라서, 인플루엔자 유전자는 H5N1, H5N3, H5N2, H5N7, H7N1, H7N3 및 H9N2 서열의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 유전자(들)는 H5N1로부터 나온다. 그 중에서도 바람직한 인플루엔자 유전자는:

혈구응집소이며, HA는 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 항원성 글리코단백질이고, 감염되는 세포에서 바이러스 결합을 초래한다. 적어도 16가지의 다른 HA 항원들이 있다. 이들 서브타입은 H1 내지 H16으로 표지된다. 첫번째 3가지 혈구응집소, H1, H2 및 H3은 사람 인플루엔자 바이러스에서 발견된다. 이 부착은 세포 안으로 독감 바이러스 유전자의 효율적인 전달을 필요로 한다. 종-선택성을 나타내는 다양한 인플루엔자 균주의 능력은 주로 혈구응집소 유전자에서 변이에 기인한다. 하나의 아미노산 치환을 야기하는 혈구응집소 내 유전자 돌연변이는 숙주 세포의 표면에서 수용체에 결합하는 바이러스 혈구응집소 단백질의 능력을 상당히 변화시킬 수 있다. 조류 인플루엔자 바이러스 HA는 알파 2-3 시알산 수용체에 결합하는 반면, 사람 인플루엔자 바이러스 HA는 알파 2-6 시알산 수용체에 결합한다. 돼지 인플루엔자 바이러스는 시알산 수용체의 유형 둘 다에 결합하는 능력을 가진다. 혈구응집소 수용체 단백질의 아미노산 위치 223에서 돌연변이는, 이 돌연변이를 가지는 균주가 사람을 감염시키기에 더 적합하게 되도록 하여 바이러스의 사람 수용체에 결합하는 능력을 증가시키고, 가금류 수용체에 대한 그것의 친화력을 감소시킨다. HA의 수용체 결합 포켓의 위치 226, 227 및 228에서 아미노산 잔기는 세포 표면 수용체에서 결합 친화도를 결정하고, 조류(시알산-2,3-NeuAcGal) 또는 사람(시알산-2,6-NeuAcGal) 세포 표면 수용체에 바이러스의 선택적인 결합에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 사람 A/HK/212/03 및 A/HK/213/03 분리주는 조류 수용체 결합과 관련된 특징을 보유하지만, 그것들은 수용체 결합 내에서 독특한 아미노산 치환(Ser227Ile)을 가진다. 발명자들은 2자리에서 돌연변이가 182 및 192로서 확인되는 HA 유전자 내에 위치하며, 바이러스를 조류와 사람 수용체 둘 다에 결합시킨다는 것을 발견하였다. H5N1 바이러스의 HA에서 하나의 E190D 돌연변이는 알파 2-3 시알산(조류 특이적)에서 알파 2-6 시알산(인간 특이적)으로 그것의 결합 선호도를 잠재적으로 전환할 수 있다. 이는 1918년 스페인 독감 바이러스로 일어난 것이고, 아미노산 226 및 228에서 어떤 돌연변이도 가지지 않았고, 따라서, 조류 특이적 수용체 결합 포켓을 가지지만, 단지 아미노산 190에서 단일 돌연변이는 알파 2-6 시알산에서 그것의 수용체 특이성을 변화시켰다(인간 특이적). HA는 중화 항체 반응을 제공한다.

뉴라미니다아제, NA는 인플루엔자 바이러스의 표면에서 발견되는 항원성 글리코단백질 효소이다. 이는 감염된 세포로부터 자손 바이러스의 방출을 돕는다. NA는 인플루엔자 바이러스 특이적 면역 반응, 즉, 다른 바이러스 변이체 또는 서브타입에 대해 교차-보호에 기여할 수 있는 항체들 및 T 세포를 유발하는 표적 항원이다.

M은 동일한 RNA 절편으로부터 다른 리딩 프레임을 사용하여 기질 단백질 M1 및 M2를 암호화한다. M1은 바이러스 RNA에 결합하는 단백질이다. M2는 엔도좀에서 비리온 비코팅동안 RNP로부터 M1 단백질의 제거를 가능하게 하도록 엔도좀으로부터 비리온 내부에 양성자의 흐름을 허용하는 이온 채널 단백질로서 작용한다. M2 단백질의 세포밖 부분(M2e)은 현저하게 보존된다. 1993년에 분리된 제1 인간 인플루엔자 A 균주로부터 M2 단백질의 세포 밖 도메인에서 아미노산 변화는 관찰되지 않았다. M2e는 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC) 메커니즘에 의한 보호를 제공한다.

폴리머라아제(PB1, PB2: 염기성 폴리머라아제 1&2, PA: 산성 폴리머라아제). PB1은 3가지의 P 단백질을 가장 특징으로 하며; 이는 모든 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라아제에 공통인 5가지 서열 차단을 함유한다. PB1은 PB1 단백질과 PB1-F2 단백질을 암호화한다. PB1 단백질은 바이러스 폴리머라아제의 중요한 성분이다. PB1-F2 단백질은 PB1 RNA 절편의 또 다른 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화되고 바이러스 병원성에 기여한다. PB2는 바이러스 mRNA 합성에 필수적인 캡-결합 및 내부 핵산가수분해(endonucleolytic) 활성을 가진다. PA는 적절한 플러스-가닥 복제물 RNA 및 vRNA 합성에 없어서는 안 되지만, 이들 과정에서 그것에 부여된 특이적 작용은 없었다.

핵단백질, NP는 핵단백질을 암호화하며, 이것의 주된 작용은 RNA 전사, 복제 및 패키징의 목적을 위한 바이러스 게놈을 단백질 막으로 싸는 것이다.

NS는 2가지의 비구조적 단백질-NS1과 NEP를 암호화한다. NS1(비구조적 단백질 1)은 손상되지 않은 바이러스 생성을 유발하는 바이러스-감염 세포에서 인터페론 반응을 억제한다. NS1 단백질은 바이러스 유전자 전사가 일어나도록 하는 숙주 방어를 피한다. H5N1 NS1은 위치 92에서 하나의 아미노산 변화를 특징으로 한다. 글루탐산으로부터 아스파르트산으로 아미노산을 변화시킴으로써, 연구자들은 H5N1 NS1의 효과를 무효화시킬 수 있다. NS1 유전자에서 이 하나의 아미노산 변화는 H5N1 인플루엔자 바이러스의 병원성을 크게 증가시켰다. 앞서 NS2 단백질로서 언급한 NEP, 핵 외수송 단백질(nuclear export protein)은 vRNP의 외수송을 매개한다.

본 발명의 한 구체예는 인플루엔자 바이러스에 대한 보편적 백신으로서 사용될 수 있는 재조합 MVA에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 H5N1 인플루엔자 바이러스에 대한 백신의 생성에 관한 것이다. 본 발명의 보편적 백신은 추가로 H5N1 조류 인플루엔자 항원의 신규 조합을 포함하고 발현시킬 수 있는 MVA 바이러스에 관한 것이다.

본 발명의 구체예 중 하나에 따라서, H5N1 바이러스로부터 일부 항원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 백신으로서 사용될 수 있는 MVA의 게놈에 도입되었다. 사용되는 유전자는 A/Vietnam/1203/04 H5N1 바이러스의 HA, NA, PB2 및 M2e 유전자로부터 선택될 수 있지만, 제한되지 않는다. 본 발명은 H5N1 바이러스로 제한되지 않을 수 있다.

인플루엔자 바이러스로부터 클로닝된 유전자는 임의의 적당한 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 유전자는 동일 또는 다른 프로모터의 하나 또는 복수의 복제물의 조절하에 있을 수 있다. P11은 인플루엔자 유전자가 발현될 수 있는 대조군 하에서 가장 바람직한 프로모터이다. 바람직한 구체예에서, 모든 유전자는 그것들 개개의 P11 프로모터의 조절하에 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따라서, 재조합 MVA 바이러스는 또한 인플루엔자 유전자와 함께 클로닝된 마커 유전자를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 사용된 마커 유전자는 향상된 그린 형광 단백질 유전자(EGFP)일 수 있다. 마커 유전자는 인플루엔자 유전자의 조절을 조절하는 P11 프로모터 중 하나의 조절하에 있을 수 있다. 바람직한 구체예에서, EGFP 마커는 개별 P11 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.

인플루엔자 바이러스 및 마커 유전자로부터의 유전자를 포함하는 모든 이들 유전자들은 하나의 전달 플라스미드에서 클로닝될 수 있다. 클로닝은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 전달 플라스미드는 자연적으로 발생하는 결실에서 MVA 바이러스의 게놈으로 전달 플라스미드의 상동성 재조합에 도움을 주는 MVA 바이러스로부터의 서열을 추가로 가질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예 중 하나는 인플루엔자 유전자를 가지는 전달 플라스미드에 관한 것이며, 마커 유전자 및 "왼쪽 측면" 및 "오른쪽 측면"은, MVA의 DelIII 자리에서 전달 플라스미드의 상동성 재조합에 도움을 주는 MVA 바이러스의 DelIII 자리로부터 시퀀싱한다.

따라서, 인플루엔자 바이러스로부터의 유전자는, 예를 들어, MVA 바이러스의 바이러스 게놈에서 자연적으로 발생하는 결실과 같이 임의의 비-필수 자리에서 클로닝되어 백신으로서 사용될 수 있는 재조합 MVA 바이러스를 만들 수 있다. 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스로부터의 유전자는 바이러스 게놈의 DelIII 자리에서 클로닝되어 백신으로서 사용될 수 있는 재조합 MVA 바이러스를 만들 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 등록번호.....하에 .....에 기탁된 신규 플라스미드가 제공된다.

본 발명의 한 추가 바람직한 구체예는 인플루엔자 바이러스, 특히 조류 인플루엔자 바이러스로부터 적어도 2개의 유전자를 포함하는 신규 플라스미드를 제공하며, 적어도 하나의 유전자는 PB2 및/또는 M2e이다. 더 바람직한 구체예에 따라서, 본 발명의 신규 플라스미드는 인플루엔자 바이러스, 특히 조류 인플루엔자 바이러스로부터 혈구응집소(HA), 뉴라미니다아제(NA), 폴리머라아제 PB2 및 기질(M) 단백질(M2e)의 세포밖 부분(M2e)을 포함한다. 본 발명의 하나의 추가 바람직한 구체예는 이들 유전자가 개개의 P11 프로모터의 조절하에 있을 수 있다는 것을 제공한다.

본 발명의 하나의 추가 바람직한 구체예는 인플루엔자 바이러스, 특히 조류 인플루엔자 바이러스로부터 적어도 2개의 외래 유전자의 카세트를 포함하고 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 MVA 바이러스에 관한 것이며, 상기 유전자는 MVA 게놈 내에서 DelIII의 자리에 삽입되고, 외래 유전자는 하나의 프로모터의 전사 조절하에 있으며, 단, 적어도 하나의 외래 서열은 PB2 또는 M2e 중 하나이다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예는 인플루엔자 바이러스, 특히 조류 인플루엔자 바이러스로부터의 적어도 4개의 외래 유전자의 카세트를 포함하고 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 MVA 바이러스에 관한 것이며, 상기 유전자는 MVA 게놈내에서 DelIII의 자리에 삽입되고, 상기 외래 유전자는 동일 프로모터의 하나, 복수 또는 복수의 복제물의 전사적 조절하에 있다. 본 발명의 하나의 바람직한 구체예에 따라서, 상기 인플루엔자 유전자는 개별 P11 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.

재조합 MVA 바이러스의 제조는 다양한 시스템에서 행해질 수 있다. BHK21 세포는 재조합 MVA 바이러스의 제조를 위해 가장 바람직한 시스템이다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 하기의 단계들을 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스를 제조하는 방법이 제공된다:

a) 포유동물 셀 라인을 배양하는 단계,

b) 셀 라인을 컨플루언시(confluency)까지 성장시키는 단계,

c) 세포를 Blu-MVA 바이러스로 감염시키는 단계,

d) P11 프로모터의 조절 하에서 인플루엔자 바이러스, 특히 조류 인플루엔자 바이러스를 포함하는 핵산으로 세포를 트랜스펙션하는 단계,

e) 자손 바이러스를 계대시켜 재조합 MVA의 역가를 증가시키는 단계 및

f) 재조합 바이러스의 분리 단계.

재조합 MVA 바이러스의 제조를 위해, 바람직하게는 BHK21 세포는 알려진 기술을 사용하여 MVA 바이러스로 감염될 수 있다. 감염 후, 감염된 세포는 인플루엔자 바이러스로부터의 유전자를 포함하는 전달 플라스미드로 트랜스펙션될 수 있다. 트랜스펙션은 인산칼슘 방법 또는 리포좀 또는 당업계에 알려진 어떤 다른 방법에 의해 행해질 수 있다. 적절한 대조군은 실험 동안 사용될 수 있다. cpe가 가시적으로 된 후, 트랜스펙션된 세포는 바이러스를 방출시키기 위해 스크레이프, 펠렛화 및 3번 냉동 해동될 수 있고, 그 다음에 BHK21 세포의 신선한 배치를 감염시키는데 사용될 수 있다. 재조합 MVA는 저장액(stock)을 만들기 전 9번 계대될 수 있다. 이는 재조합 MVA의 역가를 증가시키도록 행해질 수 있다. 이 저장액 바이러스는 PCR에 의해 혼합된 자손에서 외래 유전자의 통합을 확인하고, 웨스턴 블롯(estern blot)에 의해 이종성 유전자의 발현을 확인하고, FACS에 의해 재조합 MVA를 분리시키기 위해 행해질 수 있으며, EGFP 형광을 기반으로 한다. 재조합 MVA는 그 다음에 정제될 수 있다.

본 발명은 추가로 재조합 MVA의 예방에 효과적인 양이 필요한 사람/동물/조류의 면역화를 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 상기 방법은 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 희석제, 염, 버퍼, 안정제, 가용화제 및 당업계에 잘 알려진 다른 재료를 선택적으로 함유할 수 있는 조성물을 포함할 수 있다. 이 물질들은 본 발명에 따르는 MVA의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비독성 물질을 의미하는 "약제학적으로 허용가능한"이 필수적이다. 담체의 특성은 투여 경로에 의존할 것이다. 약제학적 조성물은 치료에서 활성 또는 사용을 향상시키는 다른 약제들을 더 함유할 수 있다. 이러한 부가적인 인자 및/또는 약제는 본 발명에 따르는 면역화를 위한 방법에 사용되는 약제학적 조성물에 포함되어 상승 효과를 만들거나 부작용을 최소화할 수 있다. 본 발명에 따르는 MVA의 조제물 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Muck Publishing Company, Easton, PA, latest edition)에서 찾을 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 인플루엔자 바이러스, 특히 조류 인플루엔자로부터의 유전자를 포함하는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신의 피험자에 투여에 의한, 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 감염의 치료방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르는 면역화 방법은 재조합 MVA의 예방적으로 효과적인 양의 사용을 만들 것이다. 본 발명의 백신은 어린이와 성인 모두를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예방적으로 유효한 용량은 추가로 감염의 확립의 억제 또는 증상의 완화를 초래하는데 충분한 화합물/성분의 양을 말한다.

본 발명의 백신은 키트의 형태로 이용가능할 수 있다. 키트 또는 조성물은 백신의 세부사항 예를 들어, 투여를 위한 설명서, 백신 내의 항원의 세부사항 등을 포함하는 리플렛과 함께 포장될 수 있다(예를 들어 동일한 박스 내). 본 설명서는 또한 경고, 예를 들어 백신 접종 후 과민성 반응의 경우 등에 용이하게 이용가능한 아드레날린 용액을 보유할 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 구체예에 따라서, 본 발명의 백신은 다른 항원, 예컨대 디프테리아, 파상풍, 백일해, 폴리오, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 간염, 뇌수막염, 폐구균, 연쇄상구균, 탄저병, 뎅기열, 말라리아, 홍역, 볼거리, 풍진, BCG, 일본뇌염, 로타바이러스, 천연두, 황열, 장티푸스, 대상포진, 수두 및 기타와 함께 인플루엔자 유전자를 포함하는 변형된 백시니아 앙카라(MVA)를 조합하여 조제될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 백신이 상기 언급한 다른 항원들을 포함하는 백신의 투여로서, 실질적으로 동시에, 동일 또는 다른 자리에 투여될 수 있다는 것을 제공한다.

투여 방식, 투여 용량 및 투여 수는 당업자에게 알려진 방식에 의해 최적화될 수 있다. 면역화는 예방적일 수 있다. 본 발명의 백신은 비경구 뿐만 아니라 경구적 경로를 통해 투여에 적당할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 면역원성 조성물의 투여는 점막 경로에 의할 수 있다. 바람직한 구체예에서, MVA 기반 백신의 전달은, 비강내 경로로써 프라이밍되고 근육내 경로에 의해 촉진되거나 또는 그 반대로써 비강내 및 근육내 경로에 의해 행해질 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 백신은 비강내 경로에 의해 투여되어 인플루엔자에 대해 환자를 면역화시킬 수 있다. 비강내 투여의 백신 조성물은, 예를 들어 점비약, 스프레이로서 액체 형태 또는 흡입에 적당한 형태, 분말 또는 크림 또는 에멀젼으로서 조제될 수 있다. 본 조성물은 안정제, 버퍼 또는 보존제와 같은 다양한 첨가제를 함유할 수 있다. 단순한 용도를 위해, 백신 조성물은 바람직하게는 점비약 또는 에어로졸의 형태로 항원의 분포에 적절한 용기로 공급된다. 사용될 수 있는 본 발명의 백신의 다른 투여 경로는 경구, 구강, 폐, 국소, 비경구(피하, 근육내 및 정맥내를 포함), 경피, 눈(안구), 경점막, 임플란트 또는 직장 투여이다.

하기의 상세한 예는 본 발명을 더 잘 이해하도록 기여하기 위한 의도이다. 그러나, 본 발명이 실시예의 대상으로 한정되는 결과를 제공하도록 의도되는 것은 아니다.

실시예

1. 상업적으로 합성된 인플루엔자 유전자( HA , NA , M2e , PB2 및 EGFP )를 가지는 플라스미트에 의한 형질전환

H5N1의 A/Vietnam/1203/04 균주의 혈구응집소(HA, 등록번호: AY818135), 뉴라미니다아제(NA, 등록번호: AY818141), 기질 단백질 2 엑토도메인(M2e, 등록번호: AY651388) 폴리머라아제 염기성 서브유닛 2(PB2,등록번호: AY651719) 유전자 및 향상된 녹색 형광 단백질 유전자(EGFP, ,등록번호: U57609)를 상업적 공급원으로부터 합성 후 구하였다. 각각의 유전자는 유전자의 앞에 프로모터 p11 및 리보좀 결합 자리 kozak 서열을 가졌다. 인공적으로 합성된 유전자를 pGA1/pUC-Kana/pPCR-Script/pGA4에서 클로닝하여 각각 플라스미드 p8, p4, p5, p7 및 p6를 만들었다. 각각의 이들 플라스미드를 E.coli DH5알파 경쟁 세포를 형질전환하기 위해 사용하였다(Maniatis, Sambrook etal, 2001). 각각의 플라스미드를 함유하는 2개의 형질전환된 콜로니들을 적당한 영양 배지에서 접종하였고, 플라스미드를 제조업자에 의해 제공되는 표준 프로토콜에 따라서 Qiagen 키트를 사용함으로써 분리하였다. 분리된 플라스미드를 적절한 제한 효소에 의해 분해하여 필요한 유전자의 존재하에서 확인하였고(도1 및 도 2), 이후에, -20℃에서 저장하였다. 플라스미드의 글리세롤 저장액을 각각의 플라스미드로 트랜스포밍한 E. coli DH5알파의 배양물의 형태로 -80℃에서 저장하였다.

2. 아기 햄스터 신장 ( BHK21 ) 셀 라인의 배양물.

BHK21 (C13) 셀라인을 ATCC로부터 얻었다. BHK21 세포를 10% NBCS로 보충한 DMEM(둘베코 변형 이글 배지)에서 정기적인 스플리팅과 씨딩에 의해 유지하였다. BHK21 세포의 저장액을 또한 함께 제조하였다.

3. MVA 바이러스의 성장

3.1 MVA 의 복구 및 MVA 의 저장액 제조

BHK21 세포를 감염시킴으로써 MVA 바이러스를 DMEM 배지에서 재생시켰다. 그러나, 임의의 적당한 배지가 사용될 수 있다. 이는 실질적으로 높은 역가에 도달할 때까지 BHK21 세포에서 반복적으로 계대하였다. MVA 감염 BHK21 세포를 표준 방법을 사용하여 수확하였고 -80℃에서 저장하였다.

3.2 MVA 의 적정

MVA는 BHK21 세포에서 플라크를 형성하지 않기 때문에, 그것의 농도를 Karber 방법에 의해 계산하여 TCID₅₀/ml을 결정하였다(Vaccinia Virus and Poxvirology: Methods and Protocols, By Stuart N. Isaacs, 2004).

4. MVA 게놈 DNA 의 분리

BHK21 (C13) 세포들을 MVA 저장액에 의해 감염시켰다. CPE의 개시 후, 감염시킨 BHK21 세포를 수확하였고 MVA 게놈 DNA추출을 위해 사용하였다(Vaccinia Virus and Poxvirology: Methods and Protocols, By Stuart N. Isaacs에 인용된 프로토콜에 따라서). 얻은 펠렛을 70% 에탄올로 세척하였고, 공기 건조시키고 탈이온화한 멸균수에 용해하였다. 추출한 게놈 DNA를 아가로오스 겔에서 실행하였다(도 3).

5. 전달 플라스미드 p2 . BRC /V/A9의 구성.

전달 플라스미드를 다수의 클로닝 단계들을 통해 구성하였다(도 4). 최종 전달 플라스미드는 각각 개별 P11 프로모터의 조절하에서, HA, NA, M2e 및 PB2 인플루엔자 유전자 및 EGFP 마커 유전자를 가진다. 전달 플라스미드 내 유전자의 스트레치는 MVA 바이러스 게놈의 Del III에서 전달 플라스미드의 상동 재조합에 도움을 주는 MVA의 Del III의 "왼쪽 측면"과 "오른쪽 측면" 서열에 의해 양 측면에 배치된다(도 5).

6. 재조합 MVA 의 생성.

6.1. 전달 카세트의 여기

전달 플라스미드 p2.BRC/V/A9를 제한 효소 SnaBI에 의해 분해하여(이는 왼쪽과 오른쪽 측면 둘 다에 자리를 가진다) MVA 측면에 따라 유전자 HA, NA, M2e, PB2, 마커 유전자 EGFP를 함유하는 전체 카세트를 절단하였다(도 5). 분해 및 겔 정제한 카세트를 멸균수에서 용리하였다.

6.2 전달 카세트 및 전장 전달 플라스미드에 의한 트랜스펙션

BHK21 세포를 60mm 조직 배양물 접시에서 배양하였다. 80-90% 컨플루언시에서, 배지를 제거하였고, 세포를 1X PBS⁺⁺로 세척하였고(1% CaCl₂ 및 1% MgCl₂를 함유하는 PBS), Blu-MVA(Del III 자리에 삽입된 β-gal 유전자를 가지는 재조합 MVA) 바이러스 저장액의 10^-5희석의 1ml/60mm 접시로 감염시켰다. 1시간의 감염 기간 동안, 트랜스펙션 혼합물을 유전자 카세트를 사용함으로써(H5N1 유전자 HA, NA, M2e, PB2, 마커 유전자 EGFP 및 MVA 측면을 함유) 또는 전장 전달 플라스미드를 사용함으로써 만들었다. 사용된 트랜스펙션 시약은 리포펙타민 또는 염화칼슘 중 하나였다. 1시간 인큐베이션 후, 바이러스를 제거하였고, 트랜스펙션을 당업계에 공지된 방법에 의해 행하였다. 37℃에서 3-4일 인큐베이션 후, 트랜스펙션한 세포를 스크레이프하고, 펠렛화하고, 3번의 냉동-해동을 받게하여 재조합 및 야생형 바이러스를 방출시켰다. 바이러스의 이 혼합 모집단을 신선한 BHK21 세포를 감염시키기 위해 사용하였다. 자손 바이러스를 저장액을 만들기 전 BHK-21 세포에서 몇 번 계대시켰다. 이것을 재조합 MVA의 역가를 증가시키기 위해 행하였다. 이 저장액 바이러스를 PCR에 의해 혼합된 자손에서 외래 유전자의 통합을 확인하고, 크로모제닉 검출에 의해 재조합 MVA를 분리하기 위해 사용하였다.

7. 재조합 MVA 의 분리

닭 배아 섬유아세포(CEF)를 11일령 발육 SPF 난으로부터 제조하였다. 세포를 혼합된 재조합 및 야생형 자손으로 감염시켰다. 바이러스 플라크를 X-gal의 오버레이에 의해 검출하였다. 재조합 바이러스를 나타내는 백색 플라크를 가려내었다.

8. 재조합 MVA 의 증폭, 정제 및 적정

8.1 재조합 MVA의 증폭

일단 재조합 바이러스가 분리되면, 이것은 BHK21 세포를 사용함으로써 증폭되었다. 재조합 MVA를 BHK21 세포의 T25 플라스크, T75 및 T175 플라스크를 순차적으로 감염시킴으로써 증폭시켰다. T175에서 성장시킨 재조합 MVA 감염 세포를 펠렛화하였고, 1OmM Tris, pH8에서 용해하였고, -80℃에서 저장하였다.

8.2 재조합 MVA의 정제

r-MVA로 감염시킨 세포를 초음파처리에 의해 파괴하였고, 세포 파편을 제거하기 위해 원심분리하였다. 상청액에 단계화된 수크로오스 기울기를 적용하였다(농도 단계: 20%, 25%, 30%, 35% 및 40%). 정제한 바이러스의 밴드를 회수하였고, 펠렛화하고 -80℃에서 저장하였다.

8.3 재조합 MVA의 적정

MVA가 BHK21 세포의 플라크를 형성하지 않기 때문에, 그것의 농도를 TCID₅₀/ml에 의해 계산하였다. BHK21 세포를 96웰 플레이트에 씨딩하였고 재조합 MVA의 2배 연속 희석으로 감염시켰다. 플레이트를 5일 동안 CO₂ 인큐베이트에서 37℃에서 인큐베이팅하였다. ml 당 TCID₅₀ 값을 Karber 방법에 따라서 계산하였다.(Vaccinia Virus and Poxvirology: Methods and Protocols, By Stuart N. Isaacs, 2004)

9. BALB /c 마우스에서 재조합 MVA - Flu 바이러스의 면역원성 연구

6-8주령 BALB/c 마우스의 한 그룹(n=6)을 1.0 x 10⁸ PFU/마우스의 투여속도에서 근육내 경로를 통해 정제된 재조합 MVA-Flu 바이러스로 면역화하였다. 6-8주령 BALB/c 마우스의 두 번째 그룹을 1.0 x 10⁸ PFU/마우스의 투여속도에서 비강내 경로를 통해 정제된 재조합 MVA-Flu 바이러스로 면역화하였다. 위약 그룹을 적당하게 취하였다. 각 마우스로부터 면역 전 혈액 샘플을 수집하였다.

두 그룹 모두에서 모든 동물들은 각각의 경로에 의해, 제7일, 제28일 및 제50일에 정제된 재조합 MVA-Flu 바이러스(1.0 x 10⁸PFU/마우스)의 부스터 용량이 주어졌다.

각 마우스를 면역화 시작 후 제0일, 제28일, 제43일, 제71일 및 제85일 후에 출혈시켰다(비강내로 면역화된 그룹의 경우에 면역화 시작 제86일 후). 각 마우스로부터 BAL 샘플과 비장을 안락사시킨 날에 수집하였다.

인플루엔자 특이적 전신 체액 면역 반응을 평가하기 위해, 각 마우스의 혈청 샘플 내 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 ELISA에 의해 결정하였다(도 7 및 도 8).

인플루엔자 특이적 점막 체액 면역 반응을 평가하기 위해, 각 마우스의 BAL 샘플내 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 ELISA에 의해 결정하였다(도 9).

비장으로부터 분리한 림프구를 사용하여 림프구증식 분석(Current Protocols In Immunology, Vol I)을 행하여 인플루엔자 바이러스에 대한 세포 면역 반응을 평가하였다(도 10).

Microbial Type Culture Collection and Gene Bank

MTCC5561

20100517

Claims

등록번호.....하에 .....에 기탁된 신규 플라스미드.
인플루엔자 바이러스로부터 적어도 4개의 유전자의 카세트를 포함하고 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스로서, 상기 유전자는 MVA 게놈 내에서 결실 III의 자리에 삽입되는 것을 특징으로 하는 바이러스.
제2항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 H5N1, H5N3, H5N2, H5N7, H7N1, H7N3 및 H9N2를 포함하는 군으로부터 선택되는 조류 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스.
제3항에 있어서, 조류 인플루엔자 바이러스는 H5N1인 것을 특징으로 하는 바이러스.
제4항에 있어서, 조류 인플루엔자 바이러스는 A/Vietnam/1203/04 H5N1인 것을 특징으로 하는 바이러스.
제2항에 있어서, 인플루엔자 바이러스로부터의 유전자는 혈구응집소(HA), 뉴라미니다아제(NA), 기질 단백질(M1 및 M2), 폴리머라아제(PB1, PB2 및 PA), 핵단백질(NP) 및 비구조적 단백질(NS 및 NEP)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스.
제6항에 있어서, 조류인플루엔자 바이러스로부터의 유전자는 혈구응집소(HA), 뉴라미니다아제(NA), 폴리머라아제 PB2 및 기질(M) 단백질의 세포밖 부분(M2e)인 것을 특징으로 하는 바이러스.
제2항에 있어서, 마커 유전자는 인플루엔자 유전자와 함께 클로닝되는 것을 특징으로 하는 바이러스.
제8항에 있어서, 마커 유전자는 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP) 유전자인 것을 특징으로 하는 바이러스.
제2항에 있어서, 인플루엔자 바이러스로부터의 유전자는 동일 또는 다른 프로모터의 하나 또는 복수의 복제물의 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 바이러스.
제10항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스이고, 모든 유전자는 하나의 프로모터의 전사 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 바이러스.
제10항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스이고, 모든 유전자는 개별 프로모터의 전사 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 바이러스.
제11항 및 제12항에 있어서, 사용된 프로모터는 P11인 것을 특징으로 하는 바이러스.
제2항에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 각각의 유전자는 개별 P11 프로모터의 전사 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 바이러스.
인플루엔자 바이러스로부터의 혈구응집소(HA), 뉴라미니다아제(NA), 폴리머라아제 PB2 및 기질(M) 단백질의 세포밖 부분(M2e)을 포함하는 신규 플라스미드.
제15항에 있어서, 유전자(들)은 개별 P11 프로모터의 전사 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 신규 플라스미드.
제15항 및 제16항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 신규 플라스미드.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 신규 플라스미드로 형질전환 또는 트랜스펙션된 숙주 세포.
인플루엔자 바이러스로부터 적어도 2개의 유전자를 포함하고 동시에 발현시킬 수 있는 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스로서, 상기 유전자는 MVA 게놈내 결실 III의 자리에 삽입되며, 단 적어도 하나의 유전자는 PB2 및/또는 M2e 중 하나인 것을 특징으로 하는 바이러스.
제19항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스.
인플루엔자 바이러스 유전자는 개별 P11 프로모터의 전사 조절하에 있는, 제19항 또는 제20항의 바이러스를 포함하는 백신.
제2항 및 제19항의 재조합 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 바이러스의 제조 방법으로서,
a) 포유동물 셀 라인을 배양하는 단계,
b) 셀 라인을 컨플루언시(confluency)까지 성장시키는 단계,
c) 세포를 Blu-MVA 바이러스로 감염시키는 단계,
d) P11 프로모터의 조절 하에서 인플루엔자 바이러스를 포함하는 핵산으로 세포를 트랜스펙션하는 단계,
e) 자손 바이러스를 계대시켜 재조합 MVA의 역가를 증가시키는 단계 및
f) 재조합 바이러스의 분리 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항에 있어서, 사용된 포유동물 셀 라인은 BHK21인 것을 특징으로 하는 방법.
선택적으로 다른 부형제, 희석제 및 안정제를 더 포함하는, 제2항 및 제19항의 바이러스를 포함하는 백신.
비경구 및 경구 투여에 적당한, 제2항 및 제19항의 바이러스를 포함하는 백신.
제25항에 있어서, 비강내, 근육내 및 점막 경로를 통한 투여가 적당한 것을 특징으로 하는 백신.
제26항에 있어서, 상기 조성물은 점비약 또는 스프레이로서 액체 형태로, 또는 흡입을 통해, 분말 또는 크림 또는 에멀젼으로서 비강 경로를 통한 전달에 적당한 것을 특징으로 하는 백신.
백신의 세부사항, 예를 들어, 투여를 위한 설명서, 백신 내 항원의 세부사항 등을 제공하는 리플렛을 포함하는, 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항의 백신을 포함하는 키트.
선행 단계들 중 어느 하나의 백신의 피험자에 투여에 의한 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 감염의 치료 방법.