JP2023534839A - インフルエンザウイルスバックボーン - Google Patents

Abstract

本発明は、Vero細胞内での増殖が増強されたインフルエンザウイルスを提供する。該インフルエンザウイルスは、選択されたヌクレオチドを有し、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、PA、NP及びNS遺伝子セグメントを含む。該発明はまた、該インフルエンザウイルスを含有する医薬製剤、並びに、該インフルエンザウイルスを哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における免疫応答の誘発方法及び該インフルエンザウイルスの生成方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年7月21日に出願された合衆国仮特許出願第63/054,676号の利益を主張しており、参照することによりそのすべてが本明細書に組み込まれる。

連邦政府によって支援された研究又は開発
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号AI109925の下で、連邦政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

電子的に提出された材料の参照による組み込み
本明細書とともに提出され、以下のとおり特定されたコンピュータ読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。2021年7月20日に作成され「755023SequenceListing.txt」と名付けられた１つの46,917バイトのASCII(Text)ファイル

発明の背景
インフルエンザ、即ち「flu」は、毎年世界全体で何十万もの人命を奪う、非常に伝染性の強いウイルス感染症である。季節性の流行は、ほとんどの場合蔓延するA型及びB型インフルエンザウイルスにより引き起こされるが、それらのコアタンパク質に基づいて分類された4種類（即ち、A、B、C及びD）のインフルエンザウイルスが存在する。

ワクチンはインフルエンザを予防するための最良の方法であるが、インフルエンザウイルスは抗原連続変異及び抗原不連続変異しがちであるので、インフルエンザワクチンはしばしば製剤化し直さなければならない。そのうえ、インフルエンザウイルスは、一般に高率の変異及び進化を示すので、インフルエンザワクチン株は蔓延する株と不一致となり、それによってワクチンの有効性が最小となる可能性がある。しかしながら、蔓延するインフルエンザウイルスがインフルエンザワクチンとよく一致すれば、ワクチン接種は全人口の40%～60%のインフルエンザ関連疾患のリスクを低減することができる。したがって、研究者らは、異なるインフルエンザサブタイプ間で交差防御免疫を誘導し得るワクチンを研究している。1つのそのような例は、機能的なM2タンパク質を発現しない生の弱毒化インフルエンザウイルス（例、A型インフルエンザに対するM2SRワクチン）である。

哺乳動物細胞培養は卵をベースにした製造に比べて利点があるので、インフルエンザワクチンは、マディン－ダービー イヌ腎臓（MDCK）細胞やアフリカミドリザル（Vero）細胞で増殖させるのが好ましい。これらの利点には、より低コストであること、製造時間がより速いこと、ウイルスにおける抗原変異のリスクが低減すること等が挙げられる。例えば、M2SRワクチンはM2タンパク質を安定に発現するVero細胞中で増殖される。しかし、細胞培養におけるワクチン製造は、しばしば望ましくない収率を招いてきた。さらに、MDCK細胞は一般的にVero細胞に比べてより許容状態であり、Vero細胞におけるウイルス製造は比較的非効率である。

ウイルスバックボーン、即ち、PB1、PB2、PA、NP、M及びNSからなる6つの内部遺伝子セグメントへの修飾がワクチン製造を増強することが示されている。例えば、Pingら、Nature Communications, 6: 8148 (2015)において開発され記載されている、高収率のA型インフルエンザワクチンバックボーン「PR8-HY」や、Pingら、PNAS, 113(51): E8296-E8305 (2016)において開発され記載されている、高収率のB型インフルエンザワクチンバックボーンは、PB1、PB2、PA、NP、M及びNS1タンパク質に特定のアミノ酸変異を含み、細胞及び卵のどちらの培養系でも、パンデミック及び季節性インフルエンザワクチンの力価を向上させることが期待された。しかし、当該技術分野で記載されるこれらの修飾は、Vero細胞におけるウイルス増殖を増大させるのには無効であり、好適な製造条件下では特にそうであった。それゆえ、ワクチンをより効率的にかつより有効に製造し得るように、Vero細胞におけるウイルス増殖を増強する必要性がある。

発明の簡単な要約
本発明は、Vero細胞における増殖が増強されたインフルエンザウイルスを提供する。該インフルエンザウイルスは、例えば、PB1、PB2、PA、NP、M及びNS1タンパク質といったタンパク質をコードする遺伝子セグメントを含み、少なくともPA、NP及びNS遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。特に、PA遺伝子セグメントはヌクレオチド位置2272にチミンを含む。NPタンパク質は、40位にセリン、161位にアスパラギン又はグリシン、204位にスレオニンを含み、任意で93位にバリンを含む。NS遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置39にグアニンを含み、NS遺伝子セグメントは176位にグルタミンを含むNS1タンパク質をコードする。

本発明はまた、該インフルエンザウイルスを含む医薬製剤、該インフルエンザウイルスを哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における免疫応答を誘発する方法、並びに、該インフルエンザウイルスを生成する方法を提供する。

図1は、インフルエンザBM2SR4 CA12 BM2SR HA及びNP変異のBM2Vero P3における時間(日)に対する増殖を示すグラフである。 図2は、B型インフルエンザNP変異体の動物由来フリー(AOF)培地中での時間(感染後の日数)に対する増殖を示すグラフである。 図3は、B型インフルエンザのバックボーンにおけるNS 569_570insAの変異頻度が後続の世代へと約20%から約50%増大したことを示す一連のサンガー配列クロマトグラムデータである。 図4は、WA/02/2019 N209S及びK420E HAのBM2Vero P3におけるAOF中での時間(接種後の日数)に対する増殖を示すグラフである。 図5は、インフルエンザBM2SR4 CA12 HA2変異のBM2Vero P3における時間(日)に対する増殖を示すグラフである。 図6は、B型インフルエンザCA12 N211T HA2変異体のAOF中での時間(感染後の日数)に対する増殖を示すグラフである。 図7Aは、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、二価のBM2SR、三価のBM2SR+M2SR-H1N1、三価のBM2SR+M2SR-H3N2、四価のM2SR、又はシュークロース-リン酸塩-グルタミン酸塩緩衝液(「SPG」コントロール）で免疫感作したマウス由来血清中の抗B型インフルエンザ-Vic HAの、時間（免疫感作後の日数）に対する力価を示すグラフである。 図7Bは、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、二価のBM2SR、三価のBM2SR+M2SR-H1N1、三価のBM2SR+M2SR-H3N2、四価のM2SR、又はSPG(コントロール)で免疫感作したマウス由来血清中の抗B型インフルエンザ-Yam HAの、時間(免疫感作後の日数)に対する力価を示すグラフである。 図8は、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、又はSPG(コントロール)で免疫感作したマウスの、B/Malaysia/2506/2004 (Vic)ウイルス投与後の時間（投与後の日数）に対するマウス％体重変化を示すグラフである。 図9は、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUMIST(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) High Dose、又はSPG（コントロール）で免疫感作後の、時間（投与後の日数）に対するマウス％体重変化を示すグラフである。 図10Aは、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUMIST(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) High Dose、又はSPG(コントロール)で免疫感作したマウス血清中の抗B型インフルエンザ-Vic HA血清IgGの、時間(ワクチン接種後の日数)に対するELISA力価を示すグラフである。 図10Bは、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUMIST(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) High Dose、又はSPG(コントロール)で免疫感作したマウス血清中の抗B型インフルエンザ-Yam HA血清IgGの、時間（ワクチン接種後の日数）に対するELISA力価を示すグラフである。 図10Cは、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUMIST(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) High Dose、又はSPG(コントロール)で免疫感作したマウス血清中の抗A型インフルエンザ/H1 HA血清IgGの、時間(ワクチン接種後の日数)に対するELISA力価を示すグラフである。 図10Dは、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUMIST(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) High Dose、又はSPG(コントロール)で免疫感作したマウス血清中の抗A型インフルエンザ/H3 HA血清IgGの、時間(ワクチン接種後の日数)に対するELISA力価を示すグラフである。 図11Aは、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUMIST(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) High Dose、又はSPG（コントロール）で免疫感作したマウスの気管-肺洗浄液中の、HA1試験抗原（A/H1、A/H3、B/Yam、又はB/Vic）に対するIgG ELISA力価を示すグラフである。 図11Bは、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUMIST(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) High Dose、又はSPG(コントロール)で免疫感作したマウスの気管-肺洗浄液中の、HA1試験抗原(A/H1、A/H3、B/Yam、又はB/Vic)に対する抗インフルエンザHA1 IgAのELISA力価を示すグラフである。 図12は、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUMIST(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) Quadrivalent、FLUZONE(商標) High Dose、又はSPG(コントロール)で免疫感作したマウスの、B型インフルエンザ/Malaysia/2506/2004 (Vic)投与後の時間(投与後の日数)に対するマウス%体重変化を示すグラフである。 図13Aは、BM2SR-Vicドナーフェレット並びにそれらと直接接触したフェレット及びエアロゾル接触したフェレット由来の鼻洗浄液中の、時間(接種後の日数)に対するBM2SR-Vicウイルス力価を示すグラフである。ウイルス検出限界は1.67 log TCID₅₀/mL(破線)であった。 図13Bは、B型インフルエンザ（Vic）ドナーフェレット並びにそれらと直接接触したフェレット及びエアロゾル接触したフェレット由来の鼻洗浄液中の、時間(接種後の日数)に対する野生型B型インフルエンザ(Vic)ウイルス力価を示すグラフである。個々のフェレットのウイルス力価、グループ平均及び該平均値の標準誤差をプロットしている。ウイルス検出限界は1.67 log TCID₅₀/mL(破線)であった。 図14Aは、表10に記載されるように免疫感作した13フェレットグループの血清中の、時間(試験日数)に対する抗A型インフルエンザ/H1 HAI力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は7.5であった。 図14Bは、表10に記載されるように免疫感作した13フェレットグループの血清中の、時間(試験日数)に対する抗A型インフルエンザ/H3 HAI力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は7.5であった。 図14Cは、表10に記載されるように免疫感作した13フェレットグループの血清中の、時間(試験日数)に対する抗B型インフルエンザ/Yam HAI力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は7.5であった。 図14Dは、表10に記載されるように免疫感作した13フェレットグループの血清中の、時間(試験日数)に対する抗A型インフルエンザ/Vic HAI力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は7.5であった。 図15Aは、表10に記載されるように免疫感作した13フェレットグループの血清中の、時間(試験日数)に対する抗A型インフルエンザ/H1 PRNT力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は15であった。 図15Bは、表10に記載されるように免疫感作した13フェレットグループの血清中の、時間(試験日数)に対する抗A型インフルエンザ/H3 PRNT力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は15であった。 図15Cは、表10に記載されるように免疫感作した13フェレットグループの血清中の、時間(試験日数)に対する抗B型インフルエンザ/Yam PRNT力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は15であった。 図15Dは、表10に記載されるように免疫感作した13フェレットグループの血清中の、時間(試験日数)に対する抗A型インフルエンザ/Vic PRNT力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は15であった。 図16は、実施例14に記載したようにB型インフルエンザ/Vicを投与後3日目の鼻甲介中の投与ウイルスの力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は1.3 log FFU/gであった。 図17は、実施例14に記載したようにB型インフルエンザ/Vicを投与後1、3、5及び7日目の鼻洗浄液中の投与ウイルスの力価を示すグラフである。グループごとの平均力価をプロットしている。検出限界は1.6 log TCID₅₀/mLであった。 図18Aは、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016ウイルスで細胞を刺激した後(ワクチン接種後28日目及び37日目に細胞を回収した)の、IFN-γを産生するPBMCの頻度(10⁶細胞あたりのスポット形成単位)を示すグラフである。 図18Bは、A/California/07/2009 HAペプチドプールで細胞を刺激した後(ワクチン接種後28日目及び37日目に細胞を回収した)の、IFN-γを産生するPBMCの頻度（10⁶細胞あたりのスポット形成単位）を示すグラフである。 図19Aは、B型インフルエンザ/Vic投与後の各フェレットグループにおける平均％体重変化を示すグラフである。 図19Bは、B型インフルエンザ/Vic投与後の各フェレットグループにおける平均体温変化を示すグラフである。

発明の詳細な説明
本発明のインフルエンザウイルスは、いかなるタイプのインフルエンザウイルスであってもよい。例えば、該インフルエンザウイルスは、任意のサブタイプのB型インフルエンザ（例、ビクトリア又はヤマガタ）であってよい。いくつかの実施態様においては、該インフルエンザウイルスは季節性のB型インフルエンザウイルスであってよい。いくつかの実施態様においては、該インフルエンザウイルスは組換えインフルエンザウイルスであってよい。本明細書で用いられる組換えインフルエンザウイルス（例、再集合体インフルエンザウイルス）は、遺伝的に区別される、即ち、異なるインフルエンザウイルス（例、異種遺伝子セグメント）に由来する遺伝的材料（例、遺伝子セグメント）を含むインフルエンザウイルスである。該インフルエンザウイルスはまた、単離されたインフルエンザウイルスであってもよい。

本明細書で用いられる「遺伝子セグメント」なる語は、ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。該遺伝子セグメントは、ウイルスRNA（vRNA）をコードするcDNA(相補的DNA)配列、即ち、1つ又は複数のウイルスタンパク質をコードする配列番号8～12及び18により表すことができる。

本明細書で用いられる「バックボーン」なる語は、PB1、PB2、PA、NP、NS1及び/又はNS2、並びにMタンパク質をコードするインフルエンザ遺伝子セグメントを意味する。本発明の遺伝子セグメントは、選択されたアミノ酸を有し得るタンパク質をコードする。

本明細書で用いられる「選択されたアミノ酸」なる語は、アミノ酸配列の特定の位置にある特定のアミノ酸を意味する。いくつかの実施態様において、選択されたアミノ酸は、元のアミノ酸配列に対する遺伝的変異の結果である。元のアミノ酸配列は、該選択されたアミノ酸に対応する位置を除いて、該選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列と同一であり得る。

インフルエンザウイルス
(A)バックボーンタンパク質
本発明の一実施態様において、インフルエンザウイルスはPA、NP、及びNS遺伝子セグメントを含み、(a)該PA遺伝子セグメントはヌクレオチド位置2272にチミンを含み、(b)該NP遺伝子セグメントは選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するNPタンパク質をコードし、該選択されたアミノ酸は、40位のセリン、161位のアスパラギンもしくはグリシン、204位のスレオニンを含み、任意で93位のバリンを含んでもよく、(c)該NS遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置39にグアニンを含み、かつ該NS遺伝子セグメントは選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するNS1タンパク質をコードし、該選択されたアミノ酸は176位のグルタミンを含む。

本発明のPB1(ポリメラーゼ塩基性タンパク質1)遺伝子セグメントは、少なくとも1つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、即ち、PB1タンパク質をコードし得る。該選択されたアミノ酸は、元のPB1配列、例えば、該選択されたアミノ酸に対応する位置を除いて、本発明のPB1アミノ酸配列と同一の配列に対する遺伝的変異により取得することができる。本発明のPB2(ポリメラーゼ塩基性タンパク質2)遺伝子セグメントもまた、少なくとも1つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、即ち、PB2タンパク質をコードし得る。

本発明のPA(ポリメラーゼ酸性タンパク質)遺伝子セグメントもまた、少なくとも1つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、即ち、PAタンパク質をコードし得る。好ましい実施態様において、該遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置2272にチミンを含む。

本発明のNP(核タンパク質)遺伝子セグメントもまた、少なくとも1つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、即ち、NPタンパク質をコードし得る。好ましい実施態様において、該NPセグメントは、177位にチミン、540位にアデニン及び670位にチミンを含み、該NP遺伝子セグメントは、40位のセリン、161位のアスパラギンもしくはグリシン、204位のスレオニンを含み、任意で93位のバリンを含んでもよい選択されたアミノ酸を有するタンパク質をコードする。

本発明のNS(非構造的)遺伝子セグメントもまた、少なくとも1つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、即ち、NS1及び／又はNS2タンパク質をコードし得る。好ましい実施態様において、該NSセグメントは、ヌクレオチド位置39にグアニン及び570位にシトシンを含み、該NS遺伝子セグメントは、176位のグルタミンを含む選択されたアミノ酸を有するNSタンパク質(NS1タンパク質)をコードする。

本発明の一実施態様において、インフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質、即ち、PB1タンパク質をコードするPB1遺伝子セグメントを含む。該PB1遺伝子セグメントは、配列番号8で表されるヌクレオチド配列を有し得る。該PB1遺伝子セグメントは、配列番号13のアミノ酸配列を有するタンパク質、即ち、PB1タンパク質をコードし得る。本実施態様の別の側面において、インフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質、即ち、PB2タンパク質をコードするPB2遺伝子セグメントを含み得る。該PB2遺伝子セグメントは、配列番号9で表されるヌクレオチド配列を有し得る。該PB2遺伝子セグメントは、配列番号14のアミノ酸配列を有するタンパク質、即ち、PB2タンパク質をコードし得る。本実施態様の別の側面において、インフルエンザウイルスは、40、161及び204位に選択されたアミノ酸、即ち、40位のセリン、161位のアスパラギンもしくはグリシン、204位のスレオニンを有し、任意で93位のバリンを有していてもよいタンパク質、即ち、NPタンパク質をコードするNP遺伝子セグメントを含み得る。該NP遺伝子セグメントは、配列番号11で表されるヌクレオチド配列を有し得る。該NP遺伝子セグメントは、配列番号16のアミノ酸配列を有するタンパク質、即ち、NPタンパク質をコードし得る。本実施態様の別の側面において、インフルエンザウイルスは、176位に選択されたアミノ酸、即ち、176位にグルタミンを有するタンパク質、即ち、NS1及び／又はNS2タンパク質をコードするNS遺伝子セグメントを含み得る。該NS遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置39にグアニン、及び570位にシトシン含み得る。該NS遺伝子セグメントは、配列番号12で表されるヌクレオチド配列を有し得る。該NP遺伝子セグメントは、配列番号17のアミノ酸配列を有するタンパク質、即ち、NS1及び／又はNS2タンパク質をコードし得る。本実施態様の別の側面において、インフルエンザウイルスは、タンパク質、即ち、PAタンパク質をコードするPA遺伝子セグメントを含み得る。該PA遺伝子セグメントは、配列番号10で表されるヌクレオチド配列を有し得る。該PA遺伝子セグメントは、配列番号15のアミノ酸配列を有するタンパク質、即ち、PAタンパク質をコードし得る。

本実施態様の選択されたアミノ酸は、特にバックボーンのほとんどのタンパク質において、該選択されたアミノ酸がないこと以外は同一であるインフルエンザウイルスと比較して、同一条件下で、インフルエンザウイルスに対して増強された増殖特性を付与する。例えば、本発明のインフルエンザウイルスは、Vero細胞において増強された増殖を示す。

本発明のインフルエンザウイルスはまた、M(マトリクスタンパク質)遺伝子セグメントを含み得る。本発明の一実施態様において、該M遺伝子セグメントは、ウイルスが機能的なBM2タンパク質の発現を欠くような、B型インフルエンザ由来の変異遺伝子セグメントであり得る。そのようなウイルスを、本明細書では「BM2SR」ウイルスという。BM2SRウイルスは単一複製B型インフルエンザウイルスである。BM2SRウイルスのM遺伝子セグメントは、配列番号18で表され得る。該M遺伝子セグメントは、タンパク質、例えば、配列番号20のアミノ酸配列を有する短縮化されたBM2タンパク質をコードし得る。BM2SRウイルスは、BM2タンパク質を安定に発現するVero細胞(即ち、BM2Vero細胞)内で増殖させることができ、多サイクル複製が可能となる。Vero細胞内での高収量はM遺伝子セグメントにおける変異に依存しない。それゆえ、本発明のインフルエンザウイルスは、機能的なM2タンパク質をコードするM遺伝子セグメントを含んでもよい。

(B)表面タンパク質
本発明のさらなる実施態様において、インフルエンザウイルスは、NA(ノイラミニダーゼ)及びHA(ヘマグルチニン)遺伝子セグメントを含む。本発明の一実施態様において、該HA遺伝子セグメントは、HAタンパク質のHA1サブユニット内に少なくとも1つの選択されたアミノ酸(例、アミノ酸変異)及び/又は該タンパク質のHA2サブユニット内に少なくとも1つの選択されたアミノ酸(例、アミノ酸変異)を含むアミノ酸配列を有するHAタンパク質をコードし得る。例えば、HA2サブユニットにおける少なくとも1つのアミノ酸変異は、61位のグルタミン酸であり得る。別の実施態様においては、HA2サブユニットにおける少なくとも1つのアミノ酸変異は、112位のグルタミン酸であり得る。該アミノ酸変異は、B型インフルエンザウイルスの任意のサブタイプ又は系統(即ち、ビクトリア又はヤマガタ)に存在し得る。好ましい実施態様において、HA2サブユニットにおけるアミノ酸変異は、B型インフルエンザウイルスのビクトリア系統における61位のグルタミン酸であり得る。別の好ましい実施態様において、HA2サブユニットにおけるアミノ酸変異は、B型インフルエンザウイルスのヤマガタ系統における112位のグルタミン酸であり得る。そのような変異もまた、産生中のウイルスの増殖の増強に寄与し得る。

本発明の一実施態様において、PA、NP、及びNS遺伝子セグメントは、単一のインフルエンザ株に由来する。本発明の別の実施態様において、PB1、PB2、PA、NP、及びNS遺伝子セグメントは、単一のインフルエンザ株に由来する。一実施態様において、HA遺伝子セグメントは、PA、NP、及びNS遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株由来であり得る。別の実施態様において、HA遺伝子セグメントは、PB1、PB2、PA、NP、及びNS遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株由来であり得る。同様に、NA遺伝子セグメントは、PA、NP、及びNS遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株由来であり得る。別の実施態様において、NA遺伝子セグメントは、PB1、PB2、PA、NP、及びNS遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株由来であり得る。従って、本発明のインフルエンザウイルスは、季節性のインフルエンザウイルス(例、B型インフルエンザ)であり得る。

(C)インフルエンザウイルスの特性
本発明のインフルエンザウイルスのバックボーンは、特にVero細胞において、インフルエンザウイルスのタイプに関係なく、インフルエンザウイルスに高い増殖特性を付与する。本発明のインフルエンザウイルスは、低い感染多重度(MOI)(例、0.001)を用いる製造プロセスにおいてさえも高収量を示す。MOIとは、感染標的(例、細胞)あたりの病原体(例、ウイルス)の平均数を意味する。多サイクルの感染を必要とする場合(例、ウイルスワクチン製造)は、より低いMOIが用いられる。医薬品適正製造基準の規制がFDAにより施行され、高収量のウイルスをなおも産生する最低のMOIの使用が一般に要請されている。これは、マスターシードストックは高価であり、非感染性粒子や過剰細胞性タンパク質による毒性がウイルス産生を低減させ得るためである。

本発明のさらなる実施態様において、インフルエンザウイルスは遺伝的に安定であり、バックボーンタンパク質、特にPB1、PB2、PA、NP、及びNSタンパク質は、たとえ低MOIで増殖させたとしても、高度に保存されている。例えば、本発明の一実施態様において、選択されたアミノ酸は、Vero細胞株での、少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、又は11回以上の連続継代の後も、PB1、PB2、NP、及びNSタンパク質の少なくとも1つにおいて保存されている。一実施態様において、Vero細胞株は、B型インフルエンザウイルスのBM2イオンチャネルタンパク質を安定に発現するVero細胞(即ち、BM2Vero細胞)を含み得る。本発明の好ましい実施態様において、選択されたアミノ酸は、B型インフルエンザウイルスのBM2イオンチャネルタンパク質を安定に発現するVero細胞株での少なくとも10回の連続継代の後も、NP及びNSタンパク質の少なくとも1つにおいて保存されている。BM2は、A型インフルエンザウイルスのM2に機能的に対応するものと考えられている。そのような実施態様においては、選択されたアミノ酸は、インフルエンザウイルスがたとえA型インフルエンザウイルスであっても保存され得る。

遺伝的に改変されたVero細胞(即ち、インフルエンザM2又はBM2タンパク質を発現するもの)は通常のVero細胞と同様の挙動を示し、通常のVero細胞に匹敵するA型もしくはB型インフルエンザウイルスの増殖を支持する。M2VeroA細胞におけるM2SRウイルスについてのウイルス力価は、未改変のVero細胞株内での、機能的なM2を発現する複製中のインフルエンザウイルスに匹敵する。さらに、BM2SRウイルス(即ち、B型インフルエンザ由来の変異M遺伝子セグメントを含み、結果として機能的なBM2タンパク質を発現しないインフルエンザウイルス)についてのBM2Vero細胞におけるウイルス力価は、未改変のVero細胞株内での、機能的なBM2を発現する複製中のインフルエンザウイルスに匹敵する。従って、M2SR及びBM2SRウイルスはM2VeroA及びBM2Vero細胞株内で複製中のインフルエンザウイルスと同様の挙動を示す。

本発明の一実施態様において、インフルエンザウイルスはヒト細胞内で複製することができる。

インフルエンザウイルスの生成方法
本発明はまた、インフルエンザウイルスの生成方法を提供し、一実施態様において、生成したインフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質を発現するPA、NP、及びNS遺伝子セグメント、即ち、本明細書に開示される本発明の組換えインフルエンザウイルスを含むる。別の実施態様において、生成したインフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質を発現するPB1、PB2、NP、及びNS遺伝子セグメント、即ち、本明細書に開示される本発明の別の実施態様を含む。

本発明の方法の一実施態様において、組換えインフルエンザウイルスの生成方法は、組換えインフルエンザウイルス(例、第一のインフルエンザウイルス)を、Vero細胞内で連続的に継代し、該生成したインフルエンザウイルス(例、第二のインフルエンザウイルス)を生成することを含む。第一のインフルエンザウイルスは、タンパク質、即ち、本発明のインフルエンザウイルスに関して記載した、選択されたアミノ酸を有するPA、NP、及びNS1タンパク質を発現するPA、NP、及びNS遺伝子セグメントを含み得る。例えば、第一のインフルエンザウイルスは、ヌクレオチド位置2272にチミンを含むPA遺伝子セグメントを含み得る。該PA遺伝子セグメントは、タンパク質、即ち、PAタンパク質をコードし得る。第一のインフルエンザウイルスのNP遺伝子セグメントは、177位にチミン、540位にアデニン、及び670位にチミンを含むことができ、40位にセリン、161位にアスパラギンもしくはグリシン、204位にスレオニンを含み、任意で93位にバリンを含んでもよいタンパク質、即ち、NPタンパク質をコードし得る。第一のインフルエンザウイルスのNS遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置39にグアニンを含むことができ、176位にグルタミンを含むタンパク質、即ち、NS1及び／又はNS2タンパク質をコードし得る。本発明の一実施態様において、第二のインフルエンザウイルス（例、生成したインフルエンザウイルス）は、Vero細胞内での第一のインフルエンザウイルスの少なくとも4回又は少なくとも5回の連続継代の後に生成される。第一のインフルエンザウイルスは、タンパク質、即ち、本発明のインフルエンザウイルスに関して記載した、選択されたアミノ酸を有するPB1及びPB2タンパク質を発現するPB1及びPB2遺伝子セグメントをさらに含み得る。

本発明のインフルエンザウイルスはまた、標準的なウイルスレスキュー技術を用いても生成することができる。例えば、本発明の一実施態様において、8つのウイルス遺伝子セグメント(即ち、PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA、及びNA)の各々に対するcDNAがクローニングされた1以上のプラスミドであって、各cDNA配列がRNAポリメラーゼIプロモーターとRNAポリメラーゼIターミネーターとで挟まれているプラスミド(即ち、pPolIプラスミド)が真核宿主細胞にトランスフェクトされる。PB1、PB2、PA、NP、並びにNS1及び/又はNS2タンパク質をコードする遺伝子セグメントは、本発明の選択されたアミノ酸を有するタンパク質をコードし得る。M2又はBM2タンパク質をコードする遺伝子セグメントは、該遺伝子セグメントが機能的なM2又はBM2をコードしないように、変異M2又はBM2遺伝子セグメントを含み得る。該宿主細胞はまた、ウイルスタンパク質(例、PA、PB1、PB2、及びNPタンパク質の少なくとも1つ以上、あるいは、PB1、PB2、PA、NP、M、NS1及び/又はNS2、HA、並びにNAタンパク質の少なくとも1つ以上)をコードする1以上の発現プラスミドでもトランスフェクトすることができる。8つのインフルエンザvRNA(即ち、遺伝子セグメント)は、次いで、宿主細胞への少なくとも1以上のプラスミドのトランスフェクションの後に合成される。共トランスフェクトされたウイルスポリメラーゼ及び核タンパク質がvRNAを、複製され、転写される機能的なvRNP（即ち、ウイルスリボヌクレオタンパク質複合体）にアッセンブリさせ、最終的に本発明の組換えインフルエンザウイルスを形成する。このプラスミドをベースにしたリバースジェネティクスシステムは、Neumann et al., PNAS,96: 9345-9350 (1999)によりさらに詳述されている。本発明のインフルエンザウイルスはまた、当該技術分野で公知の他の方法、例えば、それに限定されないが、米国特許第9,284,533号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるリボヌクレオタンパク質（RNP）トランスフェクションシステムなどを用いても生成することができる。

医薬製剤
本発明は、本明細書に記載される本発明の組換えウイルスを含有する医薬製剤(例、ワクチン又は他の免疫学的組成物)を提供する。

該医薬製剤は、少なくとも1つの医薬上許容される担体又は賦形剤をさらに含有し得る。本明細書で用いられる「医薬上許容される担体又は賦形剤」なる語は、本発明のインフルエンザウイルス以外の該医薬製剤の任意の成分を意味する。医薬上許容される担体又は賦形剤は、望ましくは本発明の組換えウイルスを顕著に不活性化することなく、本発明の組換えウイルスの有効性を増強し、又は該医薬製剤の安定性を維持することができる。

少なくとも1つの医薬上許容される担体又は賦形剤は、任意の適切な医薬上許容される担体又は賦形剤であってよく、それらの多くは当該技術分野で公知である。医薬上許容される担体又は賦形剤の例としては、医薬製剤のpHを維持する成分(例、緩衝液)、張力を調整する成分(例、無機塩などの等張化剤)、タンパク質(例、ウイルス)の安定性及び/又は免疫原性を改善する成分、粘膜接着を改善する成分、タンパク質の凝集を防止する成分、並びに/あるいは、医薬製剤を保存する成分(例、保存剤)が挙げられる。例えば、医薬上許容される担体又は賦形剤は、無機塩、界面活性剤、アミノ酸、高分子又は高分子化合物(例、タンパク質、多糖、又はハイドロゲル)、キレート剤、糖、ポリオール、及び/又はアジュバント(例、特定の免疫応答を増大させる任意の物質)の少なくとも1つを含有することができ、それらの多くは当該技術分野で公知である。ある特定の担体又は賦形剤は医薬製剤中で2以上の目的に働く。従って、以下の実施態様は本明細書に記載された記述に限定されない。

任意の適切な緩衝液を医薬製剤中に存在させ得る。一実施態様において、緩衝液は、イミダゾール緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(例、1×DPBS)、ヒスチジン緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、及びシュークロース-リン酸塩-グルタミン酸塩緩衝液(SPG)の少なくとも1つを含む。PBS及び/又はDPBS調製物は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、及びリン酸水素二ナトリウムを含むことができ、任意で、塩化カルシウム及び/又は塩化マグネシウムをさらに含み得る。任意の適切なPBS及び/又はDPBS調製物を該医薬製剤において緩衝液として使用することができ、それらの多くは当該技術分野において公知であるが、いくつかの実施態様においては、PBS及び/又はDPBS調製物は、約136.9mMの塩化ナトリウム、約2.67mMの塩化カリウム、約1.47mMのリン酸二水素カリウム、及び約8.1mMのリン酸水素二ナトリウムを含有する。

該医薬製剤において、緩衝液は任意の適切な濃度で存在し得る。該医薬製剤において、緩衝液は、約0.1 mM以上、約1 mM以上、約10 mM以上、約20 mM以上、約30 mM以上、約40 mM以上、約50 mM以上、約60 mM以上、約70 mM以上、約 80 mM以上、約90 mM以上、約100 mM以上、約120 mM以上、約140 mM以上、約160 mM以上、約180 mM以上、約200 mM以上、約250 mM以上、約300 mM以上、約350 mM以上、約400 mM以上、約450 mM以上、又は約500 mM以上の濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、該医薬製剤において、緩衝液は、約1,000 mM以下、約500 mM以下、約450 mM以下、約400 mM以下、約350 mM以下、約300 mM以下、約250 mM以下、約200 mM以下、約180 mM以下、約160 mM以下、約140 mM以下、約120 mM以下、約100 mM以下、約90 mM以下、約80 mM以下、約70 mM以下、約60 mM以下、約50 mM以下、約40 mM以下、約30 mM以下、約20 mM以下、約10 mM以下、又は約1 mM以下の濃度で存在し得る。該医薬製剤において、緩衝液は、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、該医薬製剤において、緩衝液は、約0.1 mM～約1000 mM、約0.1 mM～約500 mM、約0.1 mM～約100 mM、約1 mM～約1000 mM、約1 mM～約500 mM、約1 mM～約100 mM、約100 mM～約1000 mM、約100 mM～約500 mM等の濃度で存在し得る。

さらなる実施態様においては、該医薬製剤において、緩衝液はパーセント濃度(例、体積/体積パーセント(% v/v)、重量/体積パーセント(% w/v)、又は重量/重量パーセント(% w/w))で存在する。該医薬製剤において、緩衝液は、約0.1%以上、約1%以上、約5%以上、約10%以上、約15%以上、約20%以上、約30%以上、約40%以上、約50%以上の濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、該医薬製剤において、緩衝液は、約60%以下、約50%以下、約40%以下、約30%以下、約20%以下、約15%以下、約10%以下、約5%以下、又は約1%以下の濃度で存在し得る。該医薬製剤において、緩衝液は、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意のパーセント濃度で存在し得る。例えば、該医薬製剤において、緩衝液は、約0.1%～約60%、約1%～約60%、約10%～約60%、約0.1%～約50%、約1%～約50%、約10%～約50%、約20%～約60%、約20%～約50%、約20%～約40%、約20%～約30%、約30%～約40%、約40%～約50%等のパーセント濃度で存在し得る。

緩衝液は、医薬製剤のpHを任意の適切なpHで維持することができる。緩衝液は、医薬製剤のpHを、例えば、約4以上、約4.5以上、約5以上、約5.5以上、約6以上、約6.5以上、約7以上、又は約7.5以上のpHで維持することができる。あるいは、又はそれに加えて、緩衝液は、医薬製剤のpHを、例えば、約8以下、約7.5以下、約7以下、約6.5以下、約6以下、約5.5以下、約5以下、又は約4.5以下のpHで維持することができる。緩衝液は、医薬製剤のpHを、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内のpHで維持することができる。例えば、緩衝液は、医薬製剤のpHを、約4～約8、約4.5～約8、約5～約8、約5.5～約8、約6～約8、約6.5～約8、約7～約8、約7.5～約8、約4～約7.5、約5～約7.5、約6～約7.5、約7～約7.5、約4～約7、約5～約7、約6～約7等のpHで維持することができる。

任意の適切な等張化剤を医薬製剤中に存在させ得る。一実施態様において、1以上の無機塩が該医薬製剤中に等張化剤として存在する。該無機塩は、塩化ナトリウム、（NaCl）、硫酸マグネシウム（MgSO₄）、及び塩化マグネシウム（MgCl₂）の少なくとも1つであり得る。等張化剤、例えば無機塩は、任意の適切な量で該医薬製剤中に存在し得る。等張化剤、例えば無機塩は、該医薬製剤中、約0.1 mM以上、約 0.2 mM以上、約0.4 mM以上、約0.6 mM以上、約0.8 mM以上、約1 mM以上、約1.2 mM以上、約1.4 mM以上、約1.6 mM以上、約1.8 mM以上、約2 mM以上、約3 mM以上、約4 mM以上、約5 mM以上、約6 mM以上、約7 mM以上、約8 mM以上、約9 mM以上、約10 mM以上、約20 mM以上、約30 mM以上、約40 mM以上、約50 mM以上、約100 mM以上、約200 mM以上、約300 mM以上、約400 mM以上、約500 mM以上、約600 mM以上、約700 mM以上、約800 mM以上、約900 mM以上、約1000 mM以上、又は約1500 mM以上の濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、等張化剤、例えば無機塩は、該医薬製剤中、約2000 mM以下、 約1500 mM以下、約1000 mM以下、約900 mM以下、約800 mM以下、約700 mM以下、約600 mM以下、約500 mM以下、約450 mM以下、約400 mM以下、約350 mM以下、約300 mM以下、約250 mM以下、約200 mM以下、約150 mM以下、約100 mM以下、約50 mM以下、約45 mM以下、約40 mM以下、約35 mM以下、約30 mM以下、約25 mM以下、約20 mM以下、約10 mM以下、約9 mM以下、約8 mM以下、約7 mM以下、約6 mM以下、約5 mM以下、約4 mM以下、約3 mM以下、約2 mM以下、約1.8 mM以下、約1.6 mM以下、約1.4 mM以下、約1.2 mM以下、約1 mM以下、約0.8 mM以下、約0.6 mM以下、約0.4 mM以下、又は約0.2 mM以下の濃度で存在し得る。等張化剤、例えば無機塩は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、等張化剤、例えば無機塩は、該医薬製剤中、約0.1 mM～約2000 mM、約0.1 mM～約1500 mM、約0.1 mM～約1000 mM、約0.1 mM～約500 mM、約0.1 mM～約250 mM、約0.1 mM～約100 mM、約0.1～約50 mM、約0.1 mM～約10 mM、約1 mM～約2000 mM、約1 mM～約1500 mM、約1 mM～約1000 mM、約1 mM～約500 mM、約1 mM～約250 mM、約1 mM～約100 mM、約1 mM～約50 mM、約1 mM～約10 mM、約10 mM～約2000 mM、約10 mM～約1500 mM、約10 mM～約1000 mM、約10 mM～約500 mM、約10 mM～約250 mM、約10 mM～約100 mM、約10 mM～約50 mM、約100 mM～約2000 mM、約100 mM～約1500 mM、約100 mM～約1000 mM、約100 mM～約500 mM、約100 mM～約250 mM、約500 mM～約2000 mM、約500 mM～約1500 mM、約500 mM～約1000 mM等の濃度で存在し得る。

さらなる実施態様において、該医薬製剤において、無機塩はパーセント濃度(例、体積/体積パーセント(% v/v)、重量/体積パーセント(% w/v)、又は重量/重量パーセント(% w/w))で存在する。等張化剤、例えば無機塩は、該医薬製剤中、約0.1%以上、約1%以上、約2%以上、約3%以上、約4%以上、約5%以上、約6%以上、約7%以上、約8%以上、約9%以上、又は約10%以上のパーセント濃度で存在する。あるいは、又はそれに加えて、等張化剤、例えば無機塩は、該医薬製剤中、約10%以下、約9%以下、約8%以下、約7%以下、約6%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下、又は約1%以下のパーセント濃度で存在し得る。等張化剤、例えば無機塩は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意のパーセント濃度で存在し得る。例えば、等張化剤、例えば無機塩は、該医薬製剤中、約0.1%～約1%、約0.1%～約2%、約0.1%～約5%、約0.1%～約10%、約1%～約2%、約1%～約5%、約1%～約10%、約2%～約10%、約3%～約10%、約4%～約10%、約5%～約10%等のパーセント濃度で存在し得る。

任意の適切な界面活性剤を該医薬製剤中に存在させ得る。ある実施態様において、界面活性剤は、ポリソルベート20、ポリソルベート80、デオキシコール酸ナトリウム、及びポロキサマー188の少なくとも1つを含有し得る。該界面活性剤は、任意の適切な量で該医薬製剤中に存在し得る。いくつかの実施態様において、該界面活性剤は、該医薬製剤中にパーセント濃度(例、体積/体積パーセント(% v/v)、重量/体積パーセント(% w/v)、又は重量/重量パーセント(% w/w))で存在する。界面活性剤は、該医薬製剤中、約0.01%以上、約0.02%以上、約0.03%以上、0.04%以上、約0.05%以上、約0.06%以上、約0.07%以上、約0.08%以上、約0.09%以上、約0.1%以上、約0.2%以上、約0.3%以上、約0.4%以上、約0.5%以上、約0.6%以上、約0.7%以上、約0.8%以上、約0.9%以上、又は約1%以上のパーセント濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、界面活性剤は、該医薬製剤中、約1%以下、約0.9%以下、約0.8%以下、約0.7%以下、約0.6%以下、約0.5%以下、約0.4%以下、約0.3%以下、約0.2%以下、又は約0.1%以下のパーセント濃度で存在し得る。界面活性剤は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意のパーセント濃度で存在し得る。例えば、界面活性剤は、該医薬製剤中、約0.01%～約1%、約0.01%～約0.1%、約0.05%～約1%、約0.05%～約0.1%、約0.1%～約1%、約0.1%～約0.5%、約0.2%～約1%、約0.5%～約1%,等のパーセント濃度で存在し得る。

任意の適切なアミノ酸を該医薬製剤中に存在させ得る。ある実施態様において、該アミノ酸は、アルギニン、グルタミン酸もしくはグルタミン酸塩、アスパラギン、ヒスチジン、及びグリシンの1以上であり得る。アミノ酸は、該医薬製剤中に任意の適切な量で存在し得る。アミノ酸は、該医薬製剤中、約1 mM以上、約2 mM以上、約3 mM以上、約5 mM以上、約6 mM以上、約7 mM以上、約8 mM以上、約9 mM 以上、又は約10 mM以上の濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、アミノ酸は、該医薬製剤中、約100 mM以下、約90 mM以下、約80 mM以下、約70 mM以下、約60 mM以下、約50 mM以下、約40 mM以下、約30 mM以下、約20 mM以下、又は約10 mM以下の濃度で存在し得る。アミノ酸は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、アミノ酸は、該医薬製剤中、約1 mM～約10 mM、約1 mM～約50 mM、約1 mM～約100 mM、約5 mM～約50 mM、約10 mM～約50 mM、約20 mM～約50 mM等の濃度で存在し得る。

いくつかの実施態様において、アミノ酸は、該医薬製剤中にパーセント濃度（例、体積/体積パーセント(% v/v)、重量/体積パーセント(% w/v)、又は重量/重量パーセント(% w/w)）で存在する。該アミノ酸は、該医薬製剤中、約0.1%以上、約0.2%以上、約0.3%以上、約0.4%以上、約0.5%以上、約0.6%以上、約0.7%以上、約0.8%以上、約0.9%以上、約1%以上、約2%以上、約3%以上、約4%以上、又は約5%以上のパーセント濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、アミノ酸は、該医薬製剤中、約10%以下、約9%以下、約8%以下、約7%以下、約6%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下、又は約1%以下のパーセント濃度で存在し得る。アミノ酸は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意のパーセント濃度で存在し得る。例えば、アミノ酸は、該医薬製剤中、約0.1%～10%、約0.2%～約10%、約0.5%～約10%、約0.1%～約5%、約0.1%～約2%、約0.2%～約2%、約0.5%～約1%等のパーセント濃度で存在し得る。

任意の適切な高分子又は高分子化合物を該医薬製剤中に存在させ得る。該高分子又は高分子化合物は、例えば、タンパク質、多糖、ハイドロゲル、又は他の任意の適切な高分子又は高分子化合物であり得、それらの多くは当該技術分野において公知である。例えば、該高分子又は高分子化合物は、組換えヒト血清アルブミン(rHSA)、血清アルブミン(SA)、ゼラチン、ヒドロキシエチルスターチ(HES)、キトサン、デキストラン（DEX70K、DEX40K）、及びポリビニルピロリドン（PVP40K）であり得る。

高分子又は高分子化合物は、該医薬製剤中に任意の適切な量で存在し得る。該高分子又は高分子化合物は、該医薬製剤中にパーセント濃度(例、体積/体積パーセント(% v/v)、重量/体積パーセント(% w/v)、又は重量／重量パーセント(% w/w))で存在し得る。高分子又は高分子化合物は、該医薬製剤中、約0.1%以上、約0.2%以上、約0.3%以上、約0.4%以上、約0.5%以上、約0.6%以上、約0.7%以上、約0.8%以上、約0.9%以上、約1%以上、約2%以上、約3%以上、約4%以上、又は約5%以上のパーセント濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、高分子又は高分子化合物は、該医薬製剤中、約10%以下、約9%以下、約8%以下、約7%以下、約6%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下、又は約1%以下のパーセント濃度で存在し得る。高分子又は高分子化合物は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意のパーセント濃度で存在し得る。例えば、高分子又は高分子化合物は、該医薬製剤中、約0.1%～約10%、約0.2%～10%、約0.5%～約10%、約0.1%～約5%、約0.1%～約2%、約0.2%～約2%、約0.5～約2%、約0.1%～約1%、約0.2%～約1%、約0.5%～約1%等のパーセント濃度で存在し得る。

任意の適切なキレート剤を該医薬製剤中に存在させ得る。該キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、アミドキシム化合物(AOX)、及び/又はジチオスレイトール(DTT)であり得る。キレート剤は、任意の適切な濃度で該医薬製剤中に存在し得る。キレート剤は、該医薬製剤中、10 μM以上、約20 μM以上、約30 μM以上、約40 μM以上、約50 μM以上、約60 μM以上、約70 μM以上、約80 μM以上、約90 μM以上、約100 μM以上、約120 μM以上、又は約150 μM以上の濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、キレート剤は、該医薬製剤中、約500 μM以下、約400 μM以下、約300 μM以下、約200 μM以下、約150 μM以下、約140 μM以下、約130 μM以下、約120 μM以下、約110 μM以下、約100 μM以下、約80 μM以下、約70 μM以下、約60 μM以下、又は約50 μM以下の濃度で存在し得る。キレート剤は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、キレート剤は、該医薬製剤中、約10 μM～約500 μM、約10 μM～約200 μM、約10 μM～約150 μM、約10 μM～約100 μM、約50 μM～約500 μM、約50 μM～約200 μM、約50 μM～約150 μM、約50 μM～約100 μM等の濃度で存在し得る。

任意の適切な糖を該医薬製剤中に存在させ得る。該糖は、例えば、シュークロース、トレハロース、マンノース、及びラクトースの1以上であり得る、糖は、該医薬製剤中に任意の適切な濃度で存在し得る。糖は、該医薬製剤中、約0.1 mM以上、約0.2 mM以上、約0.4 mM以上、約0.6 mM以上、約0.8 mM以上、約1 mM以上、約1.2 mM以上、約1.4 mM以上、約1.6 mM以上、約1.8 mM以上、約2 mM以上、約3 mM以上、約4 mM以上、約5 mM以上、約6 mM以上、約7 mM以上、約8 mM以上、約9 mM以上、約10 mM以上、約20 mM以上、約30 mM以上、約40 mM以上、約50 mM以上、約60 mM以上、約70 mM以上、約80 mM以上、約90 mM以上、約100 mM以上、約200 mM以上、約300 mM以上、約400 mM以上、約500 mM以上、約600 mM以上、約700 mM以上、約800 mM以上、約900 mM以上、約1000 mM以上、又は約1500 mM以上の濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、糖は、該医薬製剤中、約2000 mM以下、約1500 mM以下、約1000 mM以下、約900 mM以下、約800 mM以下、約700 mM以下、約600 mM以下、約500 mM以下、約450 mM以下、約400 mM以下、約350 mM以下、約300 mM以下、約250 mM以下、約200 mM以下、約150 mM以下、約100 mM以下、約50 mM以下、約45 mM以下、約40 mM以下、約35 mM以下、約30 mM以下、約25 mM以下、約20 mM以下、約10 mM以下、約9 mM以下、約8 mM以下、約7 mM以下、約6 mM以下、約5 mM以下、約4 mM以下、約3 mM以下、約2 mM以下、約1.8 mM以下、約1.6 mM以下、約1.4 mM以下、約1.2 mM以下、約1 mM以下、約0.8 mM以下、約0.6 mM以下、約0.4 mM以下、又は約0.2 mM以下の濃度で存在し得る。糖は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、糖は、該医薬製剤中、約0.1 mM～約2000 mM、約0.1 mM～約1500 mM、約0.1 mM～約1000 mM、約0.1 mM～約500 mM、約0.1 mM～約250 mM、約0.1 mM～約100 mM、約0.1～約50 mM、約0.1 mM～約10 mM、約1 mM～約2000 mM、約1 mM～約1500 mM、約1 mM～約1000 mM、約1 mM～約500 mM、約1 mM～約250 mM、約1 mM～約100 mM、約1 mM～約50 mM、約1 mM～約10 mM、約10 mM～約2000 mM、約10 mM～約1500 mM、10 mM～約1000 mM、約10 mM～約500 mM、約10 mM～約250 mM、約10 mM～約100 mM、約10 mM～約50 mM、約100 mM～約2000 mM、約100 mM～約1500 mM、約100 mM～約1000 mM、約100 mM～約500 mM、約100 mM～約250 mM、約500 mM～約2000 mM、約500 mM～約1500 mM、約500 mM～約1000 mM等の濃度で存在し得る。

別の実施態様において、糖は、該医薬製剤中にパーセント濃度(例、体積/体積パーセント(% v/v)、重量/体積パーセント(% w/v)、又は重量/重量パーセント(% w/w))で存在し得る。糖は、該医薬製剤中、約1%以上、約5%以上、約10%以上、約15%以上、約20%以上、約30%以上、約40%以上のパーセント濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、糖は、該医薬製剤中、約50%以下、約40%以下、約30%以下、約20%以下、約15%以下、約10%以下、約5%以下、又は約1%以下のパーセント濃度で存在し得る。糖は、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意のパーセント濃度で存在し得る。例えば、糖は、該医薬製剤中、約0.1%～約50%、約1%～約50%、約10%～約50%、約0.1%～約20%、約1%～約20%、約10%～約20%、約0.1%～約10%、約1%～約10%等のパーセント濃度で存在し得る。

任意の適切なポリオールを該医薬瀬在中に存在させ得る。該ポリオールは、例えば、ソルビトール及び/又はマンニトールであり得る。ポリオールは、該医薬製剤中に任意の適切な濃度で存在し得る。ポリオールは、該医薬製剤中、約0.1 mM以上、約1 mM以上、約10 mM以上、約20 mM以上、約30 mM以上、約40 mM以上、約50 mM以上、約60 mM以上、約70 mM以上、約80 mM以上、約90 mM以上、約100 mM以上、約120 mM以上、約140 mM以上、約160 mM以上、約180 mM以上、約200 mM以上、約250 mM以上、約300 mM以上、約350 mM以上、約400 mM以上、約450 mM以上、又は約500 mM以上の濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、ポリオールは、該医薬製剤中、約1000 mM以下、約500 mM以下、約450 mM以下、約400 mM以下、約350 mM以下、約300 mM以下、約250 mM以下、約200 mM以下、約180 mM以下、約160 mM以下、約140 mM以下、約120 mM以下、約100 mM以下、約90 mM以下、約80 mM以下、約70 mM以下、約60 mM以下、約50 mM以下、約40 mM以下、約30 mM以下、約20 mM以下、約10 mM以下、又は約1 mM以下の濃度で存在し得る。ポリオールは、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、ポリオールは、該医薬製剤中、約0.1 mM～約1000 mM、約0.1 mM～約500 mM、約0.1 mM～約100 mM、約1 mM～約1000 mM、約1 mM～約500 mM、約1 mM～約100 mM、約100 mM～約1000 mM、約100 mM～約500 mM等の濃度で存在し得る。

別の実施態様において、ポリオールは、該医薬製剤中にパーセント濃度(例、体積/体積パーセント(% v/v)、重量/体積パーセント(% w/v)、又は重量/重量パーセント(% w/w))で存在し得る。ポリオールは、該医薬製剤中、約0.1%以上、約1%以上、約2%以上、約3%以上、約4%以上、約5%以上、約10%以上、約15%以上、約20%以上、約25%以上、約30%以上、約35%以上、約40%以上、約45%以上のパーセント濃度で存在し得る。あるいは、又はそれに加えて、ポリオールは、は、該医薬製剤中、約50%以下、約45%以下、約40%以下、約35%以下、約30%以下、約25%以下、約20%以下、約15%以下、約10%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下、又は約1%以下のパーセント濃度で存在し得る。ポリオールは、該医薬製剤中に、前記終点のいずれかにより境界づけられる範囲内の任意のパーセント濃度で存在し得る。例えば、ポリオールは、該医薬製剤中、約0.1%～約50%、約1%～約50%、約5%～約50%、約10%～約50%、約15%～約50%、約0.1%～約25%、約1%～約25%、約5%～約25%、約10%～約25%、約15%～約25%、約0.1%～約15%、約1%～約15%、約5%～約15%、約10%～約15%、約0.1%～約10%、約1%～約10%、約5%～約10%、約0.1%～約5%、約1%～約5%等のパーセント濃度で存在し得る。

一実施態様において、該医薬製剤は、本発明のインフルエンザウイルス、約0.5 Mのシュークロース、約0.1 Mもしくは約0.5 Mのマンノース、約0.3 Mもしくは約0.5 Mのトレハロース、約50%のSPG、及び約0.05%のポリソルベート20を含有する。別の実施態様において、該医薬製剤は、本発明のインフルエンザウイルス、約0.5 Mのシュークロース、約0.3 Mのトレハロース、及び約0.05%のポリソルベート20を含有する。

少なくとも1つの医薬上許容される担体又は賦形剤は、該医薬製剤の成分同士を結合するのに働く成分(例、結合剤)であり得る。該結合剤としては、タンパク質(例、ゼラチン)、高分子(例、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン)、及び/又は多糖もしくはその誘導体(例、デンプン及びセルロース)等が挙げられるが、それらに限定されない。少なくとも1つの医薬上許容される担体又は賦形剤は、該医薬製剤の嵩を増す成分(例、充填剤、希釈剤、及び/又はフィラー)であり得る。そのような充填剤としては、多糖もしくはその誘導体、糖、及び/又は無機化合物等が挙げられるが、それらに限定されない。医薬上許容される担体又は賦形剤は、該医薬製剤の味及び/又は外観を向上させる成分(例、香料、甘味料、及び/又は着色料)であり得る。医薬上許容される担体又は賦形剤は、液体又は気体を吸着することによって該医薬製剤を防湿する成分(例、吸着剤)であり得る。吸着剤としては、デンプン、リン酸カルシウム、及び/又はコロイド状二酸化ケイ素等が挙げられるが、それらに限定されない。医薬上許容される担体又は賦形剤は、例えば、デンプン、セルロース、及び/又は当該技術分野で公知の任意の他の高分子、あるいは、それらの誘導体(例、架橋ポリビニルピロリドン又はカルボキシメチルセルロース)等の、該医薬製剤の溶解を促進する成分(例、崩壊剤)であり得る。

いくつかの実施態様において、医薬上許容される担体又は賦形剤は、医薬製剤における、あるいはその製造の間の、粒子間接着を低減する、及び/又は物質のフローを最適化する成分(例、流動促進剤)である。流動促進剤の例としては、タルク、コロイド状二酸化ケイ素、及びコーンスターチ等が挙げられるが、それらに限定されない。医薬上許容される担体又は賦形剤は、特に医薬製剤を経口剤として製剤化する場合に、例えば、該医薬製剤における、あるいはその製造の間の、成分と、例えば、打錠面もしくは滑沢剤との間の接着を低減する等の、非スティッキング特性を付与する成分(例、抗接着剤)であり得る。例えば、抗接着剤はステアリン酸マグネシウムであり得る。別の実施態様において、医薬上許容される担体又は賦形剤は、成分の凝集を低減し、及び/又は、製造中の、医薬製剤、即ち、経口剤として製剤化された医薬製剤の表面と、ダイ壁との間の摩擦を低減する成分(滑沢剤)であり得る。ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、野菜油、鉱物油、ポリエチレングリコール、及び/又はラウリル硫酸ナトリウム等の、水溶性又は水不溶性の滑沢剤を実施態様に応じて使用することができる。医薬上許容される担体又は賦形剤は、コーティング剤として作用する成分であり得る。コーティング剤としては、ゼラチン、及び/又はセルロースをベースとしたコーティング剤(例、ヒドロキシメチルセルロース)が挙げられるが、それらに限定されない。

他の適切な結合剤、香料、甘味料、着色料、崩壊剤、流動促進剤、抗接着剤、滑沢剤、及びコーティング剤は、当該技術分野において周知かつ容易に同定できる。

該医薬製剤は、治療薬(例、化学療法剤又は抗炎症剤)をさらに含有し得る。該医薬製剤はまた、インフルエンザウイルスとは別の免疫応答を引き起こす化学物質を含み得る。そのような本発明のインフルエンザウイルス以外の付加的な成分は、任意の適切な量で存在し得る。

付加的な成分は、免疫系への提示に先立って、その他の成分と混合して医薬製剤を形成させることができる。付加的な成分はまた、該医薬製剤とは別個に免疫系に提示することもできる。例えば、付加的な成分と医薬製剤を別個に免疫系に提示(生体に投与)することができる。付加的な成分と医薬製剤を別個に投与する場合、付加的な成分と医薬製剤とは、免疫する生体の同じ部位に投与することができる。

医薬製剤の一実施態様において、該医薬製剤はウイルスワクチンである。ウイルスワクチンは、生の弱毒化されたウイルスワクチンであっても、不活化されたウイルスワクチンであってもよい(例、全ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、又はサブユニットワクチン)。該ウイルスワクチンは、一価のワクチン、二価のワクチン、三価のワクチン、又は四価のワクチンとして製剤化し得る。例えば、ウイルスは、複数の実施態様の本発明のインフルエンザウイルスを含み得る。いくつかの実施態様において、ワクチンは本発明のインフルエンザウイルスとは異なる少なくとも1つのインフルエンザウイルスをさらに含み得る。

ウイルスワクチンは、任意の適切な投与手段のための組成物に製剤化することができる。例えば、ウイルスワクチンは、経口剤(例、カプセル、錠剤、経口フィルム)、スプレー(例、鼻スプレー)、あるいは、鼻腔内投与、又は非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮内、もしくは皮下投与に適した任意の組成物、例えば、水性又は非水性の乳剤、液剤、懸濁剤等として製剤化することができる。

免疫応答の誘発方法
本発明は、哺乳動物に本発明のインフルエンザウイルスを投与することを含む、該哺乳動物における免疫方法の誘発方法を提供する。一実施態様において、該インフルエンザウイルスは、タンパク質、即ち、選択されたアミノ酸を含む、PB1タンパク質、PB2タンパク質、PAタンパク質、NPタンパク質、及びNS1タンパク質をそれぞれコードする、PB1遺伝子セグメント、PB2遺伝子セグメント、PA遺伝子セグメント、NP遺伝子セグメント、及びNS遺伝子セグメント、即ち、本明細書に記載される本発明のインフルエンザウイルスを含む。

哺乳動物は、例えば、ヒト又は霊長類であり得るが、それらに限定されない。

本発明の一実施態様において、本発明のインフルエンザウイルスは、本明細書に記載の医薬製剤(例、ワクチン又は他の免疫原性組成物)中で投与される。該医薬製剤は鼻腔内投与することができる。別の実施態様においては、該医薬製剤は筋肉内投与される。該医薬製剤はまた、皮下又は経口投与され得る。

該医薬製剤、例えば、ウイルスワクチンの投与計画は、哺乳動物の年齢、体重、性別、及び既往歴に依存し得る。例えば、一実施態様において、ヒトへの弱毒化ウイルスワクチンの単回用量は、約10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、もしくは10¹²、又は前記数値の任意の2つの間の範囲の、本発明のインフルエンザウイルスの粒子形成単位(PFU)、フォーカス形成単位(FFU)、又はTCID₅₀を含み得る。いくつかの実施態様において、インフルエンザウイルスの予防又は治療計画は、単回処置として該医薬製剤を投与することを含む。該医薬製剤はまた、2回以上投与することもでき、例えば、該投与計画はブースター投与を含む。例えば、該医薬製剤のブースター投与は、初回投与の後、7日以上、例えば、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上、3週間以上、4週間以上、1ヶ月以上、2ヶ月以上、3ヶ月以上、4ヶ月以上、5ヶ月以上、6ヶ月以上、7ヶ月以上、8ヶ月以上、9ヶ月以上、10ヶ月以上、11ヶ月以上、1年以上、2年以上、3年以上、4年以上、又は5年以上の幅の期間を空けて投与することができる。

実施態様
本発明は以下の態様を提供する：

(1)PA、NP及びNS遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスであって、(a)該PA遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置2272にチミンを含み；(b)該NP遺伝子セグメントは、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するNPタンパク質をコードし、該選択されたアミノ酸は、40位のセリン、161位のアスパラギンもしくはグリシン、204位のスレオニン、及び任意で93位のバリンを含み；(c)該NS遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置39にグアニンを含み、かつ該NS遺伝子セグメントは、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するNS1タンパク質をコードし、該選択されたアミノ酸は、176位のグルタミンを含む、インフルエンザウイルス。

(2)PA遺伝子セグメントが配列番号10で表されるヌクレオチド配列を有する、態様1のインフルエンザウイルス。

(3)NP遺伝子セグメントが配列番号11で表されるヌクレオチド配列を有する、態様1又は2のインフルエンザウイルス。

(4)PA遺伝子セグメントが、配列番号15で表されるアミノ酸配列を有するPAタンパク質をコードする、態様1～3のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(5)NP遺伝子セグメントが、配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するNPタンパク質をコードする、態様1～4のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(6)NS遺伝子セグメントが、配列番号12で表されるヌクレオチド配列を有する、態様1～5のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(7)NS遺伝子セグメントが、配列番号17で表されるアミノ酸配列を有するNS1タンパク質をコードする、態様1～6のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(8)選択されたアミノ酸が、Vero細胞株内で少なくとも10回連続継代した後も、NP及びNSタンパク質の少なくとも1つで保存されている、態様1～7のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(9)選択されたアミノ酸が、B型インフルエンザウイルスのBM2イオンチャネルタンパク質を安定に発現するVero細胞株内で少なくとも10回連続継代した後も、NP及びNSタンパク質の少なくとも1つで保存されている、態様1～8のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(10)インフルエンザウイルスが組換えインフルエンザウイルスである、態様1～9のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(11)ウイルスがさらにPB遺伝子セグメントを含む、態様1～10のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(12)ウイルスがさらにNA遺伝子セグメント及びHA遺伝子セグメントを含む、態様1～11のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(13)HA遺伝子セグメントが、HA2内に少なくとも1つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を有するHAタンパク質をコードする、態様12のインフルエンザウイルス。

(14)HA2内の少なくとも1つのアミノ酸変異が61位のグルタミン酸である、態様13のインフルエンザウイルス。

(15)HA2内の少なくとも1つのアミノ酸変異が112位のグルタミン酸である、態様13のインフルエンザウイルス。

(16)PA、NP及びNS遺伝子セグメントが単一のインフルエンザ株に由来する、態様1～15のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(17)HA遺伝子セグメントが、PA、NP及びNS遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来する、態様16のインフルエンザウイルス。

(18)NA遺伝子セグメントが、PA、NP及びNS遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来する、態様16又は17のインフルエンザウイルス。

(19)さらに変異M遺伝子セグメントを含む、態様1～18のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(20)インフルエンザウイルスが機能的なBM2タンパク質をコードしない、態様19のインフルエンザウイルス。

(21)ウイルスがヒト細胞内で複製可能である、態様1～20のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(22)ウイルスが、選択されたアミノ酸がないことを除いて同一であるインフルエンザウイルスと比較して、同一条件下で、Vero細胞内での増殖が増強されている、態様1～21のいずれか1つのインフルエンザウイルス。

(23)態様1～22のいずれか1つのインフルエンザウイルスを含む、医薬製剤。

(24)医薬製剤がワクチンである、態様23の医薬製剤。

(25)ワクチンが一価のワクチンとして製剤化される、態様24の医薬製剤。

(26)ワクチンが二価のワクチンとして製剤化される、態様24の医薬製剤。

(27)ワクチンが三価のワクチンとして製剤化される、態様24の医薬製剤。

(28)ワクチンが四価のワクチンとして製剤化される、態様24の医薬製剤。

(29)態様1～22のいずれか1つのインフルエンザウイルス又は態様23～28のいずれか1つの医薬製剤を哺乳動物に投与し、それによって該哺乳動物において該インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発することを含む、該哺乳動物における免疫応答の誘発方法。

(30)哺乳動物がヒトである、態様29の方法。

(31)態様1～22のいずれか1つのインフルエンザウイルスの生成方法であって、Vero細胞内でインフルエンザウイルスを連続継代することを含む、方法。

以下の実施例は本発明を更に説明するが、当然のことながら、いかなる場合においてもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

［実施例1］
本実施例は、系統横断的に増殖が促進されるインフルエンザB NP D161N変異の分離の成功について実証する。

インフルエンザB/Lee/40由来のBM2をコードするcDNAを構成的に過剰発現する許容状態にあるBM2Vero細胞において、マルチサイクルの複製に必須のBM2イオンチャネル機能の欠失を含む2つのワクチン候補インフルエンザB BM2SR株をプラスミドベースのウイルスレスキューの手順により構築した(例えば、Neumann et al., PNAS, 96: 9345-9350 (1999)参照)。主要抗原であるヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)をコードする2つのセグメントは、WHOが季節性のB型インフルエンザ病に対するワクチン接種における使用を推奨している両株、ビクトリア系統(VL)株B/Brisbane/60/2008(Bris60)とヤマガタ系統(YL)株B/Wisconsin/010(WI01)から得た。BM2欠損セグメント7は、インフルエンザB/Florida/4/2006 Mセグメントを、(1) BM2膜貫通型H+チャネルを除去する、(2) すべての翻訳リーディングフレームに複数の停止コドンを導入する、及び(3) 遺伝的安定性とM1ポリペプチドの適正発現のためにネイティブなRNA構造を維持する、ように操作することで得た。8つのゲノムセグメントのうち5つ(すなわち、PA、PB1、PB2、NP、及びNS）を、インフルエンザB/Yamagata/1/73のウイルスライブラリーからインビトロでのVero細胞培養中に高収率となるよう増殖が増強されたVL及びYL株を選別することによって得た(Ping et al. 2016, 上述)。BM2Veroで3回継代(P3)した後、各BM2SR株の完全なヌクレオチド配列を、8つ全てのセグメントからの逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)増幅したcDNAをサンガー配列決定することによって検証した。8つ全てのウイルスセグメントの配列は、YLとVLの両方からウイルスをレスキューするために使用した8つのRNAセグメント発現プラスミドの配列と同一であった。

次いで、ワクチン候補のBris60(VL)及びWI01(YL)BM2SR P3株を、低い感染多重度（MOI）で10回の追加ウイルス継代を行い、合計13回の継代を行った(P13)。各継代ラウンドの後、BM2SR複製に許容状態にある改変MDCK細胞(BM2CK、Hattast al., J. Virol., 78(11): 5576-5583(2004))において50％組織培養感染量アッセイ(TCID₅₀)によってウイルス力価を測定した。その後の各継代は、マルチサイクル複製を可能にするために、BM2Vero細胞あたりMOI = 0.001 TCID₅₀相当で感染させることで行った。10回の継代で何度もウイルス複製を繰り返した後、2つのP13株のヌクレオチド配列が再び得られた。P13 VL及びYL株の配列とP3株の配列の比較を行い、適応性のある変異を同定した。3回の独立した継代実験から得られたウイルスゲノムにおいて、VLとYLで同一の変異、あるいはB型インフルエンザの系統横断的な変異が1つだけ確認された。ユニークな横断的変異は、核タンパク質における161位のアスパラギン酸のアスパラギンへの置換（NP D161N）をコードする、B型インフルエンザのゲノムセグメント5のg540aであった。

VL及びYLのP3株の最初のB/Yamagata/1/73高収量(HY)セグメント配列は、核タンパク質(NP)セグメント5と非構造的タンパク質(NS)セグメント8の2セグメントで異なる。P3では、Bris60（VL）はNP P40S/M204T、NS g38insgをコードし、WI01(YL)BM2SRはNP-P40S、及びNS a39g、NS1-K176Qを含んでいた(Ping et al. 2016, 上述)。継代拡大後、VL NPセグメント5はNP P40S/D161N/M204Tをコードし、YLセグメント5はNP P40S/D161Nをコードしていることがわかった。両株に同一のD161N変異が存在した。同一の置換が分離されることはランダムではなく、したがって、D161Nは培養中のVero細胞におけるB型インフルエンザの増殖を促進する。これは、Vero細胞における高増殖性ウイルスについて記載された系統特異的変異とは対照的である(Ping et al. 2016, 上述)。

HA及びNAセグメントがB/CA/12/2015(YL)から得られたことを除いて、同じBM2SR単一複製ワクチンウイルスバックボーンを用いて、第3継代実験を行った。6回の継代後、別のNPセグメントヌクレオチド変異a541gが分離され、同様に161位のアスパラギン酸のグリシンへの置換D161Gをもたらした。本実施例は、部位161がVero培養における高収率増殖に関係していることを実証している。

培養におけるインフルエンザB YLの増殖を改善することが知られているHA1 N211T変異と組み合わせて、NP D161N変異をB/CA/12/2015 HAに追加した。HA1 N211Tは増殖速度と力価を改善した。NP D161N変異は、HA1 N211Tと相乗効果を示し、図1に見られるように、最大力価までの時間を1日短縮した。

NP M93Vをコードする別のB型インフルエンザのNP変異a336gは複数回分離されたが、HAとNAがVLに由来するときだけであった。WTとNP V369Iの混合物をコードするg1164rの混合物も1回分離された。

［実施例2］
本実施例は、インフルエンザB NP D161N適応変異を含むB型インフルエンザ株の分離の成功について実証する。

インフルエンザB/Lee/40由来のBM2をコードするcDNAを構成的に過剰発現する許容状態にあるBM2Vero細胞において、マルチサイクルの複製に必須のBM2イオンチャネル機能の欠失を含む種々のワクチン候補インフルエンザB BM2SR株をプラスミドベースのウイルスレスキューの手順により構築した(Neumann et al., 上述)。ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)抗原をコードする2つのセグメントは、世界保健機構(WHO)が季節性のB型インフルエンザ病に対するワクチン接種における使用を推奨している株、ビクトリア系統(VL)株B/CO/06/2017 (CO06)から得た。BM2欠損セグメント7は、インフルエンザB/Florida/4/2006 Mセグメントを、(1) BM2膜貫通型H+チャネルを除去する、(2) すべての翻訳リーディングフレームに複数の停止コドンを導入する、及び(3) 遺伝的安定性とM1ポリペプチドの適正発現のためにネイティブなRNA構造を維持する、ように操作することで得た。8つのゲノムセグメントのうち4つ(すなわち、PA、PB1、PB2、及びNS)を、インフルエンザB/Yamagata/1/73のウイルスライブラリーからインビトロでのVero細胞培養中に高収率となるよう増殖が増強されたVL株を選別することによって得た(Ping et al. 2016, 上述)。

6つの株は、セグメント5の核タンパク質(NP)のみが異なり、BM2Vero細胞での継代後に得られたインフルエンザB NP配列から分離された3つの高収率変異の順列変異を含んでいる。NPに1つのアミノ酸置換を持つ3つの株:P40S、D161NまたはM204Tを作製した。NPの置換がない対照の野生型NP株を作製した。最後に、2つの変化D161N / M204Tを持つ株と、3つの変異をすべて持つ株を構築した。BM2Veroにおいて2回継代(P2)した後、各株のNPおよびBM2SRセグメントのヌクレオチド配列を、8つ全てのセグメントからのRT-PCR増幅したcDNAをサンガー配列決定することによって検証した。

増殖特性を比較するために、BM2Veroにおける第3継代を、各ウイルスについてトリプリケートで実施した。MOI=0.001での接種後4日間毎日、培養物をサンプリングし、アリコートを、BM2CK TCID₅₀アッセイによる後の分析のために-80℃で冷凍保存した。トリプリケート測定の平均を各日について計算し、図2にプロットした。各単一変異は単独で増殖効果をもたらしたが、D161N変異はそれ自体で最大の効果を有していた。D161NをM204Tと組み合わせた場合、二重変異株は野生型および単一変異株と比較して、より速い増殖速度を達成した。三重変異株は、二重変異株と比較して、速い速度で、且つ4日間で最高最大力価を達成した。このように、D161Nは増殖を促進するNP変異であり、他の既知のNP置換と相乗的に作用して、さらに高い最大力価に達するより速い増殖を示すB型インフルエンザ株を可能にする。

［実施例3］
本実施例は、培養における継代中のインフルエンザB NSセグメントの安定性について実証する。

NS1の機能は、Vero細胞培養におけるインビトロでのB型インフルエンザウイルスの培養には不要であることが知られている。継代実験中、NSセグメントは様々な変異を蓄積した。しかしながら、これらの変異は完全には解き明かされず、出発配列との混在として観察された。

多くの変異は、ポリヌクレオチドトラクトの拡張である。g38insgを有するB/Brisbane/60/2008 BM2SR4 P13 NSセグメントのシーケンスリード内には、AUG(配列番号1)のちょうど5'におけるUTR(mRNA sense)においてpolyA7からpolyA8へ拡張した混合物、AAAAAAAUG(配列番号2)～AAAAAAAAUG(配列番号3)がある。NS g38insgを持つB/CO/06/2017株はP6まで増殖し、公開されたg38insg HYプロモーター変異の復帰と組み合わせたpolyA7のA8への拡張も有していた。これらのシークエンスデータは、5’UTRに配列の複雑な混合物があることを示し、NS g38insgがこれらの実験において不安定であったことを示唆した。

g38insgを有するNSセグメントを有するB/CA/12/2015 BM2SR株を6回継代し、出発WT NS1配列の、569位でpolyA6トラクトがpolyA7に拡張したものとの混合物が観察された。569_570insA変異は、4残基のC末端延長を伴う176アミノ酸のNS1トランケーションタンパク質を引き起こす。この変異は、以前に同定されたNS HYの変異、K176Qをコードするa570cと同じpolyA6トラクト部位内にある。P3、P5、P6継代後、ウイルス培養上清からゲノムRNAを抽出し、RT-PCRを行い、8つ全てのゲノムセグメントからcDNAを増幅した。図3に示すシーケンスクロマトグラムデータは、NSセグメント8の塩基対570-574のpolyAストレッチが継代時、経時的に5から6ヌクレオチド、長くなっていることを示している。NS 569_570insAという変異の頻度は、その後の継代で約20%から約50%変異に増加したが、このことは、この変異がVero細胞での増殖に有利であることを示している。

NS 569_570insA変異(配列番号4)の結果は、NS1オープンリーディングフレーム(ORF)におけるアミノ酸K176以降の翻訳フレームシフトである。このフレームシフトにより、4つの新しいアミノ酸、KGYT(配列番号5)が融合し、次にTAAストップコドン(配列番号6)が融合する。したがって、4残基のC末端延長を有する176アミノ酸のNSトランケーションタンパク質が、180アミノ酸ペプチド(配列番号7、XはG、R、またはVを含む任意のアミノ酸)として発現する。本実施例では、XはGであった。NEP ORFのスプライシングおよび発現は、この変異によって影響を受けない。

281残基のB型インフルエンザのC末端105アミノ酸を切断すると、NS1の機能の一部または全部が失われると思われる。NS1は、ポリアデニル化やスプライシングといった宿主のmRNA代謝の再利用や、RIG-Iの誘導といったインターフェロン依存性の宿主細胞の自然免疫応答を阻害するなどの機能を発揮する。培養中のVero細胞はインターフェロン応答が欠損しているため、その細胞株では完全なNS1欠失型インフルエンザ株であっても増殖が可能である。NS1 C-末端の欠損は、VeroにおけるBM2SRバックボーンの増殖に有利であり、この変異はワクチン材料の生産を促進すると考えられる。K176Q変異は、polyA6ラン内にGが挿入されることで、この部位の遺伝的安定性を促進するかもしれない。

K176Qを含むB/WI/01/2010 BM2SR4をP13まで継代すると、NP配列の混合物が得られた。セグメント8の配列は、K176Qを含む出発プラスミドと約70％の配列が同じであった。残りの配列では、配列の約30%でNS1 ORF から 25 bp、416del25が欠失していた。この欠失により、P123以降の158残基が切断され、135 AA NS1トランケーション変異体では12個の新しいアミノ酸(AA)が追加された。これらのデータから、NSセグメントa39g K176Qの方が全体的に安定であることがわかる。BM2Vero細胞における安定性の向上についてNS a39g K176QセグメントとNP D161N HY変異の組み合わせを調べた。NS a39g K176Q と NP P40S D161N M204Tセグメントを含むB/CA/12/2015株を、BM2Vero 細胞で10回継代した。NSやNPの変異は観察されず、このことから2つのHYセグメントを組み合わせることで安定性が向上することが示唆された。

［実施例4］
本実施例は、培養における継代中の適応性インフルエンザB HAセグメントの分離について実証する。

VLとYLの両方から得た複数のBM2SR株をBM2Vero細胞内で継代し、HAセグメントのヌクレオチド配列を決定した。コーディング配列が変化しないサイレント変異は同定されなかった。14箇所でアミノ酸を変化させる18の変異がHAセグメントで同定された(表1)。変異は大きく2つのグループに分けられる。HA1の変異は、N209 (WA02 VL)/N210 (CO/06 VL)/N211 (YL)のよく知られたN結合型グリコシル化部位に直接、あるいはグリコシラーゼ認識に重要な残基の近くに対して起こることが多かった。分離された変異の大部分は、HA2コイルドコイル領域に位置していた。2つのHA2変異が際立っていた。HA a1294g変異は、B/CO/06/2017 BM2SR株を継代した複数の実験において、NPまたはNSセグメントの同一性とは無関係に観察された。このようなグリコシル化部位の適応は、標的Vero細胞へのHA結合の親和性に影響を及ぼしていると考えられる。HA2コイルドコイルの変化は、HAが標的細胞の膜と融合するのに必要なpH依存的な構造変化に影響を与えると考えられている。

異なるB型インフルエンザの系統や株は、インフルエンザB/Bris/60/2008 HA1と比較して、インフルエンザB VL HA1遺伝子セグメントに順次1、2または3個のアミノ酸が欠失(年によって異なる)、インフルエンザB YLではHA1遺伝子セグメントに1AA欠失があるため、アミノ酸数が異なる場合がある。表1においてアスタリスクが付いたアミノ酸は、株によって異なる位置に変異が生じる可能性があることを示している。表2に、株によって生じるアミノ酸変異の位置が異なる例を示す。分離された変異の一部は、他の株のHAに導入され、増殖促進について調べられた。

［実施例5］
本実施例は、B型インフルエンザHA適応変異を有するインフルエンザB/WA/02/2019 BM2SR(VL)株のレスキューについて実証している。

WHO推奨ワクチン株B/WA/02/2019(VL)のインフルエンザHAセグメント5をコードするcDNAを3バージョン合成し、B型インフルエンザプラスミドベースウイルスレスキュー用RNA発現プラスミドベクターに挿入した。最初のHAバージョンは、インフルエンザ患者一次分離株から直接入手した野生型(WT)HAタンパク質配列をコードしていた。WTのHAは、HA1のN209グリコシル化部位を完全な状態で有している。インフルエンザB/WA/02/2019(VL)株を細胞または卵培養で継代すると、主にN209S置換によりこの部位のグリコシル化が失われる(GISAID)。第2のプラスミドは、B/CO/06/2017株の継代から得られた変異型HA2 K61E(K421E)をコードしている。また、HA2 K61E変化にグリコシル化(-)のN209S HA1変異体を加えた二重変異体も構築された。

3種類のHAプラスミドを用いた標準的なプラスミドベースのウイルスレスキューの手順を用い、BM2Vero細胞へのトランスフェクションによりB/WA/02/2019 BM2SR(VL)ウイルスを構築した。単一および二重変異HAプラスミドはいずれもBM2SRウイルスのレスキューをサポートしたが、完全WT HA配列は生存ウイルスを生成しなかった(アッセイLOD = log₁₀ 0.67 TCID₅₀/mL)。成功したワクチン候補はいずれもBM2VeroでP2まで継代し、HA配列を確認した。ウイルスはMOI = 0.01でP3に継代し、図4および表3に示すように、ウイルス力価のTCID₅₀判定のために毎日分のアリコートを凍結した。K420E (K61E HA2)変異を持つ単一変異株は順調に生育し、グリコシル化(+)株は3日で7.67の最大log₁₀TCID₅₀/mLに達した。二重変異体、グリコHA株はより速く生育したが、2日でlog₁₀ 7.50の同様のピーク力価に達した。

［実施例6］
本実施例は、B型インフルエンザB HA適応変異を有するインフルエンザB/CA/12/2015 BM2SR(YL)株の増殖を実証する。

WHO推奨ワクチン株B/CA/12/2015(YL)のインフルエンザHAセグメント5をコードするcDNAを8バージョン合成し、B型インフルエンザ逆遺伝子レスキュー用RNA発現プラスミドベクターに挿入して4種類のHA変異株を作製した。Vero継代由来のこれら4つのHA変異株は、4つのHA2残基における変異：1.) N51DとD61E; 2.) D90N; 3.) D112E; 及び4.) D112Kと、それら全てがHA1グリコシル化部位変異N211Tの組み合わせられている、5つの変異を含む。B/CO/06/2017の継代で得られたHA2 N51D, K61E変異は増殖を助けたが、N211Tと組み合わせた場合のみであった。インフルエンザA H3N2をVeroで継代して得られたHA2 D90NおよびD112K変異は、N211Tと組み合わせても増殖に害を及ぼすか、あるいは効果がなかった。D112E(D473E)は、図5に示すように、グリコシル化部位N211に関係なく、最大力価までのより速い増殖をもたらす有利なものであった。

［実施例7］
本実施例は、さらにB型インフルエンザ型HA適応変異を有するインフルエンザB/CA/12/2015 BM2SR株の増殖を実証する。

B型インフルエンザYLのHA2 D112部位は、培養中の増殖に顕著な影響を与えた。グリコシル化部位N211とは無関係に、HA2 D112変異D473E(D112E)はインフルエンザBM2SRにとって有利で、他のB/CA/12/2015(YL)HA2 112変異体よりも最大力価までの速い増殖をもたらすため、追加の置換HA2 D112GとHA2 D112Nを行った。これらのHA2変異は、アマンタジン耐性を付与するE112位のインフルエンザA HA2変異であり、HAスパイクタンパク質の構造変化が起こりうるpHを著しく上昇させる(Byrd-Leotis et al., J. Virol., 89(8): 4504-4516 (2015))。HA2 D112Gは、これまで試されたいずれのA型インフルエンザHAにおいても機能することが示されてきた。B型インフルエンザについては、図6に示すように、HA2 D112GとHA2 D112Nは、N211との組み合わせで、最大力価までより速い増殖をもたらす有利かつ相乗的なものであった。

［実施例8］
本実施例は、培養中の継代で他の適応的なB型インフルエンザHA変異の分離の成功についてさらに実証する。

これまでの実施例に従い、培養中の継代中にさらなる適応的なB型インフルエンザHA変異を分離した。これらの変異を以下の表4にまとめる。

［実施例9］
本実施例は、BM2SRウイルスが多価ワクチンに配合されたB型インフルエンザウイルスに対して抗体反応を引き起こすことについて実証する。

インフルエンザBM2SR-VicまたはBM2SR-Yamウイルス(それぞれ配列番号8、9、10、11、12および18で表される塩基配列を有する、PB1、PB2、PA、NP、NSおよびM遺伝子セグメントを含むウイルス)は、1価、2価、3価または4価のワクチンとして処方されると抗体応答を誘発する。

7週齢のBALB/c雌性マウス(N=8)に、1価のBM2SR-Vic、1価のBM2SR-Yam、2価のBM2SR、3価のBM2SR-Vic+BM2SR-Yam+M2SR-H1N1、3価のBM2SR-Vic+BM2SR-Yam+M2SR-H3N2、又は4価のBM2SR-Vicと-Yam、及びM2SR-H1N1と-H3N2ワクチンで経鼻的に免疫感作した。対照群のマウスは、SPG緩衝液(ショ糖リン酸グルタミン酸緩衝液)でモック免疫感作した。ワクチン接種の28日後、初回免疫のために投与されたものと同じワクチンからなる追加免疫により、マウスを鼻腔内免疫感作した。ワクチン接種の28日後に、初回免疫に投与したワクチンと同じワクチンからなる追加免疫をマウスに経口投与した。血清サンプルは、初回免疫後7、14、21日目、追加免疫(28日目)後35、42、49日目に採取した。血清サンプルからの抗インフルエンザB-Vic HAおよび抗インフルエンザB-Yam HA血清IgG抗体価をELISAで測定した。

得られた抗インフルエンザB-Vic HAデータを図7Aに示す。得られた抗インフルエンザB-Yam HAデータを図7Bに示す。その結果、すべてのワクチンがSPGコントロールよりも抗インフルエンザウイルス抗体を上昇させることができ、その上昇量はワクチン製剤間で同等であることを実証している。これらの結果は、多価ワクチンに配合した場合、1価の成分間の干渉がないことを実証している。

［実施例10］
本実施例は、一価又は四価のM2SRワクチンを経鼻投与することで、ワクチンに含まれていない致死的なB型インフルエンザウイルスからマウスを防御することを実証する。

実施例9に記載のBALB/c雌性マウスに、初回免疫の70日後(追加免疫の6週間後)に、致死量のインフルエンザB/Malaysia/2506/2004 (Vic)ウイルス（＞10マウス50％致死量(MLD₅₀)）をチャレンジした。一価のBM2SR-Vic(インフルエンザB/CO/06/2017)又はBM2SR-Yam(インフルエンザB/Phuket/3073/2013)及び四価のM2SRワクチンで免疫感作したすべてのマウスは、チャレンジを生き延びた。一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam及び四価のM2SRワクチンを免疫感作したマウスは、体重減少もなく健康を維持した。得られた体重減少のデータを図8に示す。SPGのみをモック免疫感作したコントロールマウスは、体重が減少し、8匹中4匹がチャレンジ後10日以内に感染した。チャレンジ後3日目に、1群3匹のマウスから肺を採取し、MDCK細胞でのプラークアッセイによりウイルス量を測定した。表5に示すように、一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、及び四価のM2SRワクチンで免疫感作したマウスの肺におけるウイルス力価は検出限界以下(肺あたり76プラーク形成ユニット(PFU)未満)であった。SPGコントロールのみで免疫感作したマウスでは、ウイルス量が検出された(平均6.86 log PFU/g)。これらの結果は、BM2SRの一価ワクチンと四価ワクチンが、交差防御を与え、どのワクチン成分とも一致しないチャレンジウイルスの複製を制限することを示している。

［実施例11］
本実施例は、BM2SR成分を含む二価、三価又は四価のM2SRが、認可された経鼻インフルエンザワクチンと比較して良好な安全性プロファイルを提供するとともに、ワクチンに含まれないインフルエンザウイルスに対して認可された筋肉内不活化インフルエンザワクチンより優れた防御を提供することを実証する。抗原的に異なる一価のBM2SR-Vicワクチンおよび一価のBM2SR-Yamワクチンは、致死的なB型インフルエンザウイルスからのマウスの防御において、抗原的に一致した認可されたワクチンと同等の防御を発揮する。

7週齢のBALB/c雌性マウス(N=13)に、以下のワクチン(一価BM2SR-Vic、一価BM2SR-Yam、四価FGHY-M2SR、FLUMIST(商標)Quadrivalent(AstraZeneca, Wilmington, DE)、FLUZONE（商標）Quadrivalent(Sanofi, Bridgewater, NJ)又はFLUZONE(商標)High Dose(Sanofi)から1つを選択して免疫感作した。各ワクチンの株構成は表6に示すとおりである。BM2SR、M2SR、及びFLUMIST(商標)は経鼻投与で、一方、FLUZONE(商標)の両ワクチンは筋肉内投与した。対照群のマウスはSPGで経鼻的にモック免疫感作した。免疫感作後14日間、マウスの体重変化について観察した。

得られた体重減少のデータを図9に示す。一価のBM2SR-Vic、一価のBM2SR-Yam、四価のM2SR、FLUZONE(商標)Quadrivalent、FLUZONE(商標)High Dose、又はSPG対照で免疫感作されたマウスは、14日間の期間にわたって体重減少がなかった。これらのデータは、BM2SRワクチンが認可されたインフルエンザワクチンと同等の安全性プロファイルを有することを示している。

初回免疫後28日目に追加免疫によりマウスを免疫感作した。追加免疫は、初回免疫でマウスに免疫感作したものと同じワクチンから成っていた。初回及び追加免疫の後に毎週血清サンプルを採取し、ワクチン成分の各々に対するプール血清IgG力価をELISAで測定した。得られた抗インフルエンザB-Vic HA血清IgG ELISA力価のデータを、図10Aに示す。得られた抗インフルエンザB-Yam HA血清IgG ELISA力価のデータを、図10Bに示す。得られた抗インフルエンザA/H1 HA血清IgG ELISA力価のデータを、図10Cに示す。得られた抗インフルエンザA/H3 HA血清IgG ELISA力価のデータを、図10Dに示す。この結果は、すべてのワクチンがインフルエンザB-Vic HA及びB-Yam HAに対する血清IgG力価をSPG対照より上昇させることができ、これらの上昇はワクチン製剤間で同等であったことが示された。FLUZONE(商標)QuadrivalentおよびFLUZONE(商標)High Doseは、生ワクチンと比較して、B型インフルエンザHA抗原に対する血清IgG力価を低下させた。

初回免疫後49日目(追加免疫後21日目)に1群4匹のマウスから気管－肺洗浄液を得て、ELISA法によりIgG及びIgAの力価を測定し、粘膜免疫応答を評価した。得られたIgG力価のデータを図11Aに、得られたIgA力価のデータを図11Bに示す。四価のM2SR及びおよびFLUMIST(商標)Quadrivalentは、試験した全ての抗原に対してIgGおよびIgAの両方の力価を惹起した。一価のBM2SR-VicおよびBM2SR-Yamで免疫したマウスは、B-Vic及びB-Yam HA抗原の両方に対してIgGおよびIgA力価を示したが、H1またはH3 HA抗原に対しては示さなかった。FLUZONE(商標)QuadrivalentおよびFLUZONE(商標)High Doseワクチンで免疫した群では、4つの抗原全てに対するIgG力価が上昇したが、いずれの抗原に対してもIgA抗体力価は検出されなかった。これらのデータから、BM2SRワクチンは、認可されている弱毒生インフルエンザワクチンであるFLUMIST(商標)Quadrivalentに匹敵する粘膜免疫応答を引き起こすことが示された。

追加免疫後6週間の時点でマウスを致死量のインフルエンザB/Malaysia/2506/2004 (Vic)でチャレンジした。SPGコントロールでモック免疫感作された8匹のマウスのうち4匹は、チャレンジ後10日までに感染により死亡したが、すべてのワクチングループは生存した。チャレンジ後の体重変化を図12に示す。一価のBM2SR、二価のM2SR、及び認可ワクチンを受けたマウスは健康を維持し体重は減少しなかったが、生存したモック免疫感作マウスでは約25%体重が減少した。免疫感作グループにおいては、FLUZONE(商標) Quadrivalentを除いて、チャレンジ後3日時点の肺においてチャレンジしたウイルスは検出されなかった(表7)。BM2SR-YamはドリフトしたインフルエンザウイルスB/Malaysia ビクトリア系統による致死的感染に対する防御をもたらした。BM2SR-Vic若しくはBM2SR-Yamで免疫感作されたマウスの肺、又は、1以上のBM2SR成分を含有するいずれの多価ワクチンでの肺において、感染性のウイルスは検出されなかった(表7)。感染性のウイルスは、ナイーブなモック免疫感作マウスの肺において検出された。ウイルスはチャレンジ後の鼻甲介においても検出された。表7に示される通り、BM2SRグループ（一価、二価、三価、又は四価）は、モック免疫マウスよりも鼻甲介におけるウイルスが2 logを超えて少なかったことから、筋肉内ワクチン(FLUZONE(商標) Quadrivalent及びHigh Dose)よりも鼻腔内投与されたワクチンの方がチャレンジウイルスを良好に防御することが示された。さらに、BM2SR-Yam(一価、又はH1N1又はH3N2とともに製剤化されたもの)は、FLUZONE(商標) High Dose(Yamを含有する)又はFLUZONE(商標) Quadrivalent (VicとYamの両方を含有する)よりも、ビクトリア系統のチャレンジに対して優れた防御をもたらした。

これらのデータは、鼻腔内投与されたBM2SRワクチンが筋肉内投与された認可済みの不活化ワクチンよりもマウスにおけるチャレンジに対してより優れた防御をもたらすることを示す。

［実施例12］
本実施例は、生産に使用されるBM2Vero細胞においてBM2SRウイルス製造が拡張可能であることを実証する。

BM2Vero細胞(インフルエンザB BM2タンパク質を安定的に発現するVero細胞)は、OptiVero培地(InVitria、Aurora、CO)を使用して、37℃、5%CO₂雰囲気の加湿インキュベータで培養した。CELLSTACK(商標)培養チャンバー-5チャンバー(CS5;Corning, Corning, NY)、ロットあたり2～4培養チャンバー内の約2億4200万個の細胞を、OptiVero培地中で、インフルエンザB/Colorado/06/2017(Vic)のHA及びNA遺伝子をコードするBM2SR-Vicウイルスか、又は、Influenza B/California/12/2015(Yam)のHA及びNA遺伝子をコードするBM2SR-Yamウイルスのいずれかにて0.01の感染多重度(MOI)で感染させた。35℃、5% CO₂で2～3日後、上清のHA力価が少なくとも32 HAU/50μLとなったときに、培養液を回収し、低速遠心分離によって細胞と細胞デブリを除去した。上清を0.2μMポアPESメンブレンに通過させる真空ろ過によってさらに清澄化し、滅菌した。清澄化した上清は、次いで、非特異的RNA及びDNAヌクレアーゼ(BENZONASE(商標)ベンゾナーゼ、5 units/mL)を用いて、37℃、2時間処理し、残存する細胞RNA及びDNAを消化/加水分解した。BENZONASE(商標)ベンゾナーゼ消化物は、次いで、235 cm² 300kD MWCO修飾ポリエーテルスルホン(mPES) MIDIKROS(商標)中空繊維フィルターモジュール(Repligen、Waltham、MA)を使用して、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)によって精製した。当該消化物を10から20倍に濃縮した。次に、混入している宿主細胞タンパク質(HCP)と残存するDNA断片を、少なくとも15カラム容量のSPGを使用したダイアフィルトレーションによって除去した。SPG緩衝液中の精製ウイルスを、25%シュークロースリン酸緩衝生理食塩水(PBS)クッションを介して25,000rpmで超遠心分離することにより、さらに10倍から100倍に濃縮した。得られたウイルスペレットをSPGに再懸濁し、分注し、液体N₂で急速冷凍した後、-80℃で保存した。

濃縮及び精製されたBM2SR-Vic及びBM2SR-Yam遺伝子の配列相同性を、ウイルスシードストックの参照配列のものと比較した。精製したウイルスから抽出したウイルスRNAをRT-PCRに供し、cDNAを生成させた後、サンガー配列決定を行った。8つのウイルスセグメントによってエンコードされたORFの分析により、すべてのセグメントが参照に対して100%のヌクレオチド配列同一性を持っていることが示された。

濃縮及び精製されたBM2SR-Vic及びBM2SR-Yamウイルスの感染力価は、BM2CK細胞(インフルエンザB BM2を安定して発現するMDCK細胞)を使用した少なくとも3つの独立した測定による50%組織培養感染量(TCID₅₀)アッセイによって決定した。この手順では、ワクチンサンプルを段階希釈してBM2CK細胞を96ウェルプレートに複製し、35℃、5%CO₂雰囲気で4日間培養した。接種後4日目の時点で、細胞単層を視覚的に観察しCPEを記録した。ウイルスの力価はReed and Muench法を使用して計算し、TCID₅₀/mLとして表された。さらに、CPEによって決定されたウイルス力価を検証するために、HA活性を各ウェルの上清のアリコートにおいて試験した。表8に示すように、濃縮及び精製後、BM2SRウイルスは一貫して10^8.6 TCID₅₀/mLを超える高い力価に達した。

BM2SRワクチンウイルスが濃縮及び精製後に複製欠損表現型を維持していることを確認するために、複製ウイルスの存在を、野生型インフルエンザウイルスには許容されるがBM2SRウイルスには非許容であるMDCK細胞における試験対象品の3連続継代によって評価した。感染の第一ラウンドでは、試験ウイルスを段階的に希釈し、細胞単層に播種した。次いで、感染細胞を35℃、5%CO₂雰囲気で4日間培養した。次いで、感染細胞培養上清を新鮮なMDCK単層に移し、35℃、5%CO₂雰囲気で4日間インキュベートした。継代の第三ラウンド及び最終ラウンドでは、この感染細胞培養培地を別の新鮮なMDCK単層に移し、35℃、5%CO₂雰囲気でさらに4日間インキュベートした。MDCK細胞は、35℃で4日間の培養毎にCPEについて観察し、且つ、子孫ビリオンの存在を確認するために培養上清中のHA活性を決定した。感染の各ラウンドについて、前ロットの複製欠損参照ウイルスであるB/California/12/2015 BM2SRをポジティブコントロールとして試験した。培地のみをネガティブコントロール接種物とした。結果として、コントロールが予想通りに機能し、且つ、4つの試験対象品のいずれかを正常細胞に接種した後には感染性の子孫が検出されないことが示された。従って、BM2SRワクチンウイルス調製物は、複製能力がなく、複製できないことが実証された。

ワクチン調製物の無菌性は、医薬品に関するWHOの仕様に基づく手順によって検証した。ワクチン調製物は、無菌条件下で、3種類の液体培地、すなわち、Luria-Bertaniブロス(LB)、トリプシン大豆ブロス(TSB)、およびチオグリコール酸培地(TGM)に接種した。培養物は37℃(LB及びTSB)及び周囲温度(TGM)で増殖させた。培養物を14日間増殖させ、次いで微生物の増殖について視覚的に観察した。試験されたすべての調製物は、すべての増殖条件において微生物の増殖が認められなかった。

［実施例13］
本実施例は、フェレットモデルにおいて、BM2SRバックボーンが弱毒化するが、脱落せず、且つ、伝播しないことを実証する。

M2SRウイルスは、例えばインフルエンザA/Brisbane/10/2007-like A/Uruguay/716/2007(H3N2)又はインフルエンザA/California/07/2009(H1N1pdm)のHA及びNA遺伝子をコードしているが、機能的M2タンパク質は発現しない組換えA型インフルエンザウイルスである。BM2SRウイルスは、例えば、B/Brisbane/60/2008（ビクトリア）又はB/Wisconsin/01/2010(ヤマガタ)のHA及びNAをコードするが、機能的BM2タンパク質を発現しない組換えB型インフルエンザウイルスである。本明細書においてM2SR Quadとも呼ばれる四価のM2SRは、A/H1N1、A/H3N2、B/ビクトリア、B/ヤマガタ HA及びNAをコードする2つのM2SR及び2つのBM2SRウイルスから構成される。

動物及び動物の管理。Triple F Farmsから購入したオスのフェレットを本研究に配置した。動物は研究開始時に約4ヶ月齢だった。動物は、健康であり、感染症に対する抗体を有していないことがサプライヤーによって証明された。到着後、動物は、紙を敷いた受け皿の上に吊り下げられた、スラット底を備えた吊り下げられたワイヤーケージに単独で収容した。動物飼育室及びケージは、一般に認められている動物管理の慣行及び関連する標準的な操作手順に従って動物の受領前に清掃及び消毒した。Certified Teklad Global Ferret Diet #2072(Teklad Diets、ウィスコンシン州マディソン)と水は自由に与えられ、週に少なくとも3回は新しいものと交換した。動物飼育室の蛍光灯は、12時間の明/暗サイクルで維持した。動物飼育室の室温と相対湿度は、各プロトコルの制限内にあり、本試験中、それぞれ20.0～25.0℃及び30～63%の範囲であった。

動物検疫および無作為化。無作為化の前にフェレットを7日間隔離し毎日観察した。動物が全体的に健康であることを意味する毎日の観察結果に基づいて、フェレットを無作為化及び試験のために検疫から解放した。検疫後、フェレットの体重を測定し、同様のグループ平均値を生成する体重に基づいてコンピュータ化された無作為化手順(TOXDATA(商標)バージョン2.1.E.11(PDS Pathology Data Systems, Inc.、バーゼル、スイス))を用いて処置グループに割り当てた。一つのグループ内で、すべての体重は平均の20%以内であった。本研究のために選択された動物は、耳タグ及びトランスポンダーによって恒久的な識別番号を受け、且つ、識別ケージカードによっても識別番号及び識別グループにより研究動物を識別した。割り当てられた識別番号は本研究内で独自のものとした。

研究動物の事前手続。動物のすべての手続は、IIT研究所の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って、動物のバイオセーフティレベル2の施設で行われた。接種前に、フェレットを3日間モニターし、体重を測定し、ベースラインの体温を確立した。各フェレットの皮下に埋め込まれたトランスポンダー（BioMedic data systems、デラウェア州シーフォード）を介して、温度の読取値を毎日記録した。試験開始前に血液を採取し、インフルエンザ抗体に関して血清を検査した。ワクチン接種前の血清サンプルを受容体破壊酵素(RDE)で処理して非特異的阻害剤を除去した後、次いで段階希釈し、規定量のインフルエンザウイルスA/California/07/2009 (H1N1pdm)、インフルエンザウイルスA/Switzerland/9715293/2013(H3N2)、インフルエンザウイルスB/Brisbane/60/2008(ビクトリア系統)およびインフルエンザウイルスB/Wisconsin/01/2010(ヤマガタ系統)を0.5%の七面鳥赤血球又は0.75～1.0%のモルモット赤血球と混合した。抗体力価は、赤血球凝集の阻害を引き起こす最低の血清希釈によって定義した。HAI(血球凝集阻害)力価が40未満のフェレットのみを血清陰性と見なし、本研究で使用した。以下に概説するように研究動物を無作為化し、グループに分けた。

BM2SRワクチンウイルスの弱毒化を評価するために、研究0日目に3匹のフェレットのグループに麻酔をかけ、単回投与量である1x10^8.2 TCID₅₀のB/CO/06/2017(Vic)BM2SRウイルスを鼻腔内接種した。対照グループ(フェレット3匹)には、単回標的用量である1x10^7.4 TCID₅₀の野生型B/Brisbane/60/2008(Vic)ウイルスを接種した。研究0日目に曝露後、体重を1日1回記録し、曝露の6時間後とその後1日1回、体温の変化をモニターした。生存確認は1日2回記録した。研究3日目に、動物(1グループあたり3匹の動物)を安楽死させ、次の組織サンプルを収集した:鼻甲介、気管、肺、腎臓、嗅球、脳、肝臓、脾臓、腸。収集されたサンプルの一部は組織学的評価のために緩衝化中性ホルマリンで固定し、サンプルの他の部分はウイルス力価測定のために-65℃以下で保存した。力価測定のために採取された組織には以下が含まれる:右鼻甲介、気管の上部1/3、右頭蓋肺葉(十分なサイズの場合)、又は肉眼的病変のある肺葉(葉の1つだけに病変がある場合は、当該葉を組織学用に処理し、ウイルス力価を他の葉から決定した。複数の葉に病変があった場合は、1つの葉をウイルス力価測定用に採取し、もう1つの葉を組織学用に採取した)、右腎臓、右嗅球、右脳、肝臓の右外側葉、脾臓の右半分(腹腔を開くと見える脾臓の端）、小腸、及び大腸。

1x10^7.4 TCID₅₀の野生型インフルエンザB/Brisbane/60/2008(Vic)を接種した1匹のフェレットは接種後1日目に体温が上昇(2.2℃)したが、野生型ウイルスを接種した他の2匹のフェレットと、1x10^8.2 TCID₅₀のB/CO/06/2017(Vic)BM2SRウイルスを接種した3匹のフェレットは投与後3日間発熱しなかった。本研究で使用されたフェレットは体重が2.8%を超えて減少又は増加しなかった。6匹のフェレットすべてを安楽死させ、臓器のウイルス負荷を力価測定した。表9に示されるように、野生型インフルエンザB/Brisbane/60/2008(Vic)は、鼻甲介及び気管を含む上気道並びに脳で検出された。ウイルスを接種したフェレット由来の臓器ではどの臓器からもウイルスは検出されなかった。

フェレットモデルにおけるBM2SR伝播の可能性を評価するために、ナイーブドナーフェレットに、1x10^8.2 TCID₅₀の投与量でインフルエンザB/CO/06/2017(Vic)BM2SRワクチンを、又は、1x10^7.4TCID₅₀の投与量でコントロールの野生型インフルエンザB/Brisbane/60/2008(Vic)ウイルスを鼻腔内接種した。24時間後、各ドナーフェレットを、1匹のナイーブフェレット(直接接触)と同じワイヤーケージ(二重収容)に配置した。追加のナイーブフェレット(エアロゾル接触)を、10～12cmの距離でドナーのケージから分離された、伝播チャンバー内の別の隣接するワイヤーケージ(単一収容)に配置した。この距離によって、エアロゾル接触と、感染動物及び直接接触との間の物理的接触を防ぎつつ、空気と呼吸飛沫の通過のみをこれらのフェレット間で共有できるようにした。接種後7日間、フェレットの体温、体重、及び臨床症状を毎日モニターした。鼻洗浄液を、1、3、5、7、9日目にすべての接種ドナーフェレットから採取し、また、2、4、6、8、10日目にすべての接触フェレットから採取した。14日目にすべてのフェレットから鼻洗浄液と血清を採取した。

3匹のBM2SRワクチンウイルスドナーフェレット、及び、それらの直接接触及びエアロゾル接触フェレットからの鼻洗浄液において、任意の時点でウイルスは検出されなかった(図13A)。BM2SRワクチンウイルスグループのフェレットは、発熱、体重減少、又は臨床症状を示さなかった。野生型インフルエンザB/Bris/60/2008は、接種後1、3、及び5日目の野生型ウイルスドナーフェレットからの鼻洗浄液で検出された(図13B)。いずれのフェレットも体温、体重、又は臨床症状の変化を示さなかったものの、野生型ウイルスドナーフェレットのうち直接接触及びエアロゾル接触フェレットはいずれも感染し、ウイルスを排出した。

これらのデータは、試験設定が適切であったことを示しており、複製可能且つ感染可能なウイルスの複製及び伝染性が証明された。同一の試験設定において、BM2SRウイルスはフェレットで複製せず、また、直接接触及びエアロゾル接触動物においても検出されなかったが、これはBM2SRウイルスが高度に弱毒化されており、フェレットにおいて複製せず、従って伝染性がないことを示す。フェレットモデルではBM2SRは弱毒化を維持されており、BM2SRを接種したフェレットは病気の臨床的徴候を示さず、呼吸路や他の臓器におけるウイルス複製も示さない。さらに、BM2SRは直接接触又はエアロゾル接触動物では検出されず、これはBM2SRが伝染性ではないことを示す。

［実施例14］
本実施例は、三価のM2SR(本明細書ではM2SR Tri-Yamとも呼ばれる)ワクチン及び四価のM2SR(本明細書ではM2SR Quadとも呼ばれる)ワクチンによって誘導される免疫応答が、ナイーブ及びプレ免疫(preimmune)フェレットモデルの両方においてドリフトチャレンジウイルスに対する防御効果をもたらすことを実証する。

動物管理、検疫、無作為化、及び研究前手続は実施例13に概説した通りとした。

実験計画を表10に示す。試験0日目に、フェレットに野生型ウイルスをプレ感染させるか、又は、M2SR Tri-Yam、M2SR Quad、FLUMIST(商標) Quadrivalent(本明細書ではFLUMIST(商標) Quadとも呼ばれる)、又はPBSを鼻腔内投与によって接種、若しくはFLUZONE(商標) Quadrivalent (FLUZONE(商標) Quadとも呼ばれる)を筋肉内注射によって接種した。試験30日目に、M2SR Tri-Yam、M2SR Quad、FLUMIST(商標) Quad及びPBSの鼻腔内投与又はFLUZONE(商標) Quadの筋肉内注射によって、フェレットにワクチン接種を行った。各ワクチンの菌株成分を表6に示す。ワクチン接種/暴露後、試験日-8から-3、28、37、51、及び65日にすべての動物から血清を採取した。さらに、末梢血単核細胞(PBMC)は、試験28日目と37日目に、すべての動物から採取した。試験72日目にフェレットにB/Brisbane/60/2008(B Victoria系統)をチャレンジした。チャレンジ後14日間、フェレットの体重、体温及び臨床症状をモニターした。チャレンジ後1、3、5及び7日目(試験73、75、77及び79日目)に、チャレンジしたすべてのフェレット(臓器収集に割り当てられたものを除く)から鼻洗浄液を収集し、ウイルス力価測定用にサンプルを-65℃以下で保存した。試験75日目に各グループから4匹のフェレットを安楽死させ、剖検した。ウイルス力価分析のために、鼻甲介、気管及び肺を採取した。試験86日目に残りのすべての動物から血清回収のために最後の採血を行った。

抗体の機能的活性を実証するために、血清HAI及びPRNT(プラーク減少中和試験)の力価を、インフルエンザA/Montana/50/2016(H1N1)、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)、B/California/12/2015(Yam)、及びB/Colorado/06/2017(Vic)(図14A～D及び図15A～D)に対して測定した。BM2SR-Yamを含むM2SR Tri-Yamによるワクチン接種は、ナイーブ動物において、すべてのワクチン成分に対する抗インフルエンザHAI及び中和抗体を誘発した。M2SR Tri-Yamは、2回目の投与後に追加免疫したナイーブ動物において、(B Victoriaに対する)系統間インフルエンザB抗体産生を誘導した。M2SR Quadを単回投与又は2連続投与した動物は、4つの株成分すべてに対するHAI及び中和抗体を産生した。さらに、M2SR Quadからの抗体産生の大きさはM2SR Tri-Yamのそれに匹敵し、これは、第2のBM2SR成分の添加がワクチン性能に影響を与えなかったこと、及びM2SR Quad製剤が菌株干渉を呈さないことを示す(図14A-D及び図15A-D)。

M2SR QuadとFLUMIST(商標) Quadは、それぞれナイーブ動物でHAIと中和抗体を誘発したが、FLUZONE(商標) Quadワクチンは2連続投与しても対応する抗体を誘発できなかった。しかし、FLUMIST(商標) Quadをワクチン接種したプレ免疫動物は、M2SR Quadと比較して、いくつかの菌株に対するHAI及び中和抗体の産生が低かった。M2SR Quadを2回投与された動物と比較して、FLUMIST(商標) Quadを2回投与された動物においては抗体産生も阻害された(図14A-D及び図15A-D)。これらの結果は、M2SR Quadが既存のインフルエンザ免疫の影響を受けないことを示す。

細胞性免疫応答のマーカーとして、全血PBMCからのインフルエンザ特異的IFN-γ分泌を、フェレット特異的な酵素免疫スポット(ELISpot)によって測定した。FLUMIST(商標) Quadでは10匹中6匹のみ、FLUZONE(商標) Quadでは10匹中2匹のみであったのに対して、M2SR Quadワクチン接種を受けたプレ免疫動物では10匹中9匹のフェレットがH3N2インフルエンザウイルス刺激後に細胞性免疫応答の上昇を示した(図18A)。H1N1 HAペプチドによる刺激後に同様の応答が見られ、M2SR Quadでは10匹中10匹の動物で細胞性免疫応答の上昇が示されたが、FLUMIST(商標) QuadとFLUZONE(商標) Quadでは上昇の頻度ははるかに低かった(それぞれ10匹中6匹及び10匹中2匹、図18B)。これらの結果は、M2SRが抗体応答に加えて強力なT細胞応答を誘導することを示す。

インフルエンザB-Vicチャレンジ後、モック治療を受けたナイーブ動物は、約5～6%の一時的な体重減少と体温上昇を示した。FLUZONE(商標) Quadの単回投与を受けたナイーブフェレットは、モック治療を受けた動物と同様に約4～5%の一時的な体重減少を示したが、M2SR Tri-Yam及びM2SR Quadグループでは体重は減少しなかった。プレ免疫ワクチングループの中で、FLUZONE(商標) Quadフェレットはモックグループと同様の体重減少及び体温上昇を示したのに対し、Quad M2SRグループは体重減及び体温上昇を示さなかった(図19)。

チャレンジ後1、3、5及び7日目に鼻腔洗浄液を採取し、MDCK細胞におけるTCID_５０アッセイによって力価測定した(図17)。M2SR Tri-Yamは、ナイーブフェレットに系統間インフルエンザB防御をもたらし、すべてのサンプリング日でウイルス力価の低下を示し、コントロールフェレットでは検出不能なレベルに達した。M2SR Quadを投与されたナイーブフェレットのウイルス力価は、M2SR Tri-Yamと同等かわずかに低く、M2SR Quad製剤には干渉がないことが再び実証された。プレ免疫フェレットにおいては、M2SR QuadとFLUMISTTM Quadの両方でチャレンジウイルスの複製を迅速に制御し、チャレンジ後3日目の時点で低レベルでしか検出されなかった。鼻腔洗浄液中のウイルスレベルの低下は、M2SR Quad又はFLUMIST(商標) Quadを2回投与したフェレットでも見られたが、FLUZONE(商標) Quadを2回投与したフェレットの力価は、チャレンジ後5日間高いままであった(図17)。

呼吸器(鼻甲介、気管、及び肺)は感染後3日目に1グループあたり4匹のフェレットから採取し、MDCK細胞でのプラークアッセイによってウイルス力価を測定した。B型インフルエンザチャレンジウイルスは、すべてのワクチン接種グループのすべてのフェレットの肺及び気管から回収されなかった。M2SR Tri-Yamは、ナイーブフェレットに系統間インフルエンザB防御をもたらし、特に2連続投与後に鼻甲介におけるウイルス力価が低下することを実証した。M2SR Quadを受けたナイーブフェレットのウイルス力価はさらに減少した。プレ免疫フェレットにおいては、M2SR及びFLUMIST(商標) Quadのワクチン接種の結果チャレンジ後3日目にウイルス力価は検出されなかった。興味深いことに、FLUZONE(商標) Quadをワクチン接種したプレ免疫フェレットのHAI及びPRNT血清分析において見られた高い中和抗体価は、鼻甲介におけるチャレンジウイルスの増殖を妨げなかった。さらに、M2SR Quad又はFLUMIST(商標) Quadを2回投与したフェレットでは、ウイルス力価は検出されなかったが、一方でFLUZONE(商標) Quadを2回投与したフェレットは防御されなかった。

本実施例は、M2SR Tri-Yam製剤又はM2SR Quad製剤の鼻腔内投与が、フェレットモデルにおけるワクチン関連の有害事象(例えば、体温の上昇、体重減少又は臨床徴候)と関連しないことを実証した。M2SR Tri-Yamワクチンは、ナイーブ動物において系統間インフルエンザB抗体の産生とチャレンジ後の防御を誘導した。M2SR Quadフェレットでは、4つの系統成分すべてに対するHAI及び中和応答が高いまま維持されており、これはM2SR多価製剤には干渉がないことを示す。さらに、認可ワクチンFLUMIST(商標) Quadとは異なり、M2SR Quadの抗体産生は、プレ免疫動物において減少しなかった。インフルエンザ特異的刺激後の細胞性免疫応答は、M2SR Quadをワクチン接種されたフェレットでより高く、より頻繁であり、この点において、現在認可されているワクチンFLUMIST(商標) Quad及びFLUZONE(商標) Quadとはさらに区別される。

本明細書に引用される刊行物、特許出願及び特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることが個別に具体的に示され、且つ、その全体が本明細書に記載されるものと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を説明する文脈における(特に、以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「a」及び「an」並びに「the」及び「少なくとも1つの」及び同様の指示対象の使用は、本明細書における別段の指定又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。「少なくとも1つ」という用語の後に1つ又は複数の項目のリストが続く使用(例えば「A及びBの少なくとも1つ」)は、リストされた項目(A又はB)から選択される1つの項目、又は、リストされた項目(A及びB)の2つ以上の任意の組み合わせを意味すると解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」という用語は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語(すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する)として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、範囲内に入る個々の値を個別に参照する簡略な方法として機能することを単に意図しており、個々の値は、本明細書において個別に列挙されているかものとして本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されたすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供されるあらゆる例又は例示的な言葉(例えば、「など」)の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書の文言は、特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。

本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための発明者らが知り得る最良のモードを含めて、本明細書に記載されている。前述の説明を読むことにより、これらの好ましい実施形態の変形が当業者には明らかとなり得る。発明者らは、当業者がそのような変形を適切に採用することを期待し、発明者らは、本明細書に具体的に記載された以外の方法で本発明が実施されることを視野に入れている。したがって、本発明は、適用法によって認められるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題のすべての修正物及び均等物を包含する。さらに、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、上記の要素のすべての可能な変形における任意の組み合わせが本発明に包含される。

配列決定規則は、アデニン(a)、グアニン(G)、シトシン(C)、及びチミン(T)の4つのヌクレオチドを参照するDNAに基づく。RNA又はインフルエンザウイルスを指す場合、Tはウラシル(U)を意味する。

Claims (31)

1. PA、NP及びNS遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスであって、
   (a) 該PA遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置2272にチミンを含み；
   (b) 該NP遺伝子セグメントは、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するNPタンパク質をコードし、該選択されたアミノ酸は、40位のセリン、161位のアスパラギンもしくはグリシン、204位のスレオニン、及び任意で93位のバリンを含み；
   (c) 該NS遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置39にグアニンを含み、かつ該NS遺伝子セグメントは、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するNS1タンパク質をコードし、該選択されたアミノ酸は、176位のグルタミンを含む、インフルエンザウイルス。
2. PA遺伝子セグメントが配列番号10で表されるヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載のインフルエンザウイルス。
3. NP遺伝子セグメントが配列番号11で表されるヌクレオチド配列を有する、請求項1又は2に記載のインフルエンザウイルス。
4. PA遺伝子セグメントが、配列番号15で表されるアミノ酸配列を有するPAタンパク質をコードする、請求項1～3のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
5. NP遺伝子セグメントが、配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するNPタンパク質をコードする、請求項1～4のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
6. NS遺伝子セグメントが、配列番号12で表されるヌクレオチド配列を有する、請求項1～5のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
7. NS遺伝子セグメントが、配列番号17で表されるアミノ酸配列を有するNS1タンパク質をコードする、請求項1～6のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
8. 選択されたアミノ酸が、Vero細胞株内で少なくとも10回連続継代した後も、NP及びNSタンパク質の少なくとも1つで保存されている、請求項1～7のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
9. 選択されたアミノ酸が、B型インフルエンザウイルスのBM2イオンチャネルタンパク質を安定に発現するVero細胞株内で少なくとも10回連続継代した後も、NP及びNSタンパク質の少なくとも1つで保存されている、請求項1～8のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
10. インフルエンザウイルスが組換えインフルエンザウイルスである、請求項1～9のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
11. ウイルスがさらにPB遺伝子セグメントを含む、請求項1～10のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
12. ウイルスがさらにNA遺伝子セグメント及びHA遺伝子セグメントを含む、請求項1～11のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
13. HA遺伝子セグメントが、HA2内に少なくとも1つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を有するHAタンパク質をコードする、請求項12に記載のインフルエンザウイルス。
14. HA2内の少なくとも1つのアミノ酸変異が61位のグルタミン酸である、請求項13に記載のインフルエンザウイルス。
15. HA2内の少なくとも1つのアミノ酸変異が112位のグルタミン酸である、請求項13に記載のインフルエンザウイルス。
16. PA、NP及びNS遺伝子セグメントが単一のインフルエンザ株に由来する、請求項1～15のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
17. HA遺伝子セグメントが、PA、NP及びNS遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来する、請求項16に記載のインフルエンザウイルス。
18. NA遺伝子セグメントが、PA、NP及びNS遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来する、請求項16又は17に記載のインフルエンザウイルス。
19. さらに変異M遺伝子セグメントを含む、請求項1～18のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
20. インフルエンザウイルスが機能的なBM2タンパク質をコードしない、請求項19に記載のインフルエンザウイルス。
21. ウイルスがヒト細胞内で複製可能である、請求項1～20のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
22. ウイルスが、選択されたアミノ酸がないことを除いて同一であるインフルエンザウイルスと比較して、同一条件下で、Vero細胞内での増殖が増強されている、請求項1～21のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス。
23. 請求項1～22のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスを含む、医薬製剤。
24. 医薬製剤がワクチンである、請求項23に記載の医薬製剤。
25. ワクチンが一価のワクチンとして製剤化される、請求項24に記載の医薬製剤。
26. ワクチンが二価のワクチンとして製剤化される、請求項24に記載の医薬製剤。
27. ワクチンが三価のワクチンとして製剤化される、請求項24に記載の医薬製剤。
28. ワクチンが四価のワクチンとして製剤化される、請求項24に記載の医薬製剤。
29. 請求項1～22のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルス又は請求項23～28のいずれか一項に記載の医薬製剤を哺乳動物に投与し、それによって該哺乳動物において該インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発することを含む、該哺乳動物における免疫応答の誘発方法。
30. 哺乳動物がヒトである、請求項29に記載の方法。
31. 請求項1～22のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスの生成方法であって、Vero細胞内でインフルエンザウイルスを連続継代することを含む、方法。