CN116134137A - 流感病毒骨架 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在Vero细胞中表现出增强生长的流感病毒。流感病毒包括具有选定核苷酸并且编码具有选定氨基酸的氨基酸序列的蛋白质的PA、NP和NS基因区段。本发明还提供了含有所述流感病毒的药物制剂，以及通过向哺乳动物施用所述流感病毒而在所述哺乳动物中引发免疫应答的方法，以及产生所述流感病毒的方法。

Description

流感病毒骨架

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2020年7月21日提交的美国临时专利申请63/054,676的权益，其通过引用整体并入本文。

关于联邦赞助的研究或开发的声明

本发明是在国家卫生研究院(National Institutes of Health)给予的政府支持，在授权号AI109925下进行的。政府享有本发明的某些权利。

以引用方式并入电子材料

通过引用以其整体并入本文的是随本文同时提交并且如下鉴定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“755023SequenceListing.txt”，创建于2021年7月20日的一份46,917字节的ASCII(文本)文件。

发明背景

流行性感冒，即“流感”是高度传染性的病毒感染，每年在全球范围内夺去成千上万的人的生命。基于流感病毒的核心蛋白分类，有四种类型的流感病毒(即，甲、乙、丙和丁)，尽管季节性流行病最常由流行的甲型流感病毒和乙型流感病毒引起。

尽管疫苗是预防流感的最佳方法，但流感疫苗必须经常重新配制，因为流感病毒易发生抗原漂移和抗原转变。此外，因为流感病毒通常表现出高的突变率和进化率，所以流感疫苗毒株可能与流行毒株不匹配，从而导致最小的疫苗效力。然而，当流行的流感病毒与流感疫苗良好匹配时，接种疫苗可以将总体人群中流感相关疾病的风险降低40％-60％。因此，研究人员一直在研究能够在不同流感亚型之间诱导交叉保护性免疫的疫苗。一个这样的实例是包含不表达功能性M2蛋白的减毒活流感病毒的疫苗(例如，用于甲型流感病毒的M2SR疫苗)。

流感疫苗优选在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞和非洲绿猴(Vero)细胞中繁殖，因为哺乳动物细胞培养物提供了优于基于蛋的生产的优势。这些优势包括较低的成本、较快的生产时间和降低的病毒中抗原突变的风险。例如，在稳定表达M2蛋白的Vero细胞中繁殖M2SR疫苗。然而，细胞培养物中的疫苗生产经常导致不良的产率。此外，MDCK细胞通常比Vero细胞更具有容纳性，使得Vero细胞中的疫苗产生相对低效。

对病毒骨架，即由PB1、PB2、PA、NP、M和NS组成的六个内部基因区段的修饰已经显示出加强疫苗产生。例如，Ping等人,Nature Communications,6:8148(2015)中开发和描述的高产率甲型流感病毒疫苗骨架“PR8-HY”，以及Ping等人，PNAS,113(51):E8296-E8305(2016)中开发和描述的高产率乙型流感病毒疫苗骨架在PB1、PB2、PA、NP和NS1蛋白中包含特定氨基酸突变，并且预期改善细胞和蛋培养系统中大规模流行和季节性流感疫苗的滴度。然而，本领域描述的这些修饰在增加Vero细胞中的病毒生长方面是无效的，特别是在优选的生产条件下。因此，需要增强Vero细胞中的病毒生长，使得疫苗能够更高效地且有效地生产。

发明内容

本发明提供了在Vero细胞中生长增强的流感病毒。流感病毒包含编码蛋白质，例如PB1、PB2、PA、NP和NS1蛋白的基因区段，其中至少PA、NP和NS基因区段具有包含选定氨基酸的氨基酸序列。具体而言，PA基因区段包含在核苷酸位置2272处的胸腺嘧啶。NP蛋白包含在第40位的丝氨酸，在第161位的天冬酰胺或甘氨酸，在第204位的苏氨酸，并且任选地在第93位的缬氨酸。NS基因区段包含在核苷酸位置39处的鸟嘌呤，并且NS基因区段编码在第176位包含谷氨酰胺的NS1蛋白。

本发明还提供了包含所述流感病毒的药物制剂；引发哺乳动物中免疫应答的方法，其包括向所述哺乳动物施用所述流感病毒；以及产生所述流感病毒的方法。

附图的几个视图的简要说明。

图1是描绘流感BM2SR4 CA12 BM2SR HA和NP突变在BM2Vero P3中的生长相对于时间(天数)的图。

图2是描绘无动物来源(AOF)培养基中乙型流感NP突变体的生长相对于时间(感染后天数)的图。

图3是一组Sanger序列色谱图数据，表明在随后的传代中，乙型流感骨架中的突变NS569_570insA的频率从约20％增加到约50％的突变体。

图4是描绘BM2Vero P3中的WA/02/2019N209S和K420E HA在AOF中的生长相对于时间(接种后的天数)的图。

图5是描绘BM2Vero P3中流感BM2SR4 CA12 HA2突变的生长相对于时间(天数)的图。

图6是描绘乙型流感CA12 N211T HA2突变体在AOF中的生长相对于时间(感染后天数)的图。

图7A是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、二价BM2SR、三价BM2SR+M2SR-H1N1、三价BM2SR+M2SR-H3N2、四价M2SR免疫或蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲液(“SPG”；对照)的小鼠血清中抗乙型流感-Vic HA的滴度相对于时间(免疫后天数)的图。

图7B是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、二价BM2SR、三价BM2SR+M2SR-H1N1、三价BM2SR+M2SR-H3N2、四价M2SR或SPG(对照)免疫的小鼠血清中抗乙型流感-Yam HA的滴度相对于时间(免疫后天数)的图。

图8是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR或SPG(对照)免疫的小鼠，在用B/Malaysia/2506/2004(Vic)病毒激发后的小鼠体重变化百分比相对于时间(攻击后天数)的图。

图9是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUMIST^TM四价、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG(对照)免疫后的小鼠体重变化百分比相对于时间(接种后天数)的图。

图10A是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUMIST^TM四价、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG(对照)免疫的小鼠的血清中抗乙型流感-Vic HA血清IgG ELISA滴度相对于时间(接种疫苗后的天数)的图。

图10B是描绘用单价BM2SR-Vic,BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUMIST^TM四价、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG(对照)免疫的小鼠血清中抗乙型流感-Yam HA血清IgG ELISA滴度相对于时间(接种疫苗后的天数)的图。

图10C是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUMIST^TM四价、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG(对照)免疫的小鼠血清中抗甲型流感/H1 HA血清IgG ELISA滴度相对于时间(接种疫苗后的天数)的图。

图10D是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUMIST^TM四价、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG(对照)免疫的小鼠的血清中抗甲型流感/H3 HA血清IgG ELISA滴度相对于时间(接种疫苗后的天数)的图。

图11A是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUMIST^TM四价、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG(对照)免疫的小鼠的气管-肺洗液中IgG ELISA滴度相对于HA1测试抗原(A/H1、A/H3、B/Yam或B/Vic)的图。

图11B是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUMIST^TM四价、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG(对照)免疫的小鼠的气管-肺洗液中抗流感HA1 IgAELISA滴度相对于HA1测试抗原(A/H1、A/H3、B/Yam或B/Vic)的图。

图12是描绘用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUMIST^TM四价、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG(对照)免疫的小鼠，在用乙型流感/Malaysia/2506/2004(Vic)激发后的小鼠体重变化百分比相对于时间(激发后的天数)的图。

图13A是描绘来自BM2SR-Vic供体雪貂及其直接接触和气溶胶接触的雪貂的鼻洗液中的BM2SR-Vic病毒滴度相对于时间(接种后的天数)的图。病毒检测极限为1.67logTCID₅₀/mL(虚线)。

图13B是描绘来自乙型流感(Vic)供体雪貂及其直接接触和气溶胶接触的雪貂的鼻洗液中野生型乙型流感(Vic)病毒滴度相对于时间(接种后的天数)的图。绘制各雪貂的病毒滴度、组平均值和平均值的标准误差。病毒检测极限为1.67log TCID₅₀/mL(虚线)。

图14A是描绘如表10所述免疫的13个雪貂组的血清中抗甲型流感/H1 HAI滴度相对于时间(研究天数)的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为7.5。

图14B是描绘如表10中所述免疫的13个雪貂组的血清中抗甲型流感/H3 HAI滴度相对于时间(研究天数)的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为7.5。

图14C是描绘如表10中所述免疫的13个雪貂组的血清中抗乙型流感/Yam HAI滴度相对于时间(研究天数)的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为7.5。

图14D是描绘如表10中所述免疫的13个雪貂组的血清中抗甲型流感/Vic HAI滴度相对于时间(研究天数)的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为7.5。

图15A是描绘如表10中所述免疫的13个雪貂组的血清中抗甲型流感/H1 PRNT滴度相对于时间(研究天数)的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为15。

图15B是描绘如表10中所述免疫的13个雪貂组的血清中抗甲型流感/H3 PRNT滴度相对于时间(研究天数)的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为15。

图15C是描绘如表10中所述免疫的13个雪貂组的血清中抗乙型流感/Yam PRNT滴度相对于时间(研究天数)的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为15。

图15D是描绘如表10所述免疫的13个雪貂组的血清中抗甲型流感/Vic PRNT滴度相对于时间(研究天数)的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为15。

图16是描绘如实施例14所述的在用乙型流感/Vic流感激发后第3天鼻甲中的激发病毒滴度的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为1.3log FFU/g。

图17是描绘如实施例14所述的用乙型流感/Vic激发后第1、3、5和7天鼻洗液中的激发病毒滴度的图。绘制每组的平均滴度。检测极限为1.6log TCID₅₀/mL。

图18A是描绘在接种疫苗后第28天和第37天收获的细胞，在A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016病毒刺激后产生IFN-γ的PBMC的频率(每10⁶个细胞的斑点形成单位)的图。

图18B是描绘在接种疫苗后第28天和第37天收获的细胞，A/California/07/2009HA肽池刺激后产生IFN-γ的PMBC的频率(每10⁶个细胞的斑点形成单位)的图。

图19A是描绘用乙型流感/Vic激发后每个雪貂组的平均体重变化百分比的图。

图19B是描绘用乙型流感/Vic激发后每个雪貂组的平均体温变化的图。

发明详述

本发明的流感病毒可以是任何类型的流感病毒。例如，流感病毒可以是乙型流感病毒的任何亚型(例如Victoria或Yamagata)。在一些实施方案中，流感病毒可以是季节性乙型流感病毒。在一些实施方案中，流感病毒可以是重组流感病毒。如本文所用，重组流感病毒(例如，重排(reassortant)流感病毒)是包含来源于遗传上不同(即不同)的流感病毒(例如，异源基因区段)的遗传材料(例如，异源基因区段)的流感病毒。流感病毒也可以是分离的流感病毒。

如本文所用，术语“基因区段”是指编码病毒蛋白的核苷酸序列。基因区段可以由编码病毒RNA(vRNA)的cDNA(互补DNA)序列表示，即编码一种或多种病毒蛋白的SEQ ID NO:8-12和18。

如本文所用，术语“骨架”是指编码PB1、PB2、PA、NP、NS1和/或NS2以及M蛋白的流感基因区段。本发明的基因区段编码可以具有选定氨基酸的蛋白质。

如本文所用，术语“选定氨基酸”是指在氨基酸序列的特定位置上的特定氨基酸。在一些实施方案中，所述选定氨基酸是亲本氨基酸序列的遗传突变的结果。除了选定氨基酸对应的位置之外，亲本氨基酸序列可以与包含选定氨基酸的氨基酸序列相同。

流感病毒

(A)骨架蛋白

在本发明的一个实施方案中，所述流感病毒包含PA、NP和NS基因区段，其中(a)所述PA基因区段包含在核苷酸位置2272处的胸腺嘧啶；(b)所述NP基因区段编码具有包含选定氨基酸的氨基酸序列的NP蛋白，其中所述选定氨基酸包含第40位的丝氨酸、第161位的天冬酰胺或甘氨酸、204位的苏氨酸和任选地第93位的缬氨酸；以及(c)所述NS基因区段包含在核苷酸位置39处的鸟嘌呤，并且其中所述NS基因区段编码具有包含选定氨基酸的氨基酸序列的NS1蛋白，其中所述选定氨基酸包含在第176位的谷氨酰胺。

本发明的PB1(聚合酶碱性蛋白1)基因区段可以编码包含至少一个选定氨基酸的蛋白，即PB1蛋白。可以通过对亲本PB1序列，例如除了选定氨基酸对应的位置之外，与本发明的PB1氨基酸序列相同的序列，进行基因突变来获得选定氨基酸。本发明的PB2(聚合酶碱性蛋白2)基因区段也可以编码包含至少一个选定氨基酸的蛋白，即PB2蛋白。

本发明的PA(聚合酶酸性蛋白)基因区段也可以编码包含至少一个选定氨基酸的蛋白，即PA蛋白。在优选的实施方案中，所述基因区段包含在核苷酸第2272位的胸腺嘧啶。

本发明的NP(核蛋白)基因区段也可以编码包含至少一个选定氨基酸的蛋白，即NP蛋白。在优选的实施方案中，NP区段包含在第177位的胸腺嘧啶、在第540位的腺嘌呤和在第670位的胸腺嘧啶，并且NP基因区段编码具有选定氨基酸的蛋白质，所述蛋白质包含在第40位的丝氨酸、在第161位的天冬酰胺或甘氨酸、在第204位的苏氨酸以及任选地在第93位的缬氨酸。

本发明的NS(非结构)基因区段也可以编码包含至少一个选定氨基酸的蛋白，即NS1和/或NS2蛋白。在优选的实施方案中，NS区段包含在核苷酸第39位的鸟嘌呤和在第570位的胞嘧啶，并且NS基因区段编码具有选定氨基酸的NS蛋白(NS1蛋白)，其包含在第176位的谷氨酰胺。

在本发明的一个实施方案中，流感病毒包含编码具有选定氨基酸的蛋白，即PB1蛋白的PB1基因区段。PB1基因区段可以具有由SEQ ID NO:8表示的核苷酸序列。PB1基因区段可以编码具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的蛋白，即PB1蛋白。在该实施方案的另一个方面，流感病毒可以包含具有选定氨基酸的蛋白，即PB2蛋白的PB2基因区段。PB2基因区段可以具有由SEQ ID NO:9表示的核苷酸序列。PB2基因区段可以编码具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的蛋白，即PB2蛋白。在该实施方案的另一个方面，流感病毒可以包含NP基因区段，其编码在第40、116位和204位具有选定氨基酸，即在第40位的丝氨酸、在第161位的天冬酰胺或甘氨酸、在第204位苏氨酸，以及任选地在第93位的缬氨酸的蛋白，即NP蛋白。NP基因区段可以具有由SEQ ID NO:11表示的核苷酸序列。NP基因区段可以编码具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的蛋白，即NP蛋白。在该实施方案的另一个方面，流感病毒也可以包含NS基因区段，其编码在第176位具有选定氨基酸，即在第176位的谷氨酰胺的蛋白，即NS1和/或NS2蛋白。NS基因区段可以包含在核苷酸第39位的鸟嘌呤和在第570的胞嘧啶。NS基因区段可以具有SEQ ID NO:12表示的核苷酸序列。NS基因区段可以编码具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的蛋白，即NS1和/或NS2蛋白。在该实施方案的另一个方面，流感病毒可以包含编码蛋白即PA蛋白的PA基因区段。PA基因区段可以具有SEQ ID NO:10表示的核苷酸序列。PA基因区段可以编码具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的蛋白，即PA蛋白。

与在相同条件下除了没有选定氨基酸之外其余均相同的流感病毒相比，实施方案的选定氨基酸，特别是在骨架的大多数蛋白中，赋予流感病毒增强的生长特性。例如，本发明的流感病毒在Vero细胞中表现出增强的生长。

本发明的流感病毒还可以包含M(基质蛋白)基因区段。在本发明的一个实施方案中，M基因区段可以是来自乙型流感病毒的突变基因区段，使得病毒缺乏功能性BM2蛋白的表达。这种病毒在本文被称为“BM2SR”病毒。BM2SR病毒是单复制乙型流感病毒。BM2SR病毒的M基因区段可以由SEQ ID NO:18表示。M基因区段可以编码具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的蛋白，例如截短的BM2蛋白。BM2SR病毒可以在稳定表达BM2蛋白的Vero细胞(即，BM2VeroA细胞)中繁殖以允许多周期复制。Vero细胞中的高产率不依赖于M基因区段的突变。因此，本发明的流感病毒可以包含编码功能性M2蛋白的M基因区段。

(B)表面蛋白

在本发明的另一个实施方案中，流感病毒包含NA(神经氨酸酶)和HA(血凝素)基因区段。在本发明的一个实施方案中，HA基因区段可以编码具有包含在蛋白的HA1亚基中至少一个选定氨基酸(例如，氨基酸突变)和/或在蛋白的HA2亚基中至少一个选定氨基酸(例如，氨基酸突变)的氨基酸序列的HA蛋白。例如，HA2亚基中的至少一个氨基酸突变可以是第61位的谷氨酸。在另一个实施方案中，HA2亚基中的至少一个氨基酸突变可以是第112位的谷氨酸。氨基酸突变可以存在于乙型流感病毒的任何亚型或谱系(即，Victoria或Yamagata)中。在优选的实施方案中，HA2亚基中的氨基酸突变可以是在乙型流感病毒Victoria谱系中第61位的谷氨酸。在另一个优选的实施方案中，HA2亚基中的氨基酸突变可以是乙型流感病毒Yamagata谱系中第112位的谷氨酸。这样的突变也可以有助于在生产过程中增强病毒的生长。

在本发明的一个实施方案中，PA、NP和NS基因区段来源于单一流感毒株。在本发明的另一个实施方案中，PB1、PB2、PA、NP和NS基因片段来源于单一流感毒株。在一个实施方案中，HA基因区段可以来源于不同于PA、NP和NS基因区段所来源的单一流感毒株的流感毒株。在另一个实施方案中，HA基因区段可以来源于不同于PB1、PB2、PA、NP和NS基因片段所来源的单一流感毒株的流感毒株。同样，NA基因区段可以来源于不同于PA、NP和NS基因区段所来源的单一流感毒株的流感毒株。在另一个实施方案中，NA基因区段可以来源于不同于PB1、PB2、PA、NP和NS基因区段所来源的单一流感毒株的流感毒株。因此，本发明的流感病毒可以是季节性流感病毒(例如，乙型流感病毒)。

(C)流感病毒的特性

不管流感病毒的类型如何，本发明的流感病毒的骨架赋予流感病毒高生长特性，特别是在Vero细胞中。本发明的流感病毒即使在使用低感染复数(MOI)(例如，0.001)的制造过程中也表现出高产率。MOI是指每个感染靶标(例如，细胞)的试剂(例如，病毒)的平均数。当需要多个感染周期(例如，病毒疫苗生产)时，使用较低的MOI。FDA执行了当前的良好生产规范规定，并且通常需要使用仍然产生高产率病毒的最低MOI。这是因为主要的种子储备液(master seed stock)是昂贵的，并且由非传染性颗粒和过量细胞蛋白产生的毒性可降低病毒产生。

在本发明的另一个实施方案中，流感病毒是遗传稳定的，使得骨架蛋白，特别是PB1、PB2、PA、NP和NS1蛋白的选定氨基酸是高度保守的，即使在低MOI下繁殖时亦如此。例如，在本发明的一个实施方案中，在Vero细胞系中至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、或超过十个连续传代后，所述选定氨基酸在PB1、PB2、NP和NS蛋白中的至少一种中是保守的。在一个实施方案中，Vero细胞系可以包含稳定表达乙型流感病毒的BM2离子通道蛋白的Vero细胞(即，BM2VeroA细胞)。在本发明的优选的实施方案中，在稳定表达乙型流感病毒的BM2离子通道蛋白的Vero细胞中至少十个连续传代后，所述选定氨基酸在NP和NS蛋白中的至少一种中是保守的。BM2被认为是甲型流感病毒M2的功能性对应物。在这样的实施方案中，即使当流感病毒是甲型流感病毒时，选定氨基酸也可以是保守的。

基因修饰的Vero细胞(即表达流感M2或BM2蛋白的那些细胞)的行为与正常Vero细胞类似，并且支持与正常Vero细胞相当的甲型流感病毒或乙型流感病毒的生长。M2VeroA细胞中M2SR病毒的病毒滴度与在未修饰的Vero细胞系中表达功能性M2的复制流感病毒相当。此外，BM2Vero细胞中BM2SR病毒(即，包含来自乙型流感病毒的突变M基因区段，因此不表达功能性BM2蛋白的流感病毒)的病毒滴度与在未修饰的Vero细胞系中表达功能性BM2的复制流感病毒相当。因此，M2SR和BM2SR病毒的行为类似于在M2VeroA和BM2Vero细胞系中的复制流感病毒。

在本发明的一个实施方案中，流感病毒能够在人细胞中复制。

产生流感病毒的方法

本文还提供了产生流感病毒的方法，其中在一个实施方案中，产生的流感病毒，即本文公开的本发明的重组流感病毒包含表达具有选定氨基酸的蛋白质的PA、NP和NS基因区段。在另一个实施方案中，即本文公开的本发明的另一个实施方案中，产生的流感病毒包含表达具有选定氨基酸的蛋白的PB1、PB2、NP和NS基因区段。

在本发明方法的一个实施方案中，产生重组流感病毒的方法包括在Vero细胞中连续传代重组流感病毒(例如，第一流感病毒)以产生所产生的流感病毒(例如，第二流感病毒)。第一流感病毒可包含PA、NP和NS基因区段，其表达具有选定氨基酸的蛋白质，即PA、NP和NS1蛋白，如结合本发明流感病毒所描述的。例如，第一流感病毒可以包含在核苷酸位置2272处包含胸腺嘧啶的PA基因区段。PA基因区段可以编码蛋白质，即PA蛋白。第一流感病毒的NP基因区段可包含第177位的胸腺嘧啶、第540位的腺嘌呤和第670位的胸腺嘧啶，并编码蛋白质，即NP蛋白，其包含第40位的丝氨酸、第161位的天冬酰胺或甘氨酸、第204位的苏氨酸和任选地第93位的缬氨酸。第一流感病毒的NS基因区段可以包含在核苷酸位置39处的鸟嘌呤，并且编码在第176位包含谷氨酰胺的蛋白质，即NS1和/或NS2蛋白。在本发明的一个实施方案中，在Vero细胞中进行第一流感病毒的至少四次或至少五次连续传代后产生第二流感病毒(例如，所产生的流感病毒)。第一流感病毒可进一步包含PB1和PB2基因区段，其表达蛋白质，即具有选定氨基酸的PB1和PB2蛋白，如结合本发明的流感病毒所描述的。

本发明的流感病毒也可以使用标准病毒拯救技术产生。例如，在本发明的一个实施方案中，将8个病毒基因区段(即PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA和NA)中的每一个的cDNA所克隆到的一种或多种质粒转染到真核宿主细胞中，其中每个cDNA序列的侧翼是RNA聚合酶I启动子和RNA聚合酶I终止子(即pPolI质粒)。编码PB1、PB2、PA、NP和NS1和/或NS2蛋白的基因区段可以编码本发明的具有选定氨基酸的蛋白。编码M2或BM2蛋白的基因区段可以包含突变的M2或BM2基因区段，使得所述基因区段不编码功能性M2或BM2。也可以用一种或多种编码病毒蛋白(例如，PA、PB1、PB2和NP蛋白中的至少一种或多种，或者PB1、PB2、PA、NP、M、NS1和/或NS2、HA和NA蛋白中的至少一种或多种)的表达质粒转染宿主细胞。然后在将至少一种或多种质粒转染到宿主细胞后合成八种流感vRNA(即基因区段)。共转染的病毒聚合酶和核蛋白将vRNA组装成功能性vRNP(即，病毒核糖核蛋白复合物)，其被复制和转录，最终形成本发明的重组流感病毒。Neumann等人,PNAS,96:9345-9350(1999)进一步详述了这种基于质粒的反向遗传学系统。本发明的流感病毒也可以使用本领域已知的其它方法产生，所述方法如但不限于核糖核蛋白(RNP)转染系统，如美国专利9,284,533(通过引用并入本文)中所述。

药物制剂

本发明提供了包含本文所述的本发明的重组病毒的药物制剂(例如，疫苗或其它免疫原性组合物)。

药物制剂还可以包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指除本发明流感病毒以外的药物制剂的任何组分。药学上可接受的载体或赋形剂可以增强本发明重组病毒的功效或维持药物制剂的稳定性，理想的是不显著灭活本发明重组病毒。

至少一种药学上可接受的载体或赋形剂可以是任何合适的药学上可接受的载体或赋形剂，其中许多是本领域已知的。示例性的药学上可接受的载体或赋形剂包括维持药物制剂的pH(例如缓冲剂)、调节张力(例如张力调节剂，如无机盐)、改善蛋白质(例如病毒)稳定性和/或免疫原性、改善粘膜粘附、防止蛋白质聚集和/或保存药物制剂(例如防腐剂)的组分。例如，药学上可接受的载体或赋形剂可以包括无机盐、表面活性剂、氨基酸、聚合物或聚合化合物(例如蛋白质、多糖或水凝胶)、螯合剂、糖、多元醇和/或佐剂(例如增强特异性免疫应答的任何物质)中的至少一种，其中许多是本领域已知的。特定的载体或赋形剂可以在药物制剂中用于不止一个目的，因此，以下实施方案不限于本文所述的描述。

药物制剂中可以存在任何合适的缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂包含咪唑缓冲剂、磷酸钾缓冲剂、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(例如，1×DPBS)、组氨酸缓冲剂、柠檬酸钠缓冲剂和蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲剂(sucrose phosphateglutamate，SPG)中的至少一种。PBS和/或DPBS制剂可以包含例如氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，并且可以任选地进一步包含氯化钙和/或氯化镁。在一些实施方案中，PBS和/或DPBS制剂包含约136.9mM氯化钠、约2.67mM氯化钾、约1.47mM磷酸二氢钾和约8.1mM磷酸氢二钠，尽管任何合适的PBS和/或DPBS制剂(其中的许多是本领域已知的)都可以用作药物制剂中的缓冲剂。

缓冲剂可以以任何合适的浓度存在于药物制剂中。缓冲剂可以以约0.1mM或更高、约1mM或更高、约10mM或更高、约20mM或更高、约30mM或更高、约40mM或更高、约50mM或更高、约60mM或更高、约70mM或更高、约80mM或更高、约90mM或更高、约100mM或更高、约120mM或更高、约140mM或更高、约160mM或更高、约180mM或更高、约200mM或更高、约250mM或更高、约300mM或更高、约350mM或更高、约400mM或更高、约450mM或更高、或者约500mM或更高的浓度存在于药物制剂中。可选地或另外，缓冲剂可以约1000mM或更低、约500mM或更低、约450mM或更低、约400mM或更低、约350mM或更低、约300mM或更低、约250mM或更低、约200mM或更低、约180mM或更低、约160mM或更低、约140mM或更低、约120mM或更低、约100mM或更低、约90mM或更低、约80mM或更低、约70mM或更低、约60mM或更低、约50mM或更低、约40mM或更低、约30mM或更低、约20mM或更低、约10mM或更低、或者约1mM或更低的浓度存在于药物制剂中。缓冲剂可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度存在于药物制剂中。例如，缓冲剂可以以约0.1mM至约1000mM、约0.1mM至约500mM、约0.1mM至约100mM、约1mM至约1000mM、约1mM至约500mM、约1mM至约100mM、约100mM至约1000mM、约100mM至约500mM等的浓度存在于药物制剂中。

在进一步的实施方案中，缓冲剂以浓度百分比(例如，体积/体积百分比(％v/v)；重量/体积百分比(％w/v)；或重量/重量百分比(％w/w))存在于药物制剂中。缓冲剂可以以约0.1％或更高、约1％或更高、约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、或者约50％或更高的浓度百分比存在于药物制剂中。可选地或另外，缓冲剂可以以约60％或更低、约50％或更低、约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低、约15％或更低、约10％或更低、约5％或更低、或者约1％或更低的浓度百分比存在于药物制剂中。缓冲剂可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度百分比存在于药物制剂中。例如，缓冲剂可以以约0.1％至约60％、约1％至约60％、约10％至约60％、约0.1％至约50％、约1％至约50％、约10％至约50％、约20％至约60％、约20％至约50％、约20％至约40％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％等的浓度百分比存在于药物制剂中。

缓冲剂可以将药物制剂的pH维持在任何合适的pH。缓冲剂可以将药物制剂的pH维持在例如约4或更高、约4.5或更高、约5或更高、约5.5或更高、约6或更高、约6.5或更高、约7或更高、或者约7.5或更高的pH。可选地或另外，缓冲剂可以将药物制剂的pH维持在例如约8或更低、约7.5或更低、约7或更低、约6.5或更低、约6或更低、约5.5或更低、约5或更低、或者约4.5或更低的pH。缓冲剂可以将药物制剂的pH维持在由任何前述端点限定的范围内的pH。例如，缓冲剂可以将药物制剂的pH维持在约4至约8、约4.5至约8、约5至约8、约5.5至约8、约6至约8、约6.5至约8、约7至约8、约7.5至约8、约4至约7.5、约5至约7.5、约6至7.5约、约7至7.5约、约4至7约、约5至7约、约6至约7等的pH。

药物制剂中可以存在任何合适的张力调节剂。在某些实施方案中，一种或多种无机盐作为张力调节剂存在于药物制剂中。无机盐可以是氯化钠(NaCl)、硫酸镁(MgSO₄)和氯化镁(MgCl₂)中的至少一种。张力调节剂，例如无机盐，可以以任何合适的量存在于药物制剂中。张力调节剂，例如无机盐，可以以约0.1mM或更高、约0.2mM或更高、约0.4mM或更高、约0.6mM或更高、约0.8mM或更高、约1mM或更高、约1.2mM或更高、约1.4mM或更高、约1.6mM或更高、约1.8mM或更高、约2mM或更高、约3mM或更高、约4mM或更高、约5mM或更高、约6mM或更高、约7mM或更高、约8mM或更高、约9mM或更高、约10mM或更高、约20mM或更高、约30mM或更高、约40mM或更高、约50mM或更高、约100mM或更高、约200mM或更高、约300mM或更高、约400mM或更高、约500mM或更高、约600mM或更高、约700mM或更高、约800mM或更高、约900mM或更高、约1000mM或更高或者约1500mM或更高的浓度存在于药物制剂中。可选地或另外，张力调节剂，例如无机盐，可以以约2000mM或更低、约1500mM或更低、约1000mM或更低、约900mM或更低、约800mM或更低、约700mM或更低、约600mM或更低、约500mM或更低、约450mM或更低、约400mM或更低、约350mM或更低、约300mM或更低、约250mM或更低、约200mM或更低、约150mM或更低、约100mM或更低、约50mM或更低、约45mM或更低、约40mM或更低、约35mM或更低、约30mM或更低、约25mM或更低、约20mM或更低、约10mM或更低、约9mM或更低、约8mM或更低、约7mM或更低、约6mM或更低、约5mM或更低、约4mM或更低、约3mM或更低、约2mM或更低、约1.8mM或更低、约1.6mM或更低、约1.4mM或更低、约1.2mM或更低、约1mM或更低、约0.8mM或更低、约0.6mM或更低、约0.4mM或更低、或者约0.2mM或更低的浓度存在于药物制剂中。张力调节剂，例如无机盐，可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度存在于药物制剂中。例如，张力调节剂，例如无机盐，可以以约0.1mM至约2000mM、约0.1mM至约1500mM、约0.1mM至约1000mM、约0.1mM至约500mM、约0.1mM至约250mM、约0.1mM至约100mM、约0.1至约50mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约2000mM、约1mM至约1500mM、约1mM至约1000mM、约1mM至约500mM、约1mM至约250mM、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1mM至约10mM、约10mM至约2000mM、约10mM至约1500mM、约10mM至约1000mM、约10mM至约500mM、约10mM至约250mM、约10mM至约100mM、约10mM至约50mM、约100mM至约2000mM、约100mM至约1500mM、约100mM至约1000mM、约100mM至约500mM、约100mM至约250mM、约500mM至约2000mM、约500mM至约1500mM、约500mM至约1000mM等的浓度存在于药物制剂中。

在进一步的实施方案中，无机盐以浓度百分比(例如，体积/体积百分比(％v/v)；重量/体积百分比(％w/v)；或重量/重量百分比(％w/w))存在于药物制剂中。张力调节剂，例如无机盐，以约0.1％或更高、约1％或更高、约2％或更高、约3％或更高、约4％或更高、约5％或更高、约6％或更高、约7％或更高、约8％或更高、约9％或更高、或者约10％或更高的浓度百分比存在于药物制剂中。可选地或另外，张力调节剂，例如无机盐，可以以约10％或更低、约9％或更低、约8％或更低、约7％或更低、约6％或更低、约5％或更低、约4％或更低、约3％或更低、约2％或更低、或者约1％或更低的浓度百分比存在于药物制剂中。张力调节剂，例如无机盐，可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度百分比存在于药物制剂中。例如，张力调节剂，例如无机盐，可以以约0.1％至约1％、约0.1％至约2％、约0.1％至约5％、约0.1％至约10％、约1％至约2％、约1％至约5％、约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约5％至约10％等的浓度百分比存在于药物制剂中。

药物制剂中可以存在任何合适的表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂可以包含聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸钠和泊洛沙姆188中的至少一种。表面活性剂可以以任何合适的量存在于药物制剂中。在一些实施方案中，表面活性剂以浓度百分比(例如，体积/体积百分比(％v/v)；重量/体积百分比(％w/v)；或重量/重量百分比(％w/w))存在于药物制剂中。表面活性剂可以约0.01％或更高、约0.02％或更高、约0.03％或更高、约0.04％或更高、约0.05％或更高、约0.06％或更高、约0.07％或更高、约0.08％或更高、约0.09％或更高、约0.1％或更高、约0.2％或更高、约0.3％或更高、约0.4％或更高、约0.5％或更高、约0.6％或更高、约0.7％或更高、约0.8％或更高、约0.9％或更高、或者约1％或更高的浓度百分比存在于药物制剂中。可选地或另外，表面活性剂可以以约1％或更低、约0.9％或更低、约0.8％或更低、约0.7％或更低、约0.6％或更低、约0.5％或更低、约0.4％或更低、约0.3％或更低、约0.2％或更低、或者约0.1％或更低的浓度百分比存在于药物制剂中。表面活性剂可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度百分比存在于药物制剂中。例如，表面活性剂可以以约0.01％至约1％、约0.01％至约0.1％、约0.05％至约1％、约0.05％至约0.1％、约0.1％至约1％、约0.1％至约0.5％、约0.2％至约1％、约0.5％至约1％等的浓度百分比存在于药物制剂中。

药物制剂中可以存在任何合适的氨基酸。在某些实施方案中，氨基酸可以是精氨酸、谷氨酸(glutamic acid)或谷氨酸(glutamate)、天冬酰胺、组氨酸和甘氨酸中的一种或多种。氨基酸可以以任何合适的量存在于药物制剂中。氨基酸可以以约1mM或更高、约2mM或更高、约3mM或更高、约5mM或更高、约6mM或更高、约7mM或更高、约8mM或更高、约9mM或更高、或者约10mM或更高的浓度存在于药物制剂中。可选地或另外，氨基酸可以以约约100mM或更低、约90mM或更低、约80mM或更低、约70mM或更低、约60mM或更低、约50mM或更低、4约0mM或更低、约30mM或更低、约20mM或更低或者约10mM或更低的浓度存在于药物制剂中。氨基酸可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度存在于药物制剂中。例如，氨基酸可以以约1mM至约10mM、约1mM至约50mM、约1mM至约100mM、约5mM至约50mM、约10mM至约50mM、约20mM至约50mM等的浓度存在于药物制剂中。

在一些实施方案中，氨基酸以浓度百分比(例如，体积/体积百分比(％v/v)；重量/体积百分比(％w/v)；或重量/重量百分比(％w/w))存在于药物制剂中。氨基酸可以以约0.1％或更高、约0.2％或更高、约0.3％或更高、约0.4％或更高、约0.5％或更高、约0.6％或更高、约0.7％或更高、约0.8％或更高、约0.9％或更高、约1％或更高、约2％或更高、约3％或更高、约4％或更高、或者约5％或更高的浓度百分比存在于药物制剂中。可选地或另外，氨基酸可以以约10％或更低、约9％或更低、约8％或更低、约7％或更低、约6％或更低、约5％或更低、约4％或更低、约3％或更低、约2％或更低、或者约1％或更低的浓度百分比存在于药物制剂中。氨基酸可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度百分比存在于药物制剂中。例如，氨基酸可以以约0.1％至约10％、约0.2％至约10％、约0.5％至约10％、约0.1％至约5％、约0.1％至约2％、约0.2％至约2％、约0.5％至约1％等的浓度百分比存在于药物制剂中。

药物制剂中可以存在任何合适的聚合物或聚合化合物。聚合物或聚合化合物可以是，例如，蛋白质、多糖、水凝胶或者任何其它合适的聚合物或聚合化合物，其中许多是本领域已知的。例如，聚合物或聚合化合物可以是重组人血清白蛋白(rHSA)、血清白蛋白(SA)、明胶、羟乙基淀粉(HES)、壳聚糖、葡聚糖(DEX70K，DEX40K)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP40K)。

聚合物或聚合化合物可以以任何合适的量存在于药物制剂中。聚合物或聚合化合物可以以浓度百分比(例如，体积/体积百分比(％v/v)；重量/体积百分比(％w/v)；或重量/重量百分比(％w/w))存在于药物制剂中。聚合物或聚合化合物可以以约0.1％或更高、约0.2％或更高、约0.3％或更高、约0.4％或更高、约0.5％或更高、约0.6％或更高、约0.7％或更高、约0.8％或更高、约0.9％或更高、约1％或更高、约2％或更高、约3％或更高、约4％或更高、或者约5％或更高的浓度百分比存在于药物制剂中。可选地或另外，聚合物或聚合化合物可以以约10％或更低、约9％或更低、约8％或更低、约7％或更低、约6％或更低、约5％或更低、约4％或更低、约3％或更低、约2％或更低、或者约1％或更低的浓度百分比存在于药物制剂中。聚合物或聚合化合物可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度百分比存在于药物制剂中。例如，聚合物或聚合化合物可以以约0.1％至约10％、约0.2％至约10％、约0.5％至约10％、约0.1％至约5％、约0.1％至约2％、约0.2％至约2％、约0.5至约2％、约0.1％至约1％、约0.2％至约1％、约0.5％至约1％等的浓度百分比存在于药物制剂中。

药物制剂中可以存在任何合适的螯合剂。螯合剂可以是例如乙二胺四乙酸(EDTA)、偕胺肟化合物(AOX)和/或二硫苏糖醇(DTT)。螯合剂可以以任何合适的浓度存在于药物制剂中。螯合剂可以以约10μM或更高、约20μM或更高、约30μM或更高、约40μM或更高、约50μM或更高、约60μM或更高、约70μM或更高、约80μM或更高、约90μM或更高、约100μM或更高、约120μM或更高、或者约150μM或更高的浓度存在于药物制剂中。可选地或另外，螯合剂可以以约500μM或更低、约400μM或更低、约300μM或更低、约200μM或更低、约150μM或更低、约140μM或更低、约130μM或更低、约120μM或更低、约110μM或更低、约100μM或更低、约80μM或更低、约70μM或更低、约60μM或更低、或者约50μM或更低的浓度存在于药物制剂中。螯合剂可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度存在于药物制剂中。例如，螯合剂可以以约10μM至约500μM、约10μM至约200μM、约10μM至约150μM、约10μM至约100μM、约50μM至约500μM、约50μM至约200μM、约50μM至约150μM、约50μM至约100μM等的浓度存在于药物制剂中。

药物制剂中可以存在任何合适的糖。糖可以是例如蔗糖、海藻糖、甘露糖和乳糖中的一种或多种。糖可以以任何合适的浓度存在于药物制剂中。糖可以以约0.1mM或更高、约0.2mM或更高、约0.4mM或更高、约0.6mM或更高、约0.8mM或更高、约1mM或更高、约1.2mM或更高、约1.4mM或更高、约1.6mM或更高、约1.8mM或更高、约2mM或更高、约3mM或更高、约4mM或更高、约5mM或更高、约6mM或更高、约7mM或更高、约8mM或更高、约9mM或更高、约10mM或更高、约20mM或更高、约30mM或更高、约40mM或更高、约50mM或更高、约60mM或更高、约70mM或更高、约80mM或更高、约90mM或更高、或者约100mM或更高、约200mM或更高、约300mM或更高、约400mM或更高、约500mM或更高、约600mM或更高、约700mM或更高、约800mM或更高、约900mM或更高、约1000mM或更高、或者约1500mM或更高的浓度存在于药物制剂中。可选地或另外，糖可以以约2000mM或更低、约1500mM或更低、约1000mM或更低、约900mM或更低、约800mM或更低、约700mM或更低、约600mM或更低、约500mM或更低、约450mM或更低、约400mM或更低、约350mM或更低、约300mM或更低、约250mM或更低、约200mM或更低、约150mM或更低、约100mM或更低、约50mM或更低、约45mM或更低、约40mM或更低、约35mM或更低、约30mM或更低、约25mM或更低、约20mM或更低、约10mM或更低、约9mM或更低、约8mM或更低、约7mM或更低、约6mM或更低、约5mM或更低、约4mM或更低、约3mM或更低、约2mM或更低、约1.8mM或更低、约1.6mM或更低、约1.4mM或更低、约1.2mM或更低、约1mM或更低、约0.8mM或更低、约0.6mM或更低、约0.4mM或更低、或者约0.2mM或更低的浓度存在于药物制剂中。糖可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度存在于药物制剂中。例如，糖可以以约0.1mM至约2000mM、约0.1mM至约1500mM、约0.1mM至约1000mM、约0.1mM至约500mM、约0.1mM至约250mM、约0.1mM至约100mM、约0.1至约50mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约2000mM、约1mM至约1500mM、约1mM至约1000mM、约1mM至约500mM、约1mM至约250mM、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1mM至约10mM、约10mM至约2000mM、约10mM至约1500mM、约10mM至约1000mM、约10mM至约500mM、约10mM至约250mM、约10mM至约100mM、约10mM至约50mM、约100mM至约2000mM、约100mM至约1500mM、约100mM至约1000mM、约100mM至约500mM、约100mM至约250mM、约500mM至约2000mM、约500mM至约1500mM、约500mM至约1000mM等的浓度存在于药物制剂中。

在其它实施方案中，糖以浓度百分比(例如，体积/体积百分比(％v/v)；重量/体积百分比(％w/v)；或重量/重量百分比(％w/w))存在于药物制剂中。糖可以以约0.1％或更高、约1％或更高、约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高的浓度百分比存在于药物制剂中。可选地或另外，糖可以以约50％或更低、约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低、约15％或更低、约10％或更低、约5％或更低、或者约1％或更低的浓度百分比存在于药物制剂中。糖可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度百分比存在于药物制剂中。例如，糖可以以约0.1％至约50％、约1％至约50％、约10％至约50％、约0.1％至约20％、约1％至约20％、约10％至约20％、约0.1％至约10％、约1％至约10％等的浓度百分比存在于药物制剂中。

药物制剂中可以存在任何合适的多元醇。多元醇可以是，例如，山梨醇和/或甘露醇。多元醇可以以任何合适的浓度存在于药物制剂中。多元醇可以以约0.1mM或更高、约1mM或更高、约10mM或更高、约20mM或更高、约30mM或更高、约40mM或更高、约50mM或更高、约60mM或更高、约70mM或更高、约80mM或更高、约90mM或更高、约100mM或更高、约120mM或更高、约140mM或更高、约160mM或更高、约180mM或更高、约200mM或更高、约250mM或更高、约300mM或更高、约350mM或更高、约400mM或更高、约450mM或更高、或者约500mM或更高的浓度存在于药物制剂中。可选地或另外，多元醇可以以约1000mM或更低、约500mM或更低、约450mM或更低、约400mM或更低、约350mM或更低、约300mM或更低、约250mM或更低、约200mM或更低、约180mM或更低、约160mM或更低、约140mM或更低、约120mM或更低、约100mM或更低、约90mM或更低、约80mM或更低、约70mM或更低、约60mM或更低、约50mM或更低、约40mM或更低、约30mM或更低、约20mM或更低、约10mM或更低、或者约1mM或更低的浓度存在于药物制剂中。多元醇可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度存在于药物制剂中。例如，多元醇可以以约0.1mM至约1000mM、约0.1mM至约500mM、约0.1mM至约100mM、约1mM至约1000mM、约1mM至约500mM、约1mM至约100mM、约100mM至约1000mM、约100mM至约500mM等的浓度存在于药物制剂中。

在其它实施方案中，多元醇以浓度百分比(例如，体积/体积百分比(％v/v)；重量/体积百分比(％w/v)；或重量/重量百分比(％w/w))存在于药物制剂中。多元醇可以以约0.1％或更高、约1％或更高、约2％或更高、约3％或更高、约4％或更高、或者约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约25％或更高、约30％或更高、约35％或更高、约40％或更高、约45％或更高的浓度百分比存在于药物制剂中。可选地或另外，多元醇可以以约50％或更低、约45％或更低、约40％或更低、约35％或更低、约30％或更低、约25％或更低、约20％或更低、约15％或更低、约10％或更低、约5％或更低、约4％或更低、约3％或更低、约2％或更低、或者约1％或更低的浓度百分比存在于药物制剂中。多元醇可以以在由任何前述端点限定的范围内的任何浓度百分比存在于药物制剂中。例如，多元醇可以以约0.1％至约50％、约1％至约50％、约5％至约50％、约10％至约50％、约15％至约50％、约0.1％至约25％、约1％至约25％、约5％至约25％、约10％至约25％、约15％至约25％、约0.1％至约15％、约1％至约15％、约5％至约15％、约10％至约15％、约0.1％至约10％、约1％至约10％、约5％至约10％、约0.1％至约5％、约1％至约5％等的浓度百分比存在于药物制剂中。

在一个实施方案中，药物制剂包含本发明的流感病毒、约0.5M蔗糖、约0.1M或约0.5M甘露糖、约0.3M或约0.5M海藻糖、约50％SPG和约0.05％聚山梨醇酯-20。在另一个实施方案中，药物制剂包含本发明的流感病毒、约0.5M蔗糖、约0.3M海藻糖和约0.05％聚山梨醇酯-20。

至少一种药学上可接受的载体或赋形剂可以是用于结合药物制剂成分的组分(例如，粘合剂)。粘合剂可以包括但不限于蛋白质(例如明胶)、聚合物(例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮)和/或多糖或其衍生物(例如淀粉和纤维素)。至少一种药学上可接受的载体或赋形剂可以是增加药物制剂体积的组分(例如，疏松剂(bulking agent)、稀释剂和/或填充剂(filler))。这种疏松剂可以包括但不限于多糖或其衍生物、糖和/或无机化合物。药学上可接受的载体或赋形剂可以是增强药物制剂的味道和/或外观(例如，调味剂、甜味剂和/或颜色)的组分。药学上可接受的载体或赋形剂可以是通过吸收或吸附液体或气体(例如吸附剂)来防潮药物制剂的组分。吸附剂包括但不限于淀粉、磷酸钙和/或胶体二氧化硅。药学上可接受的载体或赋形剂可以是促进药物制剂溶解的组分(例如崩解剂)，如淀粉、纤维素和/或本领域已知的任何其它聚合物，或其衍生物(例如交联的聚乙烯吡咯烷酮或羧甲基纤维素钠)。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体或赋形剂是在药物制剂的制造中和期间减少颗粒间粘附和/或优化产物流动的组分(例如助流剂)。助流剂的实例包括但不限于滑石、胶体二氧化硅和玉米淀粉。药学上可接受的载体或赋形剂可以是在药物制剂的制造中和期间，特别是当药物制剂被配制成口服制剂时提供不粘附特性，如降低成分与例如冲孔面(punch face)或润滑剂之间的粘附的组分(例如，抗粘附剂)。例如，抗粘附剂可以包含硬脂酸镁。在其它实施方案中，药学上可接受的载体或赋形剂可以是在制造期间减少成分的结块和/或减少例如药物制剂(即配制为口服制剂)的表面与模壁之间的摩擦的组分(例如润滑剂)。根据某些实施方案，可以使用水溶性润滑剂或不溶于水的润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、植物油、矿物油、聚乙二醇和/或十二烷基硫酸钠。药学上可接受的载体或赋形剂可以是充当包衣剂的组分。包衣剂包括但不限于基于明胶和/或纤维素的包衣剂(例如羟丙基甲基纤维素)。

其它合适的粘合剂、调味剂、甜味剂、着色剂、崩解剂、助流剂、抗粘附剂、润滑剂和包衣剂是本领域熟知的和容易确定的。

药物制剂还可以包含治疗剂(例如，化疗剂或抗炎剂)。药物制剂还可以包含触发与流感病毒分离的免疫应答的试剂。除了本发明的流感病毒以外的此类另外组分可以以任何合适的量存在。

在呈递给免疫系统之前，可以将另外的组分与其它组分混合以形成药物制剂。另外的组分也可以与药物制剂分开呈递给免疫系统。例如，另外的组分和药物制剂可以分别提供给免疫系统(例如，施用至有机体)。当另外的组分和药物制剂分开施用时，可以将另外的组分和药物制剂施用至被免疫的有机体的相同部位。

在药物制剂的一个实施方案中，药物制剂是病毒疫苗。病毒疫苗可以是减毒的活病毒疫苗或灭活的病毒疫苗(例如，全病毒疫苗、裂解病毒疫苗(split virus vaccine)或亚单位疫苗)。病毒疫苗可以配制为单价疫苗、二价疫苗、三价疫苗或四价疫苗。例如，疫苗可以包含本发明流感病毒的多个实施方案。在一些实施方案中，疫苗还可以包含不同于本发明的流感病毒的至少一种流感病毒。

可以将病毒疫苗配制成用于任何合适的施用手段的组合物。例如，可以将病毒疫苗配制成口服制剂(例如胶囊、片剂或口腔膜剂(oral film))，喷雾剂(例如鼻喷雾剂)或适于鼻内施用或肠胃外施用，例如静脉内施用、肌内施用或皮下施用的任何组合物，如水性或非水性乳剂、溶液或混悬液。

引发免疫应答的方法

本发明提供了引发哺乳动物中免疫应答的方法，其包括向所述哺乳动物施用本发明的流感病毒。在一个实施方案中，流感病毒，即本文所述的本发明的流感病毒包含PB1基因区段、PB2基因区段、PA基因区段、NP基因区段和NS基因区段，其编码包含选定氨基酸的蛋白，即分别为PB1蛋白、PB2蛋白、PA蛋白、NP蛋白和NS1蛋白。

哺乳动物可以是，例如，人或灵长类动物，但不限于此。

在本发明的一个实施方案中，本发明的流感病毒以如本文所述的药物制剂(例如，疫苗或其它免疫原性组合物)施用。可以鼻内施用所述药物制剂。在另一个实施方案中，肌内施用所述药物制剂。也可以皮下或口服施用所述药物制剂。

药物制剂(例如病毒疫苗)的给药方案可取决于哺乳动物的年龄、体重、性别和病史。例如，在一个实施方案中，针对人的单剂量减毒病毒疫苗可以包含本发明流感病毒的约10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²，或前述值中的两个之间的任何范围的颗粒形成单位(PFU)、病灶形成单位(FFU)或TCID₅₀。在一些实施方案中，用于预防或治疗流感病毒的方案包括作为单一治疗施用药物制剂。药物制剂也可以施用一次以上，例如给药方案可以包括加强剂量。例如，可以在初始剂量后7天或更长的时间内，例如8天或更长、9天或更长、10天或更长、11天或更长、12天或更长、13天或更长、14天或更长、3周或更长、4周或更长、1个月或更长、2个月或更长、3个月或更长、4个月或更长、5个月或更长、6个月或更长、7个月或更长、8个月或更长、9个月或更长、10个月或更长、11个月或更长、1年或更长、2年或更长、3年或更长、4年或更长、或者5年或更长的时间内施用加强剂量的药物制剂。

实施方案

本发明提供了以下实施方案：

(1)包含PA、NP和NS基因区段的流感病毒，其中(a)所述PA基因区段包含在核苷酸位置2272处的胸腺嘧啶；(b)所述NP基因区段编码具有氨基酸序列的NP蛋白，所述氨基酸序列包含选定氨基酸，其中所述选定氨基酸包含在第40位的丝氨酸、在第161位的天冬酰胺或甘氨酸、在第204位的苏氨酸和任选地在第93位的缬氨酸；以及(c)所述NS基因区段包含在核苷酸位置39处的鸟嘌呤，并且所述NS基因区段编码具有包含选定氨基酸的氨基酸序列的NS1蛋白，所述选定氨基酸包含在第176位的谷氨酰胺。

(2)如实施方案1所述的流感病毒，其中所述PA基因区段具有由SEQ ID NO：10表示的核苷酸序列。

(3)如实施方案1或2所述的流感病毒，其中所述NP基因区段具有由SEQ ID NO：11表示的核苷酸序列。

(4)如实施方案1-3中任一项所述的流感病毒，其中所述PA基因区段编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：15的PA蛋白。

(5)如实施方案1-4中任一项所述的流感病毒，其中所述NP基因区段编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：16的NP蛋白。

(6)如实施方案1-5中任一项所述的流感病毒，其中所述NS基因区段具有由SEQ IDNO：12表示的核苷酸序列。

(7)如实施方案1-6中任一项所述的流感病毒，其中所述NS基因区段编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：17的NS1蛋白。

(8)如实施方案1-7中任一项所述的流感病毒，其中在Vero细胞系中至少10次连续传代后，所述选定氨基酸在NP和NS蛋白中的至少一种中是保守的。

(9)如实施方案1-8中任一项所述的流感病毒，其中在稳定表达乙型流感病毒的BM2离子通道蛋白的Vero细胞系中至少10次连续传代后，所述选定氨基酸在NP和NS蛋白中的至少一种中是保守的。

(10)如实施方案1-9中任一项所述的流感病毒，其中所述流感病毒是重组流感病毒。

(11)如实施方案1-10中任一项所述的流感病毒，其中所述病毒还包含PB基因区段。

(12)如实施方案1-11中任一项所述的流感病毒，其中所述病毒还包含NA基因区段和HA基因区段。

(13)如实施方案12所述的流感病毒，其中所述HA基因区段编码具有在HA2中包含至少一个氨基酸突变的氨基酸序列的HA蛋白。

(14)如实施方案13所述的流感病毒，其中HA2中的所述至少一个氨基酸突变是第61位的谷氨酸。

(15)如实施方案13所述的流感病毒，其中HA2中的所述至少一个氨基酸突变是第112位的谷氨酸。

(16)如实施方案1-15中任一项所述的流感病毒，其中所述PA、NP和NS基因区段来源于单一流感毒株。

(17)如实施方案16所述的流感病毒，其中所述HA基因区段来源于不同于所述PA、NP和NS基因区段所源自的单一流感毒株的流感毒株。

(18)如实施方案16或17所述的流感病毒，其中所述NA基因区段来源于不同于所述PA、NP和NS基因区段所源自的单一流感毒株的流感毒株。

(19)如实施方案1-18中任一项所述的流感病毒，其还包含突变的M基因区段。

(20)如实施方案19所述的流感病毒，其中所述流感病毒不编码功能性M2蛋白。

(21)如实施方案1-20中任一项所述的流感病毒，其中所述病毒能够在人细胞中复制。

(22)如实施方案1-21中任一项所述的流感病毒，其中与在相同条件下在Vero细胞中除了没有所述选定氨基酸之外其余均相同的流感病毒相比，所述病毒具有增强的生长。

(23)药物制剂，其包含实施方案1-22中任一项所述的流感病毒。

(24)如实施方案23所述的药物制剂，其中所述药物制剂是疫苗。

(25)如实施方案24所述的药物制剂，其中所述疫苗被配制成单价疫苗。

(26)如实施方案24所述的药物制剂，其中所述疫苗被配制成二价疫苗。

(27)如实施方案24所述的药物制剂，其中所述疫苗被配制成三价疫苗。

(28)如实施方案24所述的药物制剂，其中所述疫苗被配制成四价疫苗。

(29)引发哺乳动物中免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用实施方案1-22中任一项所述的流感病毒或实施方案23-28中任一项所述的药物制剂，从而在所述哺乳动物中引发针对所述流感病毒的免疫应答。

(30)如实施方案29所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

(31)产生实施方案1-22中任一项所述的流感病毒的方法，所述方法包括在Vero细胞系中连续传代流感病毒。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

实施例1

本实施例证明了未知谱系的生长增强乙型流感NP D161N突变的成功分离。

通过基于质粒的病毒拯救程序(参见，例如Neumann等人，PNAS,96:9345-9350(1999))，在组成性过表达编码来自乙型流感/Lee/40的BM2的cDNA的允许的BM2Vero细胞中，构建了两种疫苗候选乙型流感BM2SR毒株，其缺失了多周期复制所必需的BM2离子通道功能。编码主要抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的2个区段获自Victoria谱系(VL)毒株B/Brisbane/60/2008(Bris60)和Yamagata谱系(YL)毒株B/Wisconsin/01/2010(WI01)，两种毒株均由WHO推荐用于针对季节性乙型流感疾病的疫苗接种。通过工程改造乙型流感/Florida/4/2006M区段以：(1)去除BM2跨膜H+通道，(2)在所有翻译阅读框中引入多个终止密码子，和(3)保持天然RNA结构的M1多肽的遗传稳定性和正确表达，从而获得BM2缺陷型区段7。8个基因组区段中的5个(即，PA、PB1、PB2、NP和NS)是通过从乙型流感/Yamagata/1/73的病毒文库中选择在体外Vero细胞培养过程中，具有增强的高产率生长的VL和YL毒株来获得的(Ping等人，2016，同上)。在BM2Vero中进行3次传代(P3)后，通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的来自所有8个节段的cDNA的Sanger测序来验证每个BM2SR毒株的完整核苷酸序列。所有8个病毒区段的序列与用于从YL和VL拯救病毒的8个RNA区段表达质粒的序列相同。

然后将疫苗候选Bris60(VL)和WI01(YL)BM2SR P3毒株以低感染复数(MOI)下进行另外的10次病毒传代，总共13次传代(P13)。在每轮传代后，通过组织培养感染剂量50％测定(TCID₅₀)在允许BM2SR复制的改性MDCK细胞中测定病毒滴度(BM2CK，Hatta等人,J.Virol.,78(11):5576-5583(2004))。通过以MOI＝0.001TCID₅₀当量/BM2Vero细胞感染以允许多周期复制来进行每个随后的传代。在10代的多周期病毒复制之后，再次获得两种P13毒株的核苷酸序列。进行P13 VL和YL毒株序列与P3毒株序列的比较以鉴定潜在的适应性突变。在来自三个独立传代实验的病毒基因组中仅鉴定出在VL和YL当中相同的1个突变或乙型流感谱系未知的1个突变。独特的未知突变是乙型流感基因组区段5中的g540a，其编码核蛋白(NP D161N)中天冬氨酸161至天冬酰胺的取代。

VL和YL P3毒株的初始B/Yamagata/1/73高产率(HY)区段序列对于2个区段不同：核蛋白(NP)区段5和非结构蛋白(NS)区段8。在P3时，Bris60(VL)编码NP P40S/M204T,NSg38insg，而WI01(YL)BM2SR包含NP-P40S和NS a39g，NS1-K176Q(Ping等人2016，同上)。在延长的传代后，发现VL NP节段5编码NP P40S/D161N/M204T，并且YL节段5编码NP P40S/D161N。在两种毒株中都存在相同的D161N突变。相同取代的分离不是随机的，因此D161N在培养的Vero细胞中促进乙型流感病毒的生长。这与Vero细胞中高生长病毒的谱系特异性突变相反(Ping等人2016，同上)。

除了从B/CA/12/2015(YL)获得HA和NA节段外，使用相同的BM2SR单复制疫苗病毒骨架进行第三次传代实验。传代6次后，分离另一NP区段核苷酸突变a541g，其导致相似的天冬氨酸161至甘氨酸的取代D161G。该实施例证明了位点161与Vero培养物中的高产率生长有关。

向B/CA/12/2015HA中加入NP D161N突变以及已知在培养物中改善乙型流感YL生长的HA1 N211T突变。HA1 N211T提高了生长速率和滴度。NP D161N突变与HA1 N211T是协同的，并且如图1所示将达到最大滴度的时间减少1天。

编码NP M93V的另一个乙型流感NP突变a336g被分离多次，但仅当HA和NA来源于VL时。编码WT和NP V369I的混合物的g1164r的混合物也被分离一次。

实施例2

本实施例证明了含有乙型流感NP D161N适应性突变的乙型流感毒株的成功生长。

通过基于质粒的病毒拯救程序(Neumann等人，同上)，在组成性过表达编码来自乙型流感/Lee/40的BM2的cDNA的允许的BM2Vero细胞中，构建了多种疫苗候选乙型流感BM2SR毒株，其缺失了多周期复制所必需的BM2离子通道功能。编码血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原的2个区段获自Victoria谱系(VL)毒株B/CO/06/2017(CO06)，其由世界卫生组织(WHO)推荐用于针对季节性乙型流感疾病的疫苗接种。通过工程改造乙型流感/Florida/4/2006M区段以：(1)去除BM2跨膜H+通道，(2)在所有翻译阅读框中引入多个终止密码子，和(3)保持天然RNA结构的M1多肽的遗传稳定性和正确表达，从而获得BM2缺陷型区段7。8个基因组区段中的4个(PA、PB1、PB2和NS)是通过从乙型流感/Yamagata/1/73的病毒文库中选择在体外Vero细胞培养过程中，具有增强的高产率生长的VL毒株来获得的(Ping等人，2016，同上)。

这6种毒株仅在区段5核蛋白(NP)中不同，并且含有3个高产率突变的排列，其是从在BM2Vero细胞中传代后获得的乙型流感NP序列中分离的。制备在NP:P40S、D161N或M204T中携带单一氨基酸取代的三种毒株。制备没有NP取代的对照野生型NP毒株。最后，构建了携带两个变化D161N/M204T的毒株和具有所有三个突变的毒株。在BM2Vero中进行2次传代(P2)后，通过从所有8个区段的RT-PCR扩增的cDNA的Sanger测序来验证每种毒株的NP和BM2SR区段的核苷酸序列。

为了比较生长特性，对每种病毒重复进行三次在BM2Vero中的第三次传代。在以MOI＝0.001接种后每天持续4天，对培养物取样，并且将等分试样冷冻储存在-80℃下，用于随后通过BM2CK TCID₅₀测定的分析。每天计算三次重复测定的平均值，并且绘制在图2中。单独的单个突变中的每一个赋予生长益处，但是D161N突变本身具有最大的效果。当D161N与M204T结合时，与野生型和单一突变体相比，双突变毒株实现了更快的生长动力学。与双突变体相比，三突变体具有快速的动力学并且在4天内达到最高的最大滴度。因此，D161N是生长增强NP突变，其与其它已知的NP取代协同作用，以允许乙型流感毒株具有更快速的生长，达到甚至更高的最大滴度。

实施例3

本实施例证明了在培养物传代过程中乙型流感NS区段的稳定性。

已知NS1的功能对于体外Vero细胞培养中的乙型流感病毒培养是不必要的。在传代实验过程中，NS区段积累了各种突变。然而，这些突变没有完全解决，观察到它们是与起始序列的混合物。

许多突变体是多核苷酸序列的扩展。在携带g38insg的B/Brisbane/60/2008BM2SR4 P13 NS节段的序列读取中，正好在AUG的5’的UTR(mRNA有义)(SEQ ID NO:1)中存在polyA7扩展至polyA8的混合物，即AAAAAAAUG(SEQ ID NO:2)至AAAAAAAAUG(SEQ IDNO:3)。将具有NS g38insg的B/CO/06/2017毒株培养至P6，其也具有与公开的g38insg HY启动子突变的逆转组合的polyA7扩展至A8。这些测序数据显示5’UTR中序列的复杂混合物，表明NS g38insg在这些实验中是不稳定的。

将具有携带g38insg的NS区段的B/CA/12/2015BM2SR毒株传代6次，并且观察到起始WT NS1序列中有在第569位polyA6扩展至polyA7的混合物。569_570insA突变产生具有4个残基的C末端延伸的176个氨基酸的NS1截短蛋白。该突变与先前鉴定的编码K176Q的NSHY突变a570c在相同的polyA6位点内。传代后，从病毒培养物上清液中提取P3、P5和P6基因组RNA，然后进行RT-PCR以扩增来自所有8个基因组区段的cDNA。图3中给出的序列色谱数据表明，随着传代时间的推移，NS区段8的碱基对570-574处的polyA节段的长度从5个核苷酸增加到6个核苷酸。突变NS569_570insA的频率相对于随后的传代从约20％增加到约50％的突变体，表明突变有利于在Vero细胞中的生长。

NS 569_570insA突变(SEQ ID NO:4)的结果是在NS1开放阅读框(ORF)中在氨基酸K176之后发生翻译移码。移码引起4个新氨基酸KGYT(SEQ ID NO:5)融合，然后是TAA终止密码子(SEQ ID NO:6)。因此，具有4个残基的C末端延伸的176个氨基酸的NS1截短蛋白被表达为180个氨基酸的肽(SEQ ID NO:7，其中X是任何氨基酸，包括G、R或V)。在该实施例中，X是G。NEP ORF的剪接和表达不受该突变的影响。

截短281个残基的乙型流感的C末端的105个氨基酸可能消除一些或全部NS1功能。NS1具有几种功能，包括重新利用宿主mRNA代谢，如聚腺苷酸化和剪接，以及阻止干扰素依赖性宿主细胞的先天免疫应答，如RIG-1的诱导。培养中的Vero细胞缺乏干扰素应答，这允许在该细胞系中繁殖甚至完全NS1缺失的流感毒株。NS1 C末端的缺失有利于Vero中BM2SR骨架的生长，并且这种突变可以增强疫苗材料的产生。K176Q突变可以通过在polyA6运行中插入G来促进该位点的遗传稳定性。

将含有K176Q的B/WI/01/2010BM2SR4传代至P13，获得NP序列的混合物。区段8的序列与起始质粒相同，该起始质粒在约70％的序列中包含K176Q。剩余的序列在约30％的序列中具有从NS1 ORF的25bp的缺失，416del25。这种缺失导致135个AA NS1截短突变体的P123之后的158个残基的截短+12个新氨基酸(AA)。这些数据表明NS区段a39g K176Q总体上是更稳定的。在BM2Vero细胞中测试NS a39g K176Q区段和NP D161N HY突变的组合改善了稳定性。含有NS a39g K176Q和NP P40S D161N M204T区段的B/CA/12/2015毒株在BM2Vero细胞中传代10次。未观察到NS或NP突变，这表明当组合2个HY区段时稳定性得到改善。

实施例4

本实施例证明了在培养物传代过程中分离了适应性乙型流感病毒HA突变。

来自VL和YL的多种BM2SR毒株在BM2Vero细胞中传代，并测定HA区段的核苷酸序列。没有表征没有改变编码序列的沉默突变。在HA区段中鉴定到了在14个位点处改变氨基酸的18个突变(表1)。突变分为两大类。HA1中的突变通常直接在N209(WA02 VL)/N210(CO/06VL)/N211(YL)处的熟知的N-连接糖基化位点上或对于糖基化酶识别重要的附近残基。分离的大多数突变位于HA2卷曲螺旋区。两个HA2突变突出。在B/CO/06/2017BM2SR毒株进行传代的多个实验中观察到HA a1294g突变，其与NP或NS区段同一性无关。糖基化位点适应可能对HA与靶Vero细胞结合的亲和力有影响。HA2卷曲螺旋的变化被认为影响HA与靶细胞膜融合所需的pH依赖性构象变化。表1.在BM2Vero细胞中通过BM2SR传代分离的HA区段突变和在相同位点引入的HA2突变

*＝与Bris/60/2008HA0(HA2数目未改变的)相比，由于新毒株的HA1中的1、2或3个氨基酸的缺失，毒株之间的HA0氨基酸数目不同。

@＝引入的突变

与乙型流感/Bris/60/2008HA1相比，不同的乙型流感谱系和毒株可能具有不同数目的氨基酸，这是由于在乙型流感VL HA1基因区段中依次发生的1、2或3个氨基酸的缺失(取决于年份)和在乙型流感YL的HA1基因区段中的1个AA的缺失。表1中带有星号的氨基酸表明突变可以在不同毒株的不同位置发生。表2显示了在不同毒株中发生的氨基酸突变的不同位置的实例。将一些分离的突变引入到其它毒株的HA中并测试了其生长增强作用。

表2.表1中鉴定的每种毒株的某些氨基酸突变的HA0位置

WA/02/2019	CO/06/2017	CA/12/2015	Bris/60/2008
				<![CDATA[N209S<sup>a,b,c</sup>]]>	<![CDATA[N210T<sup>a,b</sup>]]>	<![CDATA[N211T<sup>a,b</sup>]]>	<![CDATA[N212D<sup>b</sup>]]>
<![CDATA[K420E<sup>c</sup>]]>	<![CDATA[K421E<sup>a</sup>]]>	<![CDATA[K422E<sup>c</sup>]]>	<![CDATA[K423E<sup>a</sup>]]>
				<![CDATA[D471G<sup>d</sup>]]>	<![CDATA[D472G<sup>a</sup>]]>	<![CDATA[D473G<sup>c</sup>]]>	<![CDATA[D474G<sup>d</sup>]]>
<![CDATA[D471E<sup>d</sup>]]>	<![CDATA[D472E<sup>d</sup>]]>	<![CDATA[D473E<sup>c</sup>]]>	<![CDATA[D474E<sup>d</sup>]]>
				<![CDATA[D471N<sup>d</sup>]]>	<![CDATA[D472N<sup>d</sup>]]>	<![CDATA[D473N<sup>c</sup>]]>	<![CDATA[D474N<sup>d</sup>]]>

^a在FluGen处分离的。

^b来自序列数据库，卵传代毒株。

^c引入的。

^d未确定的。

实施例5

本实施例证明了乙型流感病毒HA适应性突变对乙型流感/WA/02/2019M2SR(VL)毒株的拯救。

合成了编码WHO推荐的疫苗毒株B/WA/02/2019(VL)的流感HA区段5的3个版本的cDNA，并将其插入到RNA表达质粒载体中以进行基于乙型流感质粒的病毒拯救。第一种HA版本编码直接从流感患者初级分离物获得的野生型(WT)HA蛋白序列。WT HA在HA1中具有完整的N209糖基化位点。在细胞或卵培养物中传代乙型流感/WA/02/2019(VL)毒株导致在该位点的糖基化缺失，这主要是通过N209S取代(GISAID)。第二种质粒编码从B/CO/06/2017毒株传代获得的突变HA2 K61E(K421E)。还构建了对HA2K61E改变添加糖基化减去N209S HA1突变体的双突变体。

使用三种类型的HA质粒的基于标准质粒的病毒拯救程序通过转染BM2Vero细胞来构建B/WA/02/2019BM2SR(VL)病毒。单一和双突变HA质粒都支持对BM2SR病毒的拯救，但完整WT HA序列不产生活病毒(测定LOD＝log₁₀ 0.67TCID₅₀/mL)。将两种成功的候选疫苗在BM2Vero中传代至P2，并确认HA序列。如图4和表3所示，将病毒以MOI＝0.01传代至P3，并且冷冻每日等分试样以进行病毒滴度的TCID₅₀测定。单独的具有K420E(K61E HA2)突变的单一突变毒株生长良好，允许糖基化加毒株在3天内达到7.67的最大log₁₀TCID₅₀/mL。双突变的糖-HA毒株生长较快，但在2天内达到类似的log₁₀ 7.50的峰值滴度。

表3.具有HA1和HA2突变的B/WA/02/2019BM2SR毒株的生长(测定LOD＝log₁₀0.67TCID₅₀/mL)

实施例6

本实施例证明了具有乙型流感HA适应性突变的乙型流感/CA/12/2015BM2SR(YL)毒株的生长。

合成了编码WHO推荐的疫苗毒株B/CA/12/2015(YL)的流感HA区段5的8个版本的cDNA，并将其插入到RNA表达质粒载体中以进行乙型流感反向遗传拯救，从而产生4种HA突变毒株。这四种HA突变毒株来源于在4个HA2残基处包含5个突变的Vero传代：1.)N51D和D61E；2.)D90N；3.)D112E；和4.)D112K，所有的都与HA1糖基化位点突变N211T组合。通过B/CO/06/2017传代获得的HA2 N51D,K61E突变有助于生长，但仅当与N211T组合时。通过甲型流感H3N2在Vero中传代获得的HA2 D90N和D112K突变损害生长，或者当与N211T组合时没有影响。D112E(D473E)是有利的，其赋予更快地生长至最大滴度，而糖基化位点N211无关，如图5所示。

实施例7

本实施例进一步证明了具有乙型流感HA适应性突变的乙型流感/CA/12/2015BM2SR毒株的生长。

乙型流感YL的HA2 D112位点在培养中对生长有显著影响。独立于糖基化位点N211，HA2 D112突变D473E(D112E)对流感BM2SR有益，赋予比其它B/CA/12/2015(YL)HA2112突变体更快地生长至最大滴度，因此进行了另外的HA2 D112G和HA2 D112N取代。这些HA2突变是在甲型流感HA2位置E112处的突变，其赋予金刚烷胺抗性并显著提高可发生HA刺突蛋白构象变化的pH(Byrd-Leotis等人，J.Virol.,89(8):4504-4516(2015))。已显示HA2D112G在其已被测试的每种甲型流感HA背景下均起作用。对于乙型流感，如图6所示，HA2D112G和HA2 D112N是有益的，并且与N211结合协同赋予更快地生长至最大滴度。

实施例8

本实施例进一步证明了在传代培养过程中对其它适应性乙型流感HA突变的成功分离。

根据前面的实施例，在传代培养过程中分离了另外的适应性乙型流感HA突变。这些突变总结于下表4中。

表4

实施例9

本实施例证明了BM2SR病毒引发针对配制在多价疫苗中的乙型流感病毒的抗体应答。

当配制成单价、二价、三价或四价疫苗时，流感BM2SR-Vic或BM2SR-Yam病毒(包含分别具有由SEQ ID NO:8、9、10、11、12和18表示的核苷酸序列的PB1、PB2、PA、NP、NS和M基因节段的病毒)引发抗体应答。

用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、二价BM2SR、三价BM2SR-Vic+BM2SR-Yam+M2SR-H1N1、三价BM2SR-Vic+BM2SR-Yam+M2SR-H3N2或四价BM2SR-Vic和BM2SR-Yam以及M2SR-H1N1和M2SR-H3N2疫苗鼻内免疫7周龄的BALB/c雌性小鼠(N＝8)。对照组小鼠用SPG缓冲液(蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲液)免疫。接种疫苗后28天，用加强免疫对小鼠进行鼻内免疫，该加强免疫由针对初次免疫施用的相同疫苗组成。在初次免疫后第7天、第14天和第21天以及在加强免疫(第28天)后第35天、第42天和第49天采集血清样品。通过ELISA测定来自血清样品的抗乙型流感-Vic HA和抗乙型流感-Yam HA血清IgG抗体滴度。

所得的抗乙型流感-Vic HA数据显示在图7A中。所得的抗乙型流感-Yam HA数据显示在图7B中。结果显示，所有疫苗都能够将抗流感病毒抗体提高到SPG对照之上，并且这些提高在疫苗制剂中是相当的。这些结果显示，当配制成多价疫苗时，单价组分之间没有干扰。

实施例10

本实施例证明了鼻内施用单价或四价M2SR疫苗保护小鼠免受疫苗中不含的致死性乙型流感病毒之害。

在第一次免疫后70天(加强免疫后6周)，用致死剂量的乙型流感/Malaysia/2506/2004(Vic)病毒(>10只小鼠50％致死剂量(MLD₅₀))激发实施例9中所述的BALB/c雌性小鼠。用单价BM2SR-Vic(乙型流感/CO/06/2017)或BM2SR-Yam(乙型流感/Phuket/3073/2013)和四价M2SR疫苗免疫的所有小鼠在激发后存活。用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam和四价M2SR疫苗免疫的小鼠保持健康，以及没有体重减轻。所得体重减轻数据显示在图8中。仅用SPG模拟免疫的对照小鼠在激发后10天内体重减轻，并且8只中的4只被感染。在激发后第3天，从每组3只小鼠中获得肺，并经由MDCK细胞中的噬斑测定来确定病毒载量。如表5所示，用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam和四价M2SR疫苗免疫的小鼠肺中的病毒滴度低于检测极限(每个肺少于76个噬斑形成单位(PFU))。在仅用SPG对照免疫的小鼠中检测到病毒载量(平均6.86log PFU/g)。这些结果表明BM2SR单价和四价疫苗赋予交叉保护，并限制与任何疫苗组分不匹配的激发病毒的复制。

表5.激发后3天，肺中的激发病毒滴度

实施例11

本实施例证明了与许可的鼻内流感疫苗以及许可的肌内灭活流感疫苗针对疫苗中不含的流感病毒的优异保护相比，含有BM2SR组分的二价、三价或四价M2SR提供了有利的安全特性。抗原性不同的单价BM2SR-Vic和单价BM2SR-Yam疫苗在保护小鼠免受致死性乙型流感病毒之害中提供了与抗原性匹配的许可疫苗相当的保护。

用以下疫苗之一免疫7周龄的BALB/c雌性小鼠(N＝13)：单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价FGHY-M2SR、FLUMIST^TM四价(AstraZeneca,Wilmington,DE)、FLUZONE^TM四价(Sanofi,Bridgewater,NJ)或FLUZONE^TM高剂量(Sanofi)。每种疫苗的毒株组分显示在表6中。BM2SR、M2S和FLUMIST^TM经鼻内给药，而两种FLUZONE^TM疫苗经肌内给药。对照组小鼠用SPG鼻内模拟免疫。免疫后观察小鼠14天体重的任何变化。

表6：每种疫苗的毒株组分

所得的体重减轻数据示于图9中。用单价BM2SR-Vic、单价BM2SR-Yam、四价M2SR、FLUZONE^TM四价、FLUZONE^TM高剂量或SPG对照免疫的小鼠在14天期间没有经历体重减轻。这些数据表明BM2SR疫苗具有与许可的流感疫苗等同的安全特性。

初次免疫后第28天用加强免疫对小鼠进行免疫。加强免疫由在初次免疫中免疫小鼠的相同疫苗组成。在初次免疫和加强免疫后每周收集血清样品，并通过ELISA测定针对每种疫苗组分合并的血清IgG滴度。得到的抗乙型流感-Vic HA血清IgG ELISA滴度数据示于图10A中。得到的抗乙型流感-Yam HA血清IgG ELISA滴度数据示于图10B中。得到的抗甲型流感/H1 HA血清IgG ELISA滴度数据示于图10C中。得到的抗甲型流感/H3 HA血清IgGELISA滴度数据示于图10D中。结果表明，所有疫苗都能够将抗乙型流感-Vic HA和乙型流感-Yam HA的血清IgG滴度提高到SPG对照以上，并且这些提高在疫苗制剂中是相当的。FLUZONE^TM四价和FLUZONE^TM高剂量与活疫苗相比引发了较低的抗乙型流感HA抗原的血清IgG滴度。

在初次免疫后第49天(加强免疫后21天)从4只小鼠/组获得气管-肺洗液，并通过ELISA测定IgG和IgA滴度以评价粘膜免疫应答。所得IgG滴度数据示于图11A中，而所得IgA滴度数据示于图11B中。四价M2SR和FLUMIST^TM四价引发针对所有测试抗原的IgG和IgA滴度。用单价BM2SR-Vic和BM2SR-Yam免疫的小鼠显示出针对B-Vic和B-Yam HA抗原的IgG和IgA滴度，而没有针对H1或H3 HA抗原的IgG和IgA滴度。在用FLUZONE^TM四价和FLUZONE^TM高剂量疫苗免疫的组中，针对所有四种抗原的IgG滴度升高，然而，没有检测到针对任何抗原的IgA抗体滴度。这些数据表明BM2SR疫苗引发与许可的活减毒流感疫苗FLUMIST^TM四价相当的粘膜免疫应答，而许可的肌内流感疫苗不引发任何粘膜免疫应答。

在加强免疫后6周，用致死剂量的乙型流感/Malaysia/2506/2004(Vic)激发小鼠。用SPG对照模拟免疫的8只小鼠中有4只在激发后第10天感染，而所有疫苗组存活。激发后产生的体重变化如图12所示。接受单价BM2SR、四价M2SR和许可的疫苗的小鼠保持健康，同时没有体重减轻，而存活的模拟免疫小鼠体重减轻约25％。除了FLUZONE^TM四价外，在接种疫苗组的激发后第3天在肺中没有检测到激发病毒(表7)。BM2SR-Yam提供了对流行性乙型流感/Malaysia，Victoria谱系致死感染的保护作用。在BM2SR-Vic或BM2SR-Yam免疫小鼠的肺中或在含有一种或多种BM2SR组分的任何多价疫苗中没有检测到感染性病毒(表7)。在原始模拟免疫小鼠的肺中检测到感染性病毒。在激发后的鼻甲中也检测到病毒。BM2SR组(单价，二价，三价或四价)在鼻甲中具有比模拟免疫小鼠少≥2个对数的病毒，这表明鼻内施用的疫苗相比肌内疫苗(FLUZONE^TM四价和高剂量)能够更好地保护免受激发病毒之害，如表7所示。此外，BM2SR-Yam(单价的或用H1N1或H3N2配制)提供了比FLUZONE^TM高剂量(含Yam)或FLUZONE^TM四价(含Vic和Yam)更好的对抗Victoria谱系激发的保护。

这些数据表明鼻内施用的BM2SR疫苗提供了比肌内施用的许可灭活疫苗更好的对抗小鼠中的激发的保护。

表7.乙型流感/Malaysia/2506/2004(Vic)后小鼠器官中的病毒滴度

实施例12

本实施例证明了BM2SR病毒的生产在用于生产的BM2Vero细胞中是可扩展的。

使用OptiVero培养基(InVitria,Aurora,CO)，在37℃，5％CO₂气氛下，在湿润培养箱中培养BM2Vero细胞(稳定表达乙型流感BM2蛋白的Vero细胞)。用编码乙型流感/Colorado/06/2017(Vic)的HA和NA基因的BM2SR-Vic病毒或编码乙型流感/California/12/2015(Yam)的HA和NA基因的BM2SR-Yam病毒以0.01的感染复数(MOI)，在OptiVero培养基中感染在CELLSTACK^TM培养室--5室(CS5；Corning,Corning,NY)(每批次2-4个培养室)中的大约24200万个细胞。在35℃，5％CO₂下2-3天后，当上清液的HA滴度为至少32HAU/50μL时，收获培养基并通过低速离心去除细胞和细胞碎片。通过0.2μM孔PES膜真空过滤将上清液进一步澄清并灭菌。然后将澄清的上清液用非特异性RNA和DNA核酸酶(BENZONASE^TM enzonase，5单位/mL)在37℃下处理2小时以消化/水解残留的细胞RNA和DNA。然后使用235cm² 300kDMWCO改性的聚醚砜(mPES)MIDIKROS^TM中空纤维过滤器模块(Repligen,Waltham,MA)，通过切向流过滤(TFF)纯化BENZONASE^TM benzonase消化的材料。将材料浓缩10至20倍。然后使用至少15个柱体积的SPG通过渗滤去除污染的宿主细胞蛋白(HCP)和残留的DNA片段。通过25％蔗糖磷酸盐缓冲盐水(PBS)垫以25,000rpm超速离心将SPG缓冲剂中的纯化病毒进一步浓缩10至100倍。将所得病毒沉淀重悬于SPG中，等分，然后在液体N₂中快速冷冻，然后在-80℃下储存。

将浓缩和纯化的BM2SR-Vic和BM2SR-Yam基因的序列同源性与病毒种子储备液的参考序列的序列同源性进行比较。对从纯化的病毒中提取的病毒RNA进行RT-PCR以产生cDNA，然后进行Sanger测序。由8个病毒节段编码的ORF的分析表明所有区段具有与参照100％的核苷酸序列同一性。

通过50％组织培养感染剂量(TCID₅₀)测定，通过使用BM2CK细胞(稳定表达乙型流感BM2的MDCK细胞)的至少三个独立测量，测定浓缩和纯化的BM2SR-Vic和BM2SR-Yam病毒的感染滴度。在该程序中，将疫苗样品的连续稀释液施加到96孔板中复制的BM2CK细胞，并在35℃，5％CO₂气氛下培养4天。接种后4天，目测细胞单层并针对CPE进行评分。使用Reed&Muench方法计算病毒的滴度，并将其表示为TCID₅₀/mL。另外，在每个孔上清液的等分试样中测试HA活性，以验证通过CPE测定的病毒滴度。如表8所示，浓缩和纯化后，BM2SR病毒持续达到10^8.6TCID50/mL以上的高滴度。

表8.浓缩和纯化后的病毒滴度

为了证实BM2SR疫苗病毒在浓缩和纯化后保持复制缺陷型表型，通过在MDCK细胞中进行三次连续传代试验样品来评价任何复制病毒的存在，所述MDCK细胞对野生型流感病毒是允许的，但对BM2SR病毒是非允许的。在第一轮感染中，将测试病毒连续稀释并接种到细胞单层上。然后将感染的细胞在35℃，5％CO₂气氛下培养4天。然后将感染的细胞培养物上清液转移至新鲜的MDCK单层，并在35℃，5％CO₂气氛下孵育4天。对于第三轮和最后一轮传代，将该感染的细胞培养基转移至另一个新鲜的MDCK单层，并在35℃，5％CO₂气氛下再孵育4天。在每4天35℃培养后观察MDCK细胞的CPE，并测定培养物上清液中的HA活性以确认子代病毒体的存在。对于每轮感染，测试之前的复制缺陷型参考病毒B/California/12/2015BM2SR批次作为阳性对照。阴性对照接种物仅为培养基。结果表明对照如预期进行，并且在用四种试验样品中的任一种接种正常细胞后未检测到感染性后代。因此，证明了BM2SR疫苗病毒制剂是无复制能力的，不能复制。

疫苗制剂的无菌性通过基于药物制剂的WHO规范的程序来验证。在无菌条件下将疫苗制剂接种到三种类型的液体培养基中，即Luria-Bertani肉汤(LB)、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)和巯基乙酸盐培养基(TGM)中。使培养物在37℃(LB和TSB)和环境温度(TGM)下生长。使培养物生长14天，然后目测微生物生长。所有测试的制剂在所有生长条件下的微生物生长均为阴性。

实施例13

本实施例证明了BM2SR骨架被减毒，不会脱落，并且不会在雪貂模型中传播。

M2SR病毒是不表达功能性M2蛋白的重组甲型流感病毒，其编码例如甲型流感/Brisbane/10/2007-样A/Uruguay/716/2007(H3N2)或A/California/07/2009(H1N1pdm)的HA和NA基因。BM2SR病毒是不表达功能性BM2蛋白的重组乙型流感病毒，其编码例如B/Brisbane/60/2008(Victoria)或B/Wisconsin/01/2010(Yamagata)的HA和NA。四价M2SR，在本文中也称为M2SR Quad，由编码A/H1N1、A/H3N2、B/Victoria、B/Yamagata HA和NA的2种M2SR和2种BM2SR病毒组成。

动物和动物护理.将购自Triple F Farms的雄性雪貂置于研究中。动物在研究开始时约为4月龄。供货商证明动物是健康的并且没有抗感染性疾病的抗体。在到达时，将动物单只圈养在具有板条底部的悬挂网笼中，悬挂在纸衬里的废盘上。根据公认的动物护理实践和相关的标准操作程序，在接受动物之前清洁和消毒动物房间和笼子。随意提供认证的Teklad Global Ferret Diet#2072(Teklad Diets,Madison,WI)和水，并每周至少更新三次。将动物房间中的荧光照明维持在12小时光照/黑暗循环。在研究期间，动物室温和相对湿度在各自的方案限制内并且分别在20.0至25.0℃和30至63％的范围内。

动物隔离与随机化.在随机化前将雪貂隔离保存7天并每天观察。基于指示动物的一般良好健康的每日观察，将雪貂从隔离中释放出来用于随机化和测试。隔离后，对雪貂称重，并根据产生相似组平均值(TOXDATA^TM2.1.E.11版(PDS Pathology Data Systems,Inc.,Basel,Switzerland))的体重，使用计算机化随机化程序将雪貂分配给处理组。在组中，所有体重在其平均值的20％以内。选择用于研究的动物通过耳标和应答器接收永久的识别号，并且单独的笼卡也通过单独的号和组来识别研究动物。所分配的识别号在研究中是唯一的。

研究前的动物程序.所有动物程序根据动物护理和使用委员会在IIT研究院批准的方案在动物生物安全水平-2设施中进行。接种前，监测雪貂3天以测量体重并建立基线体温。每天通过皮下植入每只雪貂的应答器(BioMedic data systems,Seaford,DE)记录温度读数。在研究开始之前收集血液，并测试血清中的流感抗体。用受体破坏酶(RDE)处理接种疫苗前的血清样品以去除非特异性抑制剂，然后连续稀释，针对确定量的甲型流感病毒/California/07/2009(H1N1pdm)、A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(Victoria谱系)和B/Wisconsin/01/2010(Yamagata谱系)进行测试，并将其与0.5％火鸡红细胞或0.75-1.0％豚鼠红细胞混合。抗体滴度定义为引起红细胞凝集抑制的最低血清稀释度。只有HAI(血凝抑制)滴度低于40的雪貂被认为是血清阴性的，并用于本研究。将研究动物随机分成如下所述的组。

为了评估BM2SR疫苗病毒的减毒作用，在研究第0天，将一组3只雪貂麻醉并鼻内接种单次剂量为1×10^8.2TCID₅₀的B/CO/06/2017(Vic)BM2SR病毒。用单次目标剂量为1×10^7.4TCID₅₀的野生型B/Brisbane/60/2008(Vic)病毒接种对照组(3只雪貂)。在研究第0天暴露后，每天记录体重一次，并在暴露后6小时监测体温变化的温度读数，然后每天一次。每天记录两次存活检查。在研究第3天，对动物(每组3只动物)进行安乐死，并收集以下组织样品：鼻甲、气管、肺、肾、嗅球、脑、肝、脾和肠。用缓冲的中性福尔马林固定所收集的样品的一部分用于组织学评价，并且将样品的另一部分储存在≤-65℃下用于病毒滴定。收集的用于滴定的组织包括：右鼻甲、气管的上1/3、右侧肺叶(right cranial lung lobe)(如果它具有足够的大小)或具有肉眼病变的肺叶(如果只有一个肺叶具有病变，则处理该肺叶用于组织学，并从任何其它肺叶确定病毒滴度。如果在多个肺叶中存在病变，则收集一个肺叶用于病毒滴度，另一个用于组织学)、右肾、右嗅球、右脑、肝的右侧叶、脾的右半部分(在打开腹腔时观察到脾的末端)、小肠和大肠。

尽管用1×10^7.4TCID₅₀的野生型乙型流感/Brisbane/60/2008(Vic)接种的1只雪貂在接种后第1天具有升高的体温(2.2℃)，但用野生型病毒接种的另外2只雪貂连同用1×10^8.2TCID₅₀的B/CO/06/2017(Vic)BM2SR病毒接种的3只雪貂在给药后3天内没有发热。在研究中使用的雪貂没有减轻或增加超过2.8％的体重。所有6只雪貂都被安乐死，并且器官中的病毒载量被滴定。如表9所示，在包括鼻甲和气管的上呼吸道和脑中检测到野生型乙型流感/Brisbane/60/2008(Vic)。在用BM2SR病毒接种的雪貂的任何器官中均未检测到病毒。

为了评估BM2SR在雪貂模型中传播的可能性，用1×10^8.2TCID₅₀剂量水平的乙型流感/CO/06/2017(Vic)BM2SR疫苗或1×10^7.4TCID₅₀剂量的对照野生型乙型流感/Brisbane/60/2008(Vic)病毒鼻内接种原始供体雪貂。24小时后，将每只供体雪貂置于具有1只原始雪貂的相同网笼(双只圈养)中(直接接触)。将另外的原始雪貂(气溶胶接触)置于传播室内的单独的相邻网笼(单只圈养)中，与供体的笼子隔开10-12cm的距离。该距离防止了气溶胶接触与感染和直接接触之间的物理接触，仅允许空气和呼吸道飞沫通过在雪貂之间共享。接种后7天，每天监测雪貂体温、体重和临床症状。在第1、3、5、7、9天从所有接种的供体雪貂和在第2、4、6、8、10天从所有接触雪貂收集鼻洗液。在第14天从所有雪貂收集鼻洗液和血清。

在任何时间点，在来自三个BM2SR疫苗病毒供体雪貂及其直接和气溶胶接触雪貂的鼻洗液中没有检测到病毒(图13A)。BM2SR疫苗病毒组中没有雪貂发热，体重减轻或显示出任何临床症状。在接种后第1、3和5天，在来自野生型病毒供体雪貂的鼻洗液中检测到野生型乙型流感/Bris/60/2008(图13B)。尽管没有雪貂显示出体温，体重或临床症状的变化，但是野生型病毒供体雪貂的所有直接和气溶胶接触雪貂都被感染并脱落病毒。

这些数据表明测试设置是合适的，可复制且可传播的病毒被证明是其复制和传播性。在相同的测试设置中，BM2SR病毒在雪貂中不复制，并且在直接和气溶胶接触的动物中没有检测到，这表明BM2SR病毒高度减毒，并且在雪貂中不复制，因此它是不可传播的。BM2SR在雪貂模型中仍然是减毒的，其中BM2SR接种的雪貂没有显示出疾病的临床迹象并且在呼吸道或其它器官中没有病毒复制。另外，在直接或气溶胶接触的动物中没有检测到BM2SR，表明BM2SR是不可传播的。

实施例14

本实施例证明了由三价M2SR疫苗(本文中也称为M2SR Tri-Yam)和四价M2SR疫苗(本文中也称为M2SR Quad)引发的免疫应答在原始和预免疫雪貂模型中都提供了针对流行性激发病毒的保护效力。

动物护理、隔离、随机化和预研究程序如实施例13中所概述。

表10.实验设计

实验设计示于表10中。在研究第0天，用野生型病毒预感染雪貂，或者通过鼻内施用M2SR Tri-Yam、M2SR Quad、FLUMIST^TM四价(本文也称为FLUMIST^TM Quad)、PBS或者通过肌内注射FLUZONE^TM四价(本文也称为FLUZONE^TM Quad)接种雪貂。在研究第30天，通过鼻内施用M2SR Tri-Yam、M2SR Quad、FLUMIST^TM Quad和PBS或通过肌内注射FLUZONE^TM Quad对雪貂接种疫苗。每种疫苗的毒株组分示于表6中。接种疫苗/暴露后，在研究第-8天至第-3、28、37、51和65天从所有动物收集血清。另外，在研究第28天和第37天从所有动物收集外周血单核细胞(PBMC)。在研究第72天，用B/Brisbane/60/2008(B Victoria谱系)激发雪貂。激发后监测雪貂体重、体温和临床症状14天。在激发后第1、3、5和7天(研究第73、75、77和79天)，从所有激发的雪貂(除了指定用于器官收集的那些之外)收集鼻洗液，并将样品在≤-65℃下储存用于病毒滴定。在研究第75天，将每组中的四只雪貂安乐死并尸体解剖。收集鼻甲、气管和肺用于病毒滴度分析。在研究第86天，将所有剩余的动物最终放血以回收血清。

测定抗甲型流感/Montana/50/2016(H1N1)、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(H3N2)、B/California/12/2015(Yam)和B/Colorado/06/2017(Vic)的血清HAI和PRNT(噬斑减少中和试验)滴度(图14A-D和图15A-D)，以证明抗体的功能活性。用含有BM2SR-Yam的M2SR Tri-Yam接种疫苗在原始动物中引发抗流感HAI和抗所有疫苗组分的中和抗体。M2SRTri-Yam在第二剂量后加强的原始动物中诱导交叉谱系乙型流感抗体产生(抗BVictoria)。接受单次剂量或两个连续剂量的M2SR Quad的动物产生HAI和针对所有4种毒株组分的中和抗体。此外，从M2SR Quad产生的抗体的量与从M2SR Tri-Yam产生的抗体的量相当，表明加入第二BM2SR组分对疫苗性能没有影响，并且M2SR Quad制剂不显示毒株干扰(图14A-D和图15A-D)。

M2SR Quad和FLUMIST^TM Quad各自在原始动物中引发HAI和中和抗体，而FLUZONE^TMQuad疫苗甚至在两次连续剂量后也不能诱导相应的抗体。然而，与M2SR Quad相比，用FLUMIST^TM Quad接种的预免疫动物具有较低的HAI和针对几种毒株的中和抗体产生。与接受两剂M2SR Quad的动物相比，接受两剂FLUMIST^TM Quad的动物也抑制抗体产生(图14A-D和图15A-D)。这些结果表明M2SR Quad对预先存在的流感免疫不敏感。

作为细胞免疫应答的标志物，通过雪貂特异性酶联免疫斑点(ELISpot)测量来自全血PBMC的流感特异性IFN-γ分泌。在接受M2SR Quad疫苗接种的预免疫动物中，10只雪貂中的9只在H3N2流感病毒刺激后表现出增加的细胞免疫应答，与之相比，FLUMIST^TM Quad仅为6/10，而FLUZONE^TM Quad仅为2/10(图18A)。在用H1N1 HA肽刺激后，观察到类似的应答，其中M2SR Quad证实10只动物中的10只的细胞免疫应答增加，而FLUMIST^TM Quad和FLUZONE^TMQuad的增加频率低得多(分别为6/10和2/10，图18B)。这些结果表明M2SR除了诱导抗体应答外还诱导强T细胞应答。

在乙型流感-Vic激发后，接受模拟处理的原始动物表现出约5-6％的瞬时体重减轻和体温升高。接受单次剂量的FLUZONE^TM Quad的原始雪貂与模拟处理的动物相当，表现出约4-5％的瞬时体重减轻，而M2SR Tri-Yam和M2SR Quad组没有任何体重减轻。在预免疫疫苗组中，FLUZONE^TM Quad雪貂显示出类似于模拟组的体重减轻和温度升高，而Quad M2SR组没有任何体重减轻或体温升高(图19)。

在激发后第1、3、5和7天收集鼻洗液并通过TCID₅₀测定在MDCK细胞中滴定(图17)。M2SR Tri-Yam提供了对原始雪貂的交叉谱系乙型流感病毒保护，在所有取样日都显示出降低的病毒滴度，并且在对照雪貂之前达到不可检测的水平。在接受M2SR Quad的原始雪貂中的病毒滴度与M2SR Tri-Yam相当或略低，这再次证明了在M2SR Quad制剂中没有干扰。在预免疫雪貂中，M2SR Quad和FLUMIST^TM Quad都快速控制了激发病毒复制，在激发后第3天仅检测到低水平。相比之下，接受FLUZONE^TM Quad病毒的雪貂直到激发后第5天以高水平脱落病毒。在接受两剂M2SR Quad或FLUMIST^TM Quad的雪貂中也观察到鼻洗液中病毒水平降低，而在接受两剂FLUZONE^TM Quad的雪貂中的滴度在激发后5天仍然较高(图17)。

在感染后第3天从每组4只雪貂收集呼吸道器官(鼻甲、气管和肺)，并通过噬斑测定在MDCK细胞中测量病毒滴度。在任何接种疫苗组中，没有从任何雪貂的肺或气管中回收到乙型流感激发病毒。M2SR Tri-Yam提供了对原始雪貂的交叉谱系乙型流感病毒保护，证明了鼻甲中病毒滴度的降低，特别是在连续两次剂量后。接受M2SR Quad的原始雪貂中的病毒滴度进一步降低。在预免疫的雪貂中，M2SR和FLUMIST^TM Quad接种在激发后第3天没有可检测的病毒滴度。有趣的是，在用FLUZONE^TM Quad接种的预免疫雪貂的HAI和PRNT血清分析中观察到的高中和抗体滴度不能防止鼻甲中的激发病毒生长。另外，尽管病毒滴度在接受两剂M2SR Quad或FLUMIST^TM Quad的雪貂中仍然不可检测，但接受两剂FLUZONE^TM Quad的雪貂没有受到保护。

本实施例证明了鼻内施用M2SR Tri-Yam或M2SR Quad制剂与雪貂模型中的任何疫苗相关的不良事件(例如，体温升高、体重减轻或临床迹象)无关。M2SR Tri-Yam疫苗诱导原始动物中交叉谱系乙型流感抗体产生及激发后保护。HAL和对所有4种毒株组分的中和应答在M2SR Quad雪貂中保持高水平，表明在M2SR多价制剂中没有干扰。此外，与许可的疫苗FLUMIST^TM Quad不同，M2SR Quad抗体的产生在预免疫动物中没有降低。在用M2SR Quad接种的雪貂中，流感特异性刺激后的细胞免疫应答更高且更频繁，这进一步将其与当前许可的疫苗FLUMIST^TM Quad和FLUZONE^TM Quad区别开来。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文，其程度如同每篇参考文献均被单独且具体地指示为通过引入并入本文并在本文整体阐述。

在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)术语“一个”和“一种”和“该”和“至少一种”以及类似指代物的使用应被解释为涵盖了单数和复数两种，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一种”之后是一项或多项的列表(例如，“A和B中的至少一种”)的使用应理解为意指选自所列项(A或B)的一项或所列项(A和B)的两种或多种的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述说明书之后，那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且本发明人有意以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求书中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。

测序惯例基于涉及四种核苷酸的DNA：腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。当涉及RNA或流感病毒时，T是指尿嘧啶(U)。

                         序列表

<110>  复尔健有限公司(FluGen, Inc.)

<120>  流感病毒骨架

<130>  755023

<150>  63/054,676

<151>  2020-07-21

<160>  20

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  3

<212>  RNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  1

aug                                                                     3

<210>  2

<211>  9

<212>  RNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  2

aaaaaaaug                                                               9

<210>  3

<211>  10

<212>  RNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  3

aaaaaaaaug                                                             10

<210>  4

<211>  1100

<212>  DNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  4

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aaaatcctct tgttactact                                                1100

<210>  5

<211>  4

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<400>  5

Lys Gly Tyr Thr

1

<210>  6

<211>  3

<212>  DNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  6

taa                                                                     3

<210>  7

<211>  180

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (126)..(126)

<223>  Xaa可以是任何氨基酸

<400>  7

Met Ala Asp Asn Met Thr Thr Thr Gln Ile Glu Val Gly Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Thr Asn Ala Thr Ile Asn Phe Glu Ala Gly Ile Leu Glu Cys Tyr Glu

            20                  25                  30

Arg Leu Ser Trp Gln Arg Ala Leu Asp Tyr Pro Gly Gln Asp Arg Leu

        35                  40                  45

Asn Arg Leu Lys Arg Lys Leu Glu Ser Arg Ile Lys Thr His Asn Lys

    50                  55                  60

Ser Glu Pro Glu Ser Lys Arg Met Ser Leu Glu Glu Arg Lys Ala Ile

65                  70                  75                  80

Gly Val Lys Met Met Lys Val Leu Leu Phe Met Asn Pro Ser Ala Gly

                85                  90                  95

Ile Glu Gly Phe Glu Pro Tyr Cys Met Lys Asn Ser Ser Asn Ser Asn

            100                 105                 110

Cys Pro Asn Cys Asn Trp Ala Asp Tyr Pro Pro Thr Ser Xaa Lys Cys

        115                 120                 125

Leu Asp Asp Ile Glu Glu Glu Pro Glu Asn Val Asp Asp Pro Thr Glu

    130                 135                 140

Ile Val Leu Arg Asp Met Asn Asn Lys Asp Ala Arg Gln Lys Ile Lys

145                 150                 155                 160

Glu Glu Val Asn Thr Gln Lys Glu Gly Lys Phe Arg Leu Thr Ile Lys

                165                 170                 175

Lys Gly Tyr Thr

            180

<210>  8

<211>  2369

<212>  DNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  8

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taaaatgaaa aaaggctcgt gtttctact                                      2369

<210>  9

<211>  2396

<212>  DNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  9

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<210>  10

<211>  2308

<212>  DNA

<213>  乙型流感病毒

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ctaatgaaca cttcctatgg aaactgtgga gggactgtgt aaatacaata agtaatgagg    1080

aaacaagtaa cgaattacag aaaaccaatt atgccaagtg ggccacagga gatggattaa    1140

catatcagaa aataatgaaa gaagtagcaa tagatgacga aacaatgtac caagaagagc    1200

ccaaaatacc taacaaatgt agagtggctg cttgggttca aacagagatg aatctattga    1260

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tggagcatgt agggagtgaa agaaggaaat actttgttaa tgaaatcaac tactgtaagg    1380

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ccagtatggg aaaatataaa gtaataccaa taaccaacag agtagtaaat gaaaagggag    1500

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aatctgtata cctatattgc cgagtgaatg gtacaaataa gatccaaatg aaatggggaa    1740

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gtccaaaaac tttcagtatt gggactcaag aaggaaaact agtgaaagga tcctttggga    1920

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gaaagggccc ttgggtattc gacttagagg gaatgtattc tggaatagaa gaatgtatta    2100

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tagtgctcaa tttggtacta ttttgttcat tatgtatcta aacatccaat ataaagaatt    2280

gagaattaaa aatgcacgtg tttctact                                       2308

<210>  11

<211>  1843

<212>  DNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  11

agcagaagca cagcattttc ttgtgaactt caagtaccaa caaaaaactg aaaatcaaaa      60

tgtccaacat ggacattgac ggcatcaaca ctggaataat tgacaaaaca ccagaagaaa     120

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ggaaagaaga aatagaccat aacaaaacag gaggcacctt ttacaagatg gtaagagata     540

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tgtacaaaac caccatgggg agtgacggtt tcagtggact aaatcacatc atgattgggc     660

attcacagac gaacgatgtc tgtttccaaa gatcaaaggc actaaaaaga gttggacttg     720

acccttcatt aatcagtact tttgcaggaa gcacactccc cagaagatca ggtacaactg     780

gtgttgcgac caaaggaggt ggaactttag tggcagaagc cattcgattt ataggaagag     840

caatggcaga cagagggcta ttgagagaca tcagagccaa gacggcctat gaaaagattc     900

ttctgaatct gaaaaacaag tgctctgcgc cccaacaaaa ggctctggtt gatcaagtga     960

tcggaagtag aaatccaggg attgcagaca tagaagatct caccctgctt gctcgaagta    1020

tggtcgttgt taggccctct gtagcaagca aagtggtgct tcccataagc atctatgcta    1080

aaatacctca actggggttc aacgttgaag aatactctat ggttgggtat gaagccatgg    1140

ctctttataa tatggcaaca cctgtttcca tattaagaat gggagacgat gcaaaagata    1200

aatcacaatt attcttcatg tcttgctttg gagctgccta tgaagaccta agagttctgt    1260

ctgcactaac aggcacggaa ttcaagccta ggtcagcatt aaagtgcaaa ggtttccacg    1320

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tactcttatt gaaataaatg taaaaaatgc tgttgtttct act                      1843

<210>  12

<211>  1098

<212>  DNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  12

agcagaagca gaggatttgt ttagtcactg gcaaacggga aaaaatggcg gacaacatga      60

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tattaaggga catgaacaac aaagatgcaa ggcaaaagat aaaagaggaa gtaaacactc     540

agaaagaagg gaagttccgt ttgacaatac aaagggatat acgtaatgtg ttgtccttga     600

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tgcatagatt gaatgcatat gaccagagtg gaaggcttgt tgctaaactt gttgctactg     720

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tatgagatga aggatgtggt tgaagtgtac agcaggcagt gcttgtgaat ttaaaataaa    1080

aatcctcttg ttactact                                                  1098

<210>  13

<211>  752

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<400>  13

Met Asn Ile Asn Pro Tyr Phe Leu Phe Ile Asp Val Pro Ile Gln Ala

1               5                   10                  15

Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Val Pro Pro Tyr Ser His

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Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Ile Asp Thr Val Ile Arg Thr His Glu

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Tyr Ser Asn Lys Gly Lys Gln Tyr Ile Ser Asp Val Thr Gly Cys Thr

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Met Val Asp Pro Thr Asn Gly Pro Leu Pro Glu Asp Asn Glu Pro Ser

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Ala Tyr Ala Gln Leu Asp Cys Val Leu Glu Ala Leu Asp Arg Met Asp

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Glu Glu His Pro Gly Leu Phe Gln Ala Ala Ser Gln Asn Ala Met Glu

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Ala Leu Met Val Thr Thr Val Asp Lys Leu Thr Gln Gly Arg Gln Thr

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Phe Asp Trp Thr Val Cys Arg Asn Gln Pro Ala Ala Thr Ala Leu Asn

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Thr Thr Ile Thr Ser Phe Arg Leu Asn Asp Leu Asn Gly Ala Asp Lys

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Gly Gly Leu Val Pro Phe Cys Gln Asp Ile Ile Asp Ser Leu Asp Arg

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Pro Glu Met Thr Phe Phe Ser Val Lys Asn Ile Lys Lys Lys Leu Pro

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Ala Lys Asn Arg Lys Gly Phe Leu Ile Lys Arg Ile Pro Met Lys Val

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Lys Asp Arg Ile Thr Arg Val Glu Tyr Ile Lys Arg Ala Leu Ser Leu

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Asn Thr Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala

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Ile Ala Thr Ala Gly Ile Gln Ile Arg Gly Phe Val Leu Val Val Glu

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Asn Leu Ala Lys Asn Ile Cys Glu Asn Leu Glu Gln Ser Gly Leu Pro

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Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ser Asn Ala Val Ala Lys

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Met Leu Ser Asn Cys Pro Pro Gly Gly Ile Ser Met Thr Val Thr Gly

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Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Cys Leu Asn Pro Arg Ile Phe Leu Ala

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Met Thr Glu Arg Ile Thr Arg Asp Ser Pro Ile Trp Phe Arg Asp Phe

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Cys Ser Ile Ala Pro Val Leu Phe Ser Asn Lys Ile Ala Arg Leu Gly

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Lys Gly Phe Met Ile Thr Ser Lys Thr Lys Arg Leu Lys Ala Gln Ile

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Pro Cys Pro Asp Leu Phe Ser Ile Pro Leu Glu Arg Tyr Asn Glu Glu

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Thr Arg Ala Lys Leu Lys Lys Leu Lys Pro Phe Phe Asn Glu Glu Gly

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Thr Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu

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Ser Thr Val Leu Gly Val Ala Ala Leu Gly Ile Lys Asn Ile Gly Asn

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Lys Glu Tyr Leu Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala Leu

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Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys Lys

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Arg Asp Gly Phe Val Ser Asn Phe Ala Met Glu Leu Pro Ser Phe Gly

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Val Ala Gly Val Asn Glu Ser Ala Asp Met Ala Ile Gly Met Thr Ile

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Ile Lys Asn Asn Met Ile Asn Asn Gly Met Gly Pro Ala Thr Ala Gln

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Ala Lys Cys Cys Asn Leu Phe Glu Ala Cys Phe Asn Ser Ala Ser Tyr

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Arg Lys Pro Val Gly Gln His Ser Met Leu Glu Ala Met Ala His Arg

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Leu Arg Met Asp Ala Arg Leu Asp Tyr Glu Ser Gly Arg Met Ser Lys

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Asp Asp Phe Glu Lys Ala Met Ala His Leu Gly Glu Ile Gly Tyr Ile

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<210>  14

<211>  770

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<400>  14

Met Thr Leu Ala Lys Ile Glu Leu Leu Lys Gln Leu Leu Arg Asp Asn

1               5                   10                  15

Glu Ala Lys Thr Val Leu Lys Gln Thr Thr Val Asp Gln Tyr Asn Ile

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Met Lys Trp Ala Met Cys Ser Asn Phe Pro Leu Ala Leu Thr Lys Gly

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Asp Met Ala Asn Arg Ile Pro Leu Glu Tyr Lys Gly Ile Gln Leu Lys

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Thr Asn Ala Glu Asp Ile Gly Thr Lys Gly Gln Met Cys Ser Ile Ala

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Ala Val Thr Trp Trp Asn Thr Tyr Gly Pro Ile Gly Asp Thr Glu Gly

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Phe Glu Lys Val Tyr Glu Ser Phe Phe Leu Arg Lys Met Arg Leu Asp

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Asn Ala Thr Trp Gly Arg Ile Thr Phe Gly Pro Val Glu Arg Val Arg

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Lys Arg Val Leu Leu Asn Pro Leu Thr Lys Glu Met Pro Pro Asp Glu

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Ala Ser Asn Val Ile Met Glu Ile Leu Phe Pro Lys Glu Ala Gly Ile

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Pro Arg Glu Ser Thr Trp Ile His Arg Glu Leu Ile Lys Glu Lys Arg

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Glu Lys Leu Lys Gly Thr Met Ile Thr Pro Ile Val Leu Ala Tyr Met

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Leu Glu Arg Glu Leu Val Ala Arg Arg Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly

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Ala Thr Ser Ala Glu Phe Ile Glu Met Leu His Cys Leu Gln Gly Glu

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Arg Ser Gln Ser Met Ile Val Ala Cys Arg Lys Ile Ile Arg Arg Ser

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Asp Gln Trp Gly Tyr Glu Glu Ser Pro Lys Ala Ser Glu Leu His Gly

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Tyr Ser Gly Phe Ala Arg Ala Val Leu Lys Gln Met Arg Asp Gln Glu

        595                 600                 605

Val Met Lys Thr Asp Gln Phe Ile Lys Leu Leu Pro Phe Cys Phe Ser

    610                 615                 620

Pro Pro Lys Leu Arg Ser Asn Gly Glu Pro Tyr Gln Phe Leu Arg Leu

625                 630                 635                 640

Ile Leu Lys Gly Gly Gly Glu Asn Phe Ile Glu Val Arg Lys Gly Ser

                645                 650                 655

Pro Leu Phe Ser Tyr Asn Pro Gln Thr Glu Val Leu Thr Ile Cys Gly

            660                 665                 670

Arg Met Met Ser Leu Lys Gly Lys Ile Glu Asp Glu Glu Arg Asn Arg

        675                 680                 685

Ser Met Gly Asn Ala Val Leu Ala Gly Phe Leu Val Ser Gly Lys Tyr

    690                 695                 700

Asp Pro Asp Leu Gly Asp Phe Lys Thr Ile Glu Glu Leu Glu Lys Leu

705                 710                 715                 720

Lys Pro Gly Glu Lys Ala Asn Ile Leu Leu Tyr Gln Gly Lys Pro Val

                725                 730                 735

Lys Val Val Lys Arg Lys Arg Tyr Ser Ala Leu Ser Asn Asp Ile Ser

            740                 745                 750

Gln Gly Ile Lys Arg Gln Arg Met Thr Val Glu Ser Met Gly Trp Ala

        755                 760                 765

Leu Ser

    770

<210>  15

<211>  702

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<400>  15

Met Asp Thr Phe Ile Thr Arg Asn Phe Gln Thr Thr Ile Ile Gln Lys

1               5                   10                  15

Ala Lys Asn Thr Met Ala Glu Phe Ser Glu Asp Pro Glu Leu Gln Pro

            20                  25                  30

Ala Met Leu Phe Asn Ile Cys Val His Leu Glu Val Cys Tyr Val Ile

        35                  40                  45

Ser Asp Met Asn Phe Leu Asp Glu Glu Gly Lys Ala Tyr Thr Ala Leu

    50                  55                  60

Glu Gly Gln Gly Lys Glu Gln Asn Leu Arg Pro Gln Tyr Glu Val Ile

65                  70                  75                  80

Glu Gly Met Pro Arg Asn Ile Ala Trp Met Val Gln Arg Ser Leu Ala

                85                  90                  95

Gln Glu His Gly Ile Glu Thr Pro Arg Tyr Leu Ala Asp Leu Phe Asp

            100                 105                 110

Tyr Lys Thr Lys Arg Phe Ile Glu Val Gly Ile Thr Lys Gly Leu Ala

        115                 120                 125

Asp Asp Tyr Phe Trp Lys Lys Lys Glu Lys Leu Gly Asn Ser Met Glu

    130                 135                 140

Leu Met Ile Phe Ser Tyr Asn Gln Asp Tyr Ser Leu Ser Asn Glu Ser

145                 150                 155                 160

Ser Leu Asp Glu Glu Gly Lys Gly Arg Val Leu Ser Arg Leu Thr Glu

                165                 170                 175

Leu Gln Ala Glu Leu Ser Leu Lys Asn Leu Trp Gln Val Leu Ile Gly

            180                 185                 190

Glu Glu Asp Ile Glu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Leu Gly Gln Thr Ile

        195                 200                 205

Ser Lys Leu Arg Asp Ile Ser Val Pro Ala Gly Phe Ser Asn Phe Glu

    210                 215                 220

Gly Met Arg Ser Tyr Ile Asp Asn Ile Asp Pro Lys Gly Ala Ile Glu

225                 230                 235                 240

Arg Asn Leu Ala Arg Met Ser Pro Leu Val Ser Val Thr Pro Lys Lys

                245                 250                 255

Leu Lys Trp Glu Asp Leu Arg Pro Ile Gly Pro His Ile Tyr Asn His

            260                 265                 270

Glu Leu Pro Glu Val Pro Tyr Asn Ala Phe Leu Leu Met Ser Asp Glu

        275                 280                 285

Leu Gly Leu Ala Asn Met Thr Glu Gly Lys Ser Lys Lys Pro Lys Thr

    290                 295                 300

Leu Ala Lys Glu Cys Leu Glu Lys Tyr Ser Thr Leu Arg Asp Gln Thr

305                 310                 315                 320

Asp Pro Ile Leu Ile Met Lys Ser Glu Lys Ala Asn Glu His Phe Leu

                325                 330                 335

Trp Lys Leu Trp Arg Asp Cys Val Asn Thr Ile Ser Asn Glu Glu Thr

            340                 345                 350

Ser Asn Glu Leu Gln Lys Thr Asn Tyr Ala Lys Trp Ala Thr Gly Asp

        355                 360                 365

Gly Leu Thr Tyr Gln Lys Ile Met Lys Glu Val Ala Ile Asp Asp Glu

    370                 375                 380

Thr Met Tyr Gln Glu Glu Pro Lys Ile Pro Asn Lys Cys Arg Val Ala

385                 390                 395                 400

Ala Trp Val Gln Thr Glu Met Asn Leu Leu Ser Thr Leu Thr Ser Lys

                405                 410                 415

Arg Ala Leu Asp Leu Pro Glu Ile Gly Pro Asp Val Ala Pro Val Glu

            420                 425                 430

His Val Gly Ser Glu Arg Arg Lys Tyr Phe Val Asn Glu Ile Asn Tyr

        435                 440                 445

Cys Lys Ala Ser Thr Val Met Met Lys Tyr Val Leu Phe His Thr Ser

    450                 455                 460

Leu Leu Asn Glu Ser Asn Ala Ser Met Gly Lys Tyr Lys Val Ile Pro

465                 470                 475                 480

Ile Thr Asn Arg Val Val Asn Glu Lys Gly Glu Ser Phe Asp Met Leu

                485                 490                 495

Tyr Gly Leu Ala Val Lys Gly Gln Ser His Leu Arg Gly Asp Thr Asp

            500                 505                 510

Val Val Thr Val Val Thr Phe Glu Phe Ser Ser Thr Asp Pro Arg Val

        515                 520                 525

Asp Ser Gly Lys Trp Pro Lys Tyr Thr Val Phe Arg Ile Gly Ser Leu

    530                 535                 540

Phe Val Ser Gly Arg Glu Lys Ser Val Tyr Leu Tyr Cys Arg Val Asn

545                 550                 555                 560

Gly Thr Asn Lys Ile Gln Met Lys Trp Gly Met Glu Ala Arg Arg Cys

                565                 570                 575

Leu Leu Gln Ser Met Gln Gln Met Glu Ala Ile Val Glu Gln Glu Ser

            580                 585                 590

Ser Ile Gln Gly Tyr Asp Met Thr Lys Ala Cys Phe Lys Gly Asp Arg

        595                 600                 605

Val Asn Ser Pro Lys Thr Phe Ser Ile Gly Thr Gln Glu Gly Lys Leu

    610                 615                 620

Val Lys Gly Ser Phe Gly Lys Ala Leu Arg Val Ile Phe Thr Lys Cys

625                 630                 635                 640

Leu Met His Tyr Val Phe Gly Asn Ala Gln Leu Glu Gly Phe Ser Ala

                645                 650                 655

Glu Ser Arg Arg Leu Leu Leu Leu Ile Gln Ala Leu Lys Asp Arg Lys

            660                 665                 670

Gly Pro Trp Val Phe Asp Leu Glu Gly Met Tyr Ser Gly Ile Glu Glu

        675                 680                 685

Cys Ile Ser Asn Asn Pro Trp Val Ile Gln Ser Ala Tyr Trp

    690                 695                 700

<210>  16

<211>  560

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<400>  16

Met Ser Asn Met Asp Ile Asp Gly Ile Asn Thr Gly Ile Ile Asp Lys

1               5                   10                  15

Thr Pro Glu Glu Ile Thr Ser Gly Thr Ser Gly Ala Thr Arg Pro Ile

            20                  25                  30

Ile Arg Pro Ala Thr Leu Ala Ser Pro Ser Asn Lys Arg Thr Arg Asn

        35                  40                  45

Pro Ser Pro Glu Arg Ala Thr Thr Ser Ser Glu Ala Asp Val Gly Arg

    50                  55                  60

Lys Thr Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr

65                  70                  75                  80

Asn Met Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met Val Lys

                85                  90                  95

Ala Gly Leu Asn Asp Asp Met Glu Arg Asn Leu Ile Gln Asn Ala His

            100                 105                 110

Ala Val Glu Arg Ile Leu Leu Ala Ala Thr Asp Asp Lys Lys Thr Glu

        115                 120                 125

Phe Gln Lys Lys Lys Asn Ala Arg Asp Val Lys Glu Gly Lys Glu Glu

    130                 135                 140

Ile Asp His Asn Lys Thr Gly Gly Thr Phe Tyr Lys Met Val Arg Asp

145                 150                 155                 160

Asn Lys Thr Ile Tyr Phe Ser Pro Ile Arg Ile Thr Phe Leu Lys Glu

                165                 170                 175

Glu Val Lys Thr Met Tyr Lys Thr Thr Met Gly Ser Asp Gly Phe Ser

            180                 185                 190

Gly Leu Asn His Ile Met Ile Gly His Ser Gln Thr Asn Asp Val Cys

        195                 200                 205

Phe Gln Arg Ser Lys Ala Leu Lys Arg Val Gly Leu Asp Pro Ser Leu

    210                 215                 220

Ile Ser Thr Phe Ala Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser Gly Thr Thr

225                 230                 235                 240

Gly Val Ala Thr Lys Gly Gly Gly Thr Leu Val Ala Glu Ala Ile Arg

                245                 250                 255

Phe Ile Gly Arg Ala Met Ala Asp Arg Gly Leu Leu Arg Asp Ile Arg

            260                 265                 270

Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Leu Leu Asn Leu Lys Asn Lys Cys

        275                 280                 285

Ser Ala Pro Gln Gln Lys Ala Leu Val Asp Gln Val Ile Gly Ser Arg

    290                 295                 300

Asn Pro Gly Ile Ala Asp Ile Glu Asp Leu Thr Leu Leu Ala Arg Ser

305                 310                 315                 320

Met Val Val Val Arg Pro Ser Val Ala Ser Lys Val Val Leu Pro Ile

                325                 330                 335

Ser Ile Tyr Ala Lys Ile Pro Gln Leu Gly Phe Asn Val Glu Glu Tyr

            340                 345                 350

Ser Met Val Gly Tyr Glu Ala Met Ala Leu Tyr Asn Met Ala Thr Pro

        355                 360                 365

Val Ser Ile Leu Arg Met Gly Asp Asp Ala Lys Asp Lys Ser Gln Leu

    370                 375                 380

Phe Phe Met Ser Cys Phe Gly Ala Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Leu

385                 390                 395                 400

Ser Ala Leu Thr Gly Thr Glu Phe Lys Pro Arg Ser Ala Leu Lys Cys

                405                 410                 415

Lys Gly Phe His Val Pro Ala Lys Glu Gln Val Glu Gly Met Gly Ala

            420                 425                 430

Ala Leu Met Ser Ile Lys Leu Gln Phe Trp Ala Pro Met Thr Arg Ser

        435                 440                 445

Gly Gly Asn Glu Val Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gln Ile Ser Cys

    450                 455                 460

Ser Pro Val Phe Ala Val Glu Arg Pro Ile Ala Leu Ser Lys Gln Ala

465                 470                 475                 480

Val Arg Arg Met Leu Ser Met Asn Ile Glu Gly Arg Asp Ala Asp Val

                485                 490                 495

Lys Gly Asn Leu Leu Lys Met Met Asn Asp Ser Met Ala Lys Lys Thr

            500                 505                 510

Asn Gly Asn Ala Phe Ile Gly Lys Lys Met Phe Gln Ile Ser Asp Lys

        515                 520                 525

Asn Lys Thr Asn Pro Val Glu Ile Pro Ile Lys Gln Thr Ile Pro Ser

    530                 535                 540

Phe Phe Phe Gly Arg Asp Thr Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Leu Asp Tyr

545                 550                 555                 560

<210>  17

<211>  281

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<400>  17

Met Ala Asp Asn Met Thr Thr Thr Gln Ile Glu Val Gly Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Thr Asn Ala Thr Ile Asn Phe Glu Ala Gly Ile Leu Glu Cys Tyr Glu

            20                  25                  30

Arg Leu Ser Trp Gln Arg Ala Leu Asp Tyr Pro Gly Gln Asp Arg Leu

        35                  40                  45

Asn Arg Leu Lys Arg Lys Leu Glu Ser Arg Ile Lys Thr His Asn Lys

    50                  55                  60

Ser Glu Pro Glu Ser Lys Arg Met Ser Leu Glu Glu Arg Lys Ala Ile

65                  70                  75                  80

Gly Val Lys Met Met Lys Val Leu Leu Phe Met Asn Pro Ser Ala Gly

                85                  90                  95

Ile Glu Gly Phe Glu Pro Tyr Cys Met Lys Asn Ser Ser Asn Ser Asn

            100                 105                 110

Cys Pro Asn Cys Asn Trp Ala Asp Tyr Pro Pro Thr Ser Gly Lys Cys

        115                 120                 125

Leu Asp Asp Ile Glu Glu Glu Pro Glu Asn Val Asp Asp Pro Thr Glu

    130                 135                 140

Ile Val Leu Arg Asp Met Asn Asn Lys Asp Ala Arg Gln Lys Ile Lys

145                 150                 155                 160

Glu Glu Val Asn Thr Gln Lys Glu Gly Lys Phe Arg Leu Thr Ile Gln

                165                 170                 175

Arg Asp Ile Arg Asn Val Leu Ser Leu Arg Val Leu Val Asn Gly Thr

            180                 185                 190

Phe Leu Lys His Pro Asn Gly Tyr Lys Ser Leu Ser Thr Leu His Arg

        195                 200                 205

Leu Asn Ala Tyr Asp Gln Ser Gly Arg Leu Val Ala Lys Leu Val Ala

    210                 215                 220

Thr Asp Asp Leu Thr Val Glu Asp Glu Glu Asp Gly His Arg Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Ser Leu Phe Glu Arg Phe Asn Glu Gly His Ser Lys Pro Ile Arg

                245                 250                 255

Ala Ala Glu Thr Ala Val Gly Val Leu Ser Gln Phe Gly Gln Glu His

            260                 265                 270

Arg Leu Ser Pro Glu Glu Gly Asp Asn

        275                 280

<210>  18

<211>  1111

<212>  DNA

<213>  乙型流感病毒

<400>  18

agcagaagca cgcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt      60

tcattgacag aagatggaga aggcaaagca gaactagcag aaaaattaca ctgttggttc     120

ggtgggaaag aatttgacct agactctgcc ttggaatgga taaaaaacaa aagatgctta     180

actgacatac agaaagcact aattggcgcc tctatctgct ttttaaaacc caaagaccag     240

gaaagaaaaa gaagattcat cacagagccc ctatcaggaa tggggacaac agcaacaaaa     300

aagaagggcc tgattctagc tgagagaaaa atgagaagat gtgtgagctt ccatgaagca     360

tttgaaatag cagaaggcca tgaaagctca gcgttactat attgtctcat ggtcatgtac     420

ctgaatcctg gaaattattc aatgcaagta aaactaggaa cgctctgtgc tttgtgcgaa     480

aaacaagcat cacattcaca cagggctcat agcagagcag cgagatcttc agtgcctgga     540

gtgagacggg aaatgcagat ggtctcagct atgaacacag caaaaacaat gaatggaatg     600

ggaaaaggag aagacgttca aaaactggca gaagaactgc aaagcaacat tggagtattg     660

agatctcttg gggcaagtca aaagaatggg gaaggaattg caaaggatgt aatggaagtg     720

ctaaagcaga gctctatggg aaattcagct cttgtgaaga aatacctata atgctcgaac     780

catttcagat tctttcaatt tgttagatag ctaaaagggg ccaaataaag agacaataaa     840

cagagaggta tcaattttga gacacagtta ccaaaaagaa atccaggcca aagaagcaat     900

gaaggaagta ctctctgaca acatggaggt attgagtgac cacatagtaa ttgaggggct     960

ttctgctgaa gagataataa aaatgggtga aacagttttg gaggtagaag aattgcatta    1020

aattcaattt ttactgtact tcttactatg catttaagca aattgtaatc aatgtcagca    1080

aataaactgg aaaaagtgcg ttgtttctac t                                   1111

<210>  19

<211>  109

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<400>  19

Met Leu Glu Pro Leu Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser

1               5                   10                  15

Ala Leu His Phe Met Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Arg

            20                  25                  30

Arg Gly Val Asn Leu Lys Ile Gln Ile Arg Asn Pro Asn Lys Glu Ala

        35                  40                  45

Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Asn Tyr Gln Lys Glu Ile

    50                  55                  60

Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Lys Ile Leu Ser Asp Asn Met Glu Val

65                  70                  75                  80

Leu Gly Asp His Ile Val Val Glu Gly Leu Ser Thr Asp Glu Ile Ile

                85                  90                  95

Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Val Glu Glu Leu Gln

            100                 105

<210>  20

<211>  11

<212>  PRT

<213>  乙型流感病毒

<400>  20

Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys

1               5                   10

Claims (31)

1.包含PA、NP和NS基因区段的流感病毒，其中

(a)所述PA基因区段包含在核苷酸位置2272处的胸腺嘧啶；

(b)所述NP基因区段编码具有氨基酸序列的NP蛋白，所述氨基酸序列包含选定氨基酸，其中所述选定氨基酸包含在第40位的丝氨酸、在第161位的天冬酰胺或甘氨酸、在第204位的苏氨酸和任选地在第93位的缬氨酸；以及

(c)所述NS基因区段包含在核苷酸位置39处的鸟嘌呤，并且所述NS基因区段编码具有包含选定氨基酸的氨基酸序列的NS1蛋白，所述选定氨基酸包含在第176位的谷氨酰胺。

2.如权利要求1所述的流感病毒，其中所述PA基因区段具有由SEQ ID NO：10表示的核苷酸序列。

3.如权利要求1或2所述的流感病毒，其中所述NP基因区段具有由SEQ ID NO：11表示的核苷酸序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的流感病毒，其中所述PA基因区段编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：15的PA蛋白。

5.如权利要求1-4中任一项所述的流感病毒，其中所述NP基因区段编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：16的NP蛋白。

6.如权利要求1-5中任一项所述的流感病毒，其中所述NS基因区段具有由SEQ ID NO：12表示的核苷酸序列。

7.如权利要求1-6中任一项所述的流感病毒，其中所述NS基因区段编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：17的NS1蛋白。

8.如权利要求1-7中任一项所述的流感病毒，其中在Vero细胞系中至少10次连续传代后，所述选定氨基酸在NP和NS蛋白中的至少一种中是保守的。

9.如权利要求1-8中任一项所述的流感病毒，其中在稳定表达乙型流感病毒的BM2离子通道蛋白的Vero细胞系中至少10次连续传代后，所述选定氨基酸在NP和NS蛋白中的至少一种中是保守的。

10.如权利要求1-9中任一项所述的流感病毒，其中所述流感病毒是重组流感病毒。

11.如权利要求1-10中任一项所述的流感病毒，其中所述病毒还包含PB基因区段。

12.如权利要求1-11中任一项所述的流感病毒，其中所述病毒还包含NA基因区段和HA基因区段。

13.如权利要求12所述的流感病毒，其中所述HA基因区段编码具有在HA2中包含至少一个氨基酸突变的氨基酸序列的HA蛋白。

14.如权利要求13所述的流感病毒，其中HA2中的所述至少一个氨基酸突变是第61位的谷氨酸。

15.如权利要求13所述的流感病毒，其中HA2中的所述至少一个氨基酸突变是第112位的谷氨酸。

16.如权利要求1-15中任一项所述的流感病毒，其中所述PA、NP和NS基因区段来源于单一流感毒株。

17.如权利要求16所述的流感病毒，其中所述HA基因区段来源于不同于所述PA、NP和NS基因区段所源自的单一流感毒株的流感毒株。

18.如权利要求16或17所述的流感病毒，其中所述NA基因区段来源于不同于所述PA、NP和NS基因区段所源自的单一流感毒株的流感毒株。

19.如权利要求1-18中任一项所述的流感病毒，其还包含突变的M基因区段。

20.如权利要求19所述的流感病毒，其中所述流感病毒不编码功能性M2蛋白。

21.如权利要求1-20中任一项所述的流感病毒，其中所述病毒能够在人细胞中复制。

22.如权利要求1-21中任一项所述的流感病毒，其中与在相同条件下在Vero细胞中除了没有所述选定氨基酸之外其余均相同的流感病毒相比，所述病毒具有增强的生长。

23.药物制剂，其包含权利要求1-22中任一项所述的流感病毒。

24.如权利要求23所述的药物制剂，其中所述药物制剂是疫苗。

25.如权利要求24所述的药物制剂，其中所述疫苗被配制成单价疫苗。

26.如权利要求24所述的药物制剂，其中所述疫苗被配制成二价疫苗。

27.如权利要求24所述的药物制剂，其中所述疫苗被配制成三价疫苗。

28.如权利要求24所述的药物制剂，其中所述疫苗被配制成四价疫苗。

29.引发哺乳动物中免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用权利要求1-22中任一项所述的流感病毒或权利要求23-28中任一项所述的药物制剂，从而在所述哺乳动物中引发针对所述流感病毒的免疫应答。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

31.产生权利要求1-22中任一项所述的流感病毒的方法，所述方法包括在Vero细胞系中连续传代流感病毒。

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