TW201910510A - 適用於黏膜傳遞之冷適應且去除毒力因子之減毒活疫苗 - Google Patents

Abstract

本發明提供適用於鼻腔給藥的減毒活流感疫苗的醫藥組合物及方法，該疫苗使用缺乏毒力因子的冷適應流感病毒，並且包括提供足以用於生產疫苗的複製能力的突變。據此生產的疫苗為非接種菌株提供了顯著的交叉保護。該疫苗對於2歲以下的兒童及49歲以上的成年人是安全的。此外，冷適應毒力因子缺失的流感病毒可以適應於提供對於非流感病原體的免疫力。

Description

適用於黏膜傳遞之冷適應且去除毒性因子之減毒活疫苗

本發明之技術領域係為疫苗，特別係提供保護以免受病毒疾病之疫苗。

以下敘述包括有助於理解本發明之資訊，而非承認該資訊係先前技術或與本發明申請案相關，亦非承認本案所明示或暗示引用的任何公開文獻為先前技術。

流行性感冒(流感)的年度疫情及大流行造成重大的疾病及健康負擔，且伴隨由併發症所導致的高死亡率。據估計，每年約有5~10%的成年人及20~30%的兒童感染季節性流感病毒，其中感染的200~500萬人可能患有重症，且每年多達50萬人死亡，這代表了全球的重大健康負擔。

流感疫苗的接種被認為是減輕季節性流感引起的疾病負擔與死亡率以及預防人類進一步/未來發生大流行的最有效途徑。目前，市面上有兩種類型的流感疫苗，裂解(即非活性病毒)疫苗(其可從幾家製造商取得)及冷適應減毒(即活病毒)疫苗(例如，來自阿斯特捷利康股份有公司(Medimmune®)的流感病毒疫苗(Flumist®))。長期以來，兩種疫苗方法都具有缺點。

目前的裂解流感疫苗(split flu vaccines)無法在短時間內準備完成，因此對應於快速新興的病毒株中效用有限。例如，在2009年的大流行中，需要近9~12個月才能提供第一批人類疫苗。此外，裂解疫苗具有眾所周知的較差的免疫原性，尤其是對於老年人及幼兒而言。另外，裂 解疫苗通常受限於特定的亞型。它們通常無法提供令人滿意地保護，因為他們在跨基因型及跨基因型亞型時完全不起作用。因此，現仍亟需針對常見病毒表位能夠產生更高力價中和抗體的免疫原性疫苗的方法，其可以提供針對兩種相同基因型或亞型的病毒的保護。

相對地，目前的冷適應減毒活疫苗(live attenuated vaccines，LAIV)相較於裂解疫苗具有較佳的免疫原性。然而，這種減毒活疫苗目前僅核准用於2至49歲的人(因其對於在2歲以下或超過49歲的人具有潛在的致病能力)。不幸的是，這種疫苗在非常年輕及較年長的成年人身上具有最大的價值。同時，應了解的是，根據CDC的初步數據，從2013年到2016年減毒活疫苗的劑型顯示相對較差或相對較低的有效性，這限制了流感疫苗對最需要的群體的效益。快速生產低成本、豐富及有效的疫苗(能夠誘導強健的免疫反應)對於干預及預防流行性感冒，特別是幼兒及老年人的季節性流感，是至關重要的。

自1997年在香港有人類感染禽流感H5N1病毒的第一次記錄以來，人類感染其他亞型的禽流感病毒，包括H9N2、H7N7、H6N1、H7N9、H5N6及H10N8也已出現在其他國家，而這些禽流感病毒亞型在這些國家的家禽間循環。在這些新興的流感病毒中，自2003年以來，已經從16個國家中確診了858例人類感染H5N1病毒；其中有453例是致命的(http：//www.who.int/influenza/human_animal_ interface/2017_03_ 16_table H5N1.pdf？ua=1)。本文所載之所有公開文獻皆通過引用而納為本文揭露之一部分，如同每一個別的公開文獻或專利申請案係具體地及個別地被指示藉由引用而納入本文揭露之一部分一樣。凡參考文獻中術語的定義或用法與本文所提供的該術語的定義不一致或相反時，該術語的定義係以本文所提供者為準而不適用參考文獻中的定義。

H5N1病毒及其衍生物(H5N6及H5N2)持續傳播並導致人類感染，而2013年在中國出現的H7N9病毒也造成了超過一千人的病例，其中約30%是致命的(http：//www.wpro.who.int/ outbreaks_emergencies/H7N9/en/)。H7N9感染的偶發病例在中國持續出現，且這種亞型被認為可能造成潛在的大流行，其比H5N1病毒的威脅更大。在中國， 也已出現人類感染其他新興的禽流感病毒亞型的病例，如H10N8及H6N1。值得關切的是，這些亞型中的部分可能進一步適應人體，或者與季節性流感病毒重配(reassortant)，並造成新一波的大流行。

2009年H1N1大流行的經驗顯示，從病毒出現至人類接種疫苗的製備，有時需要6個月以上才能用於大眾。目前的流感疫苗開發不符合快速傳播性質的大流行性流感的需求。即使無法預測病毒的發生時間及亞型，但將來肯定會有新一波的大流行。

具有增強免疫原性的流行性感冒(流感)減毒活疫苗可以滿足季節性及大流行性流感疫苗的需求。減毒的活流感疫苗相較於裂解或不活化疫苗(inactivated vaccines)有幾個優點。首先，減毒活疫苗能夠在受接種者體內誘發更好的免疫反應；其次，減毒活疫苗可以使用較少量的疫苗進行免疫接種；最後，減毒活流感疫苗可以透過鼻腔給藥而容易應用。然而，目前減毒流感疫苗可能無法提供完全的保護，並且未被核准用於最需要的非常年輕及老年的群體。

目前也有技術嘗試於低溫下進行繼代培養以產生冷適應的流感病毒疫苗。例如，Seong於美國專利號7758867中描述了對攜帶六個H1N1流感病毒基因體拷貝的病毒株進行冷適應以用於疫苗。本文所載之所有公開文獻皆通過引用而納為本文揭露之一部分，如同每一個別的公開文獻或專利申請案係具體地及個別地被指示藉由引用而納入本文揭露之一部分一樣。凡參考文獻中術語的定義或用法與本文所提供的該術語的定義不一致或相反時，該術語的定義係以本文所提供者為準而不適用參考文獻中的定義。類似地，Maassab及Herlocher於美國專利號8282937中描述了攜帶某些特定突變的冷適應H1N1流感病毒作為生產地方性流行性感冒病毒疫苗的工具的用途。然而，不清楚的是，這種冷適應病毒是否能為親代血清型的流感病毒株以外的病毒株提供長期的保護。

Yang及Kemble於美國專利號8591914中討論了使用重配流感病毒作為生產多價疫苗的潛在方法，該多價疫苗能使受接種者對多種流感血清型產生免疫力，並提及該重配病毒株可以進行冷適應。然而，不清楚的是，這種方法是否能夠為非常年輕及老年的群體提供足夠的安全性。

因此，現仍亟需一種安全有效的減毒疫苗，其適用於預防人類感染，特別是流感病毒的感染。

本發明涉及提供用於產生缺乏毒力因子的減毒及冷適應性流感病毒的裝置、系統及方法，而對疫苗製造有效地再現。該病毒可用於製造適合透過鼻腔接種的疫苗。該疫苗可安全地用於2歲以下及49歲以上的個體，並提供顯著的交叉保護。該減毒及冷適應病毒也可以透過基因修飾來適應，以提供對非流感病原體的免疫力。

在本發明的一實施例中，提出一種突變型流感病毒，用於疫苗生產，該突變型流感病毒包括H1N1流感病毒基因體，其包括毒力因子活性的缺失、第一組一個或多個突變，其在缺乏毒力因子活性的情況下賦予該突變型流感病毒在37℃複製的能力、以及第二組一個或多個突變，其在低於35℃的溫度下賦予該突變型流感病毒複製的能力。該毒力因子活性的缺失可包括毒力因子基因的至少部分缺失，該毒力因子基因的至少部分缺失包括NS1基因的至少部分缺失，其延伸至該突變型流感病毒的NS1片段的57號核苷酸至528號核苷酸之外。該第一組提供複製能力的一個或多個點突變，其可以位於突變型H1N1流感病毒的M區域之外(例如，H1N1流感病毒基因體中的G346A突變)。該第二組一個或多個突變可包括一個或多個點突變，例如在H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變。

該突變型流感病毒也可以包括在低於35℃的溫度下賦予該突變型流感病毒複製能力的第三組一個或多個突變，其可以包括與第二組突變相異的一個或多個點突變，例如在H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變，該突變型流感病毒在37℃或更高的溫度下相對於35℃或更低的溫度具有較低的複製能力。

在一些實施例中，該突變型流感病毒包括一個編碼外源性抗原的基因的插入，該外源性抗原可以衍生自人類病原體，例如病毒(例如流感病毒、嚴重急性呼吸系統綜合症病毒(SARS virus)、中東呼吸綜合症病毒(MERS virus)、茲卡病毒(Zika virus)、肝炎病毒、乳突病毒(papilloma virus)及伊波拉病毒(Ebola virus))、細菌、真菌及/或寄生蟲。在其他實施例中，該突變型流感病毒包括一個編碼內源性抗原的基因的插入，該內源性抗原與疾病狀態相關，例如癌症相關抗原及與阿茲海默症相關的tau蛋白。

本發明的另一個實施例是一種如上所述的突變型流感病毒，其中該突變型流感病毒適用於配製減毒活疫苗，該減毒活疫苗適用於經黏膜接種該減毒活疫苗。

本發明的另一個實施例是一種減毒活疫苗，包括經修飾的H1N1流感病毒，其具有毒力因子活性缺失的基因體、第一組一個或多個突變，其在缺乏該毒力因子活性的情況下賦予複製的能力、第二組一個或多個突變，其在低於35℃的溫度下賦予複製的能力，該經修飾的H1N1流感病毒足量存在，以在免疫接種時提供保護，該疫苗包括載體，且被配製為將該減毒活疫苗與黏膜接觸以進行疫苗接種；在一些實施例中，該毒力因子基因的缺失包括毒力因子基因的至少部分缺失，例如NS1基因的至少部分缺失，其延伸至該突變型流感病毒的NS1片段的57號核苷酸至528號核苷酸之外；在一些實施例中，該第一組一個或多個突變包括提供複製的能力的第一組一個或多個點突變，其可以位於該經修飾的H1N1流感病毒的M區域之外(例如，H1N1流感病毒基因體中的G346A突變)；在一些實施例中，該第二組一個或多個突變包括第二組一個或多個點突變，例如在H1N1流感病毒基因體中的T261G及/或A310G突變。在本發明中，該經修飾的病毒用於一種本發明提出的減毒活疫苗，其可以包括在低於35℃的溫度下賦予該減毒活疫苗複製能力的第三組一個或多個突變，例如在H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變，該突變型流感病毒在37℃或更高的溫度下相對於35℃或更低的溫度具有較低的複製能力。

在一些實施例中，該減毒疫苗包括一種突變型流感病毒，其具有一個編碼外源性抗原的基因的插入，例如人類病原體，適合的人類病原體例如是包括病毒(例如流感病毒、嚴重急性呼吸系統綜合症病毒、中東呼吸綜合症病毒、茲卡病毒、肝炎病毒、乳突病毒及伊波拉病毒)、細菌、真菌及寄生蟲。在一些實施例中，該減毒疫苗包括一種突變型流感病毒， 其具有一個編碼內源性抗原的基因的插入，該內源性抗原與疾病狀態相關，例如癌症相關抗原及/或tau蛋白。

如上所述，本發明提出的疫苗可以包括載體。在一些實施例中，該載體包括佐劑及/或免疫增強劑，適合的免疫增強劑包括TLR-7促效劑，例如咪喹莫特(imiquimod)。

由於缺乏至少部分毒力因子及適應降低的溫度的減毒活疫苗用於兩歲以下及/或49歲以上的人類是安全的。該減毒活疫苗在以該減毒活疫苗提供保護並用高致死劑量病原體接種的動物模型中有效提供至少20%的存活率，這種病原體係於該動物模型鼻內接種該減毒活疫苗至少兩週後進行接種。

本發明的另一個實施例是一種生產適用於減毒活疫苗的經修飾型流感病毒的方法，該方法包括從一種H1N1流感病毒中缺失毒力因子活性以產生第一突變型病毒；在37℃或37℃以上的哺乳動物細胞株中繁殖該第一突變型病毒以產生具有複製能力的第二突變型病毒，該第二突變型病毒包括第一組一個或多個突變；以及在35℃或35℃以下的禽蛋系統中繁殖該第二突變病毒以產生冷適應的第三突變型病毒，該第三突變型病毒包括第二組一個或多個突變。在一些實施例中，該毒力因子活性的缺失包括NS1基因的至少部分缺失，且其中該NS1基因的至少部分缺失延伸至NS1片段的57號核苷酸至528號核苷酸之外。在一些實施例中，該第一組一個或多個突變係第一組一個或多個點突變，其提供該第一突變型病毒複製能力，且可以位於該突變型H1N1流感病毒的M區域之外(例如，H1N1流感病毒基因體中的G346A突變)。該第二組一個或多個突變係第二組一個或多個點突變，例如在H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變。在一些實施例中，該第三突變型病毒包括第三組一個或多個突變，其與第二組突變是相異的，且在低於35℃的溫度下賦予該第三突變型病毒複製能力，例如在H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變，該第三突變病毒在37℃或更高的溫度下相對於35℃或更低的溫度具有較低的複製能力。

在一些實施例中包括一個步驟，該步驟係將編碼外源性抗原 的基因插入H1N1流感病毒。在該實施例中，該外源性抗原可以衍生自人類病原體，例如病毒(例如流感病毒、嚴重急性呼吸系統綜合症病毒、中東呼吸綜合症病毒、茲卡病毒、肝炎病毒、乳突病毒及伊波拉病毒)、細菌、真菌及/或寄生蟲。在其他實施例中，編碼內源性抗原的基因被插入，該內源性抗原與疾病狀態相關，例如癌症相關抗原及/或tau蛋白。

根據以下對各實施例的敘述以及圖式內容，將使本發明中的各種目的，特徵，實施態樣和優點更臻顯著，其中相似的元件符號表示相似的元件。

圖1示例性地描述用於產生可複製及冷適應的DelNS1流感病毒(冷適應CA04-DelNS1)的示例性過程。

圖2顯示在G346A(D101N)位置的NP突變的定序數據，儘管缺失毒力因子，其已被發現支持MDCK細胞及胚胎雞卵中的DelNS1病毒複製。

圖3顯示在T261G(L79V)及A310G(E95G)位置的NEP突變的定序數據，其已被發現支持冷適應的DelNS1病毒的複製。

圖4描繪了冷適應CA4-DelNS1病毒在33℃及39℃下的生長特性。

圖5顯示冷適應CA4-DelNS1病毒在不同溫度下進行培養的噬菌斑尺寸的照片。

圖6顯示了本揭露所提出的疫苗對受到小鼠適應PR8(H1N1)病毒致命性攻擊的動物模型所提供的保護力。

圖7顯示了本揭露所提出的疫苗對受到A/越南/1194/04(H5N1)病毒致命性攻擊的動物模型所提供的保護力。

圖8顯示了本揭露所提出的疫苗對受到A/越南/1194/04(H5N1)病毒高致命性攻擊的動物模型所提供的保護力。

圖9顯示了在單次鼻滴免疫接種後，本揭露所提出的疫苗對受到A/浙江/1/RG/2013(H7N9)病毒高致命性攻擊的動物模型所提供的保護力。

圖10顯示了在2次鼻滴免疫接種後，本揭露所提出的疫苗對受到A/ 浙江/1/RG/2013(H7N9)病毒高致命性攻擊的動物模型所提供的保護力。

圖11顯示了免疫接種經過冷適應的DelNS1流感病毒進行以提供對MERS的保護力的相關數據，該DelNS1流感病毒攜帶有編碼本揭露所提出的MERS抗原的基因。

圖12顯示經Adv-PP4處理的小鼠肺組織學照片，小鼠係以帶有MERS抗原基因的冷適應DelNS1流感病毒作為疫苗進行接種或以PBS作為假疫苗進行接種後，以MERS冠狀病毒進行感染。

以下之敘述包括有助於理解本發明之資訊，而非承認該資訊係先前技術或與本發明申請案相關，亦非承認任何本案所明示或暗示引用的公開文獻為先前技術。以下討論提供了本發明的許多示範性實施例，雖然每個實施例都代表本發明元件的一種組合，但本發明仍應包括揭露之元件的所有可能的組合。因此，如果一個實施例包括元件A、B及C，而第二實施例包括元件B及D，即使未明確揭露，本發明仍應理解為包括A、B、C或D的其他剩餘組合。

本揭露描述了使DelNS1病毒能有效複製的必要突變的發展方式，以及為DelNS1病毒提供冷適應的突變。NS1是流感病毒的毒力基因，NS1蛋白在拮抗宿主抗病毒反應及支持病毒複製中扮演重要的角色。這些特異性突變所提供的有效複製對於高病毒產量至關重要，高產量是流感疫苗開發的基本要素。透過這些特異性突變所提供冷適應的免疫病毒有助於用作為減毒活疫苗，例如可以經由呼吸道(例如鼻腔或經由吸入)方便及安全地施用的疫苗。

本揭露也描述了將新發現及建立的病毒發展成疫苗。本揭露還描述了這種新發展出的疫苗具有安全性的改善以及令人驚奇的極大功效。發明人認為以DelNS1病毒為基礎並具有這些特異性突變的疫苗也可以安全地用於兩歲以下及50歲以上的人。

應當理解的是，本揭露所公開的技術提供了許多有利的技術效果，包括改善對各種流感病毒株的保護，以及改善對於非常年輕及老年 群體的安全性。

還應當理解的是，鼻內或黏膜應用的便利性(在不產生注射相關的不適症狀而仍能提供保護的情況下)與本揭露所公開的改善的安全性及對各種流感病毒株更好的功效/保護互相結合，特別是進一步加上免疫增強劑的使用。適合的免疫增強劑包括TLR-7促效劑。在本揭露的較佳實施例中，免疫增強劑是咪喹莫特(已被證明可進一步增強對流感疫苗的免疫反應)。利用這種鼻內或黏膜應用會進一步增強對一般群體的整體效用及保護，包括非常年輕(即2歲以下)及老年人(即49歲以上)的群體。

在一些實施例中，用於描述及要求保護本發明某些實施例之表示成分的量、特性(例如濃度、反應條件等等的數字，應理解為在一些情況下以用語「大約」加以修飾。因此，在一些實施例中，本說明書及所附之申請專利範圍中所記載的數值參數是近似值，其可依據特定實施例所試圖獲得之所需特性而改變。在一些實施例中，應根據所記載之有效位數的數字及應用一般的數值簡化技術來解釋數值參數。儘管闡述本發明一些實施例的廣泛範圍的數值範圍及數值參數是近似值，但在具體實例中所提出的數值則是盡可能地精確記載。在本發明一些實施例中所記載的數值可能包含某些誤差，其係由存在於它們各自試驗測量中的標準差所必然產生的誤差。

如在本文所使用的描述及整個要求保護的內容中，除非上下文另有明確規定，否則「一」、「其」及「該」包括複數的含義。此外，如本說明書中所使用的描述，除非上下文另有明確規定，「在」的含義包括「在…內」及「在…上」。

本發明中數值範圍的敘述僅意在作為一一指稱各個落在該範圍內的單獨數值的簡寫方法。除非另有說明，在範圍內的每個單獨數值皆被納為本說明書揭露之一部分，如同其於本文中一一被指稱。除非另有說明或者與上下文明顯矛盾，本發明所述的所有方法可以以任何適合的順序進行。在本發明某些實施例中使用的任何和所有範例或示範性語詞(例如「舉例來說」)僅旨在更清楚的說明本發明，並非限制本發明所要求的保護範圍。說明書中的任何語詞不應解釋為未見於申請專利範圍中但為實施 本發明的必要元素。

本文所揭露之替代元件或實施例之群組不應解釋為本發明之限制。每個群組成員可被單獨地提及和要求保護，或者係以與該群組內其他成員或本文中其他元件任意結合的方式被提及和要求保護。基於便利性及/或專利性的理由，群組中之一個或多個成員可以納入在群組中或自群組中刪除。當發生任何前述之納入或刪除的情況時，說明書應被視為包括修改後之群組，從而滿足所附之申請專利範圍中使用的所有馬庫西式群組之書面說明要件。

在本揭露的一些實施例中，可以在免疫病毒株中降低及/或消除毒力因子的表現。在較佳地實施例中，是透過剪除毒力因子的全部或部分基因(例如，編碼NS1蛋白的基因)來達成。已經從流感病毒株中剪除毒力因子的實例是DelNS1，其中已經剪除了編碼NS1蛋白的內含子，由剪除所造成的該缺失必然對所得的病毒之複製及繁殖的能力產生不利的影響。令人驚訝的是，發明人發現在37℃下利用繼代培養哺乳動物細胞株的方法，致使該毒力因子缺失的流感病毒進行增殖，同時該病毒額外具有在沒有毒力因子的情況下其仍能使其有效複製的的突變，該突變可以在不存在毒力因子基因的情況下仍能使其進行複製是獨一無二的。

缺乏毒力但具有複製能力的特性對流感病毒而言有利於將其作為疫苗使用，而如果額外具備可降低接種後全身性感染的發生機率此一特性，也是有幫助的。發明人發現，在低溫下(例如，透過在30℃的胚胎雞蛋)繼代培養具有該毒力因子缺失突變的病毒，可以分離出冷適應的DelNS1病毒。在正常體溫(例如37℃)下，這種冷適應病毒株的複製被抑制，使得複製出的群體隔離在具有較低溫度(例如鼻腔)的身體區域中。

該冷適應的DelNS1病毒被發現是無毒的，並且比現有技術(即可商業購得的)冷適應的減毒活疫苗能夠更有效地防禦來自異亞型病毒的致命性攻擊。由於毒力因子從該冷適應的DelNS1病毒基因體中被剪除，並且與現有技術所建立的病毒流感疫苗株相較，該病毒適於在更低溫的環境下複製，所以使用本揭露所提出的病毒製備的疫苗更為安全，且能夠在最脆弱的群體(亦即老年人及幼兒)中使用。

具體地，發明人發現透過基因工程剪除毒力基因(例如NS1)的流感病毒，其透過在哺乳動物細胞株(例如MDCK細胞)以常規溫度(例如37℃)繼代方式培養，雖然其缺乏毒力因子，但仍可以提供支持病毒有效複製的突變。發明人還發現，透過在宿主細胞(例如在胚胎卵中發現)中於低溫(即小於37℃)環境下繼代培養的方式，可以提供額外的突變，該額外的突變賦予該突變病毒冷適應的能力。前述的低溫環境可以是約35℃、約33℃、約30℃、約27℃或小於27℃。

本揭露提供了一種裝置、系統及方法，其中該疫苗株可以克服當前流感疫苗的限制並且滿足所需群體用於防範季節性流感及大流行的需求。該疫苗可以使用具有以下突變的減毒活病毒來開發：(1)毒力因子缺失，(2)在沒有毒力因子的情況下提供該病毒有效的複製，以及(3)提供冷適應。本揭露內容包括三個部分：首先，開發一種DelNS1減毒流感病毒(例如缺失非結構基因1的流感病毒)，其包括在基因體的M區域中所發生的新突變，該突變允許病毒在沒有毒力因子的情況下有效地繁殖。該有效繁殖對於實際製造流感疫苗是必要的。其次，該突變病毒令人驚奇地被發現可以進一步冷適應。該發現允許一系列新突變的開發，以提供冷適應的毒力因子缺失的流感病毒。該冷適應可賦予該流感病毒經由呼吸道或黏膜途徑有效傳遞病毒疫苗製劑的能力。甚至更令人驚奇的是，透過這樣一個雙管齊下的修飾處理(即NS1缺失及用新發現的突變進行冷適應)所開發的病毒株仍然可產生高病毒力價，這個特性對疫苗生產是非常有用的。最後，透過這種雙重修飾及冷適應，使得這種高度修飾的病毒製備的疫苗能夠在鼻內傳遞，發明人發現以這種方式所產生的疫苗在動物研究中顯示出優異的安全性。令人驚奇地是，其改善了與其他(即非免疫)流感病毒株的交叉反應性，並且比先前的鼻內疫苗的黃金標準(包括唯一可用於人類受試者的鼻內流感疫苗)更有效。

發明人還發現這種流感疫苗可以透過同時使用咪喹莫特來增強對於兩種相同的病毒株及跨物種的免疫原性。2015年7月17日提交的美國臨時專利申請號62/194,136中描述了使用咪喹莫特及類似化合物以增強各種疫苗接種組合物的免疫原性。

在本揭露的一個實施例中，流感病毒係已利用毒力因子缺失進行修飾，並且接著發展出至少一個在不具有毒力因子的情況下能使該病毒能有效複製的突變以及至少一個讓該病毒具有冷適應能力的額外突變，其係作為插入一或多種源自非流感病原體基因的載體或“骨架”。這種經修飾的病毒可以作為減毒活疫苗的基礎，其提供臨床上有效的保護及/或治療非流感病原體的感染。在較佳的實施例中，可以經由黏膜有效地施用疫苗。適合的非流感病原體的實例包括SARS、MERS、Zika病毒、肝炎病毒、乳突病毒及伊波拉病毒等。特別的是，發明人發現將MERS的受體結合結構域(receptor-binding domain，RBD)插入至該修飾的流感病毒骨架中，可以用於經鼻施用的疫苗中，該疫苗賦予DPP4轉導(DPP4-transduced)小鼠對MERS感染的保護。該DPP4轉導的小鼠通常用作MERS疫苗開發的鼠類模型。發明人也成功地將Zika病毒的RBD結構域併入該修飾的流感病毒的骨架中。雖然使用了如上所述的病毒抗原，但編碼來自細菌、原生動物、真菌及/或寄生蟲的抗原基因也可以併入用於疫苗製備的此種經修飾的流感病毒骨架中。本揭露更提出了可以將其它免疫標靶(包括與疾病狀態相關的內源性(即人類))抗原(例如癌症相關抗原及/或tau蛋白))併入該載體並表現。因此，此平台可以用作初級預防及預防癌症復發中的兩種或任一種癌症疫苗(治療性及/或預防性)，或者作為阿茲海默症及其他與tau蛋白斑塊相關疾病的治療。

本揭露的方法可用來開發出各種突變。例如，儘管缺失了NS1毒力因子的至少部分基因，位於流感病毒基因體M區域內的A14U及G917A突變分別可以支持DelNS1 A/WSN/33(H1N1)及DelNS1 H7N9病毒的複製。然而，應當理解的是，病毒基因體的其它非M區域中的突變也是可以利用。例如，在本揭露的一些實施例中，流感病毒基因體的核鞘蛋白(nucleocapsid protein，NP)片段中的突變可以支持已經剪除編碼NS1毒力因子的內含子的流感病毒的複製。這種DelNS1病毒在小鼠中是無毒的，並且可以對各種亞型的流感病毒產生交叉保護。賦予類似性質的突變可以從目前季節性流感病毒流行株(例如，2009 H1N1病毒株在2009年大流行之後，已經變成人類的季節性流感病毒的流行株其中之一)中開發出來。

在本揭露的一個實施例中，係從2009 H1N1病毒株A/加州(California)/04/09開發出一種DelNS1病毒株，其中NS1編碼內含子的延伸部分或全部(例如延伸超過57號核苷酸至528號核苷酸所涵蓋的片段)已被刪除。利用本揭露所提出的方法，發展出在核鞘蛋白(NP)區域內具有G345A突變的流感病毒的DelNS1病毒株，其能夠在細胞培養及雞蛋中有效複製。令人驚訝的是，這種新的適應性突變顯著不同於DelNS1 A/WSN/33及H7N9病毒的M區域突變，且先前其沒有被報導過為DelNS1流感病毒的突變。

利用衍生自A/加州/04/09病毒株的可複製DelNS1 2009 H1N1病毒，本揭露所提出的方法已經成功地生產了DelNS1冷適應H1N1疫苗株，例如冷適應CA4-DelNS1。令人驚訝的是，這種雙重修飾可以使所提供的流感病毒產生高病毒力價，例如落入可用於疫苗生產範圍內的病毒力價。應當理解的是，現有技術(即經商業化的)減毒活流感疫苗(例如：Flumist®)依賴於衍生自H2N2病毒株(A/安納保(Ann Arbor)/6/60)的“骨架”的冷適應特徵的性質。衍生自該骨架的冷適應減毒疫苗僅被FDA核准用於2歲至49歲年齡群組中。FDA的使用限制列舉了在這些年齡群組及具有某些潛在條件的群組中使用的顧慮，因為唯一的減毒條件是疫苗株的突變僅使該病毒在下呼吸道的較高溫度環境下其複製受到限制。不幸的是，這些年齡群組對流感感染的死亡率相對較高。應當理解的是，根據本揭露所開發的疫苗對接受疫苗的受試者提供雙重保護機制，因為新型疫苗株中的DelNS1突變與賦予冷適應的突變兩者的結合提供了更高水平的安全性而不犧牲效力。

如上所述，將具有可使其具備複製能力突變的流感病毒DelNS1病毒株在低溫(即低於37℃)下利用含胚卵進行繼代培養使該病毒株發展出賦予該病毒株冷適應性的突變。在這方面有許多突變可資利用。例如，在核輸出蛋白(nuclear export protein，NEP)中的新突變-T261G及A310G-係與DelNS1 H1N1疫苗株的冷適應性質相關。值得注意的是，這些突變截然不同於作為現有商業化減毒疫苗的骨架的A/安納保/6/60病毒株中所存在的突變。令人驚訝的是，這種DelNS1冷適應H1N1病毒(例如 Ca4-DelNS1病毒)能夠有效地複製，並且藉此可以得到能夠在含胚卵中穩定複製該病毒疫苗株的操作流程。令人驚訝的是，其複製能力能夠近似於在雞蛋中培養的野生型病毒。

有利地是，這種冷適應突變被發現在較高溫環境下(例如生理溫度)限制DelNS1冷適應流感病毒的生長。例如，該病毒會在30℃至33℃下複製，但在37℃至39℃下其生長係受到限制。這顯示冷適應CA4-DelNS1病毒的複製在較高的溫度如37°至39℃可被限制。這種生長的限制顯示了本揭露所提出的冷適應Del1NS1流感病毒適合用於減毒活疫苗的用途，特別是作為減毒活疫苗株，其可以透過經由黏膜組織而被有效地施用。使用本揭露提出的冷適應DelNS1病毒株所產生的疫苗製劑已經被發現在小鼠中不會產生明顯的致病作用。

如下所示，使用本揭露提出的冷適應DelNS1流感病毒所製備的疫苗，提供小鼠對各種高致病性流感病毒株致死劑量攻擊的交叉保護。在許多病毒攻擊實驗中，冷適應的DelNS1疫苗株提供比現有技術Flumist®冷適應H1N1疫苗更好的保護。例如，用冷適應的CA4-DelNS1病毒產生免疫的小鼠與用Flumist®冷適應CA7疫苗株產生免疫的小鼠比較，其體重減輕較少且具有較高的存活率。當用高致死劑量的H5N1或H7N9病毒攻擊小鼠時，其效果甚至更為明顯。

實驗例

透過反向遺傳操作，將加州(California，CA)/04/09病毒株在56-529位置剪除內含子，藉此建構CA4-DelNS1病毒。將所拯救的病毒(rescued virus)進行繼代培養，直到DelNS1病毒在37℃下的MDCK細胞中能夠穩定複製。確認突變的序列後，進一步將CA(cold adapted，冷適應)4-DelNS1病毒進行冷適應使其在低溫下進行複製，其係藉由在30℃下於雞含胚卵中進行繼代培養，直到病毒力價穩定。該過程的示意圖如圖1所示。

在MDCK細胞中繼代培養後，對CA4-DelNS1進行序列分析。結果顯示在NP片段中發生一個G至A的適應性取代(G346A，相當於蛋白質序列中的D101N)。該取代被發現支持CA4-DelNS1病毒在MDCK 細胞及雞蛋中的複製。CA4-DelNS1病毒的非突變(P1)及突變病毒株的序列分析結果如圖2所示。

在30℃下於雞含胚卵中進行繼代培養及穩定其複製來進行冷適應後，對CA4-DelNS1病毒進行序列分析。在NS片段的NEP編碼區中鑑定並驗證出了兩個適應性取代：T261G(L79V)及A310G(E95G)。CA4-DelNS1病毒的非突變(P1)及突變病毒株的序列分析結果如圖3所示。

分別在低溫(33℃)及高溫(39℃)下多次循環複製後，在MDCK細胞中檢測冷適應CA4-DelNS1病毒的生長動力學。結果如圖4所示。

在軟瓊脂平皿上，使用MDCK細胞來評估冷適應CA4-DelNS1病毒在33℃、37℃及39℃下形成噬菌斑的特性。結果如圖5所示。

使用冷適應CA4-DelNS1病毒及Flumist® H1N1疫苗，以鼻滴法進行單次免疫，一組為6隻小鼠。免疫兩週後，用致死劑量(10 MLD50)的PR8(H1N1)病毒以接種方式來攻擊小鼠。病毒攻擊後記錄兩週的體重變化及存活率，結果如圖6所示。使用鼻滴免疫接種冷適應CA4-DelNS1病毒所提供的保護作用是顯而易見的，其提供近80%的存活率。

使用冷適應CA4-DelNS1病毒及Flumist® H1N1疫苗，以鼻滴法進行單次免疫，一組為6隻小鼠。免疫兩週後，用致死劑量(100 MLD50)的A/越南/1194/04(H5N1)病毒以接種方式來攻擊小鼠。病毒攻擊後記錄兩週的體重變化及存活率，結果如圖7所示。使用鼻滴免疫接種冷適應CA4-DelNS1病毒所提供的保護作用是顯而易見的，其提供近80%的存活率，且體重減輕不顯著。

使用冷適應CA4-DelNS1病毒及Flumist® H1N1疫苗，以鼻滴法各自進行2次免疫，時間間隔為兩週，一組為6隻小鼠。第二次免疫兩週後，用致死劑量(1000 MLD50)的A/越南/1194/04(H5N1)病毒以接種方式來攻擊小鼠。病毒攻擊後記錄兩週的體重變化及存活率，結果如圖8所示。使用鼻滴免疫接種冷適應CA4-DelNS1病毒所提供的保護作用是顯而易見的，其提供近80%的存活率。

使用冷適應CA4-DelNS1病毒及Flumist® H1N1疫苗，以鼻滴法進行單次免疫，一組為6隻小鼠。免疫兩週後，用致死劑量(6 MLD50)的A/浙江/1/RG/2013(H7N9)病毒以接種方式來攻擊小鼠。病毒攻擊後記錄兩週的體重變化及存活率，結果如圖9所示。使用鼻滴免疫接種冷適應CA4-DelNS1病毒所提供的保護作用是顯而易見的，以此方法免疫的小鼠只有一開始其體重顯現出有輕微的減輕，之後迅速且完全恢復。

使用冷適應CA4-DelNS1病毒及Flumist® H1N1疫苗，以鼻滴法各自進行2次免疫，時間間隔為兩週，一組為6隻小鼠。第二次免疫兩週後，用致死劑量(15 MLD50)的A/浙江/1/RG/2013(H7N9)病毒以接種方式來攻擊小鼠。病毒攻擊後記錄兩週的體重變化及存活率，結果如圖10所示。使用鼻滴免疫接種冷適應CA4-DelNS1病毒所提供的保護作用是顯而易見的，以此方法免疫的小鼠顯示近20%的存活率。

如上所述，本揭露提出一種冷適應，具有複製能力的DelNS1流感病毒，其可用作為開發非流感免疫病毒株的載體或骨架。例如，編碼與人類病原體(例如細菌、真菌及/或寄生蟲)相關的外源性抗原或與人類疾病相關的內源性(即人類)抗原(例如癌症、自體免疫疾病及神經退化性疾病，例如阿茲海默症及帕金森氏症)的基因可以併入本揭露所提供的冷適應DelNS1流感病毒的基因體中。使用攜帶編碼有MERS冠狀病毒抗原的外源性基因的冷適應DelNS1流感病毒所製備的疫苗，其研究結果顯示於圖11及12中。如圖11所示，於用Adv-DPP4處理以賦予其對MERS CoV易感性的小鼠中，接種前述疫苗提供小鼠對後續MERS-CoV感染的保護，結果顯示與經類似處理但未經接種小鼠比較，其體重減輕程度降低且恢復得更快。小鼠肺組織的組織學檢測結果進一步證實其具有保護能力，如圖12所示。如圖所示，接受PBS假接種的小鼠在MERS感染後顯示嚴重肺炎，而小鼠在接種了包含冷適應DelNS1流感病毒(其具有編碼MERS抗原的基因)的疫苗，僅發生中度肺炎。

實驗操作方法

DelNS1病毒適應

1.NS1缺失質體的建構：以2009 H1N1 A/加州/04/09 (CA4)作為骨架來建構DelNS1疫苗株。利用反轉錄聚合酶連鎖反應(PCR)來建構不表現NS1的質體，其引子如下：CA04-DelNS1-529F：GACATACTTATGAGGATGTC CA04-DelNS1-56R：CTGAAAGCTTGACATGGTGTTG

2.CA04-DelNS1病毒的救援：9個質體：pHW2000-CA04-PB2、pHW2000-CA04-PB1、pHW2000-CA04-PA、pHW2000-CA04-NP、pHW2000-CA04-HA、pHW2000-CA04-NA、pHW2000-CA04-M、pHW2000-CA04-DelNS1及pCX-CA04-NS1混合在一個試管中，每個質體有1μg。在6孔盤中將293T細胞培養至滿度為80%，接著以前述混合質體進行轉染。在轉染期間，使用不含青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin)的1ml Opti-MEM替換舊的培養液。16小時後去除上清液，加入2ml含有1μg/ml胰蛋白酶的MEM。轉染後70小時，去除細胞碎片後收集上清液。

3.DelNS1病毒的繼代培養：將200微升(μl)的救援DelNS1病毒注射到9至10天齡的受精卵中，並在37℃的孵育箱中孵育48小時。收集蛋尿囊液，測定HA力價。在1500g下離心10分鐘以去除血球細胞及其它碎片。將上清液轉移到Millipore 100K超過濾器中，並以3000g的速度離心10分鐘。加入10ml PBS至過濾器中以清洗濃縮的病毒，並再以3000g的速度離心10分鐘。將所得的病毒製劑以200微升的量接種在9至10天齡的受精卵中，並重複該過程直到病毒HA力價顯著增加。

4.DelNS1病毒的序列分析：病毒HA力價穩定後，萃取病毒RNA，進行全基因體定序，以檢測突變位置。

5.將適應性病毒中所發現的突變引入骨架質體中：使用標準點突變步驟(standard site-mutagenesis protocol)將找到的適應性突變引入野生型CA4病毒中，以確認取代位置對於支持病毒複製的作用。

6.以突變質體對DelNS1病毒進行再救援

細胞及雞蛋中的生長動力學

MDCK細胞：將培養在24孔盤中滿度100%的MDCK細 胞，在37℃下以0.05 MOI的DelNS1病毒感染。吸收1小時後，去除上清液，然後每孔以500微升的PBS清洗細胞一次。用含有1μg/ml胰蛋白酶的MEM覆蓋細胞，然後將細胞孵育在37℃或33℃下。在對應的時間點收集上清液，然後離心去除細胞，並儲存在-80℃以用於噬菌斑檢定。

雞蛋：將9至10日齡的雞蛋用1000 PFU的DelNS1病毒接種。將雞蛋孵育在37℃或33℃下。在對應的時間點收集尿囊液。

噬菌斑檢定

使用十倍稀釋的DelNS1病毒感染培養在六孔盤中滿度100%的MDCK細胞，並在37℃下孵育。吸收1小時後，去除上清液，然後每孔以1ml的PBS清洗細胞一次。用含有1μg/ml胰蛋白酶的MEM覆蓋細胞，然後將培養盤倒置在33℃培養箱中。48小時後，將細胞用10%福馬林固定至少1小時，然後去除福馬林及瓊脂糖凝膠。以1%的結晶紫進行細胞染色進行噬菌斑的觀察。

小鼠實驗

將6隻8週齡的雌性BALB/C小鼠麻醉，然後用25μl含有1.35×10⁵ PFU的DelNS1病毒的PBS進行鼻內接種。接種後每天記錄小鼠體重及其他參數，持續兩週。在感染後3天將小鼠安樂死以檢測感染後其肺中的病毒力價。免疫後兩週，用對應的致死劑量病毒攻擊小鼠。兩週內每天記錄小鼠體重。在病毒攻擊後，當體重減輕大於25%時，將小鼠安樂死。

MERS疫苗的實驗操作方法

pHW2000-MERS-RBD-NEP質體的建構

pHW2000-MERS-RBD-NEP質體係建構來產生表現MERS受體結合結構域(receptor binding domain，RBD)的重組NS1缺失的流感病毒。其閱讀框(open reading frame)，係由NS1的CA04 N端、MERS RBD結構域、PTV1-2A切割位，帶有N端突變的NS1序列的CA04 NEP所構成。透過PCR從pcDNA-MERS-SPIKE質體擴增MERS-RBD-PTV1-2A的序列，然後將PCR產物插入到僅包含CA04 NEP閱讀框的pHW2000-CA04-DelNS1中，透過使用核酸外切酶III連接獨立殖株。轉形 後，從正確的轉殖株萃取質體，隨後進行定序以確認序列。

CA04-delNS1-RBD病毒的救援

9個質體：pHW2000-CA04-PB2、pHW2000-CA04-PB1、pHW2000-CA04-PA、pHW2000-CA04-NP、pHW2000-CA04-HA、pHW2000-CA04-NA、pHW2000-CA04-M、pHW2000-MERS-RBD-NEP及pCX-CA04-NS1，每個質體以1μg進行混合，並對在6孔盤中滿度80%的293T細胞，進行轉染。在轉染期間，使用不含抗生素的1ml Opti-MEM替換舊的培養液。16小時後去除上清液，加入2ml含有1μg/ml胰蛋白酶的MEM。轉染後70小時，去除細胞碎片後收集上清液。將上清液注入9至10日齡的受精卵中，並在37℃下孵育48小時。收集蛋尿囊液，並離心清除碎片。之後，將病毒進行定序，並利用MDCK細胞進行噬菌斑檢定以測定病毒力價。CA04-delNS1-RBD病毒的力價最高為2 x 10⁷pfu/ml。

動物實驗

將兩組(各六隻)6-8週齡的雌性BALB/C小鼠麻醉，然後用25μl含有5 x 10⁵ TCID₅₀的MERS-RBD-DelNS1病毒的PBS進行兩次鼻內接種，接種間隔為兩周。在MERS冠狀病毒攻擊前5天，將小鼠用50μl PBS接種2.5 x 10⁸ PFU的Adv-DPP4。在Adv-DPP4感染後的第5天，用5 x 10⁵ TCID₅₀ MERS冠狀病毒攻擊小鼠。其中一組小鼠，在兩週內每天記錄其體重變化。另一組小鼠在MERS冠狀病毒攻擊後第3天進行安樂死，取得其肺組織以進行病理學檢測及病毒力價分析。

本發明所屬技術領域具有通常知識者應當明瞭，除了前述已記載的實施例之外，可能存在其他不偏離本發明概念的修改。因此，任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。此外，在解釋說明書及申請專利範圍兩者時，所有技術用語應以與上下文一致之最廣的可能方式解釋。特別是用語「包含」及「包括」，應解釋為其係以非排他性的形式指稱元件、成分或步驟，其係表示所指稱之元件、成分或步驟可與其他未被明確提及之元件、成分或步驟一起存在、使用或結合。在說明書或申請專利範圍中提及某物的至少其中之一係選自由A、B、C…及N所組成之群組時，該內容應解釋為存在該 群組其中的一個元件即可，而非必須要有A加N、或B加N等等。

<110> 新興病毒疫苗有限公司

<120> 適用於黏膜傳遞之冷適應且去除毒力因子之減毒活疫苗

<130> 102942.0001TW

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1N1流感病毒的NP蛋白在G346A(D101N)位置的突變

<400> 1

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1N1流感病毒的NEP蛋白在T261G(L79V)及A310G(E95G)位置的突變

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DelNS1 H1N1病毒株之正向引子(CA04-DelNSA-529F)

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1N1 DelNS1 strain病毒株之反向引子(CA04-DelNS1-56R)

<400> 4

Claims (59)

1. 一種突變型流感病毒，用於疫苗的生產，包括：一經修飾的H1N1流感病毒基因體，該經修飾的H1N1流感病毒基因體包括一毒力因子活性的一缺失；一第一組一個或多個突變，該第一組一個或多個突變在缺乏該毒力因子活性的情況下賦予該突變型流感病毒在37℃複製的能力；以及一第二組一個或多個突變，該第二組一個或多個突變賦予該突變型流感病毒在低於35℃的溫度下複製的能力。
2. 如申請專利範圍第1項所述之突變型流感病毒，其中該毒力因子活性的該缺失包括一毒力因子基因的至少部分缺失。
3. 如申請專利範圍第2項所述之突變型流感病毒，其中該缺失包括一NS1基因的至少部分缺失，該NS1基因的至少部分缺失延伸至該突變型流感病毒的一NS1片段的57號核苷酸至528號核苷酸之外。
4. 如申請專利範圍第1項所述之突變型流感病毒，其中該第一組一個或多個突變包括賦予該突變型流感病毒複製能力的一第一組一個或多個點突變。
5. 如申請專利範圍第4項所述之突變型流感病毒，其中該第一組一個或多個點突變係位於該突變型H1N1流感病毒的M區域之外。
6. 如申請專利範圍第4項所述之突變型流感病毒，其中該第一組一個或多個點突變中的至少一個係該H1N1流感病毒基因體中的G346A突變。
7. 如申請專利範圍第1項所述之突變型流感病毒，其中該第二組一個或多個突變包括一第二組一個或多個點突變。
8. 如申請專利範圍第7項所述之突變型流感病毒，其中該第二組一個或多個點突變中的至少一個係選自該H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變所組成的群組。
9. 如申請專利範圍第1項所述之突變型流感病毒，包括在低於35℃的溫度下賦予該突變型流感病毒複製能力的一第三組一個或多個突變。
10. 如申請專利範圍第9項所述之突變型流感病毒，其中該第三組一個或 多個突變包括一第三組一個或多個點突變，該第三組一個或多個點突變與該第二組一個或多個點突變係為相異，並且該第三組一個或多個點突變的至少一個係選自該H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變所組成的群組。
11. 如申請專利範圍第1項所述之突變型流感病毒，其中該突變型流感病毒在37℃或更高的溫度下相對於35℃或更低的溫度具有較低的複製能力。
12. 如申請專利範圍第1項所述之突變型流感病毒，更包括一基因的一插入，該基因編碼一外源性抗原。
13. 如申請專利範圍第12項所述之突變型流感病毒，其中該外源性抗原衍生自一人類病原體。
14. 如申請專利範圍第13項所述之突變型流感病毒，其中該人類病原體係選自一病毒、一細菌、一真菌及一寄生蟲所組成的群組。
15. 如申請專利範圍第14項所述之突變型流感病毒，其中該病毒係選自流感病毒、嚴重急性呼吸系統綜合症病毒、中東呼吸綜合症病毒、茲卡病毒、肝炎病毒、乳突病毒及伊波拉病毒所組成的群組。
16. 如申請專利範圍第1項所述之突變型流感病毒，更包括一基因的一插入，該基因編碼一內源性抗原，該內源性抗原與一疾病狀態相關。
17. 如申請專利範圍第16項所述之突變型流感病毒，其中該內源性抗原係選自癌症相關抗原及與阿茲海默症相關的tau蛋白所組成的群組。
18. 如申請專利範圍第1項所述之突變型流感病毒，其中該突變型流感病毒適用於配製一減毒活疫苗。
19. 如申請專利範圍第18項所述之突變型流感病毒，其中該減毒活疫苗適用於經一黏膜接種該減毒活疫苗。
20. 一種減毒活疫苗，包括：一經修飾的H1N1流感病毒，該經修飾的H1N1流感病毒具有一基因體，該基因體包括一毒力因子活性的一缺失、一第一組一個或多個突變，該第一組一個或多個突變在缺乏該毒力因子活性的情況下賦予在37℃複製的能力、一第二組一個或多個突變，該第二組一個或多個突變在 低於35℃的溫度下賦予複製的能力，其中該經修飾的H1N1流感病毒足量存在，以在免疫接種時提供保護；以及一載體，其中該減毒活疫苗被配製為將該減毒活疫苗與一黏膜接觸以進行疫苗接種。
21. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，其中該毒力因子活性的該缺失包括一毒力因子基因的至少部分缺失。
22. 如申請專利範圍第21項所述之減毒活疫苗，其中該缺失包括一NS1基因的至少部分缺失，該NS1基因的至少部分缺失延伸至該突變型流感病毒的NS1片段的57號核苷酸至528號核苷酸之外。
23. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，其中該第一組一個或多個突變包括賦予該減毒活疫苗複製能力的一第一組一個或多個點突變。
24. 如申請專利範圍第23項所述之減毒活疫苗，其中該第一組一個或多個點突變係位於該突變型H1N1流感病毒的M區域之外。
25. 如申請專利範圍第24項所述之減毒活疫苗，其中該第一組一個或多個點突變中的至少一個係該H1N1流感病毒基因體中的G346A突變。
26. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，其中該第二組一個或多個突變包括一第二組一個或多個點突變。
27. 如申請專利範圍第26項所述之減毒活疫苗，其中該第二組一個或多個點突變中的至少一個係選自該H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變所組成的群組。
28. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，包括在低於35℃的溫度下賦予該減毒活疫苗複製能力的一第三組一個或多個突變。
29. 如申請專利範圍第28項所述之減毒活疫苗，其中該第三組一個或多個突變包括一第三組一個或多個點突變，該第三組一個或多個點突變與該第二組一個或多個點突變係相異的，並且該第三組一個或多個點突變的至少一個係選自該H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變所組成的群組。
30. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，其中該突變型流感病毒在 37℃或更高的溫度下相對於35℃或更低的溫度具有較低的複製能力。
31. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，更包括一基因的一插入，該基因編碼一外源性抗原。
32. 如申請專利範圍第31項所述之減毒活疫苗，其中該外源性抗原衍生自一人類病原體。
33. 如申請專利範圍第32項所述之減毒活疫苗，其中該人類病原體係選自一病毒、一細菌、一真菌及一寄生蟲所組成的群組。
34. 如申請專利範圍第33項所述之減毒活疫苗，其中該病毒係選自流感病毒、嚴重急性呼吸系統綜合症病毒、中東呼吸綜合症病毒、茲卡病毒、肝炎病毒、乳突病毒及伊波拉病毒所組成的群組。
35. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，更包括一基因的一插入，該基因編碼一內源性抗原，該內源性抗原與一疾病狀態相關。
36. 如申請專利範圍第35項所述之減毒活疫苗，其中該內源性抗原係選自癌症相關抗原及tau蛋白所組成的群組。
37. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，其中該載體包括一佐劑。
38. 如申請專利範圍第20項至37項中任一項所述之減毒活疫苗，其中該載體更包括一免疫增強劑。
39. 如申請專利範圍第38項所述之減毒活疫苗，其中該免疫增強劑係一TLR-7促效劑。
40. 如申請專利範圍第39項所述之減毒活疫苗，其中該TLR-7促效劑係咪喹莫特。
41. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，其中該減毒活疫苗用於2歲以下的人是安全的。
42. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，其中該減毒活疫苗用於49歲以上的人是安全的。
43. 如申請專利範圍第20項所述之減毒活疫苗，其中該減毒活疫苗在以該減毒活疫苗提供保護並用高致死劑量的一病原體接種的動物模型中有效提供至少20%的存活率，其中在用該病原體係於該動物模型鼻內接種該減毒活疫苗至少兩週後進行接種。
44. 一種生產適用於減毒活疫苗的一經修飾型流感病毒的方法，包括：從一H1N1流感病毒中剪除一毒力因子活性以產生一第一突變型病毒；在37℃或37℃以上的哺乳動物細胞株中繁殖該缺失突變型病毒以產生具有複製能力的一第二突變型病毒，該第二突變型病毒包括一第一組一個或多個突變；在35℃或35℃以下的禽蛋系統中繁殖該第二突變病毒以產生冷適應的一第三突變型病毒，該第三突變型病毒包括一第二組一個或多個突變。
45. 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中該毒力因子活性的剪除包括一NS1基因的至少部分缺失，該NS1基因的至少部分缺失延伸至一NS1片段的57號核苷酸至528號核苷酸之外。
46. 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中該第一組一個或多個突變係賦予該第一突變型病毒複製能力的一第一組一個或多個點突變。
47. 如申請專利範圍第46項所述之方法，其中該第一組一個或多個點突變係位於該突變型H1N1流感病毒的M區域以外。
48. 如申請專利範圍第46項所述之方法，其中該第一組一個或多個點突變中的至少一個係H1N1流感病毒基因體中的G346A突變。
49. 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中該第二組一個或多個突變係一第二組一個或多個點突變。
50. 如申請專利範圍第49項所述之方法，其中該第二組一個或多個點突變中的至少一個係選自該H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變所組成的群組。
51. 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中該第三突變型病毒包括一第三組一個或多個突變，賦予該第三突變型病毒低於35℃時的複製能力。
52. 如申請專利範圍第51項所述之方法，其中該第三組一個或多個突變包括一第三組一個或多個點突變，其中該第三組一個或多個點突變與該第二組一個或多個點突變係相異的，並且該第三組一個或多個點突變的至少一個係選自該H1N1流感病毒基因體中的T261G及A310G突變所組成的群組。
53. 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中該第三突變型病毒在37℃或 更高的溫度下相對於35℃或更低的溫度具有較低的複製能力。
54. 如申請專利範圍第44項所述之方法，更包括插入一基因，該基因編碼一外源性抗原。
55. 如申請專利範圍第54項所述之方法，其中該外源性抗原衍生自一人類病原體。
56. 如申請專利範圍第55項所述之方法，其中該人類病原體係選自一病毒、一細菌、一真菌及一寄生蟲所組成的群組。
57. 如申請專利範圍第56項所述之方法，其中該病毒係選自流感病毒、嚴重急性呼吸系統綜合症病毒、中東呼吸綜合症病毒、茲卡病毒、肝炎病毒、乳突病毒及伊波拉病毒所組成的群組。
58. 如申請專利範圍第44項所述之方法，更包括插入一基因，該基因編碼一內源性抗原，該內源性抗原與一疾病狀態相關。
59. 如申請專利範圍第58項所述之方法，其中該內源性抗原係選自癌症相關抗原及tau蛋白所組成的群組。