BR112014002290B1

BR112014002290B1 - Vírus quimérico recombinante de influenza a, composição, método para produzir um vírus quimérico recombinante de influenza a, método para produzir uma composição, processo para produzir uma vacina de influenza e kit

Info

Publication number: BR112014002290B1
Application number: BR112014002290-9A
Authority: BR
Inventors: Yan Zhou; Aleksandar Masic
Original assignee: University Of Saskatchewan
Priority date: 2011-08-02
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2021-11-03
Also published as: MX2014001158A; US10098944B2; BR112014002290A2; WO2013016805A1; EP2739724A1; CA2842872A1; EP2739724A4; NZ620275A; MX350283B; EP2739724B1; US20130189303A1; CN106929486A; AU2012289693A1; KR20140047139A; HK1197268A1; US20170151323A1; DK2739724T3; CA2842872C; KR102076794B1; AU2012289693B2

Abstract

virus recombinante de influenza suina e usos do mesmo a presente invenção se refere a vírus quiméricos recombinantes da influenza suina, que incluem segmentos de hemaglutinina de mtais de um subtipo do vírus da influenza. também são descritos métodos para produzir os vírus recombinantes de ínfluenza, composições imunogênicas compreendendo os vírus recordbinantes de influenza, mtétodos para estimular uma resposta imune contra o vírus da influenza, e métodos para tratar e prevenir a infecção pelo vírus da influenza.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção se refere de modo geral ao vírus da influenza e composições imunogênicas e métodos para tratar e prevenir a infecção por influenza. Em particular, a invenção se refere aos vírus quiméricos recombinantes da influenza suína expressando mais de um subtipo de hemaglutinina (HA).

ANTECEDENTES

[0002] A influenza suína (SI) é uma doença respiratória aguda do suíno causada pelos vírus da influenza tipo A e tipo C. Os vírus da influenza A são vírus de RNA de fita negativa segmentados e podem ser isolados de um número de outras espécies hospedeiras animais, incluindo aves, humanos, cavalos, baleias e marta. Embora vírus de influenza inteiros raramente atravessem a barreira das espécies, segmentos de genes podem atravessar essa barreira através do processo de rearranjo, ou mudança genética. Porcos suportam a replicação dos vírus da influenza A tanto humano quanto aviário e tem sido postulados para desempenhar um importante papel na transmissão interespécies agindo como um “vaso de mixagem” para rearranjo entre vírus específicos a diferentes espécies hospedeiras (Scholtissek, Eur. J. Epidemiol. (1994) 10:455-458). Isso pode levar à geração de vírus da influenza capazes de atravessar a barreira de espécies para humanos.

[0003] Viriões da influenza incluem um núcleo interno de ribonucleoproteína (um nucleocapsídeo helicoidal) contendo um genoma de RNA de fita simples, e um envelope de lipoproteína externo revestido internamente por uma proteína matriz (M1). O genoma do vírus da influenza A consiste de oito moléculas segmentadas de RNA de fita simples de senso negativo. Cada segmento possui sinais de empacotamento de RNA segmento- específico que são compostos tanto de regiões não codificadoras quanto de regiões codificadoras curtas nas extremidades 5’ e 3’. Os oito RNAs segmentados codificam 11 proteínas virais, incluindo proteínas de polimerase de RNA RNA-dependentes (PB2, PB1 e PA) e nucleoproteína (NP) que forma o nucleocapsídeo; as proteínas de membrana matriz (M1, M2); hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA), ambas glicoproteínas de superfície que se projetam a partir do envelope contendo lipídio; a proteína não estrutural (NS1), proteína de expostação nuclear (NEP, também chamada de NS2), o fator PB1- F2 pro-apoptótico. HA é crítico para a ligação de vírus e entrada nas células, e é o principal alvo de anticorpo neutralizante, enquanto que NA desempenha um papel na liberação do vírus da progênie e é essencial para a propagação do vírus. A transcrição e replicação do genoma ocorrem no núcleo e a montagem ocorre através de brotamento na membrana de plasma. Os vírus podem rearranjar genes durante infecções misturadas.

[0004] Múltiplos subtipos do vírus da influenza suína (SIV) continuam a circular nas populações suínas apesar das vacinas disponíveis. Atualmente, H1N1, H3N2 e H1N2 são os subtipos dominantes que causam doença na população suína norte-americana. SIVs do subtipo N3N2 foram gerados através de rearranjo entre os vírus humano, aviário, e vírus suínos clássicos, estão sofrendo rápida evolução e em geral causam doença mais severa do que o clássico SIV H1N1. As atuais vacinas de SIV não proporcionam proteção cruzada contra múltiplas variantes de SIV antigênico.

[0005] Assim, permanece a necessidade do desenvolvimento de estratégias eficazes para o tratamento e prevenção da infecção por influenza suína.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção se refere a vírus quiméricos recombinantes da influenza que possuem HAs de dois ou mais subtipos de SIVs e métodos para produzir e usar os mesmos. Em representações preferidas, todo ou uma parte do segmento NA está ausente do vírus recombinante de modo que a propagação do vírus é impedida. Como NA é essencial para a propagação do vírus, a função de NA pode ser fornecida em cultura cultivando-se o vírus na presença de sialidase. O vírus recombinante que expressa mais de um tipo de HA pode ser usado em composições imunogênicas para estimular uma resposta imune contra o vírus da influenza, e para tratar e prevenir a infecção pelo vírus da influenza. Como HAs de diferentes subtipos de SIVs estão presentes, composições incluindo os vírus da influenza quiméricos podem ser usadas para proporcionar ampla cobertura contra um número de cepas da influenza.

[0007] Em particular, os inventores aqui descobriram que um vírus quimérico incluindo tanto H1 quanto H3, e retendo sinais de empacotamento RNA-específicos virais em 3’ e 5’ mas sem ter o restante do segmento NA, cresce eficazmente em cultura e é atenuado em porcos já que não há sialidase presente em suínos. Os sinais de empacotamento de NA são em grande parte retidos para empacotamento eficaz. Esses construtos quiméricos podem ser usados como vacinas atenuadas vivas eficazes e seguras. Consequentemente, em uma representação, a invenção é direcionada a um vírus quimérico recombinante da influenza suína compreendendo mais de um segmento de hemaglutinina (HA) (segmento 4) de mais de um subtipo da influenza. Em particular, o vírus compreende segmentos 1-5, 7 e 8 de um primeiro subtipo da influenza e um segundo segmento 4 de um segundo subtipo da influenza. Além disso, todo ou uma parte do segmento de neuraminidase (NA) (segmento 6) do primeiro subtipo da influenza está faltando para tornar um vírus atenuado.

[0008] Em certas representações, o segundo segmento 4 compreende sequências de empacotamento de NA do dito primeiro subtipo da influenza localizado em 3’ e opcionalmente 5’ do dito segundo segmento 4. Em representações adicionais, as sequências de empacotamento de NA compreendem sequências de empacotamento de 3’ NA de 3’ NA UTR e a sequência codificadora 3’ NA e, opcionalmente sequências de empacotamento de 5’ NA de 5’ NA UTR e a sequência codificadora 5’ NA.

[0009] Em outras representações, o vírus da influenza descrito acima é de um vírus A da influenza. Em determinadas representações, o vírus da influenza compreende um segmento HA de um subtipo H1N1 e um segmento HA de um subtipo H3N2. Em certas representações, o primeiro subtipo da influenza é o H1N1, como A/swine/Saskatchewan/18789/02. Em outras representações, o segundo subtipo da influenza é o H3N2, como A/swine/Texas/4199-2/98.

[0010] Em outras representações ainda, a invenção é direcionada para um vírus recombinante atenuado da influenza suína compreendendo segmentos 1-5, 7 e 8 de um subtipo da influenza H1N1, e segmento 4 de um subtipo da influenza H3N2. Além disso, todo ou uma parte do segmento 6 do subtipo da influenza H1N1 está faltando e o segmento 4 da H3N2 é flanqueado por sequências de empacotamento de NA do subtipo H1N1. As sequências de empacotamento compreendem sequências de empacotamento 3’ NA de 3’ NA UTR e da sequência codificadora 3’ NA e sequências de empacotamento 5’ NA de 5’ NA UTR e da sequência codificadora 5’ NA. Em certas representações, o subtipo H1N1 é A/swine/Saskatchewan/18789/02 e o subtipo H3N2 é A/swine/Texas/4199-2/98.

[0011] Em outras representações, a invenção é direcionada a uma composição compreendendo qualquer um dos vírus recombinantes descritos acima, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em certas representações, a composição compreende ainda um adjuvante. Ainda em outras representações, a invenção é direcionada a um método para induzir uma resposta imunológica em um sujeito vertebrado, compreendendo administrar a composição ao sujeito. Em outras representações, a invenção é direcionada a um método para tratar ou prevenir uma infecção por influenza em um sujeito vertebrado, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição. Em outras representações, a invenção é direcionada a um método para vacinar um sujeito contra um vírus da influenza, compreendendo administrar uma quantidade eficaz da composição ao sujeito. Em certas representações o sujeito é um suíno.

[0012] Em representações adicionais, a invenção é direcionada a um construto recombinante compreendendo (a) o segmento HA do subtipo H3N2 da influenza suína; e (b) sequências de empacotamento NA do subtipo H1N1 da influenza suína localizadas em 3’ e opcionalmente 5’ do dito segmento HA H3N2. Em certas representações, o segmento HA H3N2 é flanqueado por sequências de empacotamento NA H1N1 que compreendem sequências de empacotamento 3’ NA de 3’ NA UTR e a sequência codificadora 3’ NA e as sequências de empacotamento 5’ NA de 5’ NA UTR e a sequência codificadora 5’ NA. Em representações adicionais o subtipo H1N1 é A/swine/Saskatchewan/18789/02 e o subtipo H3N2 é A/swine/Texas/4199-2/98.

[0013] Em outras representações, a invenção é direcionada a um método para produzir um vírus quimérico recombinante da influenza, compreendendo transfectar uma célula hospedeira com (a) plasmídeos individuais compreendendo segmentos 1-5, 7 e 8 de um subtipo da influenza H1N1; e (b) um construto recombinante descrito acima, e cultivar a célula hospedeira sob condições que resultem na produção do vírus quimérico recombinante da influenza.

[0014] Em outras representações, a invenção é direcionada a uma célula transformada com (a) plasmídeos individuais compreendendo segmentos 1-5, 7 e 8 de um subtipo da influenza H1N1; e (b) um construto recombinante descrito acima.

[0015] Em outras representações, a invenção é direcionada a um método para produzir uma composição compreendendo combinar qualquer um dos vírus quiméricos recombinantes da influenza suína descritos acima com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0016] Em outras representações, a invenção é direcionada a um método para produzir uma vacina contra a influenza compreendendo: (a) propagar qualquer um dos vírus quiméricos recombinantes da influenza suína descritos acima; (b) purificar o vírus; e (c) combinar o vírus purificado com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0017] Em outras representações adicionais ainda, a invenção é direcionada a um kit compreendendo um ou mais recipientes de qualquer um dos vírus recombinantes descritos acima, ou as composições descritas acima.

[0018] Essas e outras representações da invenção ocorrerão facilmente aos especialistas no assunto em vista do aqui divulgado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] As Figuras 1A e 1B descrevem vários segmentos da influenza para uso na presente invenção. A Figura 1A descreve os 8 segmentos de um vírus H1N1 SIV da Influenza A do tipo selvagem, A/swine/Saskatchewan/18789/02 (aqui chamada de “SK02”) e os 8 segmentos do vírus atenuado quimérico recombinante produzido como descrito nos exemplos (aqui chamado de “SIV-606”). A Figura 1B é uma representação esquemática do segmento chamado “H3-HA” na Figura 1A. O segmento HA descrito na Figura 1B foi derivado de um vírus da Influenza A H3N2, A/swine/Texas/4199-2/98 (aqui chamado “Tx98”) e incluiu os sinais de empacotamento em 3’ e 5’ NA de SK02.

[0020] A Figura 2 mostra as curvas de crescimento de SIV-606 e SIV/SK02.

[0021] As Figuras 3A-3C mostram a temperatura corporal de porcos infectados com doses altas e baixas de SK02 (Figura 3A), Tx98 (Figura 3B) e SIV-606 (Figura 3C).

[0022] A Figura 4 mostra os títulos de vírus pulmonar de porcos infectados com altas e baixas doses de SIV/SK02, SIV Tx98 e SIV-606.

[0023] As Figuras 5A e 5B (SEQ ID NOS: 1 e 2) mostram a sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido, respectivamente, de HA de SIV SK02 (GenBank: AY619961.1).

[0024] As Figuras 6A e 6B (SEQ ID NOS: 3 e 4) mostram a sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido, respectivamente, de NA de SIV SK02 (GenBank: AY619960.1).

[0025] As Figuras 7A-7C (SEQ ID NOS: 5,6 e 7) mostram a sequência de nucleotídeo matriz (Figura 7A) e as sequências de aminoácidos de M2 (Figura 7B) e M1 (Figura 7C) de SIV SK02 (GenBank: AY619959.1).

[0026] As Figuras 8A e 8B (SEQ ID NOS: 8 e 9) mostram a sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido, respectivamente, de NP de SIV SK02 (GenBank: AY619958.1).

[0027] As Figuras 9A e 9B (SEQ ID NOS: 10,11 e 12) mostram a sequência de nucleotídeo de proteína não estrutural (Figura 9A) e as sequências de aminoácidos de NEP (Figura 9B) e NS1 (Figura 9C) de SIV SK02 (GenBank: AY619957.1).

[0028] As Figuras 10A e 10B (SEQ ID NOS: 13 e 14) mostram a sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido, respectivamente, de PA de SIV SK02 (GenBank: AY619956).

[0029] As Figuras 11A e 11B (SEQ ID NOS: 15 e 16) mostram a sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido, respectivamente, de PB1 de SIV SK02 (GenBank: AY619955.1).

[0030] As Figuras 12A e 12B (SEQ ID NOS: 17 e 18) mostram a sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido, respectivamente, de PB2 de SIV SK02 (GenBank: AY619954.1).

[0031] As Figuras 13A e 13B (SEQ ID NOS: 19 e 20) mostram a sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido, respectivamente, de HA de SIV Tx98.

[0032] As Figuras 14A-14C mostram títulos de soro IgG SIV/SK02- específico (Figura 14A); títulos de soro IgG SIV/Tx98-específico (Figura 14B); e títulos de soro IgG H1N1 Halifax-específico (Figura 14C) em porcos vacinados com SIV-606.

[0033] As Figuras 15A-15C mostram títulos nasais IgG SIV/SK02- específico (Figura 15A); títulos nasais IgG SIV/Tx98-específico (Figura 15B); e títulos nasais IgG H1N1 Halifax-específico (Figura 15C) em porcos vacinados com SIV-606.

[0034] As Figuras 16A-16C mostram títulos BALF IgG SIV/SK02- específico (Figura 16A); títulos BALF IgG SIV/Tx98-específico (Figura 16B); e títulos BALF IgG H1N1 Halifax-específico (Figura 16C) em porcos vacinados com SIV-606.

[0035] As Figuras 17A e 17B mostram a temperatura retal em porcos controle não vacinados e porcos vacinados com SIV-606 desafiados com SIV/02 (Figura 17A) e desafiados com SIV/Tx98 (Figura 17B).

[0036] As Figuras 18A e 18B mostram a percentagem de lesões pulmonares (Figura 18A) e carga viral pulmonar (Figura 18B) em porcos SIV/SK02 e SIV/Tx98 não vacinados, bem como em porcos vacinados com SIV-606.

[0037] As Figuras 19A-19E mostram lesões histopatológicas em porcos não vacinados desafiados (Figura 19A); porcos MEM vacinados e desafiados (Figura 19B); porcos SIV-606 vacinados e porcos SIV/SK02 desafiados (Figura 19C); porcos MEM vacinados e SIV/Tx98 desafiados (Figura 19D); e porcos SIV-606 vacinados e SIV/Tx98 desafiados (Figura 19E).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0038] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, métodos de virologia, química, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e imunologia, dentro do estado da arte. Essas técnicas são explicadas em totalidade na literatura. Ver, ex., Fundamental Virology, Current Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current edition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (current edition); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

[0039] As seguintes abreviações de aminoácidos são usadas em todo o texto:

1. DEFINIÇÕES

[0040] Na descrição da presente invenção, os seguintes termos serão empregados, e devem ser definidos como indicado abaixo.

[0041] Deve-se observar que, como são usadas neste relatório e reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma” e “o” “a” incluem seus referentes no plural, a não ser que o conteúdo prescreva claramente em contrário. Assim sendo, por exemplo, a referência a “um vírus da influenza A” inclui uma mistura de dois ou mais de tais vírus, e assim por diante.

[0042] Como é usado aqui, o termo “vírus da influenza” se refere a membros da família orthomyxoviridae de vírus envelopados com um com um genoma de RNA antisenso segmentado (Knipe and Howley (eds.) Fields Virology, 4th edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa., 2001). O termo vírus da influenza pode incluir qualquer cepa do vírus da influenza, tais como influenza A, B, ou C, que é capaz de causar doença em um animal ou humano. Em particular, o termo abrange qualquer subtipo de vírus da influenza A selecionado de H1-H15 e N1-N9, assim como, mas não limitado a H1N1, H1N2, H3N2, H3N1, H9N2 e H5N1, ou qualquer combinação de Hs e Ns. Um grande número de isolados de influenza foram parcial ou completamente sequenciados. Ver, ex., o Influenza Sequence Database (ISD) (website em flu.lanl.gov; descrito por Macken et al., "The value of a database in surveillance and vaccine selection." em Options for the Control of Influenza IV. A.D.M.E. Osterhaus, N. Cox & A.W. Hampson (Eds.) Amsterdam: Elsevier Science, 2001, 103-106) e a base de dados GenBank, particularmente o Influenza Virus Resource (website em ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). As bases de dados ISD e GenBank contem sequências completas para os segmentos de genoma da influenza A, B, e C.

[0043] O termo “derivado de” é usado aqui para identificar a fonte original de uma molécula, mas não pretende limitar o método através do qual a molécula é feita, que pode ser, por exemplo, por meio de síntese química ou recombinante.

[0044] Uma molécula do vírus da influenza é uma molécula derivada de um vírus da influenza, incluindo, sem limitação, polipeptídeo, proteína, polinucleotídeo, oligonucleotídeo, e moléculas de ácido nucleico, como aqui definido, de qualquer um dos vários isolados de subtipos da influenza A, B, ou C. A molécula não precisa ser fisicamente derivada do isolado particular em questão, mas pode ser produzida sinteticamente ou recombinantemente.

[0045] Sequências de ácido nucleico e polipeptídeo para um número de isolados do vírus da influenza são conhecidas. Sequências da influenza representativas são apresentadas nas Figuras 5-13 aqui contidas. Sequências representativas adicionais, incluindo sequências adicionais para os 8 segmentos da influenza, incluindo aqueles segmentos codificando para hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), proteína ácida polimerase (PA), proteínas básicas 1 e 2 polimerase (PB1 e PB2), proteínas 1 e 2 membrana matriz (M1 e M2), nucleoproteína (NP), e proteínas 1 e 2 não estruturais (NS1 e NEP, também chamada de NS2) de isolados da influenza encontrados em várias espécies estão listadas na base de dados do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (NCBI) e na Base de Dados de Pesquisa da Influenza encontrado em fludb.org. Ver também Ferguson et al. (2003) Nature 422: 428-433; Lin et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 9654-9658; Nguyen et al. (2005) J. Virol. 79:4201-4212; Ha et al. (2002) EMBO J. 21:865-875; and Chan et al. (2004) J. Microbiol. Immunol. Infect. 37:135-144; para comparações de sequências e uma discussão da diversidade genética e análise filogenética do vírus da influenza.

[0046] Como é usado aqui, o termo “vírus da influenza suína” se refere a um tipo A ou tipo C do vírus da influenza da família orthomyxovirus que causa a influenza suína. Apesar do orthomyxovirus ter três grupos: tipo A, tipo B, e tipo C, apenas o tipo A e o tipo C dos vírus da influenza infectam porcos. Subtipos do vírus da influenza suína incluem H1N1, H1N2, H3N2, H3N1, H9N2 e H5N1. Em certas representações, um vírus da influenza suína é um vírus que foi isolado de suínos. Para os objetivos da presente invenção, um vírus da influenza suína é ou um tipo selvagem do vírus da influenza suína ou um recombinante, vírus da influenza quimérico derivado de um tipo selvagem do vírus da influenza suína.

[0047] Como é usada aqui, a frase “tipo selvagem do vírus da influenza suína” se refere aos tipos de vírus suínos que são prevalentes, circulando naturalmente e produzindo típicos surtos da doença. Exemplos de tipos selvagens do vírus da influenza suína incluem, mas não estão limitados a, A/swine/Saskatchewan/18789/02, A/Swine/Colorado/1/77, A/Swine/Colorado/23619/99, A/Swine/Cote d'Armor/3633/84, A/Swine/Cote d'Armor/3633/84, A/Swine/England/195852/92, A/Swine/Finistere/2899/82, A/Swine/Hong Kong/10/98, A/Swine/Hong Kong/9/98, A/Swine/Hong Kong/81/78, A/Swine/Illinois/100084/01, A/Swine/Illinois/100085A/01, A/Swine/Illinois/21587/99, A/Swine/Indiana/1726/88, A/Swine/Indiana/9K035/99, A/Swine/Indiana/P 12439/00, A/Swine/Iowa/30, A/Swine/Iowa/15/30, A/Swine/Iowa/533/99, A/Swine/Iowa/569/99, A/Swine/Iowa/3421/90, A/Swine/Iowa/8548-1/98, A/Swine/Iowa/930/01, A/Swine/Iowa/17672/88, A/Swine/Italy/1513-1/98, A/Swine/Italy/1523/98, A/Swine/Korea/CY02/02, A/Swine/Minnesota/55551/00, A/Swine/Minnesota/593/99, A/Swine/Minnesota/9088-2/98, A/Swine/Nebraska/1/92, A/Swine/Nebraska/209/98, A/Swine/Netherlands/12/85, A/Swine/North Carolina/16497/99, A/Swine/North Carolina/35922/98, A/Swine/North Carolina/93523/01, A/Swine/North Carolina/98225/01, A/Swine/Oedenrode/7C/96, A/Swine/Ohio/891/01, A/Swine/Oklahoma/18717/99, A/Swine/Oklahoma/18089/99, A/Swine/Ontario/01911-1/99, A/Swine/Ontario/01911-2/99, A/Swine/Ontario/41848/97, A/Swine/Ontario/97, A/Swine/Quebec/192/81, A/Swine/Quebec/192/91, A/Swine/Quebec/5393/91, A/Swine/Taiwan/7310/70, A/Swine/Wisconsin/464/98 e A/Swine/Wisconsin/14094/99.

[0048] O termo “gene HA” se refere ao gene que codifica a glicoproteína da superfície da hemaglutinina (HA) que se projeta do envelope contendo lipídio na influenza. A HA é uma das moléculas codificadas pelo genoma segmentado da influenza A e outros vírus. Um “gene HA do vírus da influenza suína” é um gene HA isolado de um vírus da influenza suína, como por exemplo a partir de qualquer uma das cepas descritas abaixo. As sequências de polinucleotídeo e de aminoácido de genes HA suínos representativos podem ser encontradas em bases de dados públicas de sequências como Genbank. Por exemplo, genes HA de H1N1 incluem, mas não estão limitados a, Acessos GenBank Nos. AY619961.1 (ver Figuras 5A e 5B); GQ457549.1; GQ457548.1; GQ457547.1; CY091769.1; CY091745.1; CY091737.1; CY091729.1; GU721143.3; JF820285.1; JF820277.1; JF707784.1; CY087136.1; CY087104.1; CY087096.1; CY087080.1; CY087072.1; CY087064.1; CY087056.1; CY087048.1; CY086863.1; CY086839.1; CY086353.1; CY086006.1; CY085990.1; CY085982.1; CY085974.1; CY085966.1; CY085958.1; CY085950.1; CY085942.1; CY085934.1; CY085926.1; CY085918.1; CY085910.1; CY085902.1; CY085894.1; CY085886.1; CY085878.1; CY085870.1; CY085854.1; CY085846.1; CY085838.1; CY085830.1; CY085822.1; CY085814.1; CY085806.1; CY085798.1; CY085790.1; CY085782.1; CY085774.1; CY085766.1; CY085758.1; CY085742.1; CY085726.1; CY085718.1; CY085710.1; CY085702.1; CY085694.1; CY085686.1; CY085670.1; JF833344.1; JF833343.1; JF833341.1; JF833339.1; JF833338.1; JF833337.1; JF833335.1; JF916682.1; JF812292.1; JF812291.1; JF812290.1; JF812287.1; JF812284.1; JF812281.1; JF812280.1; JF812279.1; JF812278.1; JF812273.1; JF812272.1; JF812271.1; AF091317.1; AF091315.1; AF091314.1.

[0049] Genes HA de H3N2 incluem, mas não estão limitados à sequência mostrada nas Figuras 13A e 13B; bem como Acessos GenBank Nos. AY377927.2; CY092324.1; AF153233.1; JN105973.1; HQ315643.1; FJ519977.1; FJ519976.1; FJ519975.1; FJ519974.1; FJ519973.1; FJ519972.1; FJ519971.1; GU937743.1; JF833345.1; JF833340.1; JF833336.1; JF833334.1; JF812293.1; JF812289.1; JF812277.1; JF812276.1; JF812275.1; JF812274.1; CY045575.1; CY045567.1; CY045559.1; CY045551.1; HQ825243.1; HQ825235.1; HQ825229.1; HQ825226.1; HQ825223.1; HQ825218.1; HQ825210.1; HQ825210.1; HQ825198.1; HQ825190.1; HQ825182.1; HQ825174.1; HQ825166.1; JF312065.1; JF312064.1; CY086920.1; JF312073.1; JF312072.1; JF312071.1; JF316643.1; JF263536.1; JF263535.1; HQ734204.1; HQ734201.1; HQ734198.1; HQ734195.1; HQ734192.1; HQ734189.1; HQ734186.1; CY077942.1; CY077934.1.

[0050] O termo “gene NA” se refere ao gene que codifica a glicoproteína de superfície da neuraminidase (NA) que se projeta do envelope contendo lipídio na influenza. A NA é uma das moléculas codificadas pelo genoma segmentado da influenza A e outros vírus. Um “gene Nado vírus da influenza suína” é um gene NA isolado de um vírus da influenza suína, como por exemplo de qualquer uma das cepas descritas abaixo. As sequências de polinucleotídeo e aminoácido de genes NA suínos representativos podem ser encontradas em bases de dados públicas de sequências como GenBank. Por exemplo, genes NA de H1N1 incluem, mas não estão limitados a, AY619960.1 (ver Figuras 6A e 6B); JF833356.1.; JF833355.1; JF833353.1; JF833351.1; JF833350.1; JF833349.1; JF833355.1; JF833347.1; JF812315.1; JF812314.1; JF812313.1; JF812310.1; JF812307.1; JF812304.1; JF812303.1; JF812302.1; JF812301.1; JF812294.1; FJ791299.1; FJ791298.1; FJ791297.1; FJ791296.1; FJ791295.1; FJ791294.1; FJ791293.1; FJ791292.1; FJ791291.1; FJ791290.1; FJ791289.1; FJ791288.1; FJ791287.1.

[0051] O termo “sinal de empacotamento de NA” se refere aos sinais de empacotamento de RNA viral-específico em 3’ e 5’ para NA que proporcionam incorporação eficiente do RNA viral em partículas virais. Os sinais de empacotamento estão presentes nas regiões não traduzidas (UTRs) 3’ e 5’ e se estendem para a região codificadora do segmento de NA. Preferivelmente, os sinais de empacotamento de NA usados na produção dos vírus quiméricos recombinantes incluirão apenas o tanto da região NA suficiente para empacotamento e não incluirão a sequência codificadora de NA inteira. Sinais de empacotamento de NA são discutidos mais detalhadamente abaixo.

[0052] Como é usada aqui, a frase “multiplicidade de infecção” ou MOI é o número médio de vírus por célula infectada. A MOI é determinada dividindose o número de vírus adicionados (ml adicionado x PFU) pelo número de células adicionadas (ml adicionado x células /ml).

[0053] Como é usado aqui, o termo “atenuado” significa que uma variante do vírus da influenza, como um vírus quimérico recombinante descrito aqui, apresenta uma redução mensurável na eficiência de replicação em relação ao tipo selvagem do vírus da influenza. A eficiência de replicação de um vírus da influenza pode ser determinada, por exemplo, medindo-se o tamanho da placa em células MDCK, medindo títulos do vírus durante múltiplos ciclos de crescimento, ou isolando o vírus do tecido pulmonar infectado e medindo os títulos.

[0054] Os termos “polipeptídeo” e “proteína” se referem a um polímero de resíduos de aminoácidos e não estão limitados a uma extensão mínima do produto. Assim, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, multímeros, e outros, estão incluídos na definição. Tanto as proteínas inteiras quanto os seus fragmentos são abrangidos pela definição. Os termos também incluem modificações de pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação e outros. Além disso, para os objetivos da presente invenção, um “polipeptídeo” se refere a uma proteína que inclui modificações, como deleções, adições e substituições, na sequência nativa, contanto que a proteína mantenha a sua atividade desejada. Essas modificações podem ser deliberadas, como através de mutagênese direcionada, ou podem ser acidentais, como através de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido a amplificação por PCR.

[0055] “Substancialmente purificado” geralmente se refere ao isolamento de uma substância (vírus recombinante, composto, polinucleotídeo, proteína, polipeptídeo, composição de polipeptídeo) de modo que a substância compreende a maior parte do percentual da amostra na qual reside. Tipicamente em uma amostra, um componente substancialmente purificado compreende 50%, preferivelmente 80%-85%, mais preferivelmente 90%-95% da amostra. Técnicas para purificar moléculas de interesse são bem conhecidas no estado da arte e incluem, por exemplo, cromatografia por troca de íon, cromatografia por afinidade e sedimentação de acordo com a densidade.

[0056] “Isolado” significa, quando se referindo a um polipeptídeo, que a molécula indicada é separada e discreta do organismo como um todo com o qual a molécula é encontrada na natureza ou está presente na ausência substancial de outras macro-moléculas biológicas do mesmo tipo. O termo “isolado” em relação a um polinucleotídeo é uma molécula de ácido nucleico destituída, no todo ou em parte, de sequências normalmente associadas a ela na natureza; ou uma sequência, como existe na natureza, mas tendo sequências heterólogas em associação a ela; ou uma molécula dissociada do cromossomo.

[0057] “Homologia” se refere ao percentual de identidade entre duas metades de polinucleotídeo ou duas metades de polipeptídeo. Duas sequências de ácido nucleico ou duas sequências de polipeptídeos são “substancialmente homólogas” uma à outra quando as sequências apresentam pelo menos aproximadamente 50% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos aproximadamente 75% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 80%-85% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% de identidade de sequência, e mais preferivelmente ainda pelo menos aproximadamente 95%-98% de identidade de sequência por uma extensão definida das moléculas. Como é usado aqui, substancialmente homólogo também se refere a sequências apresentando completa identidade com a sequência especificada.

[0058] De modo geral, “identidade” se refere à exata correspondência nucleotídeo-a-nucleotídeo ou aminoácido-a-aminoácido de duas sequências de polinucleotídeos ou de polipeptídeos, respectivamente. O percentual de identidade pode ser determinado por uma comparação direta da informação da sequência entre duas moléculas alinhando-se as sequências, contando o número exato de correspondências entre as duas sequências alinhadas, dividindo pela extensão da sequência mais curta, e multiplicando o resultado por 100. Programas de computador facilmente disponíveis podem ser usados para auxiliar na análise, tais como ALIGN, Dayhoff, M.O. em Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, Fundação Nacional da Pesquisa Biomédica, Washington, DC, que adapta o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 para análise de peptídeos. Programas para determinar a identidade de sequências de nucleotídeos estão disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 (disponível de Genetics Computer Group, Madison, WI) por exemplo, os programas BESTFIT, FASTA, e GAP, que também usam o algoritmo de Smith e Waterman. Esses programas são facilmente utilizados com os parâmetros padrão recomendados pelo fabricante e descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package citado acima. Por exemplo, o percentual de identidade de uma sequência de nucleotídeos em particular com uma sequência de referência pode ser determinado usando o algoritmo de homologia de Smith e Waterman com uma tabela padrão de pontuação e uma pena lacuna de seis posições de nucleotídeos.

[0059] Outro método para estabelecer o percentual de identidade no contexto da presente invenção é usar o pacote de programas MPSRCH cujos direitos pertencem à University of Edinburgh, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Com esse conjunto de pacotes o algoritmo Smith-Waterman pode ser empregado onde parâmetros padrão são usados para a tabela de pontuação (por exemplo, pena para lacuna aberta de 12, pena para extensão de lacuna de um, e uma lacuna de seis). A partir dos dados gerados o valor de “correspondência” reflete a “identidade de sequência”. Outros programas apropriados para se calcular o percentual de identidade ou similaridade entre sequências são geralmente conhecidos, por exemplo, outro programa de alinhamento é o BLAST, usado com parâmetros padrão. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados utilizando os seguintes parâmetros padrão: código genético=padrão; filtro=nenhum; fita=ambas; corte=60; expectativa=10; Matriz=BLOSUM62; Descrições=50 sequências; classificado por=HIGH SCORE; Bases de dados=não-redundante, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+traduções GenBank CDS+proteína Suiça+Spupdate+PIR. Detalhes desses programas estão facilmente disponíveis.

[0060] Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hibridização de polinucleotídeos sob condições que formam duplexes estáveis entre regiões homólogas, seguido de digestão de nuclease(s) de fita-simples- específicas, e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Sequências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridização Southern sob, por exemplo, condições rigorosas, como definido para aquele sistema em particular. A definição das condições apropriadas de hibridização faz parte do estado da arte. Ver, ex., Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

[0061] Os termos “polinucleotídeo”, “oligonucleotídeo”, “ácido nucleico” e “molécula de ácido nucleico” são usados aqui para incluir uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, sejam ribonucleotídeos ou deoxiribonucleotídeos. Esse termo se refere apenas à estrutura primária da molécula. Assim, o termo inclui DNA de fitas triplas, duplas e simples, bem como RNA de fitas triplas, duplas e simples. Também inclui modificações, tais como por metilação e/ou por adição de quepe (capping), e formas não modificadas do polinucleotídeo. Mais particularmente, os termos “polinucleotídeo”, “oligonucleotídeo”, “ácido nucleico” e “molécula de ácido nucleico” incluem polidoxiribonucleotídeos (contendo 2-deoxi-D-ribose), poliribonucleotídeos (contendo D-ribose), qualquer outro tipo de polinucleotídeo que é um N- ou C-glicosídeo de uma base de purina ou pirimidina, e outros polímeros contendo espinhas dorsais não nucleotídicas, por exemplo, poliamida (ex., ácidos nucleicos de peptídeos (PNAs) e polímeros polimorfolinos (comercialmente disponível de Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, as Neugene), e outros polímeros sintéticos de ácido nucléico de sequência específica contanto que os polímeros contenham nucleobases em uma configuração que permita o emparelhamento de base e o empilhamento de base, como é encontrado em DNA e RNA. Não há distinção intencional em comprimento entre os termos “polinucleotídeo”, “oligonucleotídeo”, “ácido nucléico” e “molécula de ácido nucléico”, e esses termos serão usados de maneira intercambiável. Dessa maneira, os termos incluem, por exemplo, 3'-deoxi-2',5'-DNA, oligodeoxiribonucleotídeo N3' P5' fosforamidates, 2'-O-alquil-substituído RNA, DNA de fita dupla ou de fita simples, bem como RNA de fita dupla ou de fita simples, DNA:RNA híbridos, e híbridos entre PNAs e DNA ou RNA, e também incluem tipos de modificações conhecidas, por exemplo, rótulos que são conhecidos na arte, metilação, “quepes” ("cap"), substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (ex., metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), com ligações negativamente carregadas (ex., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), e com ligações positivamente carregadas (ex., aminoalquilfosforamidatos, aminialquilfosfotriésteres), aquelas contendo metades, tais como, por exemplo, proteínas (incluindo nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina, etc.,), aquelas com intercaladores (ex., acridina, psoralen, etc.), aquelas contendo quelantes (ex., metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquilantes, aquelas com ligações modificadas (ex., ácidos nucléicos alfa anoméricos), bem como formas não modificadas do polinucleotídeo ou oligonucleotídeo. Em particular, DNA é ácido desoxiribonucléico.

[0062] Um polinucleotídeo “derivado de” uma sequência designada se refere a uma sequência de polinucleotídeos que compreende uma sequência contígua de aproximadamente pelo menos cerca de 6 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 8 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10-12 nucleotídeos, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 15-20 nucleotídeos correspondendo, i.e., idênticos ou complementares a uma região da sequência de nucleotídeos designada. O polinucleotídeo derivado não será necessariamente fisicamente derivado da sequência de nucleotídeos de interesse, mas pode ser gerada de qualquer maneira, incluindo, mas não limitado a, síntese química, replicação, transcrição reversa ou transcrição, que é baseada na informação fornecida pela sequência de bases na(s) região(ões) das quais o polinucleotídeo é derivado. Assim sendo, pode representar ou uma orientação de senso ou de antisenso do polinucleotídeo original.

[0063] “Recombinante” como é usado aqui para descrever uma molécula de ácido nucléico significa um polinucleotídeo de origem genômica, RNA, cDNA, viral, semissintética ou sintética que, em virtude da sua origem ou manipulação não está associado com o todo ou uma parte do polinucleotídeo com o qual é associado na natureza. O termo “recombinante” como é usado em relação a um vírus, significa um vírus produzido por manipulação do genoma viral.

[0064] “Células hospedeiras recombinantes”, “células hospedeiras”, “células”, “linhagens celulares”, “culturas celulares”, e outros termos denotando microrganismos ou linhagens celulares eucarióticas mais elevadas cultivadas como entidades unicelulares se referem a células que podem ser, ou tem sido, usadas como recipientes para vírus recombinantes e vetores ou outro ácido nucléico transferido, e inclui a progênie original da célula original que foi transfectada.

[0065] Uma “sequência codificadora” ou uma sequência que “codifica” um polipeptídeo selecionado, é uma molécula de ácido nucléico que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vivo quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas (ou “elementos controle”). Os limites da sequência codificadora podem ser determinados por um códon inicial na terminação 5’ (amino) e um códon de parada de tradução na terminação 3’ (carboxilo). Uma sequência codificadora pode incluir, mas não está limitada a, RNA ou cDNA de sequências virais, de mRNA procariótico ou eucariótico, sequências de DNA genômico de DNA viral ou procariótico, e mesmo sequências de DNA sintético. Uma sequência de terminação de transcrição pode estar localizada em 3’ da sequência codificadora.

[0066] Típicos “elementos controle” incluem, mas não estão limitados a, promotores de transcrição, elementos potenciadores da transcrição, sinais de terminação da transcrição, sequências de poliadenilação (localizadas em 3’ do códon de parada de tradução), sequências para otimização de iniciação da tradução (localizadas em 5’ da sequência de codificação), e sequências de terminação da tradução.

[0067] “Operacionalmente ligado” se refere a um arranjo de elementos onde os componentes assim descritos são configurados de modo a desempenhar a sua função usual. Assim, um determinado promotor operacionalmente ligado a uma sequência codificadora é capaz de efetuar a expressão da sequência codificadora quando as enzimas adequadas estão presentes. O promotor não precisa estar contíguo à sequência codificadora, contanto que ele funcione para direcionar a sua expressão. Dessa forma, por exemplo, sequências de intervenção não traduzidas mas transcritas podem estar presentes entre a sequência promotora e a sequência codificadora e a sequência promotora pode ainda ser considerada “operacionalmente ligada” à sequência codificadora.

[0068] “Codificado por” se refere a uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de polipeptídeo ou uma parte dela contem uma sequência de aminoácido de pelo menos 3 a 5 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 8 a 10 aminoácidos, e mais preferivelmente ainda pelo menos 15 a 20 aminoácidos de um polipeptídeo codificado pela sequência de ácido nucléico.

[0069] “Cassete de expressão” ou “construto de expressão” se refere a um conjunto que é capaz de direcionar a expressão da(s) sequência(s) ou gene(s) de interesse. Um cassete de expressão geralmente inclui elementos controle, como descrito acima, como um promotor que é operacionalmente ligado à (para transcrição direta de) sequência(s) ou gene(s) de interesse, e muitas vezes inclui também uma sequência de poliadenilação. Um cassete de expressão pode estar contido em um construto plasmídeo. Além dos componentes do cassete de expressão, o construto plasmídeo também pode incluir um ou mais marcadores selecionáveis, um sinal que permite que o construto plasmídeo exista como DNA de fita simples (ex., uma origem de replicação M13), pelo menos um local de múltipla clonagem, e uma origem de replicação “mamífera” (ex., uma origem de replicação SV40 ou adenovírus).

[0070] O termo “transfecção” é usado para se referir à aceitação de ácido nucleico estrangeiro por uma célula. Uma célula foi “transfectada” quando ácido nucleico exógeno foi introduzido no interior da membrana da célula. Uma quantidade de técnicas de transfecção é de modo geral conhecida. Ver, ex., Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, e Chu et al. (1981) Gene 13:197. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais metades de DNA exógeno em células hospedeiras apropriadas. O termo se refere tanto à aceitação estável quanto transitória do material genético, e inclui a aceitação de ácidos nucleicos de peptídeos ou ligados a anticorpos.

[0071] Um “vetor” é capaz de transferir sequências de ácido nucleico para células alvo (ex., vetores virais, vetores não virais, transportadores de partículas, e lipossomas). Tipicamente, “construto de vetor”, “vetor de expressão”, e “vetor de transferência de gene”, significam qualquer construto de ácido nucleico capaz de direcionar a expressão de um ácido nucleico de interesse e que pode transferir sequências de ácido nucleico para células alvo. Dessa forma, o termo inclui clonagem e veículos de expressão, bem como vetores virais.

[0072] Uma “resposta imunológica” a um antígeno ou composição é o desenvolvimento em um sujeito de uma resposta imune humoral e/ou celular a um antígeno presente na composição de interesse. Para os objetivos da presente invenção, uma “resposta imune humoral” se refere a uma resposta imune mediada por moléculas de anticorpos, enquanto que uma “resposta imune celular” é mediada por T-linfócitos e/ou outros glóbulos brancos. Um importante aspecto da imunidade celular envolve uma resposta antígeno- específica por células-T citolíticas (“CTLs”). As CTLs possuem especificidade para antígenos de peptídeos que são apresentados em associação com proteínas codificadas pelo principal complexo de histocompatibilidade (MHC) e expressados nas superfícies das células. As CTLs auxiliam e promovem a destruição de micróbios intracelulares, ou a lise de células infectadas com tais micróbios. Outro aspecto da imunidade celular envolve uma resposta antígeno- específica por células-T auxiliares. As células-T auxiliares atuam para ajudar a estimular a função, e o foco da atividade de, células efetoras não específicas contra células que apresentem antígenos de peptídeos em associação com moléculas MHC na sua superfície. Uma “resposta imune celular” também se refere à produção de citocinas, quimiocinas e outras moléculas produzidas pelas células-T ativadas e/ou outros glóbulos brancos, incluindo aqueles derivados de células-T CD4+ e CD8+.

[0073] Uma composição ou vacina que induz uma resposta imune celular pode servir para sensibilizar um sujeito vertebrado pela apresentação de antígeno em associação com moléculas MHC na superfície da célula. A resposta imune célula-mediada é direcionada a, ou próxima a, células apresentando antígeno na sua superfície. Em adição, T-linfócitos antígeno específicos podem ser gerados para permitir a futura proteção de um hospedeiro imunizado.

[0074] A capacidade de um antígeno em particular de estimular uma resposta imunológica célula-mediada pode ser determinada por um número de testes, tais como por testes de linfoproliferação (ativação de linfócitos), testes de célula citotóxica CTL, ou testando T-linfócitos específicos para o antígeno em um sujeito sensiblizado. Esses testes são bastante conhecidos. Ver, ex., Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376. Métodos recentes para medir uma resposta imune célula-mediada incluem a medição de citocinas intracelulares ou secreção de citocinas por populações de células-T, ou pela medição de células-T de epítopo específico (ex., pela técnica de tetrâmero) (revisto por McMichael, A.J., and O’Callaghan, C.A., J. Exp. Med. (1998) 187:1367-1371; Mcheyzer-Williams, M.G., et al, Immunol. Rev. (1996) 150:5-21; Lalvani, A., et al, J. Exp. Med. (1997) 186:859-865).

[0075] Consequentemente, uma resposta imunológica como é usada aqui pode ser aquela que estimula a produção de anticorpos (ex., anticorpos neutralizantes que bloqueiam patógenos tais como os vírus entrando nas células e replicando através da ligação a toxinas e patógenos, tipicamente protegendo as células de infecção e destruição). O antígeno de interesse também pode induzir a produção de CTLs. Assim, uma resposta imunológica pode incluir um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos por células-B; e/ou a ativação de células-T supressoras e/ou células-T memória/efetoras direcionadas especificamente a um antígeno ou antígenos presentes na composição da vacina de interesse. Essas respostas podem servir para neutralizar a infectividade, e/ou anticorpo-complemento mediado, citotoxicidade (ADCC) para proporcionar proteção a um hospedeiro imunizado. Essas respostas podem ser determinadas usando imunoensaios padrão e ensaios de neutralização, bastante conhecidos. (Ver, ex., Montefiori et al. J. Clin Microbiol. (1988) 26:231-235; Dreyer et al., AIDS Res Hum Retroviruses (1999) 15:1563-1571). O sistema imune inato de mamíferos também reconhece e responde a aspectos moleculares de organismos patogênicos através da ativação de receptores do tipo Toll e moléculas receptoras similares em células imunes. Com a ativação do sistema imune inato, várias células de resposta imune não adaptativas são ativadas para, ex., produzir várias citocinas, linfocinas e quimiocinas. As células ativadas por uma resposta imune inata incluem células dendríticas imaturas e maduras do monócito e da linhagem de plasmocitóides (MDC, PDC), bem como células T e células B gama, delta, alfa e beta e outros. Dessa forma, a presente invenção também contempla uma resposta imune na qual a resposta imune envolve uma resposta tanto inata quanto adaptativa.

[0076] Uma “composição imunogênica” é uma composição que compreende uma molécula antigênica onde a administração da composição a um sujeito resulta no desenvolvimento no sujeito de uma resposta imunológica como definida acima.

[0077] Um “antígeno” se refere a uma molécula, como uma proteína, polipeptídeo, ou fragmento do mesmo, de um vírus atenuado, contendo um ou mais epítopos (seja linear, conformacional, ou ambos) que estimulará o sistema imune de um hospedeiro para criar uma resposta imunológica, como definida acima. O termo é usado de modo intercambiável, com o termo “imunogene”. O termo “antígeno” denota tanto os antígenos de subunidade (i.e., antígenos que são separados e discretos de um organismo todo com o qual o antígeno está associado na natureza), bem como, bactérias, vírus, fungos, parasitas mortos, atenuados ou inativados, ou outros micróbios. Similarmente, um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que expresse um antígeno ou determinante antigênico in vivo, assim como em terapia genética e aplicações de imunização de ácido nucleico, também está incluído aqui na definição de antígeno.

[0078] “Sujeito vertebrado” significa qualquer membro do subfilo chordata, incluindo, sem limitação, humanos e outros primatas, incluindo primatas não humanos como chimpanzés e outros macacos e espécies de macacos; animais de fazenda como gado, ovelhas, porcos, cabras e cavalos; mamíferos domésticos como cachorros e gatos; animais de laboratório incluindo roedores como camundongos, ratos e porquinhos da índia; aves, incluindo pássaros domésticos, selvagens e de jogo como galinhas, perus e outras aves galináceas, patos, gansos, e outros. O termo não denota uma idade em particular. Assim, tanto indivíduos adultos quanto recém nascidos estão cobertos.

[0079] “Quantidade terapeuticamente eficaz” no contexto das composições imunogênicas significa uma quantidade de um imunogene, ex., um vírus quimérico recombinante da influenza, que irá induzir uma resposta imunológica, seja para produção de anticorpos ou para tratamento ou prevenção da infecção pelo vírus da influenza. Essa resposta geralmente resultará no desenvolvimento no sujeito de uma resposta imune anticorpo- mediada e/ou secretória ou celular à composição. Usualmente, essa resposta inclui mas não está limitada a um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos de qualquer uma das classes imunológicas, tais como as imunoglobinas A, D, E, G ou M; a proliferação de B e T linfócitos; a provisão de sinais de ativação, crescimento e diferenciação para células imunológicas; a expansão da célula T auxiliar, célula T supressora, e/ou célula T citotóxica e/ou populações de célula yδT.

[0080] “Administração parenteral” se refere à introdução no interior do corpo fora do trato digestivo, assim como administração subcutânea, intramuscular, intradermal ou intravenosa. Isso deve ser contrastado com a administração em uma superfície mucosa, assim como oral, nasal, vaginal ou retal. “Administração mucosa” se refere à introdução no corpo via qualquer superfície mucosa, como pelo modo intragástrico, pulmonar, transdermal, intestinal, ocular, intranasal, oral, vaginal, retal, intratraqueal ou outros.

[0081] Como é usado aqui, “tratamento” se refere a qualquer um dentre (i) a prevenção da infecção ou reinfecção, como em uma vacina tradicional, (ii) a redução ou eliminação de sintomas, e (iii) a substancial ou completa eliminação do vírus da influenza em um indivíduo infectado. O tratamento pode ser efetuado profilaticamente (antes da infecção) ou terapeuticamente (após a infecção). 2. MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0082] Antes de descrever detalhadamente a invenção, deve-se entender que esta invenção não está limitada a formulações em particular ou parâmetros de processos que podem, naturalmente, variar. Deve-se compreender ainda que a terminologia usada aqui tem o objetivo de descrever representações particulares da invenção apenas, e não pretende ser limitadora.

[0083] Embora uma quantidade de métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possa ser usada na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferidos são descritos aqui.

[0084] A presente invenção fornece vírus quiméricos recombinantes da influenza suína que são atenuados com uma capacidade reduzida de replicar in vivo, métodos para produzir esses vírus atenuados da influenza suína, e o uso de tais vírus em vacinas e formulações farmacêuticas. Esses vírus são capazes de gerar uma resposta imune e criar imunidade mas, ou não causam a doença ou causam febre e/ou sintomas menos severos, i.e., os vírus tiveram a virulência diminuída. Consequentemente, são candidatos ideais para vacinas de vírus vivo. Além disso, como HAs de diferentes tipos de SIVs estão presentes, composições incluindo os vírus quiméricos da influenza podem ser usadas para proporcionar ampla cobertura contra um número se cepas da influenza.

[0085] Em particular, a invenção pertence aos vírus quiméricos recombinantes da influenza que incluem segmentos de HA de mais de um subtipo da influenza e incluem uma deleção de todo ou parte do segmento de NA, composições imunogênicas compreendendo os vírus, bem como métodos de estimular uma resposta imune contra o vírus da influenza, e métodos de interferir com a replicação do vírus da influenza.

[0086] De modo a favorecer um entendimento da invenção, é fornecida uma discussão mais detalhada abaixo, relativa à produção de vírus quiméricos recombinantes da influenza e métodos de usar os mesmos em composições no tratamento e/ou prevenção da infecção pelo vírus da influenza. A. Vírus Quiméricos Recombinantes da Influenza

[0087] Vírus da influenza suína do tipo selvagem tipicamente incluem um genoma segmentado em 8 com os segmentos designados da seguinte forma:

[0088] Os vírus quiméricos recombinantes da influenza descritos aqui incluem dois ou mais segmentos HA (segmento 4) de dois ou mais subtipos dos vírus da influenza. Os vírus recombinantes da influenza podem incluir HAs de qualquer subtipo do vírus da influenza e preferivelmente do vírus da influenza A, selecionado entre H1-H15 e N1-N9, assim como, mas não limitado a H1N2, H1N1, H3N2, H3N1, H9N2 e H5N1 ou qualquer combinação de H’s e N’s. Particularmente preferíveis são os segmentos HA de vírus que infectam porcos. As sequências de polinucleotídeos e aminoácidos de genes HA suínos representativos podem ser encontradas em bancos de dados públicos de sequências como GenBank. Por exemplo, genes HA de H1N1 incluem, mas não estão limitados a Acessos GenBank Nos. AY619961.1 (ver Figuras 5A e 5B); GQ457549.1; GQ457548.1; GQ457547.1; CY091769.1; CY091745.1; CY091737.1; CY091729.1; GU721143.3; JF820285.1; JF820277.1; JF707784.1; CY087136.1; CY087104.1; CY087096.1; CY087080.1; CY087072.1; CY087064.1; CY087056.1; CY087048.1; CY086863.1; CY086839.1; CY086353.1; CY086006.1; CY085990.1; CY085982.1; CY085974.1; CY085966.1; CY085958.1; CY085950.1; CY085942.1; CY085934.1; CY085926.1; CY085918.1; CY085910.1; CY085902.1; CY085894.1; CY085886.1; CY085878.1; CY085870.1; CY085854.1; CY085846.1; CY085838.1; CY085830.1; CY085822.1; CY085814.1; CY085806.1; CY085798.1; CY085790.1; CY085782.1; CY085774.1; CY085766.1; CY085758.1; CY085742.1; CY085726.1; CY085718.1; CY085710.1; CY085702.1; CY085694.1; CY085686.1; CY085670.1; JF833344.1; JF833343.1; JF833341.1; JF833339.1; JF833338.1; JF833337.1; JF833335.1; JF916682.1; JF812292.1; JF812291.1; JF812290.1; JF812287.1; JF812284.1; JF812281.1; JF812280.1; JF812279.1; JF812278.1; JF812273.1; JF812272.1; JF812271.1; AF091317.1; AF091315.1; AF091314.1.

[0089] Genes HA de H3N2 incluem, mas não estão limitados a, Acessos GenBank Nos. AF53233 (ver Figuras 13A e 13B); AY377927.2; CY092324.1; JN105973.1; HQ315643.1; FJ519977.1; FJ519976.1; FJ519975.1; FJ519974.1; FJ519973.1; FJ519972.1; FJ519971.1; GU937743.1; JF833345.1; JF833340.1; JF833336.1; JF833334.1; JF812293.1; JF812289.1; JF812277.1; JF812276.1; JF812275.1; JF812274.1; CY045575.1; CY045567.1; CY045559.1; CY045551.1; HQ825243.1; HQ825235.1; HQ825229.1; HQ825226.1; HQ825223.1; HQ825218.1; HQ825210.1; HQ825210.1; HQ825198.1; HQ825190.1; HQ825182.1; HQ825174.1; HQ825166.1; JF312065.1; JF312064.1; CY086920.1; JF312073.1; JF312072.1; JF312071.1; JF316643.1; JF263536.1; JF263535.1; HQ734204.1; HQ734201.1; HQ734198.1; HQ734195.1; HQ734192.1; HQ734189.1; HQ734186.1; CY077942.1; CY077934.1.

[0090] Qualquer um dos HA acima ou outras sequências de HA facilmente disponíveis podem ser usadas com a invenção.

[0091] Adicionalmente, os vírus quiméricos recombinantes da influenza tipicamente incluem uma mutação no segmento genômico de NA (segmento 6) codificando para neuraminidase de modo que a replicação do vírus é prejudicada. Mutações podem incluir deleções, inversões, inserções ou substituições que prejudicam a replicação do vírus. Em certas representações, a variante do vírus compreende uma deleção de todo ou parte do segmento NA de modo que a propagação do vírus é impedida. Como NA é essencial para a propagação do vírus, a função de NA pode ser fornecida em cultura cultivando- se o vírus na presença de sialidase. Preferivelmente, as sequências de empacotamento de NA nas regiões não traduzidas 3’ e opcionalmente 5’ (UTRs) flanqueando a sequência de NA e se estendendo para a sequência codificadora são retidas nos vírus recombinantes.

[0092] Em particular, sinais de empacotamento cis-atuação específicos existem em 3’ e 5’ (UTRs) que se estendem para as regiões codificadoras da maioria se não de todos os segmentos, incluindo o segmento NA, que é responsável pela liberação viral das células infectadas removendo ácidos siálicos dos glicoconjugados celulares e glicoproteínas virais. Cada RNA viral consiste predominantemente de sequências codificadoras (em orientação antisenso), flanqueadas em ambas as extremidades por UTRs que vão de 19 a 58 bases de comprimento. No interior dessas UTRs, as bases não codificadoras distais 12 e 13 que formam os terminais 3’ e 5’ extremos, respectivamente, de todo segmento estão altamente conservadas entre cepas virais e entre ao próprios oito segmentos. Essas sequências distais conservadas são parcialmente complementares uma à outra e podem destemperar para formar uma estrutura duplex abaulada que é essencial para transcrição e replicação do segmento. As UTRs abrigam sinais cis-atuação que contribuem para o empacotamento de RNA, já que a ligação de UTRs sobre um RNA heterólogo pode permitir que ele seja empacotado em, e transformado por, partículas do vírus da influenza. O empacotamento ideal de pelo menos alguns segmentos, como NA, HA e NS requer não apenas ambas as UTRs mas também partes curtas da região codificadora.

[0093] A análise da deleção de construtos repórter indica que as mínimas sequências necessárias para o empacotamento eficiente se estendem para além de cada UTR para incluir de 9 a 80 bases de sequência codificadora adjacente em uma das extremidades do segmento (Fujii et al., J. Virol. (2005) 79:3766-3774; Fujii et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100:2002-2007; Watanabe et al., J. Virol. (2003) 77:10575-10583). Sequências na extremidade 3’ da região codificadora parecem exercer um efeito quantitativo maior do que aquelas na extremidade 5’. Essas regiões são consequentemente úteis para empacotar e manter o RNA NA do tipo selvagem bem como RNAs NA mutantes, ex., RNAs com deleções e/ou inserções internas. Assim, os vírus quiméricos recombinantes da invenção incluirão pelo menos sinais de empacotamento da região codificadora 3’ UTR e uma parte da região codificadora 3’ NA, e preferivelmente incluirá sinais de empacotamento de ambas as partes 3’ e 5’ UTRs e 3’ e 5’ da sequência NA.

[0094] Métodos para localizar sinais de empacotamento são conhecidos. Em particular, Gog et al., Nucl. Acids Res. (2007) 35:1897-1907 encontraram grupos de códons de alta significância estatística com variação sinonímica mais baixa do que o esperado no genoma do vírus da influenza, localizados nas regiões terminais dos segmentos, onde a presença de sinais de empacotamento específicos é conhecida. A análise mutacional sinonímica dessas regiões confirmou a capacidade do seu método de identificar elementos de cis-atuação funcionalmente significativos (i.e., sinais de empacotamento) no genoma do vírus no nível do nucleotídeo único. Usando esses métodos, então, sinais de empacotamento para o segmento de NA de várias cepas do vírus e subtipos podem ser facilmente identificados. A determinação da eficiência de empacotamento dos segmentos de RNA viral recombinante pode ser realizada usando-se técnicas já conhecidas. Ver, ex., Dos et al., Virology (2005) 341:34-46.

[0095] Geralmente, as sequências de empacotamento de NA para uso na presente invenção incluirão pelo menos 19 nucleotídeos da 3’ UTR adjacente à sequência codificadora de NA, preferivelmente 19-30 nucleotídeos, tais como 19, 20...25...30...35 nucleotídeos e pelo menos 28 nucleotídeos da 5’ UTR adjacente à sequência codificadora de NA, preferivelmente 28-50 nucleotídeos, tais como 28, 29, 30...35...40...45...50 nucleotídeos. As sequências de empacotamento de NA também incluirão cerca de 145 a 250, preferivelmente 150-200 nucleotídeos de pelo menos o terminal 3’ da sequência codificadora e opcionalmente de cada extremidade da região codificadora para o segmento de NA. Assim, por exemplo, as sequências de empacotamento do vírus da influenza podem compreender sequências correspondendo ao terminal 3’ do RNA viral de NA incluindo sequências correspondendo ao N-terminus da região codificadora de NA, ex., pelo menos 150 nucleotídeos do terminal 3’ de um RNA viral de NA tipo A tais como 150, 151, 152, 153, 154, 155...160...165...170...175...180...185...190, e assim por diante, e, opcionalmente, sequências de empacotamento correspondendo ao terminal 5’ do RNA viral de NA incluindo sequências correspondendo ao C- terminus da região codificadora de NA, ex., 150, 151, 152, 153, 154, 155...160...165...170...175...180...185...190, e assim por diante.

[0096] Em uma representação em particular, pode ser fornecido um construto que inclui um segmento HA de um subtipo da influenza suína e sequências de empacotamento para outro subtipo da influenza suína localizado em 3’ e opcionalmente 5’ do segmento de HA. Como descrito nos exemplos, foi preparado um construto que incluiu um H3N2 HA flanqueado por sequências de empacotamento de H1N1. Esse construto em particular compreende uma sequência de H3N2 HA, flanqueada por 19 nucleotídeos da 3” UTR adjacente a uma sequência de H1N1 NA e 183 nucleotídeos da região codificadora 3’ NA e 28 nucleotídeos da 5’ UTR adjacente à sequência de NA e 157 nucleotídeos da região codificadora 5’ NA. Entretanto, o remanescente da região codificadora de NA é ausente. Tipicamente, as sequências de empacotamento usadas são homólogas ao vírus espinha dorsal. Assim, se um subtipo H1N1 é usado como a espinha dorsal (i.e., todos os segmentos H1N1 estão presentes no vírus recombinante com exceção do todo ou uma parte do segmento de NA), as sequências de empacotamento de NA do H1N1 serão retidas e o remanescente da sequência de NA do H1N1 convenientemente substituída por uma sequência de HA de um diferente subtipo, como uma sequência de HA do H3N2.

[0097] Se desejado, ao invés de uma deleção, a região codificadora de NA pode ser transformada de modo a que a propagação do vírus seja impedida. A região NA pode ser mutagenizada in vitro pela substituição dos nucleotídeos apropriados para resultar nas desejadas alterações de aminoácidos. Essa alteração pode incluir apenas um nucleotídeo, efetuando uma mudança em um único aminoácido, ou pode abranger várias mudanças de nucleotídeos. Mutantes podem ser produzidos através de métodos padrão da mutagênese dirigida. As mutações podem ser efetuadas usando um iniciador incompatível que hibridiza para a sequência de nucleotídeo correspondente (geralmente cDNA correspondente à sequência de RNA), a uma temperatura abaixo da temperatura de fusão do duplex incompatível. O iniciador pode ser tornado específico mantendo-se o comprimento do iniciador e a composição de base dentro de limites relativamente estritos e mantendo-se a base mutante centralmente localizada. Ver, ex., Innis et al, (1990) PCR Applications: Protocols for Functional Genomics; Zoller and Smith, Methods Enzymol. (1983) 100:468; Wu (Ed.), Meth. In Enzymol. Vol. 217, San Diego: Academic Press (1993); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492.

[0098] A mutação de NA (ex., deleção de todo ou de uma parte da sequência codificadora de NA exceto as sequências abrigando sinais de empacotamento) é preferivelmente uma que impeça a propagação do vírus.

[0099] A eficiência de replicação de um vírus da influenza atenuado pode ser determinada, por exemplo, pela medição do tamanho de placa em células de rim canino Madin-Darby (MDCK), pela medição de títulos de vírus em múltiplos ciclos de crescimento, ou isolando-se o vírus de tecido pulmonar infectado e medindo-se os títulos. Por exemplo, um vírus da influenza suína atenuado da invenção permite o vírus atenuado, em uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 0.0005, 0.0007, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, ou 6.0, para cultivo de títulos entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 vezes, aproximadamente 2 a aproximadamente 90 vezes, aproximadamente 5 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 20 a aproximadamente 80 vezes, ou aproximadamente 40 a aproximadamente 80 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 vezes, ou aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100 vezes mais baixos do que no vírus da influenza suína do tipo selvagem em cultura celular, ex., células MDCK; células de um humano (ex., PerC6, uma linhagem celular produtora derivada de retinoblastos embrionários humanos transformados com a região E1 do Adenovírus 5); camundongo, galinha (ex., fibroblastos de embrião de galinha); rato; aves; ou porco (ex., células PK(D1), células PK(15), células PK13, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK- 4, células ST, células PT-K75, células PK-2a/CL 13 ou SJPL). A eficiência de replicação pode ser determinada por um teste de hemaglutinação de BALF de porcos ou sobrenadantes de células de porco aproximadamente 2 a 10 dias, 3 a 7 dias, 3 a 5 dias, ou 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias pós-infecção ou quando os vírus são plaqueados em células MDCK. Em uma representação, o crescimento de um vírus da influenza suína atenuado da invenção é comparado com um padrão particular ou referência, ex., o vírus da influenza suína do tipo selvagem A/swine/Texas/4199-2/98. Outra medida de atenuação é cultivar o vírus na ausência de sialidase e medir títulos em comparação com uma cepa do tipo selvagem de referência conforme o acima.

[0100] Em adição às sequências de HA, e as sequências de empacotamento descritas acima, o vírus da influenza quimérico recombinante também incluirá os segmentos virais remanescentes, segmentos 1-3, 5, 7 e 8, ou seja, os segmentos codificando PB2 (segmento 1), PB1 (segmento 2), PA (segmento 3), NP (segmento 5), M1 e M2 (segmento m7), NS1 e NEP (segmento 8). Sequências de ácido nucleico e polipeptídeos para esses segmentos, bem como segmentos 4 (codificando (HA) e 6 (codificando NA) de um número de isolados do vírus da influenza são conhecidos. Sequências da influenza representativas são aqui apresentadas nas Figuras 5-13. Sequências representativas adicionais para os segmentos da influenza 8 dos isolados da influenza encontrados em várias espécies estão listados no banco de dados do Centro Nacional para Biotecnologia da Informação (NCBI) e Banco de Dados de Pesquisa da Influenza encontrado em fludb.org. Ver também Ferguson et al. (2003) Nature 422: 428-433; Lin et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 9654-9658; Nguyen et al. (2005) J. Virol. 79:4201-4212; Ha et al. (2002) EMBO J. 21:865-875; and Chan et al. (2004) J. Microbiol. Immunol. Infect. 37:135-144; para comparações de sequência e uma discussão da diversidade genética e análise filogenética do vírus da influenza.

[0101] Qualquer uma dessas sequências, bem como as suas variantes podem ser usadas para produzir os vírus quiméricos recombinantes da influenza. Assim, a invenção inclui variantes das sequências acima apresentando pelo menos 80-100% de identidade de sequência com as mesmas, incluindo qualquer percentual de identidade dentro desses limites, tais como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidade de sequência com a mesma.

[0102] Os segmentos acima descritos podem ser derivados de qualquer um dos vários vírus da influenza suína, incluindo, sem limitação, A/swine/Saskatchewan/18789/02, A/Swine/Colorado/1/77, A/Swine/Colorado/23619/99, A/Swine/Cote d'Armor/3633/84, A/Swine/Cote d'Armor/3633/84, A/Swine/England/195852/92, A/Swine/Finistere/2899/82, A/Swine/Hong Kong/10/98, A/Swine/Hong Kong/9/98, A/Swine/Hong Kong/81/78, A/Swine/Illinois/100084/01, A/Swine/Illinois/100085A/01, A/Swine/Illinois/21587/99, A/Swine/Indiana/1726/88, A/Swine/Indiana/9K035/99, A/Swine/Indiana/P 12439/00, A/Swine/Iowa/30, A/Swine/Iowa/15/30, A/Swine/Iowa/533/99, A/Swine/Iowa/569/99, A/Swine/Iowa/3421/90, A/Swine/Iowa/8548-1/98, A/Swine/Iowa/930/01, A/Swine/Iowa/17672/88, A/Swine/Italy/1513-1/98, A/Swine/Italy/1523/98, A/Swine/Korea/CY02/02, A/Swine/Minnesota/55551/00, A/Swine/Minnesota/593/99, A/Swine/Minnesota/9088-2/98, A/Swine/Nebraska/1/92, A/Swine/Nebraska/209/98, A/Swine/Netherlands/12/85, A/Swine/North Carolina/16497/99, A/Swine/North Carolina/35922/98, A/Swine/North Carolina/93523/01, A/Swine/North Carolina/98225/01, A/Swine/Oedenrode/7C/96, A/Swine/Ohio/891/01, A/Swine/Oklahoma/18717/99, A/Swine/Oklahoma/18089/99, A/Swine/Ontario/01911-1/99, A/Swine/Ontario/01911-2/99, A/Swine/Ontario/41848/97, A/Swine/Ontario/97, A/Swine/Quebec/192/81, A/Swine/Quebec/192/91, A/Swine/Quebec/5393/91, A/Swine/Taiwan/7310/70, A/Swine/Wisconsin/464/98 e A/Swine/Wisconsin/14094/99.

[0103] Em uma representação em particular, um H3N2 HA é usado no lugar de toda ou parte de uma sequência de H1N1 NA em uma espinha dorsal de H1N1. Dessa forma, o vírus recombinante resultante inclui dois HAs e o remanescente dos segmentos virais. Ver Figura 1.

[0104] Cada um dos segmentos acima descritos pode ser isolado do RNA viral usando métodos conhecidos. Por exemplo, ácidos nucleicos podem ser obtidos pela triagem de cDNA e/ou bibliotecas genômicas de células infectadas com vírus, ou pela derivação do gene de um vetor conhecido por incluir o mesmo. Por exemplo, polinucleotídeos de interesse podem ser isolados de uma biblioteca genômica derivada de RNA viral de um sujeito infectado. Alternativamente, o vírus da influenza pode ser isolado de mamíferos infectados ou de amostras biológicas (ex., secreções nasais, nasofaríngeas, da garganta ou conjuntivas, sangue, ou esfregaços anais) coletadas de sujeitos infectados. Uma vez obtido, o vírus pode ser propagado usando técnicas conhecidas, tais como descrito em Mochalova et al., Virology (2003) 313:473-480; Lin et al., Virology (1997) 233:402-410; Hardy et al., Virology (1995) 211:302-306; Hinshaw et al., J. Gen. Virol. (1978) 41:115-127. O ácido nucleico também pode ser obtido diretamente do vírus da influenza em questão.

[0105] Dessa maneira, sequências de nucleotídeos em particular podem ser obtidas de vetores abrigando as sequências desejadas ou sintetizadas completamente ou em parte usando várias técnicas de síntese de oligonucleotídeo conhecidas, tais como técnicas de mutagênese dirigida e reação por cadeia de polimerase (PCR) quando apropriado. Ver, ex., Sambrok, supra. Um método para obter sequências de nucleotídeo codificando as sequências desejadas é através do recozimento de conjuntos complementares de oligonucleotídeos sintéticos sobrepostos produzidos em um sintetizador de polinucleotídeos automatizado convencional, seguido de ligação com uma ligase de DNA apropriada e amplificação da sequência de nucleotídeo ligada via PCR. Ver, ex., Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. Adicionalmente, a síntese direcionada de oligonucleotídeo (Jones et al. (1986) Nature 54:75-82), mutagênese direcionada de oligonucleotídeo de regiões pré-existentes de nucleotídeo (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 and Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), e preenchimento enzimático de oligonucleotídeos com lacunas usando T4 DNA polimerase (Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) podem ser usados para produzir moléculas modificadas.

[0106] Um método de amplificação como o PCR pode ser usado para amplificar polinucleotídeos incluindo os vários segmentos. Em uma representação, esses segmentos são transcritos reversamente em cDNA e amplificados usando RT-PCR. Ver, ex., Hoffmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:6108-6113. O cDNA de cada segmento é clonado para fornecer plasmídeos separados para uso na preparação do vírus quimérico recombinante da influenza. Em algumas representações, o vetor de clonagem pHW2000 (Hoffmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:6108-6113) pode ser usado. Entretanto, os segmentos podem ser clonados em qualquer vetor apropriado. Numerosos vetores de clonagem são conhecidos dos especialistas, e a seleção de um vetor de clonagem adequado é uma questão de escolha. Exemplos de vetores de DNA recombinantes para clonagem e células hospedeiras que eles podem transformar incluem o bacteriófago À (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bactéria gram-negativa), pGV1106 (bactéria gram-negativa), pLAFR1 (bactéria gram-negativa), pME290 (bactéria gram-negativa não-E. coli), pHV14 (E. coli e Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) e o papiloma vírus bovino (células mamárias). Ver, geralmente, DNA Cloning: Vols. I & II, supra; Sambrook et al., supra; B. Perbal, supra.

[0107] O vírus atenuado quimérico recombinante da influenza compreendendo mais de uma sequência de HA de mais de um subtipo da influenza pode então ser produzido por qualquer método conhecido. Preferivelmente é usada genética reversa para produzir os vírus recombinantes. A genética reversa usa complexos de polimerase de RNA isolados das células infectadas com o vírus da influenza para transcrever segmentos artificiais de genoma do vírus da influenza contendo a(s) mutação(ões). O(s) segmento(s) sintetizado(s) de RNA é incorporado em partículas de vírus usando um vírus auxiliar, e vírus contendo as mudanças necessárias são então selecionados. Métodos de genética reversa para vírus da influenza são descritos, por exemplo, em Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1990) 87:3802 3805; Enami and Palese, J. Virol. (1991) 65:2711-13; Luytjes, Cell (1989) 59:1107-13; Fodor et al., J. Virol. (1999) 73:9679-9682; Gao et al., J. Virol. (2008) 82:6419-6426; Quinlivan et al., J. Virol. (2005) 79:8431-8439; e Pat. US Nos. 5,578,473, 6,974,686 e 7,037,707.

[0108] Sistemas de genética reversa recentemente desenvolvidos, baseados inteiramente em cDNA, permitiram a manipulação do genoma viral da influenza. Ver, ex., Palese et., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:11354; Neumann and Kawaoka, Adv. Virus Res. (1999) 53:265; Neumann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:9345; Fodor et al., J. Virol. (1999) 73:9679. Em uma técnica, transcritos de RNA viral modificado são transcritos in vitro a partir de construtos de cDNA na presença de proteínas NP, PB1, PB2, e PA purificadas. O RNP sintético resultante é então transfectado em células previamente infectadas com o vírus auxiliar da influenza. Esse vírus auxiliar geralmente possui um defeito de crescimento condicional, assim como restrição de limite de hospedeiro ou sensibilidade à temperatura, o que permite a subsequente seleção dos vírus transfectantes. Por exemplo, vírus auxiliares gama de hospedeiros foram usadas com sucesso para recuperar genes NA e PB2 sintéticos. Ver Enami, supra, e Subbarao, J Virol (1993) 67:7223-28.

[0109] Em representações preferíveis, um sistema de oito plasmídeos é usado para gerar vírus atenuados da influenza. Ver, ex., Hoffmann et al., Vaccine (2002) 20:3165-3170; Hoffmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U SA (2000) 97:6108-6113; e U.S. Patent Publication No. 20040029251. Nessa representação, os plasmídeos abrigando os oito segmentos dos vírus da influenza desejados, tais como os dois segmentos de HA, bem como segmentos codificando a proteína ácida de polimerase (PA), as proteínas básicas de polimerase 1 e 2 (PB1 e PB2), o segmento matriz (M) codificando proteínas matriz 1 e 2 (M1 e M2), a nucleoproteína (NP), e o segmento não estrutural (NS) codificando proteínas não estruturais 1 e 2 (NS1 e NEP), são co-transfectados em uma célula apropriada resultando no vírus quimérico recombinante descrito aqui. Ver também Patente US 6.951.754 que descreve oito sistemas genéticos reversos promotores de dual plasmídeos para a produção de vírus atenuados da influenza usando um sistema pol I-pol II.

[0110] A produção de formulações de vacinas de vírus atenuados vivos é conseguida usando métodos convencionais envolvendo a propagação do vírus quimérico recombinante em qualquer substrato que permita que o vírus desenvolva títulos suficientes para uso futuro. Tipicamente, os vírus são propagados em células, ovos embrionários, e/ou animais seguido de purificação. Geralmente, os vírus da influenza são cultivados em ovos de galinha embrionários ou células mamárias, tais como células de rim canino Martin-Darby (MDCK), células de rim bovino Martin-Darby (MDBK), células de porcos, ou células do macaco verde africano (Vero), usando técnicas conhecidas. Ver, ex., Mochalova et al., Virology (2003) 313:473-480; Lin et al., Virology (1997) 233:402-410; Hardy et al., Virology (1995) 211:302-306; Hinshaw et al., J. Gen. Virol. (1978) 41:115-127. Células de porcos representativas incluem linhagens celulares de rim suíno, linhagens celulares de testículos suínos e linhagens celulares de pulmão suíno, tais como, mas não limitado a, células PK(D1), células PK(15), células PK13, células SJPL, células NSK, células LLC-PK1, células LLC-PK1A, células ESK-4, células ST, células PT-K75, e células 13 PK-2a/CL.

[0111] Em outra representação, os vírus suínos quiméricos recombinantes da influenza são propagados em células de galinha, ex., fibroblastos do embrião de galinhas derivados de, por ex., ovos embrionados por 6-14 dias. Em outras representações, ovos jovens ou imaturos embrionados podem ser usados para propagar os vírus da invenção. Os ovos embrionados imaturos abrangem ovos que tem menos de dez dias. Ovos embrionados imaturos também podem ser ovos que imitam ovos imaturos como resultado de alterações das condições de crescimento, ex., mudanças nas temperaturas de incubação; tratamento com drogas; ou qualquer outra alteração que resulte em um ovo com um desenvolvimento retardado. Os vírus da influenza suína podem ser propagados em diferentes locais dos ovos embrionados, por ex., a cavidade alantoide.

[0112] Em uma representação específica, os vírus atenuados da influenza suína da presente invenção são propagados em qualquer substrato que permita que o vírus desenvolva títulos comparáveis àqueles determinados para as cepas do vírus da influenza suína do tipo selvagem. Preferivelmente, os viriões são cultivados na presença de sialidase já que o segmento de NA no vírus quimérico recombinante é deficiente.

[0113] É preferível que o vírus seja altamente purificado antes da formulação da vacina. Geralmente, os procedimentos de purificação resultarão na remoção extensiva do DNA celular, outros componentes celulares, e agentes adventícios. Procedimentos que degradam ou desnaturam extensivamente o DNA também podem ser usados. Ver, ex., Mizrahi, ed., Viral Vaccines, Wiley-Liss, New York (1990). Métodos de purificação são conhecidos e podem incluir um ou mais de, por exemplo, centrifugação gradiente, ultracentrifugação, ultracentrifugação zonal, ultracentrifugação de fluxo contínuo e cromatografia, como a cromatografia por troca de íon, cromatografia por exclusão de tamanho, e cromatografia por afinidade líquida, precipitação por polietileno glicol ou sulfato de amônia. B. Composições Anti-Virais

[0114] Os vírus quiméricos recombinantes da influenza, bem como os vírus quiméricos recombinantes da influenza que tenham sido subsequentemente inativados, podem ser formulados em composições para administração a sujeitos tanto para inibir infecção quanto para aumentar uma resposta imune ao vírus da influenza. Assim, tanto uma vacina ou formulação imunogênica de um vírus vivo recombinante da influenza suína quanto uma vacina ou formulação imunogênica de um vírus inativado recombinante da influenza suína podem ser formulados. Uma vacina viva ou formulação imunogênica pode ser preferível porque a multiplicação no hospedeiro leva a um estímulo prolongado de tipo e magnitude similar à que ocorre em infecções naturais, e consequentemente, confere substancial e duradoura imunidade. A produção dessas formulações de vacina e formulações imunogênicas do vírus vivo recombinante da influenza suína pode ser conseguida através de métodos convencionais envolvendo propagação como descrita acima. Quando formulada como uma vacina de vírus vivo, um limite de cerca de 102 a 108 pode ser usado, preferivelmente de cerca de 103 a 107, mais preferivelmente 104 pfu a cerca de 5x106, e mais preferivelmente cerca de 104 a 107 pfu por dose deve ser usado.

[0115] Formulações de vacinas inativadas podem ser preparadas através de técnicas convencionais para “matar” os vírus atenuados. Vacinas inativadas são “mortas” no sentido de que a sua infecctividade foi destruída. Idealmente, a infectividade do vírus é destruída sem afetar a sua imunigenicidade. De modo a preparar vacinas inativadas, o vírus atenuado é cultivado e purificado como descrito acima. O vírus purificado é então inativado usando um dos vários métodos conhecidos dos especialistas. Esses métodos incluem meios tanto químicos quanto físicos. Meios químicos para inativar um vírus da influenza incluem o tratamento do vírus com uma quantidade eficaz de um dos seguintes agentes: detergentes, formaldeído, formalina, β- propiolactone, ou luz UV. Outros métodos de inativação viral são conhecidos, tais como por exemplo, etilamina binária, acetil etilenoimina, ou irradiação gama. Ver, ex., patentes US 6.635.246; 5.891.705; 5.106.619; e 4.693.981.

[0116] Composições da invenção podem compreender ou ser coadministradas com um antígeno não-influenza ou uma combinação de antígenos, assim como com uma vacina da influenza combinada. Métodos para preparar essas formulações são descritos em, ex., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Edition, 1990. As composições da presente invenção podem ser preparadas para administração mucosa, parenteral, ex., como injetáveis, seja em soluções líquidas ou suspensões. Formas sólidas adequadas para solução em ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada ou o ingrediente ativo encapsulado em veículos de lipossoma. O ingrediente imunogênico ativo é geralmente misturado com um veículo farmacêutico compatível, assim como, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou outros, e combinações dos mesmos. Em adição, se desejado, o veículo pode conter menores quantidades de substâncias auxiliares como agentes umidificadores ou emulsificantes e agentes de tamponamento de pH.

[0117] Se usados para modular uma resposta imune, adjuvantes adicionais que aumentam a eficácia da composição também podem ser adicionados à formulação. Adjuvantes podem incluir, por exemplo, dipéptido de muramilo, avridina, hidróxido de alumínio, brometo dimetildioctadecilamônio (DDA), óleos, emulsões óleo-em-água, saponinas, citocinas, e outras substâncias conhecidas.

[0118] Transportadores também podem ser usados de modo a aumentar a imunogenicidade da vacina. Transportadores apropriados incluem grandes macromoléculas lentamente metabolizadas como proteínas, incluindo albumina sérica, hemocianina de lapa, moléculas de imunoglobina, tiroglobulina, ovalbumina, e outras proteínas bastante conhecidas; polissacarídeos, tais como sefarose, agarose, celulose, contas de celulose e outros; aminoácidos poliméricos como o ácido poliglutâmico, polilisina, e outros; copolímeros de aminoácidos; e partículas de vírus inativos.

[0119] Além disso, as moléculas da influenza podem ser formuladas em composições na forma neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adição ácida (formados com os grupos livres de amino dos polipeptídeos ativos) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos hidroclorídricos ou fosfóricos, ou ácidos orgânicos como o acético, oxálico, tartárico, mandélico, e outros. Sais formados de grupos livres de carboxilo também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio, ou hidróxidos férricos, e bases inorgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e outros.

[0120] As formulações conterão uma “quantidade terapeuticamente eficaz” do ingrediente ativo, ou seja, uma quantidade capaz de alcançar a resposta desejada em um paciente ao qual a composição é administrada. No tratamento e prevenção da infecção pela influenza, por exemplo, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” seria preferivelmente uma quantidade que previne, reduz ou melhora os sintomas da gripe. A quantidade exata necessária irá variar dependendo do paciente sendo tratado; a idade e condição geral do paciente sendo tratado; a capacidade do sistema imune do paciente de sintetizar anticorpos; o grau de proteção desejado; a severidade da doença sendo tratada; a preparação do vírus particular selecionada e seu modo de administração, entre outros fatores. Uma quantidade eficaz apropriada pode ser facilmente determinada por um especialista. Assim, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” cairá em uma gama relativamente ampla que pode ser determinada através de testes de rotina. O vírus quimérico recombinante da influenza tipicamente ficará no limite entre aproximadamente 1% a aproximadamente 95% (w/w) da composição, ou até mesmo mais alto ou mais baixo se apropriado.

[0121] Formulações adicionais que são apropriadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações em aerossol, intranasais, orais, e formulações de liberação prolongada. Para supositórios, a composição veículo incluirá ligantes de transportadores tradicionais, tais como glicóis polialcalinos, ou triglicerídeos. Esses supositórios podem ser formados de misturas contendo o ingrediente ativo no limite de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10% (p/p), preferivelmente aproximadamente 1% a aproximadamente 2%. Veículos orais incluem excipientes normalmente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, magnésio, estearato, celulose sacarina sódica, carbonato de magnésio, e outros. Essas composições de vacina orais podem ser tomadas na forma de soluções, suspensões, tabletes, pílulas, cápsulas, formulações de liberação prolongada, ou pós, e contem entre aproximadamente 10% a aproximadamente 95% do ingrediente ativo, preferivelmente aproximadamente 25% a aproximadamente 70%.

[0122] Formulações intranasais usualmente incluirão veículos que nem causem irritação à mucosa nasal nem prejudiquem substancialmente a função ciliar. Diluentes como a água, solução salina aquosa ou outras substancias conhecidas podem ser empregadas com a invenção. As formulações nasais podem ainda conter preservativos como, mas não limitado a, clorobutanol e cloreto de benzalcônio. Um surfactante pode estar presente para aumentar a absorção das proteínas pela mucosa nasal.

[0123] Formulações de liberação controlada ou prolongada são feitas incorporando-se a proteína a transportadores ou veículos tais como lipossomas, polímeros impermeáveis não-reabsorvíveis como os copolímeros de acetato de etilenovinil e copolímeros HYTREL, polímeros expansíveis como os hidrogéis, polímeros reabsorvíveis como o colágeno e certos poliácidos ou poliésteres como aqueles usados para fazer suturas reabsorvíveis, polifosfazenos, alginato, micropartículas, nanosferas de gelatina, nanopartículas de quitosana, e outros. O vírus da influenza também pode ser administrado usando minibombas implantadas, bastante conhecidas na área. C. Administração

[0124] As composições da invenção serão geralmente administradas diretamente a um paciente. A administração direta pode ser conseguida por injeção parenteral (ex., subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, ou no espaço intersticial de um tecido), ou mucosamente, tal como por administração intratraqueal, retal, oral (ex., tablete, spray), vaginal, tópica, transdérmica (Ver, ex., WO99/27961) ou transcutânea (Ver, ex., WO02/074244 e WO02/064162), intranasal (Ver, ex., WO03/028760), ocular, aural, pulmonar ou outra administração mucosa. Composições imunogênicas também podem ser administradas topicamente por transferência direta para a superfície da pele. A administração tópica pode ser conseguida sem utilizar quaisquer dispositivos, ou pelo contato da pele nua com a composição imunogênica utilizando uma bandagem ou um dispositivo tipo bandagem (ver, ex. Patente US No. 6.348.450).

[0125] Preferivelmente o modo de administração é parenteral, mucosa ou uma combinação de imunizações mucosa e parenteral. Mais preferivelmente ainda, o modo de administração é parenteral, mucosa ou uma combinação de imunizações mucosa e parenteral em um total de 1 a 2 vacinações com intervalo de 1 a 3 semanas. Preferivelmente a via de administração inclui, mas não está limitada a, administração oral, administração intramuscular e uma combinação de administração oral e intramuscular.

[0126] Em uma representação, o método para tratar uma infecção por um vírus da influenza, compreende administrar mucosamente a um paciente que tenha necessidade da mesma uma primeira composição imunogênica compreendendo os vírus da influenza da invenção seguido de administração parenteral de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma segunda composição imunogênica compreendendo os vírus da influenza da invenção.

[0127] A composição imunogênica pode ser usada para obter imunidade sistêmica e/ou mucosa, preferivelmente para obter uma maior imunidade sistêmica e/ou mucosa. Preferivelmente a resposta imune é caracterizada pela indução de um soro IgG e/ou uma resposta imune IgG.

[0128] Em qualquer método envolvendo coadministração, as várias composições podem ser administradas em qualquer ordem. Assim, em representações incluindo a administração de múltiplas diferentes composições ou moléculas, o vírus da influenza não precisa ser administrado antes de outras substâncias imunogênicas. Por exemplo, o primeiro passo pode incluir a administração de um ou mais polipeptídeos e o reforço pode compreender a administração de um ou mais vírus da influenza atenuados. Múltiplas administrações do vírus da influenza podem ser seguidas de múltiplas administrações de outras substâncias. As administrações podem ser realizadas em qualquer ordem. Consequentemente, qualquer combinação de vírus da influenza e outras substâncias imunogênicas pode ser usada para obter uma reação imune. D. Regime de Dosagem

[0129] O tratamento da dosagem pode ser de acordo com um cronograma de dose única ou um cronograma de dose múltipla. Doses múltiplas podem ser usadas em um cronograma de imunização primário e/ou em um cronograma de imunização de reforço. Em um cronograma de dose múltipla, as várias doses podem ser dadas pelas mesmas ou por vias diferentes, ex., um primeiro parenteral e um reforço mucoso, um primeiro mucoso e um reforço parenteral, etc.

[0130] Preferivelmente o regime de dosagem aumenta a avidez da resposta do anticorpo levando a anticorpos com uma característica neutralizante. Um ensaio de neutralização in vitro pode ser usado para testar anticorpos neutralizantes (ver por exemplo Asanaka et al., J. of Virol. (2005) 102:10327; Wobus et al., PLOS Biology (2004) 2; e432; and Dubekti et al., J. Med. Virol. (2002) 66:400). E. Testes para Determinar a eficácia de uma Resposta Imune

[0131] Uma maneira de avaliar a eficácia do tratamento terapêutico envolve o monitoramento da infecção após a administração de uma composição da invenção. Uma maneira de avaliar a eficácia do tratamento profilático envolve o monitoramento das respostas imune contra os antígenos nas composições da invenção após a administração da composição.

[0132] Outra maneira de checar a eficácia do tratamento terapêutico envolve o monitoramento da infecção após a administração das composições da invenção. Uma maneira de checar a eficácia do tratamento profilático envolve o monitoramento das respostas imune tanto sistemicamente (como no monitoramento do nível da produção de IgG1 e IgG2a) quanto mucosamente (como no monitoramento do nível da produção de IgA) contra os antígenos nas composições da invenção após a administração da composição. Tipicamente, as respostas de soro de anticorpos específicos são determinadas pós- imunização mas pré-desafio enquanto que as respostas do corpo a anticorpos específicos da mucosa são determinadas pós-imunização e pós-desafio.

[0133] As composições imunogênicas da presente invenção podem ser avaliadas em modelos animais in vitro e in vivo antes da administração ao hospedeiro. A eficácia das composições imunogênicas da invenção pode ser determinada in vivo desafiando modelos animais de infecção, ex., porquinhos da índia ou camundongos ou porcos, com as composições imunogênicas. As composições imunogênicas podem ou não ser derivadas das mesmas cepas que as cepas de desafio. Modelos de camundongos particularmente úteis incluem aqueles na qual a imunização intraperitoneal é seguida ou por desafio intraperitoneal ou desafio intranasal. A eficácia in vivo de modelos de camundongos inclui, mas não está limitada ao modelo de infecção de murino usando cepas de suínos e um modelo de doença de murino que é um modelo de murino usando uma cepa adaptada de camundongo, tais como as cepas que são particularmente virulentas em camundongos.

[0134] A resposta imune pode ser uma ou ambas de uma resposta imune TH1 e uma resposta TH2. A resposta imune pode ser uma resposta imune melhorada, intensificada ou alterada. A resposta imune pode ser uma ou ambas de uma resposta imune sistêmica e uma resposta imune mucosa. Preferivelmente a resposta imune é uma resposta sistêmica e/ou mucosa intensificada.

[0135] Uma imunidade sistêmica e/ou mucosa intensificada é refletida em uma resposta imune TH1 e/ou TH2 intensificada. Preferivelmente, a resposta imune intensificada inclui um aumento na produção de IgG1 e/ou IgG2 e/ou IgA. Preferivelmente a resposta imune mucosa é uma resposta imune TH2. Preferivelmente, a resposta imune mucosa inclui um aumento na produção de IgA.

[0136] Células TH2 ativadas intensificam a produção de anticorpos e são consequentemente valiosas na resposta a infecções extracelulares. Células TH2 ativadas podem secretar um ou mais de IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10. Uma resposta imune TH2 pode resultar na produção de IgG1, IgE, IgA e células B de memória para proteção futura.

[0137] Uma resposta imune TH2 pode incluir um ou mais de um aumento de uma ou mais das citocinas associadas a uma resposta imune TH2 (tais como IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10), ou um aumento na produção de IgG1, IgE, IgA e células B de memória. Preferivelmente, a resposta imune TH2 intensificada incluirá um aumento na produção de IgG1.

[0138] Uma resposta imune TH1 pode incluir um ou mais de um aumento em CTLs, um aumento em uma ou mais das citocinas associadas a uma resposta imune TH1 (tais como IL-2, IFNy, e TNFβ), um aumento em macrófagos ativados, um aumento na atividade de NK, ou um aumento na produção de IgG2a. Preferivelmente, a resposta imune TH1 intensificada incluirá um aumento na produção de IgG2a.

[0139] Composições imunogênicas da invenção, em particular, composição imunogênica compreendendo um ou mais antígenos da presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros antígenos opcionalmente com um agente imunoregulador capaz de obter uma resposta Th1 e/ou Th2.

[0140] As composições imunogênicas da invenção irão preferivelmente obter tanto uma resposta imune mediada por célula quanto uma resposta imune humoral de modo a atacar efetivamente uma invenção. Essa resposta imune preferivelmente induzirá duradouros anticorpos (neutralizantes) e uma imunidade mediada por célula que pode responder rapidamente à exposição a um ou mais antígenos infecciosos. A título de exemplo, a evidência de anticorpos neutralizantes em amostras de sangue do paciente é considerada como um parâmetro substituto para proteção já que a sua formação é de importância decisiva para a eliminação do vírus em infecções TBE (ver Kaiser and Holzmann, Infection 28; 78-84). F. Kits

[0141] A invenção também fornece kits compreendendo um ou mais recipientes de composições da invenção. As composições podem ser na forma sólida, forma líquida ou podem ser liofilizadas. Recipientes apropriados para as composições incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser de uma variedade de materiais, incluindo vidro ou plástico. O recipiente deve ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável pela agulha de uma injeção hipodérmica).

[0142] O kit pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, como uma solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, ou solução de dextrose. Também pode conter outros materiais uteis para o usuário final, incluindo outras soluções de formulação farmaceuticamente aceitáveis como tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas ou outros dispositivos de administração. O kit pode ainda incluir um terceiro componente compreendendo um adjuvante.

[0143] Para vias mucosas, a composição pode ser embalada para administração nasal, como por spray nasal, gotas nasais, gel ou pó. Ver, ex., Almeida & Alpar, J. Drug Targeting (1996) 3:455-467; Agarwal & Mishra, Indian J. Exp. Biol. (1999) 37:6-16 ou em dispositivos de inalação bastante conhecidos.

[0144] O kit também pode compreender uma bula contendo instruções por escrito para métodos de indução de imunidade ou para tratamento de infecções. A bula pode ser um esboço de bula sem aprovação ou pode ser uma bula aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) ou outro órgão regulador.

[0145] A invenção também fornece um dispositivo de administração preenchido com as composições imunogênicas da invenção. 3. EXPERIMENTAL

[0146] Abaixo estão exemplos de representações específicas para realizar a presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas com o propósito ilustrativo, e não pretendem de forma alguma limitar o escopo da presente invenção.

[0147] Esforços tem sido feitos para assegurar a precisão referente aos números utilizados (ex., quantidades, temperaturas, etc.), mas algum erro experimental e desvio deve ser, naturalmente, permitido. Exemplo 1 Geração de um Vírus Recombinante incluindo ambos os HAs H1 e H3

[0148] Um vírus quimérico recombinante da Influenza A possuindo um genoma segmentado em oito, foi produzido conforme detalhamento abaixo. O vírus incluiu sete segmentos de um vírus H1N1 suíno com a maioria do segmento de NA substituído por uma sequência da região codificadora H3 HÁ ladeada pelas sequências de empacotamento de NA. Assim o vírus incluiu HAs de dois diferentes tipos da influenza suína, H1 HA e H3 HA. Como NA é essencial para a propagação do vírus, a função de NA foi fornecida através do cultivo do vírus na presença de sialidase (neuraminidase).

[0149] Em particular, de modo a gerar um vírus recombinante da influenza suína carregando duas diferentes moléculas de HA, o segmento de NA em um vírus da influenza suína H1N1, A/swine/Saskatchewan/18789/02, aqui chamado de “SIV SK02” (obtido de Prairie Diagnostic Services, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan, Canada) foi substituído por um segmento de H3 HA do vírus da Influenza A H3N2, A/Swine/Texas/4199-2/98 (aqui chamado de “SIV Tx98”) (Figura 1A). A estrutura de leitura aberta (ORF) de H3 HA derivada de SIV-Tx98 foi ladeada por sinais de empacotamento de NA que incluíram 202nt na terminação 3’ (19nt da 3’ UTR e 183nt da região codificadora de 3’ NA) e 185nt na terminação 5’ (28nt da 5’ UTR e 157nt da região codificadora 5’ NA) da cepa SIV-SK02 (H1N1) (Figura 1B). O plasmídeo pHW-SIV-NA-H3HA codificando H3 HA ladeado por sinais de empacotamento de NA foi construído modificando-se um plasmídeo original pHW-SIV/SK-NA. Brevemente, os sinais de empacotamento de NA segmento-specíficos nas terminações 3’ e 5’ (202nt e 185nt respectivamente), foram amplificados por reação em cadeia de polimerase (PCR) usando pHW-SIV/SK-NA como modelo e os seguintes conjuntos de iniciadores: para amplificar o sinal de empacotamento 3’ NA, 5'- TAATACGACTCACTATAGGG-3' (SEQ ID NO:21) e 5’- GTCATTTCCGGGAAGTTTTTGCACCCAAGTATTGTTTTCGTAG-3’ (SEQ ID NO:22) foram usados; para amplificar o sinal de empacotamento 5’ NA, 5’- GCTGAAATCAGGATACAAAGATTGAGGCCTTGCTTCTGGGTTG-3’ (SEQ ID NO:23) e 5’-ACAGGTGTCCGTGTCGCG-3’ (SEQ ID NO:24) foram usados. O ectodomínio de H3 HA (excluindo sequência de peptídeo de sinal) de SIV/Tx98 foi amplificado por PCR usando pHW-Tx98 HA como um modelo e 5’- CTACGAAAACAATACTTGGGTGCAAAAACTTCCCGGAAATGAC-3’ (SEQ ID NO:25) e 5’-CAACCCAGAAGCAAGGCCTCAATCTTTGTATCCTGATTTCAGC- 3’ (SEQ ID NO:26) como iniciadores. As três peças de produtos de PCR foram juntadas por sobreposição de PCR. Finalmente, esse produto de PCR foi digerido por NaeI/NheI e substituído o segmento correspondente em pHW- SIV/SK-NA. O plasmídeo construído foi sequenciado por DNA para assegurar que mutações adicionais não fossem introduzidas durante a sobreposição de PCRs.

[0150] Esse construto foi inserido no vetor de clonagem pHW2000 (Hoffmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:6108-6113) para fornecer o plasmídeo-606. O vetor de clonagem pHW2000 contem 225 bp do promotor humano pol I e 33 bp da sequência terminadora de murino separada por dois locais BsmB1. O promotor pol I e elementos terminadores são ladeados por um promotor imediato-precoce truncado do citomegalovirus humano e pelo gene codificando o hormônio do crescimento bovino.

[0151] O vetor pHW2000 foi co-transfectado com plasmídeo-606 e sete plasmídeos que incluíram segmentos PB2, PB1, PA, HA, NP, M e NS da cepa SIV-SK02 como descrito em Masic et al., J. Gen. Virol. (2009) 90:375-385, na presença de 10 um/ml de sialidase de vibrio cólera que resultou no resgate bem sucedido de um vírus quimérico recombinante chamado “SIV/SK-606 ou SIV-606”. Esse vírus mutante SIV/H1H3 SIV foi resgatado usando um sistema de genética reversa de 8-plasmídeos descrito por Hoffmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:6108-6113. Em resumo, células 293T e MDCK foram co-cultivadas na mesma densidade (2.5 x 105 células/poço) em uma placa de 6-poços e mantidas em DMEM contendo 10% de FBS a 37°C, 5% CO2 por 24 horas. Uma hora antes da transfecção, o meio contendo FBS foi substituído por Opti-MEM (Invitrogen) fresco. Para resgatar SIV/SK-606, células foram transfectadas com construtos de oito plasmídeos (pHW-SIV/SK-PB2, pHW- SIV/SK-PB1, pHW-SIV/SK-PA, pHW-SIV/SK-HA, pHW-SIV/SK-NP, pHW-SIV- NA-H3HA, pHW-SIV/SK-M e pHW-SIV/SK-NS) por reagente de transfecção Transit-LT1 (Mirus, Madison, Wisconsin). Seis horas depois, a mistura de transfecção foi substituída por 1 ml de Opti-MEM fresco. Vinte e quatro horas pós-transfecção, um ml de Opti-MEM contendo 0,4% de BSA, 2μg/ml de tripsina TPCK-tratada e 10mU/ml de neuraminidase de Vibrio Cholerae (Sigma, N6514) foram adicionados às células transfectadas. O sobrenadante foi coletado 96 horas pós-transfecção. O efeito citopatogênico (CPE) foi observado após a terceira passagem consecutiva em células MDCK e a presença do vírus foi confirmada por um teste de hemaglutinação. Exemplo 2 Caracterização de SIV/SK-606

[0152] Para confirmar que o vírus recombinante SIV/SK-606 possuía ambos os segmentos HA H1 e H3 em seu genoma, o RNA viral foi isolado dos viriões purificados. Em resumo, vírus cultivados em cultura de tecido foram coletados por ultracentrifugação e sujeitados a uma centrifugação por gradiente de sacarose (Masic et al., J. Gen. Virol. (2009) 90:375-385). Para purificação do RNA, viriões purificados foram processados de acordo com as instruções do fabricante de Trizol (Invitrogen). A transcrição reversa foi realizada usando o iniciador Uni12 (Hoffman et al., Arch. Virol. (2001) 146:2275-2289) que especificamente amplifica os RNAs virais. O PCR foi realizado usando iniciadores específicos para H1 ( Fw 5' TGGCCAAACCATGAGACAAC 3' (SEQ ID NO:27) e Bw 5' GGCGTTATTCCTCAGTTGTG 3' (SEQ ID NO:28)) e H3 HAs ( Fw 5’ CGCAATCGCAGGTTTCATAG 3’ (SEQ ID NO:29) e Bw 5’ CAACCCAGAAGCAAGGCCTCAATCTTTGTATCCTGATTTCAGC 3’ (SEQ ID NO:30)).

[0153] Enquanto os produtos de PCR representando o segmento H1 HA foram detectados apenas nos genomas SK02 e SIV-606, as faixas de PCR representando o segmento H3 HA foram observadas na extração de RNA viral Tx98 e SIV-606. Esses dados demonstraram que o genoma de SIV-606 incluiu ambos os segmentos HA H1 e H3.

[0154] Para examinar se ambos os HAs foram expressados, lisados de célula infectada viral foram sujeitados a análise por Western Blot usando anticorpos específicos para H1HA, H3HA e M1. Em resumo, células MDCK foram infectadas com o tipo selvagem de SIV/SK02, o tipo selvagem de SIV/Tx98, ou SIV-606 em um MOI de 0,01. Quarenta e oito horas pós-infecção, lisados celulares foram preparados e sujeitados a análise Western blot usando anticorpos específicos para H1 HA (Anti-HA (A/California/06/2009( (H1N1) anticorpo monoclonal, eEnzyme (Maryland, USA), H3 HA (Anti-multi- Hemagglutininas (H3N2) Anticorpo, coelho IgG, eEnzyme (Maryland, USA) e M1 (Shin et al., J Gen Virol (2007) 88:942-950).

[0155] A proteína M1 foi detectada em todas as células infectadas por vírus, entretanto, H1 HA foi visto apenas em células infectadas SK02 e SIV-606 e H3 HA foi visto em amostras de Tx98 e SIV-606. Em conjunto, esses dados demonstram que o segmento H3 foi incorporado no genoma de SIV-606 e ambos os HAs foram expressados.

[0156] Para observar a morfologia do vírus recombinante, foi realizada microscopia eletrônica de transmissão por coloração negativa. A maior parte dos viriões apresentou partículas envelopadas esféricas de aproximadamente 100 mm de diâmetro, que lembrou a morfologia do vírus do tipo selvagem.

[0157] O potencial de replicação do SIV-606 foi investigado em células MDCK. Na presença de sialidase, SIV-606 formou placas similares em tamanho às do vírus do tipo selvagem. Em contraste, SIV-606 não se desenvolveu na ausência de sialidase, indicando que a replicação do vírus recombinante era dependente da sialidase. O potencial de crescimento e cinética do SIV-606 também foi determinado. Como mostrado na Figura 2, SIV- 606 alcançou um patamar em 24 h.p.i. como o vírus do tipo selvagem. SIV-606 se desenvolveu até um título de 7x 106 PFU/ml, que foi aproximadamente 1 log mais baixo que o vírus do tipo selvagem. Esses resultados indicaram que embora o SIV-606 tenha um título ligeiramente mais baixo, ele se desenvolveu até um título relativamente alto em cultura celular, o que permite a propagação do vírus. Exemplo 3 Patogenicidade de SIV-606 em Porcos

[0158] A patogenicidade o SIV-606 foi avaliada em porcos. Trinta e cinco porcos com 4 semanas SIV-negativos foram divididos aleatoriamente em sete grupos de cinco porcos. Esses foram infectados intratraquealmente com 4 ml MEM contendo 1x105 ou 1x106 PFU/ml SK02 WT, SIV-606 ou Tx98. Os animais no grupo controle foram infectados de modo simulado apenas com meio (Tabela 1). A temperatura retal foi monitorada diariamente. No 5° dia pós- infecção os porcos foram submetidos a eutanásia e necropsias foram realizadas. Como mostrado nas Figuras 3A-3C, os porcos infectados com vírus do tipo selvagem tiveram um aumento de temperatura no 1° dia pós-infecção, e a temperatura diminuiu gradualmente nos dias subsequentes. No entanto, porcos infectados com SIV-606 não apresentaram temperaturas elevadas em comparação ao grupo controle. Na necropsia, as lesões pulmonares macroscópicas foram documentadas. Os porcos infectados por simulação com SIV-606 em altas doses e baixas doses não apresentaram típicas lesões pulmonares macroscópicas. Em contraste, grandes lesões caracterizadas como áreas consolidadas de coloração violeta a roxo foram observadas em lobos cardíacos de porcos infectados com SK02 e Tx98 com doses altas e baixas. Em concordância com esses resultados, o vírus do tipo selvagem SK02 poderia ser recuperado do tecido pulmonar de todos os animais infectados com doses altas e baixas de SK02 com títulos medianos de 2.4x104 PFU/ml e 2.6x104 PFU/ml, respectivamente. Similarmente, o vírus do tipo selvagem podia ser isolado do tecido pulmonar de todos os porcos infectados com o vírus Tx98 com títulos medianos de 1x104 PFU/ml e 3.4x104 PFU/ml em grupos de doses baixas e altas. Entretanto, o vírus SIV-606 foi apenas detectado em um porco no grupo de dose baixa e 3 porcos do grupo de dose alta com um título muito baixo (títulos medianos foram de 0 e 20 PFU/ml respectivamente). Esses resultados demonstraram que o vírus SIV-606 é altamente atenuado em porcos e assim pode ser usado como uma vacina viva atenuada para a influenza suína. Tabela 1. Designação de porcos, dose e via da infecção pelo vírus

Exemplo 4 Efeito protetor do SIV-606 em Porcos

[0159] Para determinar se SIV-606 era imunogênico e poderia proporcionar proteção contra a infecção por SIV, os seguintes estudos de vacinação e desafio viral foram realizados em porcos. Vinte e três porcos H1N1 e H3N2 soro-negativos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos (n=5, exceto n=3 no grupo 5) (Tabela 2). Dois grupos de porcos receberam MEM e dois grupos de porcos foram vacinados com 4 x 106 PFU do vírus SIV-606 intratraquealmente. Os porcos receberam uma segunda vacinação no 21° dia. Dez dias após a segunda vacinação (no 31° dia), os porcos foram desafiados intratraquealmente com SIV/SK02 ou SIV/Tx98 e foram submetidos a eutanásia no 5° dia pós-infecção. Os soros foram coletados antes da primeira vacinação, 21 dias após a primeira vacinação e 10 dias após a segunda vacinação (antes do desafio viral). O soro IgG antígeno-específico e IgA nasal foram medidos nos dias 0, 21 e 31.

[0160] Após a primeira vacinação, IgG específico de SIV/SK02 em soro aumentou significativamente e a segunda dose de SIV-606 reforçou a resposta IgG medida no 31° dia (Figura 14A). O soro IgG contra SIV/Tx98 ou uma cepa de H1N1 Halifax210 heteróloga, que foi isolado durante uma pandemia em 2009, aumentou ligeiramente após uma vacinação e aumentou significativamente após a segunda vacinação (Figuras 14B e 14C).

[0161] Para avaliar a presença de anticorpos IgA específicos para os vírus da influenza H1N1 e H3N2 em superfícies de mucosa no trato respiratório superior e inferior, amostras de esfregaço nasal e fluido de lavagem bronco- alveolar (BALF) de porcos em todos os grupos foram coletadas e testadas por ELISA. A primeira vacinação de SIV-606 induziu níveis moderados de IgA na secreção nasal e a segunda vacinação reforçou a indução de IgA específica para SIV/SK02, SIV/Tx98 e Halifax210 (Figuras 15A, 15B e 15C). Similarmente, títulos de IgA permaneceram baixos em BALF após a primeira vacinação e foram significativamente mais altos após a segunda vacinação (Figuras 16A, 16B e 16C).

[0162] Após o desafio viral no 31° dia, a temperatura retal foi medida diariamente por 5 dias até a necropsia. No primeiro dia pós-infecção, os porcos vacinados com MEM e desafiados com SIV/SK02 tiveram um início de febre com uma temperatura média retal de 40.9°C. Em contraste, porcos vacinados com SIV-606 e desafiados com SIV/SK02 tiveram uma temperatura normal entre 39.1°C a 39,6°C durante esses cinco dias (Figura 17A). Similarmente, a temperatura de porcos vacinados com MEM e desafiados com Tx98 subiu para 40.1°C em um dia pós-infecção e então diminuiu para 39.6°C no dia seguinte e retornou a 39.3°C no 5° dia pós-infecção. Não foi percebida febre em porcos vacinados com SIV-606 e desafiados com Tx98 (Figura 17B). A temperatura nesse grupo flutuou entre 39.2°C e 39.7°C durante os 5 dias pós-infecção.

[0163] Na necropsia, grandes lesões pulmonares SIV-induzidas foram examinadas e avaliadas pela percentagem da superfície que as lesões tomaram em comparação com a área total do pulmão (Figura 18A). Todos os porcos nos grupos não vacinados e desafiados com SIV/SK02 ou SIV/Tx98 manifestaram grandes lesões típicas de SIV vistas como uma clara demarcação de áreas consolidadas violeta escuro encontradas na maior parte nos lobos apical e cardíaco. A avaliação média para esses grupos foi de 8,6 e 14,6 respectivamente. Em contraste, os pulmões de porcos vacinados com SIV-606 e desafiados ou com SIV/SK02 ou SIV/Tx98 não tiveram grandes lesões pulmonares.

[0164] Para medir a carga viral nos pulmões (Figura 18B), tecidos do lobo direito apical, cardíaco e diafragmático foram coletados na necropsia. O vírus foi detectado nos tecidos pulmonares de todos os porcos no grupo não vacinado desafiado com SIV/SK02 (título médio viral foi de 1,90 x 104 PFU por grama). No grupo não vacinado e desafiado com SIV/Tx98, o vírus só foi isolado de um porco. Não foi detectado vírus nos tecidos pulmonares de porcos vacinados com SIV-606 e desafiados com SIV.

[0165] Lesões histopatológicas foram examinadas usando amostras de tecido pulmonar retiradas dos lobos apical direito, cardíaco e diafragmático na necropsia. Como mostrado na Figura 19B e 19D, lesões patológicas foram observadas nos tecidos pulmonares de grupos não vacinados e desafiados. As lesões histopatológicas incluíam a perda do epitélio bronquial devido à necrose do epitélio bronquiolar, hipertrofia e hiperplasia do epitélio bronquiolar para compensar a necrose do epitélio bronquiolar, infiltração de neutrófilos através da mucosa e para o lúmen dos bronquíolos, infiltração de linfócitos peribronquiolares e perivasculares, espessamento intersticial, e proliferação de tecidos linfoides associados aos bronquíolos. Em contraste, não foram observadas alterações histopatológicas nos tecidos pulmonares de grupos vacinados com SIV-606 e desafiados (Figuras 19C e 19E). Ambos os grupos vacinados com SIV-606 mantiveram epitélio bronquiolar saudável e estruturas alveolares com espessamento intersticial leve, semelhante ao tecido mostrado no grupo não vacinado e não desafiado (Figura 19A). Tabela 2. Designação de porcos para desafio com vírus

[0166] Assim, vírus quiméricos recombinantes da influenza são divulgados, bem como composições e métodos para tratar e prevenir a influenza. Embora representações preferidas da invenção tenham sido descritas detalhadamente, fica entendido que variações óbvias podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Vírus quimérico recombinante de influenza A, consistindo em oito segmentos, em que o referido vírus compreende mais de um segmento de hemaglutinina (HA) (segmento 4) proveniente de mais de um subtipo de influenza, caracterizado por o referido vírus consistir dos segmentos 1-5, 7 e 8 proveniente do subtipo A/swine/Saskatchewan/18789/02 H1N1 porcina e de um segundo segmento 4 proveniente do subtipo A/Swine/Texas/4199-2/98 H3N2 porcina, em que o segmento 4 H3N2 compreende sequências de empacotamento de neuraminidase (NA) proveniente do referido subtipo H1N1 de influenza localizado na posição 3' e opcionalmente na posição 5' ao referido segundo segmento 4, de modo que o vírus não possua o restante do segmento da NA (segmento 6) do subtipo H1N1 para proporcionar um vírus atenuado, onde as sequencias dos segmentos 1-5, 7 e 8 proveniente do subtipo A/swine/Saskatchewan/18789/02 H1N1 porcina compreendem as sequencias SEQ ID NO: 2 (HA), SEQ ID NO: 4 (NA), SEQ ID NOS: 6 e 7 (M2 e M1), SEQ ID NO: 9 (NP), SEQ ID NOS: 11 e 12 (NS2 and NS1), SEQ ID NO: 14 (PA), SEQ ID NO:16 (PB1) and SEQ ID NO: 18 (PB2); e a sequencia do segundo segmento 4 proveniente do subtipo A/Swine/Texas/4199-2/98 H3N2 porcina compreende a sequencia SEQ ID NO: 20 (HA).

2. Vírus quimérico recombinante de influenza, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências de empacotamento da NA compreendem sequências de empacotamento 3' da NA proveniente de UTR 3' da NA e a sequência de codificação 3' da NA e, opcionalmente, sequências de empacotamento 5' proveniente da NA de UTR 5’ da NA e a sequência de codificação 5' da NA.

3. Composição caracterizado por compreender o vírus recombinante da reivindicação 1 ou reivindicação 2 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por compreender ainda um adjuvante.

5. Método para produzir um vírus quimérico recombinante de influenza A, caracterizado por compreender: (1) transfectar uma célula hospedeira com (a) plasmídeos individuais compreendendo os segmentos 1-5, 7 e 8 proveniente do subtipo A/swine/Saskatchewan/18789/02 H1N1 porcina, porém sem o segmento 6; e (b) um construto recombinante compreendendo: (i) segmento da HA do subtipo H3N2 da influenza A/Swine/Texas/4199- 2/98 porcina, e; (ii) sequências de empacotamento da NA do subtipo H1N1 de influenza A/swine/Saskatchewan/18789/02 porcina localizadas na posição 3’ e opcionalmente na posição 5’ ao dito segmento de HA H3N2, tal que o construto não possui o restante do segmento NA (segmento 6) do subtipo H1N1; e, (2) cultivar a dita célula hospedeira sob condições que resultem na produção do dito vírus quimérico recombinante de influenza.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o segmento da HA H3N2 ser flanqueado por sequências de empacotamento da HA H1N1 que compreendem sequências de empacotamento 3' da NA proveniente de UTR 3’ da NA e a sequência de codificação 3' da NA e de sequências de empacotamento 5' da NA proveniente de UTR 5’ da NA e a sequência de codificação 5' da NA.

7. Método para produzir uma composição caracterizado por compreender combinar o vírus quimérico recombinante de influenza suína conforme definido na reivindicação 1 ou 2 com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

8. Processo para produzir uma vacina de influenza caracterizado por compreender: (a) propagar o vírus quimérico recombinante da influenza suína conforme definido na reivindicação 1 ou 2 nas células, de ovos embrionários e/ou animais não-humanos; (b) purificar o vírus; e (c) combinar o vírus purificado com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

9. Kit caracterizado por compreender um ou mais recipientes com o vírus recombinante definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou conforme a composição definida em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4.

10. Kit caracterizado por compreender um recipiente com o vírus recombinante definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 ou conforme a composição definida em qualquer uma das reivindicações 3 ou 4 e um outro recipiente com um ingrediente farmaceuticamente aceitável.

11. Composição de acordo com uma das reivindicações 3 ou 4 caracterizado por ser para uso em um método para provocar uma resposta imunológica em um sujeito vertebrado.