WO2021091280A1 - Ｈ９ｎ２ 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

Ｈ９ｎ２ 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2021091280A1
WO2021091280A1 PCT/KR2020/015454 KR2020015454W WO2021091280A1 WO 2021091280 A1 WO2021091280 A1 WO 2021091280A1 KR 2020015454 W KR2020015454 W KR 2020015454W WO 2021091280 A1 WO2021091280 A1 WO 2021091280A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
influenza virus
polymerase
composition
virus
recombinant
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/015454
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
권혁준
김재홍
안세희
이충용
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Publication of WO2021091280A1 publication Critical patent/WO2021091280A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • H9N2 recombinant influenza virus a composition for its preparation, and a vaccine composition comprising the same.
  • the influenza virus belongs to Orthomyxoviridae and is a virus having 8 negative single-stranded RNA segments as its genome.
  • Polymerase units A, B1 and B2 polymerase subunits A, B1 & B2: PA, PB1, and PB2, respectively
  • nonstructural proteins 1 & 2 nonstructural proteins 1 &2; NS1 and NS2, respectively
  • PA-X and PB1-F2 proteins are made from PA and PB1 genes, respectively, and are known to play an important role in viral pathogenesis.
  • Avian influenza viruses are classified into low pathogenic avian influenza and highly pathogenic avian influenza according to their pathogenicity to chickens.
  • a vaccine that inactivated A/chicken/Korea/01310_CE20/2001(H9N2), which was passaged 20 times in embryonated eggs with low pathogenic H9N2 avian influenza A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(01310) is being used ( Korean Patent Publication No. 2007-0005867).
  • H9N2 recombinant influenza virus is provided.
  • It provides a cell transformed with a composition for producing H9N2 recombinant influenza virus.
  • It provides a vaccine composition comprising the H9N2 recombinant influenza virus.
  • NS nonstructural protein
  • Influenza virus 01310-E20 strain of polymerase B1 (polymerase subunit B1: PB1), polymerase B2 (polymerase subunit B2: PB2), polymerase A (polymerase subunit A: PA), hemagglutinin (HA) protein
  • PB1 polymerase subunit B1: PB1
  • PB2 polymerase subunit B2: PB2
  • PA polymerase subunit A
  • HA hemagglutinin
  • H9N2 recombinant influenza virus comprising one or more proteins selected from the group consisting of, nucleoprotein (NP), neuraminidase (NA), and matrix protein (matrix: M).
  • Influenza virus is a virus of the family Orthomyxoviridae and can cause flu or a flu.
  • the influenza virus H9N2 strain is also called avian influenza virus subtype H9N2.
  • Influenza virus 0028-E20 strain may be H9N2 subtype avian influenza virus SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/2000 (H9N2)] (Korean Patent No. 00708593).
  • the 0028-E20 strain may be a virus obtained by subculturing SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/2000 (H9N2)] in a chicken embryo for 20 days.
  • the 0028-E20 strain is a virus deposited as KCTC 10866BP. It is a safe vaccine week because embryonated eggs are highly productive and low pathogenic H9N2 subtype avian influenza virus (AIV), which has no fetal pathogenicity, high productivity, and no mutations related to pathogenicity to mammals. I can.
  • AIV H9N2 subtype avian influenza virus
  • Nonstructural proteins are homodimeric RNA-binding proteins required for viral replication.
  • the non-structural protein may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 of Korean Patent No. 00808593 or encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7.
  • the non-structural protein may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of Uniprot A9YCZ0 or A9YCZ1.
  • the non-structural protein may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • Influenza virus 01310-E20 strain may be a domestic low pathogenic avian influenza virus A/chicken/Korea/01310/2001 (H9N2) (hereinafter referred to as '01310') (Korean Patent No. 0790801).
  • the 01310 strain is a domestic isolate isolated as in Example 1 of Korean Patent No. 0790801 and has low pathogenicity.
  • the 01310 strain although low pathogenic, is a pathogenic virus, so it cannot be deposited with a depository institution, and is currently being stored in the Bird Disease Division of the Agriculture, Forestry and Fisheries Quarantine and Inspection Headquarters.
  • the 01310-E20 strain may be A/chicken/Korea/01310_CE20/2001 (H9N2) virus passaged 20 times in embryonated eggs.
  • Polymerase B1 (polymerase subunit B1: PB1) is one of the subunits of the RNA-dependent RNA polymerase of influenza virus.
  • the polymerase B1 protein may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • Polymerase B2 (polymerase subunit B2: PB2) is one of the subunits of the RNA-dependent RNA polymerase of the influenza virus.
  • Polymerase B2 protein may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • Polymerase A (polymerase subunit A: PA) is one of the subunits of the RNA-dependent RNA polymerase of the influenza virus.
  • the polymerase A protein may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • Hemagglutinin (HA) protein is also called hemagglutination protein or hemagglutinin.
  • the hemagglutinin may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of Uniprot I6QRZ5.
  • the hemagglutinin may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • Nucleoprotein is a structural protein that encapsulates negative strand viral RNA.
  • the nucleocapsid may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • Neuraminidase refers to an enzyme that hydrolyzes neuraminic acid to separate sialic acid.
  • the neuraminidase may be required when the virus enters or exits the host's cells.
  • the neuraminidase may be neuraminidase derived from influenza virus 01310-E20 strain.
  • the neuraminidase may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 of Korean Patent No. 0790801.
  • the neuraminidase may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of Uniprot I6RJA2.
  • the neuraminidase may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • Matrix protein (M) is a structural protein that connects the viral core and the viral envelope.
  • the matrix protein may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of Uniprot I6QXX2 or I6RB09.
  • the matrix protein may be a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the H9N2 recombinant influenza virus is one or more selected from the group consisting of polymerase B1, polymerase B2, polymerase A, hemagglutinin protein, nucleocapsid, neuraminidase, and matrix protein of influenza virus 01310-E20 strain. It may contain proteins.
  • the H9N2 recombinant influenza virus may include polymerase B1, polymerase B2, polymerase A, hemagglutinin protein, nucleocapsid, neuraminidase, and matrix protein of influenza virus 01310-E20 strain.
  • the H9N2 recombinant influenza virus may be deposited under the accession number KCTC13269BP (2017.05.17).
  • the H9N2 recombinant influenza virus may be a low pathogenic to pathogenic and highly proliferative virus in fetal fetuses.
  • the H9N2 recombinant influenza virus is not only not pathogenic to fetuses, but is highly proliferative, so it is very useful for producing a safe and productive influenza virus vaccine.
  • Another aspect is a polynucleotide encoding a non-structural protein of the influenza virus 0028-E20 strain.
  • Polynucleotide encoding one or more proteins selected from the group consisting of polymerase B1, polymerase B2, polymerase A, hemagglutinin protein, nucleocapsid, neuraminidase, and matrix protein of the influenza virus 01310-E20 strain It provides a composition for producing a recombinant H9N2 influenza virus comprising a.
  • Influenza virus 0028-E20 strain, non-structural protein, influenza virus 01310-E20 strain, polymerase B1, polymerase B2, polymerase A, hemagglutinin protein, nucleocapsid, neuraminidase, matrix protein, and H9N2 Recombinant influenza virus is as described above.
  • the polynucleotide comprises a nucleic acid sequence encoding any one of the non-structural protein, polymerase B1, polymerase B2, polymerase A, hemagglutinin protein, nucleocapsid, neuraminidase, and matrix protein. It can be a polynucleotide.
  • the polynucleotide may be changed according to codon usage.
  • the polynucleotide may be included in a vector.
  • the vector may be an expression vector.
  • the vector may include regulatory regions (eg, promoters, enhancers, and silencers) necessary for expression in animal cells.
  • the polynucleotide may be operably linked to a regulatory region.
  • the vector may further include an origin of replication, a polyA sequence, a multiple cloning site, a selection marker, and the like.
  • the vector may be a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, or a viral vector.
  • the viral vector may be an adenovirus vector, a retroviral vector, or an adeno-associated virus vector.
  • Another aspect provides a method for producing a recombinant H9N2 influenza virus comprising the step of transforming the H9N2 recombinant influenza virus into the cell by incubating the H9N2 recombinant influenza virus production composition and cells according to one aspect.
  • the cell may be a cell capable of producing a recombinant virus.
  • the cells are 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, and ST1 cells.
  • the normal cell may be an algal animal cell.
  • the cells may be embryonic eggs of chicks or fetal kidney cells.
  • the step of incubating the H9N2 recombinant influenza virus preparation composition and cells may include adding the H9N2 recombinant influenza virus to the allantoic fluid of embryonated eggs and culturing the allantoic fluid.
  • the transformation may be a nucleic acid of the composition for producing H9N2 recombinant influenza virus is introduced into the cell. Transformation can be carried out by methods known in the art. For example, transformation can be performed by transduction, transfection, microinjection, lipofection, or electroporation.
  • the method may further comprise the step of isolating the H9N2 recombinant influenza virus from the transformed cells.
  • Another aspect provides a cell transformed with the composition for producing H9N2 recombinant influenza virus according to one aspect.
  • composition and transformation for preparing H9N2 recombinant influenza virus are as described above.
  • the cell may be a cell capable of producing a recombinant virus.
  • the cells are 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, and ST1 cells.
  • the normal cell may be an algal animal cell.
  • the cells may be embryonic eggs of chicks or fetal kidney cells.
  • Another aspect provides a vaccine composition comprising the H9N2 recombinant influenza virus according to one aspect.
  • the H9N2 recombinant influenza virus is as described above.
  • the vaccine composition may be for preventing flu or bird flu.
  • the vaccine composition may be for administration to birds (eg, chickens, ducks) or mammals (eg, humans, pigs, dogs, cats, horses, cows, sheep, mice, camels).
  • the prevention refers to any action of inhibiting or delaying the onset of diseases (eg, flu, avian venom) caused by influenza virus by administration of the vaccine composition.
  • the vaccine composition may contain an effective amount of H9N2 recombinant influenza virus.
  • the term “effective amount” refers to an amount sufficient to exhibit the effect of prophylaxis or treatment when administered to an individual in need of prophylaxis or treatment.
  • the effective amount can be appropriately selected by a person skilled in the art according to the cell or individual to be selected.
  • the vaccine composition may be administered in an amount including about 1x10 7 to 1x10 11 , 1x10 8 to 5x10 10 , 5x10 8 to 2x10 10 viral particles.
  • the vaccine composition may be a dead poison vaccine or a live poison vaccine composition.
  • the vaccine composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is used in the sense of including an excipient, diluent or adjuvant.
  • the carrier is, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl blood. It may be selected from the group consisting of rolidone, water, physiological saline, a buffer such as PBS, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the composition may contain a filler, an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a preservative, or a combination thereof.
  • the vaccine composition may be administered by a parenteral route (eg, intravascular, intravenous, intraarterial, intramuscular or subcutaneous, etc.), oral, nasal, rectal, transdermal, or by inhalation route via aerosol.
  • the dosage of the vaccine composition may be, for example, about 1x10 7 to 1x10 11 , 1x10 8 to 5x10 10 , 5x10 8 to 2x10 10 viral particles.
  • the administration may be administered once a day, 2 to 24 times a day, 1 to 6 times a week, 1 to 3 times a month, or 1 to 12 times a year.
  • the vaccine composition may be formulated as an oral dosage form (eg, powder, tablet, capsule, syrup, pill, or granule), or a parenteral formulation (eg, an injection).
  • the composition may be prepared in a systemic formulation or a topical formulation.
  • the vaccine composition may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered single or multiple.
  • Another aspect provides a method of preventing flu or bird flu, comprising administering to an individual a vaccine composition according to one aspect.
  • the individual may be a bird (eg, chicken, duck) or a mammal (eg, human, pig, dog, mouse).
  • a bird eg, chicken, duck
  • a mammal eg, human, pig, dog, mouse
  • the dosage of the vaccine composition varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the form of the drug, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the vaccine composition may be administered in an amount including about 1x10 7 to 1x10 11 , 1x10 8 to 5x10 10 , 5x10 8 to 2x10 10 viral particles.
  • the administration may be administered once a day, 2 to 24 times a day, 1 to 6 times a week, 1 to 3 times a month, or 1 to 12 times a year.
  • Another aspect provides a composition for diagnosing avian influenza virus comprising an antisera against H9N2 recombinant influenza virus according to one aspect.
  • Antisera is also called immune serum, and refers to serum that has antibodies specific to antigens from outside. Serological diagnosis is possible by using antisera for diagnostic purposes.
  • the recombinant H9N2 influenza virus with low pathogenicity and high proliferation of fetal embryos can be usefully utilized as vaccines with high proliferation of fetal and embryonic embryos.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the recombinant viruses r01310-E20 and r01310-E20-NS (0028).
  • Example 1 Construction and characterization of a recombinant virus (r01310-E20-NS(0028)) having 7 genes of 01310-E20 and 0028 NS genome segment
  • the Hoffman vector in which the PA, NP, M, HA and NA gene segments of the 01310-E20 virus were cloned and the Hoffman vector in which the 3'terminal 4 nucleotide of the 3'end of the PB1 genome was replaced with'U', and the KBNP-0028 NS genome
  • a Hoffman vector (Korean Patent No. 1426407) plasmid in which the fragment was cloned was prepared.
  • DMEM (GIBCO BRL) medium containing 5% (v/v) FBS was added to a 6-well cell culture vessel, and 2 ⁇ 10 6 cells/2 ml of 293T cells (Bio Resource Center, KCTC) were added to each well. Cells were attached by incubation for about 3 to 4 hours at 37° C. and 5% CO 2. After removing the medium, 2 ml of Opti-MEM medium (Invitrogen Co. USA) was added.
  • All eight of the prepared plasmids were put in an amount of 300 ng each in one 1.5 ml tube, and Opti-MEM medium was added to a final 25 ⁇ l.
  • Opti-MEM medium was added to a final 25 ⁇ l.
  • 6 ⁇ l of Plus reagent (Invitrogen Co. USA) and 69 ⁇ l of Opti-MEM medium were added and mixed, and then added to a 1.5 ml tube containing the plasmid for mixing, and the mixture was mixed at room temperature. Incubated for about 15 minutes at.
  • the inoculated embryonated eggs were cultured at 37° C. for 3 days, and the allantoic fluid was harvested to check whether or not hemagglutination. All inoculated embryos were positive for hemagglutination.
  • the recombinant virus was named r01310-E20 or r01310-E20-NS (0028), and a schematic diagram of the virus is shown in FIG. 1. r01310-E20-NS(0028) was deposited with the Biotechnology Research Institute's Biological Resource Center on May 17, 2017, and was given the deposit number KCTC13269BP.
  • the hemagglutination titer of this recombinant virus was measured, diluted 100 times, and the virus (E2) grown in embryonated eggs by the same method was stored at -70°C.
  • the proliferation titer (50% embryo infection dose, EID 50 /ml) of the recombinant viruses of Example 1-1 in fetuses was measured. Specifically, each of the recombinant viruses was diluted 10 -1 to 10 -9 with a phosphate buffer solution, and inoculated to 5 SPF embryos of 10 to 11 days old for each dilution factor by 100 ⁇ l by the allantoic route. After incubation for 3 days, the allantoic fluid was harvested. Hemagglutination was confirmed with chicken red blood cells, and virus titer (EID 50 / ml) was measured according to the calculation formula of the Reed-Muench method. The calculated viral titers (EID 50 /ml (log 10)) are shown in Table 1.
  • r01310-E20-NS(0028) showed similar fetal proliferation compared to r01310-E20.
  • the fetal pathogenicity of the recombinant virus was measured. Specifically, the recombinant virus of Example 1-1 was diluted with a phosphate buffer solution to 10 2 EID 50 /0.1 ml each, and 10 days old SPF embryonated eggs were inoculated into the allantoic cavity. Thereafter, the time at which the fetus dies was measured, and the mean death time (MDT) was measured. The measured average killing time is shown in Table 2.
  • Recombinant virus MDT (Mean Death Time, h) r01310-E20 48.8 ⁇ 0.2 r01310-E20-NS(0028) 94.4 ⁇ 0.2
  • the MDT of the r01310-E20_NS(0028) virus was significantly longer than that of the r01310-E20 virus. Therefore, it was confirmed that the r01310-E20_NS(0028) virus was significantly less pathogenic to fetuses.
  • r01310-E20-NS(0028) 13 of the two recombinant viruses were inoculated into 10-day-old SPF embryos at a dose of 10 2 EID 50 /0.1 ml each.
  • the r01310-E20 virus obtained the virus from the allantoic fluid at 36 hours before the poultry died, and the r01310-E20-NS (0028) obtained the virus from the allantoic fluid after 72 hours.
  • the amount of the two recombinant viruses was compared by comparing the hemagglutination titer in the total amount of the obtained allantoic fluid.
  • the total hemagglutination titers in allantoic fluid of r01310-E20 and r01310-E20-NS (0028) are shown in Tables 3 and 4, respectively.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

계태아 저병원성 및 발육란 고증식성 재조합 H9N2 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 이에 의해 형질감염된 세포, 백신 조성물, 및 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.

Description

Ｈ９Ｎ２ 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물
H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스(Orthomyxoviridae)에 속하며, 음성의 단일가닥 RNA 절편 8개를 게놈으로 갖는 바이러스이다. 8개의 RNA 절편으로부터 혈구응집 단백질(hemagglutinin: HA), 뉴라미니다제(neuraminidase: NA), 뉴클레오캡시드 단백질(nucleoprotein: NP), 매트릭스 단백질 1 및 2(matrix 1 & 2: 각각 M1 및 M2), 중합효소 단위체 A, B1 및 B2(polymerase subunit A, B1 & B2: 각각 PA, PB1, 및 PB2), 및 비구조 단백질 1 및 2(nonstructural protein 1 & 2; 각각 NS1, NS2)가 만들어진다. 또한, 최근 PA와 PB1 유전자로부터 각각 PA-X와 PB1-F2 단백질이 만들어져 바이러스 병원성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
조류 인플루엔자 바이러스는 닭에 대한 병원성에 따라 저병원성 조류 인플루엔자와 고병원성 조류 인플루엔자로 분류된다. 국내에서는 저병원성 H9N2 조류인플루엔자 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(01310)를 발육란에서 20번 계대한 A/chicken/Korea/01310_CE20/2001(H9N2)를 불활화한 백신을 사용하고 있다(한국 공개 특허 제2007-0005867호). 20번 계대하는 과정에서 발육란 요막액 내에서의 증식성이 높아졌으나, 계태아에 대한 병원성이 매우 높아 접종 후 48시간 내 중사율이 증가했고, 오랜 시간 발육란에서 바이러스를 증식시키지 못하는 문제가 있다. 그러나, 어떤 바이러스 유전자가 발육란의 계태아에 대한 01310-E20 바이러스의 병원성과 관련되어 있는지 알려져 있지 않다.
따라서, 01310-E20 바이러스의 병원성과 관련된 유전자를 확인하여 계태아 저병원성 및 발육란 고증식성 재조합 조류 인플루엔자 바이러스를 제조할 필요가 있다.
H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물 또는 이를 이용한 제조 방법을 제공한다.
H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물로 형질전환된 세포를 제공한다.
H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
일 양상은 인플루엔자 바이러스 0028-E20 스트레인의 비구조적 단백질(nonstructural protein: NS); 및
인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인의 중합효소 B1(polymerase subunit B1: PB1), 중합효소 B2(polymerase subunit B2: PB2), 중합효소 A(polymerase subunit A: PA), 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질, 뉴클레오캡시드(nucleoprotein: NP), 뉴라미니다제(neuraminidase: NA), 및 매트릭스 단백질(matrix: M)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
인플루엔자 바이러스는 오소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae))의 바이러스로서, 독감 또는 유행성 감기를 유발할 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스 H9N2 스트레인은 조류 인플루엔자 바이러스 서브타입 H9N2라고도 불린다.
인플루엔자 바이러스 0028-E20 스트레인은 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스인 SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/2000 (H9N2)]일 수 있다(한국 특허 제0708593호). 상기 0028-E20 스트레인은 SNU0028 [A/chicken/Korea/SNU0028/2000 (H9N2)]를 계태아에서 20일 동안 계대배양하여 수득한 바이러스일 수 있다. 상기 0028-E20 스트레인은 KCTC 10866BP로 기탁된 바이러스로서, 발육란 고생산성 및 저병원성 H9N2 아형 조류 인플루엔자 바이러스(AIV)로 계태아 병원성이 없고, 생산성이 높으며 포유류에 대한 병원성과 관련된 돌연변이를 갖지 않아 안전한 백신주일 수 있다.
비구조적 단백질(nonstructural protein: NS)은 바이러스 복제에 필요한 동종이량체(homodimeric) RNA-결합 단백질이다. 상기 비구조적 단백질은 한국 특허 제0808593호의 서열번호 6 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 5 또는 7의 핵산 서열로 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 비구조적 단백질은 Uniprot A9YCZ0 또는 A9YCZ1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 비구조적 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인은 국내 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)(이하, '01310'라고 함)(한국 특허 제0790801호)일 수 있다. 상기 01310 균주는 한국 특허 제0790801호의 실시예1에서와 같이 분리된 국내 분리주로서 저병원성이다. 그러나, 상기 01310 균주는 저병원성이긴 하지만 병원성 바이러스이기 때문에 기탁기관에 기탁이 불가능하며, 현재 농림수산검역검사본부 조류질병과에 보관중이다. 01310-E20 스트레인은 발육란에서 20번 계대한 A/chicken/Korea/01310_CE20/2001(H9N2) 바이러스일 수 있다.
중합효소 B1(polymerase subunit B1: PB1)은 인플루엔자 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소의 서브유닛 중 하나이다. 중합효소 B1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
중합효소 B2(polymerase subunit B2: PB2)는 중합효소 B2는 인플루엔자 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소의 서브유닛 중 하나이다. 중합효소 B2 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
중합효소 A(polymerase subunit A: PA)는 인플루엔자 바이러스의 RNA-의존성 RNA 중합효소의 서브유닛 중 하나이다. 중합효소 A 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질은 단백질은 적혈구응집 단백질 또는 혈구응집소라고도 불린다. 상기 헤마글루티닌은 Uniprot I6QRZ5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 헤마글루티닌은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
뉴클레오캡시드(nucleoprotein: NP)는 음성(negative) 가닥 바이러스 RNA를 캡슐화하는 구조 단백질이다. 상기 뉴클레오캡시드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
뉴라미니다제(neuraminidase: NA)는 뉴라민산(neuraminic acid)을 가수분해하여 시알산을 분리하는 효소를 말한다. 상기 뉴라미니다제는 바이러스가 숙주의 세포에 침입하거나 빠져나올때 필요할 수 있다. 상기 뉴라미니다제는 인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인 유래의 뉴라미니다제일 수 있다. 상기 뉴라미니다제는 한국 특허 제0790801호의 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 뉴라미니다제는 Uniprot I6RJA2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 뉴라미니다제는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
매트릭스 단백질(matrix: M)은 바이러스 코어와 바이러스 외피를 연결시켜주는 구조 단백질이다. 상기 매트릭스 단백질은 Uniprot I6QXX2 또는 I6RB09의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 매트릭스 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인의 중합효소 B1, 중합효소 B2, 중합효소 A, 헤마글루티닌 단백질, 뉴클레오캡시드, 뉴라미니다제, 및 매트릭스 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 상기 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인의 중합효소 B1, 중합효소 B2, 중합효소 A, 헤마글루티닌 단백질, 뉴클레오캡시드, 뉴라미니다제, 및 매트릭스 단백질 모두를 포함할 수 있다.
상기 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스는 기탁번호 KCTC13269BP(2017.05.17)로 기탁된 것일 수 있다.
상기 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스는 계태아 저병원성 내지 무병원성 및 고증식성 바이러스일 수 있다. 상기 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스는 계태아에 병원성이 없을 뿐만 아니라, 고증식성이어서 안전하고 생산성이 좋은 인플루엔자 바이러스 백신 제작에 매우 유용하다.
다른 양상은 인플루엔자 바이러스 0028-E20 스트레인의 비구조적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인의 중합효소 B1, 중합효소 B2, 중합효소 A, 헤마글루티닌 단백질, 뉴클레오캡시드, 뉴라미니다제, 및 매트릭스 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물을 제공한다.
인플루엔자 바이러스 0028-E20 스트레인, 비구조적 단백질, 인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인, 중합효소 B1, 중합효소 B2, 중합효소 A, 헤마글루티닌 단백질, 뉴클레오캡시드, 뉴라미니다제, 매트릭스 단백질, 및 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스는 전술한 바와 같다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 비구조적 단백질, 중합효소 B1, 중합효소 B2, 중합효소 A, 헤마글루티닌 단백질, 뉴클레오캡시드, 뉴라미니다제, 및 매트릭스 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈 사용 빈도(codon usage)에 따라 변경될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 포함된 것일 수 있다. 상기 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 동물세포에서의 발현을 위해 필요한 조절 영역(예, 프로모터, 인핸서, 및 사일런서)를 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 영역과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 벡터는 복제원점, 폴리A 서열, 다중 클로닝 부위, 선별 마커 등을 더 포함할 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 아데너바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 아데노연관 바이러스 벡터일 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물과 세포를 인큐베이션하여 세포에 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 형질전환시키는 단계를 포함하는 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조 방법을 제공한다.
상기 세포는 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포이다. 상시 세포는 조류의 동물 세포일 수 있다. 상기 세포는 병아리의 발육란 또는 계태아 신장세포일 수 있다.
상기 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물과 세포를 인큐베이션하는 단계는 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 발육란의 요막액에 가하고, 요막액을 배양하는 것일 수 있다.
상기 형질전환은 세포에 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물의 핵산이 도입되는 것일 수 있다. 형질전환은 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 형질전환은 형질도입, 형질감염, 미세 주입법, 리포펙션, 또는 전기천공법으로 수행될 수 있다.
상기 방법은 형질전환된 세포로부터 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물로 형질전환된 세포를 제공한다.
H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물 및 형질전환은 전술한 바와 같다.
상기 세포는 재조합 바이러스를 생산할 수 있는 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포이다. 상시 세포는 조류의 동물 세포일 수 있다. 상기 세포는 병아리의 발육란 또는 계태아 신장세포일 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
상기 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스는 전술한 바와 같다.
상기 백신 조성물은 독감 또는 조류 독감을 예방하기 위한 것일 수 있다. 상기 백신 조성물은 조류(예, 닭, 오리) 또는 포유류(예, 사람, 돼지, 개, 고양이, 말, 소, 양, 마우스, 낙타)에 투여하기 위한 것일 수 있다. 상기 예방은 상기 백신 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 질환(예, 독감, 조류 독삼)의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다.
상기 백신 조성물은 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 1x107 내지 1x1011, 1x108 내지 5x1010, 5x108 내지 2x1010 개의 바이러스 입자를 포함한 양으로 투여될 수 있다.
상기 백신 조성물은 사독 백신 또는 생독 백신 조성물일 수 있다.
상기 백신 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 백신 조성물은 비경구 경로(예, 혈관내, 정맥내, 동맥내, 근육내 또는 피하 등), 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수 있다. 상기 백신 조성물의 투여량은 예를 들어, 약 1x107 내지 1x1011, 1x108 내지 5x1010, 5x108 내지 2x1010 개의 바이러스 입자일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 2회 내지 24회, 1주일에 1회 내지 6회, 1개월에 1회 내지 3회, 또는 1년에 1회 내지 12회 투여될 수 있다.
상기 백신 조성물은 경구 투여 제형(예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예를 들면, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형, 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다.
상기 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 독감 또는 조류 독감의 예방 방법을 제공한다.
상기 개체는 조류(예, 닭, 오리) 또는 포유류(예, 사람, 돼지, 개, 마우스)일 수 있다.
상기 백신 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 백신 조성물은 약 1x107 내지 1x1011, 1x108 내지 5x1010, 5x108 내지 2x1010 개의 바이러스 입자를 포함한 양으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 2회 내지 24회, 1주일에 1회 내지 6회, 1개월에 1회 내지 3회, 또는 1년에 1회 내지 12회 투여될 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
항혈청(antiserum)은 면역혈청(immune serum)으로도 불리고, 외부로부터 들어온 항원에 대해 특이적인 항체를 갖고 있는 혈청을 말한다. 항혈청을 진단 용도로 이용하여 혈청학적 진단이 가능하다.
계태아 저병원성 및 발육란 고증식성 재조합 H9N2 인플루엔자 바이러스는 계태아 무병원성 및 발육란 고증식성 백신주로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 재조합 바이러스 r01310-E20 및 r01310-E20-NS(0028)의 모식도를 나타낸다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 01310-E20의 7개 유전자 및 0028 NS 게놈 분절을 갖는 재조합 바이러스(r01310-E20-NS(0028)) 제작 및 특성 분석
1-1. 재조합 바이러스 제작
재조합 인플루엔자 바이러스 제작을 위하여, 호프만의 역유전학 벡터시스템(한국 특허 제0862758호)을 이용하였다.
구체적으로, 01310-E20 바이러스의 PA, NP, M, HA와 NA 유전자 절편이 클로닝된 호프만 벡터와 PB2, PB1 게놈 3'말단 4번째 뉴클레오티드가 'U'로 치환된 호프만 벡터, KBNP-0028 NS 게놈 절편이 클로닝된 호프만 벡터(한국 특허 제1426407호) 플라스미드를 준비하였다.
6-웰 세포배양용기에 5%(v/v) FBS를 함유한 DMEM(GIBCO BRL) 배지를 가하고, 2X106개/2 ㎖의 293T 세포(생물자원센터, KCTC)를 각 웰에 첨가한 후 37℃ 및 5% CO2의 조건에서 약 3 내지 4 시간 동안 인큐베션하여 세포를 부착시켰다. 배지를 제거한 후 Opti-MEM 배지(Invitrogen Co. USA) 2 ㎖를 첨가하였다.
준비된 플라스미드 8개를 모두 하나의 1.5 ㎖ 튜브에 각각 300 ng씩의 양으로 넣고, 최종 25㎕가 되도록 Opti-MEM 배지를 첨가하였다. 또다른 1.5 ㎖의 튜브에 6 ㎕의 Plus reagent(Invitrogen Co. USA)와 69 ㎕의 Opti-MEM 배지를 첨가하여 혼합한 후, 플라스미드가 들어있는 1.5 ㎖의 튜브에 첨가하여 혼합하고, 혼합물을 실온에서 약 15분간 인규베이션하였다.
4 ㎕의 lipofectamine(Invitrogen Co)과 96 ㎕의 Opti-MEM을 혼합하고, 상기 플라스미드가 있는 튜브에 첨가한 후 15분간 더 인큐베이션하였다. 반응 생성물을 293T 세포가 들어있는 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2의 조건에서 20 시간 동안 배양한 후, 웰 당 10 ㎍의 트립신(2.5 ㎍/4 ㎕)을 첨가하였다. 24 시간 후 상층액을 수확하고, 수확된 원액 100 ㎕를 10 내지 11일령 SPF 발육란(Sunrise Co., NY)에 요막강 경로로 접종하였다.
접종된 발육란을 37℃에서 3일간 배양하고, 요막액을 수확하여 혈구응집 여부를 확인하였다. 접종된 발육란은 모두 혈구응집 양성을 보였다. 재조합 바이러스를 r01310-E20 또는 r01310-E20-NS(0028)로 명명하고, 바이러스의 모식도를 도 1에 나타내었다. r01310-E20-NS(0028)를 생명공학연구원 생물자원센터에 2017년 5월17일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC13269BP를 부여받았다.
이 재조합 바이러스의 혈구응집역가를 측정하고, 100배 희석하여 동일한 방법으로 발생란에서 증식시킨 바이러스(E2)를 -70℃에서 보관하였다.
1-2. 바이러스 역가 측정
실시예 1-1의 재조합 바이러스들의 계태아에서의 증식 역가(50% embryo infection dose, EID50/㎖)를 측정하였다. 구체적으로, 각각의 재조합 바이러스들을 인산완충용액으로 10-1 내지 10-9까지 10진 희석하여 각 희석 배수 별로 10 내지 11일령의 SPF 발육란 5개에 요막강 경로로 100 ㎕씩 접종하였다. 그 후 3일간 배양한 후 요막액을 수확하였다. 닭의 적혈구로 혈구응집여부를 확인하고, Reed-Muench 방법의 계산식에 따라 바이러스 역가(EID50/㎖)를 측정하였다. 산출된 바이러스 역가(EID50/ml(log10))를 표 1에 나타내었다.
재조합 바이러스 EID50/ml(log10)
r01310-E20 9.16±0.2
r01310-E20-NS(0028) 9.36±0.2
표 1에 나타난 바와 같이, r01310-E20의 바이러스 역가가 109.16, r01310-E20-NS(0028)의 경우 109.36 EID50/㎖였다. 따라서, r01310-E20-NS(0028)은 r01310-E20 대비 비슷한 계태아 증식성을 보였다.
1-3. 계태아 병원성 측정
재조합 바이러스의 계태아 병원성을 측정하였다. 구체적으로, 실시예 1-1의 재조합 바이러스를 인산완충용액으로 각각 102 EID50/0.1㎖로 희석하고, 10일령 SPF 발육란 각 10개씩 요막강 내로 접종하였다. 그 후 계태아가 죽는 시간을 측정하여, 평균 치사 시간(Mean Death Time; MDT)을 측정하였다. 측정된 평균 치사 시간을 표 2에 나타내었다.
재조합 바이러스 MDT(Mean Death Time, h)
r01310-E20 48.8±0.2
r01310-E20-NS(0028) 94.4±0.2
표 2에 나타난 바와 같이, r01310-E20_NS(0028) 바이러스의 MDT가 r01310-E20 바이러스의 MDT 보다 유의하게 길었다. 따라서, r01310-E20_NS(0028) 바이러스가 계태아에 대한 병원성이 유의하게 낮은 것으로 확인되었다.
실시예 2. 계태아 저병원성 r01310-E20-NS(0028) 재조합 조류인플루엔자 바이러스 생산성 평가
r01310-E20 바이러스 대비 r01310-E20-NS(0028)의 생산성 향상을 알아보기 위해 두 재조합 바이러스를 각각 102 EID50/0.1㎖의 용량으로 10일령 SPF 발육란에 13개씩 접종하였다. r01310-E20바이러스는 계태아가 죽기 전인 36시간에 요막액으로부터 바이러스를 수득하고, r01310-E20-NS(0028)은 72시간 후 요막액으로부터 바이러스를 수득하였다. 수득된 요막액 총량에서의 혈구응집역가를 비교하여 두 재조합 바이러스의 양을 비교하였다. r01310-E20 및 r01310-E20-NS(0028)의 요막액 내 총 혈구응집역가를 각각 표 3 및 표 4에 나타내었다.
r01310-E20 요막액량(ml) 혈구응집역가 요막액 내 총 혈구응집역가
1 12.6 29 6,451
2 12.5 28 3,200
3 11.75 29 6,016
4 12 28 3,072
5 13 28 3,328
6 9.75 28 2,496
6(2) 3 26 192
7 11 28 2,816
8 11 28 2,816
9 9.75 28 2,496
10 13 28 3,328
11 11.8 29 6,042
12 12 28 3,072
13 11.5 28 2,944
총 154.65 48,269
r01310-E20-NS(0028) 요막액량(ml) 혈구응집역가 요막액 내 총 혈구응집역가
1 11.25 29 5,760
2 12.5 29 6,400
3 14.25 29 7,296
4 14 29 7,168
5 15 28 3,840
6 13 29 6,656
7 14.75 29 7,552
8 13 210 13,312
9 11.75 28 3,008
10 11.5 29 5,888
11 13.75 29 7,040
12 13.75 28 3,520
13 14.5 29 7,424
총 173 84,864
표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, r01310E20_NS(0028)을 접종한 경우 r01310-E20을 접종한 것보다 요막액 양과 혈구응집역가 모두 높았다. 따라서, r01310E20_NS(0028)은 r01310E20에 비해 백신주 바이러스 생산에 있어 더 높은 생산성이 있음을 확인하였다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 생물자원센터
수탁번호 : KCTC13269BP
수탁일자 : 20170517
Figure PCTKR2020015454-appb-I000001

Claims (8)

  1. 인플루엔자 바이러스 0028-E20 스트레인의 비구조적 단백질(nonstructural protein: NS); 및
    인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인의 중합효소 B1(polymerase subunit B1: PB1), 중합효소 B2(polymerase subunit B2: PB2), 중합효소 A(polymerase subunit A: PA), 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 단백질, 뉴클레오캡시드(nucleoprotein: NP), 뉴라미니다제(neuraminidase: NA), 및 매트릭스 단백질(matrix: M)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스.
  2. 청구항 1에 있어서, 기탁번호 KCTC13269BP으로 기탁된 바이러스인 것인 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스.
  3. 인플루엔자 바이러스 0028-E20 스트레인의 비구조적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    인플루엔자 바이러스 01310-E20 스트레인의 중합효소 B1, 중합효소 B2, 중합효소 A, 헤마글루티닌 단백질, 뉴클레오캡시드, 뉴라미니다제, 및 매트릭스 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 포함된 것인 조성물.
  5. 청구항 3의 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스 제조용 조성물로 형질전환된 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 세포는 293T, MDCK, Vero, DF1, PK15, 및 ST1 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 세포.
  7. 청구항 1의 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  8. 청구항 1의 H9N2 재조합 인플루엔자 바이러스에 대한 항혈청을 포함하는 조류 인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
PCT/KR2020/015454 2019-11-08 2020-11-06 Ｈ９ｎ２ 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물 WO2021091280A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0143004 2019-11-08
KR1020190143004A KR102334320B1 (ko) 2019-11-08 2019-11-08 Ｈ９ｎ２ 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021091280A1 true WO2021091280A1 (ko) 2021-05-14

Family

ID=75848990

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/015454 WO2021091280A1 (ko) 2019-11-08 2020-11-06 Ｈ９ｎ２ 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102334320B1 (ko)
WO (1) WO2021091280A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100708593B1 (ko) * 2006-03-23 2007-04-18 주식회사 고려비엔피 발육란 생산성이 우수한 저병원성 ｈ９ｎ２ 아형 조류인플루엔자 바이러스
KR20120096874A (ko) * 2009-05-18 2012-08-31 파나세아 바이오테크 리미티드 재조합 변형된 백시니아 앙카라 바이러스에 기반한 보편적 인플루엔자 백신
KR20130033043A (ko) * 2011-09-26 2013-04-03 건국대학교 산학협력단 Ｈ9 조류 인플루엔자 바이러스 유사입자 백신 및 그 응용

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101426407B1 (ko) * 2011-11-10 2014-08-07 서울대학교산학협력단 고생산성, 고면역원성, 및 무병원성 인플루엔자 바이러스 제작용 재조합 발현 벡터

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100708593B1 (ko) * 2006-03-23 2007-04-18 주식회사 고려비엔피 발육란 생산성이 우수한 저병원성 ｈ９ｎ２ 아형 조류인플루엔자 바이러스
KR20120096874A (ko) * 2009-05-18 2012-08-31 파나세아 바이오테크 리미티드 재조합 변형된 백시니아 앙카라 바이러스에 기반한 보편적 인플루엔자 백신
KR20130033043A (ko) * 2011-09-26 2013-04-03 건국대학교 산학협력단 Ｈ9 조류 인플루엔자 바이러스 유사입자 백신 및 그 응용

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AN SE-HEE; LEE CHUNG-YOUNG; CHOI JUN-GU; LEE YOUN-JEONG; KIM JAE-HONG; KWON HYUK-JOON: "Generation of highly productive and mammalian nonpathogenic recombinant H9N2 avian influenza viruses by optimization of 3’end promoter and NS genome", VETERINARY MICROBIOLOGY, ELSEVIER BV, NL, vol. 228, 1 January 1900 (1900-01-01), NL, pages 213 - 218, XP085567243, ISSN: 0378-1135, DOI: 10.1016/j.vetmic.2018.11.031 *
MINISTRY OF AGRICULTURE, FOOD AND RURAL AFFAIRS: "Final Report on Development of Programs and Exit Strategies for Highly Pathogenic AI Vaccination in Korea", February 2018 (2018-02-01), pages 9 - 12, XP009528041 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102334320B1 (ko) 2021-12-03
KR20210056185A (ko) 2021-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Collisson et al. Cytotoxic T lymphocytes are critical in the control of infectious bronchitis virus in poultry
Seo et al. Adoptive transfer of infectious bronchitis virus primed αβ T cells bearing CD8 antigen protects chicks from acute infection
Sedeik et al. Comparative efficacy of commercial inactivated Newcastle disease virus vaccines against Newcastle disease virus genotype VII in broiler chickens
Andrew et al. Cell-mediated immune responses to influenza virus antigens expressed by vaccinia virus recombinants
CN105518129B (zh) 减毒流感疫苗和其用途
Webster et al. Chemotherapy and vaccination: a possible strategy for the control of highly virulent influenza virus
WO2021091279A1 (ko) Ｈ５ｎ８ 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물
Zeitlin et al. Avian influenza
RU2746274C2 (ru) Вакцинный штамм вируса гриппа В/60/Колорадо/2017/1 (Линия Виктория) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей
WO2021091280A1 (ko) Ｈ９ｎ２ 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물
Webster et al. Vaccination as a strategy to reduce the emergence of amantadine-and rimantadine-resistant strains of A/Chick/Pennsylvania/83 (H5N2) influenza virus
Kilbourne et al. Hemagglutinin mutants of swine influenza virus differing in replication characteristics in their natural host
WO2019177256A1 (ko) 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼
KR102614346B1 (ko) Ｈ5ｎ6 재조합 인플루엔자 바이러스, 이의 제조용 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR101426407B1 (ko) 고생산성, 고면역원성, 및 무병원성 인플루엔자 바이러스 제작용 재조합 발현 벡터
WO2020166908A2 (ko) 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
KR20200061508A (ko) 약독화된 조류메타뉴모바이러스 주 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR101626798B1 (ko) 신규한 h3n2 혈청형의 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물
KR101582490B1 (ko) 인플루엔자 바이러스의 다중 아형에 대한 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 바이러스 백신
KR20200001418A (ko) 재조합 인플루엔자 a 바이러스 h5n1주 및 이를 포함하는 고병원성 인플루엔자 a 바이러스 백신 조성물
KR20140010582A (ko) 발육계란 고증식성, 무병원성 인플루엔자 바이러스 제작용 재조합 발현 벡터
Miao et al. H5N8 Subtype avian influenza virus isolated from migratory birds emerging in Eastern China possessed a high pathogenicity in mammals
RU2685121C1 (ru) Вакцинный штамм вируса гриппа A/17/Гонконг/2017/75108 (H7N9) для производства потенциально пандемической живой интраназальной гриппозной вакцины
Hoffmann et al. Pathogenicity evaluation of neuraminidase-negative H5 and H7 viruses in day-old chicks and adult chicken
Bich et al. Molecular characterization of infectious bronchitis virus (IBV) isolated from commercial chicken farms

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20884676

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20884676

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1