WO2019177256A1 - 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼 - Google Patents

재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼 Download PDF

Info

Publication number
WO2019177256A1
WO2019177256A1 PCT/KR2019/000651 KR2019000651W WO2019177256A1 WO 2019177256 A1 WO2019177256 A1 WO 2019177256A1 KR 2019000651 W KR2019000651 W KR 2019000651W WO 2019177256 A1 WO2019177256 A1 WO 2019177256A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
influenza
recombinant
vaccine
gene
type
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/000651
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
윤현주
한은영
Original Assignee
인제대학교 산학협력단
(주)지뉴인텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인제대학교 산학협력단, (주)지뉴인텍 filed Critical 인제대학교 산학협력단
Priority to US16/980,838 priority Critical patent/US11672854B2/en
Priority to CN201980025316.7A priority patent/CN111971393A/zh
Priority to EP19766645.6A priority patent/EP3766979A4/en
Publication of WO2019177256A1 publication Critical patent/WO2019177256A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a live multivalent influenza vaccine platform using recombinant adenovirus, and specifically, to develop a vaccine candidate that can simultaneously protect against H5 and H7 type highly pathogenic avian influenza viruses, and the vaccine candidate is harmless to humans. It relates to a live virus of the bird flu virus (AI virus) using a recombinant adenovirus produced by connecting to adenovirus.
  • AI virus bird flu virus
  • Influenza or influenza is a respiratory disease caused by the influenza virus. It shows symptoms such as chills, fever, sore throat, myalgia, headache, and cough during infection, and in severe cases, it causes fatal complications such as blunt pneumonia.
  • Human and avian influenza are caused by the influenza A virus, and can spread worldwide in a short time through wild birds and travelers, causing pandemic outbreaks worldwide.
  • Avian influenza (AI) is a type of influenza A virus that is an irregular RNA virus with an envelope.
  • Influenza A virus is an enviable, malformed virus belonging to the Orthomyxoviridae family, a gene whose gene consists of eight genomic fragmented RNA genomes.
  • influenza viruses infect and multiply various host cells, such as humans, birds, and pigs, to produce large amounts of virus particles. Because of these characteristics, influenza viruses often introduce new types of influenza viruses that change infectious hosts through gene exchange between species. Sometimes.
  • Influenza viruses come in so many different types that new types of viruses emerge each time an epidemic occurs. Three types of influenza viruses are known, A, B and C, but most human or avian influenza diseases are caused by influenza A virus. Influenza A viruses are classified into various H and N types according to the antigenicity of the HA and NA proteins of the envilob. H5N1 and H7N9 types are representative highly pathogenic AI viruses. Influenza viruses are very active in type conversion due to genetic mutations that occur during genome replication and recombination or mixing of other types of viruses with genome fragments. In addition, since influenza virus is infected by various animals such as humans, birds, pigs, etc.
  • the new influenza in 2009 is a new influenza virus obtained through recombination of genomic fragments when influenza A virus infects human, avian and swine host cells.
  • the emergence of new human influenza virus is possible when the human infection of the current H5N1 and H7N9 avian influenza viruses is increasing.
  • AI viruses are classified into high pathogenicity (HPAI) and low pathogenicity (LPAI) according to propagation rate, mortality rate and human transmission.
  • HPAI high pathogenicity
  • LPAI low pathogenicity
  • H5N1 type and H7N9 type are popular HPAI in Asia. These HPAIs cause the death of infected individuals, and because of the rapid rate of transmission, they are classified as the first type of animal infectious diseases in the livestock epidemic prevention method, and are diseases applied by high-level infection suppression means to prevent human infection.
  • AI viruses can be transmitted to humans by contacting humans with virus particles secreted by birds or by inhaling viral particles in the air. Human infection of the AI virus has evolved into a deadly human influenza virus and can cause a new human pandemic.
  • HPAI virus is a deadly epidemic in the poultry industry because of its high rate of transmission, high precautions such as poultry killing are taken to prevent the risk of human infection, and measures such as chicken consumption and import and export control.
  • AI avian influenza
  • H5N1 and H7N9 are Asian HPAI viruses, and because of their broad host range, human infection is possible. Human infections of these viruses have been reported repeatedly in China, and the possibility of transmission to humans through poultry or migratory birds also exists in Korea.
  • An object of the present invention is a recombinant expression vector comprising an influenza virus H5 type hemagglutinin 1 (HAmagglutinin 1, HA1) gene and an influenza virus H7 type HA1 gene, a recombinant strain transformed with the recombinant expression vector, and a recombinant strain obtained from the recombinant strain.
  • Influenza virus H5 type HA1 and H7 type HA1 recombinant fusion protein comprising an influenza virus H5 type hemagglutinin 1 (HAmagglutinin 1, HA1) gene and an influenza virus H7 type HA1 gene.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing recombinant adenovirus particles comprising the step of transfecting adenovirus with the recombinant expression vector and to provide a recombinant adenovirus particles prepared according to the method.
  • Still another object of the present invention is to provide a vaccine composition for preventing or treating influenza comprising recombinant adenovirus particles as an active ingredient, and a method for preventing or treating influenza by administering the vaccine composition to an individual except a human.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising the influenza virus H5 type hemagglutinin 1 (HAmagglutinin 1, HA1) gene and the influenza virus H7 type HA1 gene.
  • the present invention also provides a recombinant strain transformed with the recombinant expression vector.
  • the present invention also provides influenza virus H5 type HA1 and H7 type HA1 recombinant fusion proteins obtained from the recombinant strain.
  • the present invention comprises the steps of transfecting adenovirus with the recombinant expression vector; And it provides a method for producing a recombinant adenovirus particles comprising culturing the transfected adenovirus.
  • the present invention also provides a recombinant adenovirus particles prepared according to the above method.
  • the present invention also provides a vaccine composition for preventing or treating influenza comprising the recombinant adenovirus particles as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating influenza by administering the vaccine composition to an individual except a human.
  • the present invention relates to a multivalent influenza live vaccine platform using recombinant adenoviruses.
  • the present invention is a live attenuated vaccine platform using a recombinant virus, which is easy to inoculate since it is infected with a respiratory infection like an influenza virus, and is easy to inoculate. Compared to the vaccine used in combination of several, the vaccine is highly novel and does not need to mix the virus.
  • the first vaccine to incorporate a gene in which two influenza antigen genes were fused into a recombinant virus was the first to use a structurally independent HA1 gene, which does not use the entire influenza HA gene, but about half the total HA gene. One type of HA gene could be fused together.
  • the vaccine was an effective vaccine inducing the vaccine effect by two inoculations, and the vaccine platform of the present invention is expected to be useful for developing human influenza infection vaccine.
  • H5 type HA1 and H7 type HA1 fusion proteins From amino terminal to H5 type HA1 (1-334) -linker (335-349) -H7 type HA1 (350-572) sequence, Flag tag peptide is linked to 573-581, and His tag peptide is linked to 582-587. It is.
  • Figure 2 shows the structure of the shuttle vector (pAd5-AI # 4212) for adenovirus production that can express the H5 type HA1 and H7 type HA1 fusion protein.
  • the produced fusion protein gene was inserted in the direction of transcription of gene between CMV promoter and SV40 polyA site of pShuttle-CMV shuttle vector.
  • Figure 3 shows the expression results of H5 type HA1 and H7 type HA1 fusion protein.
  • lane 1 cell culture infected with control GFP expressing recombinant adenovirus
  • lane 2 cell culture infected with fusion protein expressing recombinant adenovirus (pAd5-AI # 4212 adenovirus).
  • Figure 4 shows the results of anti-HA antibody production in the blood of mice inoculated with live multivalent recombinant adenovirus vaccine via nasal inhalation.
  • 1 Serum GFP expressing recombinant adenovirus inhaled mouse serum
  • 2 Serum of H5 and H7 fusion protein expressing recombinant adenovirus inhaled mouse.
  • the influenza virus's HA protein is a protein that acts as a receptor when the virus infects a host cell. It consists of a HA1 and HA2 moiety. The two parts of the HA protein retain their independent structure without any modification in their structure even when they are separated from each other, and HA1 of the reduced type H5 and H7 can be obtained by using the HA1 moiety to bind to the host cell receptor.
  • a fusion gene was prepared by combining two genes into one gene.
  • the total gene size is not excessively large, so that a recombinant adenovirus containing a fused gene can be produced, and the recombinant virus is a live influenza vaccine.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising an influenza virus H5 type hemagglutinin 1 (HAmag) gene and an influenza virus H7 type HA1 gene.
  • HAmag hemagglutinin 1
  • the recombinant expression vector may include a ribosome binding site, an influenza virus H5 type HA1 gene, a linker, an influenza virus H7 type HA1 gene, and a tag gene in this order, but are not limited thereto.
  • influenza virus H5 type HA1 gene may be represented by SEQ ID NO: 2
  • influenza virus H7 type HA1 gene may be represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the ribosomal binding site may be RBS / Kozak (aaggaggccgccacc), which aids in the translation of the protein, and the linker may be a glycine / serine linker peptide as a role of linking two genes for expression purposes.
  • the tag gene may be a flag tag (DYKDDDDKG) and His tag (HHHHHH) gene, but is not limited thereto.
  • influenza virus may be an influenza A virus, but is not limited thereto.
  • hemagglutinin (HA) is one of the surface glycoproteins of the influenza virus, and mediates the fusion of the virus-cell membrane during adhesion of the virus to host cells and viral penetration of the virus, and of the influenza subtype. It is the surface antigenic protein of influenza viruses that determine antigen specificity.
  • vector refers to a DNA molecule that replicates itself that is used to carry a clone gene (or another piece of clone DNA).
  • an "expression vector” refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism.
  • the expression vector may preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by a chemical method, which corresponds to all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include antibiotic resistance genes such as Ampicillin, Kanamycin, Geneticin (G418), Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol, and the like.
  • the present invention is not appropriately selected and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector.
  • useful expression control sequences include, for example, early and late promoters of SV40 or adenovirus, promoters and enhancers of CMV, LTR of lactovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters.
  • promoters of the phosphatase such as Pho5
  • yeast alpha-crossing system Other sequences of construction and induction known to modulate the expression of promoters and prokaryotic or eukaryotic cells or genes of their viruses may be included and various combinations thereof.
  • the present invention also provides a recombinant strain transformed with the recombinant expression vector.
  • the recombinant strain may be an adenovirus, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides influenza virus H5 type HA1 and H7 type HA1 recombinant fusion proteins obtained from a recombinant strain.
  • the recombinant fusion protein may be represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • fusion protein means that one or more polypeptides are bound to a single polypeptide through a peptide bond, and one or more genes including the target gene are fused by a recombinant method. It means a fusion protein produced by translation into a polypeptide of.
  • the fusion protein is an amino acid cleavage sequence (chemical or enzyme specific) that the desired protein or peptide sequence is fused with each other, and that the chemical or enzyme can be cleaved specifically between the desired protein or peptide sequence Red truncation sequence).
  • the present invention comprises the steps of transfecting adenovirus with the recombinant expression vector; And it provides a method for producing a recombinant adenovirus particles comprising culturing the transfected adenovirus.
  • the recombinant adenovirus particles may express influenza virus H5 type HA1 and H7 type HA1 recombinant fusion proteins. More preferably, the recombinant fusion protein may be represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a recombinant adenovirus particles prepared according to the above method.
  • the present invention also provides a vaccine composition for preventing or treating influenza comprising the recombinant adenovirus particles as an active ingredient.
  • Host animals to which the vaccine of the present invention may elicit an immune response may include humans, dogs, cats, pigs, horses, chickens, ducks, turkeys, ferrets, and the like.
  • the influenza is avian influenza, swine influenza Or human influenza, but is not limited thereto.
  • the vaccine of the present invention may be an attenuated live poison vaccine or a dead poison vaccine, a subunit vaccine, a synthetic vaccine or a genetic engineering vaccine, but a live poison vaccine that induces an effective immune response may be used. desirable.
  • live attenuated vaccine or “live attenuated vaccine” means a vaccine containing a live virus active ingredient.
  • attenuation refers to artificially weakening the virulence of living pathogens, which means that the genes involved in the essential metabolism of the pathogens are mutated to induce immunity by stimulating only the immune system without causing disease in the body. do.
  • Attenuation of the virus can be achieved by ultraviolet (UV) irradiation, chemical treatment or in vitro high-order serial passage. Attenuation can also be achieved by making clear genetic changes, for example by inserting a sequence into a viral genome or a specific deletion of a viral sequence known to provide toxicity.
  • the vaccine of the present invention may further include one or more selected from the group consisting of a solvent, an adjuvant and an excipient.
  • the solvent may be physiological saline or distilled water
  • an adjuvant may include Freund's incomplete or complete adjuvant, aluminum hydroxide gel and vegetable and mineral oil, and excipients include aluminum phosphate and aluminum hydroxide.
  • Side or aluminum potassium sulfate may further include materials used in the manufacture of vaccines well known to those skilled in the art.
  • the vaccines of the present invention may be prepared in oral or parenteral preparations and may be administered by intradermal, intramuscular, intraperitoneal, nasal or epidural routes.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating influenza by administering the vaccine composition to an individual except a human.
  • “individual” means all animals, including humans, who have already been or can be infected with influenza virus.
  • the vaccine composition of the present invention can be effectively prevented and treated.
  • the compositions of the present invention can treat humans infected with various influenza virus subtypes or variants of influenza virus.
  • the compositions of the present invention can treat chickens or pigs infected with various influenza virus subtypes or mutant avian influenza.
  • the composition of the present invention can be administered in parallel with existing influenza virus infection disease therapeutics.
  • prevention means any action that inhibits or delays the influenza virus infection by administration of the vaccine composition.
  • treatment means any action that improves or advantageously changes the symptoms caused by influenza virus infection by administration of a vaccine composition.
  • the vaccine composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, with an effective dose level being the type and severity of the individual, age, sex, type of virus infected, drug Activity, sensitivity to drug, time of administration, route of administration, rate of excretion, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the vaccine composition of the present invention may be administered as a separate therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the amino acid sequence of the HA protein of influenza A virus (A / goose / Guangdong / 1/1996 (H5N1)) isolated from geese in Guangdong, China in 1996 in the Gene Bank Database to ensure the sequencing of the H5 type HA1 gene.
  • Amino acid sequences 1 to 346 corresponding to the HA1 region were selected from NC_007362.1).
  • This amino acid sequence contains the leader peptide portion of the HA protein and the protein coding region of the portion corresponding to the HA1 region.
  • the region contains the receptor binding site and esterase portion of the HA protein, but excludes the fusion peptide, HA2 region, and membrane transmembrane region.
  • H7N1 Amino Acid Sequence of HA Protein of Influenza A Virus (A / Chicken / Italy / 1067/99 (H7N1)) Isolated from 1999 Chickens in Gene Bank Database in order to secure the nucleotide sequence of H7 type HA1 gene (AJ584647.1) Amino acid sequences from amino acids 17 to 339 corresponding to the HA1 region were selected. The region contains the receptor binding site and esterase portion of the HA protein, but excludes the leader peptide, the fusion peptide, the HA2 portion, and the membrane transit region.
  • HA1 proteins are linked to glycine / serine linker peptide in the order of H5 type HA1 (1-334) -linker (335-349) -H7 type HA1 (350-572) to one protein.
  • Linked to expression Combined peptides acting as Flag tag (DYKDDDDKG) and His tag (HHHHHH) to be used for the identification and separation of the protein expressed on the carboxy terminal side of the peptide amino acid so linked to the peptides so linked effectively in eukaryotic cells or E. coli In order to design a protein consisting of a total of 587 amino acids (Fig. 1 and SEQ ID NO: 1).
  • the codon sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein was determined by optimizing the codon in the form that can be read best in animal cells.
  • the gene expressing the fusion protein was synthesized by adding the RBS / Kozak nucleotide sequence, which is a ribosomal binding site to help the protein translation in front of the entire nucleotide sequence (RBS KOZAK / HA1 (H5) (1-346; SEQ ID NO: 2) / GS linker (15) / HAI (H7) (17-339; SEQ ID NO: 3) / FLAG / His6tga) (SEQ ID NO: 4).
  • RBS / Kozak nucleotide sequence which is a ribosomal binding site to help the protein translation in front of the entire nucleotide sequence (RBS KOZAK / HA1 (H5) (1-346; SEQ ID NO: 2) / GS linker (15) / HAI (H7) (17-339; SEQ ID NO:
  • the synthesized gene was inserted into an eukaryotic cell expression vector, and recombinant adenovirus particles containing the expression vector were prepared.
  • the produced fusion protein gene first obtained a pAd5-AI # 4212 clone inserted in the direction capable of transcription of the gene between the CMV promoter and SV40 polyA site of the pShuttle-CMV shuttle vector required for recombinant adenovirus production (Fig. 2).
  • the pAd5-AI # 4212 DNA was commissioned by Genuine Intec Co., Ltd. to prepare recombinant adenovirus particles containing the plasmid, and examined whether fusion proteins were produced in animal cells. To this end, 2 ⁇ 10 5 HEK293A cells were incubated overnight, and then 2 ⁇ 10 9 pfu of pAd5-AI # 4212 recombinant adenovirus particles were mixed in the culture medium so that the MOU was 10,000, and the cells were infected with fetal bovine serum. Incubated for 24 hours in the medium. Thereafter, the medium was exchanged with a fetal bovine serum-free medium, and then cultured for 24 hours, and the culture solution was collected.
  • the culture solution of the infected cells was collected three times to recover the fusion protein.
  • the culture solution containing the collected fusion protein was concentrated 20 times, and then examined for the production of lysed protein by western blotting method using a flag tag.
  • a recombinant adenovirus expressing green fluorescent protein (GFP) was used instead of the fusion protein.
  • the concentrated culture solution was separated by SDS-PAGE, proteins were transferred to NC Membrane, and then reacted with a mouse anti-Flag antibody, followed by reaction with a secondary antibody, Rat-anti-mouse IgG1-HRP (eBioscience).
  • mice Four 5-week-old Female BALB / c were inoculated with pAd5-AI # 4212 recombinant adenovirus particles expressing H5 and H7 HA1 fusion proteins by intranasal instillation.
  • pAd5-AI # 4212 recombinant adenovirus particles expressing H5 and H7 HA1 fusion proteins by intranasal instillation.
  • 4 mice were inoculated with recombinant adenovirus expressing green fluorescent protein (GFP) by nasal inhalation instead of the fusion protein.
  • GFP green fluorescent protein
  • Nasal inhalation was diluted 5 ⁇ 10 8 pfu recombinant adenovirus particles in 30 ⁇ l of phosphate buffer solution, and inhaled alternately by 5 ⁇ l using both nasal pores.
  • the animals were bred for three weeks, and then inoculated again in the same manner, and one week after the inoculation, blood was collected from the
  • Antigen antibody responses were measured at 450 nm with ELISA leader (ThermoFisher MULTISKAN GO). As a result, it was confirmed that the antibody reacted with the fusion protein was formed in the serum of mice inhaled with recombinant adenoviruses expressing the H5 and H7 type HA1 fusion proteins (FIG. 4).
  • H5 and H7 HA1 fusion protein expression recombinant adenoviruses were induced in respiratory mucosal tissues like normal adenoviruses, and the antibody response was induced in a manner similar to that of influenza viruses in the mouse's immune system.
  • the recombinant adenovirus containing the HA fusion protein gene of influenza virus can be used as a live vaccine to induce an immune response to the influenza protein effectively infected and effectively inserted in the respiratory tract of the animal.
  • Influenza vaccines using this type of fusion protein are multivalent vaccines that present two or more influenza antigens to the immune system simultaneously.A new influenza vaccine has not been attempted at all. It is a manufacturing method.
  • Such vaccines offer several advantages over multivalent vaccines that use a combination of different types of influenza viruses.
  • the multivalent influenza live vaccine platform in which multiple antigens are bound to one recombinant virus particle as in the present invention, it is expected to be able to respond quickly to avian influenza transmission since there is no need to produce and mix each monovalent vaccine virus.
  • recombinant adenovirus is a live virus, it induces a strong immune response against influenza virus like AI virus infection, and because it is an attenuated live vaccine, it can be easily administered by respiratory inhalation like influenza virus infection and poultry It is a vaccine preparation method suitable for inoculation.
  • recombinant adenovirus is a relatively harmless virus and does not use a highly pathogenic influenza virus for vaccine manufacture, the biosafety risk of the manufacturing process is low, which will further contribute to shortening the production period and reducing the production cost.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼에 대한 것이다. 본 발명은 재조합 바이러스를 이용한 약독화된 생백신(live attenuated vaccine) 플랫폼으로 인플루엔자 바이러스처럼 호흡기로 감염되어 백신작용을 나타내므로 접종이 용이하며, 두 가지 타입을 하나로 융합한 다가형 백신으로, 한 가지 백신을 여러 개 혼합하여 사용하는 백신에 비하여 바이러스를 혼합할 필요가 없는 신규성이 높은 백신이다. 두 가지 인플루엔자 항원 유전자를 하나의 유전자로 융합한 유전자를 재조합 바이러스에 넣은 백신은 최초로서, 인플루엔자의 HA 유전자 전체를 사용하지 않고, 전체 HA 유전자의 절반 정도인 구조적으로 독립된 HA1 유전자를 사용함으로써, 여러 타입의 HA 유전자를 하나로 융합할 수 있었다. 재조합 바이러스를 생쥐에 코 흡입 방법으로 접종하였을 때, 두 번의 접종으로 백신 효과가 유도되는 효과적인 백신임을 확인하였고, 본 발명의 백신 플랫폼은 인간 인플루엔자 감염 백신 개발에도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼
본 발명은 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼에 대한 것으로, 상세하게는 H5형과 H7형 고병원성 조류독감 바이러스를 동시에 방어할 수 있는 백신 후보 물질을 개발하고, 이 백신 후보 물질을 인체에 무해한 아데노바이러스에 연결하여 제작한 재조합 아데노바이러스를 이용한 조류독감 바이러스(AI virus) 생백신에 관한 것이다.
인플루엔자 또는 플루는 인플루엔자 바이러스에 감염되어 나타나는 호흡기 질환으로, 감염시 오한, 발열, 인후염, 근육통, 두통, 기침 등의 증세를 보여주며, 심한 경우 전격성 폐렴과 같은 치명적인 합병증 유발하는 질환이다. 인간이나 조류 플루는 인플루엔자 A 바이러스에 의하여 발병하며, 야생조류나 여행자를 통하여 단시간에 전세계적으로 전염이 전파되어 전세계적인 플루 전염병(pandemic outbreak)의 원인이 되기도 한다. 조류인플루엔자(AI)는 인플루엔자 A 바이러스의 일종으로 엔빌롭이 있는 부정형의 RNA 바이러스이다. 인플루엔자 A 바이러스는 Orthomyxoviridae 패밀리에 속하는 엔빌롭이 있는 부정형의 바이러스로, 유전자가 8개의 게놈 조각 RNA(segmented RNA genome)으로 구성된 바이러스이다. 이 바이러스는 돌연변이나 게놈 조각의 재조합 또는 혼합 등의 방법으로 다양한 타입으로 변형되어 매년 새로운 타입의 플루 전염병을 유발하며, 10년 정도의 주기로 전세계적인 플루 전염병을 일으키기도 한다. 인플루엔자 바이러스는 인간, 조류, 돼지 등의 다양한 숙주 세포에 감염되어 증식하여 바이러스입자를 다량 생산하는데, 이러한 특성 때문에 인플루엔자 바이러스는 종종 종간에 유전자 교환을 통하여 전염 숙주를 변경한 새로운 타입의 인플루엔자 바이러스가 출현하기도 한다.
인플루엔자 바이러스는 그 타입이 매우 다양하여 전염병이 발생할 때마다 새로운 타입의 바이러스가 나타난다. 인플루엔자 바이러스에는 A, B, C 3가지 타입이 알려져 있으나, 대부분의 인간 또는 조류 플루 전염병은 인플루엔자 A 바이러스에 의하여 발생한다. 인플루엔자 A 바이러스는 엔빌롭의 HA와 NA 단백질의 항원성에 따라 다양한 H형과 N형으로 구분되는데, H5N1형과 H7N9형이 대표적인 고병원성 AI 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 게놈의 복제 과정 동안 나타나는 유전자 돌연변이나 다른 타입의 바이러스와 게놈 조각의 재조합 또는 혼합 등으로 타입의 전환이 매우 활발한 바이러스이며, 그러한 과정을 통하여 새로운 플루 전염병 발병이 나타나고 있다. 또한, 인플루엔자 바이러스는 인간, 조류, 돼지 등의 다양한 동물에 감염되어 종간의 유전자 교환 가능하기 때문에, AI 바이러스가 인간에 전염되면, 타입의 전환을 통하여 AI 바이러스가 인간 인플루엔자 바이러스로 전환될 가능성도 매우 높다. 예를 들어, 2009년에 발생한 신종 플루의 경우는 인플루엔자 A 바이러스가 인간, 조류, 돼지 숙주세포에 감염되면서 게놈 조각의 재조합을 통하여 얻어진 신형 인플루엔자 바이러스인 것이다. 그런 점에서 현재 유행중인 아시아형 H5N1형과 H7N9형의 조류 인플루엔자 바이러스의 인간 감염이 증가되면 새로운 인간 인플루엔자 바이러스의 출현이 가능한 것이다.
AI 바이러스는 전파속도, 폐사율, 인간전염 등에 따라 고병원성(HPAI)과 저병원성(LPAI)으로 구분하는데, 현재 아시아 지역에서 유행하는 H5N1형과 H7N9형은 대표적인 HPAI이다. 이들 HPAI는 감염된 개체의 사망을 초래하며, 전염의 속도가 빠르기 때문에, 가축전염병예방법에서 제1종 가축전염병으로 분류되며, 인간 감염을 막기 위하여 고단위 전염 억제 수단 적용하는 질병이다. AI 바이러스는 조류가 분비한 바이러스 입자를 인간이 눈코입을 통한 접촉이나 공기 중의 바이러스 입자를 흡입함으로써 인간에게 전염될 수 있다. AI 바이러스의 인간감염은 치명적인 인간 인플루엔자 바이러스로 진화되어 새로운 인간 플루 전염병(pandemic)의 원인이 될 수 있다. HPAI 바이러스는 전염의 속도가 빠르기 때문에 인체감염의 위험을 막기 위하여 가금류 살처분과 같은 고단위 예방조처가 가해지고, 닭고기 소비나 수출입 통제와 같은 조처가 내려지기 때문에, 가금류 산업에 치명적인 전염병이다. 국내에서는 2003년 이후 국내에도 여러 번의 조류인플루엔자(AI)가 발생하고 있으며, 2016년에는 고병원성 조류인플루엔자(AI)가 유행하여 지금까지 대규모의 가금류 살처분이 이루어지고 있다. H5N1형과 H7N9형은 아시아계통 HPAI 바이러스이며, 아주 넓은 숙주범위를 보이기 때문에 인간 감염이 가능하다. 이들 바이러스의 인간 감염은 중국에서는 반복적으로 보고되었으며, 한국에서도 가금류나 철새를 통하여 인간에 전염될 가능성이 상존한다. AI 바이러스 전염병은 2003년 이후 국내 전염이 보고되었고, 2016년 이후 고병원성 조류인플루엔자가 유행하여 현재까지 국내 가금류 산업에 치명적인 영향을 미치고 있다. 2016년 겨울에 발생한 조류인플루엔자로 3개월 동안 닭 5000만 마리 살처분하였으며, 달걀가격 폭등 및 달걀 수입 등으로 경제적 손실만 1조 5천억원 이상 발생하였다.
효과적이고 안전한 가금류 백신의 개발은 농가의 경제적인 손실 뿐아니라 인간 전염의 우려를 막아줄 수 있는 가장 확실한 방법이다. 특히, AI 전염병은 어떤 형의 인플루엔자 바이러스 때문에 발생할지 예측하기 어려운 측면이 있기 때문에 다양한 형의 HPAI 전염을 막을 수 있는 다가형 백신 개발이 필요하다. 또한, AI 전염병 백신은 질병 발생시 즉시 대응할 수 있어야 하므로, 백신 생산이 단기간에 대량으로 이루어져야 하며, 면역 효과가 높고, 호흡기 접종처럼 투여가 용이한 생백신 개발이 필요하다. 또한, HPAI가 유행하지 않은 지역에서도 예방적으로 사용할 수 있으며, 여러 가지의 HPAI 바이러스를 예방할 수 있는 효율적인 다가형 백신이 요구된다. 다가형 백신으로는 현재 여러 타입의 바이러스를 별도로 배양하여 얻은 바이러스를 혼합하여 사용하는데, 이 경우 백신 내의 바이러스 타입 구성의 불균형 및 특정한 타입에 의한 면역 반응 편중 현상 등의 문제점이 존재한다. 이러한 단점을 해소하고 면역반응성이 높으며 접종이 용이한 AI 백신을 개발하기 위하여 하나의 바이러스입자에서 다양한 타입의 인플루엔자 항원을 생산하는 재조합 바이러스 활용한 HPAI 백신 개발이 시급하다.
본 발명의 목적은 인플루엔자 바이러스 H5형 혈구응집원 1(hemagglutinin 1, HA1) 유전자 및 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주 및 상기 재조합 균주로부터 수득된 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법 및 상기 방법에 따라 제조된 재조합 아데노바이러스 입자를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 아데노바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 H5형 혈구응집원 1(hemagglutinin 1, HA1) 유전자 및 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 균주로부터 수득된 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계; 및 상기 형질감염된 아데노바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 재조합 아데노바이러스 입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼에 대한 것이다. 본 발명은 재조합 바이러스를 이용한 약독화된 생백신(live attenuated vaccine) 플랫폼으로 인플루엔자 바이러스처럼 호흡기로 감염되어 백신작용을 나타내므로 접종이 용이하며, 두 가지 타입을 하나로 융합한 다가형 백신으로, 한 가지 백신을 여러 개 혼합하여 사용하는 백신에 비하여 바이러스를 혼합할 필요가 없는 신규성이 높은 백신이다. 두 가지 인플루엔자 항원 유전자를 하나의 유전자로 융합한 유전자를 재조합 바이러스에 넣은 백신은 최초로서, 인플루엔자의 HA 유전자 전체를 사용하지 않고, 전체 HA 유전자의 절반 정도인 구조적으로 독립된 HA1 유전자를 사용함으로써, 여러 타입의 HA 유전자를 하나로 융합할 수 있었다. 재조합 바이러스를 생쥐에 코 흡입 방법으로 접종하였을 때, 두 번의 접종으로 백신 효과가 유도되는 효과적인 백신임을 확인하였고, 본 발명의 백신 플랫폼은 인간 인플루엔자 감염 백신 개발에도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 H5형 HA1과 H7형 HA1 융합 단백질의 구조(A)와 그 아미노산 서열(B)을 나타낸다. 아미노터미날부터 H5형 HA1(1-334)-linker(335-349)-H7형 HA1(350-572) 순서로 연결되었으며, 573-581에는 Flag tag 펩타이드, 및 582-587에는 His tag 펩타이드가 연결되어 있다.
도 2는 H5형 HA1과 H7형 HA1 융합단백질을 발현할 수 있는 아데노바이러스 제작용 셔틀벡터(pAd5-AI#4212)의 구조를 나타낸다. 제작된 융합단백질 유전자는 pShuttle-CMV 셔틀벡터의 CMV promoter와 SV40 polyA site 사이에 유전자를 전사할 수 있는 방향으로 삽입되었다.
도 3은 H5형 HA1과 H7형 HA1 융합단백질의 발현 결과를 나타낸다. lane 1: 대조군 GFP 발현 재조합 아데노바이러스에 감염된 세포 배양액, lane 2: 융합단백질 발현 재조합 아데노바이러스(pAd5-AI#4212 adenovirus)에 감염된 세포 배양액.
도 4는 코 흡입을 통한 다가형 재조합 아데노바이러스 생백신을 접종한 생쥐 혈액의 항HA 항체 생산 결과를 나타낸다. 1: 대조군인 GFP 발현 재조합 아데노바이러스 흡입 생쥐 혈청, 2: H5형과 H7형 HA1 융합단백질 발현 재조합 아데노바이러스 흡입 생쥐 혈청.
이에 본 발명자들은 H5형과 H7형의 HPAI에 대한 재조합 아데노바이러스 백신을 제조하기 위하여 H5형과 H7형의 HA 유전자를 하나의 유전자로 융합한 유전자를 백신제조에 사용하였다. 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질은 이 바이러스가 숙주세포에 감염될 때 수용체로 작용하는 단백질로 HA1 부분과 HA2 부분으로 구성되어 있다. HA 단백질에서 이 두 부분은 서로 분리되어도 그 구조에 변형이 없는 독립적인 구조를 유지하고 있으며, HA1 부분만으로도 숙주세포의 수용체에 결합할 수 있다는 점을 이용하여, 축소된 H5형과 H7형의 HA1 유전자 두 개를 하나의 유전자로 합친 융합유전자를 제조하였다. H5형과 H7형의 HA1 유전자 두 개를 하나의 유전자로 연결하게 되면, 전체적인 유전자의 크기가 과도하게 크지 않아 융합된 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제작할 수 있으며, 이 재조합 바이러스를 다가형 인플루엔자 생백신으로 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 H5형 혈구응집원 1(hemagglutinin 1, HA1) 유전자 및 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
바람직하게는, 상기 재조합 발현벡터는 리보솜 결합부위, 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 유전자, 링커, 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자 및 태그 유전자를 순서대로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 유전자는 서열번호 2로 표시되고, 상기 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자는 서열번호 3으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 리보솜 결합부위는 단백질의 해독을 도와주는 RBS/Kozak(aaggaggccgccacc) 일 수 있고, 상기 링커는 발현 목적의 두 유전자를 연결하는 역할로서, glycine/serine linker peptide 일 수 있으며, 상기 태그 유전자는 발현 목적 단백질의 정제를 쉽게 하기 위한 역할로서, Flag tag(DYKDDDDKG) 및 His tag(HHHHHH) 유전자 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "혈구응집원(hemagglutinin, HA)"은 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질 중 하나로서 바이러스의 숙주 세포에의 부착과 바이러스의 세포 침투 동안 바이러스-세포막의 융합을 매개하며, 인플루엔자 서브타입의 항원 특이성을 결정하는 인플루엔자 바이러스의 표면 항원단백질이다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주를 제공한다. 바람직하게는 상기 재조합 균주는 아데노바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 재조합 균주로부터 수득된 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 제공한다.
바람직하게는, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "융합 단백질"은, 한 개 이상의 폴리펩타이드가 펩타이드 결합을 통하여 한가닥의 폴리펩타이드로 결합되어 있는 것을 의미하며, 목적 유전자를 포함하는 한 개 이상의 유전자가 재조합 방법에 의해 융합되어 하나의 폴리펩타이드로 번역되어 만들어진 융합 단백질을 의미한다. 본 발명에서 상기 융합단백질은 목적하는 단백질 또는 펩타이드 서열이 서로 융합되어 있으며, 목적하는 단백질 또는 펩타이드 서열 사이에 화학물질 또는 효소가 특이적으로 인지하여 절단할 수 있는 아미노산 절단 서열(화학물질 또는 효소 특이적 절단서열)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계; 및 상기 형질감염된 아데노바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 재조합 아데노바이러스 입자는 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 발현할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 재조합 아데노바이러스 입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 닭, 오리, 칠면조, 페럿 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는, 상기 인플루엔자는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 인간 인플루엔자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 생독 백신이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "생독 백신" 또는 "생백신(live attenuated vaccine)"이란 살아있는 바이러스 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한, "약독화된(attenuation)" 이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
또한, 본 발명의 백신은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 백신은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 진피내, 근육내, 복막내, 비강 또는 경막외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "개체"란 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 백신 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 질환을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 인플루엔자 바이러스로 감염된 인간을 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물로 다양한 인플루엔자 바이러스 아형 또는 변이형의 조류 인플루엔자로 감염된 닭 또는 돼지를 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 인플루엔자 바이러스 감염 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, "예방"이란 백신 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, "치료"란 백신 조성물의 투여에 의해 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> H5형과 H7형 HA1 융합단백질(H5/H7 fusion protein) 유전자의 제작
H5형 HA1 유전자의 염기서열을 확보하기 위하여 Gene Bank Database에서 1996년에 중국 광동 지역의 거위로부터 분리된 인플루엔자 A 바이러스 (A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1))의 HA 단백질의 아미노산 서열(NC_007362.1)로부터 HA1 지역에 해당하는 아미노터미날 1번에서 346번까지의 아미노산 서열을 선택하였다. 이 아미노산 서열에는 HA 단백질의 리더 펩타이드(Leader peptide) 부분과 HA1 지역에 해당하는 부분의 단백질 암호화 지역이 포함되어 있다. 이 지역에는 HA 단백질의 수용체 결합 부위와 에스터라제(esterase) 부분을 포함하고 있으나, 융합 펩타이드(fusion peptide), HA2 부분, 막 통과 지역은 제외되었다. H7형 HA1 유전자의 염기서열을 확보하기 위하여 Gene Bank Database에서 1999년 이탈리아 닭에서 분리된 인플루엔자 A 바이러스 (A/Chicken/Italy/1067/99(H7N1))의 HA 단백질의 아미노산 서열(AJ584647.1)로부터 HA1 지역에 해당하는 아미노터미날 17번에서 339번까지의 아미노산 서열을 선택하였다. 이 지역에는 HA 단백질의 수용체 결합 부위와 에스터라제(esterase) 부분을 포함하고 있으나, 리더 펩타이드(Leader peptide) 부분, 융합 펩타이드(fusion peptide), HA2 부분, 막 통과 지역은 제외되었다. 이들 두 HA1 단백질을 글리신/세린 링커 펩타이드(glycine/serine linker peptide)로 H5형 HA1(1-334)-linker(335-349)-H7형 HA1(350-572) 순서로 연결하여 하나의 단백질로 발현되도록 연결하였다. 이렇게 연결한 펩타이드에 진핵세포나 대장균에서 효과적으로 해독되도록 이렇게 연결된 펩타이드 아미노산의 카복시터미날쪽에 발현된 단백질의 확인 및 분리과정에 사용할 수 있도록 Flag tag(DYKDDDDKG)과 His tag(HHHHHH)으로 작용하는 펩타이드를 결합시켜 총 587개의 아미노산으로 구성된 단백질을 설계하였다(도 1 및 서열번호 1).
이와 같이 제작된 단백질을 동물세포에서 발현하는 재조합 바이러스를 제작하기 위하여, 이 단백질의 아미노산 서열에 해당하는 코돈 염기서열을 동물세포에서 가장 잘 읽을 수 있는 형태로 코돈을 최적화하여 결정하였다. 최종적으로 전체 염기서열 앞 부분에 단백질의 해독을 도와주는 리보좀 결합부위인 RBS/Kozak 염기서열을 추가하여 융합 단백질을 발현하는 유전자를 합성하였다(RBS KOZAK/HA1(H5) (1-346; 서열번호 2)/GS linker(15)/HAI(H7)(17-339; 서열번호 3)/FLAG/His6tga)(서열번호 4). 유전자의 합성은 코스모진텍의 유전자합성 서비스를 이용하여 제작하였다.
< 실시예 2> H5형과 H7형 HA1 융합 단백질의 발현
상기와 같이 제작된 유전자로부터 융합단백질의 생산을 확인하기 위하여, 이 합성된 유전자를 진핵세포 발현벡터에 삽입하고, 이 발현벡터를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자를 제작하였다. 제작된 융합단백질 유전자는 먼저 재조합 아데노바이러스 제작에 필요한 pShuttle-CMV 셔틀벡터의 CMV promoter와 SV40 polyA site 사이에 유전자를 전사할 수 있는 방향으로 삽입한 pAd5-AI#4212 clone을 얻었다(도 2).
상기 pAd5-AI#4212 DNA를 ㈜지뉴인텍에 의뢰히여 이 플라스미드를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자를 제작하여 동물세포에서 융합단백질이 생산되는 지를 조사하였다. 이를 위하여, 2×105 HEK293A cell을 밤새 배양한 다음, MOU가 10,000이 되도록 pAd5-AI#4212 재조합 아데노바이러스 입자 2×109 pfu를 배양액에 섞어주어 세포에 감염시킨 다음 소태아혈청이 포함된 배지에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 소태아혈청이 없는 배지로 교환한 다음 24시간 배양한 후 배양액을 모았다. 이러한 방법으로 총 3번에 걸쳐 감염된 세포의 배양액을 모아 융합단백질을 회수하였다. 수거한 융합단백질이 포함된 배양액을 20배 농축한 다음, Flag tag을 이용한 western blotting 방법으로 윰합단백질의 생산 여부를 조사하였다. 대조군으로는 융합단백질 대신에 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 재조합아데노바이러스를 사용하였다. 농축된 배양액을 SDS-PAGE로 분리한 다음, NC Membrane에 단백질을 옮긴 후, mouse anti-Flag 항체와 반응시킨 후, 이차 항체인 Rat-anti-mouse IgG1-HRP(eBioscience)와 반응시켰다. 반응이 끝나면 PBS로 세척한 다음, WEST-QueenTM kit(iNtRON)으로 반응시킨 후, 형광이미지분석기(Fusion-SL4)를 이용하여 Flag tag 항체와 반응하는 단백질의 존재유무와 그 크기를 측정하였다(도 3). 그 결과 대조군으로 사용된 GFP 발현 재조합 아데노바이러스에 감염된 세포 배양액에서는 Flag tag 항체와 반응하는 단백질이 확인되지 않았으나, 융합단백질 발현 재조합 아데노바이러스(pAd5-AI#4212 adenovirus)에 감염된 세포 배양액에서는 50kDa와 100kDa 크기의 단백질이 Flag tag 항체와 반응하는 것으로 조사되었다. 이러한 결과는 제작된 H5형 HA1과 H7형 HA1 융합단백질을 발현 구조물이 성공적으로 융합된 단백질을 생산하는 것으로 보여주는 것이다.
< 실시예 3> 생쥐에서 H5형과 H7형 HA1 융합단백질의 발현 재조합 아데노바이러스의 항체 생산 유도 효과
5주령 Female BALB/c 4마리에 H5형과 H7형 HA1 융합단백질을 발현하는 pAd5-AI#4212 재조합 아데노바이러스 입자를 코 흡입(intranasal instillation) 방법으로 접종하였다. 대조군으로 4마리의 생쥐에는 융합단백질 대신에 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 재조합아데노바이러스를 코 흡입 방법으로 접종하였다. 코 흡입은 5×108 pfu 재조합 아데노바이러스 입자를 인산염완충용액 30μl에 희석한 후, 양쪽 코구멍을 이용하여 5㎕씩 번갈아 가며 흡입시켰다. 1차 접종이 종결되면 3주간 사육한 후, 다시 한번 같은 방법으로 바이러스를 접종하였으며, 접종 1주일 후 생쥐의 안구에서 혈액을 채취하여 항혈청을 만들었다.
융합단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 코 흡입으로 두 번 접종하여 얻은 혈청 내의 융합단백질에 대한 항체생성 유무는 Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)를 이용하여 확인하였다. 먼저 ELISA plate에 세포배양에서 얻은 H5형과 H7형 HA1 융합단백질 배양액을 넣고 4도에서 밤새 반응하여 융합단백질을 코팅하였다. 다음 날 융합단백질 재조합 아데노바이러스로 접종한 생쥐의 혈청을 500배 희석하여 넣어주고, 실온에서 2시간 반응한 다음, HRP가 결합된 anti-mouse IgG/M 이차항체(Merck Millipore AP130P)로 반응한 후, 항원항체반응을 ELISA leader(ThermoFisher MULTISKAN GO)로 450nm에서 측정하였다. 그 결과 H5형과 H7형 HA1 융합단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 흡입한 생쥐의 혈청에서는 융합단백질과 반응하는 항체가 형성되었음을 확인하였다(도 4).
이러한 결과들은 H5형과 H7형 HA1 융합단백질 발현 재조합 아데노바이러스는 정상적인 아데노바이러스처럼 호흡기 점막조직에서 감염되어 생쥐의 면역체계에 인플루엔자 바이러스에 감염되었을 때와 유사한 방식으로 항체반응이 유도되었음을 보여주는 것이다. 즉, 인플루엔자 바이러스의 HA 융합단백질 유전자를 가진 재조합 아데노바이러스는 동물의 호흡기에서 효과적으로 감염되어 효과적으로 삽입된 인플루엔자 단백질에 대한 면역반응을 유도하는 생백신으로 사용될 수 있음을 제시하는 것이다. 이러한 형태의 융합단백질을 이용한 인플루엔자 백신은 2가지 이상의 인플루엔자 항원을 면역체계에 동시에 제시하는 다가형 백신으로 한 번의 접종으로 여러 인플루엔자 타입을 방어할 수 있는 백신 제조 방법으로 그동안 전혀 시도되지 않은 새로운 인플루엔자 백신 제조 방법이다. 이러한 백신은 여러 타입의 인플루엔자 바이러스를 혼합하여 사용하는 다가 백신에 비하여 여러 가지 장점을 제공한다. 본 발명과 같은 하나의 재조합 바이러스입자에 여러 항원이 결합된 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼에서는 각각의 단가형 백신 바이러스를 생산하고 혼합하는 과정이 필요없기 때문에, 신속하게 조류인플루엔자 전염에 대응할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 재조합아데노바이러스는 살아있는 바이러스이기 때문에 AI 바이러스 감염 때처럼 인플루엔자 바이러스에 대해 강력한 면역반응을 유도하며, 약독화된 생백신이므로 인플루엔자 바이러스 감염처럼 호흡기 흡입으로 간편하게 투여할 수 있으며, 대량 예방 접종이 가능하여 가금류 접종에 적합한 백신제조법이다. 더불어, 재조합 아데노바이러스는 비교적 무해한 바이러스로서 백신제조에 고병원성 인플루엔자 바이러스를 사용하지 않기 때문에, 제조 과정의 생물학적 안전 위험도가 낮아 생산 기간의 단축 및 생산 원가의 절감에 더 기여할 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 인플루엔자 바이러스 H5형 혈구응집원 1(hemagglutinin 1, HA1) 유전자 및 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 리보솜 결합부위, 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 유전자, 링커, 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자 및 태그 유전자를 순서대로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 유전자는 서열번호 2로 표시되고, 상기 인플루엔자 바이러스 H7형 HA1 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 균주.
  6. 제5항에 있어서, 상기 재조합 균주는 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  7. 제5항에 따른 재조합 균주로부터 수득된 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 융합단백질.
  9. 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 발현벡터로 아데노바이러스를 형질감염시키는 단계; 및
    상기 형질감염된 아데노바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스 입자는 인플루엔자 바이러스 H5형 HA1 및 H7형 HA1 재조합 융합단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 입자 제조 방법.
  12. 제9항의 방법에 따라 제조된 재조합 아데노바이러스 입자.
  13. 제12항에 따른 재조합 아데노바이러스 입자를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 인플루엔자는 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 또는 인간 인플루엔자인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  15. 제13항에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하여 인플루엔자를 예방 또는 치료하는 방법.
PCT/KR2019/000651 2018-03-14 2019-01-16 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼 WO2019177256A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/980,838 US11672854B2 (en) 2018-03-14 2019-01-16 Multivalent live influenza vaccine platform using recombinant adenovirus
CN201980025316.7A CN111971393A (zh) 2018-03-14 2019-01-16 使用重组腺病毒的多价活流感疫苗平台
EP19766645.6A EP3766979A4 (en) 2018-03-14 2019-01-16 MULTIVALENT LIVE INFLUENZA VACCINE PLATFORM USING RECOMBINANT ADENOVIRUS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0029823 2018-03-14
KR1020180029823A KR101964044B1 (ko) 2018-03-14 2018-03-14 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019177256A1 true WO2019177256A1 (ko) 2019-09-19

Family

ID=66167120

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/000651 WO2019177256A1 (ko) 2018-03-14 2019-01-16 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11672854B2 (ko)
EP (1) EP3766979A4 (ko)
KR (1) KR101964044B1 (ko)
CN (1) CN111971393A (ko)
WO (1) WO2019177256A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111503A (zh) * 2020-08-24 2020-12-22 河北省动物疫病预防控制中心 同时预防禽流感h5和h9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150104117A (ko) * 2012-12-18 2015-09-14 이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이 인플루엔자 바이러스 백신 및 그의 용도
KR101835989B1 (ko) * 2016-08-31 2018-03-08 충북대학교 산학협력단 인플루엔자 바이러스의 다중 아형 h3 및 h7 에 대한 다중 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI365074B (en) 2004-10-07 2012-06-01 Wyeth Corp Multivalent avian influenza vaccines
EP1877088B1 (en) * 2005-04-11 2014-12-17 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vaccine against pandemic strains of influenza viruses
CU23576A1 (es) * 2006-02-28 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar
US8043856B2 (en) * 2007-06-14 2011-10-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Adenoviral vectors for influenza virus production
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
CN101914498B (zh) * 2010-02-08 2013-07-03 中国农业科学院上海兽医研究所 稳定表达高致病力禽流感病毒ha蛋白的mdck细胞系及其用途
US9708373B2 (en) * 2010-03-30 2017-07-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccine and uses thereof
CN102719479A (zh) 2012-03-16 2012-10-10 吉林大学 共表达两种亚型猪流感病毒ha基因重组腺病毒的制备
GB201421692D0 (en) * 2014-12-05 2015-01-21 Iquar Ltd Vaccines based on hepatitis B core antigens
MX2018004916A (es) * 2015-10-22 2019-07-04 Modernatx Inc Vacuna contra el virus de la influenza de amplio espectro.
WO2017218624A1 (en) * 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150104117A (ko) * 2012-12-18 2015-09-14 이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이 인플루엔자 바이러스 백신 및 그의 용도
KR101835989B1 (ko) * 2016-08-31 2018-03-08 충북대학교 산학협력단 인플루엔자 바이러스의 다중 아형 h3 및 h7 에 대한 다중 교차 면역반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Gene Bank", Database accession no. NC_007362.1
DATABASE Nucleotide 19 April 2001 (2001-04-19), "hemagglutinin [Influenza A virus (A/goose/Guangdong/3/1997(H5N1))]", XP055643038, retrieved from NCBI Database accession no. AAK38298.1 *
DATABASE Nucleotide 23 February 2015 (2015-02-23), "Synthetic construct hemagglutinin (HA) gene, complete cds", XP055643035, retrieved from NCBI Database accession no. KC172926 *
DATABASE Nucleotide 26 July 2016 (2016-07-26), "Influenza A virus (A/chicken/New York/Sg-00270/1995(H7N2)) segment 4 sequence", XP055643037, retrieved from NCBI Database accession no. CY035491 *
See also references of EP3766979A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111503A (zh) * 2020-08-24 2020-12-22 河北省动物疫病预防控制中心 同时预防禽流感h5和h9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101964044B1 (ko) 2019-04-02
EP3766979A1 (en) 2021-01-20
CN111971393A (zh) 2020-11-20
EP3766979A4 (en) 2022-01-12
US20210361763A1 (en) 2021-11-25
US11672854B2 (en) 2023-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Collisson et al. Cytotoxic T lymphocytes are critical in the control of infectious bronchitis virus in poultry
Kodihalli et al. Strategies for inducing protection against avian influenza A virus subtypes with DNA vaccines
Saito et al. Characterization of a human H9N2 influenza virus isolated in Hong Kong
US20220118077A1 (en) Immunogen for broad-spectrum influenza vaccine and application thereof
US10793834B2 (en) Live-attenuated virus and methods of production and use
CN113186173B (zh) 一种基于减毒流感病毒载体的新型冠状病毒肺炎疫苗
KR20070100882A (ko) 결손 인플루엔자 바이러스 입자
CN103451158A (zh) 用于犬科动物中呼吸系统疾病控制的物质和方法
CN104017775A (zh) 能够感染犬科动物的流感病毒及其用途
US10369211B2 (en) Influenza H5 vaccines
CN107281478A (zh) 流感疫苗
US20100086485A1 (en) Influenza vaccine
WO2019177256A1 (ko) 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼
Wang et al. Enhanced cross-lineage protection induced by recombinant H9N2 avian influenza virus inactivated vaccine
Virelizier et al. The role of humoral immunity in host defence against influenza A infection in mice
KR20150036685A (ko) 약독화된 돼지 인플루엔자 백신 및 이의 제조 방법 및 용도
WO2022181897A1 (ko) 코로나바이러스감염증-19(covid-19)에 대한 재조합 아데노바이러스 백신 및 이를 이용한 병용요법
US20160361409A1 (en) H5 proteins of h5n1 influenza virus for use as a medicament
Yuan et al. Immunoprotection induced by CpG-ODN/Poly (I: C) combined with recombinant gp90 protein in chickens against reticuloendotheliosis virus infection
Webster et al. Vaccination as a strategy to reduce the emergence of amantadine-and rimantadine-resistant strains of A/Chick/Pennsylvania/83 (H5N2) influenza virus
CN105169383A (zh) 以杆状病毒为载体的广谱禽流感疫苗及其制备方法和应用
KR102098585B1 (ko) 교차 면역원성을 갖는 h2 아형 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신
Kilbourne et al. Hemagglutinin mutants of swine influenza virus differing in replication characteristics in their natural host
Wu et al. Protective immunity elicited by a pseudotyped baculovirus-mediated bivalent H5N1 influenza vaccine
WO2024196133A1 (ko) 교차 면역원성을 갖는 h3 아형 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19766645

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019766645

Country of ref document: EP

Effective date: 20201014