KR20150104117A - 인플루엔자 바이러스 백신 및 그의 용도 - Google Patents

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피터 팔레스
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이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이
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Abstract

본 발명은 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 백신, 및 이들의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 바이러스 백신 및 그의 용도{INFLUENZA VIRUS VACCINES AND USES THEREOF}
본 발명은 국립 보건원에 의해 부여받은 허가 번호 AI070469, AI086061 및 HHSN266200700010C 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
본 발명은 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 백신, 및 이의 사용 방법을 제공한다.
인플루엔자 바이러스는 오쏘믹소비리다에(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 외피보유 RNA 바이러스이다(문헌[Palese and Shaw (2007) Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication, 5th ed. Fields' Virology, edited by B.N. Fields, D.M. Knipe and P.M. Howley. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA, p1647-1689]). 인플루엔자 A형 바이러스의 천연 숙주는 주로 조류이나, 인플루엔자 A형 바이러스(조류 기원의 바이러스 포함)는 또한 인간 및 다른 동물 숙주(박쥐, 개, 돼지, 말, 해양 포유동물, 및 족제비)를 감염시킬 수 있고 질병을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 아시아에서 돌고 있는 H5N1 조류 인플루엔자 A형 바이러스가 중국과 인도네시아의 돼지에서 발견되었으며 또한 그의 숙주 범위를 고양이, 표범 및 호랑이(이들은 일반적으로 인플루엔자 A형에 민감한 것으로 간주되지 않았었다(CIDRAP - 조류 인플루엔자: 농예 및 야생생물 고려사항들))를 포함한 범위로 확대시켰다. 동물들에서 인플루엔자 바이러스 감염의 출현은 잠재적으로 인간 대유행 인플루엔자 균주를 생기게 할 수 있다.
인플루엔자 A형 및 B형 바이러스는 주요 인간 병원체이며, 중증도가 무증상 감염에서부터 사망을 발생시킬 할 수 있는 주요 바이러스성 폐렴 범위에 이르는 호흡기 질병을 야기한다. 상기 감염의 임상적 영향은 상기 인플루엔자 균주의 독성 및 숙주의 노출, 병력, 연령 및 면역 상태에 따라 변한다. 계절성 인플루엔자에 의해 야기되는 누적 이환률 및 사망률은 비교적 높은 발병률로 인해 상당하다. 보통 계절에, 인플루엔자는 세계적으로 3백만 내지 5백만 건의 중증 질병 내지 500,000건 이하의 사망을 야기할 수 있다(세계보건기구(2003) 인플루엔자: 개관; 2003년 3월). 미국에서, 인플루엔자 바이러스는 추정상 인구의 10 내지 15%를 감염시키고(문헌[Glezen and Couch RB (1978) Interpandemic influenza in the Houston area, 1974-76. N Engl J Med 298: 587-592]; 문헌[Fox et al . (1982) Influenza virus infections in Seattle families, 1975-1979. II. Pattern of infection in invaded households and relation of age and prior antibody to occurrence of infection and related illness. Am J Epidemiol 116: 228-242]) 매년 대략 30,000건의 사망과 관련된다(문헌[Thompson WW et al . (2003) Mortality Associated with Influenza and Respiratory Syncytial Virus in the United States. JAMA 289: 179-186]; 문헌[Belshe (2007) Translational research on vaccines: influenza as an example. Clin Pharmacol Ther 82: 745-749]).
연간 전염병 외에, 인플루엔자 바이러스는 희귀한 대유행병의 원인이다. 예를 들어, 인플루엔자 A형 바이러스는 1918년, 1957년, 1968년 및 2009년에 발생한 대유행병과 같은 대유행병을 야기할 수 있다. 주요 바이러스 항원인 헤마글루티닌(HA)에 대해 사전-형성되는 면역성의 결여로 인해, 대유행 인플루엔자는 한 해에 인구의 50%를 초과하여 감염시킬 수 있으며 종종 전염성 인플루엔자보다 더 심한 질병을 야기할 수 있다. 두드러진 예가 1918년의 대유행병이며, 이때 추정상 5천만명 내지 1억명의 사람이 죽었다(문헌[Johnson and Mueller (2002) Updating the Accounts: Global Mortality of the 1918-1920 "Spanish" Influenza Pandemic Bulletin of the History of Medicine 76: 105-115]). 1990년대 말 고 병원성 조류 H5N1 인플루엔자 바이러스의 출현 이래로(문헌[Claas et al . (1998) Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 351: 472-7]), 다음 대유행 바이러스가 있을 수 있다는 우려가 있어 왔다. 더욱이, H7 및 H9 균주는 때때로 인간을 감염시키기 때문에 새로운 대유행병의 후보들이다.
인플루엔자 바이러스 감염에 대한 유효한 보호 방법은 백신접종을 통해서이나; 현행의 백신접종 접근법은 순환하는 균주와 상기 백신 중에 포함된 단리물 간의 양호한 합치의 성취에 의존한다. 상기와 같은 합치는 종종 인자들의 조합으로 인해 획득이 어렵다. 먼저, 인플루엔자 바이러스는 끊임없이 변화를 겪고 있다: 3 내지 5년마다 인플루엔자 A형 바이러스의 우세 균주가, 기존 항체 반응을 피하기에 충분한 항원 연속변이를 겪은 변체에 의해 대체된다. 따라서 백신 제제에 포함되는 단리물을 세계보건기구(WHO) 협력 센터의 집중적인 감시 노력을 바탕으로 매년 선택해야 한다. 두 번째, 백신 제조 및 분배에 충분한 시간을 허용하기 위해서, 균주를 인플루엔자 계절의 개시에 앞서 대략 6개월 전에 선택해야 한다. 종종, 상기 백신 균주 선택 위원회의 예견이 잘못되어, 백신접종 효능이 상당히 떨어진다.
인류 집단에 들어가는 인플루엔자 A형 바이러스의 새로운 하위유형의 가능성이 또한 현행 백신접종 전략에 중대한 도전을 제공한다. 인플루엔자 바이러스의 어떤 하위유형 및 균주가 다음 대유행병을 야기할 것인지를 예견하는 것은 불가능하기 때문에, 현행의 균주-특이적인 접근법은 대유행 인플루엔자 백신의 제조에 사용될 수 없다.
하나의 태양에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 보존된 HA 줄기 도메인에 대해 교차-보호 면역 반응을 유도하는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 안정한(예를 들어, 적합하게 형성된) HA 줄기 도메인 및 상기 줄기 도메인에 이종인 구상 HA 헤드 도메인을 포함한다(즉, 상기 헤드 및 줄기 도메인은 인플루엔자 바이러스의 상이한 균주 및/또는 하위유형으로부터 유래한다).
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) H1 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 특정한 실시태양들에서, 본 발명에 제공된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 H1 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인은 상기 집단의 대다수가 미경험인 H1 하위유형으로부터의 것이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 H1 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인은 곧 나타날 H1N1 백신 균주, 예를 들어 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2029, 2030, 2031, 2032, 2032, 2033, 2034, 또는 2035 년도에 쓰일 H1N1 백신 균주로부터의 것이다.
특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 A/푸에르토리코/8/34("PR8") HA의 줄기 도메인을 포함하지 않고 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인을 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
특정한 실시태양들에서, 본 발명에 제공된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인은 상기 집단의 대다수가 미경험인 H3 하위유형으로부터의 것이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인은 곧 나타날 H3N2 백신 균주, 예를 들어 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2029, 2030, 2031, 2032, 2032, 2033, 2034, 또는 2035 년도에 쓰일 H3N2 백신 균주로부터의 것이다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인을 포함하지 않고 A/퍼쓰/16/2009(H3) HA의 줄기 도메인을 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H7 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다).
특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/네덜란드/219/03(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/504/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/444/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/레아/NC/39482/93(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/빅토리아/361/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/네덜란드/219/03(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/504/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/444/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/레아/NC/39482/93(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인(또는 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/네덜란드/219/03(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/504/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/444/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/레아/NC/39482/93(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/네덜란드/219/03(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/504/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/444/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/레아/NC/39482/93(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/2009(H3N2)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
특정한 실시태양들에서, 본 발명에 제공된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인은 상기 집단의 대다수가 미경험인 H3 하위유형으로부터의 것이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인은 곧 나타날 H3N2 백신 균주, 예를 들어 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2029, 2030, 2031, 2032, 2032, 2033, 2034, 또는 2035 년도에 쓰일 H3N2 백신 균주로부터의 것이다.
특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다).
특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/베트남/1203/2004(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도네시아/5/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/안후이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/인도기러기/큉하이/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/칠면조/터키/1/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H7 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다).
특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/네덜란드/219/03(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/504/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/444/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/레아/NC/39482/93(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/네덜란드/219/03(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/504/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/444/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/레아/NC/39482/93(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/네덜란드/219/03(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/504/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/444/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/레아/NC/39482/93(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/네덜란드/219/03(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/504/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/캐나다/444/04(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/레아/NC/39482/93(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인(또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) 상이한 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다).
특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/리(Lee)/1940 HA의 구상 헤드 도메인(또는 B/리/1940-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인(또는 B/말레이시아/2506/2004-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/바다표범/네덜란드/1/99 HA의 구상 헤드 도메인(또는 B/바다표범/네덜란드/1/99-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/리/1940 HA의 구상 헤드 도메인(또는 B/리/1940-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인(또는 B/플로리다/4/2006-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/바다표범/네덜란드/1/99 HA의 구상 헤드 도메인(또는 B/바다표범/네덜란드/1/99-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/리/1940 HA의 구상 헤드 도메인(또는 B/리/1940-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인(또는 B/위스콘신/1/2010-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/바다표범/네덜란드/1/99 HA의 구상 헤드 도메인(또는 B/바다표범/네덜란드/1/99-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/리/1940 HA의 구상 헤드 도메인(또는 B/리/1940-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인(또는 B/브리즈번/60/2008-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/바다표범/네덜란드/1/99 HA의 구상 헤드 도메인(또는 B/바다표범/네덜란드/1/99-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H4 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/09 HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/09-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/09 HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/09-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/오리/체코/56의 구상 헤드 도메인(또는 A/오리/체코/56-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 가용성이다, 예를 들어 조성물, 예를 들어 본 발명에 개시된 조성물 중에 가용성이다. 가용성 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 예시적인 생성 방법들은 하기 실시예 6에 개시되어 있다.
상기 키메릭 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 설계하는 경우, 생성되는 단백질의 안정성을 유지하도록 주의해야 한다. 이에 관하여, 몇몇 실시태양에서, 인플루엔자 A형 바이러스로부터의 줄기 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 경우, 도 1에서 Ap 및 Aq로서 나타낸 시스테인 잔기들을, 상기 잔기들이 하기 섹션 1에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이 상기 HA 줄기의 안정성에 기여하기 때문에 유지시키는 것이 권장된다. 예를 들어, 최상의 안정성을 위해서, 상기 HA 구상 도메인을 전체로(도 1에 도시된 바와 같이 Ap와 Aq 시스테인 잔기 사이에서) "교환"하는 것이, 생성되는 형태가 본래 구조에 가장 가까울 것이므로, 바람직하다. 유사하게, 인플루엔자 B형 바이러스의 줄기 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인이 획득되는 인플루엔자 A형 바이러스의 구상 헤드 도메인 중에 존재하는 시스테인을 사용할 수 있다(예를 들어, 도 36을 참조하시오).
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나, 둘 또는 그 이상을 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신 제형)을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 면역원성 조성물(예를 들어, 백신 제형)은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(들), 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(들) 또는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(들)를 암호화하도록 조작된 게놈을 포함하는 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 생 또는 죽은 바이러스); 또는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(들) 또는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(들)를 암호화하도록 조작된 게놈을 포함하는 벡터 또는 세포를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 면역원성 조성물은 (i) 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 또는 본 발명에 개시된 cHB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드; (ii) 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 조합; 또는 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 조합; (iii) 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 및 본 발명에 개시된 cH5/B, cH7/B, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 어느 하나의 조합; 또는 (iv) 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 및 본 발명에 개시된 cH5/B, cH7/B 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 어느 하나의 조합을 포함할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 백신 제형을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나를 포함하는 1가 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 2개(즉, 2개의 별개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 2가 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 3개(즉, 3개의 별개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 3가 백신을 제공한다.
본 발명에 제공된 백신 제형은 임의의 형태의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 제공된 백신 제형은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 서브유닛 백신(예를 들어, 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 예를 들어 가용성 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 조성물); 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하는 생 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 생 약독화 인플루엔자 바이러스); 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 암호화하는 게놈을 포함하는 생 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 생 약독화 인플루엔자 바이러스); 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 죽은 인플루엔자 바이러스; 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 암호화하는 게놈을 포함하는 죽은 인플루엔자 바이러스; 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 함유하는 바이러스/바이러스-유사 입자("VLP"); 분할 바이러스 백신(여기에서 상기 바이러스는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하고/하거나 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 암호화하는 게놈을 포함한다); 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하는 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 비-인플루엔자 바이러스 발현 벡터); 및 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하는 세균 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명에 개시된 백신 제형은 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA 줄기 도메인에 대해 고도로 효능 있고 광범위하게 중화하는 항체를 이끌어낼 수 있다. 상기와 같은 "범용" 백신을 사용하여 인플루엔자 바이러스 하위유형들 전체에 걸쳐 교차-보호성 면역 반응을 유도하고/하거나 증강시킬 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스 질병 또는 감염에 대해 면역시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 대상을 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 제 1 조성물 또는 본 발명에 개시된 백신 제형으로 초회항원자극하고, 나중에 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을 포함하는 동일하거나 상이한 조성물(예를 들어, 상이한 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 조성물; 동일한 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하지만 상이한 상황(예를 들어, 상기 제 1 조성물이 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 서브유닛 백신을 포함하고 상기 상이한 조성물은 상기 동일한 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다)의 조성물, 또는 상이한 상황에서 상이한 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 조성물)로 추가접종한다. 상기 대상을 1회, 또는 1회를 초과하여, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 본 발명에 개시된 백신 제형으로 추가접종할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 대상을 1회를 초과하여 추가접종하는 경우, 제 1 및 제 2 추가접종은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 상이한 조성물 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을 사용하며, 각각의 추가접종은 상기 대상을 초회항원자극하는데 사용된 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 본 발명에 개시된 백신 제형과 상이한 조성물을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 대상에게 제 1 용량의 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 벡터, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물, 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을 투여하고 상기 대상에게 제 2 용량의 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 벡터, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물, 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을, 상기 대상이 상기 제 1 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 투여함을 포함하는, 상기 대상(예를 들어, 인간 대상)를 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법을 제공하며, 여기에서 (i) 상기 제 1 및 제 2 용량에서 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 상기 벡터, 상기 면역원성 조성물 또는 백신 제형 중의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 동일하거나 상이하고(예를 들어, 상기 제 1 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드가 상기 제 2 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드와 상이하다); 및/또는 (ii) 상기 두 용량 모두로 투여된 면역원성 조성물 또는 벡터 또는 백신 제형의 유형은 동일하거나 상이하다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 대상에게 제 3 용량의 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 벡터, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물, 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을, 상기 대상이 상기 제 2 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 투여함을 포함하며, 여기에서 (i) 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 상기 벡터, 상기 면역원성 조성물 또는 백신 제형 중의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 상기 제 1 및/또는 제 2 용량 중의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드와 동일하거나 상이하고; (ii) 상기 두 용량 모두로 투여된 면역원성 조성물 또는 벡터 또는 백신 제형의 유형은 동일하거나 상이하다. 몇몇 실시태양에서, 2개, 3개 또는 그 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 상기 제 1, 제 2 및/또는 제 3 용량의 부분으로서 투여하며, 여기에서 용량 중의 각각의 키메릭 HA 폴리펩타이드는 서로 상이하다. 일부 실시태양에서, 상기 벡터, 상기 면역원성 조성물, 또는 백신 제형의 제 1, 제 2 및/또는 제 3 용량은 2개, 3개 또는 그 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하고, 여기에서 하나의 용량으로 투여된 상기 벡터, 상기 면역원성 조성물, 또는 백신 제형 중의 각각의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 서로 상이하다(예를 들어, 상기 제 1 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드는 상기 제 2 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드와 상이하다 등).
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 1 내지 5세의 인간 대상에게 제 1 용량의 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 벡터, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물, 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을 투여하고 상기 대상에게 제 2 용량의 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 벡터, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물, 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을, 상기 대상이 상기 제 1 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법을 제공하며, 여기에서 (i) 상기 제 1 및 제 2 용량에서 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 상기 벡터, 상기 면역원성 조성물 또는 백신 제형 중의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 동일하거나 상이하고(예를 들어, 상기 제 1 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드는 상기 제 2 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드와 상이하다); 및/또는 (ii) 상기 두 용량 모두로 투여된 면역원성 조성물 또는 벡터 또는 백신 제형의 유형은 동일하거나 상이하다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 대상에게 제 3 용량의 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 벡터, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물, 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을, 상기 대상이 상기 제 2 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 투여함을 포함하며, 여기에서 (i) 상기 제 1 및 제 2 용량에서 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 상기 벡터, 상기 면역원성 조성물 또는 백신 제형 중의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 동일하거나 상이하고(예를 들어, 상기 제 1 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드는 상기 제 2 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드와 상이하다); 및/또는 (ii) 상기 두 용량 모두로 투여된 면역원성 조성물 또는 벡터 또는 백신 제형의 유형은 동일하거나 상이하다. 몇몇 실시태양에서, 2개, 3개 또는 그 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 상기 제 1, 제 2 및/또는 제 3 용량의 부분으로서 투여하며, 여기에서 하나의 용량 중의 각각의 키메릭 HA 폴리펩타이드는 서로 상이하다. 일부 실시태양에서, 상기 벡터, 상기 면역원성 조성물, 또는 백신 제형의 제 1, 제 2 및/또는 제 3 용량은 2개, 3개 또는 그 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하고, 여기에서 하나의 용량으로 투여된 상기 벡터, 상기 면역원성 조성물, 또는 백신 제형 중의 각각의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 서로 상이하다(예를 들어, 상기 제 1 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드는 상기 제 2 용량으로 투여된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드와 상이하다 등).
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명에서 제공된 키트는 하나 이상의 추가적인 성분, 예를 들어 상기 키트에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 포함할 수도 있다.
실행 실시예들(예를 들어, 실시예)은 특히, HA 줄기 도메인을 포함하고 이종 HA 구상 헤드 도메인을 나타내는 키메릭 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 구조물의 제조, 및 상기 줄기 도메인 및 상기 헤드 도메인 모두에 대한 항체와 교차-반응성인 상기 구조물로부터의 안정한 키메릭 HA 폴리펩타이드의 제조를 설명한다. 이들 실행 실시예들은 또한 인플루엔자 바이러스의 다수의 상이한 균주 및 하위유형들에 대해서 대상에서 보호 면역 반응을 생성시킴에 있어서 상기와 같은 구조물의 용도를 예시한다, 즉 이들 실시예들은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 범용 인플루엔자 백신으로서 사용할 수 있음을 설명한다.
용어
"약" 또는 "대략"이란 용어는 아미노산 위치와 관련하여 사용될 때, N-말단 방향 또는 C-말단 방향으로, 서열 중 특정 아미노산 위치 또는 상기 아미노산 위치의 5, 4, 3, 2 또는 1개의 잔기 이내의 임의의 아미노산을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "약" 또는 "대략적으로"란 용어는 숫자와 함께 사용될 때 언급된 숫자의 1, 5 또는 10% 이내의 임의의 숫자를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, "약"이란 용어는 인용된 정확한 숫자를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 핵산 서열과 관련하여 "단편"이란 용어는 모 서열로부터 연속적인 뉴클레오타이드의 일부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 상기 용어는 모 서열로부터 5 내지 15, 5 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 30, 10 내지 60, 25 내지 100, 150 내지 300 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 용어는 모 서열의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450 또는 475의 연속적인 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 아미노산 서열과 관련하여 "단편"이란 용어는 모 서열로부터 연속적인 아미노산 잔기의 일부를 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 상기 용어는 모 서열로부터 2 내지 30, 5 내지 30, 10 내지 60, 25 내지 100, 150 내지 300 또는 그 이상의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 지칭한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 용어는 모 서열의 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 150, 175 또는 200의 연속적인 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "질병" 및 "질환"이란 용어는 대상의 병을 지칭하는데 호환적으로 사용된다. 특정한 실시태양에서, "질병"이란 용어는 세포 또는 대상에서 상기 바이러스의 존재로부터, 또는 상기 바이러스에 의한 세포 또는 대상의 침입에 의해 발생하는 병적인 상태를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 병은 대상의 질병이며, 상기 질병의 중증도를 면역원성 조성물의 투여를 통해 상기 대상에서 면역 반응을 유도함으로써 감소시킨다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 대상에의 치료법의 투여와 관련하여 "유효량"이란 용어는 예방학적 및/또는 치료학적 효과(들)를 갖는 치료법의 양을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 대상에의 치료법의 투여와 관련하여 "유효량"은 하기의 효과들 중 하나, 둘, 셋, 넷 또는 그 이상을 성취하기에 충분한 치료법의 양을 지칭한다: (i) 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 중증도를 감소시키거나 개선시킨다; (ii) 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 지속기간을 감소시킨다; (iii) 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 진행을 방지한다; (iv) 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 역행을 야기한다; (v) 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 발생 또는 개시를 방지한다; (vi) 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 재발을 방지한다; (vii) 하나의 세포에서 또 다른 세포로, 하나의 조직에서 또 다른 조직으로, 또는 하나의 기관에서 또 다른 기관으로의 인플루엔자 바이러스의 확산을 감소시키거나 방지한다; (ix) 하나의 대상로부터 또 다른 대상로의 인플루엔자 바이러스의 확산을 방지하거나 감소시킨다; (x) 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 기관 기능부전을 감소시킨다; (xi) 대상의 입원을 감소시킨다; (xii) 입원 기간을 감소시킨다; (xiii) 인플루엔자 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병이 있는 대상의 생존을 증가시킨다; (xiv) 인플루엔자 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병을 제거한다; (xv) 인플루엔자 바이러스 복제를 억제하거나 감소시킨다; (xvi) 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포(들)내로의 침입을 억제하거나 감소시킨다; (xviii) 인플루엔자 바이러스 게놈의 복제를 억제하거나 감소시킨다; (xix) 인플루엔자 바이러스 단백질의 합성을 억제하거나 감소시킨다; (xx) 인플루엔자 바이러스 입자의 조립을 억제하거나 감소시킨다; (xxi) 숙주 세포(들)로부터 인플루엔자 바이러스 입자의 방출을 억제하거나 감소시킨다; (xxii) 인플루엔자 바이러스 역가를 감소시킨다; 및/또는 (xxiii) 또 다른 치료법의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)를 증대시키거나 개선시킨다.
몇몇 실시태양에서, 상기 유효량은 인플루엔자 바이러스 질병으로부터 완전한 보호를 생성시키는 것이 아니라, 처리되지 않은 대상에 비해 인플루엔자 바이러스의 보다 낮은 역가 또는 감소된 수를 생성시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 유효량은 처리되지 않은 대상에 비해 인플루엔자 바이러스의 역가의 0.5 배, 1 배, 2 배, 4 배, 6 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 25 배, 50 배, 75 배, 100 배, 125 배, 150 배, 175 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 750 배, 또는 1,000 배 또는 그 이상의 감소를 생성시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 유효량은 처리되지 않은 대상에 비해 대략 1 로그 이상, 대략 2 로그 이상, 대략 3 로그 이상, 대략 4 로그 이상, 대략 5 로그 이상, 대략 6 로그 이상, 대략 7 로그 이상, 대략 8 로그 이상, 대략 9 로그 이상, 대략 10 로그 이상, 1 내지 3 로그, 1 내지 5 로그, 1 내지 8 로그, 1 내지 9 로그, 2 내지 10 로그, 2 내지 5 로그, 2 내지 7 로그, 2 로그 내지 8 로그, 2 내지 9 로그, 2 내지 10 로그 3 내지 5 로그, 3 내지 7 로그, 3 내지 8 로그, 3 내지 9 로그, 4 내지 6 로그, 4 내지 8 로그, 4 내지 9 로그, 5 내지 6 로그, 5 내지 7 로그, 5 내지 8 로그, 5 내지 9 로그, 6 내지 7 로그, 6 내지 8 로그, 6 내지 9 로그, 7 내지 8 로그, 7 내지 9 로그, 또는 8 내지 9 로그의 인플루엔자 바이러스의 역가의 감소를 생성시킨다. 인플루엔자 바이러스의 역가, 수 또는 전체 부담의 감소의 이점은 비제한적으로 상기 감염의 보다 적은 중증 증상, 상기 감염의 보다 적은 증상 및 상기 감염과 관련된 질병의 기간의 감소를 포함한다.
"헤마글루티닌" 및 "HA"는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 헤마글루티닌을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 헤마글루티닌은 인플루엔자 헤마글루티닌, 예를 들어 인플루엔자 A형 헤마글루티닌, 인플루엔자 B형 헤마글루티닌, 또는 인플루엔자 C형 헤마글루티닌이다. 전형적인 헤마글루티닌은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 도메인들, 예를 들어 신호 펩타이드(본 발명에서 선택적임), 줄기 도메인, 구상 헤드 도메인, 관강 도메인(본 발명에서 선택적임), 막관통 도메인(본 발명에서 선택적임) 및 세포질 도메인(본 발명에서 선택적임)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 헤마글루티닌은 단일 폴리펩타이드쇄, 예를 들어 HA0으로 이루어진다. 몇몇 실시태양에서, 헤마글루티닌은 4원 회합의 하나 초과의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진다, 예를 들어 HA1 및 HA2. 당해 분야의 숙련가들은 미성숙 HA0이 절단되어 신호 펩타이드(대략 20 아미노산)를 방출하여 성숙한 헤마글루티닌 HA0을 제공할 수 있음을 알 것이다. 헤마글루티닌 HA0을 또 다른 부위에서 절단하여 HA1 폴리펩타이드(상기 구상 헤드 도메인 및 상기 줄기 도메인의 일부를 포함하여, 대략 320 아미노산) 및 HA2 폴리펩타이드(상기 줄기 도메인의 나머지, 관강 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하여, 대략 220 아미노산)를 제공할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 헤마글루티닌은 단일 펩타이드, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 헤마글루티닌은 신호 펩타이드가 없다, 즉 상기 헤마글루티닌은 성숙한 헤마글루티닌이다. 몇몇 실시태양에서, 헤마글루티닌은 막관통 도메인 또는 세포질 도메인, 또는 둘 다가 없다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "헤마글루티닌" 및 "HA"란 용어는 신호 펩타이드 절단, 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화(예를 들어, N-결합된 글리코실화), 프로테아제 절단 및 지질 변형(예를 들어, S-팔미토일화)과 같은 번역-후 가공에 의해 변형된 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드", "키메릭 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩타이드", "키메릭 헤마글루티닌 폴리펩타이드" 및 "키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"란 용어는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 줄기 도메인 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌을 지칭하며, 여기에서 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 헤드 도메인은 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 줄기 도메인에 이종이다(즉, 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인과 상이한 균주 또는 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 것이다).
"HA1 N-말단 줄기 분절"은 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 폴리펩타이드의 줄기 도메인의 아미노-말단 부분에 상응하는 폴리펩타이드 분절을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, HA1 N-말단 줄기 분절은 HA1 도메인의 대략 아미노산 HA1N - term 내지 Ap에 상응하는 아미노산 잔기들로 이루어진다. HA1N - term은 당해 분야의 숙련가들에게 인식되는 바와 같이 HA1의 N-말단 아미노산이다. Ap는 HA1 C-말단 줄기 분절 중의 시스테인 잔기와 다이설파이드 결합을 형성하거나 형성할 수 있는 HA1 N-말단 줄기 분절 중의 시스테인 잔기이다. 잔기 Ap는 도 1에서 인플루엔자 A형 헤마글루티닌 폴리펩타이드에서 확인된다. 예시적인 HA1 N-말단 줄기 분절들이 본 발명에 개시되어 있다. 몇몇 실시태양에서, HA1 N-말단 줄기 분절은 H3 헤마글루티닌으로부터의 HA1의 대략 아미노산 1 내지 52에 상응하는 아미노산 잔기들로 이루어진다. 상기 넘버링 시스템에서, 1은 성숙한 HA0 단백질(상기로부터 신호 펩타이드가 제거되었다)의 N-말단 아미노산을 지칭함에 유의한다. 당해 분야의 숙련가들은 다른 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 HA1 N-말단 줄기 분절에 상응하는 아미노산 잔기, 예를 들어 H1 헤마글루티닌으로부터의 HA1의 HA1 N-말단 줄기 분절에 상응하는 아미노산 잔기(예를 들어, 도 1을 참조하시오)를 쉽게 인식할 수 있을 것이다.
"HA1 C-말단 줄기 분절"은 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 폴리펩타이드의 줄기 도메인의 카복시-말단 부분에 상응하는 폴리펩타이드 분절을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, HA1 C-말단 줄기 분절은 HA1 도메인의 대략 아미노산 Aq 내지 HA1C -term에 상응하는 아미노산 잔기들로 이루어진다. HA1C - term은 당해 분야의 숙련가들에게 인식되는 바와 같이 HA1 도메인의 C-말단 아미노산이다. 잔기 Aq는 도 1에서 인플루엔자 A형 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중에서 확인된다. 예시적인 HA1 C-말단 줄기 분절들이 본 발명에 개시되어 있다. 몇몇 실시태양에서, HA1 C-말단 줄기 분절은 H3 헤마글루티닌으로부터의 HA1의 대략 아미노산 277 내지 346에 상응하는 아미노산 잔기들로 이루어진다. 상기 넘버링 시스템에서, 1은 성숙한 HA0 단백질(상기로부터 신호 펩타이드가 제거되었다)의 N-말단 아미노산을 지칭함에 유의한다. 당해 분야의 숙련가들은 다른 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 HA1 C-말단 줄기 분절에 상응하는 아미노산 잔기, 예를 들어 H1 헤마글루티닌으로부터의 HA1의 HA1 C-말단 줄기 분절에 상응하는 아미노산 잔기(예를 들어, 도 1을 참조하시오)를 쉽게 인식할 수 있을 것이다.
"HA2"는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA2 도메인에 상응하는 폴리펩타이드 도메인을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, HA2는 줄기 도메인, 관강 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인으로 이루어진다(예를 들어, 문헌[Scheiffle et al ., 2007, EMBO J. 16(18):5501-5508](내용 전체가 참고로 인용된다)을 참조하시오). 몇몇 실시태양에서, HA2는 줄기 도메인, 관강 도메인 및 막관통 도메인으로 이루어진다. 몇몇 실시태양에서, HA2는 줄기 도메인 및 관강 도메인으로 이루어지며; 상기와 같은 실시태양에서, 상기 HA2는 가용성일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, HA2는 줄기 도메인으로 이루어지며; 상기와 같은 실시태양에서, 상기 HA2는 가용성일 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 폴리펩타이드, 핵산 또는 바이러스와 관련하여 "이종"이란 용어는 각각 자연에서 통상적으로 발견되지 않거나 관심 폴리펩타이드, 핵산 또는 바이러스와 사실상 통상적으로 관련되지 않은 폴리펩타이드, 핵산 또는 바이러스를 지칭한다. 예를 들어, "이종 폴리펩타이드"는 상이한 바이러스, 예를 들어 상이한 인플루엔자 균주 또는 하위유형, 또는 관련되지 않은 바이러스 또는 상이한 종으로부터 유래되는 폴리펩타이드를 지칭할 수도 있다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인과 관련하여 사용될 때, 상기 이종이란 용어는 통상적으로 관련되지 않은 것으로 밝혀진 인플루엔자 HA 줄기 도메인과 관련있는 인플루엔자 HA 구상 헤드 도메인을 지칭한다(예를 들어, 상기 HA의 헤드 및 줄기 도메인은 실제로 함께 발견되지 않을 것이다).
본 발명에 사용되는 바와 같이, 대상에 대한 2개 이상의 치료법의 투여와 관련하여 "함께"란 용어는 하나보다 많은 치료법(예를 들어, 하나보다 많은 예방제 및/또는 치료제)의 사용을 지칭한다. "함께"란 용어의 사용이 대상에게 투여되는 치료법들의 순서를 제한하는 것은 아니다. 예를 들어, 제 1 치료법(예를 들어, 제 1 예방제 또는 치료제)을 대상에게 제 2 치료법의 투여 전에(예를 들어, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 16 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 5 주일, 6 주일, 8 주일, 또는 12 주일 전에), 상기 투여와 동시에, 또는 상기 투여에 이어서(예를 들어, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 16 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주일, 2 주일, 3 주일, 4 주일, 5 주일, 6 주일, 8 주일, 또는 12 주일 후에) 투여할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "감염"이란 용어는 세포 또는 대상에서 바이러스에 의한 침입, 바이러스의 증식, 및/또는 바이러스의 존재를 의미한다. 하나의 실시태양에서, 감염은 "활성" 감염, 즉 상기 바이러스가 세포 또는 대상에서 복제되고 있는 감염이다. 상기와 같은 감염은 상기 바이러스에 의해 처음 감염된 세포, 조직 및/또는 기관으로부터 상기 바이러스의 다른 세포, 조직 및/또는 기관으로의 확산을 특징으로 한다. 감염은 또한 잠복 감염, 즉 상기 바이러스가 복제되고 있지 않는 감염일 수도 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인플루엔자 바이러스 질병"이란 용어는 세포 또는 대상 중의 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 A형 또는 B형 바이러스)의 존재 또는 인플루엔자 바이러스에 의한 세포 또는 대상의 침입으로부터 발생하는 병적인 상태를 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 상기 용어는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기된 호흡기 질병을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "IFN 결함 시스템" 또는 "IFN-결함 기질"이란 어구는 IFN을 생산하지 못하거나 낮은 수준의 IFN을 생산하고(즉, 동일한 조건하에서 IFN-적격 시스템에 비해 5 내지 10%, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 30 내지 40%, 40 내지 50%, 50 내지 60%, 60 내지 70%, 70 내지 80%, 80 내지 90% 또는 그 이상의 IFN 발현의 감소), IFN에 반응하지 않거나 덜 효율적으로 반응하고/하거나, IFN에 의해 유도된 하나 이상의 항바이러스 유전자의 활성이 불완전한 시스템, 예를 들어 세포, 세포주 및 동물, 예를 들어 돼지, 마우스, 닭, 칠면조, 토끼, 래트 등을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인플루엔자-유사 바이러스"와 관련하여 사용될 때, "유사"란 용어는 언급된 인플루엔자 바이러스의 상이한 단리물을 나타내는 인플루엔자 바이러스를 지칭하며, 여기에서 상기 상이한 단리물의 아미노산 서열, 또는 상기 상이한 단리물의 HA의 아미노산 서열은 상기 언급된 인플루엔자 바이러스의 아미노산 서열 또는 상기 언급된 인플루엔자 바이러스의 HA의 아미노산 서열에 일치하거나 거의 일치하고; 및/또는 상기 상이한 단리물에 대한 면역 반응은 상기 언급된 인플루엔자 바이러스에 대해 충분한 보호를 부여하고, 이와 역으로도 마찬가지이다. 몇몇 실시태양에서, 언급된 인플루엔자 바이러스의 아미노산 서열에 거의 일치하는 아미노산 서열을 갖는 인플루엔자 바이러스 단리물은 상기 언급된 인플루엔자 바이러스의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 일치하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 실시태양에서, "인플루엔자-유사 바이러스"를 나타내는 인플루엔자 바이러스 단리물은 언급된 인플루엔자 바이러스의 HA의 아미노산 서열에 거의 일치하는 아미노산 서열을 갖는 HA를 포함한다, 예를 들어 상기 인플루엔자-유사 바이러스의 HA는 상기 언급된 인플루엔자 바이러스의 HA의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 일치하는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 숫자 용어 "로그"는 log10을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 인플루엔자 바이러스의 균주 또는 하위유형(예를 들어, H1 하위유형)과 관련하여 "집단의 대다수가 미경험인"이란 어구는 인간 집단의 50% 초과가 추정상 노출된 적이 없는 인플루엔자 바이러스의 균주 또는 하위유형을 지칭한다. 특정한 실시태양에서, "집단의 대다수가 미경험인"이란 어구는 상기 인간 집단의 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%가 추정상 노출된 적이 없는 인플루엔자 바이러스의 균주 또는 하위유형을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "감염 다중도" 또는 "MOI"란 어구는 감염된 세포당 감염성 바이러스 입자의 평균수이다. 상기 MOI는 첨가된 감염성 바이러스 입자의 수(첨가된 ㎖ x PFU/㎖)를 첨가된 세포의 수(첨가된 ㎖ x 세포/㎖)로 나누어 측정한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "핵산"이란 용어는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자(예를 들어, mRNA) 및 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성시킨 상기 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함함을 의미한다. 상기 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "폴리펩타이드"란 용어는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같이 아미드 결합에 의해 결합된 아미노산들의 중합체를 지칭한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, 폴리펩타이드란 용어는 공유 아미드 결합에 의해 결합된 단일 폴리펩타이드 쇄를 지칭할 수 있다. 상기 용어는 또한 비-공유 상호작용, 예를 들어 이온 접촉, 수소 결합, 반데르 발스 접촉 및 소수성 접촉에 의해 회합되는 다수의 폴리펩타이드 쇄를 지칭할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 용어가, 예를 들어 번역-후 가공, 예를 들어 신호 펩타이드 절단, 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화(예를 들어, N-결합된 글리코실화), 프로테아제 절단 및 지질 변형(예를 들어, S-팔미토일화)에 의해 변형된 폴리펩타이드를 포함함을 알 것이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 질병의 예방을 위한 대상에의 치료법(들)의 투여와 관련하여 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"이란 용어들은 치료법 또는 치료법들의 조합의 투여로부터 생성되는 예방학적/이로운 효과들 중 하나 이상을 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스 질병의 예방을 위한 대상에의 치료법(들)의 투여와 관련하여 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"이란 용어는 치료법 또는 치료법들의 조합의 투여로부터 생성되는 하기의 효과들 중 하나 이상을 지칭한다: (i) 인플루엔자 바이러스 질병 또는 그의 증상의 발생 또는 개시의 억제; (ii) 인플루엔자 바이러스 질병 또는 그와 관련된 증상의 재발의 억제; 및 (iii) 인플루엔자 바이러스 감염 및/또는 복제의 감소 또는 억제.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 천연 출처, 예를 들어 세포로부터 수득되는 폴리펩타이드(항체 포함)와 관련하여 사용되는 경우 "정제된" 및 "단리된"이란 용어들은 천연 출처, 예를 들어 토양 입자, 환경으로부터의 무기물, 화학물질, 및/또는 천연 출처로부터의 세포 물질, 예를 들어 비제한적으로 세포 찌꺼기, 세포벽 물질, 세포막, 세포소기관, 대부분의 핵산, 세포 중에 존재하는 탄수화물, 단백질, 및/또는 지질로부터의 오염 물질이 실질적으로 없는 폴리펩타이드를 지칭한다. 따라서, 단리되는 폴리펩타이드는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2% 또는 1%(건조 중량 기준) 미만의 세포 물질 및/또는 오염 물질을 갖는 폴리펩타이드의 제제를 포함한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, 화학적으로 합성되는 폴리펩타이드(항체 포함)와 관련하여 사용되는 경우 "정제된" 및 "단리된"이란 용어는 상기 폴리펩타이드의 합성에 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질들이 실질적으로 없는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 화학적으로 합성된다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드, 인플루엔자 헤마글루티닌 헤드 도메인 폴리펩타이드, 및/또는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드가 단리된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 바이러스와 관련하여 "복제", "바이러스성 복제" 및 "바이러스 복제"란 용어들은 바이러스의 번식을 생성시키는 바이러스 생활사의 단계들 중 하나 이상, 또는 전부를 지칭한다. 바이러스 생활사의 단계는 비제한적으로 숙주 세포 표면에의 바이러스 부착, 상기 숙주 세포의 침투 또는 침입(예를 들어, 수용체 매개된 세포이물흡수 또는 막 융합을 통해), 탈외피(바이러스 캡시드를 바이러스 효소 또는 숙주 효소에 의해 제거하고 분해시켜 상기 바이러스 게놈 핵산을 방출시키는 과정), 게놈 복제, 바이러스 전령 RNA(mRNA)의 합성, 바이러스 단백질 합성, 및 게놈 복제의 바이러스 리보뉴클레오단백질 복합체의 조립, 바이러스 입자의 조립, 바이러스 단백질의 번역-후 변형, 및 세포용해 또는 발아에 의한 상기 숙주 세포로부터의 방출 및 매몰된 바이러스 당단백질을 함유하는 인지질 외피의 획득을 포함한다. 일부 실시태양에서, "복제", "바이러스성 복제" 및 "바이러스 복제"란 용어들은 상기 바이러스 게놈의 복제를 지칭한다. 다른 실시태양에서, "복제", "바이러스성 복제" 및 "바이러스 복제"란 용어들은 바이러스 단백질의 합성을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "줄기 도메인 폴리펩타이드", "HA 줄기 도메인", "인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드" 및 "HA 줄기 도메인"이란 용어들은 인플루엔자 헤마글루티닌의 줄기 도메인을 구성하는 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하거나 이들 쇄로 이루어지는 폴리펩타이드를 지칭한다. 줄기 도메인 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 쇄, 2개의 폴리펩타이드 쇄 또는 더 많은 폴리펩타이드 쇄일 수 있다. 전형적으로, 줄기 도메인 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 쇄(즉, 헤마글루티닌 HA0 폴리펩타이드의 줄기 도메인에 상응하는) 또는 2개의 폴리펩타이드 쇄(즉, 헤마글루티닌 HA2 폴리펩타이드와 함께 헤마글루티닌 HA1 폴리펩타이드의 줄기 도메인에 상응하는)이다. 특정한 실시태양에서, 줄기 도메인 폴리펩타이드는 인플루엔자 A형 H1 또는 H3 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 또는 인플루엔자 B형 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌으로부터 유래된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 헤드 도메인 폴리펩타이드", "인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 헤드 도메인", "HA 구상 헤드 도메인", 및 "HA 헤드 도메인"이란 용어들은 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 인플루엔자 A형 바이러스의 경우, 상기 구상 헤드 도메인은 일반적으로 상기 HA 분자의 HA1 부분 중의 2개의 핵심 시스테인 잔기들 사이에 존재하는 것으로 이해된다. 이들 시스테인 잔기를 다양한 인플루엔자 A형 바이러스에 대해서 도 1에 "Ap" 및 "Aq"로서 나타낸다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "대상" 또는 "환자"란 용어들은 동물(예를 들어, 조류, 파충류, 및 포유동물)을 지칭하는데 호환적으로 사용된다. 특정한 실시태양에서, 대상은 조류이다. 또 다른 실시태양에서, 대상은 비-영장류(예를 들어, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 챔팬지 및 인간)를 포함한 포유동물이다. 몇몇 실시태양에서, 대상은 비-인간 동물이다. 일부 실시태양에서, 대상은 농장 동물 또는 애완동물이다. 또 다른 실시태양에서, 대상은 인간이다. 또 다른 실시태양에서, 대상은 인간 유아이다. 또 다른 실시태양에서, 대상은 인간 아동이다. 또 다른 실시태양에서, 대상은 인간 성인이다. 또 다른 실시태양에서, 대상은 노령의 인간이다. 또 다른 실시태양에서, 대상은 인간 미숙아이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인간 미숙아"란 용어는 37주 미만의 임신 주수로 태어난 인간 유아를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인간 유아"란 용어는 신생아 내지 1세의 인간을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인간 아동"이란 용어는 1세 내지 18세의 인간을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인간 성인"이란 용어는 18세 이상의 인간을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "노령의 인간"이란 용어는 65세 이상의 인간을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "계절성 인플루엔자 바이러스 균주"란 용어는 대상 집단이 계절을 기준으로 노출되는 인플루엔자 바이러스의 균주를 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 계절성 인플루엔자 바이러스 균주란 용어는 인플루엔자 A형 바이러스의 균주를 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 계절성 인플루엔자 바이러스 균주란 용어는 H1 또는 H3 하위유형, 즉 현재 인간 대상 집단에서 지속되는 2개의 하위유형에 속하는 인플루엔자 바이러스의 균주를 지칭한다. 다른 실시태양에서, 계절성 인플루엔자 바이러스 균주란 용어는 인플루엔자 B형 바이러스의 균주를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "치료법"이란 용어는 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병 또는 증상의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 임의의 프로토콜(들), 방법(들), 화합물(들), 조성물(들), 제형(들) 및/또는 작용제(들)를 지칭할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, "치료법"이란 용어는 생물학적 치료법, 지지 치료법, 및/또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병 또는 증상의 치료 또는 예방에 유용한 다른 치료법들을 지칭한다. 일부 실시태양에서, "치료법"이란 용어는 (i) 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, (ii) 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 또는 (iii) 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하거나 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 벡터 또는 조성물을 지칭한다. 일부 실시태양에서, "치료법"이란 용어는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "치료하다", "치료" 및 "치료하는"이란 용어들은 대상에의 치료법(들)의 투여와 관련하여 치료법 또는 치료법들의 조합의 이로운 또는 치료학적 효과를 획득하기 위해 인플루엔자 바이러스 질병 또는 감염을 치료함을 지칭한다. 특정한 실시태양에서, 상기와 같은 용어는 치료법 또는 치료법들의 조합의 투여로부터 생성되는 하기의 효과들 중 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상을 지칭한다: (i) 인플루엔자 바이러스 감염, 또는 이와 관련된 질병 또는 증상의 중증도의 감소 또는 개선; (ii) 인플루엔자 바이러스 감염, 또는 이와 관련된 질병 또는 증상의 지속기간의 감소; (iii) 인플루엔자 바이러스 감염, 또는 이와 관련된 질병 또는 증상의 역행; (iv) 인플루엔자 바이러스 역가의 감소; (v) 인플루엔자 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병과 관련된 기관 기능부전의 감소; (vi) 대상의 입원의 감소; (vii) 입원 기간의 감소; (viii) 대상의 생존의 증가; (ix) 인플루엔자 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병 또는 증상의 제거; (x) 인플루엔자 바이러스 감염, 또는 이와 관련된 질병 또는 증상의 진행의 억제; (xi) 세포, 조직, 기관 또는 대상로부터 또 다른 세포, 조직, 기관 또는 대상로의 인플루엔자 바이러스의 확산의 예방; (xii) 인플루엔자 바이러스의 숙주 세포(들)내로의 침입의 억제 또는 감소; (xiii) 인플루엔자 바이러스 게놈의 복제의 억제 또는 감소; (xiv) 인플루엔자 바이러스 단백질의 합성의 억제 또는 감소; (xv) 숙주 세포(들)로부터 인플루엔자 바이러스 입자의 방출의 억제 또는 감소; 및/또는 (xvi) 또 다른 치료법의 치료 효과의 증대 또는 개선.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 일부 실시태양에서, 바이러스와 관련하여 "야생형"이란 어구는 자연적으로 우세하고, 순환하며 질병의 전형적인 창궐을 발생시키는 바이러스의 유형들을 지칭한다. 다른 실시태양에서, 바이러스와 관련하여 "야생형"이란 용어는 모 바이러스를 지칭한다.
도 1은 인플루엔자 바이러스 A형 헤마글루티닌의 17개 하위유형의 전형적인 서열들(각각 서열번호 1 내지 16 및 35)의 CLUSTALW에 의한 서열 정렬을 나타낸다. Ap 표시된 잔기는, HA1 C-말단 줄기 분절 중의 시스테인 잔기인 Aq 표시된 잔기와 다이설파이드 결합을 형성하거나 형성할 수 있는 HA1 N-말단 줄기 분절 중의 시스테인 잔기이다. Bq 표시된 잔기는 본 발명에 개시된 HA1 C-말단 짧은 줄기 분절의 대략적인 N-말단 아미노산을 나타낸다. Cq 표시된 잔기는 본 발명에 개시된 HA1 C-말단 긴 줄기 분절의 대략적인 N-말단 아미노산을 나타낸다. Cp 표시된 잔기는 본 발명에 개시된 HA1 N-말단 긴 줄기 분절의 대략적인 C-말단 아미노산을 나타낸다.
도 2는 별개의 하위유형 HA로부터의 보존된 H1 줄기 도메인 및 상이한 구상 헤드 도메인을 갖는 키메릭 HA들의 도해를 제공한다.
도 3은 항체 및 반응성 혈청을 유도하고 분석하기 위한 신규의 인플루엔자 백신 및 진단 도구 플랫폼을 제공한다. A) 키메릭 HA의 발현. A/PR/8/34 HA의 줄기 도메인 및 A/캘리포니아/4/09(키메릭 HA)뿐만 아니라 야생형 HA(PR8-HA 및 CAL09-HA)로 이루어지는 키메릭 HA 및 GFP 대조군을 239T 세포에서 발현시켰다. 상부 웨스턴 블럿은 PR8-특이성 항체(PY102)로 탐침조사된 반면 하부의 블럿은 Cal09에 특이적인 항체(39C2)로 탐침조사되었다. B) A에서 발현된 HA 구조물들의 도식적인 도면. 키메릭 HA는 A/PR/8/34 HA 줄기 도메인 및 2009 A/캘리포니아/04/09 구상 헤드 도메인으로 구성된다.
도 4는 키메릭 HA의 도해를 제공한다. A) 키메릭 HA의 기본 구조. 구상 헤드를 편의상 다이설파이드 결합 Cys 52-Cys 277에서 교환할 수 있다. B) 완전하게 보존된 줄기 도메인 및 다양한 구상 헤드 도메인으로 이루어지는 키메릭 HA의 연속 투여에 따른 초회항원자극-추가접종 섭생.
도 5는 H1 HA의 줄기 및 H3 HA의 구상 헤드를 갖는 키메릭 HA의 생성을 개시한다. A/PR/8/34 HA의 줄기 도메인 및 HK/68의 구상 헤드 도메인(키메릭 H3)으로 이루어지는 키메릭 HA뿐만 아니라 야생형 HA(PR8-HA 및 HK68 HA)를 239T 세포에서 발현시켰다. 상부 웨스턴 블럿은 PR8-특이성 항체로 탐침조사된 반면 하부의 블럿은 H3에 특이적인 항체로 탐침조사되었다.
도 6은 A/홍콩/1/1968(H3), A/퍼쓰/16/2009(H3), A/PR/8/34(H1), A/Cal/4/09(H1), A/베트남/1203/04(H5) 및 A/청둥오리/알버타/24/01(H7)의 헤마글루티닌 단백질 서열의 서열 비교를 도시한다. Cys52 및 Cys277 아미노산 잔기를 명시한다(H3 넘버링에 의거). 검은색 음영은 보존된 아미노산을 가리킨다. 검은색 물결선은 HA의 구상 헤드 영역을 가리킨다. HA1 및 HA2의 출발점들을 나타낸다. A/홍콩/1/1968(H3), A/퍼쓰/16/2009(H3), A/PR/8/34(H1), A/Cal/4/09(H1), A/베트남/1203/04(H5) 및 A/청둥오리/알버타/24/01(H7) 각각의 HA의 N-말단에서부터 Cys52까지의 아미노산 서열들을 나타내며, 이들 서열은 각각 서열번호 23 내지 28에 상응한다. A/홍콩/1/1968(H3), A/퍼쓰/16/2009(H3), A/PR/8/34(H1), A/Cal/4/09(H1), A/베트남/1203/04(H5) 및 A/청둥오리/알버타/24/01(H7) 각각의 HA의 Cys277에서부터 C-말단까지의 아미노산 서열을 나타내며, 이들 서열은 각각 서열번호 29 내지 34에 상응한다.
도 7은 키메릭 헤마글루티닌의 도해를 묘사한다. (A) 키메릭 PR8-cH1 HA의 구성 다이어그램. 키메릭 HA를, A/PR/8/34(H1) HA의 Cys52와 Cys277 사이에 배치된 구상 헤드 도메인을 A/캘리포니아/4/09(H1) HA의 도메인과 교환하여 구성하였다. 생성되는 키메릭 HA는 PR8-cH1으로 표시된 A/캘리포니아/4/09(H1) HA의 구상 헤드 도메인을 갖는 A/PR/8/34(H1) HA의 줄기 영역을 갖는다. (B) 상이한 야생형 및 키메릭 HA, 예를 들어 야생형 PR8 HA, 키메릭 PR8-cH1 HA, 키메릭 PR8-cH5 HA, 야생형 퍼쓰 HA 및 키메릭 퍼쓰-cH7 HA(좌측에서 우측으로)의 폴딩된 구조의 도해. 완전-길이 HA 구조는 단백질 데이터베이스(PDB): PR8 HA(PDB ID 1RU7) 및 퍼쓰 HA(HK68 HA, PDB ID 1MQN에 의해 나타냄)로부터 다운로드하였다. 최종 상들은 PyMol(델라노 사이언티픽(Delano Scientific))에 의해 생성되었다.
도 8은 키메릭 HA 구조물의 표면 발현 및 기능 분석을 묘사한다. (a) 키메릭 HA 구조물의 표면 발현을 일시적으로 형질감염시킨 세포에서 평가하였다. 형질감염-후 24시간째에, 239T 세포를 트립신처리하고 키메릭 HA 단백질의 세포 표면 발현을 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 상부 패널에서, 모의-형질감염된 세포(좌측 음영 영역)를 PR8 HA(우측)로 형질감염된 세포 또는 PR8-cH1(우측) 또는 PR8-cH5(우측)로 형질감염된 세포와 비교한다. 하부 패널에서, 모의 형질감염된 세포(좌측 음영 영역)를 퍼쓰 및 퍼쓰-cH7 구조물(우측)로 형질감염된 세포와 비교한다. (b) 키메릭 HA를 발현하는 루시페라제-암호화 슈도-입자를 사용하여 MDCK 세포를 감염시켰다. 상기 루시페라제 분석에서 생성된 상대 광 단위(RLU)는 키메릭 HA를 발현하는 슈도-입자가 상기 세포내로 들어갈 수 있었음을 가리킨다.
도 9는 키메릭 헤마글루티닌을 갖는 재조합 바이러스의 생성을 개시한다. (a) 재조합 바이러스의 웨스턴 블럿 분석. 모의 감염되거나 지시된 바이러스로 2의 MOI에서 감염된(16 hpi) MDCK 세포로부터의 추출물을 제조하고 하기 항체들로 탐침조사하였다: 항-A/PR8/HA(H1) (PY102), 항-A/Cal/09/HA(H1) (29C1), 항-A/VN/HA(H5) (M08), 항-H3/HA (12D1), 항-H7 (NR-3125), 항-A/NP (HT103) 및 내부 부하 대조군으로서 항-GAPDH. (b) 하기 항체를 사용하는 재조합 바이러스로 감염된 MDCK 세포의 면역형광 분석: 항-A/NP (HT103), 항-A/H1 HA (6F12), 항-A/PR8/HA (PY102), 항-A/Cal/09/HA (29C1), 항-A/VN/HA (M08), 항-H3/HA (12D1), 및 항-A/H7 바이러스(NR-3152)
도 10은 재조합 바이러스의 증식 동역학 및 플라크 표현형을 개시한다. (A) 10일 된 발육계란을 계란당 100 pfu로 야생형 또는 재조합 바이러스로 감염시키고 바이러스 증식을 감염후 72시간 동안 모니터하였다. (B) 상기 재조합 바이러스의 플라크 표현형을 플라크 분석에 의해 평가하였다. MDCK 세포를 야생형 또는 재조합 바이러스로 감염시키고 감염후 48시간 째에 면역염색하여 A/NP(HT103)에 대한 항체를 사용하여 플라크 표현형을 밝혀내었다.
도 11은 키메릭 H6 헤마글루티닌으로 형질감염된 세포의 면역형광 분석을 묘사한다. 239T 세포를, 키메릭 H6 헤마글루티닌을 발현하는 1 ㎍의 pCAGGS 플라스미드로 형질감염시켰다. DNA(A), Cal/09 감염(B), DNA 및 Cal/09 감염(C), 또는 Cal/09 분할 백신(D)을 받은 동물로부터의 혈청을 형질감염된 세포에 가하고 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594-접합된 항-마우스 IgG와 함께 배양한 다음 형광 현미경검사에 의해 가시화하였다.
도 12는 DNA 초회항원자극 및 키메릭 바이러스 추가접종이 치사 인플루엔자 바이러스로 공격받은 동물에 대해 보호를 부여함을 입증한다. 동물을 DNA 단독, 키메릭 H9 바이러스 단독, DNA 초화항원자극 및 키메릭 H9 바이러스 추가접종, 또는 불활성화된 PR8 바이러스로 처리하였다. 이어서 마우스를 5 x 104 PFU의 PR8 바이러스로 비내 주입하여 공격하고, 상기 동물의 체중을 14일 동안 모니터하였다.
도 13은 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 cH6 단백질에 대한 줄기 특이성 항체의 반응성을 입증한다.
도 14는 키메릭 HA(cHA) 단백질(A) 및 MDCK 세포에서 cHA 발현(B)의 도식적인 표현을 묘사한다. 키메릭 HA(cHA) 단백질 및 재조합 키메릭 바이러스. (A) cHA의 도식적 표현. 구상 헤드 도메인은 잔기 C52와 C277(H3 넘버링) 사이의 아미노산 서열로서 정의된다. 헤드와 줄기 사이의 경계로서 상기 다이설파이드 결합을 사용하여, 외래 HA 헤드를 이종 줄기의 정상에 도입시켰다. 상기 줄기 도메인은 HA1 및 HA2 서브유닛의 나머지 부분으로서 정의된다. CT, 세포질 꼬리; SP, 신호 펩타이드; TM, 막관통 도메인. 완전-길이 HA 구조는 (PDB): PR8 (H1) HA (PDB ID 1RU7) 및 A/호로새/홍콩/WF10/99 HA [A/돼지/홍콩/9/98 (H9; PDB ID 1JSD)로 나타냄]로부터 다운로드하였다. 최종 상은 PyMol(델라노 사이언티픽)로 생성시켰다. H6 HA의 구조는 공개되지 않았기 때문에, 상기 PR8 HA의 헤드-폴딩의 상을 상기 cH6/1 구조물에 대해 사용한다. (B) cHA의 발현을 확인하기 위한 면역형광. MDCK 세포를 WT PR8 또는 cH9/1 N3 바이러스로 감염시키거나, 모의-감염시켰다. 상기 PR8 바이러스의 헤드 및 줄기에 특이적인 항체뿐만 아니라 H9 반응성을 갖는 항체를 사용하여 cHA 발현을 확인하였다(배율 막대: 40x).
도 15는 대유행 H1N1 바이러스로 감염된 성인 환자들이 HA 줄기와 반응성인 높은 역가의 중화 항체를 가짐을 보인다. pH1N1-감염된 성인(n=9), pH1N1으로 감염되지 않은 아동(n=5), 및 pH1N1 바이러스로 감염되지 않은 성인(n=11)의 혈청과 cH6/1 단백질(a), cH9/1 단백질; (b), HA2 단백질의 LAH(항-LAH 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다; (c), H5 HA 단백질(H5 HA에 대해 발생한 마우스 다클론 혈청을 양성 대조군으로서 사용하였으며 범-H3 항체, 12D1을 음성 대조군으로서 사용하였다; (d) (13), 또는 H3 HA 단백질(12D1을 양성 대조군으로서 사용하였고 H5 HA에 대해 발생한 마우스 다클론 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다; (e)와의 반응성. 모두 ELISA에 의해 평가하였으며; 데이터 점들은 SE 또는 모은 샘플의 반응성과 함께 평균 역가를 나타낸다.
도 16은 대유행 H1N1 바이러스로 감염된 성인 환자들이 HA 줄기에 특이성인 높은 역가의 중화 항체(A 및 B)를 가짐을 나타낸다. pH1N1-감염된(n=14) 및 pH1N1으로 감염되지 않은 성인(n=5)으로부터의 혈청을 별도로 모으고, 상기 두 풀로부터의 전체 IgG를 정제하였다. 줄기 항체의 중화 능력을 cH9/1 N3 바이러스를 사용하여 플라크 감소 분석에 의해 평가하였다. 데이터 점들은 2개 실험의 평균 및 SE를 나타낸다. 플라크를 항-H9 항체 G1-26으로 면역염색하였다. (B)는 상부를 따라 나타낸 4개의 혈청 희석물의 플라크 감소를 나타낸다. (C) 슈도유형 입자 중화 분석은 인간-정제된 IgG 제제(pH1N1-감염된 성인 및 pH1N1으로 감염되지 않은 성인으로부터의 혈청)의 중화 항체 활성을 측정한다. 전체 IgG 농도는 50, 10 및 2 ㎍/㎖이었다. 양성 대조군으로서, 줄기-특이성 단클론 항체 6F12가 사용되었다.
도 17은 cH6/1 및 cH9/1 단백질의 발현 및 기능을 나타낸다. A) 2 ㎍ cH6/1 및 cH9/1 단백질의 쿠마씨 젤. M, 마커 단백질. (B) 바큘로바이러스 발현된 cHA 단백질의 웨스턴 블럿 분석. 레인 1, cH6/1 단백질; 레인 2, cH9/1 단백질; 레인 3, WT PR8 HA; 레인 4, WT H3 HA. 블럿을 PR8 바이러스(토끼 다클론 항-HA2) 또는 H3 바이러스(마우스 mAb 12D1)의 줄기 및 H6(염소 다클론 항-H6) 또는 H9 바이러스(마우스 mAb G1-26)의 구상 헤드와 반응하는 것으로 공지된 항체로 탐침조사하여 바큘로바이러스 발현된 cHA의 정체를 확인하였다. mAb 12D1은 HA0 및 HA2 모두와 반응한다(H3 단백질 제제는 절단되어, 2개의 별개의 밴드를 생성시킨다). (C) cH9/1 N3 재조합 바이러스의 플라크 분석. 재조합 cH9/1 N3 바이러스 플라크 표현형은 WT PR8 바이러스에 의해 만들어진 플라크와 유사하다. 플라크들을 PY102 및 항-H9 항체 G1-26으로 면역염색하였다.
도 18은 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기에 대한 단클론 항체가 cHA와 결합하고 이를 중화함을 나타낸다. (A) 줄기 항체 C179를 사용하여 ELISA에 의해 cH6/1 바큘로바이러스-발현된 단백질에 대한 반응성을 시험하였다. C179는 cH9/1과 용량-의존적인 방식으로 반응하였다. (B) 줄기 항체 C179를 사용하여 ELISA에 의해 cH9/1 바큘로바이러스-발현된 단백질에 대한 반응성을 시험하였다. C179는 cH9/1과 용량-의존적인 방식으로 반응하였다(C 및 D). 항체 6F12는 cH9/1 N3 바이러스 복제를 중화한다. 6F12를 사용하여 플라크 감소 분석에 의해 cH9/1 N3 바이러스를 중화하는 줄기-특이성 단클론 항체의 능력을 평가하였다. D는 mAb 6F12의 5개 희석물(100, 20, 4, 0.8 및 0.16 ㎍/㎖)을 사용하여 cH9/1 N3 바이러스의 플라크 감소를 나타낸다. 플라크들을 항-H9 항체 G1-26으로 면역염색하였다.
도 19는 키메릭 헤마글루티닌의 도해를 묘사한다. 도 19A는 야생형 및 cH1/1 바이러스의 도해를 도시한다. 상기 키메릭 HA를, PR8(H1) HA의 Cys52와 Cys277 사이에 배치된 구상 헤드 도메인을 A/캘리포니아/4/09(H1) HA의 도메인과 교환하여 구성하였다. 생성되는 키메릭 HA는 A/캘리포니아/4/09(H1) HA의 구상 헤드 도메인을 갖는 A/PR/8/34(H1) HA의 줄기 영역을 가지며 cH1/1으로서 표시된다. 도 19B는 상이한 야생형 및 키메릭 HA들의 폴딩된 구조의 이론적인 도해를 도시한다. 좌측에서 우측으로: 야생형 PR8 HA, 키메릭 cH1/1 HA, 키메릭 cH5/1 HA, 야생형 퍼쓰 HA, 키메릭 cH7/3 HA, 및 키메릭 cH5/3 HA.
도 20은 본 연구에 사용된 H1, H3, H5 및 H7 HA간의 아미노산 일치성을 비교하는 표를 묘사한다. 아미노산 일치성 퍼센트를 ClustalW(신호 펩타이드 제외)를 사용하여 계산하였다. 아미노산 일치성 퍼센트를 전장 HA뿐만 아니라 구상 헤드 및 줄기 도메인에 대해서 비교한다. 회색 막대는 100% 일치성을 가리킨다.
도 21은 키메릭 HA 구조물의 표면 발현을 도시한다. 키메릭 HA 구조물의 표면 발현을 일시적으로 형질감염되거나 감염된 세포에서 평가하였다. 형질감염-후 48시간째에, 293T 세포를 트립신처리하고 키메릭 HA 단백질의 세포 표면 발현을 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 상부 패널에서, 모의-형질감염된 세포(회색)를 PR8 HA(검은선)로 형질감염된 세포 또는 cH1/1(검은선) 또는 cH5/1(검은선)로 형질감염된 세포와 비교한다. 가운데 패널에서, 모의-형질감염된 세포(회색)를 퍼쓰/09, cH7/3(검은선) 및 cH5/3 구조물(검은선)로 형질감염된 세포와 비교한다. 기부 패널에서, MDCK 세포를 퍼쓰/09, cH7/3 및 cH5/3 발현 재조합 바이러스로 감염시켰다. 감염-후 12시간째에 상이한 HA의 세포 표면 발현을 유식 세포측정을 사용하여 분석하였다.
도 22는 MDCK 세포에 침입하는 키메릭 HA의 능력을 설명한다. 키메릭 HA를 발현하는 루시페라제-암호화 슈도입자를 사용하여 MDCK 세포를 형질도입시켰다. 상기 루시페라제 분석에서 발생한 상대 광 단위(RLU)는 키메릭 HA를 발현하는 슈도입자가 세포를 침입할 수 있음을 가리킨다.
도 23은 재조합 cHA-발현 바이러스로 감염된 세포의 웨스턴 블럿 분석을 도시한다. 모의 감염되거나 지시된 바이러스로 2의 MOI로 감염된 MDCK 세포로부터의 추출물을 제조하고 하기 항체들로 16 hpi에서 탐침조사하였다: 항-A/PR8/HA (H1) (PY102), 항-A/Cal/09/HA (H1) (29E3), 항-A/VN/HA (H5) (mAb #8), 항-H3/HA (12D1), 항-H7 (NR-3152), 항-A/NP (HT103) 및 부하 대조군으로서 항-GAPDH.
도 24는 하기 항체를 사용하는 재조합 바이러스로 감염된 MDCK 세포의 면역형광 분석을 묘사한다: 항-A/NP (HT103), 항-A/H1 HA (6F12), 항-A/PR8/HA (PY102), 항-A/Cal/09/HA (29C1), 항-A/VN/HA (M08), 항-H3/HA (12D1), 및 항-A/H7 바이러스(NR-3152).
도 25는 야생형 및 재조합 바이러스의 증식 동역학 및 플라크 표현형을 묘사한다. (A) 10일 된 발육계란을 계란당 100 pfu로 야생형 또는 재조합 바이러스로 감염시키고 바이러스 증식을 감염후 72시간 동안 모니터하였다. 데이터 점들은 실험 반복물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. (B) 상기 재조합 바이러스의 플라크 표현형을 플라크 분석에 의해 평가하였다. MDCK 세포를 야생형 또는 재조합 바이러스로 감염시켰다. 세포를 감염후 48시간째에 고정시키고 A/NP(HT103)에 대한 항체를 사용하여 면역염색하여 플라크 표현형을 밝혀내었다.
도 26은 줄기-특이성 단클론 항체가 cHA-발현 바이러스 및 슈도유형 입자를 중화시킴을 묘사한다. cHA-발현 바이러스 또는 슈도유형 입자를 중화시키는 mAb(KB2)의 능력을 플라크 감소 분석 또는 슈도유형 입자 억제 분석에 의해 평가하였다. MDCK 세포를 지시된 양(ug/㎖)의 mAb의 존재하에서 또는 항체 없이 cHA-발현 바이러스 또는 슈도유형 입자로 감염시키거나 형질도입시켰다. 플라크 형성 또는 루시페라제 활성을 판독정보로서 사용하여 상기 mAb에 의한 억제 정도를 측정하였다. 상기 mAb는 100 ug/㎖ 이상의 농도에서 100% 억제와 함께, cH1/1(검은색 네모) 및 cH5/1(검은색 삼각형) 바이러스 복제를 용량 의존적인 방식으로 중화시킨다. 데이터 점들은 실험 반복물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. (B) 상기 mAb는 또한 4 ug/㎖ 이상에서 완전한 억제와 함께, cH1/1(검은색 네모) 및 cH5/1(검은색 삼각형) 슈도유형 입자의 침입을 용량 의존적인 방식으로 억제한다. 데이터 점들은 실험 반복물의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 상기 슈도유형 억제 분석을 독립적으로 처리하였다.
도 27은 cHA 구조물에 의한 연속적인 백신접종이 HA 줄기-특이성 항체를 이끌어내고 치사적인 공격으로부터 보호를 제공함을 설명한다. 마우스를 항원보강제와 함께 비내 및 복강내 투여된, 20 ㎍의 cH9/1 단백질로 초회항원자극하였다. 3주 후에, 마우스를 항원보강제와 함께 비내 및 복강내 투여된, 20 ㎍의 cH6/1 단백질로 추가접종하였다. 대조군으로서, 마우스를 BSA를 사용하여 유사한 방식으로 초회항원자극 및 추가접종하거나, 불활성화된 FM1 바이러스를 근육내 제공하였다. 동물을 채혈하고 5LD50의 A/포트 먼머드/1/1947(FM1) 바이러스로 최종 백신접종 후 3주째에 공격하였다. (a) ELISA 플레이트를 백신 접종(BSA + BSA는 그래프의 맨 아랫선이다)을 통해 이끌어낸 줄기 반응성 정도를 평가하기 위해서 cH5/1 N1 바이러스로 코팅하였다. (b) 마우스를 공격으로부터의 보호를 평가하기 위해서 14일 동안 매일 칭량하였다. (c) 공격후 생존율을 묘사하는 카플란 마이어 곡선. cH9/1 + cH6/1 백신접종된 마우스는 BSA 대조군에 비해 통계학적으로 보다 높은 생존율을 가졌다(p = .0003).
도 28은 cH6/1에 의한 백신 접종이 cH9/1 N1 바이러스 공격으로부터 보호를 매개하는 줄기-특이성 면역성을 이끌어냄을 설명한다. 동물을, 인플루엔자 바이러스에 의한 선행 감염 또는 상기 바이러스에 대한 백신접종을 시뮬레이션하기 위해서 YAM-HA 바이러스로 접종하였다. 3주 후에, 동물을 비내 및 복강내로, 항원보강제와 함께 cH6/1 또는 BSA로 백신접종하였다. 대조군 동물을 야생형 B/야마가타/16/1988로 접종하고 BSA로 유사한 방식으로 백신접종하거나, 불활성화된 cH9/1 N1 바이러스를 근육내로 제공하였다. 동물을 채혈하고 백신접종 후 3주째에 250LD50 cH9/1 N1 바이러스로 공격하였다. (a) 동물을 공격으로부터의 보호를 평가하기 위해서 8일 동안 칭량하였다. 3 내지 5일째에, YAM-HA + cH6/1 동물은 YAM-HA + BSA 코호트에 비해 통계학적으로 적은 체중 손실을 나타내었다(p<.05). (b) 생존을 묘사하는 카플란 마이어 곡선. 상기 YAM-HA + BSA 코호트(p = .038)뿐만 아니라 미경험 및 WT YAM + BSA 동물에 비해 YAM-HA + cH6/1 그룹에서 통계학적으로 상이한 생존율이 나타났다(p<.0001). YAM-HA + BSA 코호트의 생존율은 상기 WT-YAM + BSA 코호트의 경우와 통계학적으로 상이하였다(p = 0.058). (c) ELISA 플레이트를 백신접종을 통해 이끌어낸 줄기 반응성의 정도를 평가하기 위해서 cH5/1 N1 바이러스로 코팅하였다. (d) cH5/1 바이러스를 사용하는 플라크 감소 분석의 결과를 묘사하였다. (e) 동물을 백신 접종하고, 채혈하고, 전체 IgG를 H5-기재 슈도입자 침입 억제 분석을 위해 수확하였다. 억제 퍼센트를 대조군에 대한 루시페라제 발현의 감소로서 평가하였다.
도 29는 cH6/1에 의한 백신 접종이 치사적인 H5 인플루엔자 바이러스 공격으로부터 마우스를 보호함을 설명한다. 동물을, 인플루엔자 바이러스에 의한 선행 감염 또는 상기 바이러스에 대한 백신접종을 시뮬레이션하기 위해서 YAM-HA 바이러스로 접종하였다. 3주 후에, 동물을 비내 및 복강내로, 항원보강제와 함께 cH6/1 또는 BSA로 백신접종하였다. 대조군 동물을 야생형 B/야마가타/16/1988로 접종하고 BSA와 함께 유사한 방식으로 백신접종하거나, 불활성화된 cH5/1 N1 바이러스를 근육내로 제공하였다. 동물을 채혈하고 PR8 배경에서 10LD50의 2:6 H5 재조합체로 공격하였다(예를 들어, 문헌[Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753]을 참조하시오). (a) 생존을 묘사하는 카플란 마이어 곡선. 생존율의 차이가 상기 YAM-HA + BSA 코호트에 대해 YAM-HA + cH6/1 그룹을 비교할 때 통계학적 유의수준에 접근하였다(p=.06) (b) 생존 기간은 BSA(p = 0.037)뿐만 아니라 미경험 및 WT YAM/BSA 대조군(p < 0.001)을 백신접종한 동물보다 YAM-HA를 접종하고 cH6/1로 백신접종한 동물에서 평균적으로 더 길었다. (c) ELISA 플레이트를 백신접종을 통해 이끌어낸 줄기 반응성의 정도를 평가하기 위해서 cH5/1 N1 바이러스로 코팅하였다. 1:50 혈청 희석물을 최대 체중 손실%에 대해 플롯팅하였다. 하나의 값이 이상치인 것으로 측정되었으며 이를 분석에서 누락시켰다. 선형 회귀에 대해서, R2 = 0.56 및 p = .02.
도 30은 cHA에 의한 백신접종이 H1N1 바이러스 공격으로부터 보호를 매개하는 줄기-특이성 면역성을 이끌어냄을 설명한다. (a 내지 f) 동물을 cH9/1을 암호화하는 DNA로 초회항원자극하고 이어서 cH6/1로 백신접종하고 cH5/1 가용성 단백질(n=10) 또는 BSA(n=5)로 추가접종한 반면, 양성 대조군 마우스에게는 불활성화된 바이러스를 근육내로 제공하였다(n=5). (a) 동물을 백신접종하고 FM1 바이러스로 공격하였으며; 마우스를 매일 칭량하였고; 시간에 따른 체중 손실을 초기 체중의 백분율의 변화로서 나타낸다. (b) (a)에서 공격받은 마우스의 생존을 묘사하는 그래프. (c) 동물을 백신접종하고 pH1N1 바이러스로 공격하였으며; 마우스를 매일 칭량하였고; 시간에 따른 체중 손실을 초기 체중의 백분율의 변화로서 나타낸다. (d) (c)에서 공격받은 마우스의 생존을 묘사하는 그래프. (e) 동물을 백신접종하고 PR8 바이러스로 공격하였으며; 마우스를 매일 칭량하였고; 시간에 따른 체중 손실을 초기 체중의 백분율의 변화로서 나타낸다. (f) (e)에서 공격받은 마우스의 생존을 묘사하는 그래프. (g) 상기 A-F 및 하기 H-I에 개시된 바와 같이 백신 접종되고 5 LD50의 A/FM/1/1947(a,b), 10 LD50의 A/네덜란드/602/2009(c,d), 또는 5 LD50의 A/PR/8/1934(e,f,h,i)로 공격된 동물로부터의 혈청의 H1 HA에 대한 반응성. (h) 동물을 상기 a 내지 f에 개시된 바와 같이 백신접종하거나(네모, n=4), 또는 상기 동물은 미경험이었던 반면(삼각형, n=3), 양성 대조군 마우스에게 불활성화된 PR8 바이러스를 근육내로 제공하였다(X 표시, n=5). CD8 T 세포를 PR8 바이러스로 공격하기 전에 고갈시켰다. 마우스를 매일 칭량하였고; 시간에 따른 체중 손실을 초기 체중의 백분율의 변화로서 나타낸다. (i) (h)에서 공격받은 마우스의 생존을 묘사하는 그래프. (j) 동물을 A-F에 대해 개시된 바와 같이 백신접종하였다. 전체 IgG를 H2-기재 슈도입자 침입 억제 분석에 사용하기 위해 정제하였다. 억제 퍼센트를 대조군에 비해 루시페라제 발현의 감소로서 평가하였다. Fab 단편 CR6261을 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 31은 야생형 HA 및 발현 구조물의 도해이다. (A) 절단되지 않은 전장 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌. 신호 펩타이드는 가장 좌측 성분이고, HA 엑토도메인은 중간 성분이며, 막관통- 및 엔도도메인은 가장 우측 성분이다. (B) 삼량체화 도메인을 갖는 발현 구조물. 상기 막관통- 및 엔도도메인을 V503(H3 넘버링) 위치에서 트롬빈 절단 부위(좌측으로부터 세 번째 성분), T4 삼량체화 도메인(좌측으로부터 네 번째 성분) 및 헥사히스티딘 태그(6xhis 태그, 좌측에서부터 다섯 번째 성분)와 교환하였다. (C) 삼량체화 도메인이 없는 발현 구조물. 상기 막관통- 및 엔도도메인을 각각 509(H1, H2 및 H5) 또는 508(H3)(H3 넘버링) 아미노산 위치에서 헥사히스티딘 태그(6xhis 태그, 가장 우측 성분)와 교환하였다.
도 32는 삼량체화 도메인의 도입이 재조합 HA에서 올리고머의 안정성 및 형성에 영향을 미침을 나타낸다. (A) 환원, 변성 SDS-PAGE에 의한 삼량체화 도메인의 존재 및 부재하의 재조합 HA의 분석. 삼량체화 도메인과 함께 발현된(+) 재조합 HA는 없이(-) 발현된 HA보다 더 높은 안정성을 보인다. 절단되지 않은 HA(HA0) 및 절단 산물(HA1/분해 산물; HA2)은 화살표로 나타낸다. (B) 가교결합된 HA의 환원, 변성 SDS-PAGE 분석. HA의 상이한 종들을 블럿에 나타낸다. 고분자량 다량체는 H에 의해, 삼량체는 T에 의해, 이량체는 D에 의해, 단량체는 M에 의해 나타낸다. (C) 좌측 패널(상자 1-4): 항-헥사히스티딘-태그 항체로 탐침조사된 B로부터의 환원, 변성 및 가교결합된 그룹 1 HA의 웨스턴 블럿 분석. 우측 패널(가장 우측 상자): SDS-PAGE상에서 분석된 BS3를 갖는 가교결합 대조군(IgG). 상이한 종들(완전 항체, 중쇄, 경쇄)을 화살표로 나타낸다. 마커 밴드의 분자량을 각 패널의 좌측에 나타낸다.
도 33은 재조합 PR8(H1) 및 Cal09(H1) HA에 대한 줄기-반응성 항체의 결합. (a) (w/o T4 삼량체화 도메인, 삼각형 라인) 또는 (w/T4 삼량체화 도메인, 네모 라인) 삼량체화 도메인 하의 재조합 가용성 PR8 HA에 대한 줄기-반응성 항체 C179, CR6261 및 6F12 및 헤드-반응성 항체 PY102 및 PR8 항혈청의 결합. (b) (w/o T4 삼량체화 도메인, 삼각형 라인) 또는 (w/T4 삼량체화 도메인, 네모 라인) 삼량체화 도메인 하의 재조합 가용성 Cal09 HA에 대한 줄기-반응성 항체 C179, CR6261 및 6F12 및 헤드-반응성 항체 7B2 및 Cal09 항혈청의 결합.
도 34는 재조합 JAP57(H2) 및 VN04(H5) HA에 대한 줄기-반응성 항체의 결합. (a) (w/o T4 삼량체화 도메인, 삼각형 라인) 또는 (w/T4 삼량체화 도메인, 네모 라인) 삼량체화 도메인 하의 재조합 가용성 PR8 HA에 대한 줄기-반응성 항체 C179 및 CR6261 및 헤드-반응성 항체 8F8 및 H2 항혈청의 결합. (b) (w/o T4 삼량체화 도메인, 삼각형 라인) 또는 (w/T4 삼량체화 도메인, 네모 라인) 삼량체화 도메인 하의 재조합 가용성 VN04 HA에 대한 줄기-반응성 항체 C179 및 CR6261 및 헤드-반응성 항체 mAb#8 및 H5 항혈청의 결합.
도 35는 그룹 2 HA에 대한 줄기-반응성 항체의 결합. (a) (w/o T4 삼량체화 도메인, 삼각형 라인) 또는 (w/T4 삼량체화 도메인, 네모 라인) 삼량체화 도메인 하의 재조합 가용성 HK68 HA에 대한 줄기-반응성 항체 12D1 및 CR8020 및 헤드-반응성 항체 XY102 및 H3 항혈청의 결합. (b) (w/o T4 삼량체화 도메인, 삼각형 라인) 또는 (w/T4 삼량체화 도메인, 네모 라인) 삼량체화 도메인 하의 재조합 가용성 Wisc05 HA에 대한 줄기-반응성 항체 12D1 및 CR8020 및 H3 항혈청의 결합.
도 36은 인플루엔자 B형 바이러스의 줄기 도메인(B/플로리다/4/2006) 및 H5 하위유형의 인플루엔자 A형 바이러스의 구상 헤드 도메인(A/베트남/1203/2004)을 포함하는 예시적인 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드(서열번호 21)를 묘사한다.
도 37은 HA 줄기-기재 백신접종 전략이 상이한 H3N2 바이러스에 의한 공격으로부터 광범위한 보호를 제공함을 설명한다. (A) 백신접종 전략의 도식적인 표현(각 항원의 단량체 형태를 도시한다). (B 내지 E) 동물을 cH4/3 HA를 암호화하는 플라스미드 DNA로 백신접종하고 후속으로 재조합 가용성 cH5/3, 이어서 cH7/3 단백질로 추가접종하였다(회색 삼각형, 포인트가 아래로; n=9 또는 10마리 동물). 양성-대조군 동물은 합치된 공격 균주를 함유하는 불활성화된 백신을 받았다(회색 원; n=5마리 동물). 초회항원자극만 된 동물(회색 삼각형, 포인트가 위로; n=5마리 동물)은 DNA 초회항원자극에 이어서 2 회의 관련없는 단백질 추가접종을 받았다. 미경험 동물(검은색 사각형; n=5마리의 동물)을 공격에 대한 추가적인 대조군으로서 사용하였다. (B) Phil82(H3N2) 바이러스에 의한 공격시 체중 손실 곡선. (C) Phil82 공격시 카플란-마이어 생존 곡선. (D) X-31(H3N2) 바이러스에 의한 공격시 관찰된 이환률. (E) X-31(H3N2) 공격에 따른 생존 곡선. 백신접종된(cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3) 대 대조군(cH4/3DNA-BSA-BSA) 그룹들의 생존은 상기 두 공격실험 모두(각각 P = 0.0008 및 0.0001)에 대해서 매우 현저하다. (F 및 G) 마우스 모델에서 치사적이지 않은 바이러스에 대한 상기 백신의 보호 폭을 추가로 시험하기 위한 폐 역가측정 실험. 백신접종된 동물(BcH7/3-cH5/3-cH4/3) 및 대조군 동물(Bwt-BSA-BSA)을 5 x 104 PFU의 H3N2 변체(F) 또는 1 x 105 PFU의 인간 H3N2 A/와이오밍/03/03(G)으로 감염시켰다. 감염후 3일째에, 상기 두 그룹 모두로부터의 동물의 폐를 수확하고 균질화하고, 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50)을 측정하였다.
도 38은 cHA 구조물에 의한 백신접종이 줄기-반응성 항체의 기존 역가를 보호 수준으로 증강시킬 수 있음을 나타낸다. (A 내지 G) 인간 집단 중에 존재하는 줄기 도메인에 대한 기존 면역성을 모방하기 위해서, 동물을 cH7/3 HA를 발현하는 재조합 인플루엔자 B형 바이러스로 치사량에 가깝게 감염시켰다. 후속으로, 상기 동물을 재조합 가용성 cH5/3(또는 cH5/3N1-공격된 동물의 경우 전장 H3 HA)으로 추가접종하고 이어서 cH4/3 단백질(짙은 회색 삼각형, 포인트가 아래로; n=10마리 동물)로 추가접종하였다. 양성-대조군 동물은 합치된 공격 균주를 함유하는 불활성화된 백신을 받았다(짙은 회색 원; n=5마리 동물). 초회항원자극만 된 동물(짙은 회색 삼각형, 포인트가 위로; n=5마리 동물)은 재조합 인플루엔자 B형 초회항원자극 및 이어서 2회의 관련없는 단백질 추가접종을 받았다. 추가적인 대조군은 야생형 인플루엔자 B형 바이러스로 감염되었고 이어서 2회의 관련없는 단백질 추가접종을 받았거나(밝은 회색 삼각형, 포인트가 아래로; n=5) 또는 미경험이었다(검은색 사각형; n=5). (B 내지 D) 바이러스 공격에 따른 체중 손실 곡선. (B) 대용 공격 균주로서 최근의 인간 H3N2 단리물로부터의 HA의 줄기 도메인을 발현하는 마우스-병원성 cH5/3N1 바이러스를 사용하여, 현대 인간 H3N2 단리물은 마우스에서 병원성이 아니기 때문에, 최신 줄기 도메인들에 대한 효능을 시험하였다. X-31(H3N2; A/홍콩/1/68로부터의 HA 및 NA)(C) 및 Phil82(H3N2)(D) 바이러스에 의한 감염시 체중 손실; (E) A/cH5/3N1 공격에 따른 카플란-마이어 생존 곡선; (F) Phil82(H3N2) 공격에 따른 생존 곡선; (G) X-31(H3N2) 공격에 따른 생존 곡선. 통계 분석은 BcH7/3-cH5/3-cH4/3 및 BcH7/3-BSA-BSA 그룹의 비교시 모든 공격들에 대해 높은 유의수준을 밝혀내었다(P = 0.082, P < 0.0001 및 P < 0.0001).
도 39는 상기 유도된 항-줄기 반응이 가장 최근의 백신 균주를 포함하여 다수의 H3N2 균주에 대해 교차-반응성임을 설명한다. 상기 유도된 항-줄기 반응은 가장 최근의 백신 균주를 포함하여, 다수의 H3N2 균주에 대해 교차-반응성이다. (A 내지 E) cHA 구조물(짙은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3), 초회항원자극만 된 동물(짙은 회색 삼각형, 포인트가 위로), 또는 미경험 동물(검은색 사각형)로 백신 접종된 동물로부터 수집된 혈청의 Phil82(H3N2, 전체 바이러스)(A), X-31 바이러스(H3N2; A/홍콩/1/68 바이러스로부터 HA 및 NA 발현)(B), H3N8 바이러스(C), 현행 인플루엔자 백신 균주 Vic11(H3N2, 바이러스)(D), 또는 퍼쓰09 단백질(H3)(E)에 대한 ELISA 반응성. (F 내지 H) cHA 구조물(짙은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, B/cH7/3 바이러스-cH5/3 단백질-cH4/3 단백질), 초회항원자극만 된 동물(짙은 회색 삼각형, 포인트가 위로), 야생형 인플루엔자 B형 바이러스로 감염되고 이어서 2회의 BSA 추가접종된(밝은 회색 삼각형, 포인트가 아래로) 대조군 동물, 또는 미경험 동물(검은색 사각형)로 백신 접종된 동물로부터 수집된 혈청의 Vic11 H3N2(F) 또는 Phil82 H3N2(G) 또는 X-31 H3N2(H) 바이러스에 대한 ELISA 반응성.
도 40은 cHA 백신접종 전략에 의해 유도된 항-H3 HA 줄기 항체의 폭이 가장 최근의 중국 H7N9 바이러스를 포함하여 그룹 2 HA의 다른 구성원들까지 확대됨을 설명한다. (A) 도 37에 나타낸 백신접종 설계를, 항-H7 구상-헤드 도메인 항체가 상기 일련의 실험들에서 관찰된 효과들에 연루되지 않도록 변형시켰다. 동물은 동일한 초회항원자극(cH4/3 HA를 암호화하는 DNA) 및 1차 추가접종(cH5/3 단백질)을 받았지만, 2차 추가접종은 H3 단백질(cH4/3DNA-cH5/3-H3; 회색 삼각형, 포인트가 위로, n=10마리 동물)로 대체되었다. 양성-대조군 동물은 불활성화된 RheaH7 바이러스 백신(회색 원, n=5)을 받았다. 초회항원자극만 된 동물(회색 삼각형, 포인트가 위로, n=5마리 동물)은 DNA 초회항원자극에 이어서 2회의 관련없는 단백질 추가접종을 받았다. 미경험 동물(검은색 사각형, n=5마리 동물)이 추가적인 대조군으로서 사용되었다. (B) 레아H7(H7N1) 바이러스에 의한 공격시 체중 손실 곡선. (C) 카플란-마이어 생존 곡선. 상기 백신은 사망에 대해 양호한 보호를 제공하였다(P = 0.0088, cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3 대 대조군 cH4/3DNA-BSA-BSA). (D,E) 레아H7 바이러스(D) 또는 최근의 상하이13 H7N9(E) 바이러스에 의해 발현된 HA 단백질에 대한 백신접종된 동물(회색 삼각형, 포인트가 아래로, cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3), 대조군 동물(회색 삼각형, 포인트가 위로, cH4/3DNA-BSA-BSA), 또는 미경험 마우스(검은색 사각형)로부터의 혈청의 ELISA 반응성. (F) 백신(BcH7/3-cH5/3-cH4/3) 및 대조군(Bwt-BSA-BSA)을 받은 마우스를 1 x 105 PFU의 H10N7 바이러스로 감염시켰으며 감염후 3일째에 백신접종된 마우스의 폐에서 바이러스 TCID50의 20-배 감소가 측정되었다. (G) 백신접종된 마우스 cH4/3DNA-cH5/3-H3으로부터 수집된 혈청을 그룹 2 HA 단백질의 패널로 인식한다. MDCK 세포를 각각의 HA를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고 16시간 후에 0.5% 파라폼알데하이드로 고정시켰다. 반응성을 상기 백신을 받은 마우스로부터의 혈청으로 면역형광에 의해 검출하였다. 미경험 동물로부터 수집된 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다. 마우스(FBE9[공개되지 않은, 사내에서 생성된]) 및 인간(FI6)(문헌[Corti et al., 2011, Science 333:850-856]) 단클론 항-줄기 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 41은 키메릭 HA 백신접종에 의해 유도된 다클론 반응이 줄기 도메인에 대한 것이며 시험관내 및 생체내 모두에서 바이러스 감염을 중화시킴을 나타낸다. (A) 그룹 1 HA 단백질(H1)에 대한 ELISA는 상기 cHA 백신에 의해 유도된 교차-반응성 반응들(짙은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, B/cH7/3-cH5/3-cH4/3)이 상기 HA 단백질 중의 수용체 결합 부위의 보존된 부분들에 대한 것이 아님을 설명한다. (B) cHA 구조물로 백신접종된 동물(짙은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, B/cH7/3-cH5/3 단백질-cH4/3 단백질), 초회항원자극만 된 동물(밝은 회색 삼각형, 포인트가 위로, B/cH7/3-관련없는 단백질-관련없는 단백질), 벡터 대조군(밝은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, Bwt-관련없는 단백질-관련없는 단백질), 및 미경험 동물(검은색 사각형)로부터의 코 세척물의 ELISA 반응성. (C) 백신접종된(B/cH7/3 바이러스-cH5/3 단백질-cH4/3 단백질), 미경험, 초회항원자극만 된(B/cH7/3 바이러스-BSA-BSA), 및 벡터 대조군 동물(Bwt 바이러스-BSA-BSA)로부터의 혈청 중 항체 아이소타입. (D) cHA-백신접종된 동물(짙은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, B/cH7/3-cH5/3-cH4/3), 벡터 대조군(밝은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, Bwt-관련없는 단백질-관련없는 단백질), 및 미경험 동물(검은색 사각형)로부터의 혈청에 의한 Vic11(H3) 슈도유형 입자 중화 분석. 역의 혈청 희석을 x 축상에 나타낸다. H3 줄기-반응성 단클론 항체(12D1)를 123 ㎍/㎖의 출발 농도에서 양성 대조군(회색 원)으로서 사용하였다. (E) 백신 처리된 동물(짙은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, BcH7/3-cH5/3-cH4/3, n=5마리 동물), 벡터 대조군(밝은 회색 삼각형, 포인트가 아래로, Bwt-BSA-BSA, n=5마리 동물), 미경험 동물(검은색 사각형, n=5마리 동물), 및 양성-대조군 동물(불활성화된 Phil82 바이러스 백신을 받은, n=5마리 동물)로부터의 혈청에 의한 수동 전달 공격 실험(Phil82 H3N2 바이러스). 카플란-마이어 생존 곡선을 도시한다(BcH7/3-cH5/3-cH4/3 대 Bwt-BSA-BSA 그룹에 대해서 P < 0.026).
도 42는 백신에 의해 유도된 반응의 폭을 묘사하는 그룹 2 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 선택 구성원들의 계통발생을 도시한다. 단백질 서열들을 진뱅크(GenBank)로부터 다운로드하였으며, 메가 버전 5.1의 ClustalW 연산을 사용하여 다수의 정렬을 수행하였다. 피그트리(FigTree) 소프트웨어 및 근연접합법을 사용하여 계통수를 작성하였다. 스케일 막대는 5% 아미노산 변화를 나타낸다. 각 균주에 대한 cHA-백신접종된 마우스의 적극적으로 시험된 교차-보호/교차-반응성을 상기 균주명 뒤의 괄호안에 나타낸다(면역형광[IF], 공격, ELISA, 및 폐 역가). 표시가 없는 균주명은 시험되지 않았다.
도 43은 H3 줄기-기재 cHA에 의한 백신접종이 H7N9 바이러스에 의한 공격으로부터 마우스를 보호함을 밝혀낸다. (A) 백신접종 섭생의 도식적인 표현. 구조들은 단백질 데이터베이스 구조 #1RU7에 근거한다. (B-G)에서 마우스는 cH4/3 단백질(H3 줄기와 함께 H4 헤드)을 암호화하는 DNA 초회항원자극을 받았고 이어서 cH5/3(H3 줄기의 상부에 H5 헤드) 및 전장 H3 단백질로 추가접종받았다. 상기 동물을 H7N9 바이러스에 의한 최종 면역화후 4주째에 공격하였다. 체중 손실 곡선을 (B-D)에 도시하고, 생존 곡선을 (E-G)에 도시한다. (C 및 D)에서 대시선은 (B)에 도시된 'PIC i.n.+i.m.' 그룹의 최고 평균 체중 손실(제7일)을 가리킨다. (B) 및 E에 나타낸 마우스(PIC i.n.+i.m.)를 항원보강제로서 폴리I:C의 존재하에서 cH4/3 및 cH5/3 단백질로 비내 및 근육내로 연속적으로 추가접종하였다. (C) 및 (F)에서 동물은 추가접종과 동일한 단백질을 받았으나 면역화는 단지 근육내로만 받았다(PIC i.m.). (D) 및 (G)에서 마우스를 수중 유적형 항원보강제(OIW i.m.) 만으로 근육내로 면역시켰다. 대조군의 동물은 각각의 항원보강제와 함께 각각의 경로를 통해 BSA를 받았다. 양성 대조군 동물(동일한 그룹을 3개의 모든 실험 조건에 대해 비교하였다)을 불활성화된 합치된 공격 바이러스로 근육내 백신접종하였다.
도 44는 수중 유적형(OIW) 항원보강제 제조 및 특징을 묘사한다. (A) 상기 OIW 항원보강제 제조의 도해. 상기 OIW 유화액을 20 내지 40 ㎖ 규모로 제조한다. 스팬(Span)-85를 스쿠알렌에 용해시키고, 폴리솔베이트 80을 탈이온수에 용해시키고 이어서 시트레이트-시트르산 완충제와 혼합한다. 오일 및 수성상 분획들을 합하고 와동에 의해 거친 유화액으로 혼합하고 이어서 LV1 미세유동화기(마이크로플루이딕스(Microfluidics), 미국 매사추세츠주 웨스트우드 소재)에 12,000 psi에서 통과시킨다. 용리제를 수집하고 상기 미세유동화기를 통해 총 5회 다시 통과시켜 안정하고 균질한 유화액을 제공한다. 최종 통과물을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하고 멸균 유리 바이알에 충전한다. (B) 미세유동화에 의해 제조된 상기 OIW 항원보강제의 입자 크기를 맬번 나노(Malvern Nano) 3ZS상에서 동적 광 산란에 의해 측정하였다. 도시된 크기는 2개의 독립적으로 제조된 배치로부터의 Z-평균이다. 이들 제제는 상기 미세유동화기를 통한 최종 통과후 다분산성으로서 단정상으로 간주되며 멸균 여과 범위는 8 내지 11%이었다.
도 45는 H3 줄기-기재 cHA에 의한 백신접종이 마우스에서 H7 헤마글루티닌에 대한 높은 항체 역가를 유도함을 예시한다. (A) H7(A/상하이/1/13) HA에 대한 cHA 백신접종된 마우스의 IgG 종점 역가. 단측검정 p 값을 비-대응표본 t 검정을 사용하여 계산하였다. (B) 상이한 경로를 통해 상이한 항원보강제로 백신접종된 마우스로부터의 혈청 중의 H7 HA에 대한 면역글로불린 아이소타입 분포. 상기 분석을 1:200 희석으로 수행하였다.
하나의 태양에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 보존된 HA 줄기 도메인에 대한 교차-보호성 면역 반응을 유도하는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 안정한 HA 줄기 도메인 및 상기 줄기 도메인에 이종인 구상 HA 헤드 도메인을 포함한다(즉, 상기 헤드 및 줄기 도메인은 상이한 균주 및/또는 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터 유래된다).
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 조성물(예를 들어, 본 발명에 개시된 가용성 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하도록 조작된 게놈을 포함하는 바이러스, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 발현 벡터, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하도록 조작된 게놈을 포함하는 발현 벡터, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 등)을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 백신 제형을 제공한다. 특정한 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나를 포함하는 1가 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 2개(즉, 2개의 별개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 2가 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 3개(즉, 3개의 별개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 3가 백신을 제공한다. 본 발명에 제공된 백신 제형은 예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 서브유닛 백신(예를 들어, 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 예를 들어 가용성 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 조성물); 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하는 생 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 생 약독화 인플루엔자 바이러스); 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 암호화하는 게놈을 포함하는 생 인플루엔자 바이러스(예를 들어, 생 약독화 인플루엔자 바이러스); 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하는 죽은 인플루엔자 바이러스; 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 암호화하는 게놈을 포함하는 죽은 인플루엔자 바이러스; 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 함유하는 바이러스/바이러스-유사 입자("VLP"); 분할 바이러스 백신(여기에서 상기 바이러스는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하고/하거나 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 암호화하는 게놈을 포함한다); 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하는 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 비-인플루엔자 바이러스 발현 벡터); 및 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하는 세균 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명에 개시된 백신 제형은 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA 줄기 도메인에 대해 고도로 효능 있고 광범위하게 중화하는 항체를 이끌어낼 수 있다. 상기와 같은 "범용" 백신을 사용하여 인플루엔자 바이러스 하위유형들 전체에 걸쳐 교차-보호성 면역 반응을 유도하고/하거나 증강시킬 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스 질병 또는 감염에 대해 면역시키는 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상 또는 본 발명에 개시된 백신 제형을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명에서 제공된 키트는 하나 이상의 추가적인 성분, 예를 들어 상기 키트에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 포함할 수도 있다.
1. 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드
본 발명은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인 폴리펩타이드 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어지는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 제공하며, 여기에서 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 헤드 도메인 폴리펩타이드는 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드에 이종이다(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인 폴리펩타이드 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드는 상이한 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 하위유형들로부터 유래된다). 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 및 구상 헤드 도메인은 인플루엔자 A형 바이러스 헤마글루티닌 줄기 및 구상 헤드 도메인(예를 들어, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, 15, H16, H17, 및 H18) 및/또는 인플루엔자 B형 바이러스 헤마글루티닌 줄기 및 구상 헤드 도메인을 기본으로 할 수 있다.
전장 인플루엔자 헤마글루티닌은 전형적으로 HA1 도메인 및 HA2 도메인을 포함한다. 상기 줄기 도메인은 상기 HA1 도메인의 2개 분절 및 상기 HA2 도메인의 대부분 또는 전부에 의해 형성된다. 상기 HA1 도메인의 2개 분절은 1차 서열에서, 상기 구상 헤드 도메인(예를 들어, 도 1에서 Ap 및 Aq로 표시된 잔기들 사이의 아미노산 잔기)에 의해 분리된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 상기와 같은 구조를 유지한다. 즉, 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 HA1 도메인 및 HA2 도메인으로 구성된 안정한 줄기 구조, 및 상기 HA1 도메인의 2개 분절(1차 서열에서)을 분리시키는 구상 헤드 도메인을 포함하고, 여기에서 상기 구상 헤드 도메인은 상기 HA1 도메인 및 상기 HA2 도메인의 다른 분절들에 의해 형성된 줄기 도메인에 이종이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) H1 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/캘리포니아/4/2009(H1N1) HA의 줄기 도메인(또는 A/캘리포니아/4/2009-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 A/퍼쓰/16/2009(H3) HA의 줄기 도메인을 포함하지 않는다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H7 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/빅토리아/361/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/인디애나/10/2011(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/2009(H3N2) HA의 줄기 도메인이고 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/베트남/1203/2004(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도네시아/5/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/안후이/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/칠면조/터키/1/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/큰고니/몽골/244/2005(H5) HA의 구상 헤드 도메인이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H7 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/네덜란드/219/03(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/504/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/캐나다/444/04(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/레아/NC/39482/93(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7) HA의 구상 헤드 도메인이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) 상이한 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/리/1940 HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/말레이시아/2506/2004 HA의 줄기 도메인이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/바다표범/네덜란드/1/99 HA(또는 B/바다표범/네덜란드/1/99-유사 인플루엔자 바이러스)의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/리/1940 HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/플로리다/4/2006 HA의 줄기 도메인이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/바다표범/네덜란드/1/99 HA(또는 B/바다표범/네덜란드/1/99-유사 인플루엔자 바이러스)의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/리/1940 HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/위스콘신/1/2010 HA의 줄기 도메인이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/바다표범/네덜란드/1/99 HA(또는 B/바다표범/네덜란드/1/99-유사 인플루엔자 바이러스)의 구상 헤드 도메인이다.
또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/리/1940 HA의 구상 헤드 도메인이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 B/브리즈번/60/2008 HA의 줄기 도메인이고 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 B/바다표범/네덜란드/1/99 HA(또는 B/바다표범/네덜란드/1/99-유사 인플루엔자 바이러스)의 구상 헤드 도메인이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 (i) H3 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 줄기 도메인 및 (ii) H4 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 포함한다(때때로 본 발명에서 "cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드"라 지칭된다). 특정한 실시태양에서, cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/09 HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/09-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인은 A/퍼쓰/16/09 HA의 줄기 도메인(또는 A/퍼쓰/16/09-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 줄기 도메인)이고 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 A/오리/체코/56의 구상 헤드 도메인(또는 A/오리/체코/56-유사 인플루엔자 바이러스 HA의 구상 헤드 도메인)이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 단량체성이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 다량체성이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 삼량체성이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 신호 펩타이드를 포함한다. 전형적으로, 상기 신호 펩타이드는 폴리펩타이드 발현 및 번역 도중 또는 그 후에 절단되어 성숙한 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 또한 신호 펩타이드가 결여된 성숙한 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드가 신호 펩타이드를 포함하는 실시태양에서, 상기 신호 펩타이드는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 인플루엔자 바이러스 신호 펩타이드를 기본으로 할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 신호 펩타이드는 인플루엔자 A형 신호 펩타이드를 기본으로 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 신호 펩타이드는 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, 및 H18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 인플루엔자 A형 헤마글루티닌의 신호 펩타이드를 기본으로 한다(인플루엔자 A형 바이러스 헤마글루티닌 H18의 예에 대해서 예를 들어 문헌[Tong et al ., 2013. PLoS Path . 9(10): e1003657. Doi:10.1371/journal.ppat.1003657]을 참조하시오). 몇몇 실시태양에서, 상기 신호 펩타이드는 당해 분야의 숙련가에게 유용한 것으로 생각되는 임의의 신호 펩타이드일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 관강 도메인을 포함한다. 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드가 관강 도메인을 포함하는 실시태양에서, 상기 관강 도메인은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 인플루엔자 관강 도메인을 기본으로 할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 관강 도메인은 인플루엔자 A형 관강 도메인을 기본으로 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 관강 도메인은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, 및 H18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 인플루엔자 A형 헤마글루티닌의 관강 도메인을 기본으로 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 관강 도메인은 당해 분야의 숙련가에게 유용한 것으로 생각되는 임의의 관강 도메인일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 관강 도메인은 줄기 도메인과 동일한 헤마글루티닌으로부터의 것이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 관강 도메인은 상기 줄기 도메인 HA2 서브유닛으로서 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형으로부터의 것이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 막관통 도메인을 포함한다. 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드가 막관통 도메인을 포함하는 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 인플루엔자 막관통 도메인을 기본으로 할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 인플루엔자 A형 막관통 도메인을 기본으로 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, 및 H18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 인플루엔자 A형 헤마글루티닌의 막관통 도메인을 기본으로 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 당해 분야의 숙련가에게 유용한 것으로 생각되는 임의의 막관통 도메인일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 줄기 도메인과 동일한 헤마글루티닌으로부터의 것이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 상기 줄기 도메인 HA2 서브유닛으로서 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형으로부터의 것이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 세포질 도메인을 포함한다. 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드가 세포질 도메인을 포함하는 실시태양에서, 상기 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 인플루엔자 세포질 도메인을 기본으로 할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포질 도메인은 인플루엔자 A형 세포질 도메인을 기본으로 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포질 도메인은 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, 및 H18로 이루어진 그룹 중에서 선택된 인플루엔자 A형 헤마글루티닌의 세포질 도메인을 기본으로 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포질 도메인은 당해 분야의 숙련가에게 유용한 것으로 생각되는 임의의 세포질 도메인일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포질 도메인은 줄기 도메인과 동일한 헤마글루티닌으로부터의 것이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포질 도메인은 상기 줄기 도메인 HA2 서브유닛으로서 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형으로부터의 것이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인을 추가로 포함한다. 유용한 폴리펩타이드 도메인은 폴리펩타이드의 부분들의 정제, 폴딩 및 절단을 촉진하는 도메인들을 포함한다. 예를 들어 His 태그(His-His-His-His-His-His, 서열번호 17), FLAG 에피토프 또는 다른 정제 태그는 본 발명에 제공된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 정제를 촉진할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 His 태그는 서열, (His)n(여기에서 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상이다)을 갖는다. 박테리오파지 T4 피브리틴으로부터의 폴던(foldon), 또는 삼량체화 도메인은 본 발명에 제공된 폴리펩타이드의 삼량체화를 촉진할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 삼량체화 도메인은 삼량체성 또는 사량체성 나선 코일의 형성을 허용하는 변형된 GCN4pII 삼량체화 7가 반복부 또는 야생형 GCN4pII 삼량체화 7가 반복부를 포함한다(예를 들어, 문헌[Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466]을 참조하시오). 상기 폴던 도메인은 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 폴던 서열을 가질 수 있다(예를 들어, 문헌[Papanikolopoulou et al ., 2004, J. Biol . Chem . 279(10):8991-8998](상기 문헌의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오). 예로서 GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (서열번호 18)을 포함한다. 폴던 도메인은 본 발명에 제공된 가용성 폴리펩타이드의 삼량체화를 촉진하는데 유용할 수 있다. 절단 부위를 사용하여 폴리펩타이드의 일부의 절단, 예를 들어 정제 태그 또는 폴던 도메인 또는 이둘 모두의 절단을 촉진할 수 있다. 유용한 절단 부위는 트롬빈 절단 부위, 예를 들어 서열 LVPRGSP(서열번호 19)를 갖는 것을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 절단 부위는 담배 식각 바이러스(TEV) 프로테아제(예를 들어, 아미노산 서열 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)(서열번호 20))에 의해 인식되는 절단 부위이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 가용성 폴리펩타이드이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드는 도 1에서 Ap 및 Aq로서 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드에서 확인된 시스테인 잔기를 유지한다, 즉 도 1에서 Ap 및 Aq로서 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드에서 확인된 시스테인 잔기를 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중에 유지한다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 1차 서열에서: (i) 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드의 N-말단 분절은 도 1에서 Ap로서 확인된 시스테인 잔기에서 끝나고, (ii) 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드의 C-말단 분절은 도 1에서 Aq로서 확인된 시스테인 잔기에서 시작하며; (iii) 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 헤드 도메인 폴리펩타이드(상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드에 이종이다)는 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드의 N-말단과 C-말단 분절 사이에 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 N-말단 줄기 분절은 Ap(예를 들어, H3 헤마글루티닌으로부터의 HA1 서브유닛의 Cys52)에서 정확하게 끝나지 않고, Ap에 가까운 서열 및 구조 중의 잔기에서 끝난다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 N-말단 줄기 분절은 Ap -1, Ap-2, Ap -3, Ap -4, Ap -5, Ap -6, Ap -7, Ap -8, Ap -9, Ap -10에서 끝난다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 N-말단 줄기 분절은 Ap -1 내지 Ap -3, Ap -3 내지 Ap -5, Ap -5 내지 Ap -8, Ap -8 내지 Ap -10의 범위에서 끝난다. 예를 들어, Ap -10에서 끝나는 HA1 N-말단 줄기 분절은 H3 헤마글루티닌의 Lys42에서 끝날 것이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 N-말단 줄기 분절은 Ap +1, Ap +2, Ap+3, Ap +4, Ap +5, Ap +6, Ap +7, Ap +8, Ap +9, Ap +10에서 끝난다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 N-말단 줄기 분절은 Ap +1 내지 Ap +5, Ap +5 내지 Ap +10의 범위에서 끝난다. HA1 N-말단 줄기 분절의 끝은, 생성되는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드가 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌에 유사한 3차원 구조를 형성할 수 있도록 상기 HA1 C-말단 줄기 분절 및 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 헤드 도메인 폴리펩타이드의 끝과 함께 선택되어야 한다. 상기와 같은 실시태양에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 헤드 도메인 폴리펩타이드(상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드에 이종이다)는 1차 서열에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드의 N-말단과 C-말단 분절 사이에 위치한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 C-말단 줄기 분절은 Aq(예를 들어, H3 헤마글루티닌으로부터의 HA1 서브유닛의 Cys277)에서 정확하게 시작하지 않고, Aq에 가까운 서열 및 구조 중의 잔기에서 시작한다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 C-말단 줄기 분절은 약 Aq -1, Aq -2, Aq -3, Aq -4, Aq -5, Aq -6, Aq -7, Aq -8, Aq -9, Aq -10에서 시작한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 C-말단 줄기 분절은 Aq -1 내지 Aq -5, Aq -5 내지 Aq -10의 범위에서 시작한다. 예를 들어, Aq -10에서 끝나는 HA1 C-말단 줄기 분절은 H3 헤마글루티닌의 아이소류신262에서 시작할 것이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 C-말단 줄기 분절은 Aq +1, Aq +2, Aq +3, Aq+4, Aq +5, Aq +6, Aq +7, Aq +8, Aq +9, Aq +10에서 시작한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 C-말단 줄기 분절은 Aq +1 내지 Aq +3, Aq +3 내지 Aq +5, Aq +5 내지 Aq +8, Aq +8 내지 Ap +10의 범위에서 시작한다. HA1 N-말단 줄기 분절의 끝은, 생성되는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드가 야생형 인플루엔자 헤마글루티닌에 유사한 3차원 구조를 형성할 수 있도록 상기 HA1 C-말단 줄기 분절 및 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 헤드 도메인 폴리펩타이드의 시작과 함께 선택되어야 한다. 상기와 같은 실시태양에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 헤드 도메인 폴리펩타이드(상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드에 이종이다)는 1차 서열에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인 폴리펩타이드의 N-말단과 C-말단 분절 사이에 위치한다.
일례로, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 N-말단 줄기 분절은 헤마글루티닌 아미노산 45 내지 48번 위치(H3 넘버링 사용) 중 어느 하나에서 끝날 수 있으며 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 C-말단 줄기 분절은 헤마글루티닌 아미노산 282 내지 287번 위치(H3 넘버링 사용) 중 어느 하나에서 시작할 수 있고; 상기 이종 헤드 도메인은 아미노산 46 내지 49번 위치 중 어느 하나 및 아미노산 284 내지 289번 위치(H3 넘버링 사용) 중 어느 하나에서 시작할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 도메인이 인플루엔자 B형 바이러스로부터 유래되는 경우, HA1 N-말단 줄기 분절은 예를 들어 상기 HA의 아미노산 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50(1차 아미노산 서열에서)에서 끝날 수 있고, 상기 HA1 C-말단 줄기 분절은 상기 HA의 아미노 아미노산 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 또는 300(1차 아미노산 서열에서)에서 시작할 수 있다. 따라서 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 인플루엔자 B형 바이러스 줄기 도메인의 HA1 N-말단 줄기 분절과 HA1 C-말단 줄기 분절 사이에 삽입될 것이다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 B/홍콩/8/73(PDB:2RFT:진뱅크:M10298.1)의 HA에서, 상기 HA1 N-말단 줄기 분절은 아미노산 DRICT(서열번호 22)(이때 "D"가 1번 위치이다)로 시작할 것이며, 아미노산 42번 위치(1차 서열에서)에서 끝날 것이고; 상기 HA1 C-말단 줄기 분절은 아미노산 288번 위치(1차 서열에서)에서 시작할 것이고 상기 HA의 C-말단의 끝까지 계속될 것이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 이종 단백질, 예를 들어 열 충격 단백질(예를 들어, Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, 또는 Hsp100)이 있거나 없는 주 조직적합성 복합체(MHC)에 접합시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 면역조절 분자, 예를 들어 면역 세포, 예를 들어 B 세포(예를 들어, C3d) 또는 T 세포에 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 표적화하는 단백질에 접합시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 내재하는 면역계를 자극하는 단백질, 예를 들어 인터페론 유형 1, 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 콜로니 자극 인자, 예를 들어 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 종양 괴사 인자(TNF)-β, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 리간드(CD40L), 및 약물-유도성 CD40(iCD40)에 접합시킬 수 있다.
당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 본 발명에 개시된 기법들을 포함하여, 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있고 이들에게 적합한 것으로 생각되는 임의의 기법에 따라 제조할 수 있음을 알 것이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 단리한다.
2. 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 ( HA ) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산
본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 암호화하는 핵산을 제공한다. 유전 암호의 축퇴성으로 인해, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 어떠한 핵산도 본 발명에 포함된다. 몇몇 실시태양에서, HA1 N-말단 줄기 분절, HA1 C-말단 줄기 분절, HA2 도메인, 관강 도메인, 막관통 도메인, 및/또는 세포질 도메인을 암호화하는 천연 인플루엔자 바이러스 핵산에 상응하거나, 상기 핵산과 하이브리드화할 수 있는 핵산을 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 생성시킨다.
본 발명은 또한 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 암호화하는 핵산에 하이브리드화할 수 있는 핵산을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 단편에 하이브리드화할 수 있는 핵산을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 전장 핵산에 하이브리드화할 수 있는 핵산을 제공한다. 핵산에 대한 하이브리드화 조건에 대한 일반적인 매개변수들은 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)], 및 문헌[Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New York (1994)]에 개시되어 있다. 하이브리드화를 높은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건, 또는 낮은 엄격성 조건하에서 수행할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 낮은, 중간 및 높은 엄격성 조건들이, 상호작용하고 또한 문제의 핵산에 따라 변하는 다수의 인자들에 따라 우발적임을 알 것이다. 예를 들어, 높은 엄격성 조건은 상기 핵산(들)의 용융 온도 5 ℃ 이내의 온도, 낮은 염 농도(예를 들어, 250 mM 미만), 및 높은 공-용매 농도(예를 들어, 1 내지 20%의 공-용매, 예를 들어 DMSO)를 포함할 수 있다. 다른 한편으로, 낮은 엄격성 온도는 상기 핵산(들)의 용융 온도 아래 10 ℃ 초과의 온도, 높은 염 농도(예를 들어, 1000 mM 초과) 및 공-용매의 부재를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 단리한다. 몇몇 실시태양에서, "단리된" 핵산은 상기 핵산의 천연 출처 중에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 즉, 상기 단리된 핵산은 자연에서 상기 핵산과 관련되지 않은 이종 핵산을 포함할 수 있다. 다른 실시태양에서, "단리된" 핵산, 예를 들어 cDNA 분자는 재조합 기법에 의해 생산시 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. "세포 물질이 실질적으로 없는"이란 용어는 상기 핵산이 단리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 성분들로부터 분리된 상기 핵산의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 핵산은 다른 핵산을 약 30%, 20%, 10% 또는 5%(건조 중량 기준) 미만으로 갖는 핵산의 제제를 포함한다. "배양 배지가 실질적으로 없는"이란 용어는 상기 배양 배지가 제제 부피의 50%, 20%, 10% 또는 5% 미만을 차지하는 상기 핵산의 제제를 지칭한다. "화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는"이란 용어는 상기 핵산이 상기 핵산의 합성에 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된 제제를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기와 같은 핵산의 제제는 관심 핵산 외의 화학적 전구체 또는 화합물을 약 50%, 30%, 20%, 10%, 5%(건조 중량 기준) 미만으로 갖는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 개별적인 성분들을 암호화하는 핵산, 예를 들어 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드가 제공된 상기 구상 헤드 도메인, HA1 N-말단 줄기 분절, HA1 C-말단 줄기 분절 및/또는 HA2 도메인을 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 성분들을 암호화하는 핵산을, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 제공하기 위해서 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 조립할 수 있다.
3. 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 ( HA ) 폴리펩타이드의 발현
본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 포함한 벡터를 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 벡터는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 발현을 지시할 수 있는 발현 벡터이다. 발현 벡터의 비제한적인 예는 비제한적으로 플라스미드 및 바이러스 벡터, 예를 들어 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스 및 바큘로바이러스를 포함한다. 발현 벡터는 또한 비제한적으로 트랜스제닉 동물 및 비-포유동물 세포/유기체, 예를 들어 포유동물 N-결합된 글리코실화를 수행하도록 조작된 포유동물 세포/유기체를 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 성분들을 암호화하는 발현 벡터를 제공한다. 상기와 같은 벡터를 사용하여 하나 이상의 숙주 세포에서 상기 성분들을 발현시킬 수 있으며, 상기 성분들을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법들을 사용하여 단리하고 링커와 함께 접합시킬 수 있다.
발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 발현 벡터는 발현에 사용되는 숙주 세포를 근거로 선택된 하나 이상의 조절 서열(상기 서열은 발현시키려는 핵산에 작동적으로 연결된다)을 포함한다. 발현 벡터내에서, "작동적으로 연결된"은 관심 핵산이 상기 핵산의 발현을 허용하는(예를 들어, 상기 벡터를 숙주 세포에 도입시키는 경우 상기 숙주 세포에서 또는 시험관내 전사/번역 시스템에서) 방식으로 상기 조절 서열(들)에 연결됨을 의미하고자 한다. 조절 서열은 프로모터, 인헨서 및 다른 발현 조절 요소들(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)을 포함한다. 조절 서열은 다수 유형의 숙주 세포에서 핵산의 구성적 발현을 지시하는 것들, 몇몇 숙주 세포에서만 핵산의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직-특이성 조절 서열), 및 특정 작용제에 의해 자극시 핵산의 발현을 조절하는 것들(예를 들어, 유도성 조절 서열)을 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 발현 벡터의 설계가 형질전환시키려는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라 변할 수 있음을 알 것이다. "숙주 세포"란 용어는 핵산에 의해 형질전환되거나 형질감염된 특정 피실험 세포 및 상기와 같은 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 포함하고자 한다. 상기와 같은 세포의 자손은 연속되는 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈내로의 핵산의 통합으로 인해 상기 핵산에 의해 형질전환되거나 형질감염된 모 세포와 동일하지 않을 수도 있다.
발현 벡터를 원핵생물(예를 들어, 에스케리키아 콜라이) 또는 진핵생물 세포(예를 들어, 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터 사용, 예를 들어 문헌[Treanor et al., 2007, JAMA, 297(14):1577-1582](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용됨)을 참조하시오), 효모 세포, 식물 세포, 조류 또는 포유동물 세포)를 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현을 위해 설계할 수 있다. 효모 숙주 세포의 예는 비제한적으로 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 하기의 예들을 포함한다. 포유동물 숙주 세포의 예는 비제한적으로 크루셀 퍼.C6(Crucell Per.C6) 세포, 베로 세포, CHO 세포, VERY 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, MDCK 세포, 293 세포, 3T3 세포 또는 WI38 세포를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 골수종 세포, 예를 들어 NS0 세포, 45.6 TG1.7 세포, AF-2 클론 9B5 세포, AF-2 클론 9B5 세포, J558L 세포, MOPC 315 세포, MPC-11 세포, NCI-H929 세포, NP 세포, NS0/1 세포, P3 NS1 Ag4 세포, P3/NS1/1-Ag4-1 세포, P3U1 세포, P3X63Ag8 세포, P3X63Ag8.653 세포, P3X63Ag8U.1 세포, RPMI 8226 세포, Sp20-Ag14 세포, U266B1 세포, X63AG8.653 세포, Y3.Ag.1.2.3 세포, 및 YO 세포이다. 곤충 세포의 비제한적인 예는 Sf9, Sf21, Ao/Tn 38, 하이 파이브(High Five), 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni ), 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda ) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)를 포함한다. 특정 실시태양에서, 포유동물 세포 배양 시스템(예를 들어, 중국 햄스터 난소 또는 아기 햄스터 신장 세포)을 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현에 사용한다. 또 다른 실시태양에서, 식물 세포 배양 시스템을 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현에 사용한다. 식물 세포 배양 시스템을 사용하는 단백질의 생산을 위한 식물 세포 및 방법에 대해서 예를 들어 미국특허 제 7,504,560 호; 미국특허 제 6,770,799 호; 미국특허 제 6,551,820 호; 미국특허 제 6,136,320 호; 미국특허 제 6,034,298 호; 미국특허 제 5,914,935 호; 미국특허 제 5,612,487 호; 및 미국특허 제 5,484,719 호, 및 미국특허 출원 공개 제 2009/0208477 호, 제 2009/0082548 호, 제 2009/0053762 호, 제 2008/0038232 호, 제 2007/0275014 호 및 제 2006/0204487 호를 참조하시오. 특정한 실시태양에서, 식물 세포 배양 시스템은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현에 사용되지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 식물(예를 들어, 니코티아나(Nicotiana) 속의 식물)을 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 발현하도록 조작할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 식물을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 아그로침투(agroinfiltration) 과정을 통해 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작한다. 예를 들어, 관심 유전자, 예를 들어 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 암호화하는 핵산을 아그로박테리움의 균주에 도입시킨다. 후속으로 상기 균주를 액체 배양물에서 증식시키고 생성 세균을 세척하고 완충액에 현탁시킨다. 이어서 상기 식물을 아그로박테리움이 상기 관심 유전자를 상기 식물 세포의 일부로 형질전환시키도록 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 상기 아그로박테리움에 노출시킨다(예를 들어, 주사 또는 침수를 통해). 이어서 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드가 상기 식물에 의해 일시적으로 발현되며 상기 폴리펩타이드를 당해 분야에 공지되고 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 단리할 수 있다(구체적인 예에 대해서 문헌[Shoji et al., 2008, Vaccine, 26(23):2930-2934]; 및 문헌[D'Aoust et al., 2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940]을 참조하시오). 특정한 실시태양에서, 상기 식물은 담배 식물(예를 들어, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 대두 종에서 발현시킨다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 옥수수 종에서 발현시킨다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 벼 종에서 발현시킨다.
다른 실시태양에서, 조류(예를 들어, 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)를, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 예를 들어 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작할 수 있다(예를 들어, 문헌[Rasala et al., 2010, Plant Biotechnology Journal](2010년 3월 7일자로 온라인에서 공개됨)을 참조하시오).
몇몇 실시태양에서 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현에 사용되는 식물을 N-글리코실화 시스템(예를 들어, 세균 또는 포유동물 N-글리코실화 시스템)의 성분들을 발현하도록 조작한다, 즉 상기 식물들은 N-글리코실화를 수행할 수 있다.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있는 식물 세포 및 식물 세포 배양 시스템을 사용하는 단백질 생산 방법이 예를 들어 미국특허 제 5,929,304 호; 미국특허 제 7,504,560 호; 미국특허 제 6,770,799 호; 미국특허 제 6,551,820 호; 미국특허 제 6,136,320 호; 미국특허 제 6,034,298 호; 미국특허 제 5,914,935 호; 미국특허 제 5,612,487 호; 미국특허 제 및 미국특허 제 5,484,719 호, 미국특허 출원 공개 제 2009/0208477 호, 제 2009/0082548 호, 제 2009/0053762 호, 제 2008/0038232 호, 제 2007/0275014 호 및 제 2006/0204487 호, 및 문헌[Shoji et al., 2008, Vaccine, 26(23):2930-2934], 및 문헌[D'Aoust et al., 2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940](이들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있다.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 단리할 수 있다, 예를 들어 상기 세포는 대상의 신체 밖에 있거나 단리된 형질감염되지 않은/형질전환되지 않은 숙주 세포(즉, 상기 세포로부터 분리된)이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현하도록 조작한다.
발현 벡터를 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 숙주 세포내에 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 기법은 비제한적으로 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공-침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션, 및 일렉트로포레이션을 포함한다. 숙주 세포의 형질전환 또는 형질감염에 적합한 방법들을 문헌[Sambrook et al ., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York] 및 다른 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 숙주 세포를 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시킨다. 다른 실시태양에서, 숙주 세포를 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염시킨다.
포유동물 세포의 안정한 형질감염을 위해서, 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라, 단지 작은 분획의 세포만이 외래 DNA를 그의 게놈내에 통합시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 이러한 필수통합 성분을 확인하고 선택하기 위해서, 선택성 마커(예를 들어, 항생제에 대한 내성에 대한)를 암호화하는 핵산을 일반적으로 관심 핵산과 함께 숙주 세포에 도입시킨다. 선택성 마커의 예는 약물, 예를 들어 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 상기 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포를 약물 선택에 의해서 확인할 수 있다(예를 들어, 상기 선택성 마커 유전자가 통합된 세포는 생존할 것인 반면, 다른 세포는 죽을 것이다).
숙주 세포를 사용하는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 재조합 발현에 대한 대안으로서, 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 전사하고 번역할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 커플링된 전사/번역 시스템, 예를 들어 프로메가(Promega) TNT(등록상표), 또는 상기 전사 및 번역에 필요한 성분들을 포함하는 세포 용해물 또는 세포 추출물을 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다.
일단 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드가 생성되었으면, 이를 단백질의 단리 또는 정제에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해서, 예를 들어 크로마토그래피에 의해서(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 특정 항원 또는 상기 항원과 결합된 "태그"(예를 들어, HIS 태그, 스트렙 태그/스트렙 II 태그, 말토스 결합 단백질, 글루타치온 S-트랜스퍼라제 태그, myc 태그, HA 태그)에 대한 친화성에 의해서, 단백질 A에 의해서, 및 크로마토그래피(예를 들어, 크기분류 컬럼 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 역상 크로마토그래피, 시뮬레이션된 이동층 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 모놀리스 크로마토그래피, 대류 상호작용 매질 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피)에 의해서), 원심분리, 차별 용해도, 한외여과, 침전에 의해서, 또는 단백질의 단리 또는 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해서 단리하거나 정제할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 단리/정제된 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 가용성이다, 예를 들어 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 본 발명에 개시된 방법(예를 들어, 실시예 6을 참조하시오)을 사용하여 가용성으로 제조된다.
본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 생성 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기 폴리펩타이드가 생성되기에 적합한 배지에서 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유하는 숙주 세포를 배양함을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 상기 배지 또는 상기 숙주 세포로부터 상기 폴리펩타이드를 단리함을 추가로 포함한다.
4. 인플루엔자 바이러스 벡터
하나의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 함유하는 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 상기 인플루엔자 바이러스의 비리온내에 통합시킨다. 상기 인플루엔자 바이러스를, 상기 바이러스를 특정한 세포 유형, 예를 들어 면역 세포에 표적화하는 부분에 접합시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 인플루엔자 바이러스의 비리온은 상기 비리온내에 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드외에, 이종 폴리펩타이드를 통합시키거나 발현시킨다. 상기 이종 폴리펩타이드는, 면역강화 활성을 갖거나, 상기 인플루엔자 바이러스를 특정한 세포 유형에 대해, 예를 들어 특정한 세포 유형상의 항원에 결합하는 항체 또는 특정한 세포 유형상의 특정한 수용체와 결합하는 리간드에 대해 표적화하는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 인플루엔자 바이러스를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법들, 예를 들어 역 유전학 및 헬퍼-부재 플라스미드 구제를 사용하여 비리온의 생산 중에 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 인 트랜스(in trans) 공급함으로써 생성시킬 수 있다. 한편으로, 바이러스(여기에서 헤마글루티닌 기능은 인 트랜스 제공된다)에 의한 감염에 민감한 세포에서 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 모 인플루엔자 바이러스의 복제는 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 자손 인플루엔자 바이러스를 생성시킬 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 특정한 실시태양에서, 모 인플루엔자 바이러스의 게놈을, 자손 인플루엔자 바이러스에 의해 발현되는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하도록 조작한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 모 인플루엔자 바이러스의 게놈을, 발현되어 자손 인플루엔자 바이러스의 비리온 내로 통합되는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하도록 조작한다. 따라서, 상기 모 인플루엔자 바이러스의 복제로부터 생성되는 자손 인플루엔자 바이러스는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유한다. 상기 모 인플루엔자 바이러스의 비리온은, 인플루엔자 바이러스의 동일하거나 상이한 유형, 하위유형 또는 균주로부터의 줄기 또는 헤드 도메인을 함유하는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 상기 내에 통합시킬 수 있다. 한편으로, 상기 모 인플루엔자 바이러스의 비리온은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 활성 중 하나 이상(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 수용체 결합 및/또는 융합생성 활성)을 기능적으로 대체할 수 있는 부분을 상기 내에 통합시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 활성 중 하나 이상은, (i) (ii) 막관통 도메인에 융합된 인플루엔자 바이러스에 이종인 폴리펩타이드의 엑토도메인, 또는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질에 의해 제공된다. 특정한 실시태양에서, 상기 모 인플루엔자 바이러스의 비리온은 (i) (ii) 막관통 도메인에 융합된 인플루엔자 바이러스와 다른 감염원의 수용체 결합/융합생성 폴리펩타이드의 엑토도메인, 또는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 상기 내에 통합시킬 수 있다. 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 하나 이상의 활성을 제공하는 융합 단백질 및 상기와 같은 융합 단백질을 발현하도록 조작된 인플루엔자 바이러스의 생성 방법에 대한 설명에 대해서, 예를 들어 2007년 6월 7일자로 공개된 국제 특허 출원 공개 제 WO 2007/064802 호 및 미국특허 출원 공개 제 2012/0122185 호(이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하도록 조작된 인플루엔자 바이러스는, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인이 유래된 출처와 동일한 출처(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형)로부터의 것인 뉴라미니다제(NA) 또는 그의 단편을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하도록 조작된 인플루엔자 바이러스는, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인이 유래된 출처와 동일한 출처(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형)로부터의 것인 뉴라미니다제(NA) 또는 그의 단편을 포함하며, 여기에서 상기 구상 헤드 도메인은 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA1 및/또는 HA2 서브유닛의 줄기 도메인에 이종이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하도록 조작된 인플루엔자 바이러스는, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 HA 줄기 도메인이 유래된 출처와 동일한 출처(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형)로부터의 것인 뉴라미니다제(NA) 또는 그의 단편을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 모 인플루엔자 바이러스의 비리온은 이종 폴리펩타이드를 상기 비리온내에 통합시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 모 인플루엔자 바이러스의 게놈을, 자손 인플루엔자 바이러스에 의해 발현되는 이종 폴리펩타이드 및 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하도록 조작한다. 특정한 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 이종 폴리펩타이드, 또는 이들 모두를 상기 자손 인플루엔자 바이러스의 비리온내에 통합시킨다.
상기 이종 폴리펩타이드는 상기 인플루엔자 바이러스를 특정 세포 유형, 예를 들어 특정 세포 유형상의 항원을 인식하는 항체 또는 특정 세포 유형상의 특정 수용체와 결합하는 리간드에 대해 표적화하는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 표적화 폴리펩타이드는 상기 바이러스의 표적 세포 인식 기능을 대신한다. 특정한 실시태양에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 상기 인플루엔자 바이러스를, 인플루엔자 바이러스가 자연에서 감염시키는 동일한 세포 유형에 대해 표적화한다. 다른 특정한 실시태양에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 상기 자손 인플루엔자 바이러스를 면역 세포, 예를 들어 B 세포, T 세포, 대식세포 또는 수지상 세포에 대해 표적화한다. 일부 실시태양에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 항원 제공 세포, 예를 들어 수지상 세포의 세포-특이성 마커(예를 들어, CD44)를 인식하고 상기 마커에 결합한다. 하나의 실시태양에서, 상기 이종 폴리펩타이드는, 상기 바이러스를 수지상 세포에 표적화하는 DC-SIGN이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 상기 바이러스를 상기 인플루엔자 바이러스 비리온에 통합되도록 또 다른 폴리펩타이드로부터의 막관통 도메인과 융합될 수 있는 면역 세포에 표적화하는 항체(예를 들어, 단쇄 항체)이다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 CD20 항체, CD34 항체, 또는 DEC-205에 대한 항체이다. 표적화 기능을 갖는 폴리펩타이드를 발현하도록 바이러스를 조작하기 위한 기법들은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Yang et al., 2006, PNAS 103:11479-11484] 및 2008년 1월 24일자로 공개된 미국특허 출원 공개 제 20080019998 호 및 2007년 1월 25일자로 공개된 제 20070020238 호(이들 각각의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오.
또 다른 실시태양에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 바이러스 부착 단백질이다. 상기 태양에 사용될 수 있는 부착 단백질(들)을 갖는 바이러스의 비제한적인 예는 하기의 그룹 중에서 선택되는 바이러스이다: 레사 열 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 레트로바이러스, 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스, 진드기매개 뇌염 바이러스, 우두 바이러스, 헤르페스바이러스, 폴리오바이러스, 알파바이러스, 예를 들어 셈리키 포레스트 바이러스, 로스강 바이러스, 및 오러 바이러스(E1, E2 및 E3와 같은 표면 당단백질을 포함한다), 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 포말바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스.
하나의 실시태양에서, 플라비바이러스 표면 당단백질, 예를 들어 뎅기열 바이러스(DV) E 단백질을 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 알파바이러스 과로부터의 신드비스 바이러스 당단백질이 사용된다(문헌[K. S. Wang, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Strauss, J. Virol. 66, 4992 (1992)]). 몇몇 실시태양에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 NDV HN 또는 F 단백질; 인간 면역결핍 바이러스(HIV) gp160(또는 그의 산물, 예를 들어 gp41 또는 gp120); B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg); 헤르페스바이러스의 당단백질(예를 들어, gD, gE); 또는 폴리오바이러스의 VP1으로부터 유래된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 이종 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 임의의 비-바이러스 표적화 시스템으로부터 유래된다. 몇몇 실시태양에서, 세포내 세균 또는 원생동물과 같은 비바이러스성 병원체의 단백질이 사용된다. 일부 실시태양에서, 상기 세균성 폴리펩타이드는 예를 들어 클라미디아, 리켓차, 콕셀리아, 리스테리아, 브루셀라, 또는 레지오넬라에 의해 제공된다. 일부 실시태양에서, 원생동물 폴리펩타이드는 예를 들어 플라스모디아 종, 레이쉬마니아 스페시즈(Leishmania spp .), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii) 또는 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)에 의해 제공된다. 다른 예시적인 표적화 시스템은 문헌[Waehler et al ., 2007, "Engineering targeted viral vectors for gene therapy," Nature Reviews Genetics 8: 573-587](내용 전체가 본 발명에 인용된다)에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스에 의해 발현된 상기 이종 폴리펩타이드는 면역강화(면역 자극) 활성을 갖는다. 면역강화 폴리펩타이드의 비제한적인 예는 비제한적으로 자극 분자, 사이토킨, 케모킨, 항체 및 다른 작용제, 예를 들어 Flt-3 리간드를 포함한다. 면역강화 활성을 갖는 폴리펩타이드의 특정한 예는 인터페론 유형 1, 알파, 베타 또는 감마 인터페론, 콜로니 자극 인자, 예를 들어 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 종양 괴사 인자(TNF)-β, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 리간드(CD40L), 및 약물-유도성 CD40(iCD40)을 포함한다(예를 들어, 문헌[Hanks, B. A., et al . 2005. Nat Med 11:130-137](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오).
인플루엔자 A형 및 B형 바이러스의 게놈은 8개의 단일-가닥의 음성 센스 분절로 이루어지기 때문에(인플루엔자 C형 바이러스는 7개의 단일-가닥의 음성 센스 분절로 이루어진다), 모 인플루엔자 바이러스의 게놈을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법들, 예를 들어 역 유전학 및 헬퍼-부재 플라스미드 구제를 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(및 임의의 다른 폴리펩타이드, 예를 들어 이종 폴리펩타이드)를 발현하도록 조작할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 재조합 분절은 vRNA의 적합한 복제, 전사 및 패키징에 필요한 3' 및 5' 통합 신호뿐만 아니라 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다(문헌[Fujii et al ., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007]; 문헌[Zheng, et al ., 1996, Virology 217:242-251](이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다). 특정한 실시태양에서, 상기 재조합 분절은 상기 모 인플루엔자 바이러스와 상이하거나 동일한 유형, 하위유형 또는 균주로부터의 것들인 인플루엔자 바이러스의 분절의 3' 및 5' 비암호화 및/또는 비번역된 서열을 사용한다. 일부 실시태양에서, 상기 재조합 분절은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 3' 비암호화 영역, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 번역되지 않은 영역, 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 5' 비-암호화 영역을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 재조합 분절은 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 HA1 N-말단 줄기 분절, HA1 C-말단 줄기 분절, 구상 헤드 도메인, 및/또는 HA2로서 상기 인플루엔자 바이러스 유형, 하위유형 또는 균주와 동일한 유형, 하위유형 또는 균주인 인플루엔자 바이러스의 HA 분절의 3' 및 5' 비암호화 및/또는 번역되지 않은 서열을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 분절은 모 인플루엔자 바이러스의 HA 분절을 대체할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 분절은 상기 모 인플루엔자 바이러스의 NS1 유전자를 대체할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 분절은 상기 모 인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 대체할 수 있다. 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있는 예시적인 인플루엔자 바이러스 균주는 앤 아버/1/50, A/앤 아버/6/60, A/푸에르토리코/8/34, A/사우스 다코타/6/2007, A/우루과이/716/2007, A/캘리포니아/07/2009, A/퍼쓰/16/2009, A/브리즈번/59/2007, A/브리즈번/10/2007, A/레닌그라드/134/47/57, B/브리즈번/60/2008, B/야마가타/1/88, A/파나마/2007/99, A/와이오밍/3/03, 및 A/WSN/33을 포함한다.
일부 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 유전자 분절은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화한다. 특정한 실시태양에서, 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 유전자 분절 및 하나 이상의 다른 인플루엔자 바이러스 유전자 분절은, 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 유전자 분절 및 하나 이상의 다른 유전자 분절이 재조합 인플루엔자 바이러스의 복제 중에 함께 격리될 수 있게 하는 패키징 신호를 포함한다(문헌[Gao & Palese 2009, PNAS 106:15891-15896]; 국제 출원 공개 제 WO11/014645 호; 및 미국특허 출원 공개 제 2012/0244183 호를 참조하시오).
일부 실시태양에서, 모 인플루엔자 바이러스의 게놈을 이중시스트론성인 재조합 분절을 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작할 수 있다. 이중시스트론 기법은 다수 단백질의 암호화 서열을 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열의 사용을 통해 단일 mRNA로 조작될 수 있게 한다. IRES 서열은 상기 RNA 분자로의 리보솜의 내부 모집을 지시하며 캡(cap) 독립적인 방식으로 하류 번역을 허용한다. 간단히, 하나의 단백질의 암호화 영역을 제 2 단백질의 개방 판독 프레임(ORF)내에 삽입한다. 상기 삽입은 IRES 및 적합한 발현 및/또는 기능에 필요한 임의의 번역되지 않은 신호 서열에 인접한다. 상기 삽입은 상기 제 2 단백질의 ORF, 폴리아데닐화 또는 전사 프로모터를 파괴해서는 안 된다(예를 들어, 문헌[Garcia-Sastre et al ., 1994, J. Virol. 68:6254-6261] 및 문헌[Garcia-Sastre et al ., 1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246](이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오). 또한, 예를 들어 미국특허 제 6,887,699 호, 미국특허 제 6,001,534 호, 미국특허 제 5,854,037 호 및 미국특허 제 5,820,871 호(이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 당해 분야에 공지되거나 본 발명에 개시된 임의의 IRES를 본 발명에 따라 사용할 수 있다(예를 들어, BiP 유전자의 IRES, 진뱅크 데이터베이스 기재번호 HUMGRP78의 372 내지 592 뉴클레오타이드; 또는 뇌심근염 바이러스(EMCV)의 IRES, 진뱅크 데이터베이스 기재번호 CQ867238의 1430 내지 2115 뉴클레오타이드). 따라서, 몇몇 실시태양에서, 모 인플루엔자 바이러스를 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 및 또 다른 폴리펩타이드, 예를 들어 상기 모 인플루엔자 바이러스에 의해 발현된 유전자를 발현하는 이중시스트론성 RNA 분절을 함유하도록 조작한다. 일부 실시태양에서, 상기 모 인플루엔자 바이러스 유전자는 NA 유전자이다. 일부 실시태양에서, 상기 모 인플루엔자 바이러스 유전자는 NA 유전자이다. 일부 실시태양에서, 상기 모 인플루엔자 바이러스 유전자는 NS1 유전자이다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법들을 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 인플루엔자 바이러스 및 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 인플루엔자 바이러스를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 역 유전학 기법을 사용하여 상기와 같은 인플루엔자 바이러스를 생성시킬 수 있다. 간단히, 역 유전학 기법은 일반적으로, 바이러스성 폴리머라제에 의한 인식 및 성숙한 비리온의 생성에 필요한 패키징 신호에 필수적인 음성 가닥, 바이러스성 RNA의 비-암호화 영역을 함유하는 합성 재조합 바이러스성 RNA의 제조를 수반한다. 상기 재조합 RNA를 재조합 DNA 기법으로부터 합성하고 정제된 바이러스성 폴리머라제 복합체로 시험관내에서 재조성하여 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 재조합 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성시킨다. 상기 바이러스성 폴리머라제 단백질이 시험관내에서 또는 생체내에서 상기 합성 RNA의 전사 중에 존재하는 경우 보다 효율적인 형질감염이 성취된다. 상기 합성 재조합 RNP는 감염성 바이러스 입자내로 구제될 수 있다. 상기 기법들은 1992년 11월 24일자로 허여된 미국특허 제 5,166,057 호; 1998년 12월 29일자로 허여된 미국특허 제 5,854,037 호; 1996년 2월 20일자로 공개된 유럽 특허 출원 공개 EP 0702085A1; 미국특허 출원 제 09/152,845 호; 1997년 4월 3일자로 공개된 국제 특허 출원 공개 WO97/12032; 1996년 11월 7일자로 공개된 WO96/34625; 유럽 특허 출원 공개 EP A780475; 1999년 1월 21일자로 공개된 WO 99/02657; 1998년 11월 26일자로 공개된 WO 98/53078; 1998년 1월 22일자로 공개된 WO 98/02530; 1999년 4월 1일자로 공개된 WO 99/15672; 1998년 4월 2일자로 공개된 WO 98/13501; 1997년 2월 20일자로 공개된 WO 97/06270; 및 1997년 6월 25일자로 공개된 EPO 780 475A1에 개시되어 있으며, 이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
한편으로, 헬퍼-부재 플라스미드 기술을 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 인플루엔자 바이러스를 생성시킬 수 있다. 간단히, 바이러스 분절의 전장 cDNA를, 독특한 제한 부위들(이들은 PCR 산물이 플라스미드 벡터내에 삽입될 수 있게 한다)을 포함하는 프라이머들과 함께 PCR을 사용하여 증폭시킨다(문헌[Flandorfer et al., 2003, J. Virol. 77:9116-9123]; 문헌[Nakaya et al ., 2001, J. Virol. 75:11868-11873]; 이들 두 문헌은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다). 상기 플라스미드 벡터를 정확한 음성(vRNA 센스) 전사물이 발현되도록 설계한다. 예를 들어, 상기 플라스미드 벡터를, 정확한 음성(vRNA 센스) 전사물이 폴리머라제 I 프로모터로부터 생성되도록, 상기 PCR 산물이 절두된 인간 RNA 폴리머라제 I 프로모터와 간염 델타 바이러스 리보자임 서열 사이에 위치되게 설계할 수 있다. 각각의 바이러스 분절을 포함하는 분리된 플라스미드 벡터뿐만 아니라 필요한 바이러스 단백질을 포함하는 발현 벡터를 세포내로 형질감염시켜 재조합 바이러스 입자의 생성에 이르게 할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 필요한 바이러스 단백질을 암호화하는 바이러스 게놈 RNA 및 mRNA가 모두 발현되는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 헬퍼-부재 플라스미드 기술의 상세한 설명에 대해서, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 제 WO 01/04333; 미국특허 제 6,951,754 호, 미국특허 제 7,384,774 호, 미국특허 제 6,649,372 호, 및 미국특허 제 7,312,064 호; 문헌[Fodor et al ., 1999, J. Virol. 73:9679-9682]; 문헌[Quinlivan et al ., 2005, J. Virol. 79:8431-8439]; 문헌[Hoffmann et al ., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113]; 문헌[Neumann et al ., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350]; 문헌[Enami and Enami, 2000, J. Virol. 74(12):5556-5561]; 및 문헌[Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70(6):4188-4192](이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
본 발명에 개시된 인플루엔자 바이러스를 본 발명에 개시된 방법에 따라 사용이 허용되는 역가로 증식시키는 임의의 기질에서 번식시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 기질은 상기 바이러스를 상응하는 야생형 바이러스에 대해 측정된 역가에 필적하는 역가로 성장할 수 있게 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 기질은 상기 인플루엔자 바이러스 또는 상기 HA 기능이 유래된 바이러스에 생물학적으로 관련된 것이다. 특정한 실시태양에서, 예를 들어 NS1 유전자에서의 돌연변이에 의해 약독화된 인플루엔자 바이러스를 IFN-결핍 기질에서 번식시킬 수 있다. 예를 들어, 적합한 IFN-결핍 기질은 인터페론을 생산하거나 상기 인터페론에 응답하는 능력에 결함이 있는 것이거나, 인터페론-결핍 증식 환경을 필요로 할 수 있는 임의의 수의 바이러스의 증식에 사용될 수 있는 것이다. 예를 들어 2003년 6월 3일자로 허여된 미국특허 제 6,573,079 호, 2005년 2월 8일자로 허여된 미국특허 제 6,852,522 호, 및 2009년 2월 24일자로 허여된 미국특허 제 7,494,808 호(이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 특정한 실시태양에서, 상기 바이러스를 발육란(예를 들어, 계란)에서 번식시킨다. 특정한 실시태양에서, 상기 바이러스를 8일, 9일, 8 내지 10일, 10일, 11일, 10 내지 12일, 또는 12일된 발육란(예를 들어, 계란)에서 번식시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 바이러스를 MDCK 세포, 베로 세포, 293T 세포, 또는 당해 분야에 공지된 다른 세포주에서 번식시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 바이러스를 발육란으로부터 유래된 세포에서 번식시킨다.
본 발명에 개시된 인플루엔자 바이러스를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 방법에 의해 단리하고 정제시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 바이러스를 세포 배양물로부터 제거하고, 전형적으로는 널리 공지된 정화 과정, 예를 들어 구배 원심분리 및 정제 크로마토그래피에 의해서 세포 성분들로부터 분리시키고, 경우에 따라 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 과정, 예를 들어 플라크 분석을 사용하여 추가로 정제할 수도 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 상기 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 유전자 또는 게놈 분절은 인플루엔자 A형 바이러스로부터 수득되거나 유래된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 상기 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 유전자 또는 게놈 분절은 2개 이상의 인플루엔자 A형 바이러스 하위유형 또는 균주로부터 수득되거나 유래된다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 상기 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 유전자 또는 게놈 분절은 인플루엔자 B형 바이러스로부터 수득되거나 유래된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 상기 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 유전자 또는 게놈 분절은 2개 이상의 인플루엔자 B형 바이러스 하위유형 또는 균주로부터 수득되거나 유래된다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 상기 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 유전자 또는 게놈 분절은 인플루엔자 A형 및 B형 바이러스 하위유형 또는 균주의 조합으로부터 수득되거나 유래된다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 상기 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 유전자 또는 게놈 분절은 인플루엔자 C형 바이러스로부터 수득되거나 유래된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 상기 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 유전자 또는 게놈 분절은 2개 이상의 인플루엔자 C형 바이러스 하위유형 또는 균주로부터 수득되거나 유래된다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 상기 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 유전자 또는 게놈 분절은 인플루엔자 C형 바이러스 및 인플루엔자 A형 바이러스 및/또는 인플루엔자 B형 바이러스 하위유형 또는 균주의 조합으로부터 수득되거나 유래된다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 인플루엔자 바이러스는 약독화 표현형을 갖는다. 특정한 실시태양에서, 상기 약독화 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A형 바이러스를 기본으로 한다. 다른 실시태양에서, 상기 약독화 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B형 바이러스를 기본으로 한다. 더욱 다른 실시태양에서, 상기 약독화 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 C형 바이러스를 기본으로 한다. 다른 실시태양에서, 상기 약독화 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A형, 인플루엔자 B형 및/또는 인플루엔자 C형 바이러스의 하나 이상의 균주 또는 하위유형으로부터의 유전자 또는 게놈 분절을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 약독화 주쇄 바이러스는 인플루엔자 A형 바이러스 및 인플루엔자 B형 바이러스로부터의 유전자를 포함한다.
특정한 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스의 약독화는 상기 바이러스가 적어도 부분적으로 감염성으로 남아있고 생체내에서 복제가능하지만, 단지 낮은 역가로 발생하여 준임상 수준의 비-병원성 감염이 생성될 것을 요한다. 상기와 같은 약독화 바이러스는 상기 바이러스 또는 그의 면역원성 조합을 면역 반응을 유도하기 위해 대상에게 투여하는 본 발명에 개시된 실시태양에 특히 적합하다. 상기 인플루엔자 바이러스의 약독화를 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따라, 예를 들어 화학적 돌연변이유발에 의해 생성된 바이러스 변이체의 선택, 유전 공학에 의한 상기 게놈의 돌연변이, 약독화 기능을 갖는 분절을 함유하는 재조합 바이러스의 선택, 또는 조건 바이러스 변이체(예를 들어, 저온-적응 바이러스)의 선택에 따라 수행할 수 있다. 한편으로, 천연 약독화 인플루엔자 바이러스를 상기 인플루엔자 바이러스 벡터에 대한 인플루엔자 바이러스 주쇄로서 사용할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스를 적어도 부분적으로, 모 인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드로 대체함으로써 약독화시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스를 적어도 부분적으로, 상기 인플루엔자 바이러스를 세포 인터페론(IFN) 응답을 길항하는 상기 바이러스의 능력을 손상시키는 돌연변이된 NS1 유전자를 발현하도록 조작함으로써 약독화시킬 수도 있다. 상기 인플루엔자 바이러스에 NS1 유전자를 도입시킬 수 있는 돌연변이 유형의 예는 결실, 치환, 삽입 및 이들의 조합을 포함한다. 하나 이상의 돌연변이를 상기 NS1 유전자 전체를 통해 어디에나(예를 들어, N-말단, C-말단 또는 그 사이의 어딘가에) 및/또는 상기 NS1 유전자의 조절 요소에 도입시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 약독화 인플루엔자 바이러스는 NS1의 C-말단으로부터 5개, 바람직하게는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 또는 175개 아미노산 잔기로 이루어지는 결실, 또는 상기 C-말단으로부터 5 내지 170, 25 내지 170, 50 내지 170, 100 내지 170, 100 내지 160, 또는 105 내지 160개 아미노산 잔기의 결실을 생성시키는 인플루엔자 바이러스 NS1 유전자의 돌연변이를 갖는 게놈을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약독화 인플루엔자 바이러스는 아미노산 잔기 1 내지 130개, 아미노산 잔기 1 내지 126개, 아미노산 잔기 1 내지 120개, 아미노산 잔기 1 내지 115개, 아미노산 잔기 1 내지 110개, 아미노산 잔기 1 내지 100개, 아미노산 잔기 1 내지 99개, 아미노산 잔기 1 내지 95개, 아미노산 잔기 1 내지 85개, 아미노산 잔기 1 내지 83개, 아미노산 잔기 1 내지 80개, 아미노산 잔기 1 내지 75개, 아미노산 잔기 1 내지 73개, 아미노산 잔기 1 내지 70개, 아미노산 잔기 1 내지 65개, 또는 아미노산 잔기 1 내지 60개의 NS1 단백질을 암호화하도록 인플루엔자 바이러스 NS1 유전자 중에 돌연변이를 갖는 게놈을 포함하며, 여기에서 상기 N-말단 아미노산이 1번이다. NA1 돌연변이 및 돌연변이된 NS1을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 예에 대해서, 예를 들어 미국특허 제 6,468,544 호 및 미국특허 제 6,669,943 호; 및 문헌[Li et al., 1999, J. Infect. Dis. 179:1132-1138](이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
또 다른 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스를 적어도 부분적으로, 상기 문헌에 개시된 바와 같이 상기 바이러스의 NA 또는 M 유전자를 돌연변이시킴으로써 약독화시킬 수 있다.
5. 비-인플루엔자 바이러스 벡터
하나의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 함유하는 비-인플루엔자 바이러스를 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 상기 비-인플루엔자 바이러스의 비리온에 통합시킨다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 정제된(예를 들어, 플라크 정제된) 또는 단리된 바이러스에 의해 함유/발현된다. 상기 비-인플루엔자 바이러스를 특정 세포 유형, 예를 들어 면역 세포에 대해 상기 바이러스를 표적화하는 부분에 접합시킬 수도 있다. 일부 실시태양에서, 상기 비-인플루엔자 바이러스의 비리온은 상기 비리온내에 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 외에, 이종 폴리펩타이드를 통합시키거나 발현시킨다. 상기 이종 폴리펩타이드는, 면역강화 활성을 갖거나, 상기 비-인플루엔자 바이러스를 특정 세포 유형, 예를 들어 특정 세포 유형상의 항원을 인식하는 항체 또는 특정 세포 유형상의 특정 수용체와 결합하는 리간드에 대해 표적화하는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기와 같은 이종 폴리펩타이드의 예에 대해서 상기 섹션 4를 참조하시오.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유/발현하는 비-인플루엔자 바이러스를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 비-인플루엔자 바이러스를, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법을 사용하여 비리온의 생산 중에 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 인-트랜스 공급함으로써 생성시킬 수 있다. 한편으로, 바이러스(여기에서 헤마글루티닌 기능은 인-트랜스 제공된다)에 의한 감염에 민감한 세포에서 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 모 비-인플루엔자 바이러스의 복제는 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 자손 바이러스를 생성시킬 것이다.
비제한적으로 천연 균주, 변체 또는 변이체, 돌연변이된 바이러스, 재조합체 및/또는 유전자 변형된 바이러스를 포함한 임의의 바이러스 유형, 하위유형 또는 균주를 비-인플루엔자 바이러스 벡터로서 사용할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 모 비-인플루엔자 바이러스는 천연 바이러스가 아니다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 모 비-인플루엔자 바이러스는 유전자 조작된 바이러스이다. 몇몇 실시태양에서, 외피보유 바이러스가 본 발명에 개시된 막 결합된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현에 바람직하다.
예시적인 실시태양에서, 상기 비-인플루엔자 바이러스 벡터는 뉴캐슬병 바이러스(NDV)이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 비-인플루엔자 바이러스 벡터는 우두 바이러스이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 비-인플루엔자 바이러스 벡터는 바큘로바이러스(예를 들어, 백맘(BacMam)[인비트로젠])이다. 다른 예시적인, 비제한적인 실시태양에서, 상기 비-인플루엔자 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스(AAV), B형 간염 바이러스, 레트로바이러스(예를 들어, 감마레트로바이러스, 예를 들어 마우스 줄기 세포 바이러스(MSCV) 게놈 또는 쥐 백혁병 바이러스(MLV), 예를 들어 몰로니 쥐 백혈병 바이러스, 종양레트로바이러스, 또는 렌티바이러스), 알파바이러스(예를 들어, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스), 광견병바이러스(예를 들어, 소낭 체세포 바이러스(VSV) 또는 유두종바이러스), 폭스바이러스(예를 들어, 우두 바이러스, MVA-T7 벡터, 또는 계두), 메타뉴모바이러스, 홍역 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 헤르페스 단순 바이러스), 또는 포말바이러스이다. 예를 들어 문헌[Lawrie and Tumin, 1993, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109](레트로바이러스 벡터); 문헌[Bett et al ., 1993, J. Virol. 67, 5911](아데노바이러스 벡터); 문헌[Zhou et al ., 1994, J. Exp. Med. 179, 1867](아데노-관련된 바이러스 벡터); 문헌[Dubensky et al ., 1996, J. Virol. 70, 508-519](우두 바이러스 및 조류 폭스 바이러스를 포함한 폭스과로부터의 바이러스 벡터 및 알파 바이러스 속으로부터의 바이러스 벡터, 예를 들어 신드비스 및 셈리키 포레스트 바이러스로부터 유래된 것들); 미국특허 제 5,643,576 호(베네주엘라 말 뇌염 바이러스); WO 96/34625 (VSV); 문헌[Ohe et al ., 1995, Human Gene Therapy 6, 325-333]; 우(Woo) 등의 WO 94/12629; 문헌[Xiao & Brandsma, 1996, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622](유두종바이러스); 및 문헌[Bukreyev and Collins, 2008, Curr Opin Mol Ther. 10:46-55 (NDV)](이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
특정한 실시태양에서, 상기 비-인플루엔자 바이러스 벡터는 NDV이다. 임의의 NDV 유형, 하위유형 또는 균주는 비제한적으로 천연 균주, 변체 또는 변이체, 돌연변이된 바이러스, 재조합체 및/또는 유전자 조작된 바이러스를 포함하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 주쇄로서 작용할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 유전자 조작용 주쇄로서 작용하는 NDV는 천연 균주이다. 몇몇 실시태양에서, 유전자 조작용 주쇄로서 작용하는 NDV는 세포용해성 균주이다. 다른 실시태양에서, 유전자 조작용 주쇄로서 작용하는 NDV는 비-세포용해성 균주이다. 몇몇 실시태양에서, 유전자 조작용 주쇄로서 작용하는 NDV는 저병원성 균주이다. 일부 실시태양에서, 유전자 조작용 주쇄로서 작용하는 NDV는 중간병원성 균주이다. 다른 실시태양에서, 유전자 조작용 주쇄로서 작용하는 NDV는 고병원성 균주이다. NDV 균주의 구체적인 예는 비제한적으로 73-T 균주, 울스터(Ulster) 균주, MTH-68 균주, 이탈리엔(Italien) 균주, 히크맨(Hickman) 균주, PV701 균주, 히치너(Hitchner) B1 균주, 라 소타(La Sota) 균주, YG97 균주, MET95 균주, 및 F48E9 균주를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 유전자 조작용 주쇄로서 작용하는 NDV는 히치너 B1 균주이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 유전자 조작용 주쇄로서 작용하는 NDV는 라 소타 균주이다.
하나의 실시태양에서, 비-인플루엔자 바이러스 벡터용 주쇄로서 사용되는 NDV를 변형된 F 단백질을 발현하도록 조작하며, 여기에서 상기 F 단백질의 절단 부위를 하나 또는 2개의 잉여 아르기닌 잔기를 함유하는 것으로 교체하여 상기 돌연변이 절단 부위를 퓨린 과의 편재 발현된 프로케아제에 의해 활성화되게 한다. 상기와 같은 변형된 F 단백질을 발현하는 NDV의 구체적인 예는 비제한적으로 rNDV/F2aa 및 rNDV/F3aa를 포함한다. 돌연변이된 절단 부위를 갖는 변형된 F 단백질을 생성시키기 위해 NDV F 단백질내로 도입되는 돌연변이에 대한 설명에 대해서, 예를 들어 문헌[Park et al . (2006) "Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disease." PNAS USA 103: 8203-2808](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
하나의 실시태양에서, 상기 비-인플루엔자 바이러스 벡터는 폭스바이러스이다. 폭스바이러스 벡터는 폭스비리다에의 임의의 구성원, 특히 백신 벡터에 적합한 서열을 제공하는 우두 바이러스 또는 조류폭스 바이러스(예를 들어, 카나리아두, 계두 등)를 기본으로 할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 폭스바이러스 벡터는 우두 바이러스 벡터이다. 적합한 우두 바이러스는 비제한적으로 코펜하겐(VC-2) 균주(문헌[Goebel, et al ., Virol 179: 247-266, 1990]; 문헌[Johnson, et al ., Virol. 196: 381-401, 1993]), 변형된 코펜하겐 균주(NYVAC)(미국특허 제 6,265,189 호), WYETH 균주 및 변형된 앙카라(MVA) 균주(문헌[Antoine, et al ., Virol. 244: 365-396, 1998])를 포함한다. 다른 적합한 폭스바이러스는 바람직한 성질을 제공하고 매우 약독화된 계두 균주, 예를 들어 ALVAC 및 TROVAC 벡터, 예를 들어 ALVAC 및 TROVAC 벡터를 포함한다(예를 들어, 미국특허 제 6,265,189 호; 문헌[Tartaglia et al ., In AIDS Research Reviews, Koff, et al ., eds., Vol. 3, Marcel Dekker, N.Y., 1993]; 및 문헌[Tartaglia et al ., 1990, Reviews in Immunology 10: 13-30, 1990]을 참조하시오).
인플루엔자 폴리펩타이드를 발현하도록 비-인플루엔자 바이러스를 조작하는 방법은, 상기와 같은 바이러스의 약독화, 번식, 및 단리 및 정제 방법과 같이, 당해 분야에 널리 공지되어 있다. NDV 벡터에 대한 상기와 같은 기법에 대해서, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 제 WO 01/04333 호; 미국특허 제 7,442,379 호, 미국특허 제 6,146,642 호, 미국특허 제 6,649,372 호, 미국특허 제 6,544,785 호 및 미국특허 제 7,384,774 호; 문헌[Swayne et al . (2003). Avian Dis. 47:1047-1050]; 및 문헌[Swayne et al . (2001). J. Virol. 11868-11873](이들은 각각 내용 전체가 참고로 인용된다)을 참조하시오. 폭스바이러스에 대한 상기와 같은 기법에 대해서, 예를 들어 문헌[Piccini, et al ., Methods of Enzymology 153: 545-563, 1987]; 국제 특허 출원 공개 제 WO 96/11279 호; 미국특허 제 4,769,330 호; 미국특허 제 4,722,848 호; 미국특허 제 4,769,330 호; 미국특허 제 4,603,112 호; 미국특허 제 5,110,587 호; 미국특허 제 5,174,993 호; EP 83 286; EP 206 920; 문헌[Mayr et al ., Infection 3: 6-14, 1975]; 및 문헌[Sutter and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-10851, 1992]을 참조하시오. 몇몇 실시태양에서, 상기 비-인플루엔자 바이러스는 약독화된다.
특히 대상에게 투여하기 위한 조성물에 사용하기 위한 비-인플루엔자 바이러스 벡터의 선택에 대한 예시적인 고려사항은 상기 비-인플루엔자 바이러스 벡터에 의해 발현된 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 안전성, 낮은 독성, 안정성, 세포 유형 특이성, 및 면역원성, 특히 항원성이다.
6. 바이러스-유사 입자 및 비로솜
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 바이러스-유사 입자(VLP) 벡터, 예를 들어 정제/단리된 VLP에 통합시킬 수 있다. VLP는 일반적으로 바이러스의 구조 단백질(들)로부터 전형적으로 유래된 바이러스성 폴리펩타이드(들)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 VLP는 복제할 수 없다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VLP는 바이러스의 완전한 게놈이 없거나 바이러스의 게놈의 일부를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 VLP는 세포를 감염시킬 수 없다. 일부 실시태양에서, 상기 VLP는 그의 표면상에서 당해 분야의 숙련가들에게 공지되거나 본 발명에 개시된 바이러스(예를 들어, 바이러스 표면 당단백질) 및 비-바이러스(예를 들어, 항체 또는 단백질) 표적화 부분들 중 하나 이상을 발현한다. 일부 실시태양에서, 상기 VLP는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 및 바이러스 구조 단백질, 예를 들어 HIV gag를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 VLP는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 및 HIV gag 폴리펩타이드를 포함한다.
재조합적으로 생산된 VLP의 생성 및 특성화 방법은 여러 바이러스들, 예를 들어 인플루엔자 바이러스(문헌[Bright et al . (2007) Vaccine. 25:3871]), 인유두종 바이러스 유형 1(문헌[Hagnesee et al . (1991) J. Virol. 67:315]), 인유두종 바이러스 유형 16(문헌[Kirnbauer et al . Proc. Natl. Acad. Sci. (1992)89:12180]), HIV-1(문헌[Haffer et al ., (1990) J. Virol. 64:2653]), 및 A형 간염(문헌[Winokur (1991) 65:5029])(이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 인용된다)을 기본으로 개시되었다. NDV 단백질을 함유하는 VLP의 발현 방법은 문헌[Pantua et al . (2006) J. Virol. 80:11062-11073], 및 2009년 3월 12일자로 공개된 미국특허 출원 공개 제 20090068221 호(이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 인용된다)에 제공되어 있다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 VLP를 바큘로바이러스를 사용하여 생성시킨다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 VLP를 239T 세포를 사용하여 생성시킨다.
특정한 실시태양에서, VLP, 예를 들어 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 VLP를 세포(예를 들어, 293T 세포)에서 발현시킨다. 몇몇 실시태양에서, 상기 VLP를 시알산을 포함하는 표면 당단백질을 발현하는 세포에서 발현시킨다. 상기와 같은 실시태양에 따라, 상기 세포를 뉴라미니다제(예를 들어, 세균성 또는 바이러스성 뉴라미니다제)의 존재하에서 배양한다. 몇몇 실시태양에서, VLP, 예를 들어 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 VLP를 시알산을 포함하는 표면 당단백질을 발현하지 않는 세포에서 발현시킨다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 비로솜에 통합시킬 수도 있다. 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 비로솜을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 정제된 바이러스를 분쇄하고, 게놈을 추출하고, 상기 바이러스 단백질(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드) 및 지질을 갖는 입자를 재조립하여 바이러스성 단백질을 함유하는 지질 입자를 형성시킴으로써 비로솜을 생성시킬 수 있다.
7. 세균 벡터
특정한 실시태양에서, 세균을 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 발현하도록 조작할 수 있다. 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현에 적합한 세균은 비제한적으로 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 시겔라 스페시즈(Shigella sp.), 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 에스케리키아 콜라이(E. coli), 네이세리아 메닌지티데스(Neisseria meningitides), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 락토바실러스(Lactobacillus), 캄필로박터(Campylobacter), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 및 프란시셀라 튤라렌시스(Francisella tularensis)를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 세균을 약독화한다. 이종 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 세균의 생산 기법은 당해 분야에 공지되어 있으며 상기 기법을 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현에 적용할 수 있다. 예를 들어 2008년 10월 9일자로 공개된 미국특허 출원 공개 제 20080248066 호, 및 2007년 9월 6일자로 공개된 미국특허 출원 공개 제 20070207171 호(이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 사용된 세균 벡터는 N-결합된 글리코실화를 수행하는 능력을 갖는다, 예를 들어 상기와 같은 세균은 자연적으로 N-글리코실화 기구를 갖거나(예를 들어, 캄필로박터) 또는 N-글리코실화 기구를 갖도록 유전자 조작되었다.
8. 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 ( HA ) 폴리펩타이드에 대한 항체의 생성
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드), 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 본 발명에 개시된 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 사용하여 인플루엔자에 대한, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 줄기 영역에 대한 중화 항체를 이끌어낼 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 본 발명에 개시된 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 비-인간 대상(예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 기니피그 등)에게 투여하여, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법들(예를 들어, 면역친화성 크로마토그래피, 원심분리, 침전 등)을 사용하여 단리시킬 수 있는 항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 인간 항체를, 인간 항체를 생성시킬 수 있는 비-인간 대상(예를 들어, 트랜스제닉 마우스)를 사용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 기능성 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 랜덤하게 또는 동종 재조합에 의해 마우스 배아줄기세포에 도입시킬 수 있다. 한편으로, 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역을 상기 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에 마우스 배아줄기세포에 도입시킬 수 있다. 상기 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자를, 동종 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 동시에 또는 상기 도입과 별도로 비-기능성으로 만들 수 있다. 특히, JH 영역의 동종접합성 결실은 내인성 항체 생성을 방지한다. 상기 변형된 배아줄기세포를 확대시키고 배반포에 미세주입하여 키메릭 마우스를 생성시킨다. 이어서 상기 키메릭 마우스를 번식시켜 인간 항체를 발현하는 동종접합성 새끼를 생산한다. 상기 트랜스제닉 마우스에 의해 잠복된 인간 면역글로불린 트랜스유전자는 B 세포 분화 중에 재배열하고, 후속으로 종류변환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 상기와 같은 기법을 사용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 인간 항체 생성 기법의 개관에 대해서, 문헌[Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]을 참조하시오. 이러한 인간 항체 및 인간 단클론 항체의 생성을 위한 기술 및 상기와 같은 항체들의 생성을 위한 프로토콜에 대한 상세한 논의에 대해서, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제 0 598 877 호; 미국특허 제 5,413,923 호; 미국특허 제 5,625,126 호; 미국특허 제 5,633,425 호; 미국특허 제 5,569,825 호; 미국특허 제 5,661,016 호; 미국특허 제 5,545,806 호; 미국특허 제 5,814,318 호; 미국특허 제 5,885,793 호; 미국특허 제 5,916,771 호; 및 미국특허 제 5,939,598 호(이들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 아브제닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재), 젠팜(GenPharm)(미국 캘리포니아주 산호세 소재), 및 메다렉스 인코포레이티드(Medarex, Inc.)(미국 뉴저지주 프린스톤 소재)와 같은 회사들이, 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하기 위해 참가할 수 있다. 또한, 비-인간 대상에게, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 결합하는 인간 항체가 생성되도록 인간 말초 혈액 백혈구, 비장세포, 또는 골수(예를 들어, 트라이오마 테크닉스(Trioma Techniques) XTL)를 이식할 수도 있다.
한편으로, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 사용하여 항체 라이브러리로부터 항체를 선별할 수 있다. 예를 들어, 단리된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 고체 지지체(예를 들어, 실리카젤, 수지, 유도체화된 플라스틱 필름, 유리 비드, 면, 플라스틱 비드, 폴리스타이렌 비드, 알루미나젤, 또는 폴리사카라이드, 자기 비드)에 고정화시키고, 항체에의 결합에 대해 선별할 수 있다. 대안으로서, 상기 항체를 고체 지지체에 고정화시키고 상기 단리된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에의 결합에 대해 선별할 수 있다. 임의의 선별 분석, 예를 들어 패닝 분석, ELISA, 표면 플라스몬 공명, 또는 당해 분야에 공지된 다른 항체 선별 분석을 사용하여 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 선별할 수 있다. 상기 선별된 항체 라이브러리는 상업적으로 입수할 수 있는 항체 라이브러리, 시험관내 생성된 라이브러리, 또는 인플루엔자에 의해 감염된 개인으로부터 항체를 확인하고 클로닝 또는 단리함으로써 수득된 라이브러리일 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 항체 라이브러리는 인플루엔자 바이러스 창궐의 생존자로부터 생성된다. 항체 라이브러리를 당해 분야에 공지된 방법에 따라 생성시킬 수도 있다. 특정 실시태양에서, 상기 항체 라이브러리를, 상기 항체를 클로닝하고 상기 항체를 파지 디스플레이 라이브러리 또는 파지미드 디스플레이 라이브러리에 사용하여 생성시킨다.
본 발명에 개시된 방법에서 확인된 항체를, 당해 분야에 공지되거나 본 발명에 개시된 생물 분석을 사용하여 중화 활성 및 자기반응성의 결여에 대해 시험할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 비-인간 동물 또는 항체 라이브러리로부터 단리된 항체는 하나보다 많은 인플루엔자 하위유형으로부터 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 중화시킨다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터를 사용하여 유도되거나 확인된 항체는 인플루엔자 H3 바이러스를 중화시킨다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 사용하여 유도되거나 확인된 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 또는 그 이상의 인플루엔자 바이러스의 하위유형 또는 균주를 중화시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 중화 항체는 하나 이상의 인플루엔자 A형 바이러스 및 하나 이상의 인플루엔자 B형 바이러스를 중화시킨다. 특정 실시태양에서, 상기 중화 항체는 CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179(하이브리도마 FERM BP-4517에 의해 생성된; 타카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio, Inc.)(일본 시가현 오츠 소재)에 의해 판매되는 클론), 및/또는 AI3C(FERM BP-4516)와 같은 에피토프와 결합하지 않거나; 문헌[Ekiert DC et al . (2009) Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (published in Science Express February 26, 2009)]; 문헌[Kashyap et al . (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991]; 문헌[Sui et al . (2009) Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16: 265-273]; 미국특허 제 5,589,174 호, 미국특허 제 5,631,350 호, 미국특허 제 6,337,070 호, 및 미국특허 제 6,720,409 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2007/134237 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2007/068983 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2009/036157 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2008/075998 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2008/028946 호로서 공개된 국제 출원 제 WO PEC/EP2007/059356 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2009/079259 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2008/085876 호에 개시된 임의의 다른 항체가 아니다. 다른 실시태양에서, 상기 중화 항체는 문헌[Wang et al. (2010) "Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins," PLOS Pathogens 6(2):1-9]에 개시된 항체가 아니다. 특정 실시태양에서, 상기 중화 항체는 Ig VH1-69 분절을 사용하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 중화 항체와 상기 항원과의 상호작용은 오로지 중쇄에 의해서만 매개되는 것은 아니다.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 사용하여 확인되거나 유도된 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성 부분, 즉 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 상기 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 면역글로불린 분자일 수 있다. 항체는 비제한적으로 단클론 항체, 다중특이성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합된 Fv(sdFv), 및 항-유전형(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 유도되거나 확인된 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편을 포함한다.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 사용하여 유도되거나 확인된 항체를 진단 면역분석, 수동 면역치료법, 및 항유전형 항체의 생성에 사용할 수 있다. 수동 면역치료법에 사용되기 전에 항체를 변형시킬 수도 있다, 예를 들어 상기 항체를 키메라화 또는 인간화할 수 있다. 키메릭 및 인간화된 항체의 생성에 대한 리뷰를 위해서 예를 들어 미국특허 제 4,444,887 호 및 미국특허 제 4,716,111 호; 및 국제 특허 출원 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741(이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 또한, 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 중화시키는 상기 항체의 능력 및 상기 폴리펩타이드에 대한 상기 항체의 특이성을 상기 항체를 수동 면역치료법에 사용하기 전에 시험할 수도 있다.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 사용하여 유도되거나 확인된 항체를 사용하여 치료법의 효능 및/또는 질병 진행을 모니터할 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 면역분석 시스템, 예를 들어 몇 가지 언급하자면, 비제한적으로 방사성면역분석, ELISA(효소 결합된 면역흡수 분석), "샌드위치" 면역분석, 침강소 반응, 젤 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집반응 분석, 보체결합 분석, 면역방사성측정 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석 및 면역전기영동 분석과 같은 기법들을 사용하는 경쟁 및 비경쟁 분석 시스템을 상기 목적을 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 사용하여 유도되거나 확인된 항체를 항유전형 항체의 생성에 사용할 수 있다. 이어서 상기 항유전형 항체를 차례로, 인플루엔자의 특정 항원에 결합하는 항체의 아집단, 예를 들어 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 중화 에피토프를 생성시키기 위해 면역화에 사용할 수 있다(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373]; 문헌[Jerne et al ., 1982, EMBO J. 1:234]을 참조하시오). 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 상기와 같은 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 벡터를 사용하여 유도되거나 확인된 항체를 미모토프(mimotope)의 설계에 사용할 수 있다. 이어서 상기 미모토프를 차례로, 상기 미모토프에서 암호화된 인플루엔자의 특정 항원, 예를 들어 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 중화 에피토프에 결합하는 항체의 아집단을 생성시키기 위해 면역화에 사용할 수 있다(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373]; 문헌[Jerne et al ., 1982, EMBO J. 1:234]을 참조하시오).
9. 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 ( HA ) 폴리펩타이드에 의한 세포의 자극
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)로 생체외에서 세포를 자극하는 방법을 제공한다. 상기와 같은 세포, 예를 들어 수지상 세포를 시험관내에서 사용하여 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 항체를 생성시키거나, 예를 들어 당해 분야에 공지된 양자전이에 의해 상기 세포 자체를 대상에게 투여할 수도 있다. 입양전이 기법에 대한 설명에 대해서 예를 들어 2008년 1월 24일자로 공개된 미국특허 출원 공개 제 20080019998 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 몇몇 실시태양에서, 생체외에서 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포를 대상에게 투여할 때, 상기 세포는 포유동물 세포(예를 들어, CB-1 세포)가 아니다.
하나의 비제한적인 예에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 벡터, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 벡터를 사용하여, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하고 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대해 면역자극 성질을 나타내는 수지상 세포(DC)를 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 DC를 사용하여 기억 T 세포를 확대시킬 수 있으며 상기 세포는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드-특이성 세포독성 T 림프구 클론을 포함하여, T 세포의 효능 있는 자극인자이다. 문헌[Strobel et al ., 2000, Human Gene Therapy 11:2207-2218](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를, 상기 폴리펩타이드가 표적 세포, 예를 들어 DC와 접촉하고 상기 폴리펩타이드를 상기 표적 세포로 전달할 수 있게 하는 임의의 방식으로 상기 표적 세포로 전달할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 본 발명에 개시된 바와 같이 대상에게 전달한다. 일부 상기와 같은 실시태양에서, 상기 폴리펩타이드와 접촉한 세포를 단리하고 번식시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 시험관내에서 표적 세포로 전달한다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법을 사용하여 상기 폴리펩타이드를 표적 세포로 전달할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포를 조직 배양 플레이트, 튜브 또는 다른 용기 중에서 상기 폴리펩타이드와 접촉시킬 수 있다. 상기 폴리펩타이드를 배지 중에 현탁시키고 배양 플레이트, 튜브 또는 다른 용기의 웰에 가할 수 있다. 상기 폴리펩타이드를 함유하는 배지를 상기 세포의 도말 전에 또는 상기 세포를 도말한 후에 가할 수도 있다. 상기 표적 세포를 바람직하게는 상기 폴리펩타이드가 상기 세포와 접촉되기에 충분한 시간 동안 상기 폴리펩타이드와 배양한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 상기 폴리펩타이드와, 약 1 시간 이상, 약 5 시간 이상, 약 10 시간 이상, 약 12 시간 이상, 약 16 시간 이상, 약 24 시간 이상, 약 48 시간 이상, 약 1 시간 내지 약 12 시간, 약 3 시간 내지 약 6 시간, 약 6 시간 내지 약 12 시간, 약 12 시간 내지 약 24 시간, 또는 약 24 시간 내지 약 48 시간 동안 배양한다. 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드가 바이러스 중에 있는 몇몇 실시태양에서, 상기 표적 세포의 접촉은 상기 세포를 상기 바이러스로 감염시킴을 포함한다.
상기 표적 세포는 임의의 종, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 기니피그로부터의 것일 수 있다. 일부 실시태양에서, 표적 세포는 건강한 대상 또는 치료가 필요한 대상로부터 수득된 DC이다. 몇몇 실시태양에서, 표적 세포는 상기 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 자극하는 것이 바람직한 대상로부터 수득된 DC이다. 대상로부터 세포를 수득하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
10. 조성물
본 발명에 개시된 핵산, 벡터, 폴리펩타이드, 세균, 항체 및/또는 세포(본 발명에서 때때로 "활성 화합물"이라 칭한다)를 조성물에 통합시킬 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 조성물은 약학 조성물, 예를 들어 면역원성 조성물(예를 들어, 백신 제형)이다. 본 발명에 제공된 약학 조성물은 상기 조성물을 대상에게 투여할 수 있게 하는 임의의 형태일 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 가축 및/또는 인간 투여에 적합하다. 상기 조성물을 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 또는 치료 방법에 사용할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인프루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다. 또 다른 실시태양에서 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인프루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 암호화하는 핵산을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인프루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인프루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 함유하는 인플루엔자 바이러스 또는 비-인플루엔자 바이러스를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인프루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 발현하도록 조작된 게놈을 갖는 인플루엔자 바이러스 또는 비-인플루엔자 바이러스를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인프루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 함유하는 바이러스-유사 입자 또는 비로솜을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 5.1에 개시된 키메릭 인프루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 발현하는 세균 또는 발현하도록 조작된 세균을 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 키메릭 인프루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)로 자극된 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다.
일부 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 사용하는 치료법 외에 하나 이상의 다른 치료법들을 포함할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한"이란 용어는 동물, 및 보다 특히 인간에의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전들에 나열됨을 의미한다. "담체"란 용어는 상기 약학 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 또한, 특히 주사성 용액에 대한 액체 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카젤, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 적합한 약학 담체의 예들이 문헌[E.W. Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 개시되어 있다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
특정한 실시태양에서, 약학 조성물을 대상에 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화한다. 예를 들어, 상기 약학 조성물을 비경구, 경구, 피내, 경피, 결장직장, 복강내, 및 직장 투여에 적합하도록 제형화할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 정맥내, 경구, 복강내, 비내, 기관지내, 피하, 근육내, 국소, 피내, 경피 또는 폐 투여를 위해 제형화할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 비내 투여를 위해 제형화한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 근육내 투여를 위해 제형화한다.
몇몇 실시태양에서, 생분해성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리에틸렌 글리콜(PEG화), 폴리메틸 메트아크릴레이트 중합체, 폴리락타이드, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터, 및 폴리락트산을 담체로서 사용할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 활성 화합물을, 신체로부터의 빠른 제거에 대한 상기 화합물의 보호를 증가시키는 담체와 함께 제조한다, 예를 들어 임플란트 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 조절된 방출 제형. 상기와 같은 제형의 제조 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 리포솜 또는 마이셀을 또한 약학적으로 허용 가능한 담체로서 사용할 수 있다. 이들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어 미국특허 제 4,522,811 호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 항원보강제를 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 1가 제형, 예를 들어 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 본 발명에 개시된 cHB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 또는 본 발명에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 1가 제형이다.
다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 면역원성 조성물은 다가 제형, 예를 들어 2가 및 3가 제형이다. 일례로, 다가 제형은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하는 하나 초과의 벡터를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 다가 제형은 단일 벡터를 사용하여 발현된 하나 이상의 상이한 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 다가 제형은 상이한 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하며, 여기에서 각각의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인 및 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 상기 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 상이한 인플루엔자 바이러스 균주, 하위유형 또는 그룹들로부터의 것일 수 있다. 예를 들어 2가 제형은 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인 및 2개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 또 다른 예에서, 3가 제형은 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인 및 3개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 2가 백신 제형은 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 조합; 또는 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 조합을 포함할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 3가 백신 제형은 (i) 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH5/B, cH7/B 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 어느 하나의 조합; 또는 (ii) 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 본 발명에 개시된 cH5/B, cH7/B 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 중 어느 하나의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서 2가 또는 3가 백신 제형은 본 발명에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 보존제, 예를 들어 수은 유도체 티메로살을 추가로 포함한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 0.001% 내지 0.01% 티메로살을 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 보존제를 포함하지 않는다. 특정한 실시태양에서, 티메로살을 본 발명에 개시된 약학 조성물의 제조 중에 사용하며 상기 티메로살을 상기 약학 조성물의 제조에 이은 정제 단계를 통해 제거한다, 즉 상기 약학 조성물은 미량의 티메로살을 함유한다(정제후 용량당 <0.3 ㎍의 수은; 상기와 같은 약학 조성물은 무-티메로살 제품으로 간주된다).
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 난 단백질(예를 들어, 오브알부민 또는 다른 난 단백질)을 추가로 포함한다. 본 발명에 개시된 약학 조성물 중의 난 단백질의 양은 1 ㎖의 약학 조성물에 대해 약 0.0005 내지 약 1.2 ㎍의 난 단백질의 범위일 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 난 단백질을 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 하나 이상의 항균제(예를 들어, 항생제), 예를 들어 비제한적으로 젠타마이신, 네오마이신, 폴리믹신(예를 들어, 폴리믹신 B), 및 가나마이신, 스트렙토마이신을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 임의의 항생제를 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 바이러스를 불활성화시키는데 사용되는 하나 이상의 성분, 예를 들어 포르말린 또는 폼알데하이드 또는 세제, 예를 들어 나트륨 데옥시콜레이트, 옥톡시놀 9(트리톤 X-100) 및 옥톡시놀 10을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 바이러스를 불활성화시키는데 사용되는 임의의 성분을 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 젤라틴을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 젤라틴을 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 하나 이상의 완충제, 예를 들어 포스페이트 완충제 및 슈크로스 포스페이트 글루타메이트 완충제를 추가로 포함하지 않는다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 완충제를 포함하지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 하나 이상의 염, 예를 들어 염화 나트륨, 염화 칼슘, 나트륨 포스페이트, 일나트륨 글루타메이트, 및 알루미늄염(예를 들어, 수산화 알루미늄, 알루미늄 포스페이트, 알룸(칼륨 알루미늄 설페이트) 또는 상기와 같은 알루미늄염의 혼합물)을 추가로 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 염을 포함하지 않는다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물은 저-부가 인플루엔자 바이러스 백신이다, 즉 상기 약학 조성물은 인플루엔자 바이러스 백신에서 통상적으로 발견되는 하나 이상의 첨가제를 포함하지 않는다. 저-부가 인플루엔자 백신들이 개시되었다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 09/001217 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/IB2008/002238 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오).
본 발명에 개시된 약학 조성물을 투여 설명서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서 중에 포함시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 약학 조성물을 사용 전에 보관할 수 있다, 예를 들어 상기 약학 조성물을 동결 보관하거나(예를 들어, 약 -20 ℃ 또는 약 -70 ℃); 냉장 조건에서 보관하거나(예를 들어, 약 4 ℃); 또는 실온에서 보관할 수 있다(인플루엔자 백신을 포함하는 조성물을 냉장없이 보관하는 방법에 대해서, 국제 특허 출원 공개 제 WO 07/110776 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/IB2007/001149 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오).
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물 중의 활성 화합물이 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 세포인 경우, 상기 약학 조성물 중의 상기 세포는 포유동물 세포(예를 들어, CB-1 세포)가 아니다.
10.1. 서브유닛 백신
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 서브유닛 백신을 제공한다. 일부 실시태양에서, 서브유닛 백신은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 및 하나 이상의 표면 당단백질(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제), 다른 표적화 부분, 또는 항원보강제를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 서브유닛 백신은 단일의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 실시태양에서, 서브유닛 백신은 2, 3, 4 또는 그 이상의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 서브유닛 백신에 사용된 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 막-결합되지 않는다, 즉 가용성이다.
본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 유효량의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 또는 150 ㎍의 하나 이상의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 약 5 내지 10 ㎍, 10 내지 20 ㎍, 20 내지 30 ㎍, 30 내지 40 ㎍, 40 내지 50 ㎍, 50 내지 60 ㎍, 60 내지 70 ㎍, 70 내지 80 ㎍, 80 내지 90 ㎍, 90 내지 100 ㎍, 100 내지 110 ㎍, 110 내지 120 ㎍, 120 내지 130 ㎍, 130 내지 140 ㎍, 또는 140 내지 150 ㎍의 하나 이상의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 1가 서브유닛 백신은 7.5 ㎍ 내지 90 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 2가 서브유닛 백신은 7.5 ㎍ 내지 90 ㎍의 본 발명에 개시된 제 1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 및 7.5 ㎍ 내지 90 ㎍의 본 발명에 개시된 제 2 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 3가 서브유닛 백신은 7.5 ㎍ 내지 90 ㎍의 본 발명에 개시된 제 1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 7.5 ㎍ 내지 90 ㎍의 본 발명에 개시된 제 2 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 및 7.5 ㎍ 내지 90 ㎍의 본 발명에 개시된 제 3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 용량당 약 10 ㎍ 내지 약 60 ㎍의 하나 이상의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 약 0.001% 내지 0.01%의 티메로살, 약 0.1 ㎍ 내지 약 1.0 ㎍의 계란 단백질, 약 1.0 ㎍ 내지 약 5.0 ㎍의 폴리믹신, 약 1.0 ㎍ 내지 약 5.0 ㎍의 네오마이신, 약 0.1 ㎍ 내지 약 0.5 ㎍의 베타프로피오락톤, 및 약 .001 내지 약 .05% w/v의 노닐페놀 에톡실레이트를 포함하는 서브유닛 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 45 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, ≤1.0 ㎍의 수은(티메로살로부터), ≤1.0 ㎍의 계란 단백질(즉, 오브알부민), ≤3.75 ㎍의 폴리믹신, 및 ≤2.5 ㎍의 네오마이신을 포함하는 0.5 ㎖ 용량을 포함하거나 상기 용량으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 용량당 0.5 ㎍ 이하의 베타프로피오락톤, 및 0.015% w/v 이하의 노닐페놀 에톡실레이트를 추가로 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 0.5 ㎖ 용량 서브유닛 백신을 사전-충전 주사기에 패키징한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 45 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 25.0 ㎍의 수은(티메로살로부터), ≤1.0 ㎍의 계란 단백질(즉, 오브알부민), ≤3.75 ㎍의 폴리믹신, 및 ≤2.5 ㎍의 네오마이신을 포함하는 5.0 ㎖ 수회용량 바이알(용량당 0.5 ㎖)로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 용량당 0.5 ㎍ 이하의 베타프로피오락톤, 및 0.015% w/v 이하의 노닐페놀 에톡실레이트를 추가로 포함하거나 이로 이루어진다.
특정한 실시태양에서, 발육계란에서 번식된 인플루엔자 바이러스를 사용하여 상기 서브유닛 백신을 제조한다(즉, 상기 서브유닛 백신의 성분들(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)을 발육계란에서 번식된 바이러스로부터 단리시킨다). 또 다른 특정한 실시태양에서, 발육계란에서 번식되지 않은 인플루엔자 바이러스를 사용하여 상기 서브유닛 백신을 제조한다(즉, 상기 서브유닛 백신의 성분들(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)을 발육계란에서 번식되지 않은 바이러스로부터 단리시킨다). 또 다른 특정한 실시태양에서, 포유동물 세포, 예를 들어 불멸화된 인간 세포(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 07/045674 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/EP2006/067566 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 개 신장 세포, 예를 들어 MDCK 세포(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 08/032219 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/IB2007/003536 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 베로 세포, PerC.6 세포, 또는 오리 세포, 예를 들어 EB66 세포에서 번식된 인플루엔자 바이러스를 사용하여 상기 서브유닛 백신을 제조한다(즉, 상기 서브유닛 백신의 성분들(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)을 포유동물 세포에서 번식된 바이러스로부터 단리시킨다). 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 상기 서브유닛 백신 중의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 식물 벡터 또는 세균 벡터를 사용하여 제조한다(즉, 상기 서브유닛 백신 중의 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현 벡터로부터 수득하고/단리시킨다).
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 1가 서브유닛 백신을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 1가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 1가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 1가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 1가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH7/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 1가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 B/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 1가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 포함하는 1가 서브유닛 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공하며, 여기에서 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 인플루엔자 바이러스로부터 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하고 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 각각 2개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 2개의 상이한 인플루엔자 균주, 하위유형, 또는 그룹으로부터의 것이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 cH4/3 키메릭 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 서브유닛 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 서브유닛 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 서브유닛 백신을 제공하며, 여기에서 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 인플루엔자 바이러스로부터의 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하고, 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 각각 3개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 3개의 상이한 인플루엔자 바이러스 균주, 하위유형, 또는 그룹으로부터의 것이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 서브유닛 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 서브유닛 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 서브유닛 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 3가 서브유닛 백신은 본 발명에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 A/베트남/1203/2004(H5)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하는 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 서브유닛 백신은 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하는 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
10.2. 생 바이러스 백신
하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 생 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(조성물이 투여된 대상에서 생산되는 자손 바이러스에 의해 발현된다)를 암호화하도록 조작된 생 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 막-결합된다. 다른 특정한 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 막-결합되지 않는다, 즉 상기 폴리펩타이드는 가용성이다. 특정한 실시태양에서, 상기 생 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다, 예를 들어 상기 섹션 4에 개시된 바와 같다. 특정한 실시태양에서, 상기 생 바이러스는 비-인플루엔자 바이러스이다, 예를 들어 상기 섹션 5에 개시된 바와 같다. 다른 실시태양에서, 상기 생 바이러스는 약독화된다. 일부 실시태양에서, 면역원성 조성물은 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하거나 상기 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 2, 3, 4 또는 그 이상의 생 바이러스를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 용량당, 약 105 내지 약 1010 형광 초점 단위(FFU)의, 하나 이상의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 생 약독화 인플루엔자 바이러스, 약 0.1 내지 약 0.5 ㎎의 일나트륨 글루타메이트, 약 1.0 내지 약 5.0 ㎎의 가수분해된 돼지 젤라틴, 약 1.0 내지 약 5.0 ㎎의 아르기닌, 약 10 내지 약 15 ㎎의 슈크로스, 약 1.0 내지 약 5.0 ㎎의 이염기성 칼륨 포스페이트, 약 0.5 내지 약 2.0 ㎎의 일염기성 칼륨 포스페이트, 및 약 0.001 내지 약 0.05 ㎍/㎖의 젠타마이신 설페이트를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 단일의 0.2 ㎖ 용량들을 함유하는 사전-충전된 분무기로서 패키징한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 용량당, 약 106.5 내지 약 107.5 FFU의, 하나 이상의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 생 약독화 인플루엔자 바이러스, 0.188 ㎎의 일나트륨 글루타메이트, 2.0 ㎎의 가수분해된 돼지 젤라틴, 2.42 ㎎의 아르기닌, 13.68 ㎎의 슈크로스, 2.26 ㎎의 이염기성 칼륨 포스페이트, 0.96 ㎎의 일염기성 칼륨 포스페이트, 및 <0.015 ㎍/㎖의 젠타마이신 설페이트를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 단일의 0.2 ㎖ 용량들을 함유하는 사전-충전된 분무기로서 패키징한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 생 바이러스를 본 발명에 개시된 면역원성 조성물에 사용하기 전에 발육계란에서 번식시킨다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 생 바이러스를 본 발명에 개시된 면역원성 조성물에 사용하기 전에 발육계란에서 번식시키지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 생 바이러스를 본 발명에 개시된 면역원성 조성물에 사용하기 전에 포유동물 세포, 예를 들어 불멸화된 인간 세포(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 07/045674 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/EP2006/067566 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 개 신장 세포, 예를 들어 MDCK 세포(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 08/032219 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/IB2007/003536 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 베로 세포, PerC.6 세포, 또는 오리 세포, 예를 들어 EB66 세포에서 번식시킨다.
대상에게 투여하기 위한 생 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물이, 상기 대상에서 상기 바이러스의 증식이 자연 감염에서 발생하는 경우와 유사한 종류 및 크기의 연장된 자극을 도출할 수 있고 따라서 실질적이고, 오래 지속되는 면역성을 부여할 수 있기 때문에, 바람직할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 1가 생 바이러스 백신을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH7/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 B/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 생 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공하며, 여기에서 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 인플루엔자 바이러스로부터 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하고 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 각각 2개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 2개의 상이한 인플루엔자 균주, 하위유형, 또는 그룹으로부터의 것이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 생 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 생 바이러스 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 생 바이러스 백신을 제공하며, 여기에서 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 인플루엔자 바이러스로부터의 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하고, 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 각각 3개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 3개의 상이한 인플루엔자 균주, 하위유형, 또는 그룹으로부터의 것이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 생 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 생 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 생 바이러스 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 3가 생 바이러스 백신은 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함한다.
특정한 실시태양에서, 생 바이러스 백신의 부분인 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 상기 생 바이러스의 표면(예를 들어, 상기 생 인플루엔자 바이러스의 표면)상에서 발견되고/되거나 발현된다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 생 바이러스 백신은 A/베트남/1203/2004(H5)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 생 바이러스 백신은 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하는 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 생 바이러스 백신은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 생 바이러스 백신은 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하는 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다.
10.3. 불활성화된 바이러스 백신
하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 불활성화된 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 막-결합된다. 특정한 실시태양에서, 상기 불활성화된 바이러스는 상기 섹션 4에 개시된 바와 같은 인플루엔자 바이러스이다. 다른 실시태양에서, 상기 불활성화된 바이러스는 상기 섹션 5에 개시된 바와 같은 비-인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시태양에서, 면역원성 조성물은 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 2, 3, 4 또는 그 이상의 불활성화된 바이러스를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 불활성화된 바이러스 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원보강제를 포함한다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법을 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. 통상적인 방법은 불활성화를 위해 포르말린, 열 또는 세제를 사용한다. 예를 들어 미국특허 제 6,635,246 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 다른 방법은 미국특허 제 5,891,705 호; 미국특허 제 5,106,619 호 및 미국특허 제 4,693,981 호(이들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 것들을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)의 각 용량이 약 7.5 ㎍ 내지 90 ㎍, 또는 약 15 내지 약 60 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 약 1.0 내지 약 5.0 ㎎의 염화 나트륨, 약 20 내지 약 100 ㎍의 일염기성 나트륨 포스페이트, 약 100 내지 약 500 ㎍의 이염기성 나트륨 포스페이트, 약 5 내지 약 30 ㎍의 일염기성 칼륨 포스페이트, 약 5 내지 약 30 ㎍의 염화 칼륨, 및 약 0.5 내지 약 3.0 ㎍의 염화 칼슘을 포함하도록 하는 상기 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 단일의 0.25 ㎖ 또는 단일의 0.5 ㎖ 용량으로서 패키징한다. 다른 실시태양에서, 상기 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 수회 용량 제형으로서 패키징한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)의 각 용량이 용량당 약 7.5 ㎍ 내지 90 ㎍, 또는 약 15 내지 약 60 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 약 0.001% 내지 0.01%의 티메로살, 약 1.0 내지 약 5.0 ㎎의 염화 나트륨, 약 20 내지 약 100 ㎍의 일염기성 나트륨 포스페이트, 약 100 내지 약 500 ㎍의 이염기성 나트륨 포스페이트, 약 5 내지 약 30 ㎍의 일염기성 칼륨 포스페이트, 약 5 내지 약 30 ㎍의 염화 칼륨, 및 약 0.5 내지 약 3.0 ㎍의 염화 칼슘을 포함하도록 하는 상기 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 단일의 0.25 ㎖ 또는 단일의 0.5 ㎖ 용량으로서 패키징한다. 다른 실시태양에서, 상기 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)을 수회 용량 제형으로서 패키징한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 단일의 0.25 ㎖의 용량으로서 패키징되며 용량당 22.5 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 2.05 ㎎의 염화 나트륨, 40 ㎍의 일염기성 나트륨 포스페이트, 150 ㎍의 이염기성 나트륨 포스페이트, 10 ㎍의 일염기성 칼륨 포스페이트, 10 ㎍의 염화 칼륨, 및 0.75 ㎍의 염화 칼슘을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 단일의 0.5 ㎖의 용량으로서 패키징되며 용량당 45 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 4.1 ㎎의 염화 나트륨, 80 ㎍의 일염기성 나트륨 포스페이트, 300 ㎍의 이염기성 나트륨 포스페이트, 20 ㎍의 일염기성 칼륨 포스페이트, 20 ㎍의 염화 칼륨, 및 1.5 ㎍의 염화 칼슘을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)은 5.0 ㎖의 백신(용량당 0.5 ㎖)을 포함하거나 상기 백신으로 이루어지는 수회 용량 제형으로서 패키징되며 용량당 24.5 ㎍의 수은(티메로살로부터), 45 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 4.1 ㎎의 염화 나트륨, 80 ㎍의 일염기성 나트륨 포스페이트, 300 ㎍의 이염기성 나트륨 포스페이트, 20 ㎍의 일염기성 칼륨 포스페이트, 20 ㎍의 염화 칼륨, 및 1.5 ㎍의 염화 칼슘을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 불활성화된 바이러스를 그의 불활성화 전에 발육계란에서 번식시키고 후속으로 본 발명에 개시된 면역원성 조성물에 사용한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 불활성화된 바이러스를 그의 불활성화 전에 발육계란에서 번식시키지 않고 후속으로 본 발명에 개시된 면역원성 조성물에 사용한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하는 불활성화된 바이러스를 그의 불활성화 전에 포유동물 세포, 예를 들어 불멸화된 인간 세포(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 07/045674 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/EP2006/067566 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 개 신장 세포, 예를 들어 MDCK 세포(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 08/032219 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/IB2007/003536 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 베로 세포, PerC.6 세포, 또는 오리 세포, 예를 들어 EB66 세포에서 번식시키고 후속으로 본 발명에 개시된 면역원성 조성물에 사용한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 1가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH7/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 B/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공하며, 여기에서 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 인플루엔자 바이러스로부터 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하고 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 각각 2개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 2개의 상이한 인플루엔자 균주, 하위유형, 또는 그룹으로부터의 것이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공하며, 여기에서 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 인플루엔자 바이러스로부터의 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하고, 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 각각 3개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 3개의 상이한 인플루엔자 균주, 하위유형, 또는 그룹으로부터의 것이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 불활성화된 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 불활성화된 바이러스 백신의 부분인 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 상기 불활성화된 바이러스의 표면(예를 들어, 상기 불활성화된 인플루엔자 바이러스의 표면)상에서 발견되고/되거나 발현된다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 불활성화된 바이러스 백신은 A/베트남/1203/2004(H5)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 불활성화된 바이러스 백신은 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하는 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 불활성화된 바이러스 백신은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 불활성화된 바이러스 백신은 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하는 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다.
10.4. 분할 바이러스 백신
하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물은 분할 바이러스 백신이다. 일부 실시태양에서, 분할 바이러스 백신은 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 막-결합된다/되었다. 몇몇 실시태양에서, 상기 분할 바이러스 백신은 하나 이상의 항원보강제를 포함한다.
분할 바이러스 백신의 생성 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 비제한적인 예로서, 인플루엔자 바이러스 분할 백신을 세제에 의해 붕괴된 불활성화된 입자를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 개시된 방법에 따라 사용하기에 적합할 수 있는 분할 바이러스 백신의 일례는 발육계란에서 번식된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된 멸균 현탁액으로서 제형화되는, 근육내 사용을 위한 플루존(fluzone)(등록상표), 인플루엔자 바이러스 백신(조날 퓨리파이드, 서브비리온(Zonal Purified, Subvirion)이다. 상기 바이러스-함유 유체를 수확하고 포름알데하이드로 불활성화시킨다. 인플루엔자 바이러스를 농축시키고 연속적인 유동 원심분리기를 사용하여 선형 슈크로스 밀도 구배 용액에서 정제시킨다. 이어서 상기 바이러스를 "분할 바이러스"를 생성시키는 비이온성 계면활성제, 옥톡시놀-9(유니온 카바이드 캄파니(Union Carbide, Co.)의 트리톤(Triton)(등록상표) X-100(등록상표))를 사용하여 화학적으로 붕괴시킨다. 이어서 상기 분할 바이러스를 화학적 수단에 의해 추가로 정제하고 나트륨 포스페이트-완충된 등장성 염화 나트륨 용액에 현탁시킨다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 약 7.5 ㎍ 내지 약 90 ㎍, 또는 10 ㎍ 내지 약 60 ㎍의 하나 이상의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 약 0.01 내지 약 1.0 ㎎의 옥톡시놀-10(트리톤 X-100(등록상표)), 약 0.5 내지 0.5 ㎎의 α-토코페릴 수소 숙시네이트, 약 0.1 내지 1.0 ㎎의 폴리솔베이트 80(트윈 80), 약 0.001 내지 약 0.003 ㎍의 하이드로코르티손, 약 0.05 내지 약 0.3 ㎍의 젠타마이신 설페이트, 약 0.5 내지 약 2.0 ㎍의 계란 단백질(오브알부민), 약 25 내지 75 ㎍의 포름알데하이드, 및 약 25 내지 75 ㎍의 나트륨 데옥시콜레이트를 포함하는 분할 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에서 제공된 분할 바이러스 백신은 45 ㎍의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, ≤0.085 ㎎의 옥톡시놀-10(트리톤 X-100(등록상표)), ≤0.1 ㎎의 α-토코페릴 수소 숙시네이트, ≤.415 ㎎의 폴리솔베이트 80(트윈 80), ≤0.0016 ㎍의 하이드로코르티손, ≤0.15 ㎍의 젠타마이신 설페이트, ≤1.0 계란 단백질(오브알부민), ≤50 ㎍의 포름알데하이드, 및 ≤50 ㎍의 나트륨 데옥시콜레이트를 포함하는 0.5 ㎖ 용량을 포함하거나 상기 용량으로 이루어진다. 일부 실시태양에서, 상기 0.5 ㎖ 용량 서브유닛 백신을 사전-충전된 주사기 중에 패키징한다.
특정한 실시태양에서, 상기 분할 바이러스 백신을 발육계란에서 번식된 인플루엔자 바이러스를 사용하여 제조한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 분할 바이러스 백신을 발육계란에서 번식되지 않은 인플루엔자 바이러스를 사용하여 제조한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 분할 바이러스 백신을 포유동물 세포, 예를 들어 불멸화된 인간 세포(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 07/045674 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/EP2006/067566 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 개 신장 세포, 예를 들어 MDCK 세포(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 제 WO 08/032219 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/IB2007/003536 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 베로 세포, PerC.6 세포, 또는 오리 세포, 예를 들어 EB66 세포에서 번식된 인플루엔자 바이러스를 사용하여 제조한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 1가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH7/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 B/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 1에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드)를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 1가 분할 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공하며, 여기에서 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 인플루엔자 바이러스로부터 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하고 상기 2개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 각각 2개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 2개의 상이한 인플루엔자 균주, 하위유형, 또는 그룹으로부터의 것이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 2가 분할 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공하며, 여기에서 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 인플루엔자 바이러스로부터의 동일한 인플루엔자 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인을 포함하고, 상기 3개의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 각각 3개의 상이한 인플루엔자 바이러스로부터의 상이한 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 도메인은 3개의 상이한 인플루엔자 균주, 하위유형, 또는 그룹으로부터의 것이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스, 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하는 3가 분할 바이러스 백신을 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 분할 바이러스 백신은 A/베트남/1203/2004(H5)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 분할 바이러스 백신은 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하는 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 분할 바이러스 백신은 A/청둥오리/알버타/24/2001(H7)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 분할 바이러스 백신은 A/퍼쓰/16/2009(H3)의 줄기 도메인을 포함하는 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈을 함유하고/하거나 포함하는 바이러스를 포함하지 않는다.
10.5. 항원보강제
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 조성물은 항원보강제를 포함하거나 상기 항원보강제와 함께 투여된다. 본 발명에 개시된 조성물과 함께 투여하기 위한 항원보강제는 상기 조성물의 투여 전에, 상기 투여와 동시에, 또는 상기 투여 후에 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, "항원보강제"란 용어는 본 발명에 개시된 조성물과 함께 또는 그의 부분으로서 투여될 때 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 증가시키고, 증대시키고/시키거나 증강시키지만, 단독으로 투여될 때는 상기 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 생성시키지 않는 화합물을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 항원보강제는 상기 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 발생시키며 알러지 또는 다른 부반응은 생성시키지 않는다. 항원보강제는 예를 들어 림프구 모집, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 포함한 다수의 기전들에 의해 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 항원보강제는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 본래의 반응의 정성적인 형태에 영향을 미치는 상기 폴리펩타이드의 입체형태적 변화를 유발하지 않으면서 상기 반응을 증가시킨다. 항원보강제의 구체적인 예는 비제한적으로 알루미늄염(알룸)(예를 들어, 수산화 알루미늄, 알루미늄 포스페이트, 및 알루미늄 설페이트), 3 탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(MPL)(GB 2220211), MF59(노바티스(Novartis)), AS03(글락소미스클라인(GlaxoSmithKline)), AS04(글락소스미스클라인), 폴리솔베이트 80(트윈 80; ICL 아메리카스 인코포레이티드(Americas, Inc.)), 이미다조피리딘 화합물(국제 특허 출원 공개 제 WO2007/109812로서 공개된, 국제 출원 제 PCT/US2007/064857 호), 이미다조퀴녹살린 화합물(국제 특허 출원 공개 제 WO2007/109813으로서 공개된, 국제 출원 제 PCT/US2007/064858 호), 매트릭스(Matrix)-M(이스카노바(iscanova)), MVA(더 제너 인스티튜트(the Jenner Institute), 영국 옥스포드 소재), ISCOMATRIX(CSL 베링(Behring)), AddaVax(인비보젠(Invivogen)), 폴리I:C(인비보젠), 센다이 바이러스 칸텔 균주 결함성 간섭 RNA로부터의 시험관내 전사된 RNA 헤어핀, 및 사포닌, 예를 들어 QS21(문헌[Kensil et al ., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)]; 미국특허 제 5,057,540 호를 참조하시오)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 항원보강제는 프로인트 항원보강제(완전 또는 불완전)이다. 다른 항원보강제는, 임의로 면역 자극제, 예를 들어 모노포스포릴 지질 A와 함께, 수중 유적형 유화액(예를 들어, 스쿠알렌 또는 땅콩오일)이다(문헌[Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)]을 참조하시오). 또 다른 항원보강제는 CpG이다(문헌[Bioworld Today, Nov. 15, 1998]). 상기와 같은 항원보강제를 다른 특정한 면역자극제들, 예를 들어 MPL 또는 3-DMP, QS21, 중합체성 또는 단량체성 아미노산, 예를 들어 폴리글루탐산 또는 폴리리신, 또는 상기 섹션 4에 개시된 다른 면역강화제와 함께 또는 이들 화합물 없이 사용할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항원보강제는 물리적 항원보강제, 예를 들어 미세바늘 및 미세바늘 패치이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항원보강제는 톨형 수용체(TLR) 자극 분자, 예를 들어 플라젤린이다(문헌[McSorley et al.,2002. J. Immunol . 169:3914-3919]). 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 상이한 제형들은 상이한 항원보강제를 포함하거나 동일한 항원보강제를 포함할 수도 있음을 알아야 한다.
11. 예방학적 및 치료학적 용도
하나의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포) 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)을 사용하여 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 조성물(예를 들어, 그의 백신 제형)을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 그의 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 바이러스 벡터 또는 그의 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드로 자극된 세포 또는 그의 약학 조성물을 투여함을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법에 사용되는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 포유동물 세포, 식물 세포, 또는 곤충 세포로부터 유래된 본 발명에 개시된 정제된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드이다.
특정한 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 서브유닛 백신(섹션 10.1을 참조하시오)을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 생 바이러스 백신(섹션 10.2를 참조하시오)을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 생 바이러스 백신은 약독화 백신을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 불활성화된 바이러스 백신(섹션 10.3을 참조하시오)을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 분할 바이러스 백신(섹션 10.4를 참조하시오)을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 바이러스-유사 입자 백신(섹션 6을 참조하시오)을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 비로솜(섹션 6을 참조하시오)을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 상기 면역 반응의 유도가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하거나 발현하도록 조작된 세균 또는 그의 조성물(섹션 7을 참조하시오)을 투여함을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법에 사용되는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 포유동물 세포, 식물 세포, 또는 곤충 세포로부터 유래된 본 발명에 개시된 정제된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포) 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 임의의 하위유형 또는 균주에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 유효하다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 동일한 하위유형내의 하나 이상의 균주에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 유효하다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 동일한 하위유형의 다수의 균주에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 유효하다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포) 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 (i) H1N1 및 H1N2 하위유형; (ii) H1N1 및 H3N1 하위유형; (iii) H1N2 및 H3N2 하위유형; 및/또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 조합 중 어느 하나 및 인플루엔자 B형에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 유효하다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 하나의 HA 그룹(예를 들어, H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17, 및 H18을 포함하는 그룹 1)에 속하고 다른 HA 그룹(예를 들어, H3, H4, H7, H10, H14, 및 H15를 포함하는 그룹 2)에는 속하지 않는 인플루엔자 바이러스의 하위유형에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 예를 들어, 상기 유도되는 면역 반응은 H11, H13, H16, H9, H8, H12, H6, H1, H5 및/또는 H2로 이루어지는 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 유효할 수 있다. 한편으로, 상기 유도되는 면역 반응은 H3, H4, H14, H10, H15 및/또는 H7로 이루어지는 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 유효할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 하위유형에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 하위유형에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 H1 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스의 1, 2 또는 그 이상의 균주 및/또는 H2 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스의 1, 2 또는 그 이상의 균주에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 H1 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스의 1, 2 또는 그 이상의 균주; H3 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스의 1, 2 또는 그 이상의 균주; 및/또는 1, 2 또는 그 이상의 인플루엔자 B형 바이러스 균주에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포) 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 H1N1 및 H2N2 하위유형에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 유효하다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 H1N1 및 H2N2 하위유형에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하지 않다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 H1N1, H2N2 및 H3N2 하위유형에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 H3N2 하위유형에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 H3N2 하위유형에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 유효하지 않다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 하나의 HA 그룹에 속하고 다른 HA 그룹에는 속하지 않는 인플루엔자 바이러스의 하위유형에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 예를 들어, 상기 유도되는 면역 반응은 H11, H13, H16, H9, H8, H12, H6, H1, H5 및/또는 H2로 이루어지는 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 질병을 예방 및/또는 치료하는데 유효할 수 있다. 한편으로, 상기 유도되는 면역 반응은 H3, H4, H14, H10, H15 및/또는 H7로 이루어지는 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 질병을 예방 및/또는 치료하는데 유효할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 하위유형에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 하위유형에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료에 유효하다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 동일한 하위유형내의 하나 이상의 균주에 의해 야기된 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료에 유효하다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포) 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스 질병/감염으로부터 생성되는 증상들을 감소시키기에 유효하다. 인플루엔자 바이러스 질병/감염의 증상은 비제한적으로 전신통(특히 관절 및 인후), 발열, 오심, 두통, 염증이 있는 눈, 피로, 인후염, 충혈된 눈 또는 피부, 및 복부 통증을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포) 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스 질병/감염을 앓고 있는 대상의 입원을 감소시키기에 유효하다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 바이러스 질병/감염을 앓고 있는 대상의 입원기간을 감소시키기에 유효하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터, 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포) 또는 조성물(예를 들어, 백신 제형)을 사용하여 대상에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터, 또는 상기 중 어느 하나의 조성물을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 서브유닛 백신, 생 바이러스 백신, 불활성화된 바이러스 백신, 분할 바이러스 백신 또는 바이러스-유사 입자 백신을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터, 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포, 또는 본 발명에 개시된 조성물(예를 들어, 백신 제형)을 사용하여 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 그의 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 그의 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 바이러스 벡터 또는 그의 면역원성 조성물을 투여함을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드로 자극된 세포 또는 그의 약학 조성물을 투여함을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 서브유닛 백신을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 생 바이러스 백신을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 생 바이러스 백신은 약독화 백신을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 불활성화된 바이러스 백신을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 분할 바이러스 백신을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 바이러스-유사 입자 백신을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 비로솜을 투여함을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하거나 발현하도록 조작된 세균 또는 그의 조성물을 투여함을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 대상에게 다가 백신(예를 들어, 2가 또는 3가 백신)을 투여함을 포함하며, 여기에서 상기 다가 백신은 2개 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 제 2 다가 백신(예를 들어, 2가 또는 3가 백신)을 상기 대상에게 추가면역제(booster)로서 투여하며, 여기에서 상기 제 2 다가 백신은 2개 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제 2 다가 백신은 제 1 다가 백신과 상이하다. 특정한 실시태양에서, 상기 제 2 다가 백신의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 헤마글루티닌 구상 헤드 도메인에 관하여 상기 제 1 다가 백신의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드와 다르다. 몇몇 실시태양에서, 상기 제 2 다가 백신의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 헤마글루티닌 줄기 도메인은 상기 제 1 다가 백신의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 헤마글루티닌 줄기 도메인과 동일하다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 중화 항체(섹션 9를 참조하시오)를 투여함으로써 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하거나 치료하는 방법은 상기 예방 또는 치료가 필요한 대상에게 유효량의 본 발명에 개시된 중화 항체 또는 그의 약학 조성물을 투여함을 포함한다. 특정 실시태양에서, 상기 중화 항체는 단클론 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 중화 항체는 CR8114, CR8020(문헌[Ekiert et al ., 2011. Science. 333(6044): 843-850]), FI6(문헌[Corti et al ., 2011. Science. 333(6044) 850-856, DOI: 10.1126/science.1205669]), 인플루엔자 B형 바이러스 줄기 mAb 3A2, 10C4, 또는 5A7(문헌[Yasugi et al ., 2013. PLoS Pathog . 9(2): e1003150]), CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179(FERM BP-4517), AI3C(FERM BP-4516) 또는 문헌[Ekiert DC et al. (2009) Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (published in Science Express February 26, 2009)]; 문헌[Kashyap et al . (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991]; 문헌[Sui et al . (2009) Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16: 265-273]; 미국특허 제 5,589,174 호, 미국특허 제 5,631,350 호, 미국특허 제 6,337,070 호, 및 미국특허 제 6,720,409 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2007/134237 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2007/068983 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2009/036157 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2008/075998 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2008/028946 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/EP2007/059356 호; 및 국제 특허 출원 공개 제 WO 2009/079259 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2008/085876 호에 개시된 임의의 다른 항체가 아니다. 다른 실시태양에서, 상기 중화 항체는 문헌[Wang et al. (2010) "Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins," PLOS Pathogens 6(2):1-9]에 개시된 항체가 아니다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 대상(예를 들어, 인간 또는 비-인간 동물)에서 인플루엔자 바이러스 질병 또는 감염을 예방하거나 치료하는 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되고 본 발명에 개시된 생체내 및 시험관내 분석에 의해 측정시 상기 대상에서 상기 인플루엔자 바이러스의 복제를 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 인플루엔자 바이러스의 복제는 대략 1 로그 이상, 대략 2 로그 이상, 대략 3 로그 이상, 대략 4 로그 이상, 대략 5 로그 이상, 대략 6 로그 이상, 대략 7 로그 이상, 대략 8 로그 이상, 대략 9 로그 이상, 대략 10 로그 이상, 1 내지 3 로그, 1 내지 5 로그, 1 내지 8 로그, 1 내지 9 로그, 2 내지 10 로그, 2 내지 5 로그, 2 내지 7 로그, 2 로그 내지 8 로그, 2 내지 9 로그, 2 내지 10 로그 3 내지 5 로그, 3 내지 7 로그, 3 내지 8 로그, 3 내지 9 로그, 4 내지 6 로그, 4 내지 8 로그, 4 내지 9 로그, 5 내지 6 로그, 5 내지 7 로그, 5 내지 8 로그, 5 내지 9 로그, 6 내지 7 로그, 6 내지 8 로그, 6 내지 9 로그, 7 내지 8 로그, 7 내지 9 로그, 또는 8 내지 9 로그까지 감소된다.
11.1. 복합 치료법
다양한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포, 또는 중화 항체를, 하나 이상의 다른 치료법들(예를 들어, 항바이러스, 항균, 또는 면역조절 치료법)과 함께 대상에게 투여할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 약학 조성물(예를 들어, 면역원성 조성물)을 대상에게 하나 이상의 치료법과 함께 투여할 수 있다. 상기 하나 이상의 치료법은 인플루엔자 바이러스 질병의 치료 또는 예방에 이롭거나 인플루엔자 바이러스 질병과 관련된 증상 또는 상태를 개선시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 하나 이상의 다른 치료법은 통증 경감, 해열 약물치료, 또는 호흡을 편안하게 하거나 돕는 치료법이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 치료법들을 5 분 미만으로 떨어져서, 30 분 미만으로 떨어져서, 1 시간 떨어져서, 약 1 시간 떨어져서, 약 1 내지 약 2 시간 떨어져서, 약 2 시간 내지 약 3 시간 떨어져서, 약 3 시간 내지 약 4 시간 떨어져서, 약 4 시간 내지 약 5 시간 떨어져서, 약 5 시간 내지 약 6 시간 떨어져서, 약 6 시간 내지 약 7 시간 떨어져서, 약 7 시간 내지 약 8 시간 떨어져서, 약 8 시간 내지 약 9 시간 떨어져서, 약 9 시간 내지 약 10 시간 떨어져서, 약 10 시간 내지 약 11 시간 떨어져서, 약 11 시간 내지 약 12 시간 떨어져서, 약 12 시간 내지 18 시간 떨어져서, 18 시간 내지 24 시간 떨어져서, 24 시간 내지 36 시간 떨어져서, 36 시간 내지 48 시간 떨어져서, 48 시간 내지 52 시간 떨어져서, 52 시간 내지 60 시간 떨어져서, 60 시간 내지 72 시간 떨어져서, 72 시간 내지 84 시간 떨어져서, 84 시간 내지 96 시간 떨어져서, 또는 96 시간 내지 120 시간 떨어져서 투여한다. 특정한 실시태양에서, 2개 이상의 치료법을 동일한 환자 방문 내에 투여한다.
당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 임의의 항바이러스제를 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 약학 조성물과 함께 사용할 수 있다. 항바이러스제의 비제한적인 예는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 융합 단백질 항체, 핵산 분자, 유기 분자, 무기 분자, 및 바이러스의 그의 수용체에의 부착, 바이러스의 세포내로의 내면화, 바이러스의 복제, 또는 바이러스의 세포로부터의 방출을 억제하고/하거나 감소시키는 소분자를 포함한다. 특히, 항바이러스제는 비제한적으로 뉴클레오사이드 유사체(예를 들어, 지도뷰딘, 아사이클로비어, 강사이클로비어, 비다라빈, 요독슈리딘, 트라이플루리딘, 및 리바비린), 포스카넷, 아만타딘, 페라미비어, 리만타딘, 사퀴나비어, 인디나비어, 리토나비어, 알파-인터페론 및 다른 인터페론, AZT, 자나미비어(렐렌자(Relenza)(등록상표)), 및 오셀타미비어(타미플루(Tamiflu)(등록상표))를 포함한다. 다른 항바이러스제는 인플루엔자 바이러스 백신, 예를 들어 플루아릭스(Fluarix)(등록상표)(글락소스미스클라인), 플루미스트(FluMist)(등록상표)(메드임뮨 백신스(MedImmune Vaccines)), 플루비린(Fluvirin)(등록상표)(키런 코포레이션(Chiron Corporation)), 플루라발(Flulaval)(등록상표)(글락소스미스클라인), 아플루리아(Afluria)(등록상표)(CSL 바이오테라피스 인코포레이티드(Biotherapies Inc.)), 아그리플루(Agriflu)(등록상표)(노바티스) 또는 플루존(Fluzone)(등록상표)(아벤티스 파스퇴르(Aventis Pasteur))을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 상기 항바이러스제는 바이러스 항원에 특이적인 면역조절제이다. 특정 실시태양에서, 상기 바이러스 항원은 헤마글루티닌 폴리펩타이드 외의 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드이다. 다른 실시태양에서, 상기 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드이다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 항균제를 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 약학 조성물과 함께 사용할 수 있다. 항균제의 비제한적인 예는 아미카신, 아목시실린, 아목시실린-클라뷸란산, 암포테리신-B, 암피실린, 암피실린-설박탐, 아프라마이신, 아지쓰로마이신, 아즈트레오남, 바시트라신, 벤질페니실린, 카스포펀진, 세파클로, 세파드록실, 세파렉신, 세팔로틴, 세파졸린, 세프디니르, 세페핌, 세픽심, 세프메녹심, 세포페라존, 세포페라존-설박탐, 세포탁심, 세폭시틴, 세프피롬, 세프포독심, 세프포독심-클라뷸란산, 세포프톡심-설박탐, 세프로질, 세프퀴놈, 세프타지딤, 세프티뷰틴, 세프티오퓨어, 세프토비프롤, 세프트리악손, 세퓨록심, 클로람페니콜, 플로르페니콜, 시프로플록사신, 클라리쓰로마이신, 클리나플록사신, 클린다마이신, 클록사실린, 콜리스틴, 코트리목사졸(트림토프림/설파메톡사졸), 달바반신, 달포프리스틴/퀴노프리스틴, 다프토마이신, 디베카신, 디클록사실린, 도리페넴, 독시사이클린, 엔로플록사신, 에르타페넴, 에리쓰로마이신, 플루클록사실린, 플루코나졸, 플루시토신, 포스포마이신, 후시딘산, 가레녹사신, 가티플록사신, 제미플록사신, 젠타미신, 이미페넴, 이트라코나졸, 가나마이신, 케토코나졸, 레보플록사신, 린코마이신, 리네졸리드, 로라카르베프, 메실남(암디노실린), 메로페넴, 메트로니다졸, 메지오실린, 메즐로실린-설박탐, 미노사이클린, 목시플록사신, 뮤피로신, 날리딕시산, 네오마이신, 네틸미신, 니트로퓨란토인, 노르플록사신, 오플록사신, 옥사실린, 페플록사신, 페니실린 V, 피페라실린, 피페라실린-설박탐, 피페라실린-타조박탐, 리팜피신, 록시쓰로마이신, 스파르플록사신, 스펙티노마이신, 스피라마이신, 스트렙토마이신, 설박탐, 설파메톡사졸, 테이코플라닌, 텔라반신, 텔리쓰로마이신, 테모실린, 테트라사이클린, 티카르실린, 티카르실린-클라뷸란산, 티제사이클린, 토브라마이신, 트라이메토프림, 트로바플록사신, 타일로신, 반코바이신, 버지니아마이신, 및 보리코나졸을 포함한다.
일부 실시태양에서, 복합 치료법은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 또는 본 발명에 개시된 하나 이상의 발현 벡터에 의한 능동 면역화 및 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 사용하여 생성되고/되거나 확인된 하나 이상의 중화 항체에 의한 수동 면역화를 포함한다. 일부 실시태양에서, 복합 치료법은 본 발명에 개시된 하나 이상의 발현 벡터에 의한 면역화 및 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 의해 자극된 세포(예를 들어, 양자 전이에 의해)의 투여를 포함한다.
일부 실시태양에서, 복합 치료법은 본 발명에 개시된 2개 이상의 상이한 발현 벡터의 투여를 포함한다.
일부 실시태양에서, 복합 치료법은 다른 HA 그룹(예를 들어, 그룹 2)에서 1, 2, 3 또는 그 이상의 HA 하위유형에 대한 면역 반응을 유도하는 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포)과 함께, 하나의 HA 그룹(예를 들어, 그룹 1)에서 1, 2, 3 또는 그 이상의 HA 하위유형에 대한 면역 반응을 유도하는 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포)에 의한 능동 면역화를 포함한다.
일부 실시태양에서, 복합 치료법은 본 발명에 개시된 2개 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 의한 능동 면역화를 포함한다.
11.2. 환자 집단
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물을 미경험 대상, 즉 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기된 질병이 없거나 걸린 적이 없고 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 현재 감염되지 않은 대상에게 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물을 인플루엔자 바이러스 감염의 획득 위험이 있는 미경험 대상에게 투여한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물을 특정한 인플루엔자 바이러스에 의해 야기된 질병이 없거나, 걸린 적이 없고 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 의해 면역 반응이 유도되는 특정한 인플루엔자 바이러스에 의해 감염되지 않은 대상에게 투여한다. 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물을 또한, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 의해 면역 반응이 유도되는 인플루엔자 바이러스 또는 상기 인플루엔자 바이러스의 또 다른 유형, 하위유형 또는 균주에 의해 감염되고/되거나 감염된 적이 있는 대상에게 투여할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물을 인플루엔자 바이러스 감염으로 진단된 환자에게 투여한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물을 증상이 발현되거나 증상이 심해지기 전에(예를 들어, 환자가 입원을 요하기 전에) 인플루엔자 바이러스로 감염된 환자에게 투여한다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물을 상기 활성 화합물 또는 조성물의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 헤드 도메인이 유래된 인플루엔자 바이러스의 경우와 상이한 유형의 인플루엔자 바이러스로 감염되거나 진단된 환자에게 투여한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물을 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 도메인의 경우와 동일한 HA 그룹에 속하는 인플루엔자 바이러스에 감염될 수 있거나 감염된 환자에게 투여한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물을 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 경우와 동일한 하위유형의 인플루엔자 바이러스로 감염될 수 있거나 감염된 환자에게 투여한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물이 투여되는 대상은 동물이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 동물은 조류이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 동물은 개이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 동물은 고양이이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 동물은 말이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 동물은 소이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 동물은 포유동물, 예를 들어 말, 돼지, 마우스, 또는 영장류, 바람직하게는 인간이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물이 투여되는 대상은 인간 성인이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 대상은 50세가 넘는 인간 성인이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 대상은 노령의 인간 대상이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물이 투여되는 대상은 인간 아동이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 대상은 인간 유아이다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 대상은 6개월 미만의 유아가 아니다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 대상은 2세 이하의 인간이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 대상은 5세 이하의 인간이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 대상은 1 내지 5세의 인간이다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물이 투여되는 대상은 6개월이 넘는 임의의 유아 또는 아동 및 50세 이상의 임의의 성인이다. 다른 실시태양에서, 상기 대상은 임신한 개인이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 대상은 인플루엔자 계절(예를 들어, 일반적으로 북반구에서 11월에서부터 4월까지) 동안 임신일 수 있거나 임신하게 될 개인이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 대상은 출산 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주 전의 여성이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물이 투여되는 대상은 인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 발생하는 질병의 증가된 위험성이 있는 임의의 개인(예를 들어, 면역타협된 또는 면역결핍 개인)이다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 인간 대상은 인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 발생하는 질병의 증가된 위험성이 있는 개인(예를 들어, 면역타협된 또는 면역억제된 개인)과 밀접 접촉하는 임의의 개인이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물이 투여되는 인간 대상은 인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 발생하는 질병에 대한 민감성을 증가시키는 임의의 병에 걸린 개인이다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물을, 인플루엔자 바이러스 감염이, 개인이 걸리거나 걸릴 위험이 있는 또 다른 병의 합병증을 증가시킬 잠재성을 갖는 대상에게 투여한다. 특정 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스 합병증에 대한 민감성을 증가시키거나, 인플루엔자 바이러스가 상기 병과 관련된 합병증을 증가시키는 상기와 같은 병은 예를 들어 폐를 침범하는 병, 예를 들어 낭성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질병(COPD), 폐기종, 천식, 또는 세균 감염(예를 들어, 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 레니오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 및 클라미디아 트라코마투스(Chlamydia trachomatus)에 의해 야기된 감염); 심혈관 질병(예를 들어, 선천성 심장병, 울혈성 심부전, 및 관상동맥 질병); 내분비 질환(예를 들어, 당뇨병), 신경 및 뉴런-발달 병(예를 들어, 뇌, 척수, 말초 신경, 및 근육의 질환(예를 들어, 뇌성마비, 간질(발작 질환), 뇌졸중, 지적장애(예를 들어, 정신지체), 근이영양증, 및 척수 손상))이다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물이 투여되는 인간 대상은 그룹 홈, 예를 들어 요양원에 거주하는 개인이다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 인간 대상은 상당량의 시간을 그룹 홈, 예를 들어 요양원에서 일하거나 보낸다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 인간 대상은 건강한 간호 종사자(예를 들어, 의사 또는 간호사)이다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 인간 대상은 흡연자이다. 특정한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물이 투여되는 인간 대상은 면역타협되거나 면역억제된다.
또한, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물이 투여될 수 있는, 인플루엔자로부터 합병증이 발생할 위험이 증가된 대상은 인플루엔자 바이러스를 합병증의 고위험군, 예를 들어 6개월 미만의 유아, 6개월 미만의 유아와 접촉하게 되는 개인, 또는 요양원 또는 다른 장기간 보호 시설에 살고 있는 개인과 접촉하게 되는 개인을 포함하여 고위험군 개인의 가족 구성원에게 인플루엔자 바이러스를 전염시킬 수 있는 임의의 개인; 장기적인 폐, 심장 또는 순환기 질환이 있는 개인; 대사성 질병(예를 들어, 당뇨병)이 있는 개인; 신장 질환이 있는 개인; 혈액 질환(빈혈 또는 겸상적혈구 빈혈을 포함하여)이 있는 개인; 면역계가 약해진(약물치료, 암과 같은 악성질환, 기관 이식, 또는 HIV 감염에 의해 야기된 면역억제 포함) 개인; 장기간 아스피린 치료법을 받고 있는(따라서 인플루엔자에 감염되는 경우 레이 증후군이 발생할 위험이 높은) 아동을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물의 투여를 위한 대상은 4월에서 9월까지 외국 및 독감 창궐이 발생할 수도 있는 지역, 예를 들어 열대지방 및 서반구 지역으로 여행할 계획이 있거나; 인플루엔자 바이러스가 돌고 있는 세계의 지역으로부터의 개인을 포함할 수 있는 대규모 집단 여행자 그룹의 일부로서 여행하거나; 학교나 대학교에 출석하고 기숙사에 거주하거나, 공공단체 환경에서 거주하거나; 인플루엔자로 인해 병에 걸릴 위험성을 감소시키기를 원하는 6개월 이상의 건강한 개인을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물의 투여에 금기를 보이는 대상은 인플루엔자 백신접종에 금기를 보이는 임의의 개인, 예를 들어 6개월 미만의 유아; 및 계란, 계란 제품, 또는 상기 면역원성 제형의 제조에 사용되는 다른 성분들에 대해 과민 반응(호흡 곤란을 야기하는, 종종 쇼크가 이어지는 알러지 반응)을 갖는 개인을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 조성물의 투여가 상기 면역원성 제형의 제조에 사용되는 하나 이상의 성분들로 인해(예를 들어, 계란 또는 계란 제품의 존재로 인해) 금기를 보이는 경우, 상기 활성 화합물 또는 조성물의 투여가 금기를 일으키는 성분을 포함하지 않는 방식으로 상기 활성 화합물 또는 조성물을 제조할 수 있다(예를 들어, 상기 활성 화합물 또는 조성물을 계란 또는 계란 제품의 사용 없이 제조할 수 있다).
일부 실시태양에서, 생 바이러스 백신을 하기의 환자 집단 중 하나 이상에게 투여하지 않을 것을 권할 수 있다: 노인; 6개월 미만의 유아; 임신한 개인; 1세 미만의 유아; 2세 미만의 아동; 3세 미만의 아동; 4세 미만의 아동; 5세 미만의 아동; 20세 미만의 성인; 25세 미만의 성인; 30세 미만의 성인; 35세 미만의 성인; 40세 미만의 성인; 45세 미만의 성인; 50세 미만의 성인; 70세 초과의 노인; 75세 초과의 노인; 80세 초과의 노인; 85세 초과의 노인; 90세 초과의 노인; 95세 초과의 노인; 아스피린 및 야생형 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 합병증으로 인해, 아스피린 또는 아스피린-함유 약물치료를 받고 있는 아동 및 청소년(2 내지 17세); 천식 또는 다른 반응성 기도 질병의 병력이 있는 개인; 중증 인플루엔자 감염에 걸리기 쉽게 만들 수 있는 만성적인 근원적 의학 조건을 갖는 개인; 길랑-바레 증후군의 병력이 있는 개인; 발열과 함께 급성 중병이 있는 개인; 또는 보통 또는 심하게 아픈 개인. 상기와 같은 개인들의 경우, 본 발명에 개시된 불활성화된 바이러스 백신, 분할 바이러스 백신, 서브유닛 백신, 비로솜, 바이러스-유사 입자 또는 비-바이러스 벡터의 투여가 바람직할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 바람직하게 생 바이러스 백신이 투여되는 대상은 2 내지 17세의 건강한 아동 및 청소년, 및 18 내지 49세의 건강한 성인을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 생 바이러스 벡터를 포함하는 면역원성 제형을 다른 생-바이러스 백신과 동시에 제공하지 않는다.
12. 투여 방식
12.1. 전달 경로
본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물을 다양한 경로에 의해 대상에게 전달할 수 있다. 이들 경로는 비제한적으로 비내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복강내, 경피, 정맥내, 결막 및 피하 경로를 포함한다. 일부 실시태양에서, 조성물을 국소 투여용으로, 예를 들어 피부에 적용하기 위해 제형화한다. 특정한 실시태양에서, 투여 경로는 코, 예를 들어 코 스프레이의 부분으로서이다. 몇몇 실시태양에서, 조성물을 근육내 투여용으로 제형화한다. 일부 실시태양에서, 조성물을 피하 투여용으로 제형화한다. 몇몇 실시태양에서, 조성물을 주사에 의한 투여용으로 제형화하지 않는다. 생 바이러스 백신에 대한 특정한 실시태양에서, 상기 백신을 주사 외의 경로에 의한 투여용으로 제형화한다.
항원이 바이러스 벡터, 바이러스-유사 입자 벡터 또는 세균 벡터인 경우에, 예를 들어 상기 벡터가 유래된 주쇄 바이러스 또는 세균의 천연 감염 경로를 통해 면역원성 조성물을 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 한편으로, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 상기 폴리펩타이드가 유래되는 인플루엔자 바이러스의 천연 감염 경로를 통해 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 항원, 특히 바이러스 벡터가 활발한 분비 및 세포 면역 반응을 유도하는 능력을 유리하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터에 의한 호흡관의 감염은, 예를 들어 비뇨생식계에서, 인플루엔자 바이러스에 대한 동반 보호와 함께 강한 분비 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 바람직한 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 임의의 적합한 경로에 의해 폐에 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. 폐 투여를 또한, 예를 들어 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 스프레이로서 사용하기 위한 분무화제와의 제형에 의해 사용할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 서브유닛 백신을 근육내로 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 생 인플루엔자 바이러스 백신을 비내로 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신, 또는 분할 인플루엔자 바이러스 백신을 근육내로 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 바이러스-유사 입자 또는 그의 조성물을 근육내로 투여한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드로 자극된 세포를 시험관내에서 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법을 사용하여 대상에게 도입(또는 재-도입)시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 진피내로, 진피 아래로, 또는 말초 혈류 내로 도입시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 대상내로 도입되는 세포는 바람직하게는, 불리한 면역 반응을 피하기 위해서 상기 대상로부터 유래된 세포이다. 다른 실시태양에서, 유사한 면역 배경을 갖는 공여 숙주로부터 유래된 세포를 또한 사용할 수 있다. 불리한 면역원성 반응을 피하도록 설계된 것들을 포함하여, 다른 세포들도 또한 사용할 수 있다.
12.2. 투여량 및 투여 횟수
인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 질병의 치료 및/또는 예방에 유효할 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물의 양은 상기 질병의 성질에 따라 변할 것이며 표준 임상 기법에 의해 측정될 수 있다.
상기 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상기 감염 또는 상기 감염에 의해 야기된 질병의 중증도에 따라 변할 것이며, 의료 종사자의 판단 및 각 대상의 상황에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 유효 용량은 또한 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태(연령, 체중, 건강 포함), 상기 환자가 인간인지 또는 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약물치료, 및 치료가 예방학적인지 치료학적인지의 여부에 따라 변할 수 있다. 대개, 상기 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유동물을 포함한 비인간 포유동물도 또한 치료될 수 있다. 치료 투여량을, 안전성 및 유효성을 최적화하기 위해 최적으로 적정한다.
몇몇 실시태양에서, 최적의 투여량 범위의 확인을 돕기 위해서 시험관내 분석을 사용한다. 유효 용량을 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량 반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다.
본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대한 예시적인 용량 범위는 환자당 약 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 ㎎, 1 ㎍ 내지 10 ㎎, 또는 30 내지 300 ㎍ 핵산, 예를 들어 DNA이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 예시적인 용량(예를 들어, 분할 바이러스 백신 및 서브유닛 백신 중에서 제공되는 바와 같은) 범위는 환자의 킬로그램당 약 0.5 ㎍ 내지 1.0 ㎍, 1.0 ㎍ 내지 2.0 ㎍, 2.0 ㎍ 내지 5.0 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 10 ㎍, 15　㎍ 내지 25 ㎍, 25 ㎍ 내지 50 ㎍, 50 ㎍ 내지 100 ㎍, 100 ㎍ 내지 500 ㎍, 또는 500 ㎍ 내지 1.0 mg의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드이다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 예시적인 용량 범위는 용량당 약 0.5 ㎍ 내지 1.0 ㎍, 1.0 ㎍ 내지 2.0 ㎍, 2.0 ㎍ 내지 5.0 ㎍, 5.0 ㎍ 내지 10 ㎍, 15　㎍ 내지 25 ㎍, 25 ㎍ 내지 50 ㎍, 50 ㎍ 내지 100 ㎍, 100 ㎍ 내지 500 ㎍, 250 ㎍ 내지 500 ㎍, 500 ㎍ 내지 1.0 mg 또는 750 ㎍ 내지 1 mg의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드이고, 대상에게 필요한 만큼의 간격으로 1, 2, 3회 또는 그 이상 투여할 수 있다.
감염성 바이러스 벡터에 대한 용량은 용량당 10 내지 100, 또는 그 이상의 비리온으로 다양할 수 있다. 일부 실시태양에서, 바이러스 벡터의 적합한 투여량은 102, 5 x 102, 103, 5 x 103, 104, 5 x 104, 105, 5 x 105, 106, 5 x 106, 107, 5 x 107, 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, 5 x 1011 또는 1012 pfu이고, 대상에게 필요한 만큼의 간격으로 1, 2, 3회 또는 그 이상 투여할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, VLP에 대한 예시적인 용량 범위는 환자의 킬로그램당 약 0.01 ㎍ 내지 약 100 mg, 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 100 mg, 약 15 ㎍ 내지 약 50 mg, 약 15 ㎍ 내지 약 25 mg, 약 15 ㎍ 내지 약 10 mg, 약 15　㎍ 내지 약 5 mg, 약 15 ㎍ 내지 약 1 mg, 약 15 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 75 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 45 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 40 ㎍, 또는 약 25 내지 약 35 ㎍이다.
하나의 실시태양에서, 불활성화된 백신을 상기 백신이 약 5 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 10 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 약 15 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 75 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 15 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 약 20 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 40 ㎍, 약 25 ㎍ 내지 약 35 ㎍의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 함유하도록 제형화한다.
몇몇 실시태양에서, 활성 화합물, 즉 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포 또는 조성물을 대상에게 단일 용량으로서 1회 투여한다. 예를 들어, 앞서 인플루엔자에 노출된 대상(예를 들어, 노인 대상)는 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 그의 조성물의 수회 투여를 필요로 하지 않고, 오히려 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 그의 조성물에 의한 단일 면역화에 의해 충분히 백신접종될 수 있다. 한편으로, 앞서 인플루엔자에 노출된 대상(예를 들어, 노인 대상)는 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 그의 조성물의 수회 투여를 필요로 할 수도 있지만, 미경험 대상(즉, 앞서 인플루엔자에 노출되지 않은 대상)에 의해 요구되는 경우보다 적은 상기와 같은 투여로 충분히 백신접종될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 미경험 대상은 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 그의 조성물에 의한 1차 면역(예를 들어, 최초항원자극)에 이어서 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 그의 조성물에 의한 1, 2 또는 그 이상의 추가적인 면역(예를 들어, 추가접종)을 필요로 할 수도 있다.
특정한 실시태양에서, 대상에게 1회 초과의 본 발명에 개시된 활성 화합물 또는 그의 조성물을 연속적으로(예를 들어, 면역화 섭생의 부분으로서) 투여하는 경우에, 상기 연속되는 투여(즉, 1차 투여후 발생하는 투여)에 사용되는 활성 화합물 또는 그의 조성물의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 상기 1차 투여에 사용된 활성 화합물 또는 그의 조성물의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드와 상이하다. 특정한 실시태양에서, 상기 연속되는 투여에 사용된 활성 화합물 또는 그의 조성물의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 상기 1차 투여에 사용된 활성 화합물 또는 그의 조성물의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드와 상이한 구상 헤드 도메인을 포함하지만, 상기 1차 투여에 사용된 활성 화합물 또는 그의 조성물의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드와 동일한 HA 줄기 도메인을 포함하고 동일한 HA 줄기 도메인을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 연속되는 투여에 사용된 활성 화합물 또는 그의 조성물의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드는 상기 1차 투여에 사용된 활성 화합물 또는 그의 조성물의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드와 상이한 구상 헤드 도메인 및 상이한 HA 줄기 도메인을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 활성 화합물 또는 조성물(예를 들어, 활성 화합물을 포함하는 조성물)을 대상에게 단일 용량으로서 투여한 다음 3 내지 6주 후에 2차 용량을 투여한다. 몇몇 실시태양에서, 활성 화합물 또는 조성물을 대상에게 단일 용량으로서 투여한 다음 3 내지 6주 후에 2차 용량을 투여하고, 이어서 3 내지 6주 후에 3차 용량을 투여한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 2차 및/또는 3차 투여는 상이한 활성 화합물 또는 조성물을 사용할 수도 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 투여되는 활성 화합물 또는 조성물 중의 각각의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인은 서로 상이하다, 예를 들어 1차 및 2차, 또는 1차, 2차 및 3차 투여는 각각 상이한 활성 화합물 또는 조성물을 사용하며, 여기에서 상기 투여되는 각 활성 화합물 또는 조성물 중의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 적어도 구상 헤드 도메인이 상이하다. 이들 실시태양에 따라서, 추가접종을 상기 대상에게 상기 2차 접종에 이어서 예를 들어 3 내지 6개월, 6 내지 9개월, 또는 6 내지 12개월 간격으로 투여할 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 추가접종은 상이한 활성 화합물 또는 조성물을 사용할 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 1차(초회항원자극) 투여는 전장 헤마글루티닌 또는 그의 단편(또는 상기를 암호화하는 핵산)을 포함하고, 상기 2차(추가접종) 투여는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드(또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기 폴리펩타이드를 포함하는 VLP, 또는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스 또는 세균)의 투여를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 동일한 활성 화합물 또는 조성물의 투여들을 반복할 수 있으며 상기 투여들을 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 적어도 6개월 분리시킬 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 활성 화합물 또는 조성물을 대상에게 매년 1회 단일 용량으로서 투여한다.
아동에의 투여에 대한 특정한 실시태양에서, 1개월 이상 떨어져서 제공되는, 2회 용량의 본 발명에 개시된 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물을 아동에게 투여한다. 성인에의 투여에 대한 특정한 실시태양에서, 단일 용량을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 1개월 이상 떨어져서 제공되는, 2회 용량의 활성 화합물 또는 조성물을 성인에게 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 어린 아동(6개월 내지 9개월 된)에게 1개월 떨어져서 제공되는 2회 용량의 활성 화합물 또는 조성물을 최초로 투여할 수도 있다. 특정 실시태양에서, 백신접종 첫해에 단지 1회 용량을 받은 아동은 다음해에 2회 용량을 받아야 한다. 일부 실시태양에서, 인플루엔자 백신, 예를 들어 본 발명에 개시된 면역원성 제형을 처음으로 투여받은 2 내지 8세 아동의 경우 4주 떨어져서 투여되는 2회 용량이 바람직하다. 몇몇 실시태양에서, 6 내지 35개월 아동의 경우, 3세 초과 대상에게 바람직할 수 있는 0.5 ㎖과 대조적으로, 절반 용량(0.25 ㎖)이 바람직할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 인간 유아에의 투여의 경우, 2회 용량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 그의 조성물 및/또는 본 발명에 개시된 핵산, 벡터, VLP 및 비로솜 중 하나 이상을 유아에게 투여하며, 여기에서 1차 용량에 사용되는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 헤드 도메인은 2차 용량에 사용되는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 헤드 도메인과 상이한 균주 또는 하위유형으로부터의 것이다. 상기 1차 및 2차 투여를 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 적어도 6개월 분리시킬 수 있다.
특정한 실시태양에서, 인간 유아에의 투여의 경우, 3회 용량의 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 그의 조성물 및/또는 본 발명에 개시된 핵산, 벡터, VLP 및 비로솜 중 하나 이상을 유아에게 투여하며, 여기에서 1차, 2차 및 3차 용량에 사용되는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 헤드 도메인은 인플루엔자 바이러스의 상이한 균주 또는 하위유형으로부터의 것이다. 상기 1차, 2차 및 3차 투여를 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 적어도 6개월 분리시킬 수도 있다.
특정 실시태양에서, 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 또는 조성물을 대상에게 가을이나 겨울에, 즉 양 반구에서 인플루엔자 계절 전에 또는 상기 계절 동안 투여한다. 하나의 실시태양에서, 아동에게 상기 2차 용량을 인플루엔자 계절의 절정 전에 제공할 수 있도록, 상기 계절의 초기에, 예를 들어 북반구에서는 9월 말 또는 10월 초에 투여한다.
항체(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 사용하여 생성되고/되거나 확인된 항체)에 의한 수동 면역화의 경우, 상기 투여량 범위는 환자 체중의 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 및 보다 대개는 0.01 내지 5 ㎎/㎏이다. 예를 들어 투여량은 1 ㎎/㎏ 체중 또는 10 ㎎/㎏ 체중 또는 1 내지 10 ㎎/㎏의 범위 이내, 또는 다른 말로, 70 ㎏ 환자의 경우, 각각 70 ㎎ 또는 700 ㎎, 또는 70 내지 700 ㎎의 범위 이내일 수 있다. 예시적인 치료 섭생은 1년의 기간 동안 또는 수년에 걸쳐, 또는 수년-간격에 걸쳐 매 2주당 1회 또는 1개월에 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 단클론 항체를 동시에 투여하며, 이 경우에 투여되는 각 항체의 투여량은 상기 나타낸 범위 이내에 있다. 항체를 대개는 수회 투여한다. 단일 투여량간의 간격은 주마다, 월마다, 또는 해마다일 수 있다. 간격은 또한, 환자 중의 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다.
13. 생물학적 분석
13.1. 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 활성을 시험하기 위한 분석
본 발명에 개시된 벡터 중의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 발현을 시험하기 위한 분석을 당해 분야에 공지된 임의의 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터에의 통합에 대한 분석은 당해 분야에 널리 공지된 방법들을 사용하여, 상기 바이러스를 증식시키고, 슈크로스 쿠션을 통해 원심분리에 의해 상기 바이러스 입자를 정제하고, 면역분석, 예를 들어 웨스턴 블럿팅에 의해 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 발현에 대해서 후속으로 분석함을 포함한다. 헤마글루티닌 폴리펩타이드가 키메릭인지의 여부를 측정하기 위한 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있으며 본 발명에 개시되어 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 당해 분야에 공지된 항체-항원 상호작용에 대한 임의의 분석을 사용하여, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 예를 들어 상기 폴리펩타이드의 줄기 영역에 대한 중화 항체에 특이적으로 결합하는 그의 능력을 시험함으로써 적합한 폴딩 및 기능에 대해 분석한다. 상기와 같은 분석에 사용하기 위한 중화 항체는 예를 들어, 문헌[Ekiert DC et al . (2009) Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (published in Science Express February 26, 2009)]; 문헌[Kashyap et al . (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991]; 문헌[Sui et al . (2009) Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16: 265-273]; 미국특허 제 5,589,174 호, 미국특허 제 5,631,350 호, 미국특허 제 6,337,070 호, 및 미국특허 제 6,720,409 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2007/134237 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2007/068983 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2009/036157 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2008/075998 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2008/028946 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/EP2007/059356 호; 국제 특허 출원 공개 제 WO 2009/079259 호로서 공개된 국제 출원 제 PCT/US2008/085876 호에 개시된 중화 항체들을 포함한다. 이들 항체는 특히 CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179(FERM BP-4517), AI3C(FERM BP-4516), CR8114, CR8020(문헌[Ekiert et al ., 2011. Science. 333(6044): 843-850]), FI6(문헌[Corti et al ., 2011. Science. 333(6044) 850-856, DOI: 10.1126/science.1205669]), 인플루엔자 B형 바이러스 줄기 mAb 3A2, 10C4, 또는 5A7(문헌[Yasugi et al., 2013. PLoS Pathog. 9(2): e1003150])을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 NMR, X-선 결정학 방법, 또는 2차 구조 예견 방법, 예를 들어 원평광 2색성을 사용하여 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구조 또는 입체형태의 측정에 의해 적합한 폴딩에 대해 분석한다.
13.2. 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 사용하여 생성된 항체의 활성을 시험하기 위한 분석
본 발명에 개시된 항체를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다양한 방식들로 특성화할 수 있다(예를 들어, ELISA, 표면 플라스몬 공명 디스플레이(BIAcore), 웨스턴 블럿, 면역형광, 면역염색, 및/또는 미세중화 분석). 일부 실시태양에서, 항체를 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 벡터에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 분석한다. 상기와 같은 분석을 용액 중에서(예를 들어, 문헌[Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412 421]), 비드상에서(문헌[Lam, 1991, Nature 354:82 84]), 칩상에서(문헌[Fodor, 1993, Nature 364:555 556]), 세균상에서(미국특허 제 5,223,409 호), 포자상에서(미국특허 제 5,571,698 호; 미국특허 제 5,403,484 호; 및 미국특허 제 5,223,409 호), 플라스미드상에서(문헌[Cull et al ., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869]) 또는 파지상에서(문헌[Scott and Smith, 1990, Science 249:386 390]; 문헌[Cwirla et al ., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382]; 및 문헌[Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301 310])(이들 참고문헌들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다) 수행할 수 있다.
상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 항체의 특이적인 결합 및 다른 항원과의 교차-반응성을 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가할 수 있다. 특이적인 결합 및 교차-반응성을 분석하는데 사용될 수 있는 면역분석은 몇 가지 언급하자면, 비제한적으로 웨스턴 블럿, 방사성면역분석, ELISA(효소 결합된 면역흡수 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침강소 반응, 젤 확산 침강소 반응, 면역확산 분석, 응집반응 분석, 보체결합 분석, 면역방사성측정 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석과 같은 기법들을 사용하는 경쟁 및 비경쟁 분석 시스템을 포함한다. 상기와 같은 분석은 통상적이며 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al ., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오).
키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 항체의 결합 친화성 및 항체-항원 상호작용의 분리속도(off-rate)를 경쟁 결합 분석에 의해 측정할 수 있다. 경쟁 결합 분석의 일례는 증가량의 비표지된 항원의 존재하에서 관심 항체와 표지된 항원(예를 들어, 3H 또는 125I)의 배양, 및 표지된 항원에 대한 상기 항체의 검출을 포함하는 방사성면역분석이다. 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 항체의 친화성 및 결합 분리속도를 스캐차드 플롯 분석에 의해 상기 데이터로부터 측정할 수 있다. 2차 항체와의 경쟁을 또한 방사성면역분석을 사용하여 측정할 수 있다. 이 경우에, 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 증가량의 비표지된 2차 항체의 존재하에서, 표지된 화합물(예를 들어, 3H 또는 125I)에 접합된 시험 항체와 배양한다.
몇몇 실시태양에서, 항체 결합 친화성 및 반응속도 상수를 KinExA 3000 시스템(사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments), 미국 아이다호주 보이스 소재)을 사용하여 측정한다. 일부 실시태양에서, 표면 플라스몬 공명(예를 들어, BIAcore 동역학) 분석을 사용하여 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 대한 항체의 결합 및 분리속도를 측정한다. BIAcore 동역학 분석은 표면상에 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 고정화된 항체를 갖는 칩으로부터 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 결합 및 해리를 분석함을 포함한다. 전형적인 BIAcore 동역학 연구는 센서 칩 표면(상기 위에 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드가 고정화되어 있다) 상에 0.005% 트윈-20을 함유하는 HBS 완충제 중의 다양한 농도의 항체 시약(mAb, Fab) 250 ㎕를 주입함을 포함한다. 상기 유속을 75 ㎕/분에서 일정하게 유지시킨다. 해리 데이터를 필요에 따라 15분 이상 수집한다. 각 주입/해리 주기에 이어서, 상기 결합된 항체를 묽은 산, 전형적으로 10 내지 100 mM HCl(다른 재생제가 환경상 이유로서 사용되긴 하지만)의 짧은 1분 펄스를 사용하여 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드 표면으로부터 제거한다. 보다 구체적으로, 결합 속도 kon 및 해리 속도 koff의 측정을 위해서 상기 폴리펩타이드를 표준 아민 커플링 화학, 즉 EDC/NHS 방법(EDC = N-다이에틸아미노프로필)-카보다이이미드)의 사용을 통해 상기 센서 칩 표면상에 직접 고정화시킨다. 간단하게, 10 mM NaOAc(pH 4 또는 pH 5) 중의 폴리펩타이드 5 내지 100 nM 용액을 제조하고 상기 용액을 대략 30 내지 50 RU 값의 폴리펩타이드가 고정화될 때까지 EDC/NHS-활성화된 표면위에 통과시킨다. 이어서, 반응하지 않은 활성 에스터를 1M Et-NH2의 주입에 의해 "덮어버린다". 폴리펩타이드를 함유하지 않는 블랭크 표면을, 참조를 목적으로 동일한 고정화 조건하에서 준비한다. 일단 적합한 표면이 준비되었으면, 상기 항체 시약들 중 각 하나의 적합한 일련의 희석물을 HBS/트윈-20 중에서 제조하고, 상기 폴리펩타이드 및 기준 세포 표면들(일렬로 연결되어 있다) 모두의 위에 통과시킨다. 제조되는 항체 농도의 범위는 평형 결합 상수 KD가 추정되는 것에 따라 변한다. 상술한 바와 같이, 상기 결합된 항체를 적합한 재생제를 사용하여 각각의 주입/해리 주기후에 제거한다.
항체의 중화 활성을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명에 개시된 항체를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법을 사용하여, 인플루엔자 바이러스, 또는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 임의의 다른 조성물(예를 들어, VLP, 리포솜, 또는 세제 추출물)의 그의 숙주 세포 수용체(즉, 시알산)에의 결합을 억제하는 능력에 대해서 분석할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 수용체를 발현하는 세포를 항체의 존재 또는 부재하에서 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 접촉시킬 수 있고, 상기 항원의 결합을 억제하는 상기 항체의 능력을 예를 들어 유식 세포측정 또는 섬광 분석에 의해서 측정할 수 있다. 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 또는 상기 항체를 포함하는 조성물을 검출가능한 화합물, 예를 들어 방사성 표지(예를 들어, 32P, 35S 및 125I) 또는 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리쓰린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드 및 플루오레스카민)로 표지하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 조성물과 세포 수용체간의 상호작용을 검출할 수 있다. 한편으로, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 그의 수용체에의 결합으로부터 억제하는 항체의 능력을 무세포 분석에서 측정할 수 있다. 예를 들어 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 항체와 접촉시키고 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 세포 수용체에의 결합으로부터 억제하는 상기 항체의 능력을 측정할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 항체를 고체 지지체상에 고정화시키고 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 검출가능한 화합물로 표지한다. 한편으로, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 고체 지지체상에 고정화시키고 상기 항체를 검출가능한 화합물로 표지한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 세포 수용체에의 결합으로부터 억제하는 항체의 능력을, 대조군(예를 들어, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 세포 수용체에의 결합으로부터 억제하는 것으로 공지된 항체)에 대한 상기 항체의 결합 억제의 백분율을 평가함으로써 측정한다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 항체는 인플루엔자 바이러스 수용체 결합을 억제하지 않지만, 본 발명에 개시된 분석에서 여전히 중화성인 것으로 밝혀졌다. 일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 방법에 따라 사용하기에 적합한 항체는 당해 분야에 공지되거나 본 발명에 개시된 분석에서 바이러스-숙주 막 융합을 감소시키거나 억제시킨다.
하나의 실시태양에서, 바이러스-숙주 막 융합을 리포터를 함유하는 인플루엔자 바이러스 및 상기 바이러스로 감염될 수 있는 숙주 세포를 사용하여 시험관내 분석에서 분석한다. 항체는 리포터 활성이 음성 대조군(예를 들어, 대조군 항체의 존재하의 또는 항체의 부재하의 리포터 활성)에 비해 억제되거나 감소되는 경우 융합을 억제한다.
하나의 실시태양에서, 바이러스-숙주 막 융합을 세포 융합의 모델 시스템을 사용하여 검출한다. 예시적인 세포 융합 분석에서, 세포(예를 들어, HeLa 세포)를 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고 항체의 존재하에서 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드 융합 기능을 허용하는 완충제(예를 들어, pH 5.0 완충제)에 접촉 및 노출시킨다. 항체는 음성 대조군에 비해(예를 들어, 대조군 항체의 존재 또는 항체의 부재하의 융합세포 형성) 융합세포 형성을 감소시키거나 억제하는 경우 중화성이다.
다른 실시태양에서, 바이러스-숙주 막 융합을 시험관내 리포솜-기재 분석을 사용하여 분석한다. 예시적인 분석에서, 상기 숙주 세포 수용체를 리포터의 절반을 함유하는 리포솜으로 재구성한다. 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 또 다른 절반의 리포터를 함유하는 또 다른 리포솜 세트로 재구성한다. 상기 두 리포솜 집단을 함께 혼합하는 경우, 융합을 상기 리포터의 재구성, 예를 들어 비색측정에 의해 검출될 수 있는 효소 반응에 의해 검출한다. 상기 항체는 리포터 활성이 항체의 부재 또는 대조군 항체의 존재하에서 수행된 분석에서의 리포터 활성에 비해 감소되거나 억제되는 경우 융합을 억제한다. 몇몇 실시태양에서, 융합을 억제하는 항체의 능력을, 대조군 존재하의 융합의 백분율에 비해 항체 존재하의 융합의 백분율을 평가함으로서 측정한다.
13.3. 자극된 세포의 활성을 시험하기 위한 분석
본 발명에 개시된 방법에 따라 자극된 세포를, 예를 들어 관심 폴리펩타이드 또는 유전자(들)의 통합, 전사 및/또는 발현, 상기 통합된 유전자의 사본수, 및 상기 통합의 위치에 대해서 분석할 수 있다. 상기와 같은 분석을 언제라도 수행할 수 있으며 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 의한 표적 세포의 성공적인 자극을, 당해 분야에 공지되거나 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 중화 항체의 생성을 검출함으로써 측정한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 자극된 세포, 예를 들어 DC가 투여되는 대상을 당해 분야에 공지되거나 본 발명에 개시된 임의의 방법에 의해, 상기 세포의 위치, 벡터-전달된 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현, 면역 반응(예를 들어, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드에 대한 중화 항체의 생성)의 자극에 대해 분석하고/하거나 인플루엔자 바이러스 감염 또는 상기 감염과 관련된 질병의 증상에 대해 모니터할 수 있다.
리포터 분석을 사용하여 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 표적화의 특이성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 골수 세포의 혼합된 집단을 대상로부터 수득하고 시험관내에서 배양할 수 있다. 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 상기 골수 세포의 혼합된 집단에 투여하고, 상기 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드와 관련된 리포터 유전자의 발현을 상기 배양된 세포에서 분석할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 혼합된 세포 집단에서 자극된 세포의 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 70%, 80% 또는 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 95%는 수지상 세포이다.
13.4. 항바이러스 활성 분석
본 발명에 개시된 항체 또는 그의 조성물을 항바이러스 활성에 대해 시험관내에서 평가할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 조성물을 인플루엔자 바이러스의 증식에 대한 그의 효과에 대해서 시험관내에서 시험한다. 인플루엔자 바이러스의 증식을 당해 분야에 공지되거나 본 발명에 개시된 임의의 방법에 의해 평가할 수 있다(예를 들어, 세포 배양물 중에서). 특정한 실시태양에서, 세포를 0.0005 및 0.001, 0.001 및 0.01, 0.01 및 0.1, 0.1 및 1, 또는 1 및 10의 MOI, 또는 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 또는 10 의 MOI로 감염시키고 보충된 무혈청 배지와 함께 배양한다. 바이러스 역가를 헤마글루티닌 플라크 또는 본 발명에 개시된 임의의 다른 바이러스 분석에 의해 상등액 중에서 측정한다. 바이러스 역가를 평가할 수 있는 세포는 비제한적으로 EFK-2 세포, 베로 세포, MDCK 세포, 1차 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC), H292 인간 상피 세포주 및 HeLa 세포를 포함한다. 시험관내 분석은 당해 분야에 널리 공지되거나 본 발명에 개시된 방법들을 사용하여 변경된 바이러스 복제(예를 들어, 플라크 형성에 의해 측정된 바와 같은) 또는 바이러스 단백질(예를 들어, 웨스턴 블럿 분석에 의해 측정된 바와 같은) 또는 바이러스 RNA(예를 들어, RT-PCR 또는 노던 블럿 분석에 의해 측정된 바와 같은)의 생성을 측정하는 것들을 포함한다.
하나의 비제한적인 예에서, 표적 포유동물 세포주의 단층을 상이한 양(예를 들어, 3 플라크 형성 단위(pfu) 또는 5 pfu의 다중도)의 바이러스(예를 들어, 인플루엔자)로 감염시키고 후속으로 다양한 희석률의 항체(예를 들어, 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재하에서 배양시킨다. 감염된 배양물을 감염후 48 시간 또는 72 시간째에 수확하고 적합한 표적 세포주(예를 들어, 베로 세포) 상에서 당해 분야에 공지된 표준 플라크 분석에 의해 역가측정한다.
적혈구응집반응 분석의 비제한적인 예에서, 세포를 항체와 접촉시키고 동시에 또는 후속으로 상기 바이러스로 감염시키고(예를 들어, 1의 MOI에서) 상기 바이러스를 바이러스 복제를 허용하는 조건하에서 배양시킨다(예를 들어, 20 내지 24 시간). 상기 항체는 바람직하게는 감염 과정 전체를 통해 존재한다. 이어서 바이러스 복제 및 바이러스 입자의 방출을 0.5% 닭 적혈구를 사용하여 적혈구응집반응 분석에 의해 측정한다. 예를 들어 문헌[Kashyap et al ., PNAS USA 105: 5986-5991]을 참조하시오. 일부 실시태양에서, 화합물은 바이러스 복제를 HA의 2개 이상의 웰까지 감소시키는 경우(이는 바이러스 역가의 대략 75% 감소와 같다) 바이러스 복제의 억제제로서 간주된다. 특정한 실시태양에서, 억제제는 상기 분석에서 바이러스 역가를 50% 이상까지, 55% 이상까지, 60% 이상까지, 65% 이상까지, 70% 이상까지, 75% 이상까지, 80% 이상까지, 85% 이상까지, 90% 이상까지, 또는 95% 이상까지 감소시킨다. 다른 특정한 실시태양에서, 억제제는 대상에서 대략 1 로그 이상, 대략 2 로그 이상, 대략 3 로그 이상, 대략 4 로그 이상, 대략 5 로그 이상, 대략 6 로그 이상, 대략 7 로그 이상, 대략 8 로그 이상, 대략 9 로그 이상, 대략 10 로그 이상, 1 내지 3 로그, 1 내지 5 로그, 1 내지 8 로그, 1 내지 9 로그, 2 내지 10 로그, 2 내지 5 로그, 2 내지 7 로그, 2 로그 내지 8 로그, 2 내지 9 로그, 2 내지 10 로그 3 내지 5 로그, 3 내지 7 로그, 3 내지 8 로그, 3 내지 9 로그, 4 내지 6 로그, 4 내지 8 로그, 4 내지 9 로그, 5 내지 6 로그, 5 내지 7 로그, 5 내지 8 로그, 5 내지 9 로그, 6 내지 7 로그, 6 내지 8 로그, 6 내지 9 로그, 7 내지 8 로그, 7 내지 9 로그, 또는 8 내지 9 로그의 인플루엔자 바이러스의 역가의 감소를 생성시킨다. 인플루엔자 바이러스 역가의 로그-감소는 음성 대조군에 대한 비교, 또 다른 치료에 대한 비교, 또는 항체 투여 전 상기 환자에서의 역가에 대한 비교일 수 있다.
13.5. 세포독성 분석
당해 분야에 널리 공지된 다수의 분석들을 사용하여 활성 화합물 또는 그의 조성물에의 노출에 따른 세포(감염되거나 감염되지 않은) 또는 세포주의 생육력을 평가하고, 따라서 상기 화합물 또는 조성물의 세포독성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 세포 증식을 브로모데옥시유리딘(BrdU) 통합(예를 들어, 문헌[Hoshino et al ., 1986, Int. J. Cancer 38, 369]; 문헌[Campana et al ., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79]을 참조하시오), (3H) 티미딘 통합(예를 들어, 문헌[ Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403]; 문헌[Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:18367 73]을 참조하시오)을 측정함으로써, 직접 세포 카운트에 의해, 또는 공지된 유전자, 예를 들어 원발암유전자(예를 들어, fos, myc) 또는 세포 주기 마커(Rb, cdc2, 사이클린 A, D1, D2, D3, E 등)의 전사, 번역 또는 활성의 변화를 검출함으로써 분석할 수 있다. 상기와 같은 단백질 및 mRNA 및 활성의 수준을 당해 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 단백질을, 상업적으로 입수할 수 있는 항체를 포함한 항체를 사용하여 공지된 면역진단 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿팅 또는 면역침전에 의해 정량분석할 수 있다. mRNA를 당해 분야에 널리 공지되고 통상적인 방법들을 사용하여, 예를 들어 노던 분석, RNase 보호, 또는 역 전사와 함께 폴리머라제 쇄 반응을 사용하여 정량분석할 수 있다. 세포 생육력을 당해 분야에 공지된 트립판-블루 염색 또는 다른 세포사 또는 생육력 마커를 사용하여 평가할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 세포성 ATP의 수준을 측정하여 세포 생육력을 측정한다.
특정한 실시태양에서, 세포 생육력을 당해 분야의 분석 표준, 예를 들어 세포내 ATP의 수준을 측정하는 셀티터-글로(CellTiter-Glo) 분석 키트(프로메가(Promega))를 사용하여 3일 및 7일 기간으로 측정한다. 세포 ATP의 감소는 세포독성 효과를 가리킨다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 세포 생육력을 뉴트럴 레드 흡수 분석에서 측정할 수 있다. 다른 실시태양에서, 형태 변화에 대한 시각적 관찰은 확대, 입도, 거친 테두리를 갖는 세포, 필름같은 외관, 라운딩, 웰 표면으로부터의 탈착, 또는 다른 변화를 포함할 수 있다. 이들 변화를 T(100% 독성), PVH(부분 독성 - 매우 무거운 - 80%), PH(부분 독성 - 무거운 - 60%), P(부분 독성 - 40%), Ps(부분 독성 - 가벼운 - 20%), 또는 0(독성 없음 - 0%)의 명칭으로 제공되며, 이들은 나타난 세포독성의 정도에 따른다. 50% 세포 억제(세포독성) 농도(IC50)를 상기 데이터의 회귀 분석에 의해 측정한다.
특정한 실시태양에서, 상기 세포독성 분석에 사용되는 세포는 1차 세포 및 세포주를 포함한 동물 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 몇몇 실시태양에서, 세포독성을 하기의 세포주들 중 하나 이상에서 평가한다: U937, 인간 단핵세포 세포주; 1차 말초 혈액 단핵세포(PBMC); Huh7, 인간 간모세포종 세포주; 293T, 인간 배아 신장세포주; 및 THP-1, 단핵세포. 몇몇 실시태양에서, 세포독성을 하기의 세포주들 중 하나 이상에서 평가한다: MDCK, MEF, Huh 7.5, 디트로이트(Detroit), 또는 인간 기관기관지 상피(HTBE) 세포.
활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드) 또는 그의 조성물을 동물 모델에서 생체내 독성에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 활성 화합물의 활성을 시험하는데 사용되는, 본 발명에 개시된 동물 모델 및/또는 당해 분야에 공지된 다른 모델을 또한 상기 화합물의 생체내 독성을 측정하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 동물에게 일련의 농도의 활성 화합물을 투여한다. 후속으로, 상기 동물을 치사율, 체중 손실 또는 체중 증가의 실패, 및/또는 조직 손상을 가리킬 수 있는 혈청 마커의 수준(예를 들어, 일반적인 조직 손상의 지표로서 크레아틴 포스포키나제 수준, 가능한 간 손상의 지표로서 글루탐산 옥살산 트랜스아미나제 또는 피루브산 트랜스아미나제의 수준)에 대해 시간에 걸쳐 모니터한다. 이들 생체내 분석은 또한 투여량 외에 다양한 투여 방식 및/또는 섭생의 독성을 시험하는데 적합할 수 있다.
활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)의 독성 및/또는 효능을, 예를 들어 LD50(집단의 50%까지 치사성인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)의 측정을 위해서, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 실행에 의해 측정할 수 있다. 독성 및 치료 효과간의 용량비가 치료 지수이며 이를 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 활성 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 활성 화합물을 사용할 수도 있지만, 상기와 같은 작용제를, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고 이에 의해 부작용을 감소시키기 위해 병든 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 주의해서 설계해야 한다.
상기 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 획득된 데이터를 인간에 사용하기 위한 일련의 투여량의 활성 화합물을 제형화하는데 사용할 수 있다. 상기와 같은 작용제의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없이 상기 ED50을 포함하는 일련의 순환 농도 내에 있다. 상기 투여량은 사용되는 투여형 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 변할 수 있다. 본 발명에 개시되는 방법에 사용되는 임의의 활성 화합물의 경우, 상기 유효 용량을 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정할 수 있다. 동물 모델에서, 세포 배양물 중에서 측정된 바와 같은 IC50(즉, 증상의 최대 절반 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환하는 혈장 농도 범위를 성취하기 위한 용량을 제형화할 수 있다. 상기와 같은 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 중 수준을, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다. 투여량 결정을 위한 추가적인 정보가 본 발명에서 제공된다.
더욱이, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 분석을 사용하여, 예를 들어 바이러스 감염 또는 상기와 관련된 상태 또는 증상을 측정함으로써 본 발명에 개시된 활성 화합물 및 조성물의 예방학적 및/또는 치료학적 유용성을 평가할 수 있다.
13.6. 생체내 항바이러스 활성
활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드) 및 그의 조성물을 인간에서 사용하기 전에 목적하는 치료 또는 예방 활성에 대해서 생체내에서 분석할 수 있다. 예를 들어, 생체내 분석을 사용하여, 활성 화합물 또는 그의 조성물 및/또는 또 다른 치료법의 투여가 바람직한지의 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 질병의 예방을 위한 활성 화합물 또는 그의 조성물의 용도를 평가하기 위해서, 상기 조성물을 동물이 인플루엔자 바이러스로 감염되기 전에 투여할 수 있다. 한편으로, 또는 또한, 활성 화합물 또는 그의 조성물을 동물이 인플루엔자 바이러스로 감염됨과 동시에 상기 동물에게 투여할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 감염 또는 상기와 관련된 질병을 치료하기 위한 활성 화합물 또는 그의 조성물의 용도를 평가하기 위해서, 상기 화합물 또는 조성물을, 동물을 인플루엔자 바이러스로 감염시킨 후에 투여할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 활성 화합물 또는 그의 조성물을 상기 동물에게 1회 초과하여 투여한다.
활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드) 및 그의 조성물을, 비제한적으로 래트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 돼지, 흰족제비, 염소, 양, 개, 토끼, 기니피그 등을 포함한 동물 모델 시스템에서 항바이러스 활성에 대해 시험할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 활성 화합물 및 그의 조성물을 마우스 모델 시스템에서 시험한다. 상기와 같은 모델 시스템은 숙련가에게 광범위하게 사용되며 잘 공지되어 있다. 특정한 실시태양에서, 활성 화합물 및 그의 조성물을 마우스 모델 시스템에서 시험한다. 인플루엔자 바이러스에 대한 동물 모델의 비제한적인 예는 본 섹션에서 제공된다.
일반적으로, 동물을 인플루엔자 바이러스로 감염시키고 활성 화합물 또는 그의 조성물, 또는 위약으로 동시에 또는 후속으로 처리한다. 한편으로, 동물을 할성 화합물 또는 그의 조성물 또는 위약으로 처리하고 후속으로 인플루엔자 바이러스로 감염시킨다. 이들 동물로부터 획득한 샘플(예를 들어, 혈청, 소변, 타액, 정액, 침, 혈장 또는 조직 샘플)을 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 변경된 바이러스 역가(예를 들어, 플라크 형성에 의해 측정된 바와 같은), 바이러스 단백질의 생성(예를 들어, 웨스턴 블럿, ELISA 또는 유식 세포측정 분석에 의해 측정된 바와 같은), 또는 바이러스 핵산의 생성(예를 들어, RT-PCR 또는 노던 블럿 분석에 의해 측정된 바와 같은)을 측정하는 방법을 통해 바이러스 복제에 대해 시험할 수 있다. 조직 샘플 중 바이러스의 정량분석을 위해서, 조직 샘플을 포스페이트-완충된 염수(PBS) 중에서 균질화하고, 등명화된 균질물의 희석물을 세포(예를 들어, 베로, CEF 또는 MDCK 세포)의 단층상에 37 ℃에서 1시간 동안 흡착시킨다. 다른 분석에서, 조직병리학적 평가, 바람직하게는 상기 바이러스가 감염을 표적화하는 것으로 공지된 기관(들)의 평가를 감염 후에 수행한다. 바이러스 면역조직화학을 바이러스-특이성 단클론 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
바이러스의 독성에 대한 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드) 또는 그의 조성물의 효과를 또한, 활성 화합물 또는 그의 조성물이 투여된 감염된 대상에서 상기 바이러스의 역가, 활성 화합물 또는 그의 조성물이 투여된 감염된 대상의 생존의 길이, 활성 화합물 또는 그의 조성물이 투여된 감염된 대상에서 면역 반응, 활성 화합물 또는 그의 조성물이 투여된 감염된 대상에서 증상의 수, 지속기간 및/또는 중증도, 및/또는 활성 화합물 또는 그의 조성물이 투여된 감염된 대상에서 하나 이상의 증상의 개시 전의 기간을 평가하는 생체내 분석을 사용하여 측정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기법을 사용하여 상기와 같은 효과를 측정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 활성 화합물 또는 그의 조성물은 처리되지 않은 대상에 비해 인플루엔자 바이러스의 역가를 0.5배, 1배, 2 배, 4 배, 6 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 25 배, 50 배, 75 배, 100 배, 125 배, 150 배, 175 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 750 배, 또는 1,000 배 또는 그 이상 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 활성 화합물 또는 그의 조성물은 처리되지 않은 대상에 비해 대략 1 로그 이상, 대략 2 로그 이상, 대략 3 로그 이상, 대략 4 로그 이상, 대략 5 로그 이상, 대략 6 로그 이상, 대략 7 로그 이상, 대략 8 로그 이상, 대략 9 로그 이상, 대략 10 로그 이상, 1 내지 3 로그, 1 내지 5 로그, 1 내지 8 로그, 1 내지 9 로그, 2 내지 10 로그, 2 내지 5 로그, 2 내지 7 로그, 2 로그 내지 8 로그, 2 내지 9 로그, 2 내지 10 로그 3 내지 5 로그, 3 내지 7 로그, 3 내지 8 로그, 3 내지 9 로그, 4 내지 6 로그, 4 내지 8 로그, 4 내지 9 로그, 5 내지 6 로그, 5 내지 7 로그, 5 내지 8 로그, 5 내지 9 로그, 6 내지 7 로그, 6 내지 8 로그, 6 내지 9 로그, 7 내지 8 로그, 7 내지 9 로그, 또는 8 내지 9 로그의 인플루엔자 바이러스의 역가의 감소를 생성시킨다.
인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스제의 시험에 사용하기 위해 개발된, 인플루엔자 바이러스 동물 모델, 예를 들어 흰족제비, 마우스, 기니피그, 다람쥐원숭이, 마카크 및 닭이 개시되었다. 예를 들어 문헌[Sidwell et al ., Antiviral Res., 2000, 48:1-16; Lowen A.C. et al . PNAS., 2006, 103: 9988-92]; 및 문헌[McCauley et al ., Antiviral Res., 1995, 27:179-186] 및 문헌[Rimmelzwann et al., Avian Diseases, 2003, 47:931-933]을 참조하시오. 인플루엔자의 마우스 모델에 대해서, 인플루엔자-감염된 마우스에게 투여된 활성 화합물의 항바이러스 활성을 분석하는데 사용될 수 있는 매개변수들의 비제한적인 예는 폐렴-관련된 사망, 혈청 α1-산 당단백질 증가, 동물 체중, 헤마글루티닌에 의해 분석된 폐 바이러스, 플라크 분석에 의해 분석된 폐 바이러스, 및 폐의 조직병리학적 변화를 포함한다. 통계학적 분석을 수행하여 유의수준(예를 들어, 0.05 이하의 P 값)을 계산한다.
다른 분석에서, 동물 모델 대상의 감염후에 조직병리학적 평가를 수행한다. 코 비갑개 및 기관을 상피 변화 및 상피하 염증에 대해 검사할 수 있다. 폐를 큰, 중간 및 작거나 말단의 세기관지에서의 세기관지 상피 변화 및 세기관지주변 염증에 대해서 검사할 수 있다. 폐포를 또한 염증성 변화에 대해 평가한다. 중간 세기관지를 하기와 같이 0에서 3+의 등급으로 채점한다: 0(정상: 섬모상피 정점 경계 및 기저 가성중층핵을 갖는 중간 내지 큰 원주 상피 세포가 늘어서 있다; 최소 염증); 1+(단지 약간 증가한 증식과 함께 원주모양의 고른 윤곽의 상피층; 많은 세포상에서 여전히 섬모를 볼 수 있다); 2+(약화 내지 현저한 증식 범위의 상피층에서의 현저한 변화; 해체된 세포 및 관강 경계에서 불규칙한 층 윤곽); 3+(관강에서 볼수 있는 괴사성 세포와 함께 현저하게 붕괴되고 해체된 상피층; 일부 세기관지는 가늘어졌고 다른 것들은 현저한 반응성 증식).
상기 기관을 하기와 같이 0 내지 2.5+의 등급으로 채점한다: 0(정상: 섬모상피 정점 경계, 핵 기저 및 가성중층을 갖는 중간 내지 큰 원주 상피 세포가 늘어서 있다. 정점 경계 및 핵 사이에 세포질이 분명하다. 때때로 편평세포가 있는 작은 병소가 있다); 1+(상피층의 국소 편평 화생); 2+(많은 상피층의 확산성 편평 화생, 섬모가 국소적으로 분명할 수도 있다); 2.5+(분명히 섬모가 매우 적은 확산성 편평 화생).
바이러스 면역조직화학을 바이러스-특이성 단클론 항체(예를 들어, NP-, N- 또는 NH-특이성 단클론 항체)를 사용하여 수행한다. 염색을 하기와 같이 0 내지 3+로 채점한다: 0(감염된 세포 없음); 0.5+(감염된 세포 거의 없음); 1+(넓게 분리된 개별 세포들로서, 감염된 세포가 거의 없음); 1.5+(넓게 분리된 단일 세포들 및 작은 덩어리로서, 감염된 세포가 거의 없음); 2+(적당한 수의 감염된 세포, 대개는 세기관지 내층 상피층의 일부 또는 폐포 중 작은 소엽하 병소에서 인접한 세포들의 덩어리가 침범됨); 3+(다수의 감염된 세포, 세기관지에서 상피층의 대부분이 침범되거나, 폐포 중 큰 소엽하 병소 중에 확산됨).
일례로, 바이러스 감염의 동물 모델에서 폐 병변을 유발하고 감염을 야기하는 능력을 야생형 바이러스 및 모의 바이러스를 사용하여 비교한다. 폐 병변을 육안 검사에 의해 건강한 폐엽의 백분율로서 평가할 수 있다. 동물을 펜토바르비탈의 정맥내 투여에 의해 5일 p.i.로 안락사시키고, 폐를 완전히 제거한다. 육안으로 보이는 병변에 의해 침범된 각 폐엽의 표면의 백분율을 시각적으로 평가한다. 상기 백분율들을 평균하여 각 동물의 7개 폐엽에 대한 평균값을 획득한다. 다른 분석에서, 바이러스 부담 또는 역가를 측정하기 위해서 코 면봉을 시험할 수 있다. 코 면봉을 부검중 취하여 감염후 바이러스 부담을 측정할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 바이러스를 조직 샘플 중에서 정량분석한다. 예를 들어, 조직 샘플을 포스페이트-완충된 염수(PBS)에서 균질화하고, 등명화된 균질물의 희석물을 37 ℃에서 1시간 동안 세포(예를 들어, MDCK 세포)의 단층상에 흡착시킨다. 이어서 감염된 단층을 0.1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.01% DEAE-덱스트란, 0.1% NaHCO3 및 1% 아가를 함유하는 최소 필수 배지의 용액으로 덮는다. 플레이트를 플라크가 가시화될 수 있을 때까지 2 내지 3일 배양한다. PR8-감염된 샘플로부터의 바이러스를 역가측정하기 위한 조직 배양 감염 용량(TCID) 분석을 하기와 같이 수행한다. 96-웰 플레이트 중의 세포(예를 들어, MDCK 세포)의 융합 단층을 배지 중의 등명화된 조직 균질물의 로그 희석물과 함께 배양한다. 접종후 2 내지 3일째에, 각 웰로부터 0.05-㎖ 분액들을 적혈구응집반응 분석(HA 분석)에 의해 바이러스 증식에 대해 평가한다.
13.6.1.1. 인간에서의 분석
하나의 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스의 복제를 조절하는 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드) 또는 그의 조성물을 감염된 인간 대상에서 평가한다. 상기 실시태양에 따라, 활성 화합물 또는 그의 조성물을 상기 인간 대상에게 투여하고, 바이러스 복제에 대한 상기 활성 화합물 또는 조성물의 영향을, 예를 들어 생물학적 샘플(예를 들어, 혈청 또는 혈장) 중의 바이러스 또는 바이러스 핵산의 수준을 분석함으로써 측정한다. 바이러스 복제를 변경시키는 활성 화합물 또는 그의 조성물을, 대조군으로 처리된 대상 또는 대상 그룹에서의 바이러스 복제의 수준을 활성 화합물 또는 그의 조성물로 처리된 대상 또는 대상 그룹에서의 수준과 비교함으로써 확인할 수 있다. 한편으로, 바이러스 복제의 변경을, 활성 화합물 또는 그의 조성물의 투여 전후의 대상 또는 대상 그룹에서의 바이러스 복제의 수준을 비교함으로써 확인할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 기법들을 사용하여 상기 생물학적 샘플을 수득하고 mRNA 또는 단백질 발현을 분석할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스 감염/질병과 관련된 하나 이상의 증상의 중증도에 대한 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드) 또는 그의 조성물의 영향을 감염된 대상에서 평가한다. 상기 실시태양에 따라, 활성 화합물 또는 그의 조성물 또는 대조군을 인플루엔자 바이러스 감염을 앓고 있는 인간 대상에게 투여하고 상기 바이러스 감염의 하나 이상의 증상에 대한 상기 활성 화합물 또는 조성물의 영향을 측정한다. 하나 이상의 증상을 감소시키는 활성 화합물 또는 조성물을, 대조군으로 처리된 대상을 상기 활성 화합물 또는 조성물로 처리된 대상에 비교함으로써 확인할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 활성 화합물(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드) 또는 그의 조성물의 투여는 인플루엔자 바이러스 질병 또는 감염에 의해 야기된 인간 또는 인간 집단의 입원을 감소시킨다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 활성 화합물 또는 그의 조성물의 투여는 인플루엔자 바이러스 질병 또는 감염이 있는 인간 또는 인간 집단에서 호흡/숨쉬기 지원의 필요성을 감소시킨다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 활성 화합물 또는 그의 조성물의 투여는 인플루엔자 바이러스 질병 또는 감염이 있는 인간 또는 인간 집단의 질병의 기간을 감소시킨다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 활성 화합물 또는 그의 조성물의 투여는, 예를 들어 전신 또는 폐 혈량측정법에 의해 평가된 바와 같이 폐 용적을 개선시킨다(예를 들어, 증가시킨다). 또 다른 실시태양에서 활성 화합물 또는 그의 조성물을 건강한 인간 대상에게 투여하고 백신으로서 효능에 대해 모니터한다(예를 들어, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스 감염의 증상의 개시; 상기 대상을 감염시키는 인플루엔자 바이러스의 능력; 및/또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 감소/부재에 대해 모니터한다). 감염성 질병에 친숙한 의사들에게 공지된 기법들을 사용하여, 활성 화합물 또는 그의 조성물이 상기 인플루엔자 바이러스 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 감소시키는지의 여부를 측정할 수 있다.
14. 대상에서 항체의 평가
또 다른 태양에서, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 또는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스를 사용하여, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)에 대한 대상(예를 들어, 미경험 대상 또는 면역된/백신접종된 대상) 또는 대상 집단의 항체 반응을 평가할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드, 또는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스를 사용하여 상기 대상 또는 대상 집단에서 줄기-특이성 항체의 존재를 평가할 수 있다.
특정한 실시태양에서, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 또는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스)로 면역/백신접종된 대상 또는 대상 집단의 항체 반응을, 상기 대상 또는 대상 집단에서의 줄기-특이성 항체의 유형을 확인하기 위해 평가한다. 상기와 같은 평가는 본 발명에 개시된 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩타이드 폴리펩타이드(들)(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 또는 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스)의 투여에 대한 임상 반응을 측정하는데 중요한 대용 마커/종점을 확인할 수 있게 한다. 상기와 같은 접근법에서, 상기 대상 또는 대상 집단으로부터의 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액을 단리하고 항체의 존재에 대해 직접 시험하거나, 가공하여(예를 들어, 혈청을 얻기 위해서) 후속으로 항체의 존재에 대해 시험할 수 있다. 상기와 같은 항체 시험은 당해 분야에 공지된 분석, 예를 들어 ELISA를 사용할 수 있다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 미경험 대상(즉, 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩타이드 폴리펩타이드(들)(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드), 또는 인플루엔자 바이러스 HA 폴리펩타이드 폴리펩타이드(들)(예를 들어, 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드)를 발현하는 바이러스로 면역/백신접종된 대상) 또는 미경험 대상 집단의 항체 프로파일을, 상기 대상 또는 대상 집단이 다양한 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형들에 대한 구상 헤드-특이성 및/또는 줄기 특이성 항체를 갖는지의 여부를 측정하기 위해 평가한다. 상기와 같은 평가는 상기 대상 또는 대상 집단에 투여하기에 적합한 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드, 또는 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스의 생성을 허용할 수 있다. 상기와 같은 평가는 상기 환자에 대한 면역화 전략을 결정할 수 있다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 대상로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청)을 시험관내에서 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드와 접촉시킴을 포함하는, 특정 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형의 줄기 도메인에 특이적인 상기 대상 중의 항체의 존재를 평가/검출하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 관심 균주 또는 하위유형으로부터의 줄기 도메인을 포함한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 대상로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈청)을, 시험관내에서 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 발현/함유하는 바이러스와 접촉시킴을 포함하는, 특정 인플루엔자 바이러스 균주 또는 하위유형의 줄기 도메인에 특이적인 상기 대상 중의 항체의 존재를 평가/검출하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드는 관심 균주 또는 하위유형으로부터의 줄기 도메인을 포함한다.
15. 키트
본 발명은 본 발명에 개시된 약학/면역원성 조성물의 성분들, 예를 들어 본 발명에 제공된 하나 이상의 활성 화합물들 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제 팩 또는 키트를 제공한다. 임의로 상기와 같은 용기(들)와 함께, 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태의 통지가 있을 수 있으며, 상기 통지는 인간 투여에 대한 제조, 용도 또는 판매 당국에 의한 승인을 반영한다.
본 발명에 포함된 키트를 본 발명에 개시된 방법에 따라 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 키트는 본 발명에 개시된 활성 화합물, 바람직하게는 본 발명에 개시된 하나 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 하나 이상의 용기에 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 키트는 본 발명에 개시된 백신, 예를 들어 분할 바이러스 백신, 서브유닛 백신, 불활성화된 인플루엔자 바이러스 백신, 또는 생 인플루엔자 바이러스 백신을 포함하며, 여기에서 상기 백신은 본 발명에 개시된 하나 이상의 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함한다. 특정한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 대상 중에 존재하는 항체를 평가하기 위한 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명은 샘플 중의 HA 줄기 도메인 특이성 항체의 존재를 분석하는 방법에 사용하기 위한 본 발명에 개시된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 포함하는 키트를 제공한다.
특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트는 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포), 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포), 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포), 본 발명에 개시된 cH5/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포), 본 발명에 개시된 cH7/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포), 본 발명에 개시된 cHB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포), 또는 본 발명에 개시된 cH4/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포)를 포함한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트는 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 및 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포)의 조합; 또는 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 및 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포)의 조합을 포함한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트는 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 및 본 발명에 개시된 cH5/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포), 및 본 발명에 개시된 cH5/B, cH7/B 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 중 어느 하나의 조합을 포함한다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 본 발명에 제공된 키트는 본 발명에 개시된 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 및 본 발명에 개시된 cH7/3 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포), 및 본 발명에 개시된 cH5/B, cH7/B 및 cB/B 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드(또는 상기와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 상기와 같은 폴리펩타이드를 함유하거나 발현하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 세균), 또는 상기와 같은 폴리펩타이드로 자극된 세포) 중 어느 하나의 조합을 포함한다.
실시예
실시예 1: 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드
본 실시예는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드 및 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 투여를 포함하는 대상에서 높은 수준의 교차-중화성 HA 줄기 항체를 유도하는 방법을 개시한다. 본 실시예에 개시된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 및 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 발현하도록 조작된 세포에 의해 성공적으로 발현된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 생성시켰다. 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을, 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 줄기 및 헤드 도메인 모두의 항체 인식에 의해 입증된 바와 같이, 그의 적합한 입체형태로 성공적으로 회수하였다.
도 2는 인플루엔자 바이러스의 H1 하위유형의 줄기 도메인 및 다른 인플루엔자 바이러스 하위유형(H2, H3 및 H5)의 이종 구상 헤드 도메인을 포함하는, 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)을 묘사한다. 도 2의 전략 윤곽에 따라, H1N1(PR8-H1N1) 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 줄기 도메인 및 2009 대유행 H1 HA(Cal/09)의 구상 헤드 도메인으로 구성된 키메릭 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 생성시켰다. 상기 두 바이러스의 HA의 구상 헤드 도메인은 매우 뚜렷한 반면(약 70% 아미노산 일치성), 상기 줄기 도메인은 고도로 보존되지만 여전히 서로 다르다(약 89% 아미노산 일치성). 도 3에 입증된 바와 같이, 동일한 하위유형내에서 동일한 줄기 도메인을 갖지만 매우 상이한 HA 헤드를 갖는 키메릭 HA가 발현되었다.
또한, A/PR/8/34 HA의 줄기 도메인 및 HK/68(키메릭 H3)의 구상 헤드 도메인으로 이루어지는 키메릭 HA뿐만 아니라 야생형 HA(PR8-HA 및 HK68 HA)가 293T 세포에서 발현되었다. 도 5는 동일한 줄기 도메인(H1 하위유형 HA로부터 유래됨) 및 상이한 하위유형(H3)으로부터의 구상 헤드를 갖는 안정한 키메릭 HA를 발현하는 것이 또한 가능함을 설명한다.
따라서, 상기 HA 줄기 도메인을 완벽하게 공유하지만 그의 구상 헤드는 고도로 상이한 HA 면역원이 설계되었다. 이들 구조물에 의한 반복된 면역화는 상기 HA의 공통 줄기 도메인에 대해 높은 수준의 교차-중화성 항체를 생성시켜야 한다. 따라서 개선된 백신 전략은 확고한 교차-중화성 항-줄기 도메인 항체를 유도하기 위해서 불변 줄기 도메인 및 변화하는 구상 헤드를 갖는 키메릭 HA를 사용한다. 예를 들어 A/PR/8/34로부터의 H1 HA의 불변 줄기 도메인을 상이한 그룹 1 HA(H1, H2, H5, H9)로부터의 구상 헤드와 함께 사용하여 재조합 불활성화된 바이러스, 재조합 약독화 바이러스 및 재조합 HA 중 어느 하나의 패널을 제조할 수 있다(도 4). 예를 들어 X31 바이러스의 H3 HA의 줄기 도메인을 기본으로 하는 그룹 2 HA의 유사한 패널은 H3, H4 및 H7 구상 헤드와 함께 그룹 2 HA 범용 백신에 대한 토대를 제공할 수 있다. 재조합 바이러스를 인플루엔자 바이러스 백신 주쇄, 예를 들어 표준 기법에 의해 증식되고 불활성화 또는 약독화 백신으로서 사용된, PR/8 또는 저온-적응 인플루엔자 바이러스상에서 구제할 수 있다. 재조합 HA는 포유동물-유사 글리코실화를 수행할 수 있는 곤충 세포(MIMIC Sf9)에서 또는 예를 들어 293T 또는 베로 세포의 일시적인 형질감염에 의해 발현될 수 있으며, 이어서 C-말단 his 태그의 도움으로 Ni-킬레이트 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 다른 전략은 키메릭 HA 또는 상기 키메릭 HA를 발현하는 다른 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터를 발현하는 DNA 백신의 사용을 포함할 수 있다.
실시예 2: 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스
본 실시예는 상이한 헤마글루티닌 하위유형으로부터의 다양한 구상 헤드 및 줄기 조합을 포함하는 다수의 기능성 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌뿐만 아니라, 야생형 인플루엔자 바이러스와 유사한 증식 성질을 갖는, 상기 키메릭 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 개시한다.
물질 및 방법
세포 및 바이러스
293T 및 MDCK 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 수득하였으며 10% 송아지 태아 혈청(하이클론(HyClone); 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 및 페니실린-스트렙토마이신(깁코(Gibco), 인비트로젠(Invitrogen))이 보충된 둘베코의 최소 필수 배지(DMEM) 또는 MEM(깁코, 인비트로젠)에서 유지시켰다.
모든 A/PR/8/34 재조합 바이러스를 37 ℃에서 2일 동안 10일 된 발육계란에서 증식시켰다.
플라스미드의 제작
상이한 키메릭 헤마글루티닌을 암호화하는 플라스미드를 앞서 개시된 바와 같은 재조합 바이러스의 생성을 위한 역 유전학 플라스미드의 제작으로부터 개조된 유사한 전략에 의해 제작하였다(예를 들어, 문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682]; 및 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]을 참조하시오). 간단히, 키메릭 HA의 상이한 분절들을 SapI 부위를 함유하는 프라이머로 PCR에 의해 증폭시키고, SapI로 절단하고, 인간 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 마우스 RNA 폴리머라제 I 종결자를 함유하는 pDZ 벡터의 SapI 부위내로, 다수-분절 연결을 통해서 클로닝시켰다(예를 들어, 문헌[Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439]을 참조하시오).
유식 세포측정 분석
세포 표면에서 헤마글루티닌 단백질의 수준을 평가하기 위해서, 293T 세포를 제조사의 설명에 따라 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 1 ㎍의 적합한 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염후 24시간째에, 세포를 트립신처리하고 2% FBS를 함유하는 PBS에 재현탁한 후에 H1 HA에 대한 단클론 항체(mAb) 6F12로 1/1000 희석비로, 또는 H3 HA에 대한 mAb 12D1(문헌[Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796]을 참조하시오)로 1/400 희석비로 염색시켰다. 염색된 세포를 벡크만 쿨터 사이토믹스(Beckman Coulter Cytomics) FC 500 유식 세포계상에서 세고, 결과를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
슈도입자 생성 및 침입 분석
슈도-입자 생성을 위한 과정을 선행 연구로부터 개조하였다(예를 들어, 문헌[Evans et al., 2007, Nature 446:801-805]; 및 문헌[Sui et al., 2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009]을 참조하시오). 간단히, 293-T 세포를 (i) 목적하는 리포터(V1-GLuc)를 함유하는 프로-바이러스, (ii) HIV Gag-Pol, (iii) 상이한 키메릭 헤마글루티닌 단백질 및 (iv) 인플루엔자 A형 PR8 뉴라미니다제(NA)를 암호화하는 4개의 플라스미드로 동시-형질감염시켰다. 상등액을 형질감염후 72시간째에 수집하고 후속으로 여과하였다(0.45 ㎛ 기공 크기). 슈도-입자를 사용하는 모든 형질도입 및 감염 분석을 1 ㎍/㎖ 폴리브렌(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 존재하에서 수행하였다(문헌[Sui et al., 2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009]을 참조하시오).
상기 침입 분석을, G-Luc 리포터를 함유하는 상이한 키메릭 헤마글루티닌을 갖는 슈도-입자로 MDCK 세포를 감염시킴을 통해 수행하였다. 감염후 24시간째에, 세포를 새로운 배지로 3회 세척하여 상기 슈도-입자 접종물 중에 존재하는 G-Luc 단백질을 제거하였다. 감염후 48시간째에 루시페라제 분석을 수행하였다(문헌[Evans et al., 2007, Nature 446:801-805]을 참조하시오).
재조합 키메릭 인플루엔자 A형 바이러스의 구제
플라스미드 DNA로부터 인플루엔자 A형 바이러스의 구제를 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다(예를 들어, 문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682]; 및 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]을 참조하시오). 재조합 야생형(rWT) PR8 바이러스를 생성시키기 위해서, 293T 세포를 리포펙타민 2000(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)을 사용하여 8 pDZ PR8 구제 플라스미드 각각 1 ㎍으로 동시-형질감염시켰다. 상이한 키메릭 HA를 발현하는 바이러스들을 동일한 방식으로, 그러나 상기 HA 플라스미드를 상응하는 키메릭 플라스미드로 치환하여 생성시켜 상응하는 키메릭 바이러스를 회수하였다. 형질감염후 6시간째에, 상기 배지를 0.3% 소 혈청 알부민(BSA), 10 mM HEPES, 및 1.5 ㎍/㎖ TPCK(L-1-토실아미드-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤)-처리된 트립신을 함유하는 DMEM으로 대체하였다. 형질감염후 24시간째에, 바이러스-함유 상등액을 8일 된 발육계란에 접종하였다. 요막액을 37 ℃에서 2일 배양후에 수확하고 닭 적혈구의 적혈구응집반응에 의해서 및 MDCK 세포 중의 플라크 형성에 의해서 바이러스의 존재에 대해 분석하였다.
바이러스 증식 동역학 분석
재조합 바이러스의 복제 특성을 분석하기 위해서, 10일 된 발육계란을 100 pfu의 각각의 바이러스로 각각 접종하였다. 요막액을 수확하고 후속으로 감염후 0, 9, 24, 48 및 72시간째에(hpi) 바이러스 증식에 대해 분석하였다. 요막액 중에 존재하는 바이러스의 역가를 MDCK 세포상에서의 플라크 분석에 의해 측정하였다.
플라크의 면역염색
플라크를, 인플루엔자 A형 NP 단백질에 대한 mAb(HT103)에 의한 면역염색에 의해 가시화하였다.
웨스턴 블럿 및 간접적인 면역형광 분석
융합성 MDCK 세포의 12-웰 디쉬 중 한 웰을 37 ℃에서 1시간 동안 지시된 재조합 인플루엔자 바이러스로 감염시키거나(2의 감염 다중도[MOI]) 또는 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 모의 감염시켰다. 감염후 12시간째에(hpi), 세포를 앞서 개시된 바와 같이 1X 단백질 부하 완충제 중에 용해시켰다(예를 들어, 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]을 참조하시오). 상기 환원된 세포 용해물을 A/NP(HT103), A/PR8/HA(PY102), A/Cal/09/HA(29C1), A/VN/HA (M08)(20), A/H3/HA(12D1)에 대한 mAb를 사용하여 웨스턴 블럿 분석에 의해 분석하였다. 퍼쓰-cH7의 검출은 A/FPV/네덜란드/27(H7) 바이러스(BEI 리솔시즈(Resources)로부터 얻었다)에 대한 염소 다클론 혈청, NR-3152를 사용하였다. 상기 mAb 항-글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH) 부하 대조군 항체를 아브캠(Abcam)으로부터 얻었다. 관심 단백질들을 모두 향상된 화학발광 단백질 검출 시스템(퍼킨엘머 라이프 사이언시즈(PerkinElmer Life Sciences), 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)을 사용하여 가시화하였다.
면역형광 분석을 위해서, 15-㎜ 커버슬립상의 MDCK 세포의 융합 단층을 재조합 바이러스에 의해 2의 MOI로 감염시켰다. 15 hpi에서, 세포를 고정시키고 -20 ℃에서 20분간 메탄올-아세톤(비, 1:1)을 침투시켰다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민으로 차단시킨 후에, 세포를 1시간 동안 상기 언급한 바와 같이 A/NP(HT103), A/H1/HA(6F12), A/PR8/HA(PY102), A/Cal/09/HA(29C1), A/VN/HA(M08) (20), A/H3/HA(12D1), 및 A/H7 바이러스(NR-3152)에 대한 항체와 함께 배양시켰다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척후에, 세포를 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594-접합된 항-마우스 면역글로불린 G(IgG; 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재) 또는 알렉사 플루오르 594-접합된 항-염소 면역글로불린 G(IgG, 인비트로젠, 미국 캘리포니아 칼스바드 소재)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 최종 3회 세척에 이어서, 감염된 세포를 올림푸스(Olympus) IX70 현미경으로 형광 현미경검사에 의해 분석하였다.
결과
키메릭 헤마글루티닌의 생성
Cys52-Cys277 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기의 보존에 관한 정보를 얻기 위해서, H1, H3, H5 및 H7 하위유형의 인플루엔자 A형 바이러스 HA 서열의 정렬을 생성시켰다(도 6 참조). 상기 HA1 서브유닛의 서열은, 주로 구상 헤드 도메인상의 면역-우성 항원 부위의 존재로 인해, 상기 HA2 서브유닛의 경우보다 덜 보존된다. 보다 많이 보존된 HA2 쇄는 상기 HA 분자를 바이러스 외피에 고정시키는 줄기 영역을 포함한다. 상기 정렬은 Cys52 및 Cys277 및 상기 두 단부 모두에 대한 아미노산이, 선택된 하위유형 전체에서 보존됨을 설명한다. 이후에, Cys52에 대한 N-말단 및 Cys277에 대한 C-말단 헤마글루티닌 서열들을 줄기 도메인으로서 정의한다(도 6). 사이에 낀 서열을 본 실시예에서 헤드 도메인인 것으로 간주한다.
PR8(H1) HA로부터의 줄기 영역을 갖는 대유행 H1 Cal/09 HA 구상 헤드 도메인을 함유하는 키메릭 헤마글루티닌 구조물(PR8-cH1)을 먼저 생성시켰다(도 7A). 상기 PR8(H1) HA로부터의 줄기를 갖는 VN1203(H5) HA로부터의 구상 헤드를 함유하는 키메릭 HA(PR8-cH5)를 또한 생성시켰다(도 7B). 인플루엔자 HA의 16개 하위유형들을 모두 2개의 계통발생 그룹(그룹 1 및 2)으로 분류하며(예를 들어, 문헌[Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273]을 참조하시오) H1 및 H5 HA는 모두 그룹 1에 속하고, A/퍼쓰/16/2009(H3) HA(퍼쓰-cH7)(도 7B)로부터의 줄기 영역을 갖는 A/알버타/24/01(H7) 헤드 도메인을 갖는 키메릭 HA를 생성시키는 유사한 전략을 적용하였다. H7 및 H3은 모두 그룹 2 계통발생 그룹으로부터의 일원이다(예를 들어, 문헌[Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273]을 참조하시오).
이어서, 상기 상이한 키메릭 HA 구조물이 발현되고 세포 표면으로 운반되는지의 여부를 시험하였다. 일시적으로 형질감염된 239T 세포의 형광-활성화된 세포 분류기(FACS) 분석을, 각각 PR8 및 H3 줄기 도메인 특이성 항체에 의한 표면 염색에 따라 수행하였다(도 8a). 도 8a에 도시된 바와 같이, 3개의 키메릭 구조물 모두의 발현이 검출되었다. 상기 검출은 골지체를 통한 키메릭 HA의 세포 표면으로의 운반이 중단되지 않음을 가리킨다.
이어서, 상기 상이한 키메릭 HA의 침입 특성을, 상기 키메릭 HA, 야생형 인플루엔자 A형 PR8 NA 및 HIV-기재 루시페라제를 함유하는 레트로바이러스 HA-슈도유형 입자에 의한 MDCK 세포의 감염을 통해 검사하였다. 상기 키메릭 HA 단백질에 의해 매개된 침입 효율을 루시페라제 판독정보에 의해 검출하였다. 필적하는 수준의 슈도유형 입자-매개된 루시페라제 전달이 PR8-cH5 및 퍼쓰-cH7 키메릭 HA 및 상응하는 야생형 단백질에 대해 관찰되었다(도 8b). 상기 PR8-cH1 HA는 다른 HA 구조물에 비해 더 낮은 루시페라제 수준을 나타내었다.
키메릭 헤마글루티닌을 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스의 생성
상기 결과들에 비추어, 키메릭 HA가 전체 바이러스 입자와 관련하여 기능성인지 및 최종적으로 오직 키메릭 HA만을 발현하는 재조합 인플루엔자 A형 바이러스의 구제를 허용하는지의 여부를 확인하였다. 앞서 공개된 프로토콜을 사용하여(예를 들어, 문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682]; 및 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]), 상기 상이한 키메릭 HA를 모두 함유하는 바이러스들을 성공적으로 생성시켰다. 생성되는 바이러스들을 플라크 정제하고, 10일 된 발육란에서 증폭시키고 상기 키메릭 분절들을 RT-PCR에 의해 분석하고 서열분석하였다. 모든 경우에, 상기 바이러스들은 예상된 키메릭 HA 분절을 가지며 다른 HA 분절은 갖지 않는 것으로 밝혀졌다.
상기 키메릭 바이러스의 정체를 감염된 세포의 웨스턴 블럿팅 및 간접적인 면역형광에 의해 추가로 입증하였다(도 9a 및 9b). MDCK 세포를 rWT A/PR8, 야생형 A/퍼쓰, PR8-cH1, PR8-cH5, 및 퍼쓰-cH7 바이러스(도 9a 및 9b)로 감염시켰다. PR8-cH1 및 PR8-cH5 키메릭 HA 단백질을, 각각 Cal/09 HA(29C1) 또는 VN/04 HA(M08)(문헌[Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753]을 참조하시오)에 대한 항체를 사용하여 상응하는 샘플에서 검출하였다(도 9a). 범 H3 줄기 mAb인 12D1(문헌[Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796]을 참조하시오)을 사용하여, 상기 퍼쓰 cH7-HA와 야생형 퍼쓰 HA 사이에서 필적하는 발현 수준을 관찰하였다. 양성 밴드는 항-H7 항체(NR-3152)를 사용하는 경우 오직 상기 퍼쓰-cH7 감염 샘플에 대해서만 검출되었다.
면역형광 연구에 대해서, 감염 조건은 상기 웨스턴 분석의 경우와 유사하였다. 감염된 세포를 도 9b에 나타낸 바와 같이 상응하는 항체로 염색하였다. 감염된 세포는 모두 HA뿐만 아니라 A/NP 단백질의 예상된 발현을 나타내었다(도 9b).
재조합 바이러스의 복제 특성
상기 바이러스들의 증식 성질을 37 ℃에서 10일 된 발육계란에서 평가하였다(도 8a). rWT PR8 바이러스를, 키메릭 HA를 발현하는 재조합 바이러스의 증식 동역학의 비교를 위해 포함시켰다. PR8-cH5 바이러스에 관하여, PR8 바이러스와 비교시 유사한 복제 패턴이 관찰되었다. 퍼쓰-cH7 바이러스에 관하여, 9 hpi에서 상기 rWT PR8에 비해 바이러스 역가의 2배 감소가 존재하였다. 그럼에도 불구하고, 48 hpi에서 야생형 바이러스와 유사한 피크 역가에 도달하였다(1x109 PFU/㎖). 상기 PR8-cH1 바이러스는 모든 시점을 통해 역가의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 상기 rWT PR8 바이러스에 비해 약독화되었다. 그럼에도 불구하고, 심지어 상기 키메릭 바이러스는 대략 108 PFU/㎖의 상당한 피크 역가에 도달하였다. 상기 키메릭 바이러스 각각의 플라크 표현형을 또한 MDCK 세포에서 평가하였다. 모든 바이러스는 도 8b에 나타낸 바와 같이 필적하는 크기의 플라크를 형성시켰다. 이러한 결과는 상기 키메릭 HA 구조물이 생체내에서 정확하게 폴딩하고 생물학적으로 기능성임을 입증한다.
결론
상기 헤드와 줄기 도메인간의 경계를 정하는 상기 보존된 다이설파이드 결합 Cys52-Cys277을 이용함으로써 상이한 HA 구상 헤드 도메인을 갖는 키메릭 HA 단백질을 갖는 인플루엔자 바이러스를 생성시키는 새로운 전략이 개발되었다. 따라서, 모 헤드 도메인을 또 다른 HA의 헤드 도메인으로 치환시킴을 통해, 동일한 줄기를 갖지만 상이한 구상 헤드를 갖는 키메릭 HA의 패널을 생성시켰다. 상기 설계를, Cal/09 및 VN H5 구상 헤드를 갖는 PR8 줄기 도메인을 포함하여 다수의 하위유형 전체에 대해 시험하였다. 또한, H7 구상 헤드를 H3 줄기 도메인상에 놓았다. 이러한 구조물은 인플루엔자 HA 단백질의 2개의 계통발생 그룹 모두에 들어맞는다. 각각의 구조물은 도 7에 나타낸 바와 같이 세포 표면상에서 발현되고 융합 활성을 유지하였다. 상기 키메릭 HA를 갖는 재조합 바이러스의 생성은 상기 HA가 정확하게 폴딩하고 생물학적 기능을 유지함을 추가로 확인시켰다.
실시예 3: 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 진단 적용 및 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드에 의한 마우스의 백신접종
본 실시예는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 진단 목적으로 사용할 수 있고 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스를 백신에 사용할 수 있음을 설명한다.
물질 및 방법
세포 및 플라스미드
239T 및 MDCK 세포를 ATCC로부터 수득하고 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 및 최소 필수 배지(둘 다 깁코로부터)(상기 배지들은 각각 10% 송아지 태아 혈청(하이클론), 및 100 단위/㎖의 페니실린-100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(펜/스트렙, 깁코)이 보충된다)에서 유지시켰다. 10% 송아지 태아 혈청 및 하이클론 SFX 곤충 배양 배지(써모사이언티픽)가 보충된 TNM-FH(시그마-알드리치)를 Sf9 및 BTI-TN5B1-4(하이 파이브(High Five)) 세포 배양물에 사용하였다.
A/청둥오리/스웨덴/81/02("cH6") 바이러스 또는 A/호로새/홍콩/WF10/99("cH9") 바이러스를 함유하는 A/푸에르토리코/8/1934(PR8)의 줄기를 갖는 키메릭 헤마글루티닌 구조물을 유사한 기법을 사용하여 생성시켰다. 상기 키메릭 H6 구조물의 경우, 상이한 성분들을 PCR에 의해 증폭시키고 앞서 개시된 클로닝 전략을 사용하여 pDZ 플라스미드내로 클로닝하였다(문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-82]; 및 문헌[Hai et al., 2008, Journal of Virology 82:10580-90]을 참조하시오). 간단히, 상기 키메릭 헤마글루티닌(cHA)의 상이한 성분들을 Sap I 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, Sap I로 절단하고, pDZ 플라스미드의 Sap I 부위내로 클로닝시켰다. 바큘로-전달 플라스미드의 생성을 위해서, cH6을 PCR에 의해 증폭시키고, BamHI 및 NotI로 절단하고, C-말단 T4 파지 폴던 및 6-his 태그를 갖는 변형된 pBacPAK8(젠테크(Gentech)) 바큘로-전달 벡터내로 인프레임 클로닝시켰다(문헌[Meier et al., 2004, J Mol Biol 344:1051-69]을 참조하시오). 모든 플라스미드의 서열들을 상거(Sanger) 서열분석에 의해 확인하였다.
재조합 cH9 바이러스의 구제
재조합 백신 바이러스를 구제하기 위해서, PR8 및 cH9로부터의 7개의 야생형 바이러스 분절의 mRNA 및 vRNA를 암호화하는 8개의 역 유전학 플라스미드를 앞서 개시한 바와 같이 사용하였다(문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-82]; 및 문헌[Pleschka et al., 1996, J Virol 70:4188-92]). 간단히, 293T 세포를 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 상기 8개의 플라스미드 각각 1 ㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염후 12시간째에, 상기 배지를 0.3% 소 혈청 알부민(BSA), 10 mM HEPES, 및 1.5 ㎍/㎖ TPCK(L-1-토실아미드-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤)-처리된 트립신을 함유하는 DMEM으로 대체하였다. 형질감염후 2일째에, 바이러스-함유 상등액을 10일 된 발육계란에 접종하였다. 요막액을 37 ℃에서 2일 배양후에 수확하고 닭 적혈구의 적혈구응집반응에 의해서 바이러스의 존재에 대해 분석하였다. 이어서 상기 구제된 cH9 바이러스를 37 ℃에서 48시간 배양에 따라 10일 된 계란에서 번식시켰다. 바이러스 모액을 앞서 개시된 바와 같이 플라크 분석에 의해 역가측정하였다(예를 들어, 문헌[Steel et al., 2009, Journal of Virology 83:1742-53]을 참조하시오). 상기 cH9의 서열을 역 전사-PCR 산물의 서열분석에 의해 확인하였다.
재조합 바큘로바이러스 생성, 단백질 발현 및 정제
cH6을 운반하는 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 생성시키기 위해서, 플라스미드 및 바큘로골드(Baculogold) DNA(BD바이오사이언시즈(BDBioschiences))를 제조사의 설명에 따라 셀펙틴(Cellfectin) II(인비트로젠)로 Sf9 세포내로 동시-형질감염시켰다. 재조합 바큘로바이러스를 TNM-FH 배지(제미니 바이오프로덕츠(Gemini Bioproducts), 미국 캘리포니아주 웨스트 사크라멘토 소재)에서 증식된 Sf9 세포에서 증폭시키고 역가를 앞서 개시된 바와 같이 플라크 분석에 의해 측정하였다(예를 들어, 문헌[Steel et al., 2009, Journal of Virology 83:1742-53]을 참조하시오).
하이클론 SFX 곤충 세포 배지(서모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 메사추세츠주 월트햄소재)에서 증식된 하이 파이브 세포(문헌[Krammer et al., 2010, Mol Biotechnol 45:226-34]을 참조하시오)를, cH6을 발현하는 rBV로 500 ㎖ 진탕 플라스크 중에서 10의 감염 다중도(MOI) 및 1x106 세포/㎖의 세포 밀도로 감염시켰다. 세포를 감염후 96시간 째에 수확하고 2000x g에서 실온에서 10분간 저속 원심분리에 의해 상등액으로부터 분리시켰다. cH6 단백질의 정제를 위해서, 상등액을 수집하고 4 ℃에서 2시간 동안 Ni-NTA 수지(퀴아겐(Qiagen))와 함께 배양하였다. 상기 슬러리를 컬럼상에 부하하고 세척 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8)로 3회 세척하였다. 단백질을 용리 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8)로 0.5 ㎖ 단계로 용리시키고, 프래드포드 시약으로 단백질 함량에 대해 시험하고, 단백질을 함유하는 분획들을 모았다. 단백질 정제 및 정체를 SDS-PAGE, 쿠마씨 염색 및 웨스턴 블럿에 의해 시험하였다. 단백질 농도를 브래드포드 시약으로 측정하였다.
마우스 실험
모든 과정을 위해서, 마우스를 0.1 ㎖의 케타민/자일라진 혼합물(1.5 ㎎ 케나민 및 0.3 ㎎ 자일라진)의 복강내 주사에 의해 마취시켰다.
마우스 50% 치사 용량(LD50)을, 인플루엔자 바이러스의 10배 연속 희석물로 4마리 마우스의 그룹을 감염시킴으로써 BALB/c 마우스(챨스 리버 레보라토리즈)에서 측정하였다. 체중을 2주의 기간 동안 모니터하였다. 체중의 25%를 초과하여 상실한 마우스를 실험 종점에 도달한 것으로 간주하였으며 안락사시켰다. LD50 값을 리드와 먼치의 방법에 의해 계산하였다(문헌[Reed and Meunch. 1938, Am. J. Hyg. 27:493-497]을 참조하시오).
A/캘리포니아/04/09(Cal/09) 바이러스 감염에 따라 생성된 줄기 항체를 평가하는 실험을 위해서, 8 내지 10주 된 BALB/c 암컷 마우스를 먼저, 앞서 개시된 바와 같이 전기 자극의 적용(트라이그리드(TriGrid) 전달 시스템, 아이코어 메디칼 시스템스(Ichor Medical Systems))과 협력하여 PR8 바이러스로부터 전장 HA를 암호화하는 발현 플라스미드 80 ㎍을 근육내 투여하여 초회항원자극하였다(예를 들어, 문헌[Luxembourg et al., 2007, Expert Opinion on Biological Therapy 7:1647-64]을 참조하시오). 3주 후에, 마우스를 50 ㎕ 부피의 치사량에 가까운 용량의 104 PFU Cal/09로, 비내로 추가접종하였다. 대조군 동물에게 DNA 단독 또는 Cal/09 바이러스 단독, 또는 2009-2010 백신(Cal/09 분할 백신)의 근육내 주사를 제공하였다. 추가접종후 3주째에, 또는 대조군 동물의 경우와 동일한 시점에서, 마우스를 채혈하고 혈청을 수확하여 하기에 개시되는 바와 같이 면역형광에 의해 cH6에 대한 반응성을 시험하였다.
백신 구조물로서 cH9 바이러스의 효능을 시험하는 실험을 위해서, PR8 전장 DNA를 상술한 바와 같이 투여하였다. 초회항원자극 후 3주째에, 마우스에게 103 PFU의 cH9 바이러스를 비내로 서서히 주입하여 접종하였다. 대조군 동물에게 DNA 단독 또는 Cal/09 단독, 또는 정제된 불활성화된 PR8 바이러스를 근육내로 제공하였다. 추가접종후 3주째에, 또는 대조군 동물의 경우와 동일한 시점에서, 마우스를 5x104 LD50의 PR8 바이러스의 비내 접종으로 공격하였다. 마우스를 공격후 14일 동안 칭량하였다. 초기 체중의 27.5%를 초과하여 상실한 동물을 안락사시키고 사망으로 기록하였다.
키메릭 헤마글루티닌의 발현을 확인하기 위한 면역형광
293T 세포의 융합성 단층을 1 ㎍의 pDZ cH6 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염후 48시간째에, 세포를 고정시키고 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민으로 차단하였다. 이어서 세포를 상술한 4개의 실험 그룹(PR8 DNA 단독, Cal/09 단독, PR8 DNA 및 Cal/09 감염, 또는 Cal/09 분할 백신 단독) 각각의 동물로부터 모은 혈청과 함께 배양하였다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척 후에, 세포를 1시간 동안 알렉사 플루오르 488-접합된 항-마우스 IgG(인비트로젠)와 함께 배양하였다. 감염된 세포를 올림푸스 IX70 현미경으로 형광 현미경검사에 의해 분석하였다.
ELISA
96 웰 ELISA 플레이트(넝크, 맥시솝(Nunc, MaxiSorp))를 50 ㎖의 바큘로바이러스-발현된 cH6으로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 3% 우유/PBS로 차단하고 이어서 PBS/0.1% 트윈(PBST)으로 세척하였다. 백신접종된 마우스로부터의 혈청을 PBS로 연속해서 희석하고 상기 플레이트에 가한 다음, 37 ℃에서 1시간 배양하였다. 이어서 플레이트를 PBST로 세척하고 양고추냉이 퍼옥시다제 결합된 항-마우스 IgG(GE 헬쓰케어)의 1:2500 희석물과 함께 배양하였다. PBST에 의한 추가 세척에 이어서, 시그마패스트(Sigmafast)OPD 기질(시그마)을 가하였다. 상기 반응을 3M H2SO4에 의해 정지시키고 490 ㎚에서 광학 밀도를 측정하였다.
결과
키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 진단 용도에 사용할 수 있다
H6 인플루엔자 바이러스 하위유형의 헤마글루티닌으로부터의 구상 헤드 도메인 및 PR8 바이러스의 헤마글루티닌으로부터의 줄기 도메인을 포함하는 키메릭 헤마글루티닌 구조물을 생성시켜 상기 H6 줄기 도메인에 대해 면역된 마우스에 의한 항체 생산을 분석하기 위한 분석 도구로서 제공하였다. 상기 면역된 마우스는 오직 H1 바이러스의 구상 헤드에만 노출되었기 때문에, 상기 실험 동물에서 생성된 항체는 그의 H1 줄기를 향하는 경우 오직 키메릭 H6 헤마글루티닌(cH6)에 대해서만 반응성일 것이다.
도 11A 및 11D에 도시된 바와 같이, DNA 단독 또는 대유행 분할 백신 처리는 상기 백신접종된 마우스에서 어떠한 줄기 반응성 항체도 이끌어내지 못했다. 환언하면, Cal/09 단독에 의한 감염은, DNA 일렉트로포레이션 및 감염에 의해 유도된 정도까지는 아니지만(도 11C), 줄기 반응성 항체를 생성시켰다(도 11B). 교차-반응성 H1 줄기 항체, C179를 형질감염을 위한 대조군으로서 사용하였다(도 11E). 예상된 바와 같이, PR8의 구상 헤드에 대한 항체인 PY102는 상기 형질감염된 cH6 HA에 대해 반응하지 않았다(도 11F).
도 13에 도시된 바와 같이, 줄기 항체 결합을 검출하기 위한 도구로서 상기 cH6 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드의 유용성은 ELISA에 의해 입증되었다.
키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 백신에 사용할 수 있다
도 12에 도시된 바와 같이, 불활성화된 PR8 바이러스로 백신접종된 동물은 치사성 공격으로부터 보호된 반면, DNA만을 받은 동물은 공격후 5일까지 감염에 대해 완전히 굴복하였다. cH9 바이러스만을 받은 동물도 또한 감염으로부터 보호되지 않았으며, 단지 25% 생존율만을 가졌다. 대조적으로, DNA로 먼저 초회항원자극되고 이어서 cH9 바이러스로 추가접종된 동물들은 공격으로부터 보호되었으며, 이때 생존율은 상기 불활성화된 바이러스 제제로 백신접종된 동물과 통계학적으로 동일하였다.
실시예 4: 2009 대유행 H1N1 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 의해 유도된 헤마글루티닌 줄기 항체
본 실시예는 줄기 도메인 특이성 항체를 연구하기 위해 사용된 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 개시한다. 상기 폴리펩타이드를 사용하여, 2009 대유행 H1N1 바이러스에 의한 감염이 상기 헤마글루티닌 줄기에 대한 바이러스-중화 항체의 역가의 증가를 유도한 것으로 측정되었다. 상기 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 폴리펩타이드 외에, 전통적인 적혈구응집반응-억제 분석에서 검출되지 않는 인플루엔자 바이러스-중화 항체를 측정하는데 사용될 수 있는 분석을 또한 개시한다.
물질 및 방법
세포 및 플라스미드
293T 및 MDCK 세포를 ATCC로부터 수득하고 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 및 최소 필수 배지(둘 다 깁코로부터)(상기 배지들은 각각 10% 송아지 태아 혈청(하이클론), 및 100 단위/㎖의 페니실린-100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(펜/스트렙, 깁코)이 보충된다)에서 유지시켰다. 10% 송아지 태아 혈청 및 하이클론 SFX 곤충 배양 배지(써모사이언티픽)가 보충된 TNM-FH 배지(제미니 바이오프로덕츠)를 Sf9 및 BTI-TN5B1-4(하이 파이브) 세포 배양물에 사용하였다.
A/청둥오리/스웨덴/81/02(cH6/1) 바이러스 또는 A/호로새/홍콩/WF10/99(cH9/1) 바이러스로부터의 구상 헤드 도메인을 함유하는 A/푸에르토리코/8/1934(PR8)의 줄기를 갖는 키메릭 헤마글루티닌(cHA) 구조물을 앞서 개시된 방법을 사용하여 생성시켰다(문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82, 10580]; 문헌[Fodor et al ., 1999, J Virol 73, 9679]). 간단히, 상기 키메릭 헤마글루티닌(cHA)의 상이한 성분들을 Sap I 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, Sap I로 절단하고, pDZ 플라스미드의 Sap I 부위내로 클로닝시켰다(문헌[Quinlivan et al., 2005, J Virol 79, 8431]). 바큘로-전달 플라스미드의 생성을 위해서, cH6/1 및 cH9/1을 PCR에 의해 증폭시키고, BamHI 및 NotI로 절단하고, C-말단 T4 파지 폴던 및 6-his 태그를 갖는 변형된 pFastBac(인비트로젠) 바큘로-전달 벡터내로 인프레임 클로닝시켰다(문헌[Meier et al., 2004, J Mol Biol 344, 1051]). 모든 플라스미드의 서열들을 상거 서열분석에 의해 확인하였다.
재조합 바큘로바이러스 생성, 단백질 발현 및 정제
재조합 cH6/1 및 cH9/1 단백질을 생성시키기 위해서, 바큘로-전달 벡터를 제조사의 설명에 따라 에스케리키아 콜라이 균주 DH10Bac(인비트로젠)내로 형질전환시켰다. 올바른 표현형을 나타내는 DH10Bac 콜로니들을 골라, 증식시키고, 바크미드(bacmid)를 플라스미드 미디 키트(Plasmid Midi Kit)(퀴아겐)를 사용하여 제조하였다.
상기 cH6/1 또는 cH9/1 유전자를 운반하는 바크미드를 제조사의 설명에 따라 셀펙틴 II(인비트로젠)로 Sf9 세포내로 형질감염시켰다. 재조합 바큘로바이러스를 TNM-FH 배지(제미니 바이오프로덕츠, 미국 캘리포니아주 웨스트 사크라멘토 소재)에서 증식된 Sf9 세포에서 증폭시키고 역가를 플라크 분석에 의해 측정하였다(문헌[King et al., 2007, Methods Mol Biol 388, 77]).
하이클론 SFX 곤충 세포 배지(서모 피셔 사이언티픽)에서 증식된 하이 파이브 세포를, cH6/1 또는 cH9/1을 발현하는 재조합 바큘로바이러스로 500 ㎖ 진탕 플라스크 중에서 10의 감염 다중도(MOI) 및 1x106 세포/㎖의 세포 밀도로 감염시켰다(문헌[Krammer et al. 2010, Mol Biotechnol 45, 226]). 세포를 감염후 96시간째에 수확하고 2000x g에서 실온에서 10분간 저속 원심분리에 의해 상등액으로부터 분리시켰다. cHA 단백질의 정제를 위해서, 상등액을 수집하고 4 ℃에서 2시간 동안 Ni-NTA 수지(퀴아겐)와 함께 배양하였다. 상기 슬러리를 컬럼상에 부하하고 세척 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8)로 3회 세척하였다. 단백질을 용리 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8)로 0.5 ㎖ 단계로 용리시키고, 프래드포드 시약으로 단백질 함량에 대해 시험하고, 단백질을 함유하는 분획들을 모았다. 모은 분획들을 PBS 중에서 완충제 교환하고 수평 로터에서 10 kD 분자량 컷-오프를 갖는 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터 유닛(밀리포어(Millipore))을 사용하여 농축시켰다. 단백질 정제 및 정체를 SDS-PAGE, 쿠마씨 염색 및 웨스턴 블럿에 의해 시험하였다. 하기의 항체들을 사용하여 cHA의 발현을 확인하였다: 항-H6 염소 항혈청(BEI, #NR-663), G1-26(항-H9, 마우스; BEI# NR-9485), 3951(토끼, 항-HA2 PR8)(문헌[Graves et al., 1983, Virology 126, 106]), PY102(항-PR8 헤드, 마우스), 및 12D1(항-H3 줄기, 마우스)(문헌[Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796]). 최종 단백질 농도를 브래드포드 시약으로 측정하였다.
재조합 cHA 발현 바이러스의 구제
cH9/1을 발현하는 재조합 바이러스를 구제하기 위해서, PR8로부터의 6개의 야생형 바이러스 분절의 mRNA 및 vRNA를 암호화하는 역 유전학 플라스미드뿐만 아니라 A/청둥오리/알버타/24/01 바이러스 및 cH9/1로부터의 N3 NA를 암호화하는 플라스미드를 앞서 개시한 바와 같이 사용하였다(문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82, 10580]; 문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73, 9679, 27]). 간단히, 293T 세포를 제조사의 설명에 따라 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 상기 8개의 플라스미드 각각 1 ㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염후 12시간째에, 상기 배지를 0.3% 소 혈청 알부민, 10 mM HEPES, 및 1.5 ㎍/㎖ TPCK(L-1-토실아미드-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤)-처리된 트립신(시그마 T1426)을 함유하는 DMEM으로 대체하였다. 형질감염후 2일째에, 바이러스-함유 상등액을 10일 된 발육계란에 접종하였다. 요막액을 37 ℃에서 2일 배양후에 수확하고 닭 적혈구의 적혈구응집반응에 의해서 바이러스의 존재에 대해 분석하였다. 이어서 상기 구제된 cH9/1 바이러스를 37 ℃에서 48시간 배양에 따라 10일 된 계란에서 번식시켰다. 바이러스 모액을 TPCK 트립신의 존재하에 MDCK 세포상에서 앞서 개시된 바와 같이 플라크 분석에 의해 역가측정하였다(문헌[Steel et al., 2009, J Virol 83, 1742]). 상기 cH9/1 RNA의 서열을 역 전사-PCR 산물의 서열분석에 의해 확인하였다.
키메릭 헤마글루티닌의 발현을 확인하기 위한 면역형광
MDCK 세포의 융합 단층을 2의 MOI에서 cH9/1N3으로 감염시켰다. 감염후 48시간째에, 세포를 고정시키고 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민으로 차단시켰다. 이어서 세포를 마우스 mAb:항-NP 항체 HT103, PY102, 항-H9(BEI NR#9485), 또는 범-H1 줄기-특이성 항체(6F12)와 함께 배양하였다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척 후에, 세포를 알렉사 플루오르 488-접합된 항-마우스 IgG(인비트로젠)와 함께 1시간 동안 배양하였다. 감염된 세포를 올림푸스 IX70 현미경을 사용하여 형광 현미경검사에 의해 분석하였다.
인간 혈청 샘플
인간 혈청 샘플을 수집하고 기관 프로토콜에 따라 사용하였다. 혈청을 3개의 환자 코호트: pH1N1으로 감염되지 않은 성인, pH1N1으로 감염되지 않은 아동, 및 pH1N1 바이러스 감염된 성인으로부터 수집하였다. 혈청을 증상을 나타낸 감염의 처음 3주 이내에 pH1N1 감염된 환자로부터 수집하였다. 모은 혈청을 사용하는 실험을 위해서, 같은 부피의 각 샘플을 혼합하여 풀을 생성시켰다. 감염의 확인을 래머트(Wrammert) 등에 의해 RT-PCR 및 혈청학적 분석에 의해 수행하였다(문헌[Wrammert et al ., 2011, J Exp Med 208, 181-193]).
헤마글루티닌 억제 분석
수집된 혈청을 먼저, 적혈구응집반응의 비-특이적인 억제제를 제거하기 위해서 트립신-열-퍼요오데이트 처리에 의해서 또는 RDE 처리에 의해서 불활성화시켰다(문헌[Coleman, Dowdle, 1969, Bull World Health Organ 41, 415 (1969)]). 적혈구응집반응 억제(HI) 분석을 앞서 개시된 바와 같이(문헌[Lowen et al., 2009,. J Virol 83, 2803]) 수행하여 cH9/1N3 및 A/오리/프랑스/MB42/76(H6 HA)(문헌[Desselberger et al., 1978, Proc Natl Acad Sci U S A 75, 3341 (Jul, 1978)]) 바이러스와의 반응성을 시험하였다. 샘플은 HI 활성이 상기 혈청의 1:10 희석물에 의해 나타나지 않는 경우 음성인 것으로 간주된다.
ELISA
96 웰 ELISA 플레이트(퀴아겐 히스솔브(HisSorb) 또는 넝크 이뮬론(Immulon) 2)를 PBS 중에서 희석된 50 ul의 바큘로바이러스-발현된 cH6/1, cH9/1 또는 전장 헤마글루티닌(H5 HA, BEI NR#660; H3 HA, BEI NR#15171) 단백질 또는 H1 서열(PR8) 긴 알파 나선(LAH)(문헌[Wang et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107, 18979])으로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 0.5% 우유/2% 염소 혈청/PBS로 차단하고 이어서 PBS/0.1% 트윈(PBST)으로 3X 세척하였다. 단클론 항체, 인간 대상로부터의 혈청, 및 대조군으로서 사용된 마우스 혈청을 PBS 또는 차단 완충제로 연속 희석하고 이어서 상기 플레이트에 가한 다음 실온에서 1시간 배양하였다. 이어서 플레이트를 PBST로 3X 세척하고 추가로 1시간 동안 알칼리성 포스파타제(AP)(메리디안 라이프 사이언스(Meridian Life Science)) 또는 항-마우스 AP(인비트로젠)에 커플링된 염소 항-인간 IgG[Fc]의 1:5000 희석물과 함께 배양하였다. PBST로 3X 세척한 다음, p-나이트로페닐 포스페이트 기질(시그마)을 가하였다. 상기 반응을 10분 후에 NaOH로 정지시키고 405 ㎚에서 광학 밀도를 측정하였다.
플라크 감소 분석
감염된 성인 및 미경험(pH1N1 바이러스로 감염되지 않은) 환자로부터의 혈청을 먼저 모으고 IgG 단백질의 정제를 위해 단백질 G 세파로스(GE 헬쓰케어)가 있는 중력 흐름 컬럼상에 부하하였다. 상기 컬럼을 PBS로 세척하였다. 다클론 항체를 0.1M 글리신 완충제(pH 2.7)로 용리시켰다. 2M 트리스-HCl 완충제(pH 10)를 1:10 비로 즉시 가하여 상기 pH를 복원시켰다. 상기 용리물을 PBS 중에서 완충제 교환하고 수평 로터에서 50 kD MW 컷-오프를 갖는 아미콘 울트라-15 원심분리 필터 유닛(밀리포어)을 사용하여 농축시켰다. 단백질 농도를 A280 방법을 사용하여 나노드롭(NanoDrop) 2000 분광광도계상에서 측정하였다. 비-특이성 혈청 억제제의 제거를 상기 정제된 IgG 제제에서 HI 활성의 부재를 나타낸 다수의 바이러스 균주를 사용하여 HI 시험에 의해 확인하였다(데이터 도시 안 됨). 줄기-반응성 항체의 중화 능력을 앞서 개시된 바와 같이 평가하였다(문헌[Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796]). 바이러스를 먼저 웰당 100 플라크 형성 단위를 제공하는 농도로 희석하였다. 이어서 상기 모은 혈청으로부터 상이한 농도의 IgG를 실온에서 1시간 동안 바이러스와 공동-배양하였다. MDCK 세포로 시딩된 6-웰 플레이트를 PBS로 세척하고 이어서 200 ul의 바이러스-IgG 혼합물로 감염시켰다. 37 ℃에서 45분 배양에 이어서, 바이러스 및 IgG를 세포로부터 흡출하고 적합한 항체 농도 및 TPCK 트립신을 함유하는 아가 오버레이를 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 2일 동안 배양하였다. 플라크를 항-H9 항체 G1-26을 사용하여 면역염색에 의해 가시화하였다(문헌[Bouvier et al., 2008, J Virol 82, 10052).
슈도유형 입자 중화 분석
슈도유형 입자 생성을 위한 과정을 선행 연구로부터 개조하였다(문헌[Evans et al., 2007, Nature 446, 801). 간단히, 293-T 세포를 (i) 목적하는 리포터(V1-GLuc)를 함유하는 프로-바이러스, (ii) HIV Gag-POl, (iii) 키메릭 cH9/1 헤마글루티닌 단백질 및 (iv) 인플루엔자 B/야마가타/16/88 뉴라미니다제(NA)를 암호화하는 4개의 플라스미드로 동시-형질감염시켰다(문헌[Tscherne et al., 2010, J Virol Methods 163, 336). 상기 V1-GLuc 플라스미드는, 세포로부터 분비되고 상기 세포 상등액 중에서 검출될 수 있는 루시페라제 단백질을 암호화한다. 상등액을 형질감염 후 48시간째에 수집하고 상기 cH9/1 입자 제제를 정제하기 위해서 후속으로 여과하였다(0.45 ㎛ 기공 크기). 이어서 입자를 상이한 농도(50 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 및 2 ㎍/㎖)의 정제된 인간 IgG와 함께 배양하고(감염후 선형 범위내에서 루시페라제 활성을 제공하는 것으로 측정된 양으로) MDCK 세포에 가하였다. 감염을 6시간 동안 진행한 후에 세포를 세척하고 새로운 상등액을 세포 위에 놓았다. 슈도유형 입자를 사용하는 모든 감염을 1 ㎍/㎖ 폴리브렌(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 존재하에서 수행하였다(문헌[Tscherne et al., 2010, J Virol Methods 163, 336]). 감염후 48시간째에 루시페라제 분석을 수행하였다.
결과
키메릭 헤마글루티닌 -기재 시약의 개발
키메릭 헤마글루티닌(cHA) 구조물을 생성시켜 인간 혈청 중의 줄기 항체의 존재를 평가하기 위한 분석 도구로서 제공하였다. C52와 C277 사이에 존재하고 HA 줄기와 헤드 사이의 경계를 그리는 다이설파이드 결합을 이용하여, PR8 바이러스의 HA로부터의 줄기 도메인 정상의 H6 또는 H9 헤마글루티닌의 구상 헤드 도메인을 암호화하는 발현 플라스미드를 조작하였다(도 14A). 줄기 항체를 함유하는 인간 혈청 샘플은 H6 또는 H9 바이러스에 대한 적혈구응집반응 억제(HI) 활성에 대해 음성인 듯하지만(이들 바이러스 하위유형에의 선행 노출의 결여로 인해), H1 헤마글루티닌 줄기에의 선행 노출로 인해 상기 cH6/1 또는 cH9/1 구조물과 반응성일 수 있음이 가정되었다. 이들 도구, 재조합적으로 발현된 cHA 단백질, 및 상기 cHA를 발현하는 바이러스를 사용하여 인간 혈청 샘플 중의 줄기 항체의 상대량을 평가하고 상기 줄기-특이성 항체에 의해 매개되는 임의의 중화 활성을 측정할 수 있었다.
분석학적 분석을 위한 cH6/1 및 cH9/1 단백질을 생성시키기 위해서, 상기 키메릭 HA를 암호화하는 플라스미드를 생성시키고 바큘로바이러스 발현 시스템에서 가용성 단백질로서 발현시켰다. 2 ㎍의 전체 단백질의 쿠마씨 염색은 이들 제제의 고도의 순도를 암시한다(도 17A). 상기 cH9/1의 약간 지연된 이동은 상기 cH9/1 헤드상에 점거된 글리코실화 부위의 증가된 수의 결과인 것으로 생각된다. 상기 cHA 단백질을 상기 HA의 다양한 부분과 반응성인 항체들을 사용하여 웨스턴 블럿 분석에 의해 추가로 특성화하였다. 도 17B에 도시된 바와 같이, 오직 PR8로부터의 cH6/1, cH9/1 및 전장 HA만이 상기 PR8 줄기에 특이성인 토끼 다클론 항혈청과 반응하였다. 상기 H6, H9 및 PR8의 헤드 도메인에 대한 단클론 항체는 상기 키메릭 구조물이 PR8 줄기 정상의 외래 헤드를 발현하고 있는 중임을 입증하였다. H3 단백질을 음성 대조군으로서 사용하였으며, 상기 단백질은 범-H3 항체 12D1(문헌[Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796])을 사용하는 경우에만 검출되었다.
상기 키메릭 분자를 발현하는 재조합 바이러스를 또한 중화 줄기 항체의 검출을 목적으로 구제하였다. 지난 세기에 걸쳐 모든 인간 인플루엔자 바이러스들은 N1 또는 N2 하위유형의 NA를 암호화하였기 때문에, 상기 cH9/1N3 재조합 바이러스의 구제는 줄기-특이성 항체의 중화 능력을 평가할 수 있게 한 반면, 어떠한(N1 또는 N2) 뉴라미니다제 항체 활성도 측정되지 않은 것으로 판단되었다. 상기 cH9/1N3 바이러스(N3 하위유형 뉴라미니다제와 H9 구상 헤드 HA와 함께 H1 줄기를 발현한다)를 역 유전학을 사용하여 구제하였으며 발육계란에서 높은 역가로 증식시켰다. 상기 바이러스의 플라크 분석 표현형은 PR8 야생형 바이러스의 경우와 유사하였다(도 14C). 바이러스 계대후 H9 헤드의 존재를 확인하기 위해서, 세포를 cH9/1N3 바이러스로 감염시켰다. 이어서 감염된 세포를, H9 하위유형 헤마글루티닌 단백질에 특이성 항체인 마우스 mAb G1-26으로 탐침조사하였다. 범-H1 줄기 특이성 항체, 6F12를 사용하여 야생형 PR8 및 cH9/1N3 바이러스 감염된 세포 모두를 검출하였다(도 14B).
줄기 특이성 항체는 cHA와 결합하고 이를 중화시킨다
cH6/1 및 cH9/1 단백질을 줄기 항체의 검출 도구로서 사용할 수 있음을 입증하기 위해서, 상기 cHA의 사용을 먼저 HA 줄기와 반응하는 것으로 공지된 항체로 확인하였다. 실제로, H1 HA의 줄기와 반응성인 항체, 마우스 mAb C179(문헌[Okuno et al, 1993, J Virol 67, 2552])를 용량 의존적인 방식으로 ELISA에 의해 바큘로바이러스 발현된 cH6/1 및 cH9/1 단백질에 결합시켰다(도 18A 및 B).
이어서, 상기 cH9/1N3 바이러스의 복제가 단클론 항체 6F12(H1 인플루엔자 바이러스에 대한 중화 활성을 갖는다)에 의해 억제될 수 있는지의 여부를 확인하였다(데이터 도시 안 됨). 항체 6F12는 cH9/1N3 바이러스에 결합하고 상기 바이러스를 플라크 감소 분석에서 용량 의존적인 방식으로 중화시킬 수 있었으며(도 18C 및 D), 이때 4 ㎍/㎖이 넘는 농도에서 100퍼센트 억제가 나타났다. 이러한 결과는 상기 키메릭 단백질 및 재조합 cH9/1N3 바이러스를 사용하여 중화 활성을 갖는 줄기 항체를 검출할 수 있다는 가정을 입증하였다.
pH1N1 으로 감염된 환자는, cHA 와 결합하고 이를 중화시키는 높은 역가의 항체를 갖는다
cH6/1 및 cH9/1 가용성 단백질을 사용하여 환자 혈액 샘플 중의 줄기-반응성 항체를 정량분석하기 전에, HI 활성에 대한 혈청을 상기 두 HA 하위유형을 발현하는 바이러스에 대해서 시험하였다. A/오리/프랑스/MB42/76(H6) 및 cH9/1N3 바이러스를 사용하여, 수집된 모든 성인 및 소아 혈청 샘플이 HI 음성임을 확인하였다(결과 도시 안 됨).
이어서, 상기 혈청과 cH6/1 및 cH9/1 단백질과의 반응성을 ELISA에 의해 시험하였다. pH1N1 바이러스로 감염되지 않은 성인 및 소아 대상로부터 수집한 혈청은 어느 단백질과도 거의 반응성을 나타내지 않았다. 그러나, pH1N1 인플루엔자 바이러스로 감염된 환자로부터 수집한 혈청은 상기 두 cHA 구조물 모두에 대해 증대된 결합을 나타내었으며, 이때 pH1N1 감염된 혈청 풀을 감염되지 않은 성인 및 아동의 경우와 비교할 때 IgG 반응성에 있어서 30배 초과의 차이(동등한 광학 밀도 판독을 제공하는 희석물을 비교하여)가 있었다(도 15a 및 b). 따라서, 상기 음성 HI 데이터를 고려하여, cHA 단백질과의 반응성은 줄기 도메인에서 발생하는 것으로 판단되었다.
인간 혈청을 모은 샘플을 사용하여, 상기 HA 줄기의 일부, 긴 알파 나선(LAH)에 대한 IgG 결합을 또한 시험하였다. 상기 IgG는 마우스에서 보호 면역성을 매개하는 것으로 앞서 입증되었다(문헌[Wang et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107, 18979]). pH1N1으로 감염된 환자로부터의 혈청은 H1 LAH와 반응성인 항체를 함유한 반면, 상기 대유행 바이러스에 노출되지 않은 환자는 최소의 LAH-특이성 혈청 항체를 가졌다(도 15c).
상기 H5 헤마글루티닌 하위유형은 상기 H1 HA와 동일한 계통발생 그룹내에 있고 매우 유사한 줄기 구조를 공유한다(문헌[Ekiert et al., 2009, Science 324, 246]). 흥미롭게도, 상기 pH1N1에 노출된 환자들은 상기 H5 단백질과 반응성인 증대된 혈청 항체 특이성을 가진 반면(도 15d), 동종 H5 하위유형 바이러스에 대해서는 어떠한 혈청 HI 활성도 갖지 않았다(데이터 도시 안 됨). 이러한 결과는 상기 pH1N1 바이러스에의 노출이 줄기-특이성 항체에 의해 매개되는 일정한 정도의 항-H5 면역성을 부여했을 수도 있음을 암시하였다.
중요하게, pH1N1으로 감염된 환자는 H3 헤마글루티닌 단백질(H3은 H1 및 H5 HA로부터 분리된 계통발생 그룹 중에 있다)에 특이성인 혈청 항체가 추가접종되지 않았다(도 15e). 상기 결과는 pH1N1-감염된 환자로부터의 혈청 중의 줄기-특이성 항체의 증대된 역가는 일반적인 면역 자극의 함수가 아니라, 오히려, 상기 H1 줄기 항체 특이성이 상기 대유행 바이러스 균주에 의한 감염에 의해 선택적으로 증강되었음을 입증한다.
이어서, 이들 인간 샘플에서 발견된 상기 줄기 반응성 항체들이 중화 능력을 가졌는지의 여부를 평가하였다. 감염 및 비감염된 성인으로부터의 혈청 샘플을 모으고 상기 헤마글루티닌 헤드에 결합하는 비-특이성 억제제(예를 들어, 시알산 함유 분자 및 렉틴)를 제거하기 위해서 전체 IgG를 정제하였다. 상기 순수한 IgG 제제를 사용하여, 55.5 ㎍/㎖ 총 혈청 IgG 이상의 항체 농도에서 완전한 억제 플라크 형성(도 16A 및 B)이 성취되었다. 상기 ELISA 데이터에 따라, pH1N1 감염된 성인으로부터의 혈청을 감염되지 않은 성인으로부터의 혈청과 비교할 때 대략 30배의 중화 능력의 차이가 관찰되었다. 표준으로서 mAb 6F12를 사용하여, 6F12 및 다클론 인간 IgG 제제에 의해 매개된 중화 활성간에 비교를 수행할 수 있었다. cHA 바이러스의 100% 중화를 제공하는 6F12 및 인간 IgG를 비교함으로써, 최근 30일 동안 pH1N1으로 감염된 환자로부터의 전체 인간 IgG의 7%가 중화 줄기 항체를 포함하는 것으로 추정되었다.
최종적으로, 줄기 반응성 항체의 중화 능력을, 숙주 세포 내로의 바이러스 침입시 생성되는 루시페라제 활성의 판독정보를 갖는 슈도유형 입자 감염 분석을 사용하여 평가하였다. 상기 cH9/1 단백질을 발현하는 슈도유형 입자를 정제된 인간 IgG와 함께 배양하고 중화 활성을 세포 상등액 중의 루시페라제 효소 활성의 부재하에서 생성되는 입자 침입의 억제에 의해 측정하였다(방법을 참조하시오). 상기 플라크 감소 분석과 일치하게, 상기 슈도유형 입자 분석은 또한 10 ㎍/㎖을 초과하는 전체 IgG 농도에서 입자의 100% 중화를 나타내었다(도 16C).
결론
헤마글루티닌 단백질의 구상 헤드와 결합하는 항체를 추가로 포함하는 제제에서 줄기-특이성 항체의 선택적인 검출을 허용하는, 키메릭 헤마글루티닌 단백질 및 상기 키메릭 단백질을 발현하는 바이러스 형태의 신규의 분석 도구들이 개발되었다. 이들 신규의 헤마글루티닌 구조물은 별개의 헤마글루티닌 하위유형으로부터의 구상 헤드 도메인과 함께 불변 H1 하위유형 줄기를 갖는다(예를 들어, H6 헤드를 갖는 H1 줄기). 이를, 상기 헤마글루티닌 단백질(19) 중의 시스테인 52와 277 사이에 존재하는 다이설파이드 결합을 이용하여 사이에 낀 서열을 상이한 HA 하위유형의 것과 교환함으로써 수행하였다.
이들 키메릭 헤마글루티닌(cHA) 구조물을 사용하여, 확인된 pH1N1 바이러스 감염을 갖는 작은 인간 코호트가, pH1N1 바이러스로 감염되지 않은 성인 및 소아 대조군에 비해 높은 역가의 줄기 특이성 중화 항체를 생성시킴이 입증되었다. 이러한 발견은 pH1N1 감염에 반응하여 생성된, 상기 헤마글루티닌 줄기와 반응성인 항체가 2009년 인플루엔자 대유행 이전에 순환했던 계절성 H1N1 바이러스의 멸종에 기여한 듯하다는 가설을 지지한다.
실시예 5: 키메릭 헤마글루티닌을 발현하는 인플루엔자 바이러스: 상이한 하위유형 및 계통발생 그룹으로부터 유래된 구상 헤드 및 줄기 도메인
본 실시예는 상이한 헤마글루티닌 하위유형 및 상이한 계통발생 그룹으로부터의 다양한 구상 헤드 및 줄기 조합을 포함하는 다수의 기능성 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌뿐만 아니라, 야생형 인플루엔자 바이러스의 경우와 유사한 증식 성질을 갖는 상기 키메릭 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 인플루엔자 바이러스를 개시한다. 상기 키메릭 재조합 바이러스는 야생형 인플루엔자 바이러스의 경우와 유사한 증식 성질을 가지며 바이러스학 및 면역학적 분석에서 도메인-특이성 항체를 측정하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다.
물질 및 방법
세포 및 바이러스
293T 및 MDCK 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 수득하고 10% 송아지 태아 혈청(하이클론; 써모 사이언티픽) 및 페니실린-스트렙토마이신(깁코, 인비트로젠)이 보충된 둘베코의 최소 필수 배지(DMEM) 또는 MEM(깁코, 인비트로젠)에서 유지시켰다. A/푸에르토리코/8/1934(PR8) 및 A/퍼쓰/16/2009(퍼쓰/09) 야생형(친절하게도 알렉산더 클리모프(Alexander Klimov), CDC에 의해 제공됨) 및 재조합 바이러스들을 37 ℃에서 2일 동안 10일 된 특수 비병원성 발육계란(챨스 리버)에서 증식시켰다.
플라스미드의 제작
상이한 키메릭 헤마글루티닌을 암호화하는 플라스미드를 앞서 개시된 것과 유사한 전략을 사용하여 제작하였다(예를 들어, 문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682]; 및 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]을 참조하시오). 간단히, 키메릭 HA의 상이한 분절들을 SapI 부위를 함유하는 프라이머와 함께 PCR에 의해 증폭시키고, SapI으로 절단하고, 양극성 발현 벡터 pDZ 벡터(여기에서 vRNA 전사는 인간 RNA 폴리머라제 I 프로모터 및 마우스 RNA 폴리머라제 I 종결자에 의해 조절되고 mRNA/cRNA 전사는 닭 베타 액틴 폴리머라제 II 프로모터에 의해 조절된다(예를 들어, 문헌[Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439]을 참조하시오))의 SapI 부위에 다중-분절 연결을 통해 클로닝시켰다. 우리는 상기 H7 HA 플라스미드(진뱅크 ID: DQ017504)에 대해서 다니엘 페레즈(메릴랜드 대학)에게 진심으로 감사드린다. A/푸에르토리코/8/1934(PR8) 유전자를 암호화하는 플라스미드를 앞서 개시한 바와 같이 사용하였다(문헌[Hai et al ., 2008, J Virol 82:10580-10590]).
뉴클레오타이드 서열 수탁 번호
본 연구에 사용된 모든 제작된 cHA 유전자들은 인플루엔자 연구 데이터베이스에 수탁 번호 IRD-RG-684014, IRD-RG-684022, IRD-RG-684030, 및 IRD-RG-684038로 기탁되었다. 상기 키메릭 cH1/1, cH5/1, cH7/3 및 cH5/3은 각각 A/푸에르토리코/8-RGcH1-1/34, A/푸에르토리코/8-RGcH5-1/34, A/퍼쓰/16-RGcH7-3/09, 및 A/퍼쓰/16-RGcH5-3/09로서 나열되어 있다.
유식 세포측정 분석
세포 표면에서 헤마글루티닌 단백질 발현의 수준을 평가하기 위해서, 293T 세포를 제조사의 설명에 따라 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 1 ㎍의 적합한 플라스미드로 형질감염시키거나 MDCK 세포를 cHA-발현 재조합 바이러스로 감염시켰다. 형질감염후 48시간째에, 293T 세포를 트립신처리하고 2% FBS를 함유하는 PBS 중에 재현탁시킨 후에 단클론 항체(mAb) 6F12(5 ㎍/㎖)(우리 실험실에서 생성된 그룹 1 HA의 줄기 도메인에 광범위하게 반응성인 mAb)(데이터 도시 안 됨) 또는 H3 HA에 대한 mAb 12D1(5 ㎍/㎖)로 염색시켰다(문헌[Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796]을 참조하시오). 감염후 12시간 째에, MDCK 세포를 트립신처리에 의해 재현탁시키고 상기 mAb 12D1으로 염색하였다. 염색된 세포를 벡크만 쿨터 사이토믹스(Beckman Coulter Cytomics) FC500 유식 세포계상에서 분석하고, 결과를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
슈도입자 생성 및 침입 분석
슈도입자 생성을 위한 과정을 선행 연구로부터 개조하였다(예를 들어, 문헌[Evans et al., 2007, Nature 446:801-805] 및 문헌[Tscherne et al, 2010, J Virol Methods 163:336-43]을 참조하시오). 간단히, 우리는 (i) 목적하는 리포터(V1-가우시아(Gaussia) 루시페라제)를 함유하는 프로-바이러스(문헌[Evans et al., 2007, Nature 446:801-805]), (ii) HIV Gag-Pol(문헌[Evans et al., 2007, Nature 446:801-805]), (iii) 키메릭 헤마글루티닌 단백질 및 (iv) B/야마가타/16/88 바이러스 뉴라미니다제(NA)를 암호화하는 4개의 플라스미드로 293T 세포를 동시-형질감염시켰다. 상등액을 형질감염 후 72시간째에 수집하고 후속으로 여과하였다(0.45 ㎛ 기공 크기). 슈도유형 바이러스 유사 입자(VLP)의 존재를 적혈구응집반응 분석을 통해 평가하였다. 상이한 VLP 제제를 MDCK 세포의 접종에 앞서 동일한 4개의 적혈구응집반응 단위로 조절하였다. 슈도입자를 사용하는 하기의 분석들을 모두 형질도입 효율을 증가시키기 위해서 1 ㎍/㎖ 폴리브렌(시그마)의 존재하에서 수행하였다(예를 들어, 문헌[Evans et al., 2007, Nature 446:801-805] 및 문헌[Tscherne et al, 2010, J Virol Methods 163:336-43]을 참조하시오).
침입 분석을, MDCK 세포를 상이한 키메릭 헤마글루티닌을 발현하고 상기 가우시아 루시페라제 리포터를 함유하는 슈도입자로 형질도입시킴으로써 수행하였다. 형질도입후 24시간째에, 세포를 새로운 배지로 3회 세척하여 상기 접종물 중에 존재하는 임의의 잔류 가우시아 루시페라제 단백질을 제거하였다. 형질도입후 48시간째에, 루시페라제 분석을 수행하였다(문헌[Evans et al., 2007, Nature 446:801-805]).
재조합 키메릭 인플루엔자 A형 바이러스의 구제
플라스미드 DNA로부터 인플루엔자 A형 바이러스의 구제를 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다(예를 들어, 문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682]; 및 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]을 참조하시오). 재조합 야생형(rWT) PR8 바이러스를 생성시키기 위해서, 293T 세포를 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 사용하여 8 pDZ PR8 구제 플라스미드 1 ㎍으로 동시-형질감염시켰다. cHA-발현 재조합 바이러스를 생성시키기 위해서 야생형 HA 플라스미드를 목적하는 키메릭 HA를 암호화하는 플라스미드로 치환시켰다. 형질감염후 6시간째에, 상기 배지를 0.3% 소 혈청 알부민(BSA), 10 mM HEPES, 및 1.5 ㎍/㎖ TPCK(L-1-토실아미드-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤)-처리된 트립신(시그마)을 함유하는 DMEM으로 대체하였다. 형질감염후 24시간째에, 바이러스-함유 상등액으로 8일 된 발육계란을 접종하였다. 요막액을 37 ℃에서 2일 배양후에 수확하고 닭 적혈구의 적혈구응집반응에 의해서 바이러스의 존재에 대해 분석하였다. 바이러스 모액을 앞서 개시된 바와 같이 MDCK 세포상의 플라크 형성에 의해서 역가측정하였다(문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682]; 및 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]).
바이러스 증식 동역학 분석
재조합 바이러스의 복제 특성을 분석하기 위해서, 10일 된 발육계란을 100 플라크 형성 단위(pfu)의 야생형 또는 cHA-발현 재조합 바이러스로 접종하였다. 요막액을 수확하고 후속으로 감염후 0, 9, 24, 48 및 72시간째에(hpi) 바이러스 증식에 대해 분석하였다. 요막액 중에 존재하는 바이러스의 역가를 상기 참조한 바와 같이 MDCK 세포상에서의 플라크 분석에 의해 측정하였다.
플라크의 면역염색
플라크를 앞서 개시된 프로토콜(문헌[Bouvier et al ., 2008, Journal of Virology 82:10052-8]; 및 문헌[Steel et a.l, 2009, J Virol 83:1742-53])을 사용하여, 인플루엔자 A형 핵단백질(NP)에 대한 mAb HT103에 의한 면역염색에 의해 가시화하였다.
웨스턴 블럿 및 간접적인 면역형광 분석
융합성 MDCK 세포를 37 ℃에서 1시간 동안 지시된 재조합 인플루엔자 바이러스로 감염시키거나(2의 감염 다중도[MOI]) 또는 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 모의 감염시켰다. 12 hpi에서, 세포를 앞서 개시된 바와 같이 1X SDS 부하 완충제 중에 용해시켰다(예를 들어, 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]을 참조하시오). 상기 환원된 세포 용해물을 인플루엔자 A형 바이러스 핵단백질(NP)(HT103)에 대한 단클론 항체, PR8 HA 헤드 도메인(PY102), Cal/09 HA 헤드 도메인(29E3), VN/04 HA 헤드 도메인(mAb #8) 및 12D1(HA 줄기에 대해 반응성인 범-H3 항체)를 사용하여 웨스턴 블럿 분석에 의해 분석하였다. H7 헤드 도메인을 검출하기 위해서, 다클론 염소 혈청 NR-3152를 사용하였다(A/FPV/네덜란드/27(H7) 바이러스(BEI 리솔시즈)에 대해 생성됨). 항-글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH) 항체(아브캠)를 부하 대조군으로 사용하였다. 단백질을 향상된 화학발광 단백질 검출 시스템(퍼킨엘머 라이프 사이언시즈)을 사용하여 가시화하였다.
면역형광 분석을 위해서, 15-㎜ 커버슬립상의 MDCK 세포의 융합 단층을 재조합 바이러스에 의해 2의 MOI로 감염시켰다. 15 hpi에서, 세포를 고정시키고 -20 ℃에서 20분간 메탄올-아세톤(비, 1:1)을 침투시켰다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민으로 차단시킨 후에, 세포를 1시간 동안 mAb 6F12뿐만 아니라 상술한 항체들과 함께 배양시켰다. 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS로 3회 세척후에, 세포를 알렉사 플루오르 594-접합된 항-마우스 IgG(인비트로젠) 또는 알렉사 플루오르 594-접합된 항-염소 IgG(인비트로젠)와 함께 배양하였다. 최종 3회 세척에 이어서, 감염된 세포를 올림푸스 IX70 현미경으로 형광 현미경검사에 의해 분석하였다.
플라크 감소 분석
플라크 감소 분석을 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다(문헌[Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796]을 참조하시오). PR8 줄기 정상의 Cal/09 또는 VN/04 구상 헤드 도메인으로 구성된 cHA를 발현하는, 대략 60 내지 80 pfu의 재조합 바이러스를 상이한 농도(100, 20, 4, 0.8, 0.16 및 0.032 ug/㎖)의 mAb KB2(우리 실험실에서 생성된 광범위 중화 항-HA 줄기 항체)(데이터 도시 안 됨)와 함께 또는 상기 항체 없이 실온에서 240 uL의 총 부피로 60분 동안 배양하였다. 6-웰 플레이트 중의 MDCK 세포의 융합층을 PBS로 2회 세척하고 이어서 37 ℃에서 40분 동안 상기 항체-바이러스 혼합물과 함께 배양하였다. 이어서 상술한 농도의 항체가 보충되거나 항체가 없는 TPCK-트립신 오버레이를 상기 접종물의 흡출 후에 각 웰에 가하였다. 플레이트를 37 ℃에서 2일 동안 배양하였다. 이어서 플라크를 항-인플루엔자 A NP 항체 HT103으로 면역염색에 의해 가시화하였다(문헌[Bouvier et al., 2008, Journal of Virology 82:10052-8]; 및 문헌[Steel et a.l, 2009, J Virol 83:1742-53]).
슈도유형 입자 중화 분석
슈도유형 입자 생성을 위한 과정은, 인플루엔자 B/야마가타/16/88 바이러스 NA와 함께 VN/04(H5) 또는 Cal/09(H1) 헤드 및 PR8(H1) 줄기로 구성된 cHA 구조물을 사용하여, 상술한 바와 동일하게 수행되었다. 이어서 입자를 100 내지 0.032 ㎍/㎖의 5배 희석의 상이한 농도의 mAb KB2와 함께 배양하였다. 이어서, 상기 혼합물을 MDCK 세포에 가하였다. 형질도입을 6시간 동안 진행한 후에 세포를 세척하고 새로운 배지를 세포위에 놓았다. 슈도유형 입자를 사용하는 모든 형질도입을 1 ㎍/㎖ 폴리브렌(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 존재하에서 수행하였다(문헌[Tscherne et al, 2010, J Virol Methods 163:336-43]). 형질도입후 48시간째에, mAb KB2에 의해 침입이 차단되는 정도를 분석하기 위해서 루시페라제 분석을 수행하였다.
결과
키메릭 헤마글루티닌의 생성
상기 Cys52-Cys277 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기가 보존되었는지를 보기 위해서, H1, H3, H5 및 H7 하위유형의 인플루엔자 A형 바이러스 HA 서열의 정렬을 본 연구에 사용하였다. 이들 시스테인 잔기는 HA 하위유형 전체에 걸쳐 고도로 보존되기 때문에, 그룹 1 및 그룹 2 HA 모두에 대해서, 상기 Cys52-Cys277 다이설파이드 결합을 상기 헤드와 줄기 도메인 사이의 식별점으로서 사용하였다. 헤드 영역으로서 상기 Cys52와 Cys277 사이의 서열을 한정하고, 줄기로서 상기 분자의 나머지를 한정함으로써, 다양한 HA 하위유형으로부터 신규의 헤드 및 줄기 조합을 암호화하는 구조물들을 제조할 수 있음이 합리화되었다(도 19A 및 B).
헤마글루티닌 하위유형들의 줄기 영역들 사이에 존재하는 아미노산 일치성의 정도는 우리로 하여금 헤드 도메인들의 교환이 가능할 수도 있음을 더욱 고무시켰다. 아미노산 일치성의 보다 높은 백분율이 모든 하위유형들에 걸쳐, 상기 헤드 도메인에 비해 상기 줄기 도메인에서 나타났다(도 20).
인플루엔자 HA의 16개 하위유형은 모두 2개의 계통발생 그룹으로 분류된다(문헌[Palese and Shaw, 2006, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication, Fields virology, 5th ed., 1647-1690]). 특정 그룹의 줄기 영역내에서 보다 높은 아미노산 일치성 백분율이 관찰되었고 그룹 1 바이러스로부터의 헤드 및 줄기 도메인을 함유하는 하나의 cHA 바이러스가 성공적으로 생성되었기 때문에(문헌[Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-8]), 그룹내 cHA를 생성시키려는 시도가 수행되었다. 그룹 1의 경우, PR8(H1)HA로부터의 줄기 영역을 갖는 대유행 H1 Cal/09 HA 또는 VN/04 구상 헤드 도메인을 암호화하는 2개의 키메릭 헤마글루티닌 구조물(각각 cH1/1 및 cH5/1)을 생성시켰다(도 19B). 유사한 전략을 적용시켜 상이한 그룹 2 인플루엔자 균주로부터의 헤드 및 줄기 도메인, 즉 Alb/01(H7, 그룹 2)로부터의 헤드 및 퍼쓰/09(H3, 그룹 2) HA(cH7/3)로부터의 줄기 영역을 발현하는 키메릭 HA를 생성시켰다(도 19B). 최종적으로, 상기 헤드 및 줄기 도메인을 교환하여 퍼쓰/09 HA(H3, 그룹 2) 줄기 정상의 VN/05 HA(H5, 그룹 1)의 헤드 도메인을 함유하는 그룹내 키메릭 HA(cH5/3)를 제조할 수 있는지의 여부를 평가하였다(도 19B).
상기 플라스미드의 제작에 이어서, 상이한 키메릭 HA 구조물이 발현되고 야생형 HA와 같이 세포 표면으로 운반될 수 있는지의 여부를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 일시적으로 형질감염된 293T 세포의 형광-활성화된 세포 분류기(FACS) 분석을, 각각 H1 및 H3 줄기 도메인 특이성 항체에 의한 표면 염색에 따라 수행하였다. 상기 방법을 사용하여, 모두 4개의 키메릭 구조물의 세포 표면 발현을 검출하였다(도 21). 그러나, 야생형 PR8 HA에 비해, 적은 표면 단백질 발현이 cH1/1 구조물에 대해서 검출되었으며, 이는 상기 Cal/09 HA의 헤드 도메인과 관련된 본래의 특성 또는 상기 키메릭 DNA 구조물에 대한 보다 낮은 형질감염 효율에 기인할 수 있었다. 또한, 상기 cH7/3 및 cH5/3 구조물에 대해서 세포 표면 발현 패턴의 차이가 존재함은 흥미롭다. 이러한 "이중 피크" 발현 패턴은 오직 형질감염 조건에서만 관찰되었으며, 재현성이었다. 상기 패턴은 cH7/3 또는 cH5/3-발현 재조합 바이러스에 의한 감염시에는 검출되지 않았다(도 21). 따라서, 이들 데이터는 상기 cHA들이 골지 복합체를 통해 세포 표면으로 운반될 수 있음을 가리킨다.
이어서, MDCK 세포의 형질도입을 통한 상이한 cHA의 침입 특성을, 루시페라제 리포터 구조물을 함유하고 상기 입자 표면상에서 상기 cHA 및 야생형 B/야마가타/16/88 바이러스 NA를 발현하는 레트로바이러스 슈도유형 입자를 사용하여 검사하였다. 상기 cHA 단백질에 의해 매개되는 침입 효율을 루시페라제 판독정보에 의해 검출하였다. 필적할만한 수준의 슈도유형 입자-매개된 루시레파제 발현이 cH5/1, cH7/3 및 cH5/3 키메릭 HA 및 상응하는 야생형 단백질에 대해서 관찰되었다(도 22). 상기 cH1/1 HA를 암호화하는 입자는 다른 HA 구조물에 비해 보다 낮은 루시페라제 수준을 발현하였으며, 이는 상기 생산자 세포주에서의 보다 낮은 cH1/1의 발현 및 따라서 보다 적은 입자당 HA 삼량체 또는 상기 cH1/1 HA의 덜 효율적인 침입 성질에 기인할 수 있었다. 상기 슈도유형 입자를 4 헤마글루티닌 단위로 표준화하는 경우, 슈도유형 입자의 실제량은 적혈구에의 결합의 차이로 인해 변할 수 있음도 또한 가능하다.
키메릭 헤마글루티닌을 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스의 생성
우리의 cHA 구조물은 효율적으로 발현되었고 세포 표면으로 운반되는 것으로 측정되었기 때문에, cHA를 암호화하는 재조합 인플루엔자 바이러스가 구제될 수 있는지의 여부를 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 상이한 cHA를 함유하는 바이러스를 앞서 공개된 프로토콜을 사용하여 성공적으로 생성시켰다(예를 들어, 문헌[Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682]; 및 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]을 참조하시오). 생성되는 바이러스를 플라크 정제하고, 10일 된 발육계란에서 증폭시키고, 키메릭 분절들을 RT-PCR에 의해 분석하고 서열분석하였다. 모든 경우에, 상기 바이러스는 예상된 키메릭 HA 분절을 갖고 다른 HA 분절은 갖지 않는 것으로 밝혀졌다(데이터 도시 안 됨).
구제된 바이러스 중의 cHA의 존재를 웨스턴 블럿(도 23) 및 감염된 세포의 간접 면역형광(도 24)에 의해 추가로 확인하였다. MDCK 세포를 rWT PR8, 야생형 퍼쓰/09, cH1/1, cH5/1, cH7/3 및 cH5/3 바이러스로 감염시켰다. cH1/1 및 cH5/1 키메릭 HA 단백질을 각각 Cal/09(H1) HA(29E3)(문헌[Medina et al., 2010, Nature Communications 1:28]) 또는 VN/04(H5) HA(mAb #8)(문헌[Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-53])의 헤드 도메인에 대해 반응성인 항체를 사용하여 상응하는 샘플 중에서 검출하였다(도 23). 상기 cH7/3, cH5/3 및 야생형 퍼쓰 HA 중에서 필적하는 발현 수준을 12D1, 범-H3 항-줄기 mAb를 사용하여 관찰하였다(문헌[Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796]을 참조하시오). 야생형 퍼쓰 HA는 상기 젤상에서 보다 느린 이동을 보였으며 이는 상기 구상 헤드 도메인 중의 보다 많은 수의 글리코실화 부위에 기인하는 듯하다. 정확한 HA 헤드 도메인이 각각 cH7/3 또는 cH5/3 감염 샘플 상에서 항-H7 다클론(NR-3152) 또는 항-H5 단클론 항체(mAb #8)를 사용하여 H3 줄기의 정상에서 발현됨이 입증되었다. 양성 밴드가 상기 두 경우 모두에서 검출되었다.
상기 면역형광 연구의 경우, 상기 감염 조건은 웨스턴 블럿 분석에 사용된 경우와 유사하였다. 감염된 세포를 도 23에 사용된 바와 같은 상응하는 항체로 염색하였다. 모든 감염된 세포는 상기 키메릭 및 야생형 HA뿐만 아니라 인플루엔자 A형 바이러스 NP의 예상된 발현을 나타내었다(도 24).
재조합 바이러스의 복제 특성
야생형 및 재조합 바이러스의 증식 성질을 37 ℃에서 10일 된 발육 계란에서 평가하였다(도 25A). 상기 rWT PR8 바이러스를 키메릭 HA를 발현하는 재조합 바이러스의 증식 동역학의 비교를 위해 포함시켰다. cH5/1 및 cH5/3 바이러스는 rWT PR8 바이러스의 경우에 필적하는 증식 동역학을 나타내었다. cH7/3 바이러스는 48 hpi(1X109 PFU/㎖)에서 rWT PR8과 유사한 피크 역가로 증식하였지만, 9 hpi에서는 rWT PR8 바이러스에 비해 2 로그의 바이러스 역가의 감소가 존재하였다. 상기 cH1/1 바이러스는 모든 시점에서의 감소된 바이러스 역가에 의해 입증된 바와 같이, 상기 rWT PR8 바이러스에 비해 약독화되었다. 그럼에도 불구하고, cH1/1 바이러스는 대략 108 PFU/㎖의 상당한 피크 역가에 도달하였다. 상기 퍼쓰/09 야생형 바이러스는 발육란에서 필적하는 피크 역가로 증식한다(데이터 도시 안 됨).
상기 키메릭 바이러스 각각의 플라크 표현형을 또한 MDCK 세포에서 평가하였다. 모든 바이러스는 도 25B에 나타낸 바와 같이 필적하는 크기의 플라크를 형성시켰다. 이들 데이터는 함께 상기 키메릭 HA 구조물이 정확하게 폴딩하고 생물학적으로 기능성임을 입증한다.
줄기 특이성 항체는 cHA -발현 바이러스 및 슈도입자를 중화시킬 수 있다
최종적으로, 줄기-특이성 항체를, cHA를 발현하는 우리의 새롭게 생성된 재조합 바이러스를 중화시키는 증력에 대해 시험하였다. 플라크 감소 분석을 mAb KB2, 넓은 그룹 1 반응성을 갖는 HA-줄기 특이성 항체의 존재하에서 또는 항체 없이 수행하였다. mAb KB2는 유사한 효율 및 용량 의존적인 방식으로 모든 cHA-발현 바이러스들을 중화시키는 것으로 나타났다. 100 ug/㎖에서, mAb KB2는 4 ug/㎖ 정도로 낮은 농도에서 약간의 중화 활성과 함께, cH1/1 및 cH5/1 바이러스를 100% 효율로 완전히 중화시킬 수 있었다(도 26A).
상기 결과를 확인하기 위해서, 슈도유형 입자 억제 분석을 mAb KB2로 수행하였다. cH1/1 또는 cH5/1 및 인플루엔자 B형 바이러스 NA를 발현하는 슈도유형 입자를 mAb KB2의 존재하에서 또는 항체 없이 MDCK 세포에 가하였다. 형질도입후 48시간째에, 상등액을 수집하고 루시페라제 활성을 분석하였다. 예상된 바와 같이, mAb KB2는 4 ug/㎖ 이상의 농도에서 cH1/1 및 cH5/1 슈도유형 입자의 침입을 용량 의존적인 방식으로 차단하였다. 보다 낮은 농도의 mAb KB2는 상기 플라크 감소 분석에 사용되는 농도에 비해 슈도유형 입자 침입을 억제하기에 충분하였지만, 이는 슈도유형 입자 표면상의 HA 삼량체의 추정상 보다 낮은 통합에 기인하는, 예상된 결과였다(문헌[(Corti et al., 2010, The Journal of Clinical Investigation 120:1663-73]). 전체 바이러스 대 슈도유형 입자를 포함하는 분석에서 mAb의 이러한 상이한 중화 효능의 현상은 다른 연구들에서 인식되었었다(문헌[Corti et al., 2010, The Journal of Clinical Investigation 120:1663-7321]; 문헌[Sui et al ., 2009, Nature Structural & Molecular Biology 16:265-73]).
결론
상기 헤드와 줄기 도메인 사이의 경계를 한정하는 보존된 다이설파이드 결합 Cys52-Cys277을 이용하여 상이한 HA 구상 헤드 도메인들을 갖는 키메릭 HA 단백질을 갖는 인플루엔자 바이러스를 생성시키는 새로운 전략이 개발되었다. 따라서, 상기 모 헤드 도메인을 또 다른 HA의 헤드 도메인으로 치환시킴을 통해서, 동일한 줄기, 그러나 상이한 구상 헤드를 갖는 키메릭 HA의 패널을 생성시켰다. 상기 설계를 Cal/09 및 VN H5 구상 헤드를 갖는 PR8 줄기 도메인을 포함하는 다수의 하위유형들 전체에 걸쳐 시험하였다. 또한, H7 구상 헤드를 H3 줄기 도메인상에 놓았다. 이들 구조물은 인플루엔자 HA 단백질의 계통발생 그룹들 모두에 들어맞는다. 각 구조물은 상기 세포 표면상에서 발현되었으며 융합 활성을 유지하였다. 상기 키메릭 HA를 갖는 재조합 바이러스의 생성은 상기 HA가 정확하게 폴딩하고 생물학적 기능을 유지함을 추가로 입증한다.
실시예 6: 범용 인플루엔자 백신으로서 키메릭 헤마글루티닌 구조물
본 실시예는 독특한 헤마글루티닌 헤드 및 줄기 조합을 함유하는 단백질인 키메릭 헤마글루티닌(cHA) 구조물에 의한 백신접종을 통해 유도될 수 있는 줄기-특이성 면역 반응의 보호 효능을 설명한다.
물질 및 방법
세포 및 바이러스
293T 및 MDCK 세포를 ATCC로부터 수득하고 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 및 최소 필수 배지(둘 다 깁코로부터)에서 유지시켰다. 각각의 배지는 10% 송아지 태아 혈청(하이클론), 및 100 단위/㎖의 페니실린-100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(펜/스트렙, 깁코)이 보충되었다.
인플루엔자 바이러스 A/포트 먼머드/1/1947(FM1) 및 A/네덜란드/602/2009를 마우스 폐에서 계대하고 이어서 48시간 동안 10일 된 발육계란에서 증식시켰다. 다중염기성 절단 부위 제거된 저 병원성 A/베트남/1203/04(VN04):PR8 2:6 재조합 바이러스(예를 들어, 문헌[Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753]을 참조하시오) 및 B/야마가타/16/1988 바이러스를 각각 37 ℃에서 48시간 또는 33 ℃에서 72시간 동안 10일 된 발육란에서 증식시켰다.
재조합 인플루엔자 바이러스를 상술한 바와 같이 및 앞서 개시한 바와 같이 역 유전학 시스템에 의해 생성시켰다(예를 들어, 문헌[Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439]을 참조하시오). H1 줄기 정상의 H9 바이러스의 HA 구상 헤드 도메인을 발현하는 바이러스인 cH9/1 N1 바이러스, 및 cH5/1(H5 헤드(VN04), H1 줄기) N1 바이러스를 앞서 개시된 바와 같이 유사한 방식으로 구제하였다(예를 들어, 문헌[Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578]을 참조하시오). YAM-HA 바이러스를 생성시키기 위해서, 상기 B/야마가타/16/1988(WT YAM) HA의 세포외 도메인을 A/푸에르토리코/8/1934 바이러스 HA의 상응하는 도메인으로 치환시켰다(예를 들어, 문헌[Hai et al., 2011, Journal of virology 85:6832-6843]을 참조하시오). 다른 7개의 WT YAM 바이러스 분절을 암호화하는 역 유전학 플라스미드가 선행의 연구에서 제작되었다(예를 들어, 문헌[Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590]을 참조하시오). 구제에 이어서, cHA-발현 재조합 바이러스를 37 ℃에서 48시간 동안 10일 된 발육계란에서 번식시켰다. YAM-HA 바이러스를 33 ℃에서 72시간 동안 8일 된 발육계란에서 증식시켰다.
재조합 및 야생형 바이러스들을 상술한 바와 같이 TPCK 트립신의 존재하에서 MDCK 세포(ATCC)상에서 역가측정하였다. cH5/1 N1 바이러스를 ELISA 분석에 사용하기 위해서 30% 슈크로스 쿠션상에서 부분 정제시켰다. cH9/1 N1, cH5/1 N1 및 FM1 바이러스를 구배 원심분리를 통해 정제하고 양성 대조군 백신으로서 사용되는 PBS 중의 희석된(1:4000) 포름알데하이드로 불활성화시켰다.
cH6 /1 및 cH9 /1 단백질 구조물의 생성
가용성 cH6/1 및 cH9/1 단백질을 상술한 바와 같이 및 앞서 개시된 바와 같이(예를 들어, 문헌[Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578]을 참조하시오) 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 생성시켰다. 간단히, 바큘로전달 벡터를 먼저 생성시킨 다음 바크미드의 Sf9 세포내로의 형질감염을 수행하였다. 이어서 재조합 바큘로바이러스를 사용하여 하이 파이브 세포를 10의 MOI로 감염시켰다. 상등액을 감염후 96시간째에 수확하고 이어서 4 ℃에서 2시간 동안 Ni-NTA 수지(퀴아겐)와 함께 배양하여 His-표지된 재조합 cHA 단백질을 정제하였다. 상기 슬러리를 컬럼상에 부하하고, 세척한 다음, pH 8 용리 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸) 중에서 용리시켰다. 단백질을 함유하는 분획들을 모아 PBS 중에서 완충제-교환하고 수평 로터에서 10-kDa 분자량 컷오프를 갖는 아미콘 울트라 원심분리 필터 유닛(밀리포어)을 사용하여 농축시켰다. 단백질 순도 및 정체를 SDS/PAGE, 쿠마씨 염색, 및 웨스턴 블럿에 의해 시험하였다. 최종 단백질 농도를 브래드포드 시약으로 측정하였다.
동물
동물들을 먹이 및 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하고 12시간 명/암 주기로 유지시켰다. 6 내지 8주된 암컷 BALB/c 마우스(잭슨 레보라토리즈)를 모든 비내 과정들에 대해서 0.1 ㎖의 케타민/자일라진(0.15 ㎎ 케타민 및 0.03 ㎎ 자일라진)의 복강내(IP) 주사로 마취시켰다.
백신접종 및 공격 실험
미경험의 6 내지 8주 된 암컷 BALB/c 마우스를 항원보강제 R848(인비트로젠)의 존재하에서 비내로(10 ug) cH9/1 단백질로, 및 아다박스(Addavax), MF59-유사 항원보강제(인비트로젠)로 복강내로(10 ug) 백신접종하였다. 동물을 최초항원자극후 3주째에 cH6/1 단백질 또는 BSA(바이오래드)로 추가접종하였다. 추가 백신접종도 또한, 항원보강제로서 폴리 I:C(인비트로젠)를 사용하지만, 비내(10 ug) 및 복강내(10ug)로 투여하였다. 불활성화된 FM1 바이러스(1 ug)를 양성 대조군으로서 50 ul 부피로 근육내로 투여하였다. 추가접종후 3주째에, 동물을 채혈하고 혈청을 수확하고, 동물을 5 LD50의 FM1 바이러스로 공격하였다. 체중을 공격후 14일 동안 모니터하였다.
다른 실험에서, 동물을 cH9/1 암호화 플라스미드 DNA(80 ug, 트라이그리드(TriGrid) 전달 시스템; 아이코어 메디칼 시스템스(Ichor Medical Systems))로 초회항원자극하고 이어서 3주 후에 폴리I:C와 함께 비내(10 ug) 및 근육내(10 ug) 투여되는 cH6/1 또는 cH9/1(대조군) 단백질로 추가접종하였다. 상기 추가접종을 3주 후에 cH5/1 또는 cH9/1(대조군) 단백질로 반복하였다. 대조군 동물을 cH9/1 암호화 DNA로 또한 DNA 일렉트로포레이션시켰지만 BSA로 2회 추가접종하였다(처리 그룹과 유사한 방식으로). 양성 대조군 동물에게 불활성화된 FM1 또는 PR8 바이러스(1 ㎍) 또는 1 ㎍의 pH1N1 1가 분할 백신을 근육내(BEI)로 제공하였다. 이어서 동물을 추가접종후 3 내지 5주째에 5 LD50의 PR8 또는 FM1 또는 10 LD50의 pH1N1 바이러스로 공격하였다. CD8+ T-세포 고갈에 사용된 동물을 300 ㎍의 항-CD8+ T-세포 항체(예를 들어, 문헌[M.L. Salem, 2000, Int. J. Immunopharmacol. 22:707]을 참조하시오)(ATCC로부터 구입한, 하이브리도마주 2.43으로부터)로 공격전 48 및 24시간째에 처리하고 5 LD50의 PR8 바이러스로 공격하였다. 체중을 공격후 14일 동안 모니터하였다. 20% 컷오프를 모든 바이러스에 대해 사용하였다.
다른 실험들에 대해서, 마우스를 YAM-HA 또는 WT YAM 바이러스로 접종하고, 이어서 3주 후에 폴리 I:C의 존재하에서 BSA 또는 cH6/1 단백질로 근육내 및 복강내로 백신접종하였다. 미경험 동물은 추가의 대조군으로서 제공되었다. 모든 동물을 채혈하고 백신접종에 이어서 3 내지 5주째에 상기 PR8 배경에서 제거된 다염기성 절단 부위를 갖는 250 LD50 cH9/1 N1 바이러스, 또는 10 LD50의 2:6 재조합 H5 바이러스로 공격하였다(예를 들어, 문헌[Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753]을 참조하시오). 포름알데하이드-불활성화된 cH9/1 N1 바이러스(1 ug) 및 cH5/1 N1 바이러스를 적합한 바이러스 공격을 위한 양성 대조군으로서 50 ul의 부피로 근육내 투여하였다. 동물을 상기 동물이 기관 지침에 따라, 공격에 이어서 그의 초기 체중의 30%를 초과하여 상실한 경우 안락사시켰다. 20% 컷오프를 저 병원성 cH9/1 N1 및 A/네덜란드/602/2009 바이러스에 의한 감염에 사용하였다. 이들 두 바이러스를 사용하는 공격의 경우, 모든 대조군의 사망 또는 실질적인 체중 손실을 알기 위해서 보다 엄격한 용량을 사용하였다(250 또는 10 LD50).
효소 결합된 면역흡수 분석
이뮬론 4HBX(써모 사이언티픽) 플레이트를 PBS 중에서 5 ug/㎖로 희석된 부분 정제된 cH5/1 N1 바이러스로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 3% 무지방 분유를 함유하는 0.1% 트윈 20-PBS(TPBS)로 1시간 동안 차단하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 1% 분유를 함유하는 TPBS 중에서 연속 희석된 마우스 혈청과 함께 배양하였다. 3회 세척후에, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 알칼리성 포스페이트(AP) 결합된 항-마우스 IgG(γ-쇄 특이성, 인비트로젠)와 함께 배양하였다. 이어서 플레이트를 TPBS로 3회 세척하고, p-나이트로페닐포스페이트(PNPP) 기질(지메드(Zymed))로 전개시키고, 0.5M NaOH로 정지시키고, 405 ㎚의 광학 밀도에서 판독하였다. 모든 실험에 대해서, 시너지(Synergy) 4(바이오텍(BioTek)) 플레이트 판독기를 사용하였다.
줄기-특이성 항체 역가를 상술한 바와 같이 ELISA에 의해 검출하였다. 줄기-특이성 반응성을 정량분석하기 위해서 PR8 항원을 사용하여 ELISA 플레이트를 코팅하였다. 백신접종된 마우스에서 줄기-특이성 항체의 중화 능력을 검출하기 위해서, 혈청을 모으고 전체 혈청 IgG를 정제하였다.
H5 HA를 발현하는 슈도입자를 앞서 개시한 바와 같이 슈도입자 침입 분석에 사용하였다(예를 들어, 문헌[Hai et al., 2012, J. Virol. 86:5774-5781] 및 문헌[N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578]을 참조하시오). 침입시, 슈도입자는 루시페라제 리포터를 발현한다. IgG에 의한 상기 침입의 억제를 비-IgG 처리된 대조군에 비해 발현의 백분율로서 정량분석하였다. 동물이 H5 구상 헤드 도메인에 노출되지 않았기 때문에, 상기 분석은 백신접종에 의해 생성된 줄기-특이성 항체가 바이러스를 중화하는 정도를 측정하였다. 인플루엔자 B형 야생형 감염된 마우스로부터의 정제된 IgG 및 단클론 항체 CR6261을 대조군으로서 사용하였다.
플라크 감소 중화 분석( PRNA )
mAb의 희석물을 먼저 진탕기상에서 RT에서 1시간 동안 60 내지 80 플라크-형성 단위(pfu)의 바이러스(cH9N1 인플루엔자 A형 바이러스)와 함께 예비-배양하였다. 이어서 상기 바이러스 및 정제된 IgG 혼합물을 사용하여 MDCK 세포의 단층을 12-웰 포맷으로 중복해서 감염시키고 37 ℃에서 1시간 동안 10분마다 간헐적으로 흔들면서 배양하였다. 상기 아가 오버레이는 상응하는 IgG 희석물이 보충되었다. 감염후 2일째(dpi)에, 상기 단층을 4% PFA/1XPBS로 30분 동안 고정시켰다. 세포를 RT에서 30분 동안 5% NF-우유/1X PBS로 차단하고 RT에서 1시간 동안 H9 특이성 단클론 항체(5 ㎍/㎖)와 함께 상응하게 배양하였다. HRP에 2차 접합된 항-마우스를 1:1000 희석으로 2차로서 사용하였다. 플라크를 트루블루(TrueBlue) 퍼옥시다제 기질(KPL Inc.)을 사용하여 가시화하고 상기 반응을 수돗물로 정지시켰다. 플라크를 각각의 항체에 대해 카운트하고 억제 퍼센트를 mAb가 없는 그룹에 대해 계산하였다.
통계학적 시험
통계학적 분석을 일방 스튜던츠 T 시험(프리즘(Prism)4, 그래프패드(GraphPad))을 사용하여 수행하였다. 도 29c에 대해서, 모든 값들을 평균의 표준 오차와 함께 평균으로서 플롯팅한다. 생존의 차이를 로그 랭크 유의수준 시험과 함께 카플란 마이어 생존 분석으로 계산하였다.
P-값에 의한 분석에 대해서, 0.05 이하의 P-값을 통계학적 유의수준으로 간주한다. 분산이 통계학적으로 상이한 것으로 측정되는 경우 웰치의 보정을 사용하였다. 0.05 이하의 P-값을 통계학적 유의수준으로 간주한다. 도 29c에서 최대 체중 손실에 대한 줄기 혈청 반응성을 비교하는 경우, 하나의 값이 이글비치와 호아글린(Iglewicz and Hoaglin)의 방법(문헌[Iglewicz, B. a. H., D. 1993. Volume 16: How to detect and handle outliers. In E. Mykytka (ed.), The ASQC Basic References in Quality Control: Statistical Techniques. American Society of Quality Control]을 참조하시오)에 따라 이상치(변형된 Z-점수 > 3.5 평균 이상 표준 편차)로서 검출되었으며 이를 분석으로부터 누락시켰다.
결과
cHA 구조물에 의한 연속되는 백신접종은 HA 줄기-특이성 항체를 유도하여 치사성 인플루엔자 공격으로부터 보호를 제공한다
상이한 항원성을 갖는 바이러스들로부터의 구상 헤드 도메인을 발현하는 구조물은 상기 HA의 줄기 도메인에 대한 다클론 반응을 자극할 수 있음이 가정되었다. 이를 시험하기 위해서, 마우스를 먼저 항원보강제와 함께 cH9/1 가용성 단백질로 백신접종하였으며, 이때 상기 HA의 줄기는 A/푸에르토리코/8/1934(PR8) 바이러스로부터의 것이고 헤드는 H9 단리물로부터의 것이다. 초회항원자극후 3주째에, 마우스를 제 2 가용성 cHA, cH6/1(H6 바이러스로부터의 헤드, PR8 바이러스로부터의 줄기)로, 상기 분자의 줄기 도메인에 대한 체액 반응을 자극할 의도로 추가접종하였다. (마우스를 양성 대조군으로서 제공된 불활성화된 FM1 바이러스로 백신접종하였다). 추가접종후 3주째에, 마우스를 채혈하여 상기 H1 줄기 도메인에 대한 혈청 반응성을 평가하고, 이어서 마우스-적응 A/포트 먼머드/1/1947(FM1) 바이러스로 공격하였다. 도 27a에 나타낸 바와 같이, 백신접종된 마우스는 상기 HA 줄기 도메인에 대해 혈청 항체 반응을 생성시켰다. FM1에 의한 공격에 이어서, 동물들은 상당량의 체중을 상실하였지만(도 27b), 7일 후에 90%의 전체 생존율이 회복되었다(도 27c). 마우스가 단지 H9 및 H6 바이러스의 구상 헤드 도메인에만 노출되었다 하더라도, 모든 마우스는 FM1 바이러스에 HI 음성인 것으로 입증되었으며, 이에 의해 백신접종으로부터 유도된 보호는 상기 줄기 도메인에 특이성인 면역 반응의 결과임이 확인되었다. 따라서, PR8-기재 cHA에 의한 백신접종은 FM1 바이러스 공격에도 불구하고 보호성인 줄기-특이성 면역성을 제공한다.
cH6 /1 단백질에 의한 백신접종은 cH9 /1 N1 바이러스 공격으로부터의 보호를 매개하는 줄기-특이성 면역성을 유도한다
항체 반응이 2개의 상이한 가용성 cHA 구조물을 투여함으로써 줄기에 대해 생성되었지만, 상당한 정도의 이환률이 FM1 공격에 이어서 나타났다. 마우스는 인플루엔자 바이러스에 면역학적으로 미경험이므로, 상기 HA 줄기에 대해 높은 혈청 항체 역가를 유도하기 위해서 인플루엔자 바이러스에의 다수의 노출에 이어서 항원적으로 독특한 헤드의 도입이 필요할 수 있다. 상기 헤마글루티닌 줄기에 대한 특이성과 함께 혈청 항체 역가의 증대된 자극은 또한 감염을 필요로 할 수 있으며, 이는 cHA 단백질 단독의 초회항원자극 및 추가접종에 따른 확고한 보호가 관찰되지 않은 이유를 설명할 수 있다.
상기 바이러스 헤마글루티닌에 대한 면역 반응을 자극하지만 다른 바이러스 단백질들에 대한 보호 면역성은 생성시키지 않기 위해서, PR8 바이러스로부터의 HA의 엑토도메인을 발현하는 재조합 B/야마가타/16/1988 바이러스(YAM-HA)를 제작하였다(예를 들어, 문헌[Hai et al., 2011, Journal of virology 85:6832-6843]을 참조하시오). 마우스를 인플루엔자 바이러스에 대한 사전 노출을 모방하기 위해서 YAM-HA로 접종하고, 이어서 3주 후에 BSA 또는 cH6/1 단백질로 백신접종하였다. 추가의 대조군으로서, 마우스를 야생형 B/야마가타/16/1988(WT YAM) 바이러스로 감염시키고 BSA로 백신접종하였다. 이어서 cH9/1(H9 헤드, H1 줄기)를 발현하는 인플루엔자 A형 바이러스를, 오직 상기 HA 줄기에 대한 면역 반응의 보호 성질을 명확하게 입증하기 위해서, 공격 바이러스로서 사용하였다. 다시, 동물은 H1 및 H6 바이러스로부터의 구상 헤드 도메인에 노출되었기 때문에, 상기 cH9/1 HA를 발현하는 바이러스에 의한 공격에 따라 나타난 보호는 가장 그럴듯하게는 상기 H1 줄기 도메인에 대한 면역성의 결과인 듯하였다.
도 28a에 나타낸 바와 같이, YAM-HA 노출에 이어서 cH6/1 단백질 백신을 받은 동물은 상기 PR8 배경에서 cH9/1 발현 바이러스에 의한 250 LD50 공격으로부터 완벽하게 보호되었다. cH6/1 가용성 단백질로 백신접종된 동물은 BSA로 백신접종된 동물에 비해 3, 4 및 5일째에 통계학적으로 적은 체중을 상실하였다. 이러한 체중 손실로부터의 보호는 BSA로 백신접종된 코호트에 비해, cH6/1로 백신접종된 그룹에서 생존을 증가시켰다(p = 0.038; 도 28b). 미경험 동물 및 WT YAM으로 접종된 동물은 감염으로부터 보호되지 않았으며, 이는 다른 백신접종 그룹에서 나타난 임의의 보호가 바이러스 복제의 결과가 아니라, 대신에 상기 H1 줄기 도메인에 대한 특이적인 반응이었음을 입증한다. 동물은 H1 및 H6 바이러스로부터의 구상 헤드 도메인에 노출되었고 cH9/1 공격 바이러스에 대해 HI 음성이었기 때문에, 여기에서 나타난 보호는 상기 H1 줄기 도메인에 대한 면역성의 결과인 것으로 여겨진다.
상기 HA 줄기에 대한 특이성을 갖는 단클론 항체가 계절성 H1N1 바이러스로 감염되거나 상기 바이러스에 대해 백신접종된 개인으로부터 단리되었고(예를 들어, 문헌[Corti et al., 2010, The Journal of clinical investigation 120:1663-1673]; 문헌[Corti et al., 2011, Science 333:850-856]; 문헌[Ekiert et al., 2011, Science 333:843-850]; 문헌[Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273]; 문헌[Throsby et al., 2008, PLoS One 3:e3942]을 참조하시오), 줄기 역가는, 보다 낮은 수준이기는 하지만, 상기 pH1N1 바이러스로 감염되지 않은 개인에서 감지되었음(예를 들어, 문헌[Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578]을 참조하시오)은 흥미롭다. 그 자체로서, YAM-HA 접종된 동물이 어느 정도의 줄기 역가를 생성시킬 수 있음은 놀랍지 않다. 그러나, 상기 cH6/1 구조물에 의한 백신접종은 혈청 줄기 역가를 4배(동등한 OD 값을 제공하는 반비례 희석)까지 증가시켰다(도 28c, 및 동물들을 실질적인 체중 손실 및 사망으로부터 보호하였다(도 28a 및 28b)). 상기 cH6/1 구조물에 의한 백신접종은 바이러스를 100% 효율로 중화하는 줄기-특이성 IgG의 생성을 유도한 반면(YAM-HA + BSA)(도 28d), 오직 초회항원자극만의 동물로부터의 혈청은 거의 배경(YAM-HA + BSA) 이상의 중화 수준을 나타내지 않았다. 실제로, YAM-HA로 접종되고 이어서 BSA로 백신접종된 동물은 WT YAM 바이러스로 접종되고 BSA로 백신접종된 동물과 통계학적으로 유사한 생존율을 가졌다(p=0.058). 대조적으로, 백신으로서 cH6/1 단백질의 사용은, WT YAM으로 접종된 동물의 경우에 비해 매우 현저한 비율로, 공격으로부터 100% 생존을 제공하였다(p<.0001). 생존이 또한 YAM-HA로 접종되고 BSA로 백신접종된 마우스의 경우에 비해 증대되었다(p=0.038). 이러한 차이는, YAM-HA + BSA 마우스 및 YAM-HA + cH6/1 마우스로부터의 IgG가 유사한 효율로 H5 HA를 암호화하는 슈도입자의 침입을 억제하였기 때문에, 상기 슈도입자 침입 분석에 반영되지 않았다(도 28e). 상기 침입 분석은 단지 슈도입자의 침입을 차단하는 항체의 능력을 검출할뿐임에 주목하는 것이 중요하다. 따라서, 침입 하류의 줄기-항체 및/또는 그의 감염된(면역) 세포와의 상호작용의 효과는 상기 분석에서 검출되지 않을 것이다. 이는 중화의 차이가 상기 두 그룹간에 관찰되지 않았고 생체내 결과를 반영하지 않았음을 설명할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 감염 프로토콜에 의해 유도된 항체들은 줄기 특이성이었으며 광범위하게 중화성이었다. 상기 공격 바이러스는 오직 H1 바이러스로부터의 줄기 도메인을 암호화하기 때문에, 상기 나타난 보호는 cH6/1 백신접종을 통해 자극된 HA 줄기 도메인에 대한 숙주 면역 반응의 결과였다는 결론을 내릴 수 있다.
cH6 /1 단백질에 의한 백신접종은 치사성 H5 인플루엔자 바이러스 공격으로부터 마우스를 보호한다
이어서 cH6/1 단백질에 의한 백신접종이 H5 바이러스에 의한 공격으로부터 마우스를 보호할 수 있는지의 여부를 확인하였다. 마우스를 상술한 바와 같이 접종하고 백신접종하였으며, PR8 배경에서 A/베트남/1203/2004 바이러스로부터의 HA 및 NA를 발현하는, 10 LD50의 2:6 재조합 바이러스로 공격하였다(예를 들어, 문헌[Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753]을 참조하시오). 예상된 바와 같이, 미경험 동물 및 WT YAM 바이러스로 접종된 동물은 공격으로부터 보호되지 않았으며 8일까지 감염에 굴복하였다. YAM-HA 바이러스로 접종되고 BSA로 백신접종된 동물은 공격으로부터 약간 보호되었으며, 생존율은 40%이었다. 동물을 cH6/1 단백질로 백신접종시켰을 때, 90% 생존율과 함께 증가된 보호가 관찰되었다. 상기 두 백신 그룹간의 생존율의 차이는 통계학적 유의수준에 접근하였지만(p=0.06), cH6/1로 백신접종된 마우스가 통계학적으로 보다 긴 시간 동안 생존하였다(p=0.037)(도 29a 및 29b). 상기 HA 줄기에 대한 반응성을 H5 공격에 이은 모니터링 기간에 걸쳐 최대 체중 손실%와 비교할 때, 역의 상관성이 검출되었으며, 이때 보다 높은 혈청 줄기 역가를 갖는 동물이 공격에 이어서 적은 체중을 상실하는 경향이 있었고(도 29c), 이는 cH6/1이 HA-줄기 기재 면역성을 증강시킬 수 있다는 개념을 지지한다.
백신접종된 마우스가 HA 구상 헤드 도메인에 대해 면역학적으로 미경험이고 HI 음성인, 상기 도메인을 갖는 공격 바이러스를 사용한 경우, 그 결과는 백신접종에 이은 공격으로부터의 보호가 오직 상기 HA 줄기에 대한 면역 반응을 기본으로 함을 가리킨다. 수용체 결합 부위에 대한 교차 반응성 항체가 여기에서 나타난 보호에 한 역할을 할 수도 있을 가능성을 배제하기 위해서, 마우스를 모두 HI에 대해 시험하였으며 그들의 각각의 공격 바이러스에 대해 HI 음성인 것으로 밝혀졌다.
cHA 에 의한 백신접종은 H1N1 바이러스 공격으로부터 보호를 매개하는 줄기-특이성 면역성을 유도한다
줄기-특이성 항체는 인간 혈청에서 검출되었다(예를 들어, 도 15A 및 15B; 문헌[M. Thorsby et al., 2008, PLoS One 3:e3942], 문헌[D.C. Ekiert et al., 2009, Science 324:246-251], 문헌[D.C. Ekiert et al., 2011, Science 333:843-850], 문헌[J. Wrammert et al., 2011, J. Exp. Med. 208:181-193] 및 문헌[N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578]을 참조하시오). 인플루엔자 바이러스 HA에 대한 선행 노출은 줄기 특이성 면역 반응의 확고한 생성에 중요할 수 있기 때문에, 마우스에서 상기 인플루엔자 바이러스에 대한 기존 면역성이 되풀이될 수 있는지의 여부를 확인하였다. 상기 노출이 바이러스 공격에 따른 이환률에 대해서 보다 유효하게 보호할 것임이 가정되었다. 이를 수행하기 위해서, 마우스를 cH9/1을 암호화하는 DNA 발현 벡터(예를 들어, 문헌[J. Steel et al, 2010, MBio 1(1), pii:e00018-10]을 참조하시오)로 초회항원자극하고, 이어서 가용성 cH6/1 단백질에 이어서 cH5/1 단백질(H5 헤드, H1 줄기)로 추가접종하고, 최종적으로 H1N1 바이러스의 패널로 공격하였다(도 30a 내지 30f). FM1(도 30a 및 30b), A/네덜란드/602/2009(pH1N1)(도 30c 및 30d) 및 PR8 바이러스(도 30e 및 30f)에 의한 감염에 이어서 모든 cHA-백신접종된 동물들이 공격으로부터 보호되었으며 단지 최소량의 체중 손실(존재하는 경우)만이 나타났다. 대조적으로, cH9/1 DNA로 초회항원자극에 이어서 BSA를 받은 음성 대조군 동물들은 상당량의 체중이 손실되었고, 한 마리를 제외하고, 9일까지 감염에 굴복하였다(도 30a 내지 30f). 상기 공격 각각의 실험들에서 cHA-백신접종된 동물의 생존은 대조군의 경우와 현저하게 상이하였다(도 30b, 30d 및 30f). 상기 유도된 보호가 줄기-특이성 체액 면역성의 결과인지를 확인하기 위해서, 모든 마우스가 혈청이 ELISA에 의해 H1 HA와 결합할 수 있었지만, 각 공격 바이러스에 대해 HI 음성인 것을 확인하였으며(도 30g), 이는 우리의 백신접종 프로토콜에 의한 줄기 특이성 항체의 생성을 입증한다. 상기 HA 줄기내에서 에피토프를 향하는 CD8 T 세포가 여기에서 나타난 보호에 한 역할을 하는 것이 가능하기 때문에(예를 들어, 문헌[M. Tamura et al., J Virol. 72:9404-9406]), 마우스를 백신접종하고 PR8 공격 전에 단클론 항체 2.43을 투여하여 CD8 T 세포를 고갈시켰다(문헌[M.L. Salem, 2000, Int. J. Immunopharmacol. 22:707-718]). 고갈은 체중 손실에도 생존 결과에도 영향을 미치지 않았으며, 이는 백신접종에 의해 유도된 보호에서 체액 반응을 뜻한다(도 30h 및 30i). 따라서, 상기 HA 줄기에 대한, 그러나 헤드에 대해서는 아닌 적응 체액 면역 반응은 상기 3개의 상이한 H1N1 바이러스들에 대해 보호를 제공하였다.
상기 cHA-기재 백신접종 프로토콜이 다른 하위유형들에 대한 중화 능력과 함께 줄기-특이성 항체를 유도하는지를 추가로 확인하기 위해서, H2 HA를 갖는 슈도입자의 침입을 차단하는 백신접종된 마우스로부터 정제된 IgG의 능력을 시험하였다. 슈도입자는 침입에 이어서 루시페라제 리포터 유전자를 발현하므로, 중화 활성은 세포 상등액 중의 루시페라제 효소 활성의 부재에 의해 측정되었다(문헌[R. Hai et al., 2012, J. Virol. 86:5774-5781] 및 문헌[N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578]). 공격에 이어서 나타난 보호와 일치하게, 백신접종된 마우스로부터 정제된 IgG는 슈도입자의 침입을 용량-의존적인 방식으로, 및 양성 대조군으로서 사용된 HA 줄기에 대해 특이성을 갖는 단클론 항체인 CR6261의 효능과 유사한 효능으로 억제하였다(도 30j). 따라서, 상기 백신접종 프로토콜은 H2와 같이 다른 그룹 1 HA를 중화할 수 있는, 넓은 특이성을 갖는 줄기 항체를 유도하였다.
결론
본 실시예는 키메릭 HA에 의한 백신접종을 통해 유도될 수 있는 줄기-특이성 면역 반응의 보호 효과를 설명한다. 상기 HA 줄기에 대한 면역 반응은 바이러스 공격으로부터의 보호에 충분하고, 상기 백신접종 프로토콜은 이종하위유형 보호를 제공함이 설명되었다. 인간에서 광범위한 인플루엔자 바이러스에 대한 보호를 제공하기 위한 유사한 전략이 개발될 수 있었으며, 이는 매년 백신접종의 필요성을 무효화하고 대유행의 대비를 증대시킬 수 있다.
실시예 7: 카복시-말단 삼량체화 도메인은 가용성 재조합 헤마글루티닌 기질의 줄기 도메인상의 입체형태적 에피토프를 안정화시킨다
본 실시예는 카복시-말단 삼량체화 도메인이 재조합 가용성 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌상의 줄기 에피토프의 구조적 보전에 중요함을 설명한다.
물질 및 방법
세포
Sf9 곤충 세포(ATCC #CRL-1711)를 10% FBS(애틀란타 바이오로지칼스(Atlanta Biologicals), 0.1% 플루로닉 F68(시그마) 및 페니실린-스트렙토마이신 항생제(깁코) 혼합물이 보충된 TMN-FH 배지(제미니 바이오프로덕츠(Gemini BioProducts))에서 증식시켰다. BTI-TN-5B1-4 세포(하이 파이브 - 비엔나 인스티튜트 오브 바이오테크놀로지 서브클론(Vienna Institute of Biotechnology subclone)를 페니실린-스트렙토마이신 항생제 혼합물(깁코)이 보충된 하이클론 SFX 무혈청 배지(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))에서 증식시켰다.
클로닝 및 재조합 바큘로바이러스 생성
H1 균주 A/푸에르토리코/8/34(PR8), A/캘리포니아/04/09(Cal09), H2 균주 A/일본/305/57(JAP57), H3 균주 A/홍콩/1/68(HK68), A/위스콘신/67/05(Wisc05) 및 H5 균주 A/베트남/1203/04(VN04 - 다중염기성 절단 부위가 제거된; 문헌[Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753]을 참조하시오)을 암호화하는 서열들을 폴리머라제 쇄 반응에 의해 pCAGGS 플라스미드로부터 증폭시키고 BamHI 또는 StuI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제(NEB)를 사용하여 변형된 pFastBac 벡터(인비트로젠)내로 클로닝시켰다. 2 세트의 구조물, 삼량체화 도메인이 있는 HA 및 상기 도메인이 없는 HA를 클로닝하였다: 삼량체화 도메인이 없는 HA 구조물은 상기 HA의 C-말단 막관통- 및 엔도도메인이 헥사히스티딘-태그로 대체되도록 설계되었고(HA 서열은 H1의 경우 I509, H2 및 H5의 경우 V509, 및 H3의 경우 G508로 끝난다; H3 넘버링); 다른 세트의 구조물, 삼량체화 도메인이 있는 HA는 또한 C-말단 막관통- 및 엔도도메인은 없으나(HA 서열은 V503으로 끝난다 - H3 넘버링), 상기 C-말단 헥사히스티딘-태그 외에 트롬빈 절단 부위 및 T4 폴던 삼량체화 도메인(예를 들어, 문헌[Meier et al., 2004, J Mol Biol 344:1051-1069]을 참조하시오)을 포함한다(도 31). 생성된 재조합 pFastBac 클론을 제조사의 설명에 따라 DH10Bac 세균(인비트로젠)내로 형질전환시키고 재조합 바크미드를 퓨어링크 플라스미드 필터 미디프렙(PureLink Plasmid Filter Midiprep) 키트(인비트로젠)로 제조하였다. 재조합 바크미드를 재조합 바큘로바이러스의 구제를 위해 셀펙틴 II(인비트로젠)를 사용하여 Sf9 세포내로 형질전환시켰다. 모든 서열을 상거 서열분석에 의해 확인하였다.
단백질 발현, 정제 및 특성화
바큘로바이러스를 Sf9 세포에서 계대 3 모액으로 증폭시키고 이어서 하이클론 SFX 무혈청 배지(피셔 사이언티픽)에서 1 x 106 세포/㎖의 BTI-TN-5B1-5(하이 파이브) 세포를 10의 감염 다중도로 감염시키는데 사용하였다. 발현을 1000 ㎖ 진탕기 플라스크에서 96시간 동안 28 ℃에서 수행하였다. 96시간 후에, 상등액을 저속 원심분리(5000 g, 4 ℃, 20분)에 의해 등명화하고 실온(RT)에서 2시간 동안 Ni-NTA(퀴아겐) 수지(250 ㎖의 배양 상등액에 대해서 3 ㎖ 슬러리)와 함께 배양하였다. 이어서 상기 수지-상등액 혼합물을 10 ㎖ 폴리프로필렌 컬럼(퀴아겐)상에 통과시켰다. 유지된 수지를 15 ㎖의 세척 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8)로 4회 세척하고 단백질을 용리 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸, pH 8)로 용리시켰다. 상기 용리물을 30 kDa의 컷-오프를 갖는 아미콘 울트라셀(밀리포어) 원심분리 유닛을 사용하여 농축시키고 완충제를 pH 7.4의 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 교환하였다. 단백질 농도를 소 혈청 알부민 표준 곡선과 함께 퀵스타트 브래드포드(Quickstart Bradford) 염색 시약(바이오 래드)을 사용하여 정량분석하였다. 단백질 순도, 보전 및 정체를 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)(4 내지 20% 폴리아크릴아미드 - 미니 PROTEAN TGX 젤, 바이오 래드), 쿠마씨 염색 및 웨스턴 블럿 또는 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해 평가하였다. 삼량체화 및/또는 다량체화의 정도를, 제조사의 권장사항에 따라 HA를 비스-[설포숙신이미딜]수베레이트(BS3 - 피셔 사이언티픽)와 가교결합시켜 시험하였다. 간단히, 3 ㎍의 HA를 25배 몰 과잉의 BS3 가교결합제의 존재하에서 30 ㎕의 PBS 중에서 배양하였다. 상기 혼합물을 RT에서 30분 동안 배양하고 이어서 BS3를, 1M 트리스-HCl 완충제(pH 8)를 50 mM의 최종 농도로 가함으로써 급냉시켰다. 후속으로 마우스 항-his 1차 항체(시그마) 및 항-마우스 양고추냉이 퍼옥시다제(산타 크루즈 바이오테크놀로지) 또는 알칼리성 포스파타제(산타 크루즈 바이오테크놀로지) 접합된 2차 항체를 사용하는 SDS-PAGE 및/또는 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
효소 결합된 면역흡수 분석
임뮤놀론 4HBX(써모 사이언티픽) 플레이트를 삼량체화 도메인이 있는, 및 없는 재조합 HA로, 코팅 완충제(0.1M Na2CO3/NaHCO3, pH 9.2, 50 ㎕/웰) 중에서 5 ㎍/㎖의 농도로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서 상기 플레이트를 1% 트윈 20(TBPS) 및 3% 무지방 분유를 함유하는 PBS(pH 7.4)로 RT에서 1시간 동안 차단하였다. 차단후에, 플레이트를 TPBS로 1회 세척하고 이어서 RT에서 1시간 동안 3배 희석의 단클론 항체 또는 혈청(1% 분유를 갖는 TPBS 중의 웰당 100 ㎕ - 단클론 항체 출발 농도 30 ㎍/㎖; 혈청의 경우 1:100 희석)과 함께 배양하였다. 이어서 플레이트를 100 ㎕의 TPBS로 3회 세척하고 추가로 1시간 동안 RT에서 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-마우스 IgG(산타 크루즈 바이오테크놀로지) 또는 항-인간 Fab 2차 항체(시그마)와 함께 1:3000의 희석(웰당 50 ㎕)으로 배양하였다. 3회 더 세척후에, 플레이트를 시그마FAST OPD 기질(시그마)(100 ㎕/웰)을 사용하여 전개시키고, 3M HCl(50 ㎕/웰)로 정지시키고 시너지 4(바이오텍) 플레이트 판독기상에서 490 ㎚의 흡광도에서 판독하였다. 획득된 판독치를 2차 항체만 배양된 웰로부터의 값으로 배경 공제하였다.
안정성 연구를 위해서, 삼량체화 도메인을 갖는 PR8 바이러스로부터의 HA를 4 ℃에서 60일 동안, 또는 -80 ℃에서 보관하고 1(표준), 2, 3 또는 4회의 동결-해동 주기를 진행하였다. 헤드 대 줄기 결합 항체의 안정성을 PY102 및 C179 단클론 항체를 사용하여 비교하였다. ELISA에서 항체-HA 조합을, 중복물이 사용된 안정성 연구를 제외하고, 3회 중복하여 수행하였다.
결과
C-말단 삼량체화 도메인은 HA를 안정화시키고 삼량체 형성을 유도한다
다양한 그룹 1 및 그룹 2 HA의 세포외 도메인을 바큘로바이러스 발현 시스템에서 C-말단 T4 파지 삼량체화 도메인(도 31) 없이 또는 상기 도메인과 함께 가용성 형태로 발현시켰다. 단백질을 감염후 96시간째에 수확하고 Ni-NTA 컬럼을 사용하여 C-말단 헥사히스티딘-태그를 통해 정제하였다. 정제된 단백질을 한외여과 회전 컬럼을 사용하여 농축시키고, 단백질 보전 및 불순물에 대해 SDS-PAGE 및 쿠마씨 염색에 의해 평가하고 브래드포드 시약으로 정량분석하였다. 상기 아미노산 서열, 및 다중염기성 절단 부위가 없는 바큘로바이러스 발현된 전장 HA가 대개는 절단되지 않는다는 사실을 근거로, HA의 세포외 도메인은, 글리코실화의 고려 없이 단량체당 대략 60 kDa(또는 삼량체당 180 kDa)의 예상된 분자량을 가질 것이다. 삼량체화 도메인이 없는 Cal09(H1), JAP57(H2) 및 VN04(다중염기성 절단 부위가 없는 H5)는, 60 kDa의 절단되지 않은 HA 밴드(HA0) 외에 대략 40 kDa(HA1) 및 25 kDa(HA2)의 밴드의 존재에 의해 가리키는 바와 같이 HA1 및 HA2로 부분적으로 절단되는 것으로 생각되었다. 비-환원, 변성 SDS-PAGE에서 삼량체화 도메인을 갖는 Cal09, JAP57 및 VN04 HA에 대한 60 kDa 밴드의 독점적인 존재를 근거로, 이들 단백질이 대개는 절단되지 않은 HA0로서 발현되는 것으로 추정될 수 있다(도 32A). 추가로, 삼량체화 도메인이 없는 Wisc05(H5) HA의 제제는 항-줄기 항체(12D1)로 탐침조사할 때 반응성인 40 kDa의 분해 산물을 나타내었다. 따라서 상기 종은 비-특이성 절단의 산물인 듯하였다. 삼량체화 도메인을 갖는 Wisc05 HA는 오직 HA0 밴드로서만 나타났다(도 32A). PR8 및 HK68 HA는 삼량체화 도메인의 부재하에서조차 매우 안정성(HA0로서 존재함)인 것으로 보였다.
HA를 BS3(HA에 대한 삼량체화를 나타내기 위해서 최근에 사용된 친수성 11 옹스트롬 화학적 가교결합제(예를 들어, 문헌[Weldon et al., 2010, PLoS One 5]을 참조하시오)를 사용하여 T4 삼량체화 도메인과, 및 상기 도메인 없이 가교결합시켰다. 가교결합 후에, 샘플을 환원, 변성 부하 염료 중에 희석하고, 환원, 변성 SDS-PAGE 젤상에서 분석하였다. 삼량체화 도메인이 없는 그룹 1 HA는, 실행 젤 내로 거의 흐르지 않고 대개는 적층 젤에서 유지되는 고분자량 올리고머를 형성시켰다(도 32B 및 32C). 가장 강한 표현형은 VN04 및 JAP57에 대해서 검출되었으며; 다른 그룹 1 HA는 또한 추가적인 삼량체(대략 230 kDa), 이량체(130 내지 150 kDa) 및 단량체(60 kDa)를 형성하였다(도 32B 및 32C). 삼량체화 도메인을 갖는 그룹 1 HA는 대개 상기 SDS-PAGE 젤상에서 대략 230 kD으로 흐르고 상기 실행 젤에 한정된 밴드를 형성하는 삼량체를 형성하였다. 그러나, 상기 HA는 또한 이량체(대략 130 내지 150 kDa, Cal09가 가장 강함) 및 단량체(60 kDa)를 형성하였다. 그룹 2 HA는 상이한 양상이었다: HK68 HA는 삼량체화 도메인의 존재와 상관없이 우세하게 삼량체를 형성하였으며 이량체를 약간의 정도로 형성하였다. Wisc05 HA는 삼량체화 도메인의 부재하에서 주로 이량체화를 나타낸 반면, T4 도메인을 갖는 HA는 대개 삼량체화되었다.
C-말단 삼량체화 도메인은 HA 기질에 대한 줄기-반응성 항체의 결합을 증대시킨다
상기 HA 구조물에 대한 광범위하게 반응성인 중화 항체 패널의 반응성을, 삼량체화 도메인이 있는 HA 기질 및 상기 도메인이 없는 HA 기질에 대한 상기 항체의 차별적인 결합을 측정하기 위해서 평가하였다. 줄기-특이성 항체 mAb C179, 마우스 mAb 6F12, 인간 mAb CR6261(모두 그룹 1 특이성); 및 마우스 mAb 12D1 및 인간 mAb CR8020(둘 다 그룹 2 특이성)을 상기 실험에 사용하였다. 최근에 단리되고 H1 및 H5 Ha 모두에 대해 반응성을 가짐을 특징으로 하는 4개의 다른 줄기-반응성 항체, KB2, BD3, GG3 및 IB11을 또한 상기 실험에 사용하였다. 대조군으로서, HA의 구상 헤드 도메인에 결합하는 것으로 공지된 균주 특이성 항체를 사용하였다. 추가적인 대조군으로서, 인플루엔자 바이러스 균주(PR8, Cal09, H3, VN04)로 치사량에 가깝게 감염되거나 VLP(JAP57)로 백신접종된 마우스의 혈청을 사용하였다. 항체 C179, CR6261 및 6F12는 시험된 2개의 H1 HA(Cal09 및 PR8) 모두에 대해 강한 결합 표현형을 나타내었다. 이들이 삼량체화 도메인을 갖는 HA에 독점적으로 결합하였고(도 33a 및 33b); 삼량체화 도메인이 없는 HA에는 결합하지 않은 것으로 관찰된 것은 흥미롭다. 유사한 결합 특성이 상기 4개의 다른 줄기-반응성 광범위 중화 H1-H5 항체의 경우에 나타났다. 대조적으로, 헤드-특이성 항체, 예를 들어 7B2(Cal09) 및 PY102(PR8)는 삼량체화 도메인의 발현과 관계없이 HA와 반응하였으며 이러한 결과는 Cal09 또는 PR8 감염된 동물로부터의 혈청을 사용하여 확인되었다(도 33a 및 33b).
상기 효과는 H1 하위유형에 특이적이지 않다 - 삼량체화 도메인이 존재 및 부재하는 JAP57(H2) 및 VN04(H5) HA에 대한 C179 및 CR6261의 결합을 시험할 때, 유사한 표현형이 관찰되었으며, 이때 이들 항체는 오직 상기 단백질의 삼량체화된 형태와만 반응하였다(도 34a 및 34b). 동일 결과가, 상기 4개의 H1-H5 항체의 반응성 평가시 관찰되었다. 헤드-특이성 항체 8F8(JAP57) 및 mAb#8(VN04) 또는 다클론 항-H2 또는 항-H5 혈청은 HA의 두 형태 모두를 동등하게 잘 인식하였다.
그룹 2 HA-결합 항체에 대해서 상이한 패턴이 나타났다. 그룹 2 HA와 줄기 항체와의 반응성에 대한 삼량체화 도메인의 영향을 시험하기 위해서, 광범위하게 반응성인 항체 CR8020 및 12D1을 사용하였다. CR8020은 그룹 2 HA에서 입체형태적 에피토프에 결합하는 반면, 12D1은 상기 HA2 서브유닛의 긴 알파 나선(LAH)내의 선형 에피토프와 결합하는 것으로 생각된다. 삼량체화 도메인을 갖는 HK68 및 Wisc05 HA에 대한 CR8020 결합은 삼량체화 도메인이 없는 HA에 대한 결합에 비해 크게 증대되었다(도 35a 및 35b). 그러나, 상기 삼량체화 도메인의 결여가 그룹 1 HA에 대해서 관찰된 바와 같이 결합을 완전하게 없애지는 못했다. 12D1은 삼량체화 도메인이 있거나 없는 HA를 구분하지 못했다(도 35).
결론
상기 T4 삼량체화 도메인은 가용성 HA 분자의 성공적인 삼량체화를 허용하며 바큘로바이러스 발현에 이은 상기 분자의 안정성을 크게 증가시킨다.
실시예 8: H1 인플루엔자 바이러스의 줄기 도메인 및 H5 인플루엔자 바이러스의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 HA(CH5/1)를 발현하는 인플루엔자 바이러스
본 실시예는 H1 인플루엔자 바이러스의 줄기 도메인 및 H5 인플루엔자 바이러스의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 HA를 발현하는 인플루엔자 바이러스(즉, cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 인플루엔자 바이러스)의 조작 및 구제를 설명한다.
cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 발현하는 인플루엔자 바이러스의 구제를 위한 플라스미드를, A/캘리포니아/04/09의 HA 유전자를 운반하는 구제 플라스미드 중의 구상 헤드 도메인에 대한 코돈(53 내지 276, H3 넘버링)을 A/베트남/1203/04(H5)의 구상 헤드 도메인으로 치환시켜 제작하였다. 상기 구조물의 서열을 상거 서열분석에 의해 확인하고 293T 세포에서의 발현을 상술한 방법에 따라 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 시험하였다.
구제를 위한 재조합 바이러스의 생성을 상기 실시예 5에 개시된 접근법들을 사용하여 수행하였다. cH5/1cal09 HA를 암호화하는 플라스미드를 인플루엔자 A형 바이러스의 7개의 다른 게놈 분절들(PR8 주쇄)을 암호화하는 7개의 상보성 구제 플라스미드와 함께 293T 세포내로 동시-형질감염시켰다. 형질감염후 하루째에 상등액을 수확하고 10일 된 발육계란에 직접 접종하였다. 접종후 48시간째에 계란을 4 ℃로 냉각시키고 요막액을 수확하였다. 바이러스 증식을 적혈구응집반응 분석에 의해 평가하였다. 양성 계란으로부터의 상등액이 MDCK 세포상에서 플라크 형성되었으며 단일 플라크를 골라 발육란에서 다시 번식시켰다. 플라크 정제된 바이러스로부터 RNA를 단리하고, 역-전사시키고 서열을 상거 서열분석에 의해 확인하였다. 상기 바이러스 클론의 정체를, 엄격하게 H1 줄기-반응성인 항체(6F12) 및 A/베트남/1203/04(H5)에 대한 균주 특이성 항-헤드 항체에 의한 염색에 의해 증명하였으며, 이는 A/캘리포니아/04/09의 HA 유전자 및 A/베트남/1203/04(H5)의 구상 헤드 도메인을 포함하는 cH5/1 키메릭 인플루엔자 헤마글루티닌 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 생성 및 단리를 입증한다.
실시예 9: 헤마글루티닌 줄기-기재 범용 백신 구조물은 그룹 2 인플루엔자 바이러스에 대해 보호한다
본 실시예는 H3 헤마글루티닌(그룹 2)의 줄기 도메인을 포함하는 키메릭 HA 폴리펩타이드의 투여를 수반하는 백신접종 전략이 대상에서 이종 H3, H10, H14, H15 및 H7(신규의 중국 H7N9 바이러스로부터 유래됨) 헤마글루티닌에 대해 고도로 교차-반응성인 광범위한 중화 항-줄기 항체를 유도함을 설명한다. 본 실시예는 또한 상기 항-줄기 항체가 H7 하위유형을 포함하여, 다양한 그룹 3 헤마글루티닌을 발현하는 인플루엔자 바이러스에 대한 광범위한 보호를 부여함을 설명한다.
물질 및 방법
세포 및 바이러스
마딘-달비 개 신장(MDCK; ATCC CCL-34) 및 인간 배아 신장 293T(ATCC CRL-11268) 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 구입하고 각각 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)(깁코) 및 최소 필수 배지(깁코)에서 증식시켰다. 상기 두 배지 모두 10% 소 태아 혈청(FBS; 하이클론) 및 100 단위/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(펜-스트렙; 깁코)이 보충되었다.
키메릭 및 재조합 인플루엔자 바이러스를 앞서 개시된 바와 같이 플라스미드-기재 역 유전학에 의해 생성시켰다(문헌[Margine et al ., 2013, J. Virol . 87:4728-4737]; 문헌[Hai et al., 2012. J. Virol . 86:5774-5781]; 문헌[Krammer et al., 2013. J. Virol . 87:6542-6550]). 바이러스 균주 A/빅토리아/361/11(H3N2; Vic11), A/퍼쓰/16/09(H3N2; 퍼쓰09), A/필리핀/2/82(H3N2; Phil82), X-31(H3N2; A/푸에르토리코/8/34와 A/홍콩/1/68으로부터의 HA 및 NA의 6:2 재조합체), A/레아/노쓰 캐롤라이나/39482/93(H7N1; 레아H7), A/cH5/3N1(A/베트남/1203/04의 H5 구상 헤드 도메인, 퍼쓰09로부터의 H3 줄기 도메인, 및 A/푸에르토리코/8/34로부터의 내부 유전자를 발현한다), A/와이오밍/03/03(H3N2; WyoH3), A/넓적부리/알래스카/7MP1708/07(H3N8), A/청둥오리/내륙 알래스카/10BM01929/10(H10N7), 및 B/cH7/3(B/야마가타/16/88 배경에서 A/퍼쓰/16/09로부터의 H3 줄기 도메인 정상의 A/청둥오리/알버타/24/01로부터의 H7 구상 헤드를 발현한다)을 37 ℃에서 48시간(인플루엔자 A형 바이러스의 경우) 또는 33 ℃에서 72시간(인플루엔자 B형 바이러스의 경우) 8- 또는 10-일 된 발육계란에서 증식시켰다(문헌[Hai et al., 2012. J. Virol . 86:5774-5781]; 문헌[Hai et al., 2011. J. Virol. 85:6832-6843]). A/인디애나/10/11(H3N2 변체, H3N2v)을 MDCK 세포상에서 증식시켰다. 바이러스 역가를 토실 페닐알라닐 클로로메틸 케톤(TPCK)-처리된 트립신의 존재하에서 MDCK 세포상에서 측정하였다. Vic11, 퍼쓰09, Phil82, X-31, 레아H7, 및 A/cH5/3N1 바이러스를 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)을 위해 슈크로스 밀도 한외원심분리를 통해 정제시켰다. 양성 대조군(Phil82, X-31, 레아H7 및 A/cH5/3N1)으로서 사용된 균주의 정제된 제제를 포르말린 처리에 의해 불활성화시켰다. 모든 바이러스를 생물학적 안전성 수준 2 조건하에서 취급하였다. cH5/3 및 cH7/3 단백질을 발현하는 바이러스는, 저-병원성 표현형과 관련되고 A/푸에르토리코/8/34 배경(대개 인간에게 안전한 것으로 간주된다)(문헌[Beare et al., 1975. Lancet ii:729-732])에서 구제된 원래의 H3 절단 부위를 함유하였다. 상기 사용된 H7N1 단리물은 또한 조류 종들에서 저 병원성 표현형을 나타낸다(문헌[Joseph et al., 2007, J. Virol. 81:10558:10566]). Sf9 세포(ATCC CRL-1711)를 10% FBS, 1% 플루로닉 F68(시그마), 및 펜-스트렙(깁코)이 보충된 트리코플러시아 니 (Trichoplusia ni) 배지-제형 Hink(TNM-FH)(제미니 바이오프로덕츠)에서 유지시켰다. BTI-TN-5B1-4(하이 파이브) 세포(ATCC CRL-10859)를 펜-스트렙(깁코)을 함유하는 하이클론 SFX 무혈청 곤충 세포 배지(피셔 사이언티픽)에서 증식시켰다.
재조합 단백질 발현
cH4/3(퍼쓰09로부터의 H3 줄기 도메인과 함께 A/오리/체코/56으로부터의 H4 구상 헤드 도메인), cH5/3(퍼쓰09로부터의 줄기 도메인과 함께 A/베트남/1203/04로부터의 H5 구상 헤드 도메인), cH7/3(퍼쓰09의 H3 줄기 도메인 정상의 A/청둥오리/알버타/24/01로부터의 H7 구상 헤드), 및 퍼쓰09 HA의 발현을 위한 재조합 바큘로바이러스들을 다른 곳에 개시된 바와 같이 생성시켰으며(문헌[Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728-4737]; 문헌[Krammer et al ., 2012. PLoS One . 7:e43603. doi:10.1371/journal.pone.0043603]), Sf9 세포에서 번식시켰다. 발현을 위해서, 하이 파이브 세포를 재조합 바큘로바이러스로 대략 10의 감염 다중도로 감염시키고, 페른바흐(Fernbach) 플라스크로 옮기고, 진탕시키면서 28 ℃에서 배양하였다. 배양 상등액을 감염후 96시간째에 저속 원심분리(5,500 상대 원심력[RCF], 10분, 4 ℃)에 의해 수확하고, 이어서 회전 진탕기에서 75 rpm에서 진탕시키면서 실온(RT)에서 3시간 동안 Ni-나이트릴로트라이아세트산(NTA) 수지(퀴아겐)와 함께 배양하였다. 이어서 상기 수지-상등액 혼합물을 10 ㎖ 폴리프로필렌 컬럼(퀴아겐)에 통과시키고, 세척 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8)로 4회 세척하고 용리 완충제(50 mM Na2HCO3, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8)로 용리시켰다. 상기 용리된 분획을 농축시키고, 상기 완충제를 아미콘 울트라 원심분리 필터 유닛(밀리포어; 30 kDa 분자량 컷오프)을 사용하여 pH 7.4의 포스페이트 완충된 염수(PBS)로 교환하였다. 정제된 단백질의 순도, 보전 및 정체를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 또는 ELISA에 의해 평가하고 단백질 농도를 브래드포드 시약(바이오래드)을 사용하여 측정하였다. ELISA를 위해서 가용성 A/퍼쓰/16/09 H3, A/상하이/1/13 H7 및 A/PR/8/34 H1 HA를 유사한 방식으로, 그러나 ELISA에서 사용시 백신 구조물에 의해 유도되는 줄기-반응성 항체를 평가하기 위해서 배경 신호를 제거하기 위해 스트렙탁틴(StrepTactin) 수지(GE 헬쓰케어)를 통해 GCN4pII 삼량체화 동기 및 C-말단 스트렙-태그 II와의 융합 단백질로서 발현시켰다(문헌[Krammer et al., 2013, J. Virol. 87:6542-6550]).
동물, 백신접종, 및 공격
모든 동물 실험을 6- 내지 8-주 된 암컷 BALB/c 마우스(잭슨 레보라토리즈)를 사용하고 마운트 시나이(Mount Sinai) 공공 동물 보호 사용 위원회의 아이칸 시나이(Icahn Sinai) 의과대학의 지침을 준수하여 수행하였다. 동물들은 먹이와 물에 자유롭게 접근하였으며 12시간 명-암 주기로 유지되었다. 동물을 0.1 ㎖의 케타민-자일라진 혼합물(0.15 ㎎/㎏ 및 0.03 ㎎/㎏)을 복강내로 투여함으로써 모든 비내 과정 동안 마취시켰다.
초기 실험의 경우, 미경험의 6- 내지 8-주 된 BALB/c 마우스를 좌측 종아리근에 cH4/3 HA(문헌[Margine et al ., 2013. J. Virol . 87:4728-4737]; 문헌[Krammer et al ., 2013. J. Virol . 87:6542-6550]; 문헌[Steel et al ., 2010. mBio 1(1):e00018-10. doi:10.1128/mBio.00018-10])를 암호화하는 DNA를, 트라이그리드 전달 시스템(아이코어 메디칼 시스템스)을 사용하여 생체내 일렉트로포레이션에 의해 백신접종하였다. 3주 후에, 동물을 근육내(i.m.) 및 비내(i.n.)로 각 부위에(n=9 또는 10 마리의 동물/그룹) 5 ㎍ 폴리(I·C)(인비트로젠)로 항원보강된 5 ㎍ 단백질로 추가접종하였다. 초회항원자극만 된 동물(n=5/그룹)에게, 동일한 양의 항원보강제와 함께 동일한 양의 관련없는 단백질(소 혈청 알부민[BSA])을 제공하였다(i.m. 및 i.n. 모두로). 2차 추가접종을 동일한 방식으로, 그러나 cH7/3 단백질을 사용하여 3주후에 투여하였다. 상기 H7N1 공격 전용의 마우스의 부분집합의 경우에, 상기 cH7/3 단백질을 전장 퍼쓰09 H3 단백질로 대체하였다. 초회항원자극만 된 동물에게 다시 상응하는 BSA 백신접종을 제공하였다. 양성-대조군 동물(n=5/그룹)을 공격 3주 전에, 1 fl.g의 불활성화된 합치된 공격 바이러스로 백신접종하였다. 미경험 마우스(n=5/그룹)를 추가의 음성-대조군으로서 포함시켰다. 최종 추가접종 후 4주째에, 동물을 마취시키고 5 50% 치사 용량(LD50)의 Phil82, X-31 또는 레아7 바이러스로 감염시켰다. 체중을 14일의 기간 동안 매일 모니터하고 초기 체중의 25% 이상을 상실한 동물은 죽은 것으로 기록하고 인도적으로 안락사시켰다. 혈청 샘플을 턱밑샘 출혈에 의해 초회항원자극 전 및 공격전에 수집하였다.
2차 실험 세트를 위해서, 미경험의 6- 내지 8-주 된 BALB/c 마우스를 치사량에 가까운 용량(106 PFU)의, cH7/3 HA 단백질을 발현하는 재조합 인플루엔자 B형 바이러스 벡터(B/야마가타/16/88 기본)로 비내 감염시켰다. 대조군 동물에게 동일한 용량의 야생형(wt) 인플루엔자 B형 바이러스(Bwt)를 제공하였다. 이어서 상기 백신 그룹 중의 마우스를, 상기 cH5/3N1 바이러스 공격 전용의 동물 부분집합(이들 동물에게는 cH5/3 단백질 대신에 동일한 방식으로 재조합 퍼쓰09 전장 H3 HA를 제공하였다(n=10/그룹))을 제외하고, cH5/3 단백질(5 ㎍ i.n. + 5 ㎍ i.m., 각각 5 ㎍의 폴리(I·C)로 항원보강되었다)로 추가접종하였다. 단지-초회항원자극 및 벡터 대조군 동물(n=5/그룹)을 관련없는 단백질(BSA; 상기 백신 그룹과 동일한 양, 항원보강제, 및 투여 경로)로 대신 추가 접종하였다. 최종적으로, 동물을 3주 후에 상기 1차 추가접종에 대해 개시된 바와 같이 cH4/3 단백질로 2차 추가접종하였다. 다시, 단지-초회항원자극 및 벡터 대조군 동물에게 관련없는 단백질을 동일한 방식으로 제공하였다. 미경험 마우스(n=5/그룹)를 추가적인 음성-대조군으로서 포함시켰다. 양성-대조군 동물(n=5/그룹)을 바이러스 공격 3주 전에 1 ㎍의 불활성화된 합치된 공격 바이러스로 i.m. 백신접종하였다. 최종 추가접종 후 4주째에, 동물을 마취시키고 10 LD50의 Phil82 또는 X-31 또는 100 LD50의 cH5/3N1 바이러스로 공격하였다. 체중 손실을 14일의 기간 동안 매일 모니터하고 초기 체중의 25% 이상을 상실한 동물은 죽은 것으로 기록하고 인도적으로 안락사시켰다. 혈청 샘플을 턱밑샘 출혈에 의해 초회항원자극 전 및 공격전에 수집하였다. 폐 역가측정 실험을 위해서, 마우스를 상술한 바와 같이 백신접종하고(cHA 및 Bwt-BSA-BSA 그룹, n=3 마우스/그룹), 이어서 5X104 PFU의 H3N2v 또는 1X105 PFU의 H3N8, WyoH3, 또는 H10N7 바이러스로 감염시켰다. 폐를 감염후 3일째에 수확하고 균질화하였으며, 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50)을 이전에 개시된 바와 같이 측정하였다(문헌[Miller et al., 2013, J. Infect. Dis. 207:98-105]).
수동 전달 실험을 위해서, 상기 나중의 실험 세트로부터의 혈청을 (인플루엔자 B형-벡터식) 백신 그룹, 양성-대조군, 벡터 대조군 및 미경험 동물로부터 수집하였다. 이어서 각 그룹으로부터의 혈청을 복강내 주사에 의해 미경험 마우스(6 내지 8주 된 것, n=5/그룹, 300 ㎕ 혈청/마우스)로 전달하고, 마우스를 상기 전달후 2시간째에 5 LD50의 Phil82 바이러스로 공격하였다. 체중을 14일의 기간 동안 매일 모니터하였으며, 초기 체중의 30% 이상을 상실한 동물은 죽은 것으로 기록하고 안락사시켰다.
ELISA
ELISA 플레이트(임뮤놀론 4 HBX)를 카보네이트/바이카보네이트 코팅 완충제(pH 9.4) 중에서 희석한 정제된 바이러스(4 ㎍/㎖) 또는 정제된 단백질(2 ㎍/㎖)로 밤새 4 ℃에서 코팅하였다. 플레이트를 0.1% 트윈 20(TPBS) 및 3% 무지방 분유를 함유하는 PBS로 RT에서 1시간 동안 차단시켰다. 마우스 혈청을 1:100 예비희석하고, 1% 무지방 분유를 함유하는 TPBS에서 1:2 단계로 연속해서 희석하고, RT에서 1시간 동안 상기 플레이트 상에서 배양하였다. TPBS(3X 100 ㎕/웰)로 광범위 세척한 후에, 상기 플레이트를 RT에서 1시간 동안 1% 무지방 분유를 함유하는 TPBS 중에서 희석된 항-마우스 IgG 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 IgG(산타 크루즈)와 함께 배양하였다. TPBS로 3회 더 세척한 후에, 플레이트를 o-페닐렌다이아민 다이하이드로클로라이드(시그마패스트 OPD; 시그마) 기질을 사용하여 전개시켰다. 3M HCl을 사용하여 반응을 정지시키고, 플레이트를 490 ㎚의 광학 밀도에서 판독하였다.
코 세척물에서 IgA의 검출을, 알칼리성 포스파타제(AP)-결합된 항-마우스 IgA 항체를 1:500 희석하여 사용하고(서던 바이오테크) 37 ℃에서 3시간 동안 배양하는 단계를 제외하고, 유사한 분석으로 수행하였다. 혈청 중 아이소타입 분포를, 각 하위유형에 특이적인 2차 항체 및 결합의 검출을 허용하는 AP-접합된 3차 항체의 콜렉션을 함유하는 아이소타입 분류 키트(인비트로젠)를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다.
슈도유형 입자 중화 분석
상기 슈도유형 입자 생성 프로토콜을 선행 연구로부터 개조하였다(문헌[Hai et al ., 2012. J. Virol . 86:5774 ?5781]; 문헌[Evans et al ., 2007. Nature, 446:801- 805]; 문헌[Pica et al ., 2012. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 109:2573-2578]). 간단히, 293-T 세포를 루시페라제 리포터 유전자, HIV Gag-Pol, Vic11 HA 단백질, 및 인플루엔자 B형 바이러스 B/야마가타/16/88로부터의 뉴라미니다제를 함유하는 프로바이러스를 암호화하는 4개의 플라스미드로 동시형질감염시켰다. 배양 상등액을 형질감염후 48시간째에 수집하고 0.45 ㎛ 기공 크기 필터 유닛에 통과시켜 세포 찌꺼기를 제거하였다. 상기 정제된 슈도유형 입자를 상이한 농도의 불활성화된 마우스 혈청과 배양한 후에 MDCK 세포에 가하였다. 상기 형질도입 과정을 6시간 동안 수행하고, 이어서 세포를 세척하고, 새로운 배지를 세포위에 놓았다. 상기 형질도입 과정을 1 ㎍/㎖의 폴리브렌(시그마, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 존재하에서 수행하였다. 루시페라제 활성을 형질도입후 48시간째에 판독하였다. 줄기-반응성 단클론 항체 12D1(문헌[Wang et al ., 2010. PLoS Pathog . 6:e1000796.doi:10.1371/journal.ppat.1000796])을 123 ㎍/㎖의 출발 농도로 양성 대조군으로서 사용하였다.
면역형광 염색
MDCK 세포를 A/안후이/1/13(H7N9), A/상하이/1/13(H7N9), A/닭/할리스코/12283/12 (H7N3), A/청둥오리/구르제브/263/82(H14N5), 및 A/쐐기 꼬리 슴새/서호주/2576/79 (H15N9)로부터의 HA를 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 각각의 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염후 16시간째에, 세포를 0.5% 파라포름알데하이드로 고정시키고 백신접종된 동물(cH4/3DNA-cH5/3-H3) 또는 미경험 동물로부터 수집된 혈청 1:2300 희석물로 염색하였다. 줄기-반응성 항체 FI6(문헌[Corti et al., 2011, Science, 333:850-856]) 및 FBE9(둘 다 10 ㎍/㎖의 농도로 사용됨)를 양성 대조군으로서 제공한 반면, 미경험 동물로부터 수집된 혈청은 음성 대조군으로서 사용되었다. 알렉사 488에 접합된 2차 항체를 사용하여 상기 단백질들에 대한 반응성을 가시화하였다. 상들을 공초점 현미경(칼 자이스 마이크로이미징(Carl Zeiss MicroImaging GmbH), 독일 예나 소재)상에서 X10의 배율로 촬영하였다.
통계학적 시험, 헤마글루티닌 모델링 , 및 계통발생적 분석
통계학적 분석을 프리즘4(그래프패드)를 사용하여 수행하였다. 모든 값을 평균의 표준 편차와 함께 평균으로서 플롯팅한다. 생존의 차이를 로그 순위 유의수준 시험과 함께 카플란-마이어 생존 분석을 사용하여 계산하였다. 0.05 이하의 P 값들은 통계학적 유의 수준으로 간주된다. 야생형 및 키메릭 헤마글루티닌의 모델을 생성시키기 위해서, 단백질 데이터 뱅크(PDB)로부터의 구조들을 파이몰(PyMol) 소프트웨어(델라노 사이언티픽(Delano Scientific))를 사용하여 모델링하였다. cH4/3 구조물의 모델링을 위해서, A/홍콩/1/68(HK68)의 HA(PBD 식별자[ID] 1MQN]를 사용하였으며, H4 헤드 도메인은 상이한 색상으로 표시하였다(H4 구조는 입수할 수 없다). cH5/3 HA를 HK68 HA(PBD ID 1MQN)로부터의 줄기 및 H5 바이러스(PBD ID 2FK0)의 구상 헤드로 모델링하였고; cH7/3은 조류 H7 바이러스(PDB ID 4DJ6)로부터의 HK68 줄기 도메인 및 헤드 도메인으로 모델링하였다. 키메릭 공격 바이러스는 HK68(PBD ID 1MQN)의 줄기 구조 및 H5 HA(PBD ID 4DJ6)의 헤드를 사용하여 모델링하였다. 계통발생적 분석은 ClustalW(EMBL-EBI)를 사용하여 수행하였다. 상기 단백질 서열을 진뱅크로부터 다운로드하였으며, 다수의 정렬을 메가 버전 5.1의 ClustalW 연산을 사용하여 수행하였다. 계통수를 픽트리(FigTree) 소프트웨어 및 근연접합법을 사용하여 작성하였다.
결과
키메릭 HA 구조물은 다양한 H3N2 바이러스에 의한 공격으로부터 광범위한 보호를 제공한다
상기 마우스 모델에서 그룹 2 HA-발현 인플루엔자 바이러스에 대한 광범위한 보호를 유도하기 위해서, 상기 보존된 HA 줄기 도메인에 대한 항체를 특이적으로 추가접종하였다. 이를 위해서, 다양한 헤드 도메인과 결합된 H3 줄기 도메인을 발현하는 cHA 분자의 콜렉션을 제작하였다(문헌[Margine et al., 2013. J. Virol . 87:4728- 4737]; 문헌[Hai et al., 2012. J. Virol. 86:5774-5781]). 마우스를 cH4/3 HA(H4 구상 헤드 도메인 및 H3 줄기 도메인을 발현한다)를 암호화하는 플라스미드 DNA로 근육내(i.m.) 초회항원자극하였다(도 37A). 3주 후에, 마우스를 가용성 cH5/3 단백질(H5 구상 헤드 도메인과 결합된 H3 줄기 도메인)로 i.m. 및 비내(i.n.) 경로 모두를 통해 추가접종하였다. 상기 두 경로 모두 전신 및 점막 면역성의 유도를 보장하는데 사용되었는데, 그 이유는 상기 두 반응이 모두 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 효율적인 보호에 중요하기 때문이다. cH7/3 단백질(H3 줄기 상부의 H7 구상 헤드)에 의한 2차 추가접종을 3주 후에 하였다(도 37A). 상기 동물을 통상적인, 구속되지 않은(가용성, 막-결합되지 않은) 줄기 도메인을 발현하는 항원에 반복적으로 노출시킴으로써 상기 영역의 면역원성(현재 사용되는 백신접종 전략은 단지 부차적인 우세 반응만을 유도한다)을 증대시킬 수 있음이 가정되었다(문헌[Wrammert et al., 2008. Nature 453:667-671]; 문헌[Margine et al ., 2013. J. Virol . 87:4728 - 4737]).
대조군 동물은 상기 DNA 초회항원자극만(초회항원자극만의 대조군) 또는 합치된 불활성화된 공격 바이러스(양성 대조군)를 받았거나 미경험이었다. 인플루엔자와 관련된 이환률 및 사망에 대해 보호하는 상기 백신의 능력을 시험하기 위해서, 마우스를 2개의 상이한 H3N2 바이러스로 감염시켰다. 모든 cHA-백신접종된 동물이 각각의 공격 균주에 대해 HI 음성인 것은 흥미롭다. A/필리핀/2/82 바이러스(Phil82)에 의해 감염시, 상기 백신접종된 동물은 양성 대조군에서의 체중 손실 없음에 비해 최소량의 체중을 상실하였으며, 임상적 증상을 나타내지 않았고, 사망에 대해서는 완전히 보호되었다(도 37B 및 C). 그러나, 미경험 동물은 체중을 빠르게 상실하였고 9일까지 감염에 굴복하였다(미경험 대조군). 초회항원자극만 된 대조군은 또한 빠른 체중 손실을 나타내었으며 단지 20%만이 바이러스 공격에 살아남았다. 유사한 결과가 X-31(홍콩 1968 H3N2 바이러스의 당단백질을 발현하는 바이러스)에 의해 공격시 관찰되었다(도 37D 및 E).
선행의 데이터는 인플루엔자 바이러스에 의한 치사에 가까운 감염이 마우스 및 인간에서 줄기-반응성 항체를 유도하는 하나의 방식임을 입증한다(문헌[Margine et al ., 2013. J. Virol . 87:4728 - 4737]; 문헌[Pica et al ., 2012. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 109:2573-2578]; 문헌[Krammer et al., 2012. J. Virol. 86:10302-10307]). 대부분의 인간 개인은 그의 수명 전체에 걸쳐 인플루엔자 바이러스에 수회 노출되기 때문에, 일반적으로 줄기-반응성 항체의 기준선을 갖는다. 상기 마우스 모델에서 이러한 기존 면역성을 모방하기 위해서, 야생형 인플루엔자 B형 바이러스 HA 대신에 cH7/3 HA를 발현하는 인플루엔자 B형 바이러스를 구제하였다. 치사량에 가까운 용량의 상기 바이러스를 사용하여 마우스를 초회항원자극하고, 이어서 3주 간격으로 cH5/3에 이어서 cH4/3 단백질로 백신접종하였다(i.m. 및 i.n. 모두로)(도 38A). Phil82 또는 X-31에 의한 공격시, 상기 동물들은 질병의 임상 징후를 나타내지 않았고 불활성화된 합치된 공격 균주를 받은 양성-대조군 동물에 필적하는 최소의 체중 손실을 나타내었다(도 38C, D, F 및 G). 야생형 인플루엔자 B형 바이러스로 치사에 가깝게 감염되고 관련되지 않은 단백질(BSA)로 유사한 방식으로 백신 접종된 대조군 동물뿐만 아니라, 미경험 마우스 및 초회항원자극만 된 대조군은 빠르게 체중을 상실하였고 상기 두 감염 모두에 대해 굴복하였다. 이어서, 보다 최근의 H3N2 단리물에 대해 보호하는 줄기-지시된 면역성의 능력을 시험하였다. 최신의 H3N2 바이러스는 상기 마우스 모델에서 병원성이 아니므로, 최근의 백신 균주 A/퍼쓰/16/09(퍼쓰09)의 H3 줄기 도메인 및 A/PR/8/34(H1N1)로부터의 NA를 발현하는 cH5/3N1 바이러스를 상기 목적에 사용하였다(문헌[Hai et al., 2012. J. Virol. 86:5774 ?5781]). 상기 줄기-반응성 항체에 의해 부여된 보호를 평가하기 위해서(및 H5-H5 헤드 반응성 항체를 제외하기 위해서), 상기 백신접종 섭생을 상기 마우스의 부분집합에 대해 변경하였으며 전장 H3을 상기 cH5/3 단백질 대신에 투여하였다(도 38A). 고 용량(100 마우스 LD50[mLD50])의 cH5/3N1 바이러스에 의한 공격시, 체중 손실로부터의 확고한 보호뿐만 아니라 상기 백신접종된 동물의 사망으로부터의 완벽한 보호가 관찰되었다. 이는 최신의 H3N2 단리물에 대한 상기 HA 줄기-기재 백신 접근법의 효능을 입증하였다(도 38B 및 E). 상기 마우스 모델에서 사망을 유도하지 않는 추가의 다양한 H3 균주를 시험하기 위해서, 폐 역가측정 실험을 수행하였다. 상술한 바와 같이 백신접종된 동물을 H3N2 변체 바이러스(H3N2v)(문헌[CDC. July 2012. MMWR Morb . Mortal . Wkly . Rep . 61:561]), 조류 H3N8 단리물(H3N8), 및 인간 N3N2 A/와이오밍/03/03 균주(WyoH3)로 감염시켰다. 감염후 3일째에, 백신접종된 동물의 폐 역가는 낮은 반면(검출 한계에 가까움), 대조군 동물(Bwt-BSA-BSA)로부터 수집된 폐에서는 높은 바이러스 역가가 검출되었다(도 37F 및 G, 데이터 도시 안 됨). 합해보면, 이들 데이터는 상기 줄기-기재 백신접종 전략이 상기 인플루엔자의 마우스 모델에서 이종 및 이종하위유형 바이러스에 대해 확고한 보호를 제공할 수 있음을 명백히 보여준다.
키메릭 HA 구조물에 의한 백신접종은 광범위한 전신 및 점막 줄기-지시된 체액 반응을 유도한다
상기 백신접종 섭생에 의해 유도된 줄기-지시된 항체 반응을 특성화하기 위해서 ELISA를 사용하였다. 상기 동물은 임의의 다른 인플루엔자 A형 단백질이 아니라 오직 벡터-발현되거나 재조합 HA에만 노출되었기 때문에, 정제된 바이러스를 항-줄기 반응을 측정하기 위한 기질로서 사용할 수 있었다. 상기 두 백신접종 섭생(인플루엔자 B형 바이러스 벡터식 또는 DNA 초회항원자극된) 모두로부터의 혈청을 공격 균주 Phil82 및 X-31뿐만 아니라, 퍼쓰09로부터의 H3N8 균주 및 HA 단백질, 현행 H3N2 백신 균주 A/빅토리아/361/11(Vic11)에 대한 반응성에 대해 시험하였다. 미경험이거나 오직 DNA 초회항원자극에만 노출된 동물로부터 수집된 혈청은 낮은 배경 수준 결합을 나타내었지만, 백신접종된 마우스로부터 수집된 혈청 중 5개 바이러스 균주 모두에 대해서 높은 반응성이 존재하였다(도 39A 내지 E). 유사하게, 높은 줄기-지시된 항체 역가가 cHA-발현 인플루엔자 B형 바이러스에 의해 초회항원자극된 동물의 혈청에서 검출되었다(도 39F 내지 H). 벡터 대조군(야생형 인플루엔자 B형 바이러스) 및 미경험 동물은 다시 단지 배경 반응성만을 나타낸 반면, 상기 초회항원자극만 된 그룹(c7/3 HA-발현 인플루엔자 B형 바이러스)은 중간 결합 표현형을 가졌다. 상기 후자의 그룹에서 중간 역가는 바이러스 복제의 결과인 것으로 생각되었다(문헌[Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728 - 4737]; 문헌[Krammer et al., 2012. J. Virol. 86:10302-10307]). 아이소타입 분포는 상기 백신에 의해 유도된 항체 반응의 프로파일이 균형을 이루며, 이때 IgG의 대부분은 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 하위부류인 것으로 밝혀졌다(도 41C를 참조하시오).
상기 혈청 IgG 역가 외에, 백신접종된 마우스의 점막 표면상의 분비성 IgA의 수준을 평가하였다. 이는 상기 백신을 받은 마우스의 그룹으로부터 수집된 코 세척물 중의 퍼쓰09 H3 HA에 대한 높은 반응성을 밝혔으며, 반면에 대조군 동물로부터의 코 세척물은 상기 기질과 반응하지 않았다(도 41B를 참조하시오). 점막 항-줄기 IgA 항체, 및 바이러스 감염을 차단하는 그의 능력은 여전히 공식적으로 특성화되지 않았지만, 상기 관찰된 보호에 기여하는 것으로 가정되었다.
광범위하게 반응성인 항-구상 헤드 항체가 최근에 문헌에 개시되었다(문헌[Ekiert et al ., 2012. Nature 489:526 -532]; 문헌[Lee et al ., 2012. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 109:17040-17045]; 문헌[Krause et al., 2012. J. Virol. 86:6334 - 6340]). 실제로 드물기는 하지만, 이들 항체는 수용체-결합 부위의 보존된 영역을 인식하고 계통발생적 관련성에 밀접하게 따르지 않으면서 다양한 구상 헤드 도메인을 인식하는 경향이 있다. 그룹 1 및 그룹 2 HA 모두의 헤드 도메인에 대한 결합(예를 들어, H1-H3 결합)이 이들 항체에 의해 개시되었다. 상기 cHA-기재 백신접종이 상기와 같은 항체를 유도하는지의 여부를 평가하기 위해서, 기질로서 전장 H1 HA를 사용하여 추가의 ELISA를 수행하였다(도 41A를 참조하시오). cHA-백신접종된 동물로부터의 혈청은 상기 기질과 반응하지 않았으며, 이는 cHA 백신접종이 광범위하게 반응성인 항-헤드 항체를 탐지할 수 있는 수준으로 유도하지 않음을 암시한다.
유도된 광범위하게 반응성인 항체는 시험관내 및 생체내 모두에서 바이러스를 효능 있게 중화시킨다
상기 백신접종 섭생에 의해 유도된 줄기 항체의 시험관내 교차-중화 성질을 추가로 시험하기 위해서, Vic11 HA-슈도유형 입자를 사용하는 침입 억제 분석을 수행하였다. 백신접종된 동물로부터의 혈청은 상기 슈도입자의 세포 침입을 용량-의존적인 방식으로 억제하였다(도 41D를 참조하시오). 대조적으로, 인플루엔자 B형 바이러스 벡터-감염된 대조군 동물 및 미경험 마우스로부터의 혈청은 상기 분석에서 비억제성인 것으로 나타났다.
생체내에서 관찰된 상기 백신-유도된 보호가 적어도 부분적으로 혈청 중 중화 항체에 기인하는 것인지를 보이기 위해서 수동 전달 실험을 수행하였다. 백신접종된, 양성-대조군, 인플루엔자 B형 바이러스 벡터-감염된, 또는 미경험 동물로부터의 혈청을 미경험 마우스로 전달하고, 이어서 Phil82 바이러스로 공격하였다. 백신접종되거나 양성-대조군으로부터의 혈청을 받은 마우스는 사망으로부터 완전하게 보호된 반면, 상기 음성-대조군들 중 어느 하나로부터의 혈청을 받은 동물들 중 어느 것도 생존하지 못하였다(도 41E를 참조하시오). 이러한 결과는 상기 줄기-유도된 체액 반응이 치사 공격으로부터 마우스를 보호하기에 충분함을 가리킨다.
키메릭 HA 구조물에 의한 백신접종은 줄기-기재 이종하위유형 면역성을 유도한다
다양한 그룹 2 HA 인플루엔자 바이러스를 교차-중화하는 항체가 문헌에 개시되었다(문헌[Wang et al ., 2010. PLoS Pathog . 6:e1000796. doi:10.1371/journal.ppat.1000796]; 문헌[Ekiert et al., 2011. Science 333:843- 850]). 이종하위유형 H7N1 바이러스에 대한 보호를 시험하고 상기 관찰된 보호에서 헤드-지시된 항체의 임의의 관련을 배제시키기 위해서, 상기 cH7/3 HA 단백질이 전장 H3 HA로 대체되었지만(도 40A), 상술한 DNA-단백질-단백질 백신접종 섭생을 사용하였다. 조류 H7N1 A/레아/노쓰 캐롤라이나/39482/93 균주(레아H7)로 공격된 백신접종된 및 양성-대조군 동물은 대략 15%의 유사한 초기 체중 손실을 경험하였다(도 40B). 이는 추정상 상기 실험 바이러스 공격에 필요한 높은 수의 PFU/마우스 치사 용량에 기인한다. 그러나, 상기 두 그룹으로부터의 마우스들은 빠르게 체중을 다시 획득하였고, 상기 백신 그룹은 90%의 생존율을 나타내었다. 그러나, 미경험 및 초회항원자극만 된 동물은 각각 심한 체중 손실을 겪었고 생존이 없거나 낮았다(20%). 상기 후자 실험의 결과는 HA 줄기-지시된 반응에 의해 제공된 면역성의 진정한 이종하위유형 성질을 입증한다(도 40C). 상기 혈청 중에 존재하는 광범위 중화 항체의 수준을 추가로 평가하기 위해서, ELISA를 정제된 H7N1 공격 바이러스뿐만 아니라 신규의 중국 H7N9 바이러스 균주(문헌[Gao et al ., 2013. N. Engl . J. Med . 368:1888-1897])로부터의 재조합 H7 단백질로 수행하였다. 상기 H7 HA에 대해 상기 동물로부터 수집된 혈청 중 높은 항체 역가의 검출은 상기 H3 줄기 도메인에 의해 유도된 반응의 교차-반응성 성질을 뒷받침한다(도 40D 및 E, 도 41). 또한, H10N7 바이러스에 의한 공격 실험을, 분석 정보로서 폐 역가를 사용하여 수행하였다. 백신접종된 동물에 대한 3일 폐 역가는 103 TCID50/㎖의 범위내에 있는 반면, 모의-백신접종된 동물은 10 내지 100배 더 높은 역가를 나타내었다(도 40F). cHA-백신접종된 동물로부터의 혈청의, 유라시아 및 북미 계통 H7 HA뿐만 아니라 H14 및 H15 HA를 발현하는 세포에 대한 효율적인 결합은 상기 면역 반응의 교차-반응성 성질을 추가로 증명한다(도 40G 및 42).
논의
상기 항-줄기 항체는 백신접종 또는 감염을 통해서 인플루엔자 바이러스에 노출된 인간에서 발견될 수 있지만(문헌[Margine et al ., 2013. J. Virol . 87:4728 - 4737]; 문헌[Sui et al ., 2011. Clin . Infect . Dis . 52:1003-1009]; 문헌[Corti et al ., 2010. J. Clin . Invest . 120:1663-1673]), 사실상 드문 것으로 보이며, 이들 항체의 생체내 수준은 보호를 제공하기에 너무 낮은 듯하다. 결과적으로, 이들 광범위 중화 줄기 반응성 항체의 수준을 증강시킬 수 있는 백신은 순환하는 인간 인플루엔자 바이러스 균주뿐만 아니라 최근 생겨난 중국 H7N9 균주와 같은 잠재적인 대유행성 조류 바이러스(문헌[Gao et al ., 2013. N. Engl . J. Med . 368:1888-1897])에 대해 광범위한 보호를 이끌어낼 수 있었다. 상기 HA의 줄기 도메인의 보존을 근거로, 상기와 같은 범용 백신은 3개의 성분, 즉 그룹 1, 그룹 2 및 인플루엔자 B형 줄기-기재 항원을 포함해야 하는 듯하다.
H3 줄기 도메인 및 다양한 구상 헤드를 발현하는 키메릭 HA 구조물에 의해 연속적으로 백신접종된 동물은 상기 줄기 도메인에 대한 높은 역가의 교차-반응성 항체를 발생시켰다. 이들 항체는 H3N2 균주 및 H3N8 바이러스의 패널에 대해 보호성일 뿐만 아니라 조류 H7N1 및 H10N7 단리물에 의한 이종-하위유형 공격에 대한 확고한 보호를 제공하였으며, 이는 상기 그룹 2 HA-발현 바이러스의 두 계통군 모두에 걸쳐있는 폭을 입증한다. 상기 폭은 뉴잉글랜드 참물범 및 다른 동물원성 H3 균주로부터 단리된 H3N2 변체(H3N2v) 바이러스 및 H3N8 바이러스(문헌[Baz et al., 2013. J. Virol . 87:6901-6910]; 문헌[CDC. July 2012. MMWR Morb . Mortal . Wkly . Rep. 61:561]; 문헌[Anthony et al., 2012. mBio 3(4):e00166-12. doi: 10.1128/mBio.00166-12])뿐만 아니라, 때때로 인간을 감염시키는 H4-, H7-, 및 H10-발현 바이러스(문헌[Runstadler et al ., 2013. Infect . Genet . Evol . 17:162-187]; 문헌[Kayali et al ., 2011. PLoS One 6:e26818. doi:10.1371/journal.pone.0026818]; 문헌[Arzey et al ., 2012. Emerg . Infect . Dis. 18:814 - 816]; 문헌[CDC. 2012. MMWR Morb . Mortal . Wkly . Rep . 61:726-727]; 문헌[Fouchier et al ., 2004. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 101:1356-1361]; 문헌[Tweed et al ., 2004. Emerg . Infect . Dis . 10:2196-2199])의 대유행 가능성에 관해 점점 커지는 우려에 비추어 중요하다. 중요하게, 상기 백신접종 전략은 또한 상기 최근 생겨난 중국 H7N9 바이러스로부터의 H7 HA에 대한 높은 역가의 줄기-반응성 항체를 유도하였다(문헌[Gao et al ., 2013. N. Engl . J. Med . 368:1888-1897]).
인간은 그의 수명 전체를 통해 인플루엔자 바이러스에 여러번 노출되며 따라서 상기 줄기 도메인에 특이성을 갖는 기존의 기억 B 세포를 갖는 듯하다. 상기 마우스 모델에서 상기 상황을 모방하고 줄기-반응성 항체의 기존 역가를 효율적으로 증강시키고자, 마우스를 관련 없는 구상 헤드 도메인과 함께 H3 줄기 도메인을 발현하는 재조합 인플루엔자 B형 바이러스로 치사량에 가깝게 감염시킴으로써 상기 H3 줄기 도메인에 사전 노출시켰다. 동일한 줄기 도메인을 함유하지만 상이한 헤드를 함유하는 cHA 구조물에 의해 후속 백신접종시, 상기 줄기-반응성 항체의 수준은 효율적으로 증강되며 1968년에서 2009년에 걸친 H3N2 인플루엔자 바이러스 균주의 패널에 의한 공격으로부터 마우스를 보호하였다. 백신접종된 마우스로부터의 혈청은 광범위한 H3N2 바이러스 기질뿐만 아니라 H7N1 바이러스 및 H7N9 HA 단백질 기질에 양호한 반응성을 나타내었다. 백신접종된 동물은 또한 H3N2v, H3N8 및 H10N7 감염에 의한 감염후에 감소된 폐 역가를 나타내었다. 더욱 또한, 상기 혈청은 중화 활성을 나타내었고 마우스를 수동 전달 공격 실험에서 보호할 수 있었다. 이러한 결과는 상기 백신접종 전략에 의해 유도된 중화 기전을 밝혔으며 아마도 바이러스 중화에 근거한 항체-매개된 기전이 보호를 매개함을 암시한다. CD8+ 및 CD4+ T 세포에 의한 보호에 대한 기여를 이 시점에서 배제할 수 없지만, 혈청 단독의 전달로도 공격으로부터 보호하기에 충분하였다. 교차-반응성 항-인플루엔자 항체를 중화시키지 않음으로써 유도되는 증대된 병원성이 노인에서의 상기 신규의 중국 H7N9 바이러스의 높은 병원성에 대한 가능한 이유로서 제시되었다(문헌[Skowronski et al., 2013. Euro Surveill . 18:pii=20465. http://www.eurosurveillance.org/View Article.aspx? ArticleId=20465]). 높은 역가의 교차-중화 항체를 갖는 cHA-백신접종된 동물에서는 증대된 병원성은 관찰되지 않았다. 실제로, 상기 동물은 이환 및 사망으로부터 보호되었으며 상기 바이러스는 보다 빨리 제거되었다.
본 실험은 그룹 2 HA-발현 바이러스에 대한 보호가 줄기-반응성 항체 단독에 의해 매개될 수 있음을 보이기 위해 설계되었다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 인간 백신 전략은 기능성 뉴라미니다제 및 인플루엔자 바이러스의 모든 내부 단백질과 함께 cHA 구조물을 발현하는 불활성화된 또는 약독화된 바이러스를 기본으로 할 수 있다. 인간이 기억 반응을 갖는 H3 HA의 구상 헤드 도메인의, 인간이 미경험인 "외래"의 관련없는 헤드 도메인에 의한 대체는 줄기-반응성 항체의 증강(문헌[Krammer et al ., 2013. J. Virol . 87:6542-6550]; 문헌[Miller et al., 2013. J. Infect . Dis . 207:98-105]; 문헌[Pica et al ., 2012. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 109:2573-2578]; 문헌[Li et al ., 2012. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 109:9047-9052]; 문헌[Wrammert et al ., 2011. J. Exp . Med . 208:181-193]; 문헌[Thomson et al ., 2012. Front . Immunol . 3:87])외에, 상기 NA에 대한 항체의 수준을 증대시켜야 한다. 더욱 또한, 강한 T-세포 에피토프를 갖는 내부 단백질의 존재는 또한 상기 면역 반응의 세포 가지가 활성화되고 보호에 기여하는 듯함을 보증할 것이다. 상기와 같은 백신은 모든 순환하는 인간 인플루엔자 바이러스 균주뿐만 아니라 잠재성 대유행 하위유형에 대한 광범위 보호를 보장하는 그룹 1, 그룹 2 및 B 줄기 성분을 포함할 것이다. 매우 어린 아동을 제외하고, 대부분의 인간은 상기 HA의 줄기 도메인에 대한 낮은 수준의 항체를 포함하여 인플루엔자 바이러스에 대한 기존 면역성을 갖고 있기 때문에, 3가 키메릭 HA 백신에 의한 백신접종은 상기 역가를 보호 수준으로 충분히 증강시키는 것이 가능하다.
실시예 10: H3 줄기-기재 키메릭 헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스 구조물은 H7N9 공격으로부터 마우스를 보호한다
본 실시예는 대상을 H7 헤드 도메인을 갖지 않는 키메릭 HA 구조물을 사용하여 신규의 H7N9 바이러스에 대해 보호할 수 있음을 설명한다. 본 실시예는 또한 인간용으로 허가된 것들과 유사한 수중 유적형 기재 항원보강제가 상기 키메릭 HA 백신 후보들에도 잘 수행됨을 설명한다.
보호에 대한 점막 반응의 중요성을 연구하기 위해서, 점막 및 전신 면역성을 모두 유도하는 실험 설비를 적용하고 오직 전신 면역성만을 유도하는 것과 비교하였다. 추가로, 2개의 항원보강제, 즉 이전에 동물에서 cHA와 함께 성공적으로 사용되었던 폴리I:C(PIC), 및 일반적인 수중 유적형(OIW) 항원보강제를 비교하였다(문헌[Ott et al., 2000. The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective, p. 211-228. In O'Hagan DT (ed.), Vaccine Adjuvants, vol. 42. Springer]). 후자는 인간용으로 허가된 항원보강제와 유사하다(문헌[Ott et al., 2000. The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective, p. 211-228. In O'Hagan DT (ed.), Vaccine Adjuvants, vol. 42. Springer]).
동물(사각형, N=10/그룹, 6 내지 8주 된 암컷 BALB/c 마우스)을 트라이그리드 일렉트로포레이션 장치(아이코어 메디칼 시스템스)에 의한 근육내 일렉트로포레이션을 통해 cH4/3 단백질(A/퍼쓰/16/09로부터 유래된 H3 줄기 도메인의 상부의 A/오리/체코/56으로부터 유래된 H4 헤드)(문헌[Margine et al., 2013. J Virol 87:10435-10446])을 발현하는 DNA 플라스미드로 초회항원자극하였다(도 43A). DNA 백신접종이 cHA 백신접종 섭생에 의한 광범위 보호의 유도에 필수적이지 않음은 흥미롭다. 단지 단백질만(DNA 부재)의 백신접종은 선행 연구(문헌[Goff et al ., 2013. PLoS One 8:e79194])에서 DNA 초회항원자극에 의한 백신접종에 필적하는 결과를 제공하였다. 초회항원자극 후 3주째에, 동물은 재조합 cH5/3 단백질(A/퍼쓰/16/09로부터 유래된 H3 줄기 상부의 A/베트남/1203/04로부터 유래된 H5 헤드)(문헌[Margine et al., 2013. J Virol 87:10435-10446])을 받았다. 하나의 그룹에서 동물은 5 ㎍의 PIC(고분자량, 인비트로젠)가 항원보강된 5 ㎍의 cH5/3 단백질을 비내(i.n.) 및 5 ㎍을 근육내(i.m.)('PIC i.n.+i.m.')로 받았다. 제 2 그룹은 단지 PIC(총 5 ㎍의 HA)를 i.m. 용량('PIC i.m.)'으로 받은 반면, 제 3 그룹은 일반적인 OIW 기재 항원보강제('OIW i.m.')와 함께 5 ug의 cH5/3 단백질을 받았다(도 43A). 3주 후에 모든 마우스를 각각 동일한 백신접종 경로, 항원보강제 및 면역원량을 사용하여 전장 H3 단백질로 2차 추가접종하였다(도 43A). 백신접종에 사용된 모든 재조합 단백질을, C-말단 T4 폴던 삼량체화 도메인 및 정제를 용이하게 하기 위한 헥사히스티딘 태그를 갖는 바큘로바이러스 발현 시스템에서 발현시켰다(문헌[Krammer et al ., 2012. PLoS One 7:e43603]). 상기 OIW 항원보강제(20 mM 시트레이트, 0.5% 폴리솔베이트 80, pH 6.5, 0.5% 스팬-85(솔비탄 트라이올리에이트), 4.3% 스쿠알렌)를 앞서 개시된 바와 같이 제조하였다(문헌[Ott et al., 2000. The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective, p. 211-228. In O'Hagan DT (ed.), Vaccine Adjuvants, vol. 42. Springer])(도 44). 양성 대조군(원, n=5)은 포르말린-불활성화된 A/상하이/1/13 H7N9(SH1, A/상하이/1/13으로부터 유래된 HA 및 NA의 6:2 재조합체 및 A/푸에르토리코/8/34로부터의 내부 유전자) 완전 바이러스 제제의 1회 i.m. 백신접종을 받았다. 음성 대조군(삼각형, n=4-5)은 모의 DNA 백신접종에 이어서, 비교된 각각의 cHA 백신접종 섭생과 동일한 양 및 경로로 투여된 소 혈청 알부민(BSA)의 2회의 추가접종을 받았다. 최종 면역화후 4주째에, 동물을 채혈하고 이어서 10 쥐 치사 용량 50(mLD50)의 SH1 바이러스로 공격하였다. 체중 손실을 14일의 기간동안 모니터하였으며, 초기 체중의 20%를 초과하여 상실한 마우스는 안락사시켰다. 상기 PIC i.n.+i.m. 그룹의 동물은 상기 PIC i.m. 그룹에서의 15%(도 43C)에 비해 초기 체중의 평균 10%를 상실하였으며(도 43B), 이는 감염 부위에서의 점막 면역성이 보호에 중요한 역할을 함을 암시한다. 더욱 또한, 상기 OIW i.m. 그룹의 마우스는 평균적으로 그의 초기 체중의 단지 12%만을 상실하였으며(도 43D), 이는 또한 상기 관찰된 생존을 반영한다. 모든 PIC i.m.+i.n. 백신접종된 동물이 상기 PIC i.m. 동물의 단지 70%에 비해(도 43F), 상기 공격에 생존하였다(도 43E). 그러나, 상기 OIW i.m. 그룹에서의 생존은 100%이었으며(도 43F), 이는 상기 OIW 항원보강제의 보다 양호한 보호 효과를 가리킨다. 상기 3개의 상이한 백신접종 섭생에 의해 유도된 H7 HA 항체의 역가를 정량적으로 평가하기 위해서, 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISA)을 기질로서 재조합 SH1 H7 HA를 사용하여 수행하였다. 상기 cHA-백신접종된 동물은 H7 헤드 도메인에 노출되었기 때문에, H7에 대한 임의의 관찰된 반응성은 우세하게는 교차-반응성 항-줄기 항체로부터 유도될 것임이 가정되었다. 상기 헥사히스티딘 태그 또는 삼량체화 도메인에의 결합을 배제하기 위해서, GCN pII 류신 지퍼 삼량체화 도메인 및 스트렙 태그 II와 함께 발현된 재조합 SH1 H7 HA를 사용하였다(문헌[Krammer et al., 2013. J Virol 87:6542-6550]; 문헌[Weldon et al.,. 2010. PLoS One 5]). 가장 높은 종점 역가는 PIC i.n.+i.m. 백신접종된 동물에서 검출되었고, 이어서 OIW i.m. 동물에서 검출되었다(도 45A). 상기 PIC i.m. 백신을 받은 마우스는 상기 OIW i.m. 동물보다 통계학적으로 현저하게 더 낮은 역가를 가졌다(p=0.03). 이러한 종점 역가의 차이는 체중 손실 및 생존의 차이와 상관이 있다. 항체 아이소타입 분포는 항원보강제에 의해 강하게 영향을 받을 수 있으며 항체의 보호 효율에 큰 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 상기 3개의 백신접종 섭생을 비교할 때 상기 아이소타입 프로파일에 현저한 차이는 없었다(도 45B). 이는 i.m.만의 백신접종의 경우, 항체 역가가 보호의 큰 상관물임을 암시한다. 상기 백신 및 대조군으로부터의 혈청을 또한 미세-중화 분석에서 시험하였으나 상기 cHA 백신접종된 그룹의 결과는 추정상 상기 분석의 검출 한계(1:20)로 인해 음성이었다(데이터 도시 안 됨). 상기 i.n. 백신접종에 의해 유도된 점막 IgA 항체는, 상기 두 경로 모두를 통해 면역된 동물이 단지 근육내로 백신접종된 동물보다 더 낮은 이환률을 나타내었기 때문에, 보호에 상당한 기여를 갖는 것으로 가정된다. 상기 PIC i.n.+i.m. 그룹과 PIC i.m. 그룹간의 체중 손실의 차이는 7일(p=0.0383) 및 8일(0.0136)째에 통계학적으로 유의수준이었다(비대응 t-검정). 그러나, 상기 동물은 또한 상기 i.m.만의 동물만큼의 항원을 2회 받았음을 알아야 한다.
결론적으로, 본 실시예는 마우스를, H7 헤드 도메인을 갖지 않는 cHA 구조물을 갖는 줄기-기재 면역화 섭생을 사용하여 신규의 H7N9 바이러스에 대해 보호할 수 있음을 설명한다. 더욱 또한, 인체용으로 허가된 경우와 유사한 수중 유적형 항원보강제(문헌[Ott et al., 2000. The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective, p. 211-228. In O'Hagan DT (ed.), Vaccine Adjuvants, vol. 42. Springer; O'Hagan et al ., 2013. Expert Rev Vaccines 12:13-30])가 상기 cHA 백신 후보와 잘 수행되었으며, 이는 상기 조합을 또한 인간에서의 시험에 고려할 수 있음을 암시한다. 광범위한 인플루엔자 바이러스 보호를 제공하는 HA 줄기 기재 백신은 균주 특이성 계절 백신을 대체할 수 있었으며 H7N9와 같은 잠재적인 대유행성 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 대비를 더욱 증대시킬 수 있었다.
본 명세서에 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원들은 각각의 개별적인 공개문헌 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 인용됨을 가리키는 것처럼 본 발명에 참고로 인용된다. 상기 발명을 이해의 명확성을 위해서 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 개시하였지만, 당해 분야의 통상적인 숙련가들은 본 발명의 교시에 비추어 일부 변화 및 변형을 첨부된 특허청구범위의 진의 또는 범위로부터 이탈됨 없이 수행할 수 있음을 쉽게 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Icahn School of Medicine at Mount Sinai <120> INFLUENZA VIRUS VACCINES AND USES THEREOF <130> 6923-219-228 <140> PCT/US2013/075697 <141> 2013-12-17 <150> 61/738,672 <151> 2012-12-18 <150> 61/840,899 <151> 2013-06-28 <160> 35 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 565 <212> PRT <213> Influenza virus A <220> <223> influenza virus A hemagglutinin subtype H1 <400> 1 Met Lys Ala Asn Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Leu Ala Ala Ala Asp 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Asp Pro Leu Leu Pro Val Arg Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Ile Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu 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Arg Ile Cys Thr 1 5 <210> 23 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/Hong Kong/1/1968 (H3) <400> 23 Gln Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asp Asp 20 25 30 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 35 40 45 Gly Lys Ile Cys 50 <210> 24 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/Perth/16/2009 (H3) <400> 24 Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 20 25 30 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 35 40 45 Gly Glu Ile Cys 50 <210> 25 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/PR/8/34 (H1) <400> 25 Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys 35 40 <210> 26 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/Cal/4/09 (H1) <400> 26 Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Lys Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys 35 40 <210> 27 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/Viet Nam/1203/04 (H5) <400> 27 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Lys His Asn Gly Lys Leu Cys 35 40 <210> 28 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/mallard/Alberta/24/01 (H7) <400> 28 Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ala Asn Gly Thr Lys Val 1 5 10 15 Asn Thr Leu Thr Glu Lys Gly Ile Glu Val Val Asn Ala Thr Glu Thr 20 25 30 Val Glu Thr Val Asn Ile Lys Lys Ile Cys 35 40 <210> 29 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/Hong Kong/1/1968 (H3) <400> 29 Cys Ile Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys 1 5 10 15 Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Lys Tyr 20 25 30 Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro 35 40 45 Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 50 55 60 Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln 65 70 75 80 Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala 85 90 95 Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly 115 120 125 Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu 130 135 140 Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr 145 150 155 160 Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg 165 170 175 Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys 180 185 190 Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Glu Ser Ile Arg Asn Gly 195 200 205 Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe 210 215 220 Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu 225 230 235 240 Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu 245 250 255 Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile 260 265 270 Cys Ile <210> 30 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/Perth/16/2009 (H3) <400> 30 Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys 1 5 10 15 Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr 20 25 30 Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro 35 40 45 Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 50 55 60 Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln 65 70 75 80 Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala 85 90 95 Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Gly Lys Thr 100 105 110 Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly 115 120 125 Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu 130 135 140 Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr 145 150 155 160 Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Lys 165 170 175 Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys 180 185 190 Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly 195 200 205 Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe 210 215 220 Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu 225 230 235 240 Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu 245 250 255 Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile 260 265 270 Cys Ile <210> 31 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/PR/8/34 (H1) <400> 31 Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Ile Asn Ser Ser Leu 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr 20 25 30 Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Thr Pro 35 40 45 Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 50 55 60 Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln 65 70 75 80 Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn 85 90 95 Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Thr Val Ile Glu Lys Met 100 105 110 Asn Ile Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Lys 115 120 125 Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile 130 135 140 Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr 145 150 155 160 Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys 165 170 175 Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu 180 185 190 Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly 195 200 205 Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu 210 215 220 Lys Val Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Ile Tyr Gln Ile Leu 225 230 235 240 Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu 245 250 255 Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg 260 265 270 Ile Cys Ile 275 <210> 32 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/Cal/4/09 (H1) <400> 32 Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr Ser Leu 1 5 10 15 Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro Lys Tyr 20 25 30 Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro 35 40 45 Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 50 55 60 Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln 65 70 75 80 Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn 85 90 95 Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met 100 105 110 Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys 115 120 125 Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile 130 135 140 Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr 145 150 155 160 Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg 165 170 175 Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu 180 185 190 Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly 195 200 205 Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu 210 215 220 Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu 225 230 235 240 Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu 245 250 255 Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg 260 265 270 Ile Cys Ile 275 <210> 33 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/Viet Nam/1203/04 (H5) <400> 33 Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met 1 5 10 15 Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr 20 25 30 Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro 35 40 45 Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu 50 55 60 Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser 65 70 75 80 Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys 85 90 95 Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met 100 105 110 Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg 115 120 125 Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val 130 135 140 Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr 145 150 155 160 Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg 165 170 175 Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu 180 185 190 Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly 195 200 205 Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu 210 215 220 Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Ile Tyr Gln Ile Leu 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val 245 250 255 Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg 260 265 270 Ile Cys Ile 275 <210> 34 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal sequence of hemagglutinin protein of A/mallard/Alberta/24/01 (H7) <400> 34 Cys Glu Gly Asp Cys Phe His Ser Gly Gly Thr Ile Val Ser Ser Leu 1 5 10 15 Pro Phe Gln Asn Ile Asn Pro Arg Thr Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr 20 25 30 Val Lys Gln Thr Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro 35 40 45 Glu Asn Pro Lys Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 50 55 60 Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His 65 70 75 80 Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln 85 90 95 Ser Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Asp Lys 100 105 110 Thr Asn Gln Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn Glu Phe Ser Glu Ile Glu 115 120 125 Gln Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu 130 135 140 Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His 145 150 155 160 Thr Ile Asp Leu Ala Asn Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val 165 170 175 Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys Phe 180 185 190 Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Ser Ile Arg Asn 195 200 205 Asn Thr Tyr Asp His Thr Gln Tyr Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asn Arg 210 215 220 Ile Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Ile Ile 225 230 235 240 Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Ile Leu Leu Ala Ile Ala 245 250 255 Met Gly Leu Val Phe Ile Cys Ile Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys Thr 260 265 270 Ile Cys Ile 275 <210> 35 <211> 564 <212> PRT <213> influenza virus A <220> <223> influenza virus A hemagglutinin <400> 35 Met Glu Leu Ile Val Leu Leu Ile Leu Leu Asn Pro Tyr Thr Phe Val 1 5 10 15 Leu Gly Asp Arg Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ala Asn Gln Asn Asn Gln 20 25 30 Thr Val Asn Thr Leu Leu Glu Gln Asn Val Pro Val Thr Gly Ala Gln 35 40 45 Glu Ile Leu Glu Thr Asn His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Asn Gly 50 55 60 Val Pro Pro Leu Asp Leu Gln Ser Cys Thr Leu Ala Gly Trp Leu Leu 65 70 75 80 Gly Asn Pro Asn Cys Asp Ser Leu Leu Glu Ala Glu Glu Trp Ser Tyr 85 90 95 Ile Lys Ile Asn Glu Ser Ala Pro Asp Asp Leu Cys Phe Pro Gly Asn 100 105 110 Phe Glu Asn Leu Gln Asp Leu Leu Leu Glu Met Ser Gly Val Gln Asn 115 120 125 Phe Thr Lys Val Lys Leu Phe Asn Pro Gln Ser Met Thr Gly Val Thr 130 135 140 Thr Asn Asn Val Asp Gln Thr Cys Pro Phe Glu Gly Lys Pro Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Arg Asn Leu Asn Trp Ile Gln Gly Asn Ser Gly Leu Pro Phe Asn 165 170 175 Ile Glu Ile Lys Asn Pro Thr Ser Asn Pro Leu Leu Leu Leu Trp Gly 180 185 190 Ile His Asn Thr Lys Asp Ala Ala Gln Gln Arg Asn Leu Tyr Gly Asn 195 200 205 Asp Tyr Ser Tyr Thr Ile Phe Asn Phe Gly Glu Lys Ser Glu Glu Phe 210 215 220 Arg Pro Glu Ile Gly Gln Arg Asp Glu Val Lys Ala His Gln Asp Arg 225 230 235 240 Ile Asp Tyr Tyr Trp Gly Ser Leu Pro Ala Gln Ser Thr Leu Arg Ile 245 250 255 Glu Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro Glu Tyr Gly Phe Tyr Tyr Lys 260 265 270 Arg Lys Glu Gly Lys Gly Gly Leu Met Lys Ser Lys Leu Pro Ile Ser 275 280 285 Asp Cys Ser Thr Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Ala Leu Asn Ser Thr 290 295 300 Leu Pro Phe Gln Asn Val His Gln Gln Thr Ile Gly Asn Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ala Thr Ser Leu Met Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Asn 325 330 335 Pro Gln Met Glu Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 340 345 350 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 355 360 365 Glu Asn Gln Glu Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ala Thr Gln 370 375 380 Lys Ala Val Asp Ala Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 385 390 395 400 Met Asn Ser Gln Phe Glu Ser Asn Ile Lys Glu Phe Asn Arg Leu Glu 405 410 415 Leu Arg Ile Gln His Leu Ser Asp Arg Val Asp Asp Ala Leu Leu Asp 420 425 430 Ile Trp Ser Tyr Asn Thr Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg 435 440 445 Thr Leu Asp Phe His Asp Ala Asn Val Lys Asn Leu Phe Glu Lys Val 450 455 460 Lys Ala Gln Leu Lys Asp Asn Ala Ile Asp Glu Gly Asn Gly Cys Phe 465 470 475 480 Leu Leu Leu His Lys Cys Asn Asn Ser Cys Met Asp Asp Ile Lys Asn 485 490 495 Gly Thr Tyr Lys Tyr Met Asp Tyr Arg Glu Glu Ser His Ile Glu Lys 500 505 510 Gln Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Thr Asp Tyr Ser Arg Tyr Tyr Ile 515 520 525 Met Thr Leu Tyr Ser Thr Ile Ala Ser Ser Val Val Leu Gly Ser Leu 530 535 540 Ile Ile Ala Ala Phe Leu Trp Gly Cys Gln Lys Gly Ser Ile Gln Cys 545 550 555 560 Lys Ile Cys Ile

Claims (65)

  1. 인플루엔자 바이러스 A/캘리포니아/4/2009(H1N1)로부터의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    H5 하위유형이 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)인 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  3. 인플루엔자 바이러스 A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) 또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)로부터의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  4. 제 3 항에 있어서,
    H5 하위유형이 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)인 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  5. 인플루엔자 바이러스 A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) 또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)로부터의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 H7 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  6. 제 5 항에 있어서,
    H7 하위유형이 인플루엔자 바이러스 A/네덜란드/219/03(H7), A/캐나다/504/04(H7), A/캐나다/444/04(H7), A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7), A/청둥오리/알버타/24/2001(H7), A/레아/NC/39482/93(H7) 또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)인 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  7. 인플루엔자 바이러스 B/말레이시아/2506/2004, B/플로리다/4/2006, B/위스콘신/1/2010 또는 B/브리즈번/60/2008로부터의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 H5 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  8. 제 7 항에 있어서,
    H5 하위유형이 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)인 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  9. 인플루엔자 바이러스 B/말레이시아/2506/2004, B/플로리다/4/2006, B/위스콘신/1/2010 또는 B/브리즈번/60/2008로부터의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 H7 하위유형의 인플루엔자 바이러스로부터의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    H7 하위유형이 인플루엔자 바이러스 A/네덜란드/219/03(H7), A/캐나다/504/04(H7), A/캐나다/444/04(H7), A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7), A/청둥오리/알버타/24/2001(H7), A/레아/NC/39482/93(H7) 또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)인 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  11. 인플루엔자 바이러스 B/말레이시아/2506/2004, B/플로리다/4/2006, B/위스콘신/1/2010 또는 B/브리즈번/60/2008로부터의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 인플루엔자 B형 바이러스의 상이한 균주로부터의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  12. 제 11 항에 있어서,
    인플루엔자 B형 바이러스의 상이한 균주가 B/리(Lee)/1940 또는 B/바다표범/네덜란드/1/99인 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  14. 제 13 항에 따른 핵산을 발현하는 세포.
  15. 제 13 항에 따른 핵산을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 바이러스.
  16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스.
  17. 제 15 항에 있어서,
    인플루엔자 바이러스, 소낭 체세포 바이러스(VSV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스인 바이러스.
  18. 제 16 항에 있어서,
    인플루엔자 바이러스, VSV, NDV, 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스인 바이러스.
  19. 제 17 항에 있어서,
    불활성화되거나 분할된 바이러스.
  20. 제 18 항에 있어서,
    불활성화되거나 분할된 바이러스.
  21. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스-유사 입자.
  22. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물.
  23. 제 15 항에 따른 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  24. 제 16 항에 따른 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  25. 제 17 항에 따른 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  26. 제 18 항에 따른 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  27. 제 21 항에 따른 바이러스-유사 입자를 포함하는 면역원성 조성물.
  28. (i) 인플루엔자 바이러스 A/캘리포니아/4/2009(H1N1)의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는, 제 1 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드; 및
    (ii) (a) 인플루엔자 바이러스 A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) 또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)의 HA의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는, 제 2 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  29. (i) 인플루엔자 바이러스 A/캘리포니아/4/2009(H1N1)의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는, 제 1 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드; 및
    (ii) (a) 인플루엔자 바이러스 A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) 또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)의 HA의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 B/말레이시아/2506/2004의 HA의 구상 헤드 도메인 및 인플루엔자 바이러스 A/네덜란드/219/03(H7), A/캐나다/504/04(H7), A/캐나다/444/04(H7), A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7), A/청둥오리/알버타/24/2001(H7), A/레아/NC/39482/93(H7) 또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는, 제 2 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    (a) 인플루엔자 바이러스 B/말레이시아/2506/2004, B/플로리다/4/2006, B/위스콘신/1/2010 또는 B/브리즈번/60/2008의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5), A/큰고니/몽골/244/2005(H5), B/리/1940 또는 B/바다표범/네덜란드/1/99의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 제 3 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  31. (i) 인플루엔자 바이러스 A/캘리포니아/4/2009(H1N1)의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 제 1 핵산을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 제 1 바이러스; 및
    (ii) (a) 인플루엔자 바이러스 A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) 또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)의 HA의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 핵산을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 제 2 바이러스
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  32. (i) 인플루엔자 바이러스 A/캘리포니아/4/2009(H1N1)의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 제 1 핵산을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 제 1 바이러스; 및
    (ii) (a) 인플루엔자 바이러스 A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) 또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)의 HA의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 B/말레이시아/2506/2004의 HA의 구상 헤드 도메인 및 인플루엔자 바이러스 A/네덜란드/219/03(H7), A/캐나다/504/04(H7), A/캐나다/444/04(H7), A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7), A/청둥오리/알버타/24/2001(H7), A/레아/NC/39482/93(H7) 또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 핵산을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 제 2 바이러스
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,
    (a) 인플루엔자 바이러스 B/말레이시아/2506/2004, B/플로리다/4/2006, B/위스콘신/1/2010 또는 B/브리즈번/60/2008의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5), A/큰고니/몽골/244/2005(H5), B/리/1940 또는 B/바다표범/네덜란드/1/99의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 암호화하는 제 3 핵산을 발현하도록 조작된 게놈을 포함하는 제 3 바이러스를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  34. (i) 인플루엔자 바이러스 A/캘리포니아/4/2009(H1N1)의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 제 1 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 제 1 바이러스; 및
    (ii) (a) 인플루엔자 바이러스 A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) 또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)의 HA의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 제 2 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 제 2 바이러스
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  35. (i) 인플루엔자 바이러스 A/캘리포니아/4/2009(H1N1)의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인 및 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5) 또는 A/큰고니/몽골/244/2005(H5)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 제 1 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 제 1 바이러스; 및
    (ii) (a) 인플루엔자 바이러스 A/빅토리아/361/2011(H3N2), A/참물범/매사추세츠/1/2011(H3N8) 또는 A/인디애나/10/2011(H3N2)의 HA의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 A/네덜란드/219/03(H7), A/캐나다/504/04(H7), A/캐나다/444/04(H7), A/닭/할리스코/CPA1/2012(H7), A/청둥오리/알버타/24/2001(H7), A/레아/NC/39482/93(H7) 또는 A/청둥오리/네덜란드/12/2000(H7)의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 제 2 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 제 2 바이러스
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서,
    (a) 인플루엔자 바이러스 B/말레이시아/2506/2004, B/플로리다/4/2006, B/위스콘신/1/2010 또는 B/브리즈번/60/2008의 헤마글루티닌(HA)의 줄기 도메인; 및 (b) 인플루엔자 바이러스 A/베트남/1203/2004(H5), A/인도네시아/5/2005(H5), A/안후이/1/2005(H5), A/인도기러기/큉하이/1A/2005(H5), A/칠면조/터키/1/2005(H5), A/큰고니/몽골/244/2005(H5), B/리/1940 또는 B/바다표범/네덜란드/1/99의 HA의 구상 헤드 도메인을 포함하는 제 3 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드를 포함하는 제 3 바이러스를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  37. 제 31 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원성 조성물 중의 각각의 바이러스가 인플루엔자 바이러스, VSV, NDV 또는 아데노바이러스인 면역원성 조성물.
  38. 제 31 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원성 조성물 중의 각각의 바이러스가 불활성화되거나 분할된 면역원성 조성물.
  39. 제 37 항에 있어서,
    각각의 인플루엔자 바이러스가 불활성화되거나 분할된 면역원성 조성물.
  40. 유효량의 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법.
  41. 제 1 용량의 유효량의 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 대상에게 투여하고, 상기 대상이 상기 제 1 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 2 용량의 유효량의 상기 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    대상이 제 2 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 3 용량의 유효량의 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  43. 제 1 용량의 유효량의 제 1 면역원성 조성물을 대상에게 투여하고, 상기 대상이 상기 제 1 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 2 용량의 유효량의 제 2 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법으로서, 상기 면역원성 조성물이 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물이고, 상기 제 1 면역원성 조성물 중에 존재하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인이 상기 제 2 면역원성 조성물 중에 존재하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인과 다른 방법.
  44. 유효량의 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하는 방법.
  45. 유효량의 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 질병을 치료하는 방법.
  46. 제 40 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상이 인간인 방법.
  47. 제 41 항 또는 제 43 항에 있어서,
    대상이 1 내지 5세의 인간 대상인 방법.
  48. 제 41 항 또는 제 43 항에 있어서,
    대상이 노령의 인간 대상인 방법.
  49. 제 40 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역원성 조성물을 대상에게 근육내 또는 비내로 투여하는 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가용성인 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  51. 제 50 항에 있어서,
    삼량체화 도메인을 포함하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드.
  52. 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  53. 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 용량의 유효량의 면역원성 조성물을 대상에게 투여하고, 상기 대상이 상기 제 1 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 2 용량의 유효량의 상기 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  54. 제 53 항에 있어서,
    방법이 대상이 제 2 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 3 용량의 유효량의 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  55. 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 용량의 유효량의 제 1 면역원성 조성물을 대상에게 투여하고, 상기 대상이 상기 제 1 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 2 용량의 유효량의 제 2 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법으로서, 상기 제 1 면역원성 조성물 중에 존재하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인이 상기 제 2 면역원성 조성물 중에 존재하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인과 다른 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  56. 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하는 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  57. 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상에서 인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
  58. 제 52 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상이 인간인 면역원성 조성물.
  59. 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
  60. 제 1 용량의 유효량의 면역원성 조성물을 대상에게 투여하고, 상기 대상이 상기 제 1 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 2 용량의 유효량의 상기 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
  61. 제 60 항에 있어서,
    방법이 대상이 제 2 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 3 용량의 유효량의 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 추가로 포함하는 용도.
  62. 제 1 용량의 유효량의 제 1 면역원성 조성물을 대상에게 투여하고, 상기 대상이 상기 제 1 용량을 수용한지 30일 내지 6개월 후에 제 2 용량의 유효량의 제 2 면역원성 조성물을 상기 대상에게 투여함을 포함하는, 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역시키는 방법으로서, 상기 제 1 면역원성 조성물 중에 존재하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인이 상기 제 2 면역원성 조성물 중에 존재하는 키메릭 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 폴리펩타이드의 구상 헤드 도메인과 다른 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
  63. 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병을 예방하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
  64. 대상에서 인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 제 22 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물의 용도.
  65. 제 59 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상이 인간인 면역원성 조성물의 용도.
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