ES2326705T3 - Produccion de enzimas lisosomicas en sistemas de expresion basados en plantas. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A LA PRODUCCION DE ENZIMAS LISOSOMALES RECOMBINANTES HUMANOS Y ANIMALES ENZIMATICAMENTE ACTIVOS QUE IMPLICA LA CONSTRUCCION Y EXPRESION DE ESTRUCTURAS RECOMBINANTES DE EXPRESION QUE COMPRENDEN SECUENCIAS CODIFICANTES DE ENZIMAS LISOSOMALES HUMANOS O ANIMALES EN UN SISTEMA DE EXPRESION VEGETAL. EL SISTEMA DE EXPRESION VEGETAL PROPORCIONA LA MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL Y EL PROCESADO PRODUCIENDO UN PRODUCTO GENICO RECOMBINANTE QUE MUESTRA ACTIVIDAD ENZIMATICA. LA INVENCION SE DEMUESTRA MEDIANTE EJEMPLOS DE TRABAJO EN LOS QUE PLANTAS DE TABACO TRANSGENICAS QUE TIENEN ESTRUCTURAS RECOMBINANTES DE EXPRESION QUE COMPRENDEN SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS DE LA HCG Y IDUA HUMANAS PRODUCEN GLUCOCEREBROSIDASA HUMANA Y AL - L - IDURONIDASA HUMANA MODIFICADAS, ENZIMATICAMENTE ACTIVAS. LOS ENZIMAS LISOSOMALES RECOMBINANTES PRODUCIDOS SEGUN LA INVENCION PUEDEN UTILIZARSE PARA VARIOS FINES, INCLUYENDO PERO SIN ESTAR LIMITADO A, LA TERAPIA DE SUSTITUCION DE ENZIMAS PARA EL TRATAMIENTODE ENFERMEDADES DE ALMACENAMIENTO LISOSOMAL HUMANAS Y ANIMALES.
Description
Producción de enzimas lisosómicas en sistemas de
expresión basados en plantas.
La presente invención se refiere a la producción
de enzimas lisosómicas humanas y animales en plantas que comprenden
expresar la secuencia codificante genética de una enzima lisosómica
humana o animal en un sistema de expresión en plantas. El sistema
de expresión en plantas proporciona la modificación
pos-traduccional y el procesamiento para producir
proteína recombinante que tiene actividad enzimática.
La invención se demuestra en este documento
mediante ejemplos de trabajo en los que plantas de tabaco
transgénicas producen una glucocerebrosidasa humana modificada
(hGC) y una \alpha-L-iduronidasa
humana (IDUA), que son ambas enzimáticamente activas.
Las enzimas lisosómicas recombinantes producidas
según la invención pueden usarse para una variedad de fines que
incluyen, pero no se limitan a, terapia de sustitución de enzimas
para el tratamiento terapéutico de enfermedades de almacenamiento
lisosómico, investigación para el desarrollo de nuevas
aproximaciones al tratamiento médico de enfermedades de
almacenamiento lisosómico y procedimientos industriales que implican
la hidrólisis de sustratos enzimáticos.
Los lisosomas, que están presentes en todas las
células animales, son orgánulos citoplásmicos ácidos que contienen
una colección de enzimas hidrolíticas. Estas enzimas funcionan en la
degradación de sustratos macromoleculares interiorizados y
endógenos. Cuando hay una deficiencia de enzima lisosómica, los
sustratos sin degradar del enzima deficiente se acumulan
gradualmente dentro de los lisosomas provocando un aumento
progresivo en el tamaño y el número de estos orgánulos dentro de la
célula. Esta acumulación dentro de la célula conduce finalmente a
la disfunción del órgano y a la patología macroscópica de una
enfermedad de almacenamiento lisosómico, dependiendo la enfermedad
particular de la deficiencia de enzima particular. Se han
caracterizado más de treinta enfermedades de almacenamiento
lisosómico hereditarias distintas en seres humanos.
Algunos ejemplos de enfermedades de
almacenamiento lisosómico (y sus enzimas deficientes asociadas)
incluyen enfermedad de Fabry
(\alpha-galactosidasa), enfermedad de Farber
(ceramidasa), enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa),
gangliosidosis G_{ml} (\beta-galactosidasa),
enfermedad de Tay-Sachs
(\beta-hexosaminidasa), enfermedad de
Niemann-Pick (esfingomielinasa), enfermedad de
Schindler
(\alpha-N-acetilgalactosaminidasa),
síndrome de Hunter
(iduronato-2-sulfatasa), síndrome de
Sly (\beta-glucuronidasa), síndromes de Hurler y
Hurler/Scheie (iduronidasa) y síndrome de
células-I/San Filipo (transportador de
manosa-6-fosfato).
Un tratamiento probado para enfermedades de
almacenamiento lisosómico es la terapia de sustitución de enzimas
en la que una forma activa de la enzima se administra directamente
al paciente. Sin embargo, aportes abundantes, económicos y seguros
de enzimas lisosómicas terapéuticas no están comercialmente
disponibles para el tratamiento de ninguna de las enfermedades de
almacenamiento lisosómico.
La enfermedad de Gaucher es la enfermedad de
almacenamiento lisosómico más común en seres humanos, encontrándose
la mayor frecuencia en la población judía Ashkenazi. Aproximadamente
de 5.000 a 10.000 personas en los Estados Unidos están aquejados
por esta enfermedad (Grabowski, 1993, Adv. Hum. Genet.
21:377-441). La enfermedad de Gaucher resulta de
una deficiencia de glucocerebrosidasa (hGC; glucosilceramidasa;
\beta-glucosidasa ácida; EC 3.2.1.45). Esta
deficiencia conduce a una acumulación del sustrato enzimático,
glucocerebrósido, en células reticuloendoteliales de la médula
ósea, el bazo y el hígado, dando como resultado complicaciones
esqueléticas significativas tales como expansión de la médula ósea
y deterioro óseo, y también hiperesplenismo, hepatomegalia,
trombocitopenia, anemia y complicaciones pulmonares (Grabowski,
1993, supra; Lee, 1982, Prog. Clin. Biol. Res.
95:177-217; Brady y col., 1965, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 18:221-225).
La terapia de sustitución de hGC ha
revolucionado el tratamiento y la atención médica de la enfermedad
de Gaucher, llevando a una mejora significativa en la calidad de
vida de muchos pacientes con enfermedad de Gaucher (Pastores y
col., 1993, Blood 82:408-416; Fallet y col., 1992,
Pediatr. Res. 31:496-502). Los estudios han
mostrado que la administración intravenosa regular de hGC modificada
específicamente (Ceredase^{TM}, Genzyme Corp.) puede dar como
resultado mejoras espectaculares e incluso inversiones en las
manifestaciones hepáticas, esplénicas y hematológicas de la
enfermedad (Pastores y col., 1993, supra; Fallet y col.,
1992, supra; Figueroa y col. 1992, N. Eng. J. Med.
327:1632-1636; Barton y col., 1991, N. Eng. J. Med.
324:1464-1470; Beutler y col., 1991, Blood
78:1183-1189). Las mejoras en las complicaciones
esqueléticas y pulmonares asociadas son posibles, pero requieren
dosis mayores de enzima durante periodos de tiempo más largos.
A pesar de los beneficios de la terapia de
sustitución de hGC, la fuente y el alto coste de la enzima limitan
seriamente su disponibilidad. Hasta recientemente, la única fuente
comercial de hGC purificada ha sido la recogida de placentas
humanas, mediante la cual diez a veinte kilogramos (kg) de placentas
proporcionan sólo 1 miligramo (mg) de enzima. Se requieren de
quinientos a dos mil kilogramos de placenta (equivalente a
2.000-8.000 placentas) para tratar a cada paciente
cada dos semanas. Los costes actuales para la terapia de sustitución
de HGC oscilan desde 55 \textdollar hasta 220 \textdollar/kg de
peso corporal del paciente cada dos semanas, o desde 70.000
\textdollar hasta 300.000 \textdollar/año para un paciente de
50 kg. Debido a que la necesidad de terapia dura esencialmente
durante la duración de la vida de un paciente, los costes de la
enzima sola pueden superar 15.000.000 \textdollar durante 30 a 70
años de terapia.
Un segundo problema importante asociado al
tratamiento de pacientes con enfermedad de Gaucher con
glucocerebrosidasa aislada de tejido humano (y quizá incluso de
otros tejidos animales) es el riesgo de exponer a los pacientes a
agentes infecciosos que pueden estar presentes en las placentas
reunidas, por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH),
virus de la hepatitis, y otros.
Por consiguiente, se necesita una nueva fuente
de hGC para reducir eficazmente el coste del tratamiento y para
eliminar el riesgo de exponer a los pacientes con enfermedad de
Gaucher a agentes infecciosos.
El síndrome de Hurler es el más común del grupo
de trastornos de almacenamiento lisosómico humano conocidos como
las mucopolisacaridosis (MPS) que implican una incapacidad para
degradar sulfato de dermatano y sulfato de heparano. Los pacientes
con enfermedad de Hurler son deficientes en la enzima lisosómica
\alpha-L-iduronidasa (IDUA) y la
acumulación resultante de glucosaminoglucanos en los lisosomas de
células afectadas conduce a una variedad de manifestaciones
clínicas (Neufeld & Ashwell, 1980, The Biochemistry of
Glycoproteins and Proteoglycans, ed. W.J. Lennarz, Plenum
Press, NY; págs. 241-266) que incluyen retraso en el
desarrollo, aumento de tamaño del hígado y el bazo, anomalías
esqueléticas, retraso mental, rasgos faciales toscos, opacidad
corneal y afectación respiratoria y cardiovascular. El síndrome de
Hurler/Scheie (MPS I H/S) y el síndrome de Scheie (MPS IS)
representan formas menos graves del trastorno, pero también
implican deficiencias de IDUA. Los estudios moleculares en los
genes y ADNc de pacientes con MPS I han llevado a una comprensión
emergente del genotipo y el fenotipo clínico (Scott y col., 1990,
Am. J. Hum. Genet. 47:802-807). Además, se han
caracterizado tanto una forma canina como una felina de MPS I
(Haskins y col., 1979, Pediat. Res. 13:1294-1297;
Haskins y Kakkis, 1995, Am. J. Hum. Genet. 57:A39 Abstr. 194; Shull
y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
91:12937-12941) proporcionando un modelo in
vivo eficaz para probar las aproximaciones terapéuticas.
Recientemente se informó de la eficacia de la
sustitución de enzimas en el modelo canino de síndrome de Hurler
usando IDUA humana generada en células CHO (Kakkis y col., 1995, Am.
J. Hum. Genet. 57:A39 (Abstr.); Shull y col., 1994, supra).
Dosis semanales de aproximadamente 1 mg administradas durante un
periodo de 3 meses dieron como resultado niveles normales de la
enzima en el hígado y el bazo, niveles más bajos, pero
significativos, en el riñón y los pulmones y niveles muy bajos en
el cerebro, corazón, cartílago y córnea (Shull y col., 1994,
supra). Los exámenes de tejido mostraron la normalización del
almacenamiento lisosómico en el hígado, el bazo y el riñón, pero no
mostraron mejoras en el corazón, el cerebro y los tejidos de la
córnea. Un perro se mantuvo en tratamiento durante 13 meses y
estaba claramente más activo con mejora en las deformidades
esqueléticas, rigidez articular, opacidad corneal y aumento de peso
(Kakkis y col., 1995, supra. Un experimento de una única
dosis mayor fue bastante prometedor y mostró actividad de IDUA
detectable en el cerebro y el cartílago, además de en tejidos que
previamente mostraron actividad a la dosis más baja. Los
experimentos y ensayos de dosis mayores adicionales que implicaban
una administración más larga están actualmente limitados por la
disponibilidad de enzima recombinante. Estos experimentos subrayan
el potencial de la terapia de sustitución para pacientes con
enfermedad de Hurler y las graves restricciones tanto en ensayos
caninos como humanos debidas a las limitaciones en la producción de
enzima recombinante usando las tecnologías actuales.
Las enzimas lisosómicas solubles comparten
etapas iniciales de biosíntesis con las proteínas secretoras, es
decir, la síntesis en el ribosoma, la unión del péptido señal
N-terminal a la superficie del retículo endoplásmico
rugoso (ER), el transporte al lumen del ER en el que se escinde el
péptido señal y la adición de oligosacáridos a residuos de
asparagina específicos (N-ligados), seguido por
modificaciones adicionales de la proteína naciente en el aparato de
Golgi (von Figura y Hasilik, 1986, Annu. Rev. Biochem.
55:167-193). Los oligosacáridos
N-ligados pueden ser complejos, variados y
heterogéneos, y pueden contener residuos con alto contenido de
manosa. Las proteínas se someten a procesamiento adicional en un
compartimento post-ER pre-Golgi y en
el cis-Golgi para formar o una señal de reconocimiento
dependiente del oligosacárido
manosa-6-fosfato
(M-6-P) N-ligado o
independiente del oligosacárido
M-6-P N-ligado para
enzimas localizadas en el lisosoma (Kornfeld & Mellman, 1989,
Ann. Rev. Cell Biol., 5:483-525; Kaplan y col.,
1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:2026). La presencia de la señal
de reconocimiento de M-6-P da como
resultado la unión de la enzima a receptores de
M-6-P (MPR). Estas enzimas unidas
permanecen en la célula, se empaquetan finalmente en lisosomas y,
por tanto, se segregan desde proteínas dirigidas a a secreción o a
la membrana plasmática.
Aunque muchas enzimas lisosómicas son solubles y
son transportadas a lisosomas por MPRs, las proteínas integrales de
membrana y las asociadas a la membrana (en particular hGC) son
dirigidas y transportadas a lisosomas independientes del sistema
M-6-P/MPR (Kornfeld & Mellman,
1989, Erickson y col., 1985). La hGC no se vuelve soluble después
de la traducción, pero en su lugar se asocia a la membrana
lisosómica por medios que no se han dilucidado (von Figura &
Hasilik, 1986, Annu. Rev. Biochem. 55:167-193;
Kornfeld y Mellman, 1989, Annu. Rev. Cell Biol.
5:483-525).
La hGC se sintetiza como un único polipéptido
(58 kDa) con una secuencia señal (2 kDa) en el extremo amino. La
secuencia señal se escinde cotraduccionalmente y la enzima se
glicosila con un grupo heterogéneo de oligosacáridos tanto
complejos como con alto contenido de manosa para formar un
precursor. Los glicanos participan predominantemente en la
conformación de proteínas. El precursor "con alto contenido de
manosa", que tiene una masa molecular de 63 KDa, se procesa
postraduccionalmente en el Golgi para dar un producto intermedio de
66 KDa, que entonces se modifica adicionalmente en el lisosoma para
dar la enzima madura que tiene una masa molecular de 59 Kda
(Jonsson y col., 1987, Eur. J. Biochem. 164:171; Erickson y col.,
1985, J. Biol. Chem., 260:14319).
El polipéptido de hGC maduro está compuesto por
497 aminoácidos y contiene cinco secuencias consenso de aminoácidos
de N-glicosilación
(Asn-X-Ser/Thr). Cuatro de estos
sitios están normalmente glicosilados. La glicosilación del primer
sitio es esencial para la producción de proteína activa. Se han
identificado cadenas de oligosacárido tanto con alto contenido de
manosa como complejas (Berg-Fussman y col., 1993, J.
Biol. Chem. 268:14861-14866). La hGC de placenta
contiene 7% de carbohidrato, 20% del cual es del tipo con alto
contenido de manosa (Grace & Grabowski, 1990, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 168:771-777). El tratamiento de hGC
placentaria con neuraminidasa (dando una
asialo-enzima) da como resultado un aumento de las
velocidades de eliminación y captación por células hepáticas de
rata con un aumento concomitante en la actividad enzimática hepática
(Furbish y col., 1981, Biochim. Biophys. Acta
673:425-434). Esta hGC placentaria modificada con
glicano se usa actualmente como un agente terapéutico en el
tratamiento de la enfermedad de Gaucher. Los estudios bioquímicos y
de mutagénesis dirigida han proporcionado un mapa inicial de
regiones y residuos importantes para el plegamiento, la interacción
con el activador y la localización del sitio activo (Grace y col.,
1994, J. Biol. Chem. 269:2283-2291).
Se ha publicado la secuencia completa de ADN
complementario (ADNc) para hGC (Tsuji y col., 1986, J. Biol. Chem.
261:50-53; Sorge y col., 1985, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:7289-7293), y E. coli que
contiene la secuencia de ADNc de hGC clonada a partir de células de
fibroblasto, como se describe (Sorge y col.,1985, supra),
está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC)
(nº de acceso 65696).
Las metodologías recombinantes tienen el
potencial de proporcionar una fuente más segura y menos cara de
enzimas lisosómicas para la terapia de sustitución. Sin embargo, la
producción de enzimas activas, por ejemplo hGC, en un sistema
heterólogo requiere el correcto direccionamiento al ER, y la
glicosilación N-ligada apropiada a niveles o
rendimientos que eviten la degradación basada en ER o la agregación.
Debido a que las enzimas lisosómicas maduras deben glicosilarse
para ser activas, los sistemas bacterianos no pueden usarse. Por
ejemplo, la hGC expresada en E. coli es enzimáticamente
inactiva (Grace & Grabowski, 1990, supra).
Los monómeros activos de hGC se han purificado a
partir de células de insecto (células Sf9) y células de
ovario de hámster chino (CHO) infectadas o transfectadas,
respectivamente, con ADNc de hGC (Grace & Grabowski, 1990,
supra; Grabowski y col., 1989, Enzyme
41:131-142). Recientemente se desveló un
procedimiento para producir hGC recombinante en cultivos de células
CHO y en cultivos de células de insecto en la patente de EE.UU. nº
5.236.838. La hGC recombinante producida en estos sistemas
heterólogos tenía una masa molecular aparente que oscilaba desde 64
hasta 73 kDa y contenía del 5 al 15% de carbohidrato (Grace &
Grabowski, 1990, supra; Grace y col., 1990, J. Biol. Chem.
265:6827-6835). Estas hGC recombinantes tenían
propiedades cinéticas idénticas a la enzima natural aislada de
placentas humanas, basándose en análisis que usan una serie de
análogos del sustrato y del estado de transición, activadores
lipídicos cargados negativamente, activadores proteicos (saposina
C) e inhibidores covalentes basados en el mecanismo (Grace y
col., 1994, supra; Berg-Fussman y
col., 1993, supra; Grace y col., 1990, J. Biol. Chem.
265:6827-6835; Grabowski y col., 1989,
supra). Sin embargo, tanto las células de insecto como las
células CHO conservaron la mayoría de la enzima en vez de
secretarla al medio, aumentando significativamente la dificultad y
el coste de recoger la enzima pura (Grabowski y col., 1989,
supra).
Por consiguiente, se necesita un sistema
recombinante que pueda producir enzimas lisosómicas humanas o
animales en una forma activa a menor coste y que serán
apropiadamente dirigidas para facilitar la recuperación.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a que las plantas son eucariotas, los
sistemas de expresión en plantas tienen ventajas respecto a los
sistemas de expresión procariotas, particularmente con respecto al
correcto procesamiento de productos génicos eucariotas. Sin
embargo, a diferencia de las células animales, las células de
plantas no poseen lisosomas. Aunque la vacuola de la planta parezca
funcionalmente análoga al lisosoma, las plantas no contienen MPRs
(Chrispeels, 1991, Ann. Rev. Pl. Phys. Pl. Mol. Biol.
42:21-53; Chrispeels y Tague, 1991, Intl. Rev.
Cytol. 125:1-45) y los mecanismos de
direccionamiento a las vacuolas pueden diferir significativamente de
los de direccionamiento a lisosomas. Por ejemplo, el mecanismo
predominante del direccionamiento a vacuolas en plantas no parece
ser dependiente de glicanos, pero en su lugar parece que se basa en
secuencias peptídicas C- o N-terminales (Gomez
& Chrispeels, 1993, Plant Cell 5:1113-1124;
Chrispeels & Raikhal, 1992, Cell 68:613-618;
Holwerda y col., 1992, Plant Cell 4:307-318;
Neuhaus y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:10362-10366; Chrispeels, 1991, supra;
Chrispeels & Tague, 1991, supra; Holwerda y col., 1990,
Plant Cell 2:1091-1106; Voelker y col., 1989, Plant
Cell 1:95-104). Como resultado, las plantas no se
han considerado como sistemas de expresión apropiados para enzimas
lisosómicas que deben procesarse apropiadamente para producir un
producto activo.
La presente invención se refiere a la producción
de enzimas lisosómicas humanas o animales en plantas, células de
plantas o tejidos de plantas transformados o transfectados, e
implica construir y expresar constructos de expresión recombinantes
que comprenden secuencias codificantes de enzimas lisosómicas en un
sistema de expresión en plantas. El sistema de expresión en plantas
proporciona modificaciones cotraduccionales y postraduccionales
apropiadas del péptido naciente requeridas para el procesamiento,
por ejemplo, escisión de la secuencia señal, glicosilación y
clasificación del producto de expresión de manera que se produzca
una proteína enzimáticamente activa. Usando los procedimientos
descritos en este documento, las enzimas lisosómicas recombinantes
se producen en sistemas de expresión en plantas a partir de los
cuales las enzimas lisosómicas recombinantes pueden aislarse y
usarse para una variedad de fines. La presente invención se
ejemplifica mediante la ingeniería genética de plantas de tabaco
transgénicas con tres constructos de expresión de enzimas
lisosómicas. Un constructo comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una glucocerebrosidasa humana (hGC) modificada,
específicamente una hGC fusionada en su extremo C al péptido
FLAG^{TM} de ocho aminoácidos (hGC:FLAG^{TM}). Otro constructo
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una
\alpha-L-iduronidasa humana
(IDUA). El tercer constructo comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica una glucocerebrosidasa humana (hGC). Las plantas de
tabaco transgénicas que tienen los constructos de expresión producen
enzimas lisosómicas que son enzimáticamente activas.
Los sistemas de expresión en plantas y las
enzimas lisosómicas recombinantes producidas con el mismo tienen
una variedad de usos que incluyen, pero no se limitan a: (1) la
producción de enzimas lisosómicas enzimáticamente activas para el
tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico; (2) la
producción de proteínas alteradas o mutadas, enzimáticamente
activas o de otro modo, que sirven de precursores o sustratos para
el procesamiento in vivo o in vitro adicional para
dar una forma industrial especializada para investigación o usos
terapéuticos, tal como para producir una enzima terapéutica más
eficaz; (3) la producción de anticuerpos contra enzimas lisosómicas
para uso en el diagnóstico médico; y (4) uso en cualquier
procedimiento comercial que implique la hidrólisis de
sustratos.
Fig. 1. Constructo de expresión y vector de
transformación de plantas del ADNc de hGC:FLAG^{TM}. El
constructo MeGA:hGC:FLAG^{TM} en un vector intermedio pBS se corta
y se inserta en el sitio SstI del vector de transformación de
plantas binario pBIB-KAN para formar el plásmido
CTPro1:hGC:FLAG. R y L representan los bordes derecho e izquierdo
del ADN-T, respectivamente, que delimitan con
precisión el ADN insertado en el genoma de la planta. NPTII =
marcador de selección de kanamicina, FL = epítopo FLAG^{TM}, pAnos
= señal de poliadenilación/terminación, Pnos = secuencia promotora
del gen nopalina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens. Los
cebadores de amplificación por PCR para hGC fueron: GC1
(5'TTGtcTAGaGTAAGCATCATGGCTGGC3') (SEQ ID NO:1); y GC4
(5'cacgaattCTGGCGACGCCACAGGTAGGTGTGA3') (SEQ ID NO:2); las
secuencias derivadas de hGC están en mayúsculas; los sitios de
restricción están subrayados. Enzimas de restricción: E, EcoRI; S,
SstI; N, NotI; X, XbaI.
Figs. 2A-E. Transformación y
generación de plantas de tabaco que llevan el constructo
MeGA:hGC:FLAG^{TM}. Fig. 2A. Transformación mediada por
Agrobacterium de discos de hojas de tabaco. Los discos de
hojas se inocularon con una suspensión de células de cepas de A.
tumefaciens que llevaban el plásmido CTPro1:hGC:FLAG. Fig. 2B.
Desarrollo de brotes en medio de selección 22 días
pos-inoculación. Fig. 2C. Desarrollo de raíces en
medio de enraizamiento 27 días pos-inoculación. El
uso de medio de enraizamiento que contiene kanamicina diferenció
claramente entre brotes transgénicos que formaron raíces y brotes
"falsos positivos" que no formaron raíces en medio selectivo.
Fig. 2D. Plantas transformadas tres semanas después de transferirlas
a tierra. Fig. 2E. Planta transformada 10 semanas después de
transferirla a tierra.
Fig. 3. Análisis por hibridación genómica de
Southern de plantas control y transgénicas. El ADN genómico total
se aisló de una planta control sin transformar (ST) y de
transformantes independientes generados a partir de Nicotiana
tabacum cv. Xanthi (X-1, X-8,
X-9, X-11) y cv. VA116 (V1).
De cinco a 10 \mug de ADN genómico total se digirieron con
HindIII y se resolvieron en un gel de agarosa en TBE. El ADN se
transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se sondó con una
secuencia de hGC:FLAG^{TM} marcada con ^{32}P de un fragmento
de HindIII de 1,7 kb purificado en gel aislado del vector intermedio
pBS que contenía el constructo de expresión MeGA:hGC:FLAG^{TM}
(véase la Fig. 1).Fig. 4. Inducción de niveles de ARNm de
hGC:FLAG^{TM} en plantas transgénicas. El ARN total se aisló
mediante procedimientos habituales con
guanidino-tiocianato a partir de tejidos de hojas
ST y X-11 a 0 y 24 h después de la activación
mecánica de genes (MGA). Se glioxilaron cinco \mug de ARN total,
se separaron por tamaño en un gel de agarosa al 1,2%, se
transfirieron a filtros NitroPure (MSI) y se sondaron con una
secuencia génica de hGC:FLAG^{TM} marcada con ^{32}P a partir
de un fragmento de HindIII de 1,7 kb purificado en gel aislado del
vector intermedio pBS mostrado en la Fig. 1.
Las Figs. 5A-B. Inducción de la
proteína de fusión hGC:FLAG^{TM} en plantas de tabaco transgénicas
como se detectó por análisis de Western usando anticuerpos
anti-FLAG^{TM} y anticuerpos
anti-hGC. El tejido de hojas de
X-11 se indujo mediante MGA a tiempo 0 a temperatura
ambiente, se recogió a 2, 4, 8, 16 y 24 h y se congeló a -20ºC
antes de la extracción. hGC:FLAG^{TM} se solubilizó moliendo el
tejido en un molinillo de granos de café con nieve carbónica y se
homogeneizó en Triton X-100 al 1%, taurocolato al
1%, citrato de sodio 25 mM pH 7,0,
\beta-mercaptoetanol 4 mM y ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 5 mM, seguido por dos ciclos de
congelación y descongelación del homogeneizado. Se determinaron
tanto la concentración de proteína como la actividad enzimática de
extractos sin células. Fig. 5A. Se analizaron diez \mug de
proteína soluble total mediante inmunotransferencia de Western
usando anticuerpos anti-FLAG^{TM}. Carril 1, 24
ng de proteína de control marcada con FLAG^{TM}; carril 2,
X-11 a tiempo 0; carril 3, X-11 a 2
h; carril 4, X-11 a 4 h; carril 5,
X-11 a 8 h; carril 6, X-11 a 12 h;
carril 7, X-11 a 24 h; carril 8, ST (planta de
control) a 12 h. Fig. 5B. Se analizaron cuarenta \mug de proteína
soluble total mediante inmunotransferencia de Western usando
anticuerpos anti-hGC. Carril 1, ST a tiempo 0;
carril 2, X-11 a tiempo 0; carril 3,
X-11 a 2 h; carril 4, X-11 a 4 h;
carril 5, X-11 a 8 h; carril 6, X-11
a 12 h, carril 7, X-11 a 24 h; carril 8, ST a 8 h.
El nivel máximo de expresión de hGC:FLAG^{TM} se encontró entre
8-12 h pos-MGA.
Fig. 6. Actividad de
\beta-glucosidasa total
(\beta-glucosidasa y hGC de planta endógena)
pos-MGA de tejido de hoja de X-11.
Se ensayó un décimo de \mug de extracto sin células para la
capacidad para convertir el sustrato fluorométrico,
4-metilumbeliferil-D-glucopiranósido
(4MuGlc), en 4MU a 37ºC, como se mide en un fluorómetro (Hoefer
DyNA Quant-200, Hoefer, Pharmacia, Biotech. Inc.)
con excitación a 365 nm y emisión a 460 nm. UF = unidades de
fluorómetro; tiempo = h pos-inducción (es decir,
daño de tejido o MGA).
Figs. 7A-B. Purificación por
afinidad de la proteína de fusión hGC:FLAG^{TM}. Fig. 7A. Gel de
SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie y análisis
por Western de hGC:FLAG^{TM} purificado por afinidad con
FLAG^{TM}. Carril 1, gel de SDS-PAGE teñido con
azul de Coomassie de 0,1 \mug de hGC:FLAG^{TM} purificado por
afinidad con FLAG^{TM}; Carril 2, análisis de Western usando
anticuerpos anti-hGC en 0,1 \mug de
hGC:FLAG^{TM} purificado por afinidad con FLAG^{TM}. Fig. 7B.
Gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie y
análisis de Western de hGC:FLAG^{TM} purificado por afinidad con
ConA. Carril 1, gel de SDS-PAGE teñido con azul de
Coomassie de 10 \mug de hGC:FLAG^{TM} purificado con ConA;
Carril 2, análisis de Western de hGC:FLAG^{TM} purificado con
ConA usando anticuerpos anti-FLAG^{TM}. Estos
resultados indican que la proteína hGC:FLAG^{TM} purificada con
ConA está glicosilada.
Fig. 8 Análisis de Western por
inmunotransferencia por ranuras usando anticuerpos
anti-FLAG^{TM} en fracciones de etapas de
purificación de hGC:FLAG^{TM} usando tejido de planta 12 h
pos-MGA. Carril A, proteína de control marcada con
FLAG^{TM}: ranura 1, 1 ng; ranura 2, 6 ng; ranura 3, 8 ng; ranura
4, 18 ng; ranura 5, 60 ng. Carril B, fracciones del aislamiento de
hGC:FLAG^{TM}: ranura 1, 0,5 \mul/80.000 \mul de proteína
soluble de extracto crudo sin células; ranura 2, 0,5 \mul/80.000
\mul de proteína soluble de sobrenadante de sulfato de amonio
(AS) al 33%; ranura 3, 2,5 \mul/5.000 \mul de proteína soluble
de hGC:FLAG^{TM} purificado por afinidad con ConA. Carril C:
ranura 1, 1 \mul de proteína soluble de extracto crudo de tejido
de planta; ranura 2, 1 \mul de proteína soluble de sobrenadante de
AS al 33%; ranura 3, 5 \mul de proteína soluble de
hGC:FLAG^{TM} purificado por afinidad con ConA.
Fig. 9. Secuencia de nucleótidos del constructo
hGC:FLAG^{TM} (SEQ ID NO:3) que se clonó y se expresó en cepas de
tabaco X-11 y X-27. Las letras
subrayadas en mayúsculas en tres posiciones representan cambios
respecto a la secuencia en GENBANK (secuencia de ADNc del banco
ATCC). Las letras en minúsculas representan adiciones a la
secuencia de hGC, por ejemplo, el epítope FLAG^{TM}.
Fig. 10. Secuencia de aminoácidos deducida de la
proteína de fusión hGC:FLAG^{TM} (SEQ ID NO:4). Las letras
subrayadas en mayúsculas en dos posiciones representan cambios
respecto a la secuencia de aminoácidos de hGC original desvelada
por E. Neufled. Las letras en minúsculas representan adiciones a la
secuencia de aminoácidos de hGC. Por ejemplo, dykddddk = el epítopo
FLAG^{TM}.
Fig. 11. Secuencia de 456 bases que comprenden
el promotor MeGA.
Fig. 12. Estrategia de construcción del vector
de expresión de IDUA. Los constructos MeGA:IDUA y 35S^{ENH}:IDUA
se insertaron en el sitio HindIII/SacI del vector binario
pBIB-KAN. R y L representan los bordes derecho e
izquierdo de ADN-T que delimitan con precisión el
ADN insertado en el genoma de la planta, NPTII es el marcador de
selección de kanamicina, pAnos es la señal de
poliadenilación/terminación y Pnos un promotor del gen nopalina
sintetasa de Agrobacterium tumefaciens. Los cebadores de PCR
para IDUA fueron: ID1, (5'-CTAGtcta
gaATGCGTCCCCTGCGCCCCCGCG) (SEQ ID NO:6) y ID2, (5'GgaattcgagctcTCATGGATTGCCCGGGGATG) (SEQ ID NO:7); las secuencias de IDUA están escritas en mayúsculas, los sitios de restricción introducidos están subrayados. SP, péptido señal; IDUA, región codificante de IDUA humana; H, HindIII; S, SacI; X, XbaI.
gaATGCGTCCCCTGCGCCCCCGCG) (SEQ ID NO:6) y ID2, (5'GgaattcgagctcTCATGGATTGCCCGGGGATG) (SEQ ID NO:7); las secuencias de IDUA están escritas en mayúsculas, los sitios de restricción introducidos están subrayados. SP, péptido señal; IDUA, región codificante de IDUA humana; H, HindIII; S, SacI; X, XbaI.
Figs. 13A-C. Tabaco transgénico
que expresa el constructo MeGA:IDUA. Fig. 13A. Germinación de
semillas de primera generación en medio selectivo que muestra
segregación de plantas de semillero resistentes y sensibles a
kanamicina. Fig. 13B. Plantas jóvenes que contienen el constructo
MeGA:IDUA (derecha) y plantas parentales sin transformar cultivadas
en paralelo. Fig. 13C. Plantas completamente maduras que expresan
IDUA en el invernadero.
Figs. 14A-B. Inducción del
transgén de IDUA en tejidos de hoja de tabaco. El tejido de hoja de
la planta transgénica IDUA-9 se indujo mediante
escisión en tiras de 1,5 mm y se incubó a temperatura ambiente en
toallas de papel húmedas en una bolsa de plástico cerrada
herméticamente. El tejido se separó para el análisis (se almacenó a
-80ºC para ARN, -20ºC para proteína) a 0, 2, 4, 8, 11 y 27 h
pos-inducción. Fig. 14A. Análisis por transferencia
de Northern de ARNm de IDUA de plantas de tabaco transgénicas. Se
corrieron quince \mug de ARN total en gel de
glioxal-agarosa, se transfirieron sobre membrana de
nitrocelulosa y se hibridaron con ADNc de IDUA marcado con
^{32}P. Fig. 14B. Análisis por transferencia de Western de
proteínas solubles totales (20 \mug) de extractos de hoja de
tabaco usando anticuerpos para IDUA desnaturalizada sintetizada en
células CHO. El carril de control representa IDUA sintetizada en
células CHO (98 kDa bajo nuestras condiciones de gel). La IDUA
sintetizada a partir de tabaco transgénico tiene un tamaño molecular
de 92 kDa.
Fig. 15. Inmunodetección de IDUA secretada por
plantas transgénicas en el tampón de incubación. Se hirvieron
cincuenta \mul de tampón de incubación y se colocaron en ranuras
sobre membrana OPTITRAN junto con IDUA de control sintetizada en
células CHO. Los anticuerpos para IDUA desnaturalizada sintetizada
en células CHO se usaron para detectar la IDUA.
Fig. 16. Actividad de IDUA en extractos de
tejido y tampón de incubación a partir de tejido de plantas
transgénicas IDUA-9. Panel A: el tejido de plantas
IDUA-9 se indujo y se incubó en tampón, que se
recogió y se sustituyó a diversos tiempos después de la inducción
como se describe en el texto. Las cajas abiertas representan la
actividad de IDUA en extractos preparados a partir de tejido
inducido después de la incubación en tampón. Las cajas sombreadas
representan la actividad de IDUA en el tampón de incubación. Panel
B: se indujo tejido de planta IDUA-9 y se incubó
sin tampón durante 34 horas después de las cuales se preparó un
extracto a partir del tejido inducido. Se muestra la actividad de
IDUA del extracto.
Fig. 17. Comparación de la actividad de IDUA en
plantas de tabaco transgénicas IDUA-7,
IDUA-8 e IDUA-9: Panel A: se indujo
tejido de planta y se incubó en tampón, que se recogió y se
sustituyó a diversos tiempos después de la inducción como se
describe en el texto. Se representó la actividad de IDUA presente en
el tampón de incubación recogido a diversos tiempos
pos-inducción. Panel B: se indujo tejido de planta y
se incubó sin tampón en ausencia de tampón de incubación durante 34
horas, después de las cuales se prepararon extractos a partir de
los tejidos inducidos. Se muestran las actividades de IDUA de los
extractos.
Fig. 18. Análisis de Western por transferencia
por ranuras de IDUA secretada por la planta transgénica
IDUA-9 después de tres adiciones y recogidas
secuenciales de tampón de incubación; 24, 26 y 34 h
pos-MGA. El tejido (1,5 g) se indujo y se incubó en
una bolsa de plástico húmeda durante 24 h. Se usaron diez ml de
tampón de incubación para lavar el tejido; esta fracción se indica
como 24 h. Se añadió tampón recientemente preparado (10 ml) y se
incubó a temperatura ambiente durante 2 h; esta fracción se indicó
como 26 h. Se añadió tampón recientemente preparado (10 ml) al
tejido y se incubó durante 8 h y esta fracción se indicó como 34 h.
Se hirvieron cincuenta \mul de tampón de incubación de cada
fracción y se colocaron en ranuras sobre membrana OPTITRAN y se
analizaron con anticuerpos anti-IDUA.
Fig. 19. La secuencia de nucleótidos de la
secuencia codificante de IDUA usada en el constructo de expresión
MeGA:IDUA y 355^{ENH}:IDUA.
Fig. 20. La secuencia de aminoácidos deducida de
la secuencia codificante de IDUA mostrada en la Fig. 19.
Fig. 21. Constructo de expresión y vector de
transformación de plantas de ADNc de hGC. El constructo de expresión
MeGA:hGC en un plásmido intermedio pBS se corta y se inserta en el
sitio SstI del vector de transformación de plantas binario
pBIB-KAN para formar el vector de transformación
pCT50. Los cebadores de amplificación por PCR para la
reconstrucción del extremo 3' de la región codificante de hGC
fueron: GC23, que tiene la secuencia 5'GCCTATGCTGAGCACAAGTTACAG3'
(SEQ ID NO:11); y GC37, cuya hebra complementaria tiene la secuencia
5'TTCCTTGAGCTCGTCACTGGCGACGCCACAGGTA3' (SEQ ID NO:12). Las otras
abreviaturas y anotaciones mostradas son las mismas que las
descritas para la Fig. 1.
La presente invención se refiere a la producción
de enzimas lisosómicas recombinantes humanas o animales en plantas
y en células de plantas y tejidos de plantas cultivados que
implican: (1) construcción de constructos de expresión
recombinantes que comprenden secuencias codificantes de enzimas
lisosómicas y vectores de transformación que contienen los
constructos de expresión; (2) transformar o transfectar células de
plantas, tejidos de plantas o plantas con los vectores de
transformación; (3) expresar las secuencias codificantes de enzimas
lisosómicas en la célula de planta, tejido de planta o planta; y
(4) detectar y purificar los productos de expresión que tienen
actividad de enzima lisosómica.
Los sistemas de expresión en plantas y las
enzimas lisosómicas recombinantes producidas con los mismos tienen
una variedad de usos que incluyen, pero no se limitan a: (1) la
producción de enzimas enzimáticamente activas para el tratamiento
de enfermedades de almacenamiento lisosómico; (2) la producción de
anticuerpos contra enzimas lisosómicas, anticuerpos que tendrían
usos en el diagnóstico médico; (3) uso en cualquier procedimiento
comercial que implica la hidrólisis de sustrato; y (4) la producción
de proteínas modificadas o fragmentos de péptidos que sirven de
precursores o sustratos para el procesamiento in vivo o in
vitro adicional para dar una forma industrial especializada
para investigación o usos terapéuticos, tal como para producir una
enzima terapéutica con eficacia aumentada o especificidad de
sustrato alterada. Estos productos de proteínas lisosómicas
recombinantes expresados en plantas no necesitan ser enzimáticamente
activos o de estructura idéntica a las enzimas lisosómicas o
proteínas animales o humanas nativas correspondientes con el fin de
ser útiles para investigación o aplicaciones industriales.
Los términos "enzima lisosómica" y
"producto génico de enzima lisosómica", como se usan en este
documento con respecto a cualquier enzima y producto tales
producidos en un sistema de expresión en plantas, se refieren a un
péptido recombinante expresado en una planta transgénica o célula de
planta a partir de una secuencia de nucleótidos que codifica una
enzima lisosómica humana o animal, una enzima lisosómica humana o
animal modificada, o un fragmento, derivado o modificación de tal
enzima. Las enzimas lisosómicas humanas o animales modificadas
útiles incluyen, pero no se limitan a, enzimas lisosómicas humanas o
animales que tienen una o varias adiciones, deleciones y/o
sustituciones de aminoácido producidas naturalmente o introducidas
artificialmente.
El término "secuencia codificante de enzima
lisosómica", como se usa en este documento, se refiere a una
secuencia de ADN o ARN que codifica una proteína o péptido, o un
fragmento, derivado u otra modificación de los mismos, que presenta
actividad enzimática detectable contra un sustrato de enzima
lisosómica.
El término "enzimáticamente activa" se usa
en este documento con respecto a cualquier enzima lisosómica
recombinante producida en un sistema de expresión en plantas para
significar que la enzima lisosómica recombinante puede hidrolizar o
el sustrato natural o un sustrato análogo o sintético del mismo de
la enzima lisosómica humana o animal correspondiente, a niveles
detectables.
El término "enzimáticamente activa" también
se usa en este documento con respecto a la hGC recombinante y la
hGC modificada producida en un sistema de expresión en plantas para
significar que tales hGCs pueden hidrolizar el sustrato de hGC
nativa, es decir,
N-acil-singosil-1-O-\beta-D-glucósido,
de la hGC o que puede escindir el \beta-glucósido
sintético,
4-metil-umbeliferil-\beta-D-glucósido
(4MuGlc), a niveles detectables. De modo similar, el término como
se aplica a IDUA producida en plantas y a IDUA modificada significa
que tales IDUAs pueden hidrolizar el sustrato de IDUA nativa, es
decir, sulfato de dermatano o sulfato de heparano, o pueden
escindir el \alpha-glucósido sintético,
4-metilumbeliferil-\alpha-L-idurónido
(4-MUI), a niveles detectables.
El término "transformante" como se usa en
este documento se refiere a una planta, célula de planta o tejido
de planta en el cual se ha introducido un constructo génico que
comprende una secuencia codificante de enzima lisosómica mediante
un procedimiento distinto de la transfección con un virus
manipulado.
El término "transfectante" se refiere a una
planta, célula de planta o tejido de planta que se ha infectado con
un virus manipulado y mantiene establemente dicho virus en la célula
infectada.
Una vez se identifica que un transformante o
transfectante de planta expresa una enzima lisosómica recombinante,
una realización no limitante de la invención implica la expansión
clonal y el uso de ese transformante o transfectante en la
producción y purificación de enzima lisosómica recombinante
enzimáticamente activa. En otra realización no limitante de la
invención, cada nueva generación de plantas de la progenie puede
cribarse nuevamente para la presencia de secuencia de nucleótidos
que codifica para una enzima lisosómica, dando tal cribado como
resultado la producción por generaciones posteriores de plantas de
cantidades recuperables de enzima lisosómica recombinante activa, y
a partir de la cual se purifica luego la enzima.
La invención se divide en las siguientes
secciones únicamente con el fin de descripción: (a) genes o
secuencias codificantes para enzimas lisosómicas implicadas en
enfermedades de almacenamiento lisosómico; (b) construcción de
constructos de expresión recombinantes para expresar secuencias
codificantes de enzimas lisosómicas en célula de planta; (c)
construcción de vectores de transformación de plantas que comprenden
los constructos de expresión; (d) transformación/transfección de
plantas que pueden traducir y procesar productos de traducción
primaria con el fin de expresar una enzima lisosómica recombinante
enzimáticamente activa; (e) identificación y purificación de la
enzima lisosómica recombinante así producida; (f) expansión del
número de plantas transformadas o transfectadas; y (g)
procedimientos para usar terapéuticamente la enzima lisosómica
recombinante.
Las enzimas lisosómicas recombinantes producidas
según esta invención tendrán una variedad de usos, siendo
probablemente su uso más significativo en terapia de sustitución de
enzimas para enfermedades de almacenamiento lisosómico. Estas
enzimas lisosómicas incluyen, pero no se limitan a:
\alpha-N-acetilgalactosaminidasa
(Warner y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990,
173:13-19; lipasa ácida; arilsulfatasa A;
aspartilglicosaminidasa; ceramidasa;
\alpha-L-fucosidasa (de Wet y
col., 1984, DNA 3:437-447),
\alpha-galactosidasa,
\beta-galactosidasa, galactosilceramidasa,
glucocerebrosidasa, \alpha-glucosidasa,
\beta-glucuronidasa, heparina-N-sulfatasa,
\beta-hexosaminidasa, iduronato sulfatasa,
\alpha-L-iduronidasa,
\alpha-manosidasa,
\beta-manosidasa, sialidasa y esfingomielinasa. De
estas enzimas, los ADNc se han clonado para
\alpha-N-acetilgalactosaminidasa
(Zhu & Goldstein, 1993, Gene 137:309-314);
lipasa ácida (Amesis y col., 1994, Eur. J. Biochem
219:905-914); \alpha-galactosidasa
(Eng & Desnick, 1994, Hum Mutat. 3:103-111);
glucocerebrosidasa humana (hGC) (Sorge y col., 1985,
supra);
\alpha-L-iduronidasa (Scott y
col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:9695-9699); iduronato sulfatasa (Daniele y col.,
1993, Genomics 16:755-757);
\alpha-manosidasa (Schatzle y col., 1992, J. Biol.
Chem 267:4000-4007); y sialidasa (Ferrari y col.,
1994, Glycobiology 4:2047-2052).
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
enzimas lisosómicas que pueden usarse según la invención incluyen,
pero no se limitan a, cualquier secuencia de ácidos nucleicos que
codifica una enzima lisosómica, enzima lisosómica modificada, o
equivalente funcional de las mismas que incluye, pero no se limitan
a: (a) cualquier secuencia de nucleótidos que se hibrida
selectivamente con el complemento de una secuencia codificante de
una enzima lisosómica humana o animal bajo condiciones estrictas,
por ejemplo, lavando en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a 68ºC (Ausubel y
col., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.
I, Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons,
Inc., New York, en la página 2.10.3), y codifica un producto
homólogo a la enzima lisosómica humana o animal; y/o (b) cualquier
secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento de la
secuencia codificante humana o animal de enzimas lisosómicas bajo
condiciones menos estrictas, tales como condiciones moderadamente
estrictas, por ejemplo, lavando en 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 42ºC
(Ausubel y col., 1989, supra), que sin embargo todavía
codifica un producto génico homólogo que es enzimáticamente activo;
y (c) cualquier secuencia codificante de nucleótidos que codifica de
otra forma una proteína de cualquier organismo que puede hidrolizar
un sustrato nativo de enzima lisosómica humana o animal o sustrato
análogo.
La invención también incluye, pero no se limita
a:
(a) vectores de ADN que contienen cualquiera de
las secuencias codificantes de nucleótidos anteriores y/o sus
complementos; (b) vectores de expresión y transformación de ADN que
contienen constructos de expresión que comprenden cualquiera de las
secuencias codificantes de nucleótidos anteriores asociadas
operativamente a un elemento regulador que dirige la expresión de
las secuencias codificantes en células de plantas o plantas; y (c)
células de plantas o plantas genéticamente manipuladas que contienen
cualquiera de las secuencias codificantes anteriores asociadas
operativamente a un elemento regulador que dirige la expresión de
las secuencias codificantes y/o antisentido en la célula de la
planta. Como se usa en este documento, el término "elemento
regulador" incluye, pero no se limita a, promotores inducibles y
no inducibles, potenciadores, operadores y otros elementos
conocidos para aquellos expertos en la materia que dirigen y/o
regulan la expresión génica. La invención también incluye
fragmentos, derivados u otras modificaciones de las secuencias de
ADN descritas en este documento.
Con el fin de expresar una enzima lisosómica en
un sistema de expresión en plantas, la secuencia codificante de la
enzima lisosómica se inserta en un constructo de expresión apropiado
y el constructo de expresión se incorpora en un vector de
transformación para transferirse a las células de la planta. El
constructo de expresión se construye preferentemente de manera que
la secuencia codificante de enzima lisosómica esté operativamente
asociada a uno o más elementos reguladores que incluyen, por
ejemplo, promotores y/o potenciadores necesarios para la
transcripción y traducción de la secuencia codificante de la enzima
lisosómica. Los procedimientos para construir los constructos de
expresión y los vectores de transformación incluyen recombinación y
manipulación genética in vitro estándar. Véanse, por
ejemplo, las técnicas descritas en Weissbach y Weissbach, 1988,
Methods For Plant Molecular Biology, Academic Press,
capítulos 26-28.
Los elementos reguladores que pueden usarse en
los constructos de expresión incluyen promotores que pueden ser
heterólogos u homólogos a la célula de la planta. El promotor puede
ser un promotor de planta o un promotor que no es de planta que
puede dirigir altos niveles de transcripción de una secuencia ligada
en células de plantas y plantas. Los ejemplos no limitantes de
promotores de plantas que pueden usarse eficazmente en la práctica
de la invención incluyen el virus del mosaico de la coliflor (CaMV)
35S, rbcS, el promotor de la proteína de unión a clorofila
a/b, AdhI, NOS y HMG2, o modificaciones o derivados de los mismos.
El promotor puede ser o constitutivo o inducible. Por ejemplo, y no
a modo de limitación, un promotor inducible puede ser un promotor
que promueve la expresión o aumenta la expresión de la secuencia de
nucleótidos de enzimas lisosómicas después de la activación
mecánica de genes (MGA) de la planta, tejido de planta o célula de
planta. Un ejemplo no limitante de un promotor de planta inducible
por MGA es MeGA (descrito más adelante).
Los constructos de expresión pueden modificarse
adicionalmente según procedimientos conocidos para aquellos
expertos en la materia para potenciar u optimizar la expresión
génica heteróloga en plantas y células de plantas. Tales
modificaciones incluyen, pero no se limitan a, mutar elementos
reguladores de ADN para aumentar la fuerza del promotor o para
alterar la propia secuencia codificante de enzimas lisosómicas.
Otras modificaciones incluyen eliminar secuencias de intrón o
secuencias no codificantes en exceso de los extremos 5' y/o 3' de la
secuencia codificante de enzimas lisosómicas con el fin de
minimizar los efectos negativos asociados a una secuencia o
distancia sobre la expresión de hGC, por ejemplo, minimizando o
eliminando las secuencias desestabilizadoras de mensajes.
Los constructos de expresión pueden modificarse
adicionalmente según procedimientos conocidos para aquellos
expertos en la materia para añadir, eliminar o modificar de otro
modo las secuencias de péptidos señal para alterar la escisión de
péptidos señal o para aumentar o cambiar el destino de la enzima
lisosómica expresada por el sistema de endomembrana de la planta.
Por ejemplo, pero no a modo de limitación, el constructo de
expresión puede manipularse específicamente para dirigir a la
enzima lisosómica para la secreción, o la localización vacuolar, o
la retención en el retículo endoplásmico (ER).
En una realización, el constructo de expresión
puede manipularse para incorporar una secuencia de nucleótidos que
codifica una señal que dirige a la enzima lisosómica a la vacuola
de la planta. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el dominio de
143 aminoácidos N-terminal derivado de la proteína
vacuolar de plantas, proaleuraína (Holwerda y col., 1992,
supra; Holwerda y col., 1990, supra) puede
manipularse en el constructo de expresión para producir un producto
de fusión de péptido señal-enzima lisosómica con la
transcripción y la traducción. El péptido señal de proaleuraína
dirigirá la enzima lisosómica a la vacuola de la célula de plantas,
pero él mismo se escinde durante el tránsito por el sistema de
endomembrana de la planta para generar la proteína madura.
En otra realización no limitante, un péptido
señal puede manipularse en el constructo de expresión para dirigir
a la enzima lisosómica para que sea secretada por la célula de la
planta. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el péptido señal de
tabaco PR-1, que es una proteína secretada
relacionada con la patogénesis (Cornelissen y col., 1986, EMBO J.
5:37-40) puede manipularse en el constructo de
expresión para dirigir la secreción de la enzima lisosómica desde
la célula de planta.
En una realización no limitante adicional, el
péptido señal puede manipularse en el constructo de expresión para
dirigir que la enzima lisosómica sea retenida dentro del ER. Tales
enzimas lisosómicas retenidas por el ER pueden presentar patrones
de glicosilación alterados, y quizá preferibles, como resultado del
fallo del péptido en avanzar por el aparato de Golgi, dando así
como resultado una falta de procesamiento de glicosilo posterior.
Por ejemplo, y no a modo de limitación, una secuencia de nucleótidos
puede manipularse en el constructo de expresión para dar como
resultado la fusión de la secuencia de aminoácidos KDEL, es decir,
Lys-Asp-Glu-Leu,
con el extremo carboxilo de la enzima lisosómica. La secuencia KDEL
da como resultado la retención de la enzima lisosómica en el ER
(Pfeffer y Rothman, 1987, Ann. Rev. Biochem.
56:829-852).
El constructo de expresión puede modificarse
adicionalmente según procedimientos conocidos para aquellos expertos
en la materia para añadir secuencias codificantes que faciliten la
purificación de la enzima lisosómica. En una realización no
limitante, una secuencia de nucleótidos que codifica el epítopo
diana de un anticuerpo monoclonal puede manipularse en el
constructo de expresión en asociación operativa con los elementos
reguladores y situarse de manera que el epítopo expresado se
fusione con la enzima lisosómica. Por ejemplo, y no a modo de
limitación, una secuencia de nucleótidos que codifica el epítopo
marcador FLAG^{TM} (International Biotechnologies, Inc., IBI),
que es un péptido marcador hidrófílico, puede insertarse mediante
técnicas estándar en el constructo de expresión en un punto que se
corresponde con el extremo carboxilo de la enzima lisosómica. El
producto de fusión epítopo FLAG^{TM}-enzima
lisosómica expresado puede detectarse luego y purificarse por
afinidad usando anticuerpos anti-FLAG^{TM}.
En otra realización no limitante, una secuencia
de nucleótidos puede manipularse en el constructo de expresión para
proporcionar una secuencia de conector escindible entre la secuencia
de péptidos de la enzima lisosómica y cualquier señal de
direccionamiento, péptido indicador, marcador de selección o
marcador de detección, como se describen anteriormente, que no se
ha escindido de otro modo de la secuencia de péptidos de la enzima
lisosómica durante el procesamiento de péptidos y el tráfico por el
sistema de endomembrana de la planta. Una secuencia de conector tal
puede seleccionarse de manera que pueda escindirse o química o
enzimáticamente durante la purificación de la enzima lisosómica
(Light y col., 1980, Anal. Biochem.
106:199-206).
Los vectores de transformación de la invención
pueden desarrollarse a partir de cualquier vector de transformación
de plantas conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a,
la familia muy conocida de los plásmidos Ti de Agrobacterium
y derivados de los mismos, que incluyen vectores tanto integrativos
como binarios, y que incluyen, pero no se limitan a,
pBIB-KAN, pGA471, pEND4K, pGV3850 y pMON505. También
están incluidos ADN y ARN de virus de plantas que incluyen, pero no
se limitan a, CaMV, geminivirus, virus del mosaico del tabaco y
derivados manipulados de los mismos, cualquiera de los cuales puede
servir eficazmente de vector para transferir una secuencia
codificante de enzimas lisosómicas, o equivalente funcional de la
misma, con elementos reguladores asociados, en células de plantas
y/o mantener autónomamente la secuencia transferida. Además, pueden
utilizarse elementos transponibles conjuntamente con cualquier
vector para transferir la secuencia codificante y la secuencia
reguladora a una célula de planta.
Para ayudar en la selección de transformantes y
transfectantes, los vectores de transformación pueden modificarse
preferentemente para que comprendan una secuencia codificante para
un producto génico indicador o marcador de selección. Tal secuencia
codificante para un indicador o marcador de selección debería estar
preferentemente en asociación operativa con la secuencia
codificante del elemento regulador descrito anteriormente.
Los genes indicadores que pueden ser útiles en
la invención incluyen, pero no se limitan, al gen de
\beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson y col.,
1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:8447) y el gen de luciferasa
(Ow y col., 1986, Science 234:856). Las secuencias codificantes que
codifican marcadores de selección que pueden ser útiles en la
invención incluyen, pero no se limitan a, aquellas secuencias que
codifican productos génicos que confieren resistencia a
antibióticos, antimetabolitos o herbicidas que incluyen, pero no se
limitan a, kanamicina, higromicina, estreptomicina, fosfinotricina,
gentamicina, metotrexato, herbicidas de glifosato y sulfonilurea, e
incluyen, pero no se limitan a, secuencias codificantes que
codifican enzimas tales como neomicina fosfotransferasa II (NPTII),
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) e higromicina fosfotransferasa
I (HPT, HYG).
Puede utilizarse una variedad de sistemas de
expresión en plantas para expresar la secuencia codificante de
enzimas lisosómicas o su equivalente funcional. Las especies de
plantas particulares pueden seleccionarse de cualquier especie
dicotiledónea, monocotiledónea, gimnosperma, planta vascular o no
vascular inferior, que incluyen cualquier cultivo de cereales u
otro cultivo agrícolamente importante. Tales plantas incluyen, pero
no se limitan a, alfalfa, Arabidopsis, espárrago, cebada,
repollo, zanahoria, apio, maíz, algodón, pepino, lino, lechuga,
colza, pera, guisantes, petunia, álamo, patata, arroz, soja,
remolacha azucarera, girasol, tabaco, tomate, trigo y trébol
blanco.
Los procedimientos por los que las plantas
pueden transformarse o transfectarse son muy conocidos para aquellos
expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Plant
Biotecnology, 1989, Kung & Arntzen, eds., Butterworth
Publishers, cap. 1, 2. Los ejemplos de procedimientos de
transformación que pueden usarse eficazmente en la invención
incluyen, pero no se limitan a, transformación mediada por
Agrobacterium de discos de hojas u otros tejidos de plantas,
microinyección de ADN directamente en células de plantas,
electroporación de ADN en protoplastos de células de plantas,
fusión de liposomas o esferoplastos, bombardeo con microproyectiles
y la transfección de células o tejidos de plantas con virus de
plantas apropiadamente manipulados.
Los procedimientos de cultivo de tejidos de
plantas necesarios para poner en práctica la invención son muy
conocidos para aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo,
Dixon, 1985, Plant Cell Culture: A Practical Approach, IRL
Press. Aquellos procedimientos de cultivo de tejidos que pueden
usarse eficazmente para poner en práctica la invención incluyen la
producción y el cultivo de protoplastos de plantas y suspensiones de
células, la propagación de cultivos estériles de discos de hojas u
otros tejidos de plantas en medios que contienen cepas manipuladas
de agentes transformantes tales como, por ejemplo, cepas de
Agrobacterium o de virus de plantas y la regeneración de
plantas transformadas completas a partir de protoplastos,
suspensiones de células y tejidos del callo.
La invención puede ponerse en práctica
transformando o transfectando una planta o célula de planta con un
vector de transformación que contiene un constructo de expresión que
comprende una secuencia codificante para la enzima lisosómica y
seleccionando transformantes o transfectantes que expresan la enzima
lisosómica. Las células y tejidos de plantas transformadas o
transfectadas pueden seleccionarse mediante técnicas muy conocidas
para aquellos expertos en la materia que incluyen, pero no se
limitan a, detectar productos de genes indicadores o seleccionar
basándose en la presencia de uno de los marcadores de selección
descritos anteriormente. Entonces, las células o tejidos de plantas
transformadas o transfectadas se cultivan y a partir de los mismos
se regeneran plantas completas. La integración y el mantenimiento
de la secuencia codificante de enzimas lisosómicas en el genoma de
la planta puede confirmarse mediante técnicas estándar, por ejemplo,
mediante análisis por hibridación de Southern, análisis por PCR,
que incluye PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR),
o ensayos inmunológicos para los productos proteicos esperados. Una
vez se ha identificado un transformante o transfectante de planta
tal, una realización no limitante de la invención implica la
expansión clonal y el uso de ese transformante o transfectante en
la producción de enzima lisosómica.
Como un ejemplo no limitante de un procedimiento
de transformación, la transformación mediada por
Agrobacterium de discos de hojas de plantas puede seguir
procedimientos que son muy conocidos para aquellos expertos en la
materia. Brevemente, los discos de hojas pueden cortarse de plantas
de semillero cultivadas axénicamente, incubarse en una suspensión
bacteriana, por ejemplo, 10^{9} ufc/ml, de A.
tumefaciens que contiene un plásmido manipulado que
comprende un marcador de selección tal como, por ejemplo,
resistencia a kanamicina, y transferirse a medio de "formación de
brotes" selectivo que contiene, por ejemplo, kanamicina, que
bloqueará el crecimiento de bacterias y células de plantas sin
transformar e inducirá la iniciación de brotes y la formación de
hojas a partir de células transformadas. Los brotes se regeneran y
luego se transfieren a medios selectivos para desencadenar la
iniciación de raíces. La selección estricta de antibióticos en la
etapa de enraizamiento es útil para permitir que sólo los brotes
establemente transformados generen raíces. Las plántulas
transgénicas pequeñas pueden ser transferidas luego a turba
estéril, vermiculita o tierra y aclimatarse gradualmente para el
crecimiento en el invernadero o en el campo.
La transcripción de la secuencia codificante de
enzimas lisosómicas y la producción de la enzima lisosómica en
plantas, tejidos de plantas o células de plantas transformados o
transfectados pueden confirmarse y caracterizarse por una variedad
de procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia. La
transcripción de la secuencia codificante de enzimas lisosómicas
puede analizarse mediante técnicas convencionales que incluyen,
pero no se limitan a, detectar la presencia de transcritos de ácido
ribonucleico mensajero (ARNm) de enzimas lisosómicas en plantas o
células de plantas transformadas o transfectadas usando análisis por
hibridación de Northern o amplificación por
RT-PCR.
La detección de la propia enzima lisosómica
puede llevarse a cabo usando cualquiera de una variedad de técnicas
convencionales que incluyen, pero no se limitan a, detectar la
actividad de enzimas lisosómicas en extractos de plantas, por
ejemplo, detectando la hidrólisis de o el sustrato natural de la
enzima o un análogo del sustrato. Adicionalmente, la enzima
lisosómica puede detectarse inmunológicamente usando anticuerpos
monoclonales o policlonales, o fragmentos inmunorreactivos o
derivados de los mismos, producidos contra la enzima, por ejemplo,
por análisis por transferencia de Western, y determinación de la
secuencia de aminoácidos limitada de la proteína.
La identificación indirecta de la producción de
enzimas en una planta puede realizarse usando cualquier marcador
detectable o indicador ligado a la enzima lisosómica. Por ejemplo,
pero no a modo de limitación, el epítopo FLAG^{TM}, que puede
ligarse a la enzima lisosómica, como se describe anteriormente,
puede detectarse en tejidos y extractos de plantas usando
anticuerpos monoclonales anti-FLAG M2 (IBI)
conjuntamente con el sistema de detección quimioluminiscente
Western Exposure^{TM} (Clontech).
La producción de enzima lisosómica en una planta
transformada o transfectada puede confirmarse y caracterizarse
adicionalmente por localización histoquímica cuyos procedimientos
son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Véase, por
ejemplo, Techniques of Immunocytochemistry, Vol I, 1982,
Bullock y Petrusz, eds., Academic Press, Inc. Por ejemplo, pero no
a modo de limitación, el tejido tanto recientemente obtenido,
congelado como fijado e incluido puede seccionarse, y las secciones
pueden sondarse tanto con anticuerpos primarios policlonales como
monoclonales producidos contra la enzima lisosómica o, por ejemplo,
anticuerpos monoclonales anti-FLAG^{TM}.
Entonces, los anticuerpos primarios pueden detectarse mediante
técnicas convencionales, por ejemplo, usando la técnica de
estreptavidina conjugada con fosfatasa
alcalina-proteína A biotinilada, o un anticuerpo
secundario que posee un marcador detectable que se une al anticuerpo
primario.
Los productos de expresión pueden purificarse
adicionalmente y caracterizarse como se describe a continuación en
las subsecciones.
Aquí se describe un procedimiento no limitante
para producir y purificar la enzima lisosómica, estando la
secuencia codificante de enzimas lisosómicas operablemente asociada
a un promotor inducible en el constructo de expresión. La hoja u
otro tejido o células de una planta o cultivo de células transgénico
transformado o transfectado con este constructo de expresión puede
procesarse para inducir la expresión de la secuencia codificante de
enzimas lisosómicas. Este procedimiento de inducción puede incluir
inducir la activación de genes lisosómicos por uno o más
procedimientos aplicados por separado o en combinación que incluyen,
pero no se limitan a, daño físico u otra activación mecánica de
genes (MGA) y aplicación de desencadenantes químicos o patogénicos
u hormonas de plantas. Los niveles de activación de genes
lisosómicos también pueden potenciarse en células o tejidos de
plantas por factores tales como la disponibilidad de nutrientes,
gases tales como O_{2} y CO_{2}, y luz o calor. Después de la
inducción de la expresión, el tejido puede almacenarse, por ejemplo
a -20ºC. Si la proteína lisosómica es dirigida para la localización
dentro de la célula de planta, la pared celular de la planta deberá
ser penetrada para extraer la proteína. Por consiguiente, el tejido
de la planta puede molerse para dar un polvo fino, por ejemplo,
usando un molinillo de tejidos y nieve carbónica, u homogeneizarse
con un homogeneizador de tejido de vidrio esmerilado. Para
resuspender la enzima lisosómica, las membranas de la planta deben
solubilizarse usando un tampón de extracción que contiene un
detergente, por ejemplo, un detergente biliar tal como taurocolato
de sodio al 1% (p/v), en una disolución tamponada, por ejemplo
citrato de sodio 25 mM, pH 7,0. Entonces, el homogeneizado puede
clarificarse, por ejemplo, por centrifugación a 10.000 x g durante
30 min para producir un homogeneizado sin células.
La enzima lisosómica debe purificarse
adicionalmente si va a ser útil como un reactivo terapéutico o para
investigación. La enzima lisosómica puede purificarse a partir de
extractos de plantas según procedimientos muy conocidos para
aquellos expertos en la materia (Furbish y col., 1977, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:3560-3563). Una vez se confirma
la presencia de la enzima, puede aislarse de extractos de plantas
mediante técnicas bioquímicas convencionales que incluyen, pero no
se limitan a, precipitación diferencial con sulfato de amonio (AS),
cromatografía de filtración en gel o cromatografía de afinidad, por
ejemplo, utilizando unión hidrófoba, inmunológica o a lectina. En
cada etapa del procedimiento de purificación, el rendimiento, la
pureza y la actividad de la enzima pueden determinarse por uno o
más ensayos bioquímicos que incluyen, pero no se limitan a: (1)
detectar la hidrólisis del sustrato de la enzima o un análogo del
sustrato; (2) análisis inmunológico usando un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA); (3) análisis por
electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE); y (4) análisis de Western. La enzima
puede purificarse alternativa o adicionalmente por cromatografía de
afinidad en la que la enzima se une a su inhibidor que está ligado,
por ejemplo, a un sustrato inerte.
Una vez solubilizadas, todas las fracciones que
contienen enzimas pueden mantenerse, por ejemplo, mediante
almacenamiento a 4ºC, y estabilizarse, si es necesario, por ejemplo,
con \beta-mercaptoetanol 4 mM, EDTA 5 mM y/o
posiblemente con altos niveles de glicerol o etilenglicol.
Con el fin de estudiar si el sistema de
expresión en plantas reconoce eficazmente y escinde correctamente
el péptido señal humano de la enzima lisosómica, la enzima producida
por la planta puede purificarse y analizarse mediante secuenciación
del extremo N. Por consiguiente, la enzima puede tratarse, por
ejemplo, con Endo-F/N-glucanasa
(Boehringer Mannheim) para eliminar los glicanos N-ligados, y
el péptido resultante puede repurificarse mediante procedimientos
descritos anteriormente. La pureza de la enzima puede determinarse
basándose, por ejemplo, en SDS-PAGE teñido con
plata. La banda que contiene la enzima puede cortarse del gel, el
péptido eluirse de la misma y luego analizarse mediante
secuenciación comercial del aminoácido N-terminal para
determinar si se ha producido la correcta escisión del péptido
señal. La escisión incompleta puede detectarse, por ejemplo, como
una banda doble en SDS-PAGE, o como secuencias
N-terminales mezcladas.
Los oligosacáridos de enzimas lisosómicas
humanas y animales nativas son estructuras de antena típicas que
contienen N-acetilglucosamina, manosa y ácido siálico. El
glicoconjugado asociado a la enzima lisosómica de la invención
puede determinarse, por ejemplo, mediante estudios de unión a
lectina (Reddy y col., 1985, Biochem. Med.
33:200-210, Cummings, 1994, Meth. Enzymol.
230:66-86).
Los glicanos de plantas no contienen ácido
siálico, que es un azúcar terminal frecuente en glicanos de
mamíferos. Además, los glicanos complejos de plantas son
generalmente más pequeños y contienen un residuo \beta
1-2 xilosa unido a los residuos de manosa ligados a
\beta del núcleo (Gomez y Chrispeels, 1994, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91:1829-1833).
La determinación de la composición y la
estructura de los glicanos de la enzima lisosómica de la invención
es de particular interés porque: (a) la composición de los glicanos
indicará el estado del movimiento de la proteína por el Golgi; y
(b) la presencia de un glicano complejo puede indicar si se
desencadenará una respuesta antigénica en seres humanos.
Pueden usarse varias aproximaciones moleculares,
genéticas y químicas para elevar la proporción de la forma con alto
contenido de manosa de los glicanos en enzimas lisosómicas,
haciéndolas más similares en estructura a la proteína humana nativa
(Grabowski y col. 1995, Ann. Int. Med. 122:33-39;
Berg-Fussman y col. 1993, J. Biol. Chem.
268:14861-14866). Por ejemplo, pero no a modo de
limitación, el análogo de manosa,
1-desoximanojirimicina (dMM), inhibe la manosidasa
I, la primera enzima específica para Golgi que participa en el
procesamiento de glicanos. Los tejidos de plantas tratados con dMM
producen glicoproteínas que carecen de fucosa y xilosa y mantienen
un perfil de glicanos que concuerda con la inhibición en la etapa de
manosidasa I (Vitale y col. 1989, Pl. Phys.
89:1079-1084). El tratamiento de tejidos de plantas
que expresan enzimas lisosómicas con dMM puede ser útil para
producir enzimas lisosómicas con un perfil de glicanos con alto
contenido de manosa relativamente homogéneo. Tales enzimas
lisosómicas deberían ser sumamente eficaces para uso en el
tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico en seres
humanos y animales.
Una vez se selecciona una planta transformada o
transfectada que produce una cantidad útil de la enzima lisosómica
recombinante de la invención, una realización de la invención
contempla la producción de clones de esta planta tanto por
procedimientos de reproducción asexual muy conocidos como por
procedimientos de cultivo de tejidos de plantas habituales. Por
ejemplo, los tejidos de una planta de interés pueden inducirse para
que formen plantas genéticamente idénticas a partir de esquejes
asexuales. Alternativamente, el tejido del callo y/o suspensiones
de células pueden producirse a partir de una planta tal y
subcultivarse. Posteriormente, a partir de la misma puede
regenerarse un número elevado de plantas mediante transferencia al
medio de cultivo regenerativo apropiado.
Alternativamente, la planta que produce la
enzima lisosómica recombinante puede cruzarse como una línea
parental, bien macho o hembra, con otra planta de la misma especie
o variedad, cuya otra planta también puede o no ser transgénica
para la secuencia codificante lisosómica para producir una
generación F1. Los miembros de la generación F1 y las generaciones
posteriores pueden probarse, como se describe anteriormente, para la
herencia y el mantenimiento estables de la secuencia codificante de
enzimas lisosómicas, además de para la producción de enzimas
lisosómicas. Por tanto, se contempla un programa de cultivo por el
cual la secuencia codificante de enzimas lisosómicas puede
transferirse a otras cepas o variedades de plantas que tienen
características agronómicas ventajosas, por ejemplo, mediante un
programa de retrocruzamiento controlado. Por tanto, la invención
engloba líneas parentales que comprenden la secuencia codificante
de enzimas lisosómicas, además de todas las plantas en generaciones
posteriores que descienden de un cruce en el que al menos una de los
padres comprendía la secuencia codificante de enzimas lisosómicas.
La invención engloba adicionalmente todas las semillas que
comprenden la secuencia codificante de enzimas lisosómicas y a
partir de las cuales pueden cultivarse tales plantas, y cultivos de
tejido, que incluyen tejidos del callo, suspensiones de células y
protoplastos que comprenden la secuencia codificante de enzimas
lisosómicas, tanto si pueden regenerarse de nuevo como si no para
dar plantas.
Las enzimas lisosómicas recombinantes de la
invención son útiles para el tratamiento terapéutico de enfermedades
de almacenamiento lisosómico proporcionando una cantidad
terapéutica de una enzima lisosómica particular, o un derivado o
modificación de la misma, a un paciente que padece una enfermedad de
almacenamiento lisosómico o afección resultante de una deficiencia
de la forma activa humana o animal correspondiente de esa
enzima.
Por "cantidad terapéutica" se indica una
cantidad de enzima lisosómica enzimáticamente activa que producirá
un alivio significativo de síntomas clínicos de una enfermedad de
almacenamiento lisosómico particular.
Una cantidad terapéutica produce "alivio
significativo de síntomas clínicos" de la enfermedad de
almacenamiento lisosómico particular si sirve para reducir uno o
más de los efectos o síntomas patológicos de la enfermedad o para
reducir la velocidad de progresión de uno o más de tales efectos o
síntomas patológicos.
Puede determinarse un protocolo de dosificación
y tratamiento eficaz mediante medios convencionales empezando con
una baja dosis en animales de laboratorio y luego aumentando la
dosificación a la vez que se controlan los efectos, y también
variando sistemáticamente la pautade dosificación. La cantidad de
enzima lisosómica recombinante que va a administrarse a un paciente
que padece una enfermedad o afección lisosómica variará. Un médico
puede tener en cuenta numerosos factores cuando determina una dosis
óptima para un sujeto dado. Estos factores incluyen la estatura del
paciente, la edad del paciente, la condición general del paciente,
la enfermedad particular que está tratándose, la gravedad de la
enfermedad, la presencia de otros fármacos en el paciente, y
similares. Las dosificaciones de ensayo se elegirían después de
considerar los resultados de estudios en animales y cualquier
bibliografía clínica disponible con respecto a resultados pasados de
terapia de sustitución para la enfermedad de almacenamiento
lisosómico particular.
Por ejemplo, las cantidades terapéuticas de hGC
e IDUA recombinantes y hGC e IDUA modificadas producidas según la
invención pueden englobar en cada caso dosificaciones de entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 500 mg para un paciente de 70
kg por mes, dependiendo de la gravedad de los síntomas del paciente
de la enfermedad de Gaucher o de Hurler.
La cantidad de enzima lisosómica recombinante de
la invención administrada al paciente puede disminuirse o
aumentarse según la actividad enzimática de la enzima lisosómica
particular. Por ejemplo, la administración de una enzima lisosómica
recombinante de la invención que se ha modificado para tener una
actividad enzimática aumentada respecto a la enzima humana o animal
nativa requerirá la administración de una menor cantidad al
paciente que una enzima lisosómica humana o animal nativa que tiene
menor actividad enzimática.
Además, la cantidad de enzima lisosómica
recombinante administrada al paciente puede modificarse con el
tiempo dependiendo de un cambio en la afección del paciente a
medida que avanza el tratamiento, cuya determinación está dentro de
las destrezas del médico que lo atiende.
La invención también proporciona formulaciones
farmacéuticas para uso de la enzima lisosómica recombinante en el
tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosómico. Las
formulaciones comprenden una enzima lisosómica recombinante de la
invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Puede usarse
una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua
tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Las
formulaciones farmacéuticas también pueden comprender componentes
adicionales que sirven para prologar la vida útil de formulaciones
farmacéuticas que incluyen conservantes, estabilizadores de
proteínas y similares. Las formulaciones son preferentemente
estériles y están libres de material particulado (para formas
inyectables). Estas composiciones pueden esterilizarse mediante
técnicas de esterilización convencionales muy conocidas.
Las composiciones pueden contener sustancias
auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para
aproximarse a condiciones fisiológicas tales como agentes
tamponantes y de ajuste del pH, agentes de regulación de la
toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico,
cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc.
Las formulaciones pueden adaptarse para diversas
formas de administración que incluyen intramuscularmente,
subcutáneamente, intravenosamente y similares. Las formulaciones
objeto también pueden formularse de manera que se proporcione la
liberación sostenida de una enzima lisosómica. Los procedimientos
actuales para preparar composiciones que pueden administrarse
parenteralmente y los ajustes necesarios para la administración a
sujetos serán conocidos o evidentes para aquellos expertos en la
materia y se describen en más detalle en, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Science, 17th Ed. Mack Publishing
Company, Easton, Pa. (1985).
La invención se ilustra en los ejemplos de
trabajo descritos a continuación para la expresión de hGC en
tabaco.
\vskip1.000000\baselineskip
Las subsecciones a continuación describen la
producción de una glucocerebrosidasa humana (hGC) modificada
enzimáticamente activa en tabaco.
La E. coli que contiene la secuencia de
ADNc de hGC clonada a partir de células de fibroblasto, como se
describe (Sorge y col. 1985, supra), se obtuvo de la
ATCC (nº de acceso 65696). Los cebadores de oligonucleótidos GC1
(correspondientes al extremo amino de la región codificante de hGC
como se muestra en la Fig. 1) y GC4 (correspondientes al extremo
carboxi de la región codificante de hGC) se usaron para amplificar
la secuencia de ADNc de hGC usando la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). El cebador GC1 se diseñó para incluir el codón de
iniciación ATG de hGC y para generar un sitio de XbaI en 5'. El
cebador GC4, complementario al ARNm de hGC, no incluye el codón de
terminación para el gen y se diseño para generar un sitio de
restricción EcoRI. El diseño del oligonucleótido GC4 también
corrigió una base alterada en la secuencia de ATCC (GenBank/EMBL nº
M11080), produciéndose así una secuencia de
Arg-Arg-Gln en el extremo 5' del
sitio en el que se insertará un epítopo FLAG^{TM}.
El fragmento de 1,9 kb generado por PCR se
purificó mediante elución en gel de agarosa, se digirió con XbaI y
EcoRI y se ligó en el plásmido similarmente digerido, Bluescript
SK^{-} (Stratagene). Este vector de clonación se eligió debido a
su pequeño tamaño (2,9 kb) y su amplia región de clonación
múltiple.
El promotor MeGA, que comprende un fragmento de
456 pb (Fig. 11) (SEQ ID NO:5) como se modificó a partir del
promotor HMG2 de tomate (Weissenborn y col. 1995, Phys. Plantarum
93:393-400), se usó para dirigir la expresión del
gen de hGC. El promotor MeGA es inducible y tiene una baja expresión
basal en tejidos de plantas sin estrés, pero está altamente
inducido tanto en tejidos inmaduros como maduros mediante el
procedimiento de activación mecánica de genes (MGA), o mediante una
variedad de productos químicos que inducen las respuestas de defensa
de las plantas. La MGA incluye, pero no se limita a, el corte
mecánico en tiras de tejido de las hojas, por ejemplo, en tiras de
2 mm, seguido por el almacenamiento a temperatura ambiente en papel
de cromatografía Whatman 3MM humedecido con agua estéril en una
bolsa de plástico cerrada herméticamente. La expresión de un
constructo MeGA:GUS se ha controlado en plantas de tabaco
transgénicas desde la fase de planta de semillero hasta la
floración y no mostró pérdida de actividad inducible cuando las
plantas alcanzaron la madurez.
El promotor MeGA de 456 pb se amplificó por PCR
usando cebadores que incorporaban un sitio de restricción NotI en
el extremo 5' del fragmento y un sitio XbaI en el extremo 3' del
promotor. Este fragmento también contenía la secuencia líder 5' no
traducida de su secuencia de tomate nativa y, por tanto, proporcionó
todos los elementos de 5' necesarios para la expresión de las
secuencias de hGC fusionadas. Tras la amplificación, el fragmento
se purificó en PAGE, se digirió con NotI y XbaI y se ligó en el
plásmido que contenía la región codificante de hGC, que también se
había digerido con NotI/XbaI, para producir una fusión MeGA:hGC.
Con el fin de facilitar la detección y la
purificación del producto génico de hGC, una secuencia codificante
del epítop FLAG^{TM} se fusionó manteniendo la pauta de lectura al
extremo C de la secuencia codificante de hGC. El epítopo
FLAG^{TM} (IBI) es el octapéptido
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(o DYKDDDDK) (SEQ ID NO:10) diseñado para ser un péptido marcador
hidrófilo situado en una superficie de proteína para facilitar las
interacciones de anticuerpos (Shelness, 1992, Epitope
1:11-17; Hopp y col. 1988, Bio/Tech.
6:1204-1210).
Se sintetizó un oligonucleótido de doble hebra
(Fig. 1) que incorporaba: (a) un sitio de restricción EcoRI en 5'
que crea una fusión que mantiene el marco de lectura con el sitio
EcoRI del extremo C de hGC manipulado; (b) la región codificante
del octapéptido FLAG^{TM}; (c) un codón de terminación tras el
epítopo; y (d) un sitio SstI/EcoRI en 3'. El ADN que codifica
FLAG^{TM} se purificó por PAGE, se digirió con EcoRI y el
fragmento que codifica FLAG^{TM} se insertó en el sitio EcoRI del
plásmido de MeGA:hGC, y se analizó la orientación del inserto.
La fusión de la traducción se analizó mediante
transcripción in vitro usando T3 ARN polimerasa dirigida por
el promotor T3 en el vector pBluescript SK^{-} tras la escisión
del promotor MeGA, y la traducción in vitro en presencia de
^{35}S-metionina usando lisados de reticulocitos
de conejo (BRL). El producto de traducción principal tenía
aproximadamente 56-59 kDa, que coincide con el
tamaño esperado del producto de fusión hGC:FLAG^{TM} (59 kDa).
Además, el constructo de fusión hGC:FLAG^{TM} se secuenció
completamente usando el sistema de
didesoxi-secuenasa (USB). La secuencia de
nucleótidos de la fusión hGC:FLAG^{TM} (SEQ ID NO:3) se muestra
en la Fig. 9; la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:4) se
muestra en la Fig. 10. La construcción alteró el residuo de
aminoácido 545 a una arginina (R) y añadió diez residuos de
aminoácido, que incluyen el octapéptido FLAG^{TM}, al extremo
carboxi de hGC. Véase la Fig. 10.
El constructo de expresión MeGA:hGC:FLAG^{TM}
se cortó del vector pBluescript mediante digestión con SstI y se
ligó en el sitio de restricción correspondiente en la región de
clonación múltiple del vector binario de plantas
pBIB-KAN (Becker, 1990, Nucl. Acids Res. 18:203)
para formar el plásmido CTPro1:hGC:FLAG^{TM}. Como se muestra en
la Fig. 1, la inserción del constructo de expresión
MeGA:hGC:FLAG^{TM} posicionó correctamente un terminador
transcripcional de plantas para el constructo. Además, el vector
binario lleva un gen NPTII dentro del ADN de transferencia
(ADN-T) que permite la selección de células de
plantas transformadas basándose en la resistencia a kanamicina. El
plásmido manipulado se transformó en la cepa DH5\alpha de
E. coli y se analizó la correcta inserción antes de
la movilización a la cepa LBA4404 de Agrobacterium
tumefaciens (Hoekma y col. 1983, Nature
303:179-180).
La transformación mediada por
Agrobacterium (Horsch y col. 1984, Science
223:496-498) se usó para integrar establemente la
secuencia de ADN-T modificada que contenía el
constructo MeGA:hGC:FLAG^{TM} en el genoma de tabaco. Los discos
de hojas cortados de plantas de semillero de tabaco cultivadas
asépticamente (Nicotiana tabacum) cvs. Xanthi (una
variedad no comercial) y VA116 (una variedad comercial curada en
aire caliente) se incubaron brevemente en una suspensión bacteriana
(10^{9} ufc/ml) de A. tumefaciens que contenía el
plásmido manipulado (Fig. 2A) y se cocultivaron en placas que
contenían un cultivo nodriza de células de tabaco cultivadas
durante 48 h. Entonces, los discos de hojas se transfirieron a medio
MS (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant.
15:473-497) que contenía 100 mg/l de kanamicina y
zeatina 9,12 \muM, que es un medio de "formación de brotes"
selectivo que bloquea el crecimiento de bacterias y células de
plantas sin transformar y estimula la formación de brotes (Horsch y
col., supra).
Los brotes se observaron tres semanas
pos-inoculación (Fig. 2B) y se cortaron y se
colocaron en medio de enraizamiento selectivo (100 mg/l de
kanamicina, ácido indol-3-acético 10
\muM en medio MS). Después de 1 semana, las plántulas enraizadas
(Fig. 2C) se transfirieron a tierra orgánica estéril y se colocaron
en el invernadero (Fig. 2D). Los brotes adicionales se cortaron y
enraizaron durante las 4 semanas siguientes sembrándose un total de
45 transformantes individuales (Fig. 2E). La presencia del
constructo génico no pareció tener ningún efecto sobre el
crecimiento o el desarrollo de estos transformantes.
La inserción estable del constructo
MeGA:hGC:FLAG^{TM} se confirmó por análisis por hibridación
genómica de Southern. El ADN total se aisló de tejido de hojas de
ocho regenerantes jóvenes y se digirió con HindIII, que sólo corta
una vez el ADN introducido (véase la Fig. 1). El segundo sitio
HindIII flanquea el ADN introducido y se localiza en el ADN
genómico de la planta. Por tanto, cuando 3' del sitio HindIII se
sondó con secuencias de ADNc de hGC (fragmento de HindIII de 1,7 kb
a partir del vector intermedio pBluescript), cada fragmento debería
tener un tamaño distinto y representar un acontecimiento de
inserción independiente dentro del genoma de la planta.
Cinco de los ocho transformantes putativos
probados mostraron insertos de hGC múltiples (Fig. 3). Cuatro de
estas plantas (X-1, X-8,
X-9 y X-11) se derivaron de la
variedad cultivada Xanthi. Una planta (V-1) se
derivó de la variedad cultivada VA116. El transformante
X-8 tenía menos ADN cargado y mostró dos bandas con
una exposición autorradiográfica más larga. Además, se detectaron
altos niveles de hGC en otros transformantes para los que no se
llevaron a cabo las hibridaciones de Southern, incluyendo una planta
designada X-27.
Como se describe anteriormente, el promotor MeGA
es esencialmente inactivo en hojas no estresadas, pero se activa
por MGA (véase la Fig. 4) o mediante tratamiento con productos
químicos que inducen respuestas de defensa de las plantas. Con el
fin de demostrar que las plantas transgénicas expresan ARNm de
hGC:FLAG^{TM} en el patrón de expresión inducible esperado, el
tejido de plantas transformadas se indujo por MGA, es decir,
cortando en tiras el tejido de hojas en tiras de 2 mm, seguido por
incubación en papel Whatman nº 1 humedecido con agua estéril dentro
de una bolsa de plástico ZipLoc^{TM} y se incubó a temperatura
ambiente durante 24 h. El ARN total se aisló mediante
procedimientos habituales con guanidino-tiocianato
del tejido de hojas de plantas sin transformar y transformadas
inmediatamente con el corte (tiempo 0), o a 24 h después de MGA.
Como se muestra en la Fig. 4, los niveles de
ARNm de hGC:FLAG^{TM} fueron indetectables en hojas de
X-11 al tiempo 0, pero mostraron un aumento marcado
en niveles de transcrito de hGC 24 h después de MGA. Un transcurso
de tiempo más detallado de una segunda planta, V-1,
mostró ARNm detectable antes de 4 h, niveles de ARN máximo a las 24
h y disminuyendo los niveles de ARNm a las 48 h. Además, los niveles
de transcrito aumentaron en respuesta a desencadenantes de defensa
químicos en comparación con MGA. Este patrón de expresión es
exactamente el esperado de un constructo transgénico ligado al
promotor MeGA (Park y col. 1992, Pl. Mol. Biol.
20:327-331; Yang y col. 1991, Pl. Cell
3:397-405).
Como se describe anteriormente, el constructo de
fusión hGC:FLAG^{TM} se diseñó para utilizar el epítopo
FLAG^{TM} para facilitar la detección y la purificación de la
proteína de fusión hGC:FLAG^{TM}. Siete semanas después de
plantarse las plantas en tierra, discos de hojas de 35 plantas de
los 45 transformantes descritos anteriormente se recogieron (y de
ese modo se dañaron) para inducir la expresión transgénica. Los
extractos de los discos de hojas de plantas de control y plantas
transgénicas se colocaron en ranuras sobre membranas de
nitrocelulosa para el análisis por inmunotransferencia puntual. Los
anticuerpos monoclonales (anti-FLAG M2, IBI) contra
el epítopo FLAG^{TM}, conjuntamente con el sistema de detección
quimioluminiscente Western Exposure^{TM} (Clontech, Inc.), se
usaron para probar el material inmunorreactivo. De las 35 plantas
probadas, 25 mostraron expresión transgénica significativa.
El análisis de Western de extractos de hojas
dañadas de plantas sin transformar y plantas transformadas se
probaron para la inmunorreactividad a anticuerpos policlonales
producidos contra hGC (Fig. 5B). Estos anticuerpos no han mostrado
unión a ninguna proteína mamífera distinta de la
\beta-glucosidasa ácida, es decir, la
glucocerebrosidasa de chimpancés. Los extractos de plantas
transgénicas mostraron una fuerte inmunorreactividad mediante una
única banda de proteína con una masa molecular aparente de
aproximadamente 66-69 kDa (Fig. 5B). El tamaño de
la proteína inmunorreactiva se redujo a aproximadamente 58 kDa
después del tratamiento con N-glucanasa, que indica que la
enzima estaba glicosilada. Las inmunotransferencias de Western
análogas sondadas con anticuerpos anti-FLAG^{TM}
mostraron bandas adicionales de masas moleculares similares (Fig.
5A), sugiriendo que tanto el anticuerpo policlonal para hGC como el
anticuerpo anti-FLAG^{TM} reconocen el mismo
producto de proteínas de fusión.
Los tejidos de plantas se probaron para la
actividad de hGC usando un ensayo sensible y conveniente que se
utiliza ampliamente en la investigación de la enfermedad de Gaucher
(Grabowski y col. 1990, en: Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular Biology, 25:385-414, CRC Press, Inc.).
Este ensayo usa el sustrato fluorométrico,
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranósido
(4MuGlc) (el "ensayo con 4MuGlc"). Un aumento en la absorbancia
a 460 nm resulta de la escisión de 4MuGlc e indica la presencia de
actividad enzimática. El 4MuGlc también sirve de sustrato para
\beta-glucosidasas de plantas endógenas que se han
detectado en hojas de plantas tanto de control como transgénicas.
Sin embargo, se usaron varias propiedades diferentes de hGC para
distinguir entre la actividad de glucosidasa endógena y la
actividad de hGC (TABLA 1). Las diferencias en la solubilidad,
junto con el uso del sistema de afinidad
anti-FLAG^{TM} para la purificación de
hGC:FLAG^{TM}, se emplearon para solucionar el problema de
separar hGC:FLAG^{TM} de las \beta-glucosidasas
de plantas endógenas (Tabla 2, Fig. 8).
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Con el fin de determinar la mejor duración del
tiempo de incubación pos-MGA para el rendimiento
óptimo de la proteína de hGC:FLAG^{TM} y la actividad enzimática
de hGC, los extractos se analizaron a partir de hojas transgénicas
a 0, 2, 4, 8, 16 y 24 h pos-MGA. El tejido de planta
(0,5 g) se molió usando nieve carbónica y un molinillo de granos de
café. Para solubilizar el hGC:FLAG^{TM}, el tejido molido se
resuspendió en 1,0 ml de tampón de extracción que contenía citrato
de sodio 25 mM, pH 7,0, taurocolato de sodio al 1% (p/v),
\beta-mercaptoetanol 4 mM y EDTA 5 mM. El
homogeneizado se congeló en un baño de nieve carbónica/etanol
durante 30 min y se descongeló a 4ºC durante 2 h. Se repitió este
procedimiento de congelación-descongelación. Los
restos de células se sedimentaron a 14.000 x g durante 15 min a 4ºC.
El sobrenadante sin células se recogió y llevó a glicerol al 40%
(v/v) con el fin de inhibir la desnaturalización de la proteína de
hGC:FLAG^{TM}.
El análisis de Western se llevó a cabo en 10
\mug de proteína soluble a partir de extractos de hojas para
probar la inmunorreactividad a anticuerpos policlonales producidos
contra hGC (Fig. 5B) y anticuerpos monoclonales contra el epítopo
FLAG^{TM} (Fig. 5A). El mayor nivel de inducción de la proteína de
hGC:FLAG^{TM} se produjo entre 8 y 12 h
pos-MGA.
Para determinar el tiempo óptimo
pos-MGA para obtener el mayor nivel de actividad
enzimática de hGC, 0,1 \mug de extractos de hojas se ensayaron
usando el ensayo con 4MuGlc. La mayor actividad de hGC se encontró
en extractos a partir de 12 h pos-daño del tejido
(Fig. 6).
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Cuarenta gramos de tejido
pos-dañado (12 h) se molieron para dar un fino polvo
usando nieve carbónica y un molinillo de granos de café. Se
añadieron cien ml de tampón de extracción y la muestra se transformó
en una suspensión usando un Polytron (Brinkman Scientific). El
extracto se congeló en un baño de nieve carbónica/etanol durante 1
h y se descongeló durante 16 h a 4ºC. Los restos de células se
sedimentaron a 14.000 x g durante 30 min. El sobrenadante se filtró
a través de 4 capas de estopilla y el filtrado se guardó. Una
alícuota de 1 ml se almacenó en glicerol al 40% (v/v) para la
posterior determinación de la proteína y la actividad enzimática de
hGC, mientras que gradualmente se añadió sulfato de amonio (AS) con
agitación al filtrado restante hasta la concentración final del 33%
(p/v) y se incubó a 4ºC durante 1 h. El homogeneizado se aclaró por
centrifugación a 14.000 x g durante 30 min. El sobrenadante se
dializó durante toda la noche a 4ºC contra el siguiente tampón:
citrato de sodio 0,1 M, pH 6,0,
\beta-mercaptoetanol 4 mM y EDTA 5 mM. El
sobrenadante se clarificó por centrifugación a 14.000 x g durante
30 min. El sobrenadante aclarado se concentró (Amicon, filtros YM30)
hasta un volumen final de 5 ml, y 0,5 ml del sobrenadante de AS
concentrado se guardaron para el análisis de la proteína y la
actividad enzimática de hGC. El hGC:FLAG^{TM} en 1 ml de
sobrenadante concentrado se purificó por cromatografía de afinidad
usando una columna de afinidad anti-FLAG^{TM}.
Para utilizar el epítopo FLAG^{TM} para la
purificación de la proteína de hGC:FLAG^{TM}, 1 ml de extracto de
hojas preparado como anteriormente se aplicó a un 1 ml de columna de
afinidad anti-FLAG^{TM} M2. La columna se
equilibró previamente con solución salina tamponada con fosfato
(PBS; 50 mM, pH 6,4) que contenía glicerol al 10% y
\beta-mercaptoetanol 4 mM a 4ºC. Después de varios
lavados con PBS, la proteína de hGC:FLAG^{TM} unida se eluyó con
tres alícuotas de 1 ml de péptido FLAG^{TM} purificado (IBI), es
decir, 1 ml a 500 \mug/ml, seguido por 2 x 1 ml a 250 \mug/ml.
El material eluido se transfirió por ranuras sobre una membrana de
nitrocelulosa y se probó para la inmunorreactividad al anticuerpo
anti-FLAG^{TM} M2, y se analizó por
SDS-PAGE y se tiñó con azul de Coomassie para
determinar la pureza relativa (Fig. 7A). El material no
inmunorreactivo se eluyó en la primera fracción ya que la liberación
de la proteína de hGC:FLAG^{TM} unida requiere el equilibrado con
el péptido. Como consecuencia, la segunda y tercera fracciones
eluidas contuvieron la mayoría del material inmunorreactivo. El
análisis por SDS-PAGE de proteína de hGC:FLAG^{TM}
purificada con anti-FLAG^{TM} mostró una única
banda que migraba conjuntamente con la proteína inmunorreactiva
anti-FLAG^{TM} (Fig. 7A).
Con el fin de utilizar las propiedades de los
glicanos presentes en la proteína de hGC:FLAG^{TM} para fines de
purificación, la proteína de hGC:FLAG^{TM} también se aisló usando
una columna de afinidad por concanavalina A (ConA) (Sigma). El
extracto de tejido concentrado (1,5 ml) se cargó sobre un volumen de
lecho de 1,5 ml de ConA en tampón de columna (citrato de sodio 0,1
M a pH 6,5, cloruro sódico 0,15 M). Se añadió un volumen igual de
tampón de columna al extracto concentrado y se pasó por la columna
dos veces a 4ºC. La columna de ConA se lavó tres veces con tampón
de columna usando tres veces el volumen de tampón del lecho. La
hGC:FLAG^{TM} unida se eluyó con 5 ml de
\alpha-D-manopiranósido de metilo
0,1 M (Sigma) seguido por 5 ml de
\alpha-D-manopiranósido de metilo
1 M. Las fracciones se recogieron y se ensayaron para el contenido
de proteínas y la actividad enzimática de hGC. Todas las fracciones
que contenían actividad enzimática de hGC se concentraron (Amicon,
filtros YM30) a un volumen final de 0,5 ml. Para estabilizar la
actividad enzimática de hGC de la proteína de hGC:FLAG^{TM}, el
extracto concentrado se preparó al 40% (v/v) en glicerol y se
almacenó a 4ºC. El análisis en SDS-PAGE de la
proteína de hGC:FLAG^{TM} purificada con ConA (Fig. 7B) mostró
una banda que migraba a 66-69 kd y tres bandas de
menor masa molecular que se tiñeron igualmente con azul de
Coomassie.
La determinación de la actividad enzimática y de
proteína de fracciones de cada etapa en la purificación indica que
el procedimiento más eficaz para purificar hGC:FLAG^{TM} era
emplear cromatografía de afinidad por
anti-FLAG^{TM} seguida por la cromatografía de
afinidad por ConA (véanse la Tabla 2 y las Figs.
7A-B).
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\vskip1.000000\baselineskip
Puede hacerse una estimación de la cantidad de
hGC:FLAG^{TM} extraída por g de peso fresco de tejido de plantas
de tabaco o por mg de proteína soluble a partir del análisis por
transferencia por ranuras de Western de extractos crudos iniciales
usando anti-FLAG^{TM}. Se extrajeron
aproximadamente 2 mg/ml de proteína soluble por 0,5 g de peso
fresco de tejido de plantas. El análisis por transferencia por
ranuras de Western de 1 \mul de extracto crudo indica la
presencia de aproximadamente 0,5 a 0,6 \mug de hGC:FLAG^{TM}
(Fig. 8). Basándose en estos resultados, una única planta de tabaco
madura que comprende aproximadamente 1,6 kg de peso fresco de
tejido contendrá aproximadamente 2,5 g de hGC:FLAG^{TM} por
planta. Por consiguiente, un acre estándar de tabaco plantado con
6.000 plantas podría producir potencialmente 15 kg de
hGC:FLAG^{TM} (Tabla 3).
Las subsecciones a continuación describen la
producción de \alpha-L-iduronidasa
(IDUA) humana recombinante enzimáticamente activa en plantas de
tabaco transgénicas.
La primera etapa en la construcción del vector
de transformación de plantas deseado era generar la región
codificante de IDUA humana con sitio de restricción flanqueante
apropiado para facilitar la fusión a promotores de plantas
específicos y la inserción en vectores de transformación de plantas.
E. Neufeld (Universidad de California, Los Angeles) proporcionó un
clon de ADNc de IDUA humana de longitud completa. En este clon, la
secuencia de ADNc de IDUA se insertó en el sitio EcoRI del plásmido
pBS (Moskowitz y col. 1992, FASEB J. 6:A77; Murray, 1987, Methods
in Enzymol. 149:25-42). Esta secuencia de ADNc de
IDUA se ha expresado en líneas de células animales (Moskowitz y
col. 1992, supra, 1987, supra) y muestra que contiene
toda la información necesaria para producir IDUA enzimáticamente
activa (Murray, 1987, supra). El ADNc de IDUA codifica una
proteína de 653 aminoácidos (66 kDa) que incluye el péptido señal 26
del extremo amino que se escinde cuando pasa por la membrana del
ER. Para ayudar en la inserción del ADNc de IDUA en el vector de la
planta, se introdujeron sitios únicos XbaI y SacI flanqueantes por
PCR usando en 5' el cebador ID1 y en 3' el cebador ID2, Pfu
polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA); como se muestra en la Figura
12. El fragmento de 1,9 kb generado por PCR se purificó por
electroforesis en gel de agarosa, se digirió con XbaI y SacI y se
ligó en pBS y pSP64poliA (Gibco, un vector para la
transcripción/traducción in vitro). La secuencia codificante
de IDUA amplificada por PCR se secuenció antes de la inserción en
los constructos de expresión. Las secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos deducidas de la secuencia codificante de IDUA
amplificada se muestran en las Figs. 19 (SEQ ID NO:8) y 20 (SEQ ID
NO:9), respectivamente. La secuencia codificante de IDUA amplificada
por PCR se diferencia de la originalmente publicada por E. Neufeld
en las posiciones 931 y 932. La secuencia de IDUA amplificada por
PCR tiene el dinucleótido CG en lugar del GC original en esas
posiciones. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos deducida
de la IDUA amplificada por PCR tiene un residuo de glutamato en
lugar de una glutamina en la posición 282. La transcripción in
vitro de la secuencia de IDUA amplificada por PCR en un vector
pSP64poliA:IDUA y la traducción in vitro mediada por lisados
de reticulocitos de conejo del transcrito resultante produjeron
proteína que tenía una masa molecular esperada para IDUA.
La región codificante de IDUA amplificada por
PCR se insertó en 5' de dos promotores de plantas regulados de
forma distinta: 1) el promotor MeGA y 2) el promotor 35S^{ENH}.
Como se trató anteriormente, el promotor MeGA muestra poca o
ninguna expresión en la mayoría de los tejidos de plantas, pero es
fuertemente inducible dando como resultado una acumulación
significativa de producto transgénico 12 a 48 horas después de la
inducción del promotor MeGA. El promotor 35S^{ENH} es un promotor
constitutivo de alto nivel ampliamente usado que está constituido
por un promotor 35S de CaMV modificado que contiene un potenciador
doble que se fusiona a un potenciador de traducción a partir del
virus del mosaico del tabaco. Véase Cramer y col. 1996,
"High-Level of Enzymatically Active Human
Lysosomal Proteins in Transgenic Tobacco", Transgenic Plants:
A production System for Industrial and Pharmaceutical Proteins,
eds. Owens & Pen, John Wiley & Sons; Chrispeels, 1991, Annu.
Rev. Plant Physiol. Plan. Biol. 42:21-53; y Haskins
y col. 1979, Pediat. Res. 13:1294-1297. Cada
promotor se ligó como un fragmento HindIII-XbaI en
5' del ADNc de IDUA (véase la Figura 12).
Durante las etapas de subclonaje y de análisis
de vectores, los transformantes bacterianos que tenían cualquier
vector que contenía el extremo 5' del ADNc de IDUA se recuperaron a
frecuencias inferiores a las esperadas. Por ejemplo, se requirieron
múltiples ligaciones y transformaciones de células DH5\alpha de
E. coli competentes con pBS que contenían el ADNc de
IDUA amplificado por PCR de 1,9 kb para generar menos de 100
transformantes. Entre los 70 transformantes analizados por análisis
de restricción del ADN del plásmido, sólo 2 clones contuvieron el
fragmento de 1,9 kb de tamaño apropiado. Uno de los dos clones se
secuenció y se halló que contenía la secuencia codificante de IDUA
completa. Se redujo el tamaño de la colonia de transformante que
contenía IDUA. Estas eficiencias reducidas fueron independientes del
vector plasmídico, la presencia o ausencia de promotor de plantas,
la expresión de IDUA (sin fusionar al promotor bacterianamente
activo) o el huésped bacteriano. El subclonaje independiente del
extremo 3' frente al 5' del ADNc de IDUA localizó una región
"odiosa" en el extremo 5' de la secuencia de IDUA. La
estructura secundaria de ADN o el alto contenido de GC de esta
región pueden producir intolerancia en organismos heterólogos. Este
efecto del extremo 5' del ADNc de IDUA también ha sido notificado
en sistemas de expresión en levaduras y en células animales. Sin
embargo, estas limitaciones en la transformación de la secuencia de
IDUA no impidieron el aislamiento y la caracterización
satisfactorios de los constructos de transformación y expresión de
IDUA
deseados.
deseados.
Para ambos constructos de promotores, las
fusiones de ADNc de promotor:IDUA se cortaron como fragmentos de
HindIII/SacI y se ligaron en pBIB-KAN digerido con
HindIII y SacI (Figura 12). pBIB-Kan es un vector de
transformación de plantas grande (> 13 kb) que proporciona una
señal de terminación/poliadenilación (pAnos) para el transgén
introducido, un marcador de selección (NPTII o resistencia a
kanamicina) para células de plantas transformadas y secuencias de
borde de ADN-T que delimitan el ADN que va a
transferirse (Becker, 1990, Nucl. Acids Res. 18:203). Los vectores
recombinantes se propagaron en E. coli y se
caracterizaron completamente antes de la transferencia a
Agrobacterium tumefaciens. Un vector pBIB-KAN
que contiene el constructo de expresión MeGA:IDUA usado en la
transformación de ADN-T de plantas es pCT22.
La transformación mediada por
Agrobacterium se usó para integrar establemente los
constructos 35S^{ENH}:IDUA y MeGA:IDUA en el genoma de tabaco. Se
cortaron aproximadamente 80 discos de hojas de plantas de semillero
Nicotiana tabacum cvs. Xanthi cultivadas asépticamente para
cada constructo génico y se inocularon con cultivos en suspensión
de cepas de A. tumefaciens que contenían los vectores de
expresión/transformación de IDUA. Tras un periodo de cocultivo de
48 horas, los discos de hojas se transfirieron a medio de selección
que contenía kanamicina y hormonas que promueven la formación de
brotes. Aunque generalmente aparecen numerosos brotes
(4-10 por disco) 2-3 semanas después
de la transferencia al medio de selección, los brotes transformados
con IDUA aparecieron tarde, es decir, después de 3-5
semanas, y fueron pocos en número (0-1 por disco).
La inducción de la formación de raíces también se retrasó en los
brotes transformados con IDUA en comparación con brotes que
contenían otros constructos transgénicos. Un rendimiento final de
siete plántulas de 35S^{ENH}:IDUA y diez de MeGA:IDUA se
transfirieron a la tierra. Una vez en la tierra, todas las plantas
llegaron a la madurez con morfología normal, floración y producción
de semillas. Las progenies que expresaban IDUA mostraron un ligero
retraso en el crecimiento temprano (Fig. 13B), pero en la madurez
plena fueron indistinguibles en tamaño y aspecto de las plantas sin
transformar.
Las plantas transgénicas se seleccionaron
inicialmente basándose en la resistencia a kanamicina. La inserción
estable del constructo génico MeGA:IDUA se confirmó por análisis por
hibridación genómica de Southern. El ADN total se aisló de tejido
de hojas de nueve plantas transgénicas y se digirió con HindIII y se
analizó por hibridación de Southern usando el ADNc de IDUA como
sonda. Los nueve transformantes putativos analizados mostraron de
una a tres copias del inserto de IDUA y ninguna indicación de
reordenamientos o deleciones. Este número de copias de transgenes
es típico de tabaco transgénico manipulado con otros constructos
mediante Agrobacterium.
Los anticuerpos preparados para la IDUA nativa y
desnaturalizada a partir de células CHO se obtuvieron de E. Kakkis
(Harbor-UCLA Medical Center, Los Angeles, CA).
Mediante análisis por inmunotransferencia por ranuras y de Western
en SDS-PAGE se encontró que los anticuerpos no
reaccionaban con ninguna proteína en extractos de tejido de tabaco
transgénico sin transformar o (sólo transformados con el vector)
pBIB-Kan a partir de tejido de hojas sin inducir o
inducido. Cuando la IDUA purificada de células CHO se sembró en
extractos de tabaco sin transformar, no hubo disminución en el
nivel de IDUA detectada con respecto al detectado en el tampón de
extracción que contenía la misma concentración de IDUA purificada.
Este hallazgo indica que el extracto de tabaco no inhibe la
inmunodetección de IDUA.
Se recogieron tejidos de hojas de siete plantas
transgénicas independientes, se homogeneizaron en un volumen 3X de
tampón de extracción (PBS con Triton X100 al 0,1%, PMSF 200 \muM,
pepstatina 1 \muM, leupeptina 4 \muM) y los extractos se
clarificaron de restos de células por centrifugación a 12.000 X g
durante 30 min. Veinticinco \mug de proteína soluble total de
cada extracto se desnaturalizaron con calor y se colocaron en
ranuras sobre membrana OPTITRAN (S&S). Se añadió proteína de
IDUA purificada en cantidades que oscilaban de 20 ng a 400 ng a la
membrana para servir de patrones de comparación. Basándose en la
detección de anticuerpos usando quimioluminiscencia, no se encontró
proteína de IDUA inmunorreactiva en los extractos de ninguna de las
plantas transgénicas de 35S^{ENH}:IDUA. Este promotor constitutivo
también expresó escasamente la proteína C humana (< 0,02% de
proteína soluble). Basándose en estos hallazgos, las plantas que
contenían 355^{ENH}:IDUA no se analizaron adicionalmente.
El promotor MeGA es inactivo en hojas de tabaco
en ausencia de inducción. Para obtener la expresión de IDUA, las
hojas se recogieron, se indujeron mediante daño mecánico y se
incubaron a temperatura ambiente bajo alta humedad (es decir, las
hojas dañadas se envolvieron en papel de filtro húmedo en bolsas
cerradas herméticamente o se estratificaron en un recipiente con
tampón cuidadosamente agitado sobre el tejido) para permitir la
síntesis de novo del producto transgénico. En un cribado
inicial de diez plantas que contenían MeGA:IDUA, los extractos de
tejido se usaron para análisis por inmunotransferencia puntual por
ranuras (véase anteriormente). Los extractos mostraron poco o
ningún contenido de IDUA para todas las plantas. Los posteriores
análisis revelaron que la IDUA se secretó a partir de las hojas y
se filtró sobre el papel de filtro durante la etapa de incubación.
Esto era algo sorprendente porque la recuperación de proteínas
extracelulares de hoja intacta requiere generalmente infiltración
de tampón inducida por vacío de la hoja (véase Parent & Asselin,
1987, Can. J. Bot. 62:564-569; Regalado &
Ricardo, 1996, Plant Physiol. 110:227-232). Como se
describe más adelante, el procedimiento de expresión se modificó
posteriormente para incluir una etapa de incubación
pos-inducción que implicara una rotación suave del
tampón alrededor del tejido dañado que permitiera la recuperación de
proteína de IDUA y la actividad en el tampón de incubación. Los
posteriores análisis se centraron principalmente en una planta,
IDUA-9, también conocida como
CT40-9, ya que las pruebas preliminares muestran
niveles detectables de actividad de IDUA y material inmunorreactivo
de anti-IDUA. La IDUA-9 contiene 3
copias del constructo MeGA:IDUA.
Con el fin de demostrar la inducción del
promotor MeGA y la acumulación de ARNm de IDUA, el ARN total se
aisló (Rutter, 1981, J. Biol. Chem. 91:468-478) de
hojas de IDUA-9 antes y después de la inducción.
Como se muestra en la Figura 14A, el ARNm de IDUA del tamaño
esperado (aproximadamente 2,2 kb) se detectó a bajos niveles
basales en tejido sin inducir y mostró un aumento marcado 8 h
pos-inducción y alcanzó un nivel máximo 27 h
pos-inducción. Este patrón es similar a la cinética
de inducción de transgenes vista con otros constructos dirigidos
por MeGA (por ejemplo, hGC:FLAG^{TM}). Las especies de ARN
hibridantes más pequeñas también se acumularon después de la
inducción. No se han detectado ARN de masa molecular inferior
análogos en plantas que expresan hGC:FLAG^{TM} y pueden ser
únicos para la planta IDUA-9 o una consecuencia de
la secuencia de IDUA.
Los tejidos de IDUA-9 inducidos
también se usaron para extractos de proteínas. Los análisis por
transferencia de Western mostraron que la IDUA derivada de CHO y la
IDUA de tejido de tabaco migraron de forma muy parecida en
SDS-PAGE (Figura 14B). La IDUA (92 kD) de extracto
de tabaco de IDUA-9 migró ligeramente más rápido que
la IDUA secretada de las células CHO. Esto es supuestamente debido
a las diferencias en la composición de glicanos. Sin embargo, la
similitud en el tamaño sugiere que la IDUA recombinante producida en
el tabaco también estaba glicosilada.
Como se trató anteriormente, las células CHO
secretan IDUA recombinante al medio. Para determinar si el tabaco
también secreta IDUA recombinante al medio, el tejido de hojas de
plantas IDUA-7, -8 y -9 transgénicas se indujo
durante 0 a 34 h y se colocó en una placa de Petri de plástico con
tampón de incubación (PBS). A 0 h, el tampón de incubación se usó
para lavar el tejido inducido y el lavado se almacenó congelado. El
tampón recientemente preparado se añadió al tejido inducido y se
incubó a temperatura ambiente. A 8 h, el tampón se eliminó y se
congeló. Se añadió tampón recientemente preparado al tejido inducido
y se incubó adicionalmente. El tampón se eliminó 24 h
pos-inducción. Se añadió tampón recientemente
preparado al tejido inducido y se incubó adicionalmente. El tampón
de incubación final se eliminó 34 h pos-inducción y
un extracto de tejido se preparó a partir del tejido de hojas
incubado. Se hirvieron cincuenta \mul de cada tampón de incubación
y extracto de tejido y se colocaron en ranuras sobre membrana
OPTITRAN. También se transfirió un intervalo de proteína de IDUA de
control de 0 a 40 ng y la IDUA se detectó usando anticuerpos
anti-IDUA. Como se muestra en la Figura 15, la
proteína de IDUA estaba presente en el tampón de incubación tras la
inducción en los tres tejidos transgénicos analizados. Esto indica
que el tabaco transgénico secreta IDUA después de la síntesis.
Uno de los factores más críticos en la
evaluación de la utilidad de la IDUA recombinante sintetizada en
plantas es si la IDUA es enzimáticamente activa. La actividad
enzimática de hidrolasas lisosómicas humanas requiere la
glicosilación y el plegamiento apropiados y los sistemas de
expresión heterólogos frecuentemente dan como resultado la
degradación localizada en el retículo endoplásmico o la acumulación
de agregados insolubles e inactivos. Para determinar si la IDUA
recombinante sintetizada en hojas transgénicas tiene actividad
enzimática, se usó un ensayo fluorométrico sensible usando el
sustrato
4-metilumbeliferil-\alpha-L-idurónido
(4-MUI) (Calbiochem, La Jolla, CA) (véase Neufeld,
E.F. 1991, Ann. Rev. Biochem. 60:257-280). Se mostró
que los extractos de tabaco sin transformar no contenían actividad
de IDUA endógena. Cuando la IDUA recombinante derivada de CHO se
sembró en extractos crudos de hojas de tabaco sin transformar, no se
encontró inhibición detectable de la actividad. Cuando los
extractos de tejido de planta transgénica IDUA-9 se
ensayaron, los extractos mostraron actividad de IDUA a niveles
reproducibles, pero relativamente bajos (0,2 a 0,4 nmoles de
4-MU/h/g de tejido). Esto confirma que el tabaco
tiene toda la maquinaria necesaria para sintetizar y procesar IDUA
en una forma activa. De acuerdo con la distribución de IDUA
mostrada por inmunodetección, las actividades de IDUA
significativamente mayores se detectaron en la fracción secretada
como se describe más adelante.
Una parte significativa de la IDUA recombinante
producida en tabaco transgénico se recuperó en el tampón de
incubación tras la inducción del constructo génico MeGA:IDUA (Fig.
15). Se determinó la localización de la mayoría de la IDUA activa
después de la inducción e incubación. Esto se hizo comparando la
actividad de IDUA y la inmunorreactividad anti-IDUA
del extracto de tejido con la del tampón de incubación. Como se
muestra en la Figura 16, había niveles mucho más altos de actividad
de IDUA en el tampón de incubación que en el extracto de tejido
después de la inducción e incubación. Además, la actividad de IDUA
en el tampón de incubación mostró una fuerte correlación con la de
la cantidad de material inmunorreactivo anti-IDUA
hallado en el tampón de incubación, como se revela por los datos
presentados en la Fig. 15. Por tanto, el tabaco transgénico que
expresa IDUA secreta la mayoría de su IDUA activa (aproximadamente
el 67%) en el tampón de incubación después de la inducción e
incubación.
Basándose en ensayos de actividad y análisis de
Western, la actividad específica de la IDUA secretada se estimó que
era aproximadamente 64 U/\mug de proteína. En comparación, la
enzima de IDUA purificada a partir de células CHO manipuladas tiene
una actividad específica de aproximadamente 242 U/\mug de
proteína.
La variación en los niveles de expresión
transgénica es muy común en plantas transgénicas debido a efectos
``posicionales producidos por el sitio de inserción del transgén
dentro del genoma huésped. Se examinaron los niveles de actividad
de IDUA en tres plantas transgénicas que expresan IDUA
independientes (es decir, IDUA-7,
IDUA-8 e IDUA-9). Entre estas
plantas transgénicas, la IDUA-9 tiene la mayor
actividad de IDUA (Fig. 17). La cantidad relativa de IDUA activa
que queda en la célula, como se refleja por la actividad presente en
el extracto de tejido, después de 34 h de incubación osciló del 14%
al 35% de la actividad total (Fig. 17).
Las tres plantas transgénicas anteriormente
identificadas se identificaron en un cribado de aproximadamente
cincuenta plantas independientemente transformadas. Esto es un
cribado a escala relativamente pequeña. Es razonable esperar que
los cribados a mayor escala de plantas manipuladas con IDUA
proporcionen plantas que producirán IDUA activa a niveles
superiores a los de las plantas desveladas en este documento.
El rendimiento de la IDUA recombinante a partir
de IDUA-9 se estimó que era aproximadamente 6
\mug/g de tejido fresco. Este cálculo aproximado se basó en el
material presente en el tampón de incubación después de 34 h de
incubación (véase la Fig. 18). Sin embargo, ni el procedimiento de
inducción ni el de recuperación de IDUA usado se optimizó. Por
tanto, es probable que puedan obtenerse mayores rendimientos de IDUA
mediante la optimización de los procedimientos de inducción y
recuperación. Debe observarse que las plantas de tabaco
transgénicas dieron un promedio superior a 1 kg de peso fresco de
hoja en la madurez, y que las hojas pueden recolectarse
periódicamente de plantas cultivadas en invernadero durante más de
un año. Por consiguiente, el cultivo de plantas de tabaco
transgénicas tanto en el campo como en el invernadero ofrece un
medio conveniente y eficaz para producir grandes cantidades de
IDUA.
Un segmento del extremo 3' de la secuencia
codificante de hGC se amplificó por PCR a partir del clon de ADNc
en E. coli ATCC65696 (véase la Sección 6.1.1. supra)
usando como cebador en 5' GC23 oligo, 5'GCCTATGCTGAG
CACAAGTTACAG3' (SEQ ID NO:11), cuyo extremo 5' se corresponde con el nucleótido 894 de la secuencia de hGC:FLAG mostrada en la Fig. 9, y como cebador en 3' GC37 oligo, cuya cadena complementaria tiene la secuencia 5'TTCCTTGAGCTCGtcaCTGGCGACGCCACAGGTA3' (SEQ ID NO:12), un sitio de restricción SacI se muestra subrayado y en minúscula se muestra un codón de terminación que conserva la pauta de lectura con la secuencia codificante de hGC amplificada. El sitio del cebador en 5' en la secuencia codificante de hGC está en 5' de un sitio de restricción SalI. Por consiguiente, el ADN amplificado se cortó con SalI y SacI y el fragmento SalI/SacI que contenía el extremo 3' de la secuencia codificante de hGC se insertó en el vector intermedio pBS que contenía el constructo de expresión MeGA:hGC:FLAG^{TM} (véase la Fig. 1 y la Sección 6.1.2. supra) que se había cortado con SalI y SacI. Se identificaron clones que habían sustituido el extremo 3' del constructo MeGA:hGC:FLAG^{TM} por el extremo 3' de la secuencia codificante de hGC dando un constructo de expresión MeGA:hGC. Esta construcción eliminó la adición de diez aminoácidos en el extremo carboxilo y corrigió la sustitución de aminoácidos en el residuo 545 en la fusión hGC:FLAG^{TM}, reconstruyéndose así una secuencia codificante de hGC sin modificar. El constructo de expresión MeGA:hGC se cortó del vector intermedio pBS mediante digestión con SacI y se insertó en el pBIB-KAN para formar el vector de transformación pCT54. En la Fig. 21 se muestra un esquema de la construcción del vector pCT54.
CACAAGTTACAG3' (SEQ ID NO:11), cuyo extremo 5' se corresponde con el nucleótido 894 de la secuencia de hGC:FLAG mostrada en la Fig. 9, y como cebador en 3' GC37 oligo, cuya cadena complementaria tiene la secuencia 5'TTCCTTGAGCTCGtcaCTGGCGACGCCACAGGTA3' (SEQ ID NO:12), un sitio de restricción SacI se muestra subrayado y en minúscula se muestra un codón de terminación que conserva la pauta de lectura con la secuencia codificante de hGC amplificada. El sitio del cebador en 5' en la secuencia codificante de hGC está en 5' de un sitio de restricción SalI. Por consiguiente, el ADN amplificado se cortó con SalI y SacI y el fragmento SalI/SacI que contenía el extremo 3' de la secuencia codificante de hGC se insertó en el vector intermedio pBS que contenía el constructo de expresión MeGA:hGC:FLAG^{TM} (véase la Fig. 1 y la Sección 6.1.2. supra) que se había cortado con SalI y SacI. Se identificaron clones que habían sustituido el extremo 3' del constructo MeGA:hGC:FLAG^{TM} por el extremo 3' de la secuencia codificante de hGC dando un constructo de expresión MeGA:hGC. Esta construcción eliminó la adición de diez aminoácidos en el extremo carboxilo y corrigió la sustitución de aminoácidos en el residuo 545 en la fusión hGC:FLAG^{TM}, reconstruyéndose así una secuencia codificante de hGC sin modificar. El constructo de expresión MeGA:hGC se cortó del vector intermedio pBS mediante digestión con SacI y se insertó en el pBIB-KAN para formar el vector de transformación pCT54. En la Fig. 21 se muestra un esquema de la construcción del vector pCT54.
El Agrobacterium que contenía pCT54 se
usó para transformar plantas y las plantas de tabaco transgénicas
que contenían el constructo de expresión MeGA:hGC se produjeron
según procedimientos descritos anteriormente. Las plantas de tabaco
transgénicas que contenían el constructo de expresión MeGA:hGC se
identificaron y se les asignó las designaciones
CT54-1 a -40. Los análisis de la actividad
enzimática de hGC y la presencia de hGC en los tejidos inducidos de
plantas transgénicas se llevaron a cabo usando el ensayo enzimático
descrito en la Sección 6.2.5. y el análisis por transferencia de
Western usando anticuerpos anti-hGC descritos en la
Sección 6.2.6. La purificación de la hGC producida en tejido de
tabaco transgénico se lleva a cabo usando el procedimiento descrito
en la Sección 6.3., excepto que se omitió la etapa de cromatografía
de afinidad por anti-FLAG^{TM}, cuyo
procedimiento se modifica adicionalmente según las estrategias y
procedimientos conocidos en la técnica para purificar la enzima de
hGC.
Los siguientes materiales biológicos se han
depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) en
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. 20852, en cumplimiento con los
requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes en las fechas indicadas a
continuación y se les asignó los números de acceso de ATCC indicados
a continuación.
La presente invención no va a limitarse en
alcance por el material biológico depositado ya que se pretende que
las realizaciones depositadas sean ilustraciones de los aspectos
individuales de la invención, y cualquier material biológico, o
constructos que sean funcionalmente equivalentes, están dentro del
alcance de esta invención. De hecho, diversas modificaciones de la
invención, además de aquellas mostradas y descritas en este
documento, serán evidentes para aquellos expertos en la materia a
partir de la anterior descripción y los dibujos adjuntos. Tales
modificaciones pretenden entrar dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
<110> Virginia Tech Intellectual Property,
Inc.
\hskip1cmCroptech Development Corp.
\hskip1cmRadin, David N.
\hskip1cmCramer, Carole L.
\hskip1cmOishi, Karen K.
\hskip1cmWeissenborn, Deborah L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LISOSÓMICAS EN
SISTEMAS DE EXPRESIÓN BASADOS EN PLANTAS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P08216EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 96931569.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
13-09-1996
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/003.737
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
14-09-1995
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1642
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo de hGC:FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión de hGC:FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 463
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor MeGA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
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<400> 6
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2067
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de IDUA amplificada por
PCR
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 653
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de IDUA
amplificada por PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epítopo FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
Claims (44)
1. Un procedimiento para producir una enzima
lisosómica enzimáticamente activa o enzima lisosómica modificada
enzimáticamente activa en una planta transgénica que comprende:
(a) cultivar la planta transgénica que comprende
un constructo de expresión recombinante que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica una secuencia que codifica la enzima
lisosómica o enzima lisosómica modificada y un promotor que regula
la expresión de la secuencia de nucleótidos de manera que la enzima
lisosómica o enzima lisosómica modificada se expresa a partir del
constructo de expresión por la planta transgénica; y
(b) recuperar la enzima lisosómica o enzima
lisosómica modificada a partir de un órgano de la planta
transgénica;
en el que la enzima lisosómica modificada tiene
la secuencia de aminoácidos de la enzima lisosómica con una o
varias sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácido y el
órgano es una hoja, tallo, raíz, flor, fruto o semilla.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el promotor es un promotor inducible y cuyo procedimiento
comprende adicionalmente, entre las etapas (a) y (b), la etapa de
inducir el promotor inducible antes o después de recolectar la
planta transgénica.
3. El procedimiento según la reivindicación 2,
en el que el promotor inducible se induce por la activación
mecánica de genes.
4. El procedimiento según la reivindicación 3,
en el que el promotor inducible comprende la SEQ ID NO NO:5.
5. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la enzima lisosómica modificada comprende un péptido
marcador detectable fusionado con el extremo amino o carboxilo de la
enzima lisosómica.
6. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que el péptido marcador detectable comprende la SEQ ID NO:
10.
7. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la planta transgénica es una planta de tabaco
transgénica.
8. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 4 y 7, en el que la enzima lisosómica o enzima
lisosómica modificada es una enzima lisosómica humana o enzima
lisosómica humana modificada.
9. El procedimiento según la reivindicación 8,
en el que la enzima lisosómica humana o enzima lisosómica humana
modificada es una glucocerebrosidasa, glucocerebrosidasa modificada,
\alpha-L-iduronidasa o
\alpha-L-iduronidasa
modificada.
10. Un constructo de expresión recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima
lisosómica o enzima lisosómica modificada enzimáticamente activa y
un promotor que regula la expresión de la secuencia de nucleótidos
en una célula de planta, en el que la enzima lisosómica modificada
tiene la secuencia de aminoácidos de la enzima lisosómica con una o
más sustituciones, adiciones y/o deleciones de amino-
ácido.
ácido.
11. El constructo de expresión recombinante de
la reivindicación 10, en el que el promotor es un promotor
inducible.
12. El constructo de expresión recombinante de
la reivindicación 11, en el que el promotor inducible está inducido
por la activación mecánica de genes.
13. El constructo de expresión recombinante de
la reivindicación 12, en el que el promotor inducible comprende la
SEQ ID NO:5.
14. El constructo de expresión recombinante de
la reivindicación 10, en el que la enzima lisosómica modificada
comprende un péptido marcador detectable fusionado con el extremo
amino ácido o carboxilo de la enzima lisosómica.
15. El constructo de expresión recombinante de
la reivindicación 14, en el que el péptido marcador detectable
comprende la SEQ ID NO:10.
16. El constructo de expresión recombinante de
la reivindicación 10 ó 13, en el que la enzima lisosómica o enzima
lisosómica modificada es una enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada humana.
17. El constructo de expresión recombinante de
la reivindicación 16, en el que la enzima lisosómica o enzima
lisosómica modificada humana es una glucocerebrosidasa,
glucocerebrosidasa modificada,
\alpha-L-iduronidasa o
\alpha-L-iduronidasa
modificada.
18. Un vector de transformación de plantas que
comprende el constructo de expresión recombinante de la
reivindicación 16.
19. Un vector de transformación de plantas que
comprende el constructo de expresión recombinante de la
reivindicación 17.
20. Una célula, tejido u órgano de planta que
comprende el constructo de expresión recombinante de la
reivindicación 16.
21. Una célula, tejido u órgano de planta que
comprende el constructo de expresión recombinante de la
reivindicación 17.
22. Un plásmido que comprende la SEQ ID
NO:3.
23. Un plásmido que comprende la SEQ ID
NO:8.
24. Una planta o célula de planta transgénica
que puede producir una enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada enzimáticamente activa, cuya planta o célula de planta
transgénica comprende un constructo de expresión recombinante que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima
lisosómica o enzima lisosómica modificada y un promotor que regula
la expresión de la secuencia de nucleótidos en la planta o célula de
planta transgénica, en la que la enzima lisosómica modificada tiene
la secuencia de aminoácidos de la enzima lisosómica con una o más
sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácido.
25. La planta o célula de planta transgénica de
la reivindicación 24, en la que el promotor es un promotor
inducible.
26. La planta o célula de planta transgénica de
la reivindicación 25, en la que el promotor inducible es inducido
por la activación mecánica de genes.
27. La planta o célula de planta transgénica de
la reivindicación 26, en la que el promotor inducible comprende la
SEQ ID NO:5.
28. La planta o célula de planta transgénica de
la reivindicación 24, en la que la enzima lisosómica modificada
comprende un péptido marcador detectable fusionado con el extremo
amino o carboxilo de la enzima lisosómica.
29. La planta o célula de planta transgénica de
la reivindicación 28, en la que el péptido marcador detectable
comprende la SEQ ID NO:10.
30. La planta o célula de planta transgénica de
la reivindicación 24, en la que la planta o célula de planta
transgénica es una planta de tabaco o célula de tabaco
transgénica.
31. La planta o célula de planta transgénica de
cualquiera de las reivindicaciones 24, 27 y 30, en la que la enzima
lisosómica o enzima lisosómica modificada es una enzima lisosómica o
enzima lisosómica modificada humana.
32. La planta o célula de planta transgénica de
la reivindicación 31, en la que la enzima lisosómica humana o
enzima lisosómica humana modificada es una glucocerebrosidasa,
glucocerebrosidasa modificada,
\alpha-L-iduronidasa o
\alpha-L-iduronidasa
modificada.
33. Una hoja, tallo, raíz, flor o semilla de la
planta transgénica de la reivindicación 31.
34. Una hoja, tallo, raíz, flor o semilla de la
planta transgénica de la reivindicación 32.
35. Una planta que comprende una secuencia de
ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO:3 que puede producir
una enzima lisosómica o enzima lisosómica modificada enzimáticamente
activa.
36. Una planta que comprende una secuencia de
ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO:8 que puede producir
una enzima lisosómica o enzima lisosómica modificada enzimáticamente
activa.
37. Una enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada que es enzimáticamente activa y se produce según un
procedimiento que comprende:
(a) cultivar una planta transgénica que tiene un
constructo de expresión recombinante que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica la enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada y un promotor que regula la expresión de la secuencia de
nucleótidos de manera que la enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada se expresa a partir del constructo de expresión por la
planta transgénica; y
(b) recuperar la enzima lisosómica o enzima
lisosómica modificada a partir de un órgano de la planta
transgénica;
\newpage
en la que la enzima lisosómica modificada tiene
la secuencia de aminoácidos de la enzima lisosómica con una o más
sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácido, y el órgano
es una hoja, tallo, raíz, flor, fruto o semilla.
38. La enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada de la reivindicación 37, producida según el procedimiento
en el que el promotor es un promotor inducible, y cuyo
procedimiento comprende adicionalmente, entre las etapas (a) y (b),
la etapa de inducir el promotor inducible antes o después de
recolectar la planta transgénica.
39. La enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada de la reivindicación 38, producida según el procedimiento
en el que el promotor inducible comprende la SEQ ID NO:5.
40. La enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada de la reivindicación 37, en la que la enzima lisosómica
modificada comprende un péptido marcador detectable fusionado con el
extremo amino ácido o carboxilo de la enzima lisosómica.
41. La enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada de la reivindicación 40, en la que el péptido marcador
detectable comprende la SEQ ID NO:10.
42. La enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada de la reivindicación 37, producida según el procedimiento
en el que la planta transgénica es una planta de tabaco
transgénica.
43. La enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada de cualquiera de las reivindicaciones 37, 39 y 42, en la
que la enzima lisosómica o enzima lisosómica modificada es una
enzima lisosómica humana o enzima lisosómica humana modificada.
44. La enzima lisosómica o enzima lisosómica
modificada de la reivindicación 43, en la que la enzima lisosómica
humana o enzima lisosómica humana modificada es una
glucocerebrosidasa o glucocerebrosidasa modificada,
\alpha-L-iduronidasa o
\alpha-L-iduronidasa
modificada.
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