ES2660667T3 - Biorreactor desechable a gran escala - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo desechable para cultivar y recolectar tejido y/o células vegetales que comprende un recipiente no rígido que tiene un volumen de al menos 400 litros y que está configurado con orificios de intercambio de gases y un orificio de recolección que hace posible que dicho dispositivo se use continuamente durante al menos dos ciclos consecutivos de cultivo/recolección, en que los orificios de intercambio de gases incluyen una pluralidad de orificios de entrada de gases ubicados en una superficie del recipiente en la parte inferior de una mitad de una altura del recipiente, configurados para mezclar y airear medio en el recipiente, en que el dispositivo no tiene una mezcla mecánica del medio en el recipiente ni un rociador para distribuir gas cuando está presente medio en el mismo y en que el dispositivo está diseñado y construido para mantener una saturación de oxígeno y fuerzas de cizallamiento adecuadas para cultivar dicho tejido y/o células vegetales.
Description
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desechables a gran escala. La glucocerebrosidasa recolectada a partir de biorreactores desechables a gran escala (400 litros) se purificó como se detalla con posterioridad y se analizó en una columna C-4 RP-HPLC y se verificó a 214 nm (fig. 9a) y 280 nm (fig. 9b). Debe apreciarse que el prGCD aparece en forma de un pico único con un tiempo de retención de 64,12 minutos, similar al patrón de prGCD (64,70 minutos);
La fig. 10 es una fotografía de un gel IEF que muestra la pureza superior del prGCD producida usando un biorreactor desechable a gran escala. Muestras de prGCD producidas en el biorreactor desechable a gran escala (400 litros) y purificadas en el procedimiento de purificación de 5 columnas descrito con posterioridad se separaron en un gel de isoelectroenfoque junto con prGCD purificado a partir de un biorreactor desechable a pequeña escala (10 litros). Columna 2-gran escala, 3ª fase de purificación; columna 3-gran escala, 4ª fase de purificación; columna 4-gran escala, 5ª fase de purificación; columna 5-pequeña escala; columnas 1 y 6, patrones de IEF PI. Debe apreciarse la identidad y nivel elevado de pureza del prGCD a partir del biorreactor desechable a gran escala en todas las fases de purificación;
La fig. 11 es una transferencia Western que muestra la pureza de prGCD producida usando un biorreactor desechable a gran escala. Muestras de GCD de reactores de 400 litros (columnas 1 y 2, 50 ng y 100 ng, respectivamente), reactores de 80 litros (columnas 3 y 4, 50 ng y 100 ng, respectivamente), glucocerebrosidasa Cerezyme comercialmente preparada (columnas 5 y 6, 50 ng y 100 ng, respectivamente) y proteínas hospedantes de zanahoria (CHP) (columnas 7 y 8, 50 ng y 100 ng, respectivamente) fueron separadas en SDS-PAGE, sometidas a transferencia Western y se hicieron reaccionar con anticuerpo policlonal anti-CHP específico. Las bandas fueron visualizadas mediante sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico. Debe apreciarse la ausencia de impurezas en el biorreactor desechable a gran escala, como en todas las otras preparaciones de prGCD;
La fig. 12 es una fotografía del extremo inferior de un ejemplo de biorreactor desechable de la presente invención, que muestra múltiples entradas de gases para proporcionar aireación y mezcla del medio de cultivo y un ejemplo de estructura de soporte rígida cónica.
La fig. 13 es una fotografía que muestra una batería de ejemplos de biorreactores desechables a gran escala de la presente invención;
La fig. 14 es una fotografía de un ejemplo de biorreactor de la presente invención que muestra un orificio de recolección reutilizable:
La fig. 15 es una fotografía de transferencia Western que muestra la inmunodetección de AChE recombinante humana expresada en vegetales. 50 (columnas 3 y 7), 100 (columnas 2 y 6) y 200 ng (columnas 1 y 5) de AChE-R humana recombinante producido en un biorreactor desechable a gran escala según una realización de la presente invención (columnas 1-3) y AChE-S humana recombinante disponible en el comercio (columnas 4-6) fueron detectados usando un anticuerpo policlonal de cabra purificado por afinidad surgido contra un péptido en el N terminal de AChE de origen humano (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) (idéntico en AChE-R y AChE-S). La columna 4 son patrones de pesos moleculares. La unión fuerte de anticuerpo es evidente en todas las muestras;
La fig. 16 es una fotografía de la tinción de proteína no específica Flamingo® de gel de SDS-PAGE de AChE-R recombinante humana expresado en vegetales, producido en un biorreactor desechable a gran escala según una realización de la presente invención, en comparación con el perfil de AChE-S disponible en el comercio. La AChE-R expresada en vegetales (columnas 1-3) y la AChE-S producida a partir de células de mamífero (columnas 5-7) se separaron como en la figura 13, y el gel fue teñido con reactivos Flamingo® como se describe en la presente memoria descriptiva. Debe apreciarse que el perfil de desplazamiento de AChE-R se corresponde con el de AChE-R detectada mediante inmunoensayo usando anticuerpos anti-AChE (figura 13 anterior). Además, la banda única observada sobre el gel como se muestra en la figura 13 indica la eficacia de la purificación;
La fig. 17 es un gel de ensayo de Karnovsky teñido para detectar la actividad catalítica de acetilcolinesterasa en células vegetales cultivadas en un biorreactor desechable a gran escala. Se purificó acetilcolinesterasa-R catalíticamente activa a partir de células BY-2 recolectadas a partir de tandas reunidas de células, cultivadas en un biorreactor desechable a gran escala de 400 l según una realización de la presente invención. Se separaron cantidades decrecientes de proteína purificada a partir de células (columnas 1 y 4 =200 ng; columnas 2 y 5 =100 ng; columnas 3 y 6 = 50 ng) en un gel de poliacrilamida nativo al 10% bajo condiciones no desnaturalizantes, se lavaron y se trataron para revelar la actividad catalítica de acetilcolina (tinción de Karnovsky). Se incluyeron como testigos cantidades correspondientes de acetilcolina-S (columnas 4-6). La electroforesis de AChE-R y AChE-S se realizó en gel de poliacrilamida nativa al 10% bajo condiciones no desnaturalizantes. Los geles se realizaron a 4ºC, se aclararon 3 veces con H2O y se incubaron durante 1 h con agitación en tampón que contenía acetiltiocolina (0,5 mg/ml; Sigma), acetato de sodio (65 mM, pH 6,0; Sigma), citrato de sodio (5 mM; Sigma), sulfato cúprico (3 mM; Sigma) y ferricianuro de potasio (0,5 mM; Riedel De Haen). La actividad catalítica se detectó visualmente. La flecha superior indica el desplazamiento del tetrámero de AChE-S. La flecha inferior indica el desplazamiento de AChE monómera.
Descripción de las realizaciones preferidas
La presente invención es de un dispositivo desechable y reutilizable para cultivar y recolectar tejido y/o células
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vegetales que comprende un recipiente no rígido que tiene un volumen de al menos 400 litros y que está configurado con orificios de intercambio de gases y un orificio de recolección que hacen posible que dicho dispositivo sea usado continuamente durante al menos dos ciclos consecutivos de cultivo/recolección, en que los orificios de intercambio de gases incluyen una pluralidad de orificios de entrada de gases colocados en una superficie del recipiente en la parte inferior de una mitad de una altura del recipiente configurado para mezclar y airear medio en el recipiente, en que el dispositivo no tiene agitación mecánica para mezclar el medio en el recipiente ni un rociador para distribuir gas cuando está presente medio en el mismo y en que el dispositivo está diseñado y construido para mantener la saturación de oxígeno y fuerzas de cizallamiento adecuadas para cultivar dicho tejido/células vegetales. Este dispositivo puede ser usado para cultivar células vegetales transformadas para la producción de materiales biológicamente activos derivados de vegetales, recombinantes (por ejemplo, productos farmacéuticos) a partir de las células y/o medio de cultivo. También se proporciona un sistema de cultivo de células vegetales usando el dispositivo de la presente invención.
Los principios y el funcionamiento de la presente invención se pueden comprender mejor con referencia a los dibujos y descripciones que se acompañan.
Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la descripción que sigue o ilustrados mediante los ejemplos. La invención es capaz de otras realizaciones o de ser puesta en práctica o llevada a cabo de diversas maneras. También, debe entenderse que la fraseología y terminología empleadas en la presente memoria descriptiva son para los fines de la descripción y no deben ser consideradas como limitantes.
Como se describe con anterioridad, el ajuste a escala de grandes volúmenes de biorreactores desechables requiere soluciones únicas a los problemas de aireación y mezcla. Algunos biorreactores de la técnica anterior han empleado un gas para estos fines. La solicitud de patente de EE.UU. nº 2005/0282269 de Proulx et al. describe un biorreactor desechable que tiene múltiples entradas de gases con difusores de gases integrados y filtros en los orificios de entrada, colocados en el extremo inferior del recipiente, con el fin de proporcionar aireación y mezcla. Esta configuración está limitada en cuanto que los filtros que están en contacto con el medio líquido tenderían a quedar bloqueados e interferir con el suministro adecuado de gases. No se describen capacidad o dimensiones volumétricas.
Otro tipo de biorreactor desechable que usa gas para la aireación y agitación es ofrecido por la entidad Cellexus Biosystems, PCC (Cambridge, Inglaterra). Este biorreactor es una bolsa flexible que tiene un tubo rociador integral fijado o colocado a lo largo del extremo inferior interior del dispositivo, para introducir aire o gas para aireación y mezcla. Las bolsas del biorreactor de Cellexus están diseñadas según una geometría asimétrica única, que concentra la mayoría del volumen de fluido de la bolsa en la mitad superior del biorreactor. Este diseño requiere un recinto de soporte especialmente diseñado (Cellmaker Lite® para el funcionamiento.
La patente de EE.UU. nº 6.432.698 de Gaugler et al. describe una bolsa de cultivo desechable y flexible para el cultivo de nematodos. La bolsa de cultivo está equipada con una entrada de gases y un difusor, en la forma de un tubo, para la aireación y mezcla del medio de cultivo. Están previstos volúmenes de hasta 200 litros, aunque no se proporciona una reducción para la práctica. No se describen dimensiones específicas.
La solicitud de patente de EE.UU. nº 2005/0272146 de Hodge et al. describe un biorreactor desechable de 150 litros que tiene paletas propulsoras integradas para la mezcla. La mezcla del medio de cultivo en biorreactores mediante propulsores se conoce que crea fuerzas de cizallamiento inadecuadas para cultivar células vegetales.
La patente de EE.UU. nº 6.391.683 de Shaaltiel et al. describe dispositivos de cultivo desechables que comprenden bolsas no rígidas que tienen orificios de entrada y salida de gases, diseñadas para un uso único o para ciclos múltiples de cultivo y recolección. El dispositivo emplea una presión de aire a través de un volumen y número de burbujas cuidadosamente regulados para mezclar y airear el cultivo. El cultivo eficaz de células vegetales transformadas que expresan exactamente una diversidad de proteínas recombinantes heterólogas (de mamíferos y no mamíferos) ha sido descrito usando los biorreactores descritos por Shaaltiel (véase la patente de EE.UU. 6.391.683, solicitud de patente de EE.UU. nº 10/784.295, publicaciones de patentes internacionales PCT nos WO 2004/091475, WO 2005/080544 y WO 2006/040761). Sin embargo, Shaaltiel et al., en el documento 6.691.683, describen un diseño adecuado para volúmenes de tamaño más pequeños y medios, que limitan los rendimientos de las proteínas recombinantes sintetizadas en los mismos.
Al reducir la presente invención a la práctica, los presentes inventores han diseñado un biorreactor desechable y reutilizable a gran escala construido de materiales no rígidos transparentes o translúcidos. El biorreactor tiene orificios de toma de muestras que posibilitan un uso durante al menos dos ciclos consecutivos de cultivo, dimensiones específicas y orificios de intercambio de gases que proporcionan gas de una manera suficiente para mezclar y airear un cultivo celular en el biorreactor con una concentración de oxígeno disuelto adecuada y fuerzas de cizallamiento para un crecimiento eficaz de células vegetales en volúmenes de más de 400 litros.
Por tanto, según un aspecto de la presente invención, se proporciona un dispositivo desechable para cultivar y recolectar y/o células vegetales.
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El dispositivo de la presente invención incluye un recipiente no rígido que tiene un volumen de al menos 400 litros y que está configurado con orificios de intercambio de gases y un orificio de recolección que hace posible que el dispositivo sea usado continuamente durante al menos dos ciclos consecutivos de cultivo/recolección.
Aunque el presente dispositivo puede ser usado para cultivar cualquier tipo de célula o tejido, está diseñado para hacer posible un cultivo eficaz a gran escala de células y tejido vegetales.
La saturación de oxígeno del medio es crucial para un crecimiento eficaz de células y la expresión de proteínas recombinantes y, por lo tanto, es crítica para el funcionamiento apropiado de biorreactores y su uso en la producción de productos celulares recombinantes. La saturación de oxígeno de biorreactores para un crecimiento de cultivo de células vegetales es incluso más importante, ya que las células vegetales son más sensibles a fluctuaciones en la saturación de oxígeno que las bacterias o células de mamíferos (véase la publicación de Schlatmann et al, Biotech. Bioeng., 1995; 45: 435-39). Además, las células vegetales son sensibles al entorno hidrodinámico en los biorreactores convencionales, debido lo más probablemente a un tamaño de células vegetales mayor, vasculización intensiva y modelos de agregación. Por tanto, aunque la aireación del medio de cultivo mediante la introducción de burbujas de gas en el recipiente proporciona también mezcladura, se deben evitar fuerzas de cizallamiento perjudiciales para las células vegetales frágiles. Recientemente, las células vegetales en cultivo han mostrado que son susceptibles a fuerzas de cizallamiento subletales, que responden con una respuesta “sub-lítica” característica, que a su vez limita significativamente la eficacia de los biorreactores de células vegetales (Namdev y Dulop, App. Biochem and Biotech, Part A, Frontiers in Bioprocessing, 1995).
Por tanto, el dispositivo de la presente invención mantiene la saturación de oxígeno y las fuerzas de cizallamiento adecuadas para cultivar tejidos y/o células vegetales en volúmenes de 400 litros o más, empleando parámetros, o combinación de parámetros, críticos para determinar la saturación de oxígeno y las fuerzas de cizallamiento en cultivo.
La saturación de oxígeno y las fuerzas de cizallamiento adecuadas para cultivar tejidos y/o células vegetales en el dispositivo se mantiene mediante una combinación de valores o intervalos de valores de: a) una relación de altura a volumen; b) una presión de gas de entrada; c) una densidad de entradas de gases por área seccional transversal; d) una velocidad de aireación en la entrada; y e) un volumen de burbujas gaseosas en la entrada.
Relación de altura a volumen: Los métodos de mezcla mecánica son inadecuados para ser usados en biorreactores de células vegetales, especialmente cuando están siendo tratados volúmenes grandes de medio. La aireación y mezcla del medio de cultivo en un biorreactor a gran escala se pueden realizar mediante el movimiento de burbujas gaseosas a través del medio. Cuanto más intensivo sea el contacto del burbujeo gaseoso con el medio, mayor será la capacidad potencial de intercambio de gases y más eficaz será la acción de mezcla del gas en el medio. Por tanto, aunque la relación de altura a volumen de los biorreactores de volúmenes más pequeños puede permitir una mayor flexibilidad, la relación de altura a volumen de los dispositivos biorreactores que van a ser usados volúmenes grandes (por ejemplo, 400 litros o más) deben ser mantenidas en un intervalo de aproximadamente 0,06 a 1 centímetros por litro. La relación de altura a volumen se puede calcular a partir de la altura (longitud) del recipiente del dispositivo y el área de sección transversal media del dispositivo. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el volumen del dispositivo es la altura dividida por el área seccional transversal. Por ejemplo, para un biorreactor que tiene una altura (longitud) de 200 centímetros y un volumen de 400 l (que tiene, por ejemplo, un radio medio de aproximadamente 25 cm), la relación de altura a volumen es 200/400 o 0,5; para un biorreactor que tiene una altura de 300 cm y un volumen de 3.000 l, la relación de altura a volumen es de 300/3.000, o 0,1. Ejemplos de intervalos de relaciones de altura a volumen adecuados para ser usados con el biorreactor de la presente invención son de aproximadamente 0,06 a 1 centímetro por litro, preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5, lo más preferentemente de aproximadamente 0,44 cm por litro.
Además, se apreciará que la relación de altura a volumen puede ser calculada usando el volumen interno rellenable potencial total del recipiente o bien usando una parte designada del mismo, que es el volumen interno rellenable funcional en funcionamiento del recipiente, sin el “espacio vacío” que se encuentra normalmente por encima del nivel de fluido en un biorreactor.
Presión del gas de entrada: Con el fin de proporcionar suficiente gas (por ejemplo, aire u oxígeno) para la mezcla y aireación del medio de cultivo del biorreactor a gran escala, la presión de gases en la(s) entrada(s) necesita ser suficiente para superar la fuerza descendente de la columna de líquido en el biorreactor, y al mismo tiempo evitar las fuerzas de cizallamiento asociadas con la creación de demasiadas burbujas, o burbujas de tamaño inadecuado para el cultivo de células vegetales. Los biorreactores a gran escala de la presente invención, que tienen una relación de altura a volumen adecuada para el cultivo de células vegetales, necesitan una presión de gases mayor a la entrada de gases que en los biorreactores de volúmenes más pequeños. La presión gaseosa se expresa en unidades de bares, en que 1 bar es 100.000 pascales (Pa) o 1.000.000 dinas por cm2. Las presiones manométricas para verificar los reguladores de presión para el control de la presión gaseosa en la(s) entrada(s) de gases son bien conocidas en la técnica, y están ampliamente disponibles en el comercio. Ejemplos de intervalos de presiones de gases de entrada adecuados para el biorreactor de la presente invención están en el intervalo de aproximadamente 1,5 bar a aproximadamente 4 bar, más preferentemente de aproximadamente 1,5 bar a aproximadamente 2,5 bar.
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fluidos, con el fin de evitar la introducción no intencionada de material en el recipiente 12 durante o con posterioridad a la adición de medios, etc.
El dispositivo 10 incluye adicionalmente orificios de intercambio de gases para comunicar los gases dentro y fuera del recipiente 12. Los orificios de intercambio de gases incluyen al menos un orificio de entrada de gases 28, para gas de filtración (como aire, oxígeno u otros gases) a través del medio, para la aireación y mezcla del cultivo de células vegetales y al menos un orificio 30 de gases de escape, para la evacuación del gas que se filtra a través del contenido del recipiente 12 (por ejemplo, medio de cultivo y células). Los orificios de entrada y los orificios de salida de gases pueden estar equipados con un filtro 49, descrito en detalle en la presente memoria descriptiva. En una realización, se proporciona una pluralidad de entradas de gases con el fin de distribuir mejor la presión de aire mientras se proporciona el flujo de entrada necesario para el flujo deseado de burbujas de aire.
El (los) orificio(s) de entrada de gases 28 puede estar conectado a un suministro de gas (por ejemplo, una bomba) a través de un tubo o tubos de suministro de gases.
El (los) orificio(s) de entrada de gases 28 puede estar hecho a partir de un material flexible (por ejemplo, silicona) o rígido (por ejemplo, acero inoxidable). El orificio de entrada de gases 34 (entrada de gases 34(I) corresponde al orificio de entrada de gases 28(I) en la posición I y la entrada 34(II) corresponde al orificio de entrada de gases 28(II) en la posición II) del(os) orificio(s) de entrada de gases 28 está diseñada para proporcionar burbujas gaseosas de volumen adecuado para airear y mezclar el medio de cultivo vegetal y evitar la sedimentación, sin generar fuerzas de cizallamiento no deseadas, como se describió con anterioridad. La entrada de gases 34 puede variar en su forma (estrecha, ancha, inclinada, cónica, redondeada, etc.), para proporcionar una forma y tamaño de burbujas deseados. Alternativamente, el orificio puede estar conformado en una pieza con diámetros diferentes en la abertura interna y externa, como se describe para el orificio de recolección 19.
Los orificios de intercambio de gases 28 y 30, el (los) orificio(s) de recolección 19 y los orificios de toma de muestras opcionales se forman creando una abertura en la superficie del recipiente 12 y reforzando la abertura alrededor del orificio con un material rígido o no rígido adicional, como es bien conocido en la técnica.
Con el fin de proporcionar una mezcla y aireación adecuadas, se puede proporcionar una pluralidad de orificios de entrada de gases 28 a una densidad de 20 a 70 entradas por metro cuadrado. Los orificios de entrada de gases 28 pueden estar colocados alrededor del perímetro del recipiente 12 a una distancia predeterminada del extremo inferior 16 del mismo. La colocación de los orificios de entrada de gases 28 está determinada por el volumen y la altura del recipiente y por el tipo de aireación deseada para usos de cultivos de vegetales específicos. Los orificios de entrada de gases 28 pueden estar colocados de 15 a 65 centímetros a partir de la parte inferior 16 del recipiente. En una realización de la invención, al menos uno de los orificios de entrada de gases está en una ubicación por debajo del nivel del orifico de recolección 18.
Se pueden proporcionar orificios de entrada de gases 28 adiciones en la medida necesaria, por ejemplo, para recipientes que tienen dimensiones de altura muy grandes o para recipientes con volúmenes más elevados, con el fin de proporcionar volúmenes mayores de gas, sin aumentar la presión de la entrada de gas o el volumen de las burbujas de gas. Los orificios de entrada de gases 28 adicionales pueden estar colocados en cualquier ubicación en la superficie del recipiente 12 y están ubicados preferentemente en la parte inferior en una mitad de la altura del recipiente 12, para proporcionar una mezcla y aireación sustanciales del medio. Esta configuración, que tiene una pluralidad de orificios de entrada de gases como se indica en la presente memoria descriptiva mediante los orificios de entrada de gases en la posición I [28(I)] y II [28(II)], que tienen las entradas de gases 34(I) y 34(II), respectivamente, colocados a una distancia unos de otros para proporcionar una mezcla y aireación eficaces del cultivo de células vegetales. Los orificios de entrada de gases contienen adicionalmente un mecanismo de prevención de la contaminación, como un filtro 49 o un separador (no mostrado), que puede evitar la entrada de gases, fluidos o sólidos contaminantes (por ejemplo, microbios portados el aire) en el volumen interno del recipiente 12 y el medio de cultivo.
El recipiente 12 incluye un orificio 30 de gases de escape para la evacuación y separación del gas que se acumula por encima del medio de cultivo. El orificio 30 de gases de escape está colocado en la parte superior de la mitad, preferentemente un tercio de la parte superior del recipiente 12, en una ubicación sustancialmente por encima del nivel del fluido (por ejemplo, medio de cultivo) con el fin de que esté en comunicación fluida con el “espacio vacío” por encima del medio de cultivo. La abertura externa 46 de gases de escape del orificio 30 de gases de escape puede estar abierta al medioambiente y el flujo de gas de escape es desregulado en el orificio 30 de gases de escape. Opcional y alternativamente, el orificio 30 de gases de escape puede incluir adicionalmente un regulador 48 de gases de escape (por ejemplo, una válvula o cierre de presión) que regula el flujo de gas fuera del recipiente 12 y, por tanto, puede ser usado para crear una presión positiva de gas en el recipiente 12 y mantener así el recipiente 12 ampliamente inflado y en la forma cilíndrica deseada. El orificio 30 de gases de escape puede incluir adicionalmente un mecanismo de prevención de la contaminación, como un filtro 49 o un separador, que puede evitar la entrada de gases, fluidos o sólidos contaminantes (por ejemplo, microbios portados en el aire) en el volumen interior del recipiente 12 y el medio de cultivo.
Como el recipiente 12 de la presente invención está diseñado para ser usado con volúmenes de al menos 400 y de
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verificado en cuanto a uno o más contaminantes y/o en cuanto a la calidad de las células y/o producto(s) celular(es) que se producen en el recipiente. Más preferentemente, y si se encuentra que están presentes uno o más contaminantes en el cultivo, o las células y/o producto(s) celular(es) que se producen son de escasa calidad, el dispositivo y su contenido son desechados.
En un momento apropiado, particularmente si no se encuentran contaminante(s) y/o células y/o productos celulares de escasa calidad, es preferentemente recolectada al menos una primera parte del material en el recipiente, como el medio que contiene células y/o producto(s) celular(es). Más preferentemente, se deja que permanezca en el recipiente una segunda parte restante de material, como un medio que contiene células y/o producto(s) celular(es), en que esta segunda parte puede servir opcionalmente como un inoculante para un siguiente ciclo de cultivo/recolección. A continuación, se pueden proporcionar el medio de cultivo esterilizado y/o los aditivos esterilizados para el siguiente ciclo de cultivo/recolección a través de la entrada 51 de aditivos, opcionalmente conectada a un filtro 49 para evitar la contaminación.
El ciclo anteriormente descrito se realiza opcionalmente más de una vez. De forma opcional y preferida, el método permite que las células sean cultivadas y/o recolectadas anaeróbicamente.
Para la realización anaeróbica, se proporciona un gas inerte, en lugar de oxígeno o aire, a través de las entradas de gases del dispositivo. Para al menos un dispositivo se realiza el siguiente procedimiento. Se introduce un inoculante axénico en el dispositivo a través de un orificio de recolección. A continuación, se añaden medio de cultivo esterilizado y/o aditivos esterilizados al dispositivo a través del conducto de entrada de aditivos comunes. Opcionalmente, el dispositivo está iluminado como se describió anteriormente.
Las células en el dispositivo se deja que crezcan en el medio hasta un rendimiento deseado de células y/o producto(s) de las células. De forma opcional y preferida, se deja que salgan del dispositivo el aire y/o gases residuales en exceso, opcionalmente a través de un filtro, más preferentemente de forma continua, a través de un orificio de gases de escape.
Como para el método anterior, el material en el recipiente es verificado en cuanto a la presencia de uno o más contaminante(s) y/o células de escasa calidad y/o producto(s) celular(es) de escasa calidad, en cuyo caso el recipiente y su contenido son preferentemente desechados. También como para el método anterior, las células y/o producto(s) celular(es) son preferentemente recolectados en un momento adecuado, por ejemplo, cuando se ha producido la cantidad deseada de producto(s) celular(es).
Normalmente, un sistema de purificación de agua suministra agua desionizada y sustancialmente exenta de endotoxinas a un depósito que comprende medios concentrados y medios diluidos y seguidamente se bombea al dispositivo 10 a través de una entrada de aditivos. Se instalan filtros, normalmente de 0,2 micrómetros, en los conductos de alimentación y también justo en dirección ascendente de la entrada para minimizar el riesgo de contaminación del contenido del recipiente en cada dispositivo 10. De forma alternativa o adicional, se puede usar también una válvula para minimizar este riesgo.
Para el primer ciclo de cultivo de cada dispositivo 10, el inoculante, normalmente una muestra suficiente del tipo de célula que se requiere colectar en el dispositivo 10, es previamente mezclado con medios o agua en un recipiente previamente esterilizado y es introducida en el dispositivo 10, normalmente a través del orificio del recolector, pero de forma alternativa u opcional a través de un orificio de entrada de aditivos separado. Seguidamente se introducen los medios en el dispositivo 10 a través del orificio del recolector, o a través del orificio opcional de entrada de aditivos. Para los ciclos posteriores, solamente se introducen medios y/o aditivos, como se describió con anterioridad.
Normalmente, un compresor de aire proporciona aire o gases sustancialmente esterilizados a cada dispositivo 10, a través de un cierto número de aparatos: un filtro grueso para separar partículas, un secador y un aparato de humedad para suprimir la humedad y un filtro de materias finas, normalmente de 0,2 micrómetros, para separar los contaminantes. Preferentemente, otro filtro justo en dirección ascendente de la entrada de gases minimiza adicionalmente el riesgo de contaminación del contenido del recipiente.
Para cada dispositivo 10, todas las conexiones al recipiente 12, es decir, el orificio(s) de entrada de gases, el orificio de entrada de aditivos y preferentemente también el orificio(s) de gases de escape y el recolector son esterilizados antes de su uso y la esterilización se mantiene durante la conexión a la instalación periférica que incluye, por ejemplo, el suministro y escape de aire, realizando las conexiones en la campana de flujo de aire laminar.
Se proporciona preferentemente un control de la temperatura para cada dispositivo 10 mediante una unidad de manejo de aire adecuada. La iluminación opcional del dispositivo puede ser proporcionada por luces fluorescentes adecuadas apropiadamente dispuestas alrededor del dispositivo 10, cuando sea necesario para el crecimiento celular o la producción de compuestos.
Durante cada ciclo de cultivo de cada dispositivo 10, el contenido de cada recipiente 12 correspondiente es normalmente aireado y mezclado durante aproximadamente 3 a aproximadamente 14 días, o más, bajo condiciones de temperatura controlada e iluminación. Las condiciones y la duración del cultivo se determinan según los
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requisitos individuales de cada ciclo de cultivo, como el tipo de célula cultivada, producto recombinante que va a ser recolectado, concentración de inoculante y similares.
Al final del ciclo de cultivo para cada dispositivo 10, el orificio del recolector correspondiente está normalmente conectado a un entorno previamente esterilizado con conectores adecuados que son esterilizados antes y durante la conexión, como se describió con anterioridad. Seguidamente se efectúa la recolección, dejando atrás entre aproximadamente 2,5% y aproximadamente 45%, aunque normalmente entre aproximadamente 10% y aproximadamente 35% de células y/o tejido para que sirvan como inoculante para el siguiente ciclo.
Las células/tejidos y/o producto(s) celular(es) recolectados pueden ser seguidamente secados de forma opcional o extraídos, en la medida necesaria.
Otro ajuste opcional es la adición de oxígeno puro durante el procedimiento de cultivo celular, más preferentemente en el día 3 o 4 después del comienzo del procedimiento de cultivo.
Un ejemplo de un tipo de célula preferido adecuado para el cultivo en el biorreactor desechable a gran escala de la invención es la célula de zanahoria transformada descrita en la sección de ejemplos que sigue. Como se describe en la sección de ejemplos, esta célula es una célula de zanahoria transformada de Agrobacterium tumefaciens que expresa un gen exógeno que codifica glucocerebrosidasa humana (hGCD). En otra realización de un aspecto de la invención, el tipo de célula es Nicotiana tabacum. Todavía en otra realización de la invención, las células de Nicotinia tabacum son células BY-2. Los métodos para la transformación y expresión de genes exógenos en zanahoria y otros tipos de células, adecuadas para ser usados en los biorreactores desechables a gran escala de la presente invención, son bien conocidos en la técnica. La transformación y expresión de proteínas exógenas biológicamente activas en zanahoria y otros cultivos celulares, usando biorreactores desechables, se describe en detalle en la solicitud de patente de EE.UU nº 10/784.295 y la publicación PCT WO 2004/096978. La sección de ejemplos que sigue demuestra el uso del presente dispositivo en el cultivo de células de zanahoria anteriormente descritas y en células Nicotiana tabacum del tabaco. Como se muestra en el presente documento, el cultivo de células transgénicas de zanahoria y tabaco en un dispositivo de biorreactor a gran escala 10, que tiene un volumen de más de 400 litros, dio lugar a un rendimiento y pureza superiores de la proteína recombinante. Las células de zanahoria que expresan glucocerebrosidasa humana y las células de tabaco que expresan acetilcolinesterasa-R fueron cultivadas en biorreactores desechables a gran escala y a escala más pequeña y las condiciones del cultivo, rendimientos y productos se analizaron y se compararon (véanse los ejemplo 2 y 3). Los resultados muestran que el biorreactor desechable a gran escala de la presente invención proporciona una saturación de O2 aumentada del medio de cultivo, a una velocidad de aireación de la entrada significativamente inferior, hasta 30% durante al menos 7 días de cultivo y una mayor eficacia del cultivo, dando lugar a un rendimiento mayor del producto de proteína recombinante. El análisis de la proteína recombinante mediante mapeo de péptidos (fig. 8), IEF (fig. 10), SDS-PAGE y análisis inmunológico (figs. 7 y 15-17) y cromatografía (figs. 6 y 9) mostraron que las preparaciones de enzimas glucocerebrosidasa y acetilcolinesterasa a partir de células recolectadas del biorreactor desechable a gran escala son iguales a las de una preparación estándar obtenida con una tecnología a gran escala, indicando fuertemente la congruencia y la identidad de las preparaciones de enzimas producidas a partir de células recolectadas de los reactores de 80 l, 400 l y 800 l. Las preparaciones de enzimas a partir del biorreactor desechable a gran escala mostraron también valores comparables, si no superiores, de la actividad catalítica y actividad específica (véase la tabla 5 y la fig. 17). Además, se mostró que la β-glucocerebrosidasa recombinante producida en biorreactores desechables a gran escala de la presente invención contiene niveles indetectables de proteínas de células hospedantes de zanahoria, no menos pura que la β-glucocerebrosidasa fabricada mediante métodos de producción a volúmenes estándares (fig. 11). Por tanto, el biorreactor desechable a gran escala de la presente invención puede proporcionar condiciones exactas, eficaces e incluso superiores para el ajuste a escala de cultivos de células vegetales que expresan proteínas recombinantes desarrolladas en volúmenes más pequeños, incluso mucho más pequeños.
Ejemplos
Se hace referencia seguidamente a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de una forma no limitativa.
Generalmente, la nomenclatura usada en la presente memoria descriptiva y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de DNA recombinante. Estas técnicas se explican en detalle en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, las publicaciones "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", VoIs. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías expuestas en las patentes de EE.UU. nos 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells -A Manual of Basic Technique" de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8ª Edition), Appleton &
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Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles y descritos en profundidad en la bibliografía de patentes y científica, véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nos 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins
S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. L, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Los presentes procedimientos se cree que son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector.
Ejemplo 1
Cultivo eficaz de células vegetales en un biorreactor desechable a gran escala
Con el fin de ensayar los parámetros de crecimiento, rendimientos y características de los cultivos y productos celulares producidos usando el biorreactor desechable a gran escala, se cultivaron células de zanahoria que expresan glucocerebrosidasa humana en los biorreactores desechables a gran escala y a escala más pequeña y se analizaron y compararon las condiciones de cultivo, rendimientos y productos analizados.
Materiales y métodos experimentales:
Transformación y cultivo de células de zanahoria que expresan GCD: La transformación y cultivo de células se efectuaron como se describe en el ejemplo 2.
Crecimiento de cultivos a escala elevada en un biorreactor. Se dispusieron en placas aproximadamente 1 cm (de diámetro) de callo de células de zanahoria genéticamente modificadas, que contienen el gen rh-GCD, sobre un medio de agar en una placa de 9 cm que contiene 4,4 g/l de medio MSD (Duchefa, Haarlem, Holanda), 9,9 mg/l de tiamina-HCl (Duchefa), 0,5 mg de ácido fólico (Sigma Ltd, St Louis, MO), 0,5 mg/l de biotina (Duchefa), 0,8 g/l de hidrolizado de caseína (Duchefa), 30 g/l de azúcar y hormonas 2-4 D (Sigma). El callo se hizo crecer durante 14 días a 25ºC.
Se preparó un cultivo de suspensión celular subcultivando el callo transformado en medio líquido de MSD que contiene 0,2 mg de ácido 2,4-dicloroacético, como es bien conocido en la técnica. El cultivo de suspensión celular se cultivó seguidamente en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, comenzando con un volumen de trabajo de 25 ml y aumentando el volumen hasta 50 ml después de 7 días de tratamiento, a 25ºC con una velocidad de agitación de 60 rpm. Posteriormente, el volumen del cultivo celular se aumentó hasta 300 ml en un Erlenmeyer de 1 l bajo las mismas condiciones.
Se efectuó un inóculo del biorreactor pequeño (10 l) [véase el documento WO 98/13469] que contenía 4 l de medio MSD añadiendo 400 ml de suspensiones celulares derivadas de dos matraces Erlenmeyer de 1 l que se cultivaron durante siete días. Después de una semana de cultivo a 25ºC con 1 lpm de flujo de aire, se añadió medo MDS hasta 10 l y el cultivó se continuó bajo las mismas condiciones. Después de un cultivo adicional (cinco días), la mayor parte de las células se recolectaron y se recogieron haciendo pasar los medios celulares a través de un retículo de 80 micrómetros. El medio sobrante se escurrió y la torta de la estructura celular se almacenó a -70ºC.
Antiespumante: Para evitar la formación de espuma, se usó una emulsión de Antifoam C medicinal (polidimetilsiloxano-PDMS, Dow Coming, Midland MI) que contenía 30% de simeticona USP, metilcelulosa, ácido sórbico y agua. El antiespumante fue añadido a los medios del biorreactor de 400 l a una concentración de 10 ppm.
Análisis del antiespumante: Se usó una emulsión de Antifoam C (PDMS) como un antiflatulente y un ingrediente en alimentos no estandarizados. La presencia de PDMS se evaluó según y en cumplimiento de todos los requisitos de la USP para emulsiones de dimeticona. Se introdujo una solución de 450 ml de PDMS al 0,075% en una columna de cromatografía de intercambio catiónico de 15 ml (Macro-Prep® High S Support, BioRad, Hercules, CA). Se tomaron partes alícuotas para el análisis de PDMS a partir del material introducido, circulación de flujo (materiales no unidos) y a partir de tres etapas de elución de NaCl 0,2 M, NaCl 1,2 M y etanol al 12% en NaCl 1,2 M.
Se recogieron muestras alícuotas del cultivo recolectado durante las diferentes etapas de cromatografía (etapas de introducción, circulación de flujo, lavado y elución) y se analizaron en cuanto a la presencia de PDMS usando un método de RP-HPLC, con una columna C4 verificada a 262 nm (absorbancia pico de la emulsión de Antifoam C).
SDS-PAGE: La electroforesis de gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) separa las proteínas principalmente por su peso molecular. Además, esta técnica proporciona grandes cantidades de información sobre la pureza y composición de las proteínas. La identidad del peso molecular y el modelo de impureza de proteínas de prGCD producida a partir de células recolectadas del biorreactor desechable a gran escala fueron examinados mediante análisis SDS-PAGE usando tinción con azul Coomassie Brilliant, según protocolos estándar de separación
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aspecto de formación de espuma del medio, que debe ser evitado por muchas razones, requiere atención. Se añadió espumante (10 ppm) a cada medio de cultivo celular cuando fue transferido al biorreactor de 400 l.
• El nivel más bajo de detección usando técnicas de laboratorio estandarizadas como HPLC y absorción atómica es de aproximadamente 7 ppm.
Con el fin de confirmar que la recolección y purificación de producto recombinante a partir del biorreactor desechable a gran escala es capaz de eliminar el residuo de antiespumante, se sometió un gran exceso de antiespumante de PDMS a las etapas iniciales del procedimiento de purificación y se verificó la presencia de antiespumante a lo largo de las mismas.
La figura 5a es un análisis por RP-HPLC del antiespumante de PDMS (0,075%) en una parte alícuota de la solución de carga de la columna de intercambio catiónico. El tiempo de retención (pico) fue de 22,531 minutos. La figura 5b muestra el antiespumante en el flujo a través de la columna (tiempo de retención 22,554 minutos), con el tamaño del pico y absorbancia a 262 nm similares al material introducido. No se detectó PDMS en muestras de ninguna de las 3 etapas de elución posteriores (NaCl 0,2 M, NaCl 1,2 M y etanol al 12% en NaCl 1,2 M). La tabla 3 indica claramente que no se retuvo PDMS en la columna:
Tabla 3: Resumen de rendimiento y producción de PDMS en una columna de cromatografía de intercambio catiónico
- Muestra
- Volumen de muestra (ml) Absorbente (OD/ml) OD total Rendimiento de absorbente (%) área pico de HPLC rendimiento por HPLC (%)
- Carga
- 450 0,097 43,65 100 438,46 100
- Circulación de flujo
- 448 0,101 45,24 103 443,00 101
Estos resultados indican claramente que un residuo antiespumante es fácilmente separado del medio y permanece por debajo de niveles detectables desde las primeras fases del procedimiento de aislamiento y purificación.
Ejemplo 2
Expresión eficaz de glucocerebrosidasa humana en suspensión de células de zanahoria usando un biorreactor desechable a gran escala
Este ejemplo proporciona una descripción de experimentos que se realizaron con células vegetales transformadas, cultivadas en el biorreactor desechable a gran escala de la presente invención, según algunas reacciones de la presente invención.
Materiales y métodos experimentales
Vectores de plásmidos: *CE-T-se construyó a partir de plásmido CE obtenido del Prof. Galili [patente de Estados Unidos 5.367.110 de 22 de noviembre de 1994].
El plásmido CE fue digerido con SalI. El extremo cohesivo de SalI fue hecho un extremo romo usando el fragmento grande DNA polimerasa I. Seguidamente el plásmido fue digerido con PstI y ligado a un fragmento de DNA que codifica la señal de dirección a diana de ER del gen de endoquitinasa básica [Arabidopsis thaliana] ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCACTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC (SEQ ID nº 6) y la señal de dirección a diana vacuolar de quitinasa de Tobacco A: GATCTTTTAGTCGATACTATG (SEQ ID nº 5) digerida con Smal y Pstl.
*pGREENII – obtenido del Dr. P. Mullineaux [Roger P. Hellens et al., (2000) Plant MoI. Bio. 42:819-832]. La expresión del vector pGREEN II está controlada por promotor 35S del virus mosaico de coliflor, el elemento mejorador translacional omega TMV (virus mosaico del tabaco) y la secuencia terminadora de octopinasintasa de Agrobacterium tumefaciens.
cDNA de glucocerebrosidasa humana (hGCD): Se obtuvo glucocerebrosidasa humana de la entidad ATCC (nº de acceso 65696), GC-2.2 [GCS-2kb; lambda-EZZ-gamma3 Homo sapiens] que contenía glucosidasa beta ácida [glucocerebrosidasa]. Longitudes de insertos (kb): 2,20; tejido: célula WI-38 de fibroblasto.
Construcción de plásmido de expresión de hGCD: El cDNA que codifica hGCD (número de clon de ATCC 65696) fue amplificado usando los cebadores directo 5' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' (SEQ ID nº 3) y el inverso 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3' (SEQ ID nº 4). El producto de PCR DNA purificado fue digerido con endonucleasas EcoRI y BgIII (véanse las secuencias de reconocimientos indicadas en los cebadores) y ligada en un vector intermedio que tenía un cassette CE-T digerido con las mismas enzimas. El cassette de expresión fue cortado y eluido a partir del vector intermedio y ligando en el vector binario pGREENII usando enzimas de restricción Smal y Xbal, formando el vector de expresión final. La resistencia a la kanamicina es conferida por el gen NPTII accionado
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enzimático usando un sustrato sintético para la evaluación de cada tanda. Una unidad de enzimas se define como la cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de un micromol del sustrato sintético para-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (pNP-Glc) por minuto a 37ºC.
Resultados
Caracterización de glucocerebrosidasa recombinante a partir de un biorreactor desechable a gran escala: Con el fin de determinar el carácter óptimo de las condiciones de cultivo mejoradas suministradas por el biorreactor desechable a gran escala, y con el fin de ensayar la fiabilidad y carácter reproducible estas condiciones, se compararon las características moleculares y físico-químicas del producto recombinante, producido en biorreactores desechables a gran escala, con preparaciones producidas en biorreactores a escala más pequeña.
Peso molecular de glucocerebrosidasa determinado mediante espectrometría de masas: Se efectuó un análisis de espectrometría de masas para determinar la masa de la proteína sin necesidad de patrones de proteínas. Se usaron dos métodos de espectrometría de masas para determinar el peso molecular de enzima producida a partir de células recolectadas del biorreactor de 400 l, y esto se comparó con la glucocerebrosidasa producida en reactores a escala más pequeña. Todas las preparaciones de enzimas fueron aisladas y purificadas de la misma manera.
La tabla 4 siguiente resume el peso molecular de diversas tandas de enzimas obtenidas mediante dos instrumentos, LCQ classic y MALDI-TOF. Las tandas de prGCD producidas a partir de células recolectadas del biorreactor de 400 l están indicadas mediante PX400-GC.
Tabla 4. Peso molecular prGCD diferentes producidas a partir de tandas diferentes
- Biorreactor
- Tanda de enzimas nº Peso molecular (D) (LCQ classic) Peso molecular (D) (MALDI-TOF)
- 80 l
- PLX-GC-016-0505-DS 60.877 60.954
- 80 l
- PLX-GC-016-Fenilo 60.884 60.923
- 80 l
- PLX-GC-017-0705-DS 60.865 60.524
- 80 l
- PLX-GC-017-Fenilo 60.869 60.586
- 400 l
- PX-400-GC-1 60.593 60.712
- 400 l
- PX-400-GC-2 60.869 60.819
Los resultados de las espectrometrías de masas muestran que la estimación del peso molecular de la proteína en todas las preparaciones se aproxima rutinariamente a 60800 Dalton y permanece congruente entre las tandas producidas a partir de células cultivadas del biorreactor de 400 l y de biorreactores de 80 l. Este peso molecular es congruente con un polipéptido glicosilado que tiene 506 aminoácidos que contribuyen a 56.642,6 Dalton y la adición de las estructuras de glicano que contribuyen a los 4.158 Dalton restantes (aproximadamente 7%).
Identificación, determinación del peso molecular y pureza mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia Western: La identidad del peso molecular y el modelo de impureza de proteínas de la glucocerebrosidasa producida a partir de células recolectadas del biorreactor de 400 l se examinaron mediante análisis SDS-PAGE usando tinción con azul Coomassie Brilliant.
La figura 6 muestra el SDS-PAGE con tinción de azul Coomassie Brilliant de una preparación de enzimas estándar (PLX-GC-016-0505-DS), Cerezyme y glucocerebrosidasa producida a partir de células recolectadas del biorreactor desechable a gran escala de 400 l (PLX-400-GC-2).
La figura 6 establece adicionalmente que la prGCD de células cultivadas en el biorreactor a gran escala muestra propiedades próximas a idénticas a la GCD producida en otros métodos. La migración de la proteína fue similar, con un peso molecular estimado de 60,9 kD. Además, el modelo de bandas de proteínas es igual entre las tandas del biorreactor estándar y de 400 l, indicando la ausencia de evidencia de impurezas de proteínas en la enzima producida a partir de células recolectadas del biorreactor de 400 l.
La inmunodetección de las proteínas separadas SDS-PAGE (transferencia Western) con anticuerpo antiglucocerebrosidasa se realizó para identificar las moléculas de β-glucocerebrosidasa purificadas a partir de células recolectadas del biorreactor de 400 l en comparación con tandas previamente fabricadas y con βglucocerebrosidasa humana comercial (Cerezyme®, Genzyme) usando anticuerpos anti-β-glucocerebrosidasa purificados por afinidad específica.
La figura 7 muestra análisis de transferencia Western usando anticuerpos anti-β-glucocerebrosidasa de conejo específicos para la detección de β-glucocerebrosidasa estándar (PLX-GC-016-0505 DS), Cerezyme® y la proteína producida a partir de células recolectadas del biorreactor de 400 l (PX-400-GC-2). Las bandas de proteínas identificadas por el anticuerpo específico son iguales entre las tandas de los procedimientos de biorreactores
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