NL1012782C2

NL1012782C2 - Verbeterde gfp-variant, bruikbaar als markering, en gfp-construct.

Info

Publication number: NL1012782C2
Application number: NL1012782A
Authority: NL
Inventors: Adrianus Cornelis Jac Frijters; Michiel Theodoor Jan De Both
Original assignee: Keygene Nv
Priority date: 1999-08-05
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2001-02-06

Description

Verbeterde gfp-variant, bruikbaar als markering, en g/p-construct.

De onderhavige aanvrage betreft een variant van het gfp-gen, die gebruikt kan worden als label of markering in (micro-)biologische, biochemische en/of moleculair-5 biologische technieken, in het bijzonder als een genetische markering en/of expressie-markering in vivo.

De aanvrage heeft verder betrekking op een nucleïnezuursequentie of genetisch construct die/dat voor de verbeterde g/p-variant volgens de aanvrage codeert.

De aanvrage betreft verder het fluorescerende eiwit dat door deze variant van het 10 gfp-gen gecodeerd wordt, alsmede de toepassing van de gfp- variant volgens de uitvinding en/of het hierdoor gecodeerde eiwit als label of markering.

Het wildtype gfp-gen, het hierdoor gecodeerde eiwit, alsmede het gebruik hiervan als label of markering, zijn bekend, onder meer uit de hieronder genoemde stand der techniek. Het wildtype gfp-gen, dat afkomstig is uit de kwal Aequorea 15 victoria, is ongeveer 720 bp groot en codeert voor een fluorescerend eiwit ("Green Fluorescent Protein" of "GFP" van ongeveer 238 aminozuren.

In de stand der techniek zijn ook een aantal varianten van het wildtype gfp-gen en GFP-eiwit en het gebruik hiervan als marker of label beschreven, waarvoor wordt verwezen naar de in Tabel 1 genoemde stand der techniek, alsmede naar bijvoorbeeld 20 WO 95/07463, WO 95/21191, WO 96/23810, WO 96/23898, WO 96/27675, WO

97/11094, WO 97/20078, WO 97/41228, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, WO 98/36081, US-A-5,491,084, US-A-5,625,048, US-A-5,741,668, US-A-5,777,079, US-A-5,804,387 en US-A-5,811,238.

Doel van de uitvinding is het verschaffen van een verbeterde gfp-variant. Meer 25 in het bijzonder is het doel van de uitvinding het verschaffen van een verbeterde gfp-variant, die -vergeleken met zowel het wildtype gfp als de bekende varianten hiervan-een combinatie vertoont van de volgende eigenschappen: verbeterde oplosbaarheid van het gecodeerde eiwit, met name in biologische vloeistoffen of -media zoals bijvoorbeeld voorkomen in de (levende) cellen 30 waarin het mutante gfp tot expressie wordt gebracht; versterkte fluorescentie van het gecodeerde eiwit; 1012782 2 verschuiving van de (voornaamste) excitatiepiek van/voor het gecodeerde eiwit naar het rode, dan wel naar het blauwe uiteinde van het electromagnetische spectrum; (versterkte) dubbele excitatiepiek van het gecodeerde eiwit; en/of 5 - verbeterde verenigbaarheid van het gen of eiwit met (heterologe) biologische systemen in vivo, zoals verbeterde expressie.

De uitvinding verschaft derhalve in een eerste aspect een variant van het gfp-gen, dan wel een nucleïnezuursequentie die hiervoor codeert, welke variant omvat, ten opzichte van de sequentie van het wild-type: 10 - ten minste één mutatie in ten minste één van de codons die coderen voor aminozuurposities 99,153 en/of 163, zodanig dat het door het variante gen gecodeerde eiwit een verbeterde oplosbaarheid vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; ten minste één mutatie in ten minste één van de codons die coderen voor 15 aminozuurposities 65, 66 en/of 67, zodanig dat het excitatiespectrum van het door het variante gen gecodeerde eiwit verschoven wordt naar het rode of blauwe uiteinde van het spectrum, vergeleken met het wildtype GFP; ten minste één mutatie in ten minste een van de codons die coderen voor aminozuurposities 163,167 en/of 175, zodanig dat het door het variante gen 20 gecodeerde eiwit verbeterde "dual excitation"-karakteristieken vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; en bij voorkeur tevens ten minste één mutatie in het codon dat codeert voor aminozuurpositie 64, zodanig dat het door het variante gen gecodeerde eiwit een versterkte fluorescentie vertoont, vergeleken met het wildtype GFP.

25 De mutaties op posities 65, 66 en/of 67 zijn hierbij bij voorkeur verder zodanig, dat het gecodeerde eiwit tevens een versterkte fluorescentie (d.w.z. emissie) vertoont, vergeleken met het wildtype GFP, in het bijzonder bij golflengten tussen 450 en 550 nm.

De uitvinding verschaft in een verder aspect een nucleïnezuursequentie of 30 genetisch construct, die/dat codeert voor de verbeterde gfp-variant volgens de uitvinding.

Deze sequentie/dit construct kan in de vorm van een DNA- of RNA-sequentie zijn en is bij voorkeur in de vorm van een dubbelstrengs-DNA. Zo kan de sequentie/het 1012782 3 construct in de vorm zijn van een synthetisch DNA - bijvoorbeeld verkregen zoals hieronder omschreven- dat al dan niet is geïntegreerd in het (genomisch) DNA van een gastheerorganisme; in een vorm die zich zelfstandig kan handhaven en/of repliceren in een gastheerorganisme; en/of in een vorm die stabiel kan worden overgedragen van een 5 gastheerorganisme naar een volgend (bijvoorbeeld door conjugatie of bij een kruising naar een volgende generatie), zoals een vector of een plasmide. De sequentie/het construct kan verder in een vorm zijn die geschikt is voor transformatie van een beoogd gastheerorganisme, zoals een plasmide of een andere transformatievector.

De nucleïnezuursequentie/het construct volgens de uitvinding kan verder andere 10 op zichzelf bekende elementen van nucleïnezuursequenties of genetische constructen omvatten, zoals promoters of andere regelelementen, terminators, transcriptionele en/of translationele enhancers, integratiefactoren, signaalsequenties en dergelijke, alsmede sequenties die coderen voor andere eiwitten of genetisch bepaalde eigenschappen, eventueel als fusie met de gfp-variant volgens de uitvinding, zoals hieronder nader 15 omschreven.

De uitvinding betreft verder de toepassing van de ^-variant volgens de uitvinding en/of het door deze variant gecodeerde fluorescerende eiwit als label of markering, in het bijzonder als genetische markering of expressiemarkering in vivo. Deze toepassing omvat in de regel ten minste een stap waarbij een gastheerorganisme 20 of een cel, deel of weefsel ervan wordt getransformeerd met een nucleïnezuursequentie of een genetisch construct dat codeert voor een gfp-variant volgens de uitvinding; en/of ten minste een stap waarbij een gfp-variant volgens de uitvinding in een gastheerorganisme, of een cel, deel of weefsel ervan, tot expressie wordt gebracht.

Verdere aspecten en voorkeursuitvoeringsvormen van de uitvinding zullen uit de 25 onderstaande beschrijving duidelijk worden.

De gfp-varianten volgens uitvinding omvatten bij voorkeur een combinatie van de volgende mutaties, ten opzichte van de sequentie van het wild-type: ten minste één mutatie in ieder van de codons die coderen voor aminozuurposities 99,153 en/of 163, zodanig dat gecodeerde eiwit een 30 verbeterde oplosbaarheid vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; ten minste één mutatie in ten minste een van de codons die coderen voor aminozuurposities 65,66 en/of 67, en bij voorkeur in het codon dat codeert voor aminozuurpositie 65, zodanig dat het excitatiespectrum van het gecodeerde eiwit 1012782 4 verschoven wordt naar het rode uiteinde van het spectrum, vergeleken met het wildtype GFP; ten minste één mutatie in ieder van de codons die coderen voor aminozuurposities 163,167 en/of 175, zodanig dat het gecodeerde eiwit 5 verbeterde "dual excitation"-karakteristieken vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; en ten minste één mutatie in het codon dat codeert voor aminozuurpositie 64, zodanig dat het gecodeerde eiwit een versterkte fluorescentie vertoont, vergeleken met het wildtype GFP.

10 De mutaties op posities 65, 66 en/of 67 zijn hierbij opnieuw bij voorkeur zodanig, dat het gecodeerde eiwit tevens een versterkte fluorescentie (d.w.z. emissie) vertoont, vergeleken met het wildtype GFP, in het bijzonder bij golflengten tussen 450 en 550 nm.

De bovenbedoelde mutaties kunnen een of meer inserties, deleties en/of 15 substituties omvatten van een of meer nucleotiden in/van de codons die coderen voor de bovengenoemde aminozuurposities, zodanig dat de aldus verkregen mutante sequentie codeert voor een GFP-variant met een gewijzigd of ingevoegd aminozuur op de genoemde posities, en/of waarbij op deze positie(s) een of meer aminozuren zijn verwijderd, steeds ten opzichte van de aminozuursequentie van het wildtype-GFP; of ?0 'en combinatie van een of meer van dergelijke mutaties. De mutaties omvatten bij . orkeur een of meer substitities, zodanig dat het mutante codon codeert voor een ander aminozuur als aanwezig op de betreffende positie in het wildtype GFP.

Bij voorkeur toegepaste aminozuursubstituties zijn weergegeven in de onderstaande Tabel 2 101 2782 5 TABEL 2

Aminozuurpositie Wild-type Variant volgens de uitvinding

64 F L of M

65 S C, T, G of A

66 67

99 F S

153 M Tof A

163 V A

167 I T

175 S G

5 In het bijzonder de voorkeur verdient 65 S naar T, meer in het bijzonder in combinatie met 64 F naar L, hetgeen een aanzienlijk versterkte fluorescentie kan geven. Verder verdient ook 153 M naar A de voorkeur. Een bij voorkeur toegepast voorbeeld van deze voorkeursuitvoeringsvorm is vermeld in Tabel 1.

De deskundige zal in staat zijn om -op basis van de genetische code en de 10 bekende gedegenereerdheid hiervan, alsmede de onderhavige beschrijving- codons te kiezen die coderen voor deze en andere geschikte in de uitvinding geschikte aminozuren/aminozuursubstituties. Of deze substituties leiden tot de gewenste verbeterde eigenschappen kan bijvoorbeeld worden vastgesteld door het gecodeerde eiwit tot expressie te brengen en de eigenschappen ervan te vergelijken met het 15 wildtype GFP en de bekende GFP-varianten, volgens op zichzelf bekende bepalingsmethoden.

De mutaties op posities 99, 153 en/of 163 volgens de uitvinding leiden tot verbeterde oplosbaarheid in van het mutante GFP in biologische vloeistoffen of -media, met name zoals voorkomen in de (levende) cellen waarin het mutante gfp tot expressie 20 wordt gebracht, zoals de cytosolfractie. Hiervoor kan de oplosbaarheid in water, in een fysiologische buffer of -oplossing, of een waterig celextract als een maat worden 101 2782 6 genomen, bijvoorbeeld in een (vergelijkende) in vitro proef. De uitvinding is niet beperkt tot een verklaring van deze verbeterde oplosbaarheid; zo kan dit veroorzaakt worden door de aanwezigheid van aminozuren met hydrofiele(re) zijketens, of door een wijziging in de tertiare structuur van het eiwit, zoals een veranderde 5 vouwing/driedimensionale structuur.

De mutaties op posities 163,167 en 175 volgens de uitvinding leiden tot verbeterde "dubbele excitatie” (“dual excitation")-karakteristieken van het eiwit. Wat hiermee wordt bedoeld blijkt uit Figuur 1, waarin de excitatie- en emissiespectra van het wildtype GFP, van enige GFP varianten uit de stand der techniek en van een GFP 10 variant volgens een voorkeuringsuitvoeringsvorm van de uitvinding zijn weergegeven.

Zoals blijkt uit Figuur 1 omvat het exitatiespectrum van het wild-type GFP een voornaamste piek, aangegeven met (I), en een secundaire piek, aangegeven met (II). Verbeterde "dubbele exitatie" volgens de uitvinding betekent dat - zoals eveneens weergegeven in Figuur 1- piek (II) in de GFP-varianten volgens de uitvinding versterkt 15 is ten opzichte van piek (I), dat wil zeggen in absolute zin of relatief

Hierdoor kan de GFP-variant volgens de uitvinding bij twee trajecten van golflengte worden aangestraald, dat wil zeggen bij een golflengte die overeenkomt met piek (I) en/of een golflengte die overeenkomt met piek (II), waar het wild-type GFP voornamelijk bij piek (I) moet worden aangestraald (zoals blijkt uit Figuur 1 is piek II 20 in wildtype GFP verwaarloosbaar, zodat instralen bij een overeenkomstige golflengte doorgaans weinig zinvol zal zijn).

De mogelijkheid van het (tevens) aanstralen van piek (II) in de GFP-variant kan nuttig zijn, daar hiermee het optreden van autofluorescentie (d.w.z. fluorescentie van bestanddelen van het te meten biologische monster anders dan het GFP, hetgeen met 25 name kan voorkomen bij golflengten die overeenkomen met piek (I)) kan worden vermeden. Dergelijke autofluorescentie kan in het bijzonder een probleem vormen wanneer wildtype GFP of bekende GFP varianten worden toegepast als in vivo markering in eukaryotisch weefsel of eukaryotische cellen, zoals plantencellen; de GFP varianten volgens de uitvinding zijn dan ook in het bijzonder geschikt voor deze 30 toepassing.

Bovendien zal - zoals blijkt uit Figuur 1- in de bij voorkeur toegepaste GFP-varianten volgens de uitvinding piek (II) bovendien een grotere (relatieve) intensiteit 101 2782 7 hebben dan piek (I), hetgeen een verdere reden is waarom instralen van deze GFP-varianten bij piek (II) i.p.v. bij piek (I) de voorkeur kan verdienen.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding heeft de GFP variant volgens de uitvinding een excitatie/emissiespectrum zoals weergegeven in Figuur 1, 5 d.w.z. met een eerste excitatiepiek (piek (I)) tussen ongeveer 355 en 435 nm (met een maximum van ongeveer 395 nm), een tweede excitatiepiek (piek (II)) tussen 450 nm en 520 nm (met een maximum van ongeveer 490 nm), en een emissiepiek tussen ongeveer 470 nm en 550 nm (met een maximum van ongeveer 510 nm). Hierbij is de 2e exitatiepiek versterkt t.o.v. het wildtype GFP (d.w.z. uitgezet als relatieve intensiteit 10 zoals in Figuur 1), terwijl ook de emissie is versterkt t.o.v. het wildtype (opnieuw uitgezet als relatieve intensiteit). Hierbij vertonen de GFP varianten volgens de uitvinding bovendien (vergeleken met bijvoorbeeld het bekende "eGFP") tevens een excitatiepiek tussen ongeveer 355 en 435 nm vertonen (d.w.z. "dubbele exitatie").

Met meer voorkeur is in de GFP varianten volgens de uitvinding “piek (II)” ten 15 minste even groot als “piek (I)”, en bij voorkeur ten minste 1,5 x zo groot, en met meer voorkeur ten minste 2 x zo groot, waarbij de "grootte" van de pieken de (relatieve) intensiteit van de maxima in het exitatiespectrum aangeeft ( d.w.z bij de golflengten van de betreffende maxima, die voor de verschillende GFP-varianten anders kunnen zijn).

20 De g#?-variant volgens de uitvinding omvat bij voorkeur een of meer substituties in de aminozuren 65,66 en/of 67 -die coderen voor de chromofoor- zodanig dat het exitatiespectrum van de tot expressie gebrachte GFP-variant is verschoven richting het rode deel van het spectrum (zogenaamde "red-shift"), vergeleken met het wildtype GFP. Hiervoor wordt bij voorkeur een enkele substitutie op aminozuurpositie 65 25 toegepast.

Verder kan volgens de uitvinding eventueel ook een aminozuursubstitutie op positie 66 -al dan niet in combinatie met substituties op positie 65 en/of 67- worden toegepast, hetgeen kan leiden tot verschuiving van het exitatiespectrum naar het blauwe deel van het spectrum ("blue shift"), waarbij een z.g. "BFP" of "Blue Fluorescent 30 Protein" kan worden verkregen. Hiervoor kunnen bijvoorbeeld de mutaties 66 Y naar H en 68 V naar I worden genoemd, eventueel in combinatie met 64 F naar M.

Een andere mutatie die kan worden genoemd voor aminozuur 66 is Y naar W.

1012782 8

Met "verschuiving van het exitatiespectrum naar het rode, dan wel het blauwe uiteinde van het spectrum" wordt hier bedoeld dat de voornaamste golflengte(n) waarbij het mutante GFP volgens de uitvinding kan worden ingestraald bij een langere golflengte (in nm) ligt (verschuiving naar het rode uiteinde) dan wel bij een kortere 5 golflengte ligt (verschuiving naar het blauwe uiteinde), ten opzichte van het spectrum van het wildtype. Hierbij kan al een verschuiving van 10 nm, bij voorkeur 15-25 nm, een aanzienlijke verbetering in de (gebruiks)eigenschappen van de variant geven, bijvoorbeeld doordat de voor de exitatie van de mutant te gebruiken golflengte(n) beter aansluit/aansluiten bij de doorgaans gebruikte (meetapparatuur. Zo heeft het 10 exitatiespectum van wildtype GFP een optimum bij ongeveer 395 nm, terwijl dit de optimum voor een naar het rode uiteinde van het spectrum verschoven mutant ("red shift'-mutant) volgens de uitvinding bij ongeveer 490 nm kan liggen, hetgeen beter overeenkomt met de golflengte van 488 nm die veel in meetapparatuur wordt toegepast. Een dergelijke kleine verschuiving in het excitatiespectrum, met name naar langere 15 golflengte(n), kan er ook al toe leiden dat het te meten biologische monster minder autofluorescentie en/of lichtverstrooing vertoont.

De bovengenoemde verschuiving kan zowel verkregen worden doordat het gehele exitatiespectrum is "opgeschoven" in golflengte vergeleken bij het wildtype, of slechts één piek hiervan, waarbij eventueel ook een tegelijk optredende versterking van 20 deze piek (met name door de verbeterde "dubbele exitatie") een bijdrage kan leveren. Dit is bijvoorbeeld weergegeven voor een "red shift" mutant volgens de uitvinding in Figuur 1, waarbij piek (I) hetzelfde maximum heeft als het wildtype GFP, maar waarbij piek (II) zowel is verschoven naar een langere golflengte (met ongeveer 15-20 nm), als ook versterkt is, ten opzichte van het wildtype.

25 Mogelijk te gebruiken golflengten voor de exitatie van de GFP-mutanten volgens de uitvinding zijn weergegeven in Tabel 3. Hierbij zijn steeds de maxima vermeld, waarbij een traject van + 40 nm, bij voorkeur + 20 nm, met meer voorkeur + 10 nm ten opzichte van het vermelde maximum wordt aangehouden. Een golflengte tussen haakjes geeft een ondergeschikte piek aan, terwijl bij een mutant met "dubbele 30 exitatie"-eigenschappen de maxima voor beide pieken zijn vermeld. Ter vergelijking is ook het wildtype vermeld.

1012782 9 TABEL3 GFP maximum wildtype 395 (470) uitv.: "red shift" 395 en 490 uitv.: "blue shift" 380

Verder kan de fluorescentie worden versterkt door de met veel voorkeur 5 toegepaste verdere substitutie op positie 64, bijvoorbeeld F naar M of bij voorkeur L.

Naast de bovengenoemde mutaties die leiden tot verschuivingen in het excitatiespectrum kan de g(p-variant volgens de uitvinding nog een of meer mutaties omvatten die leiden tot een verandering in het emissiespectrum, d.w.z. in de “kleur” van het eiwit. Hierbij kan met name een zogenaamd"YFP" of "yellow fluorescent 10 protein" worden verkregen, d.w.z. een GFP-variant die straalt met een “groen-gele” kleur, in plaats van met de “groene” kleur van het wildtype GFP. Hiervoor kunnen mutaties worden genoemd zoals (uitgedrukt als het gecodeerde aminozuur) 65 S naar G, 68 V naar L, 72 S naar A, en/of 203 T naar Y of I, of een geschikte combinatie hiervan.

15 Een verandering in het emissiespectrum kan in bepaalde GFP-varianten tevens gepaard gaan met een verandering in het excitatiespectrum. Zo kan de combinatie van 65 S naar G, 68 V naar L en 72 S naar A leiden tot een variant met een roodverschuiving in zowel het exitatie- als emissiespectrum, terwijl de combinatie van 64 F naar M, 66 Y naar H of W en 68 V naar I kan leiden tot een variant met een 20 blauwverschuiving in beide spectra. Ook YFP’s kunnen - naast de verandering van de geëmitteerde “kleur” - een verschuiving in (een van) de exitatiepiek(en) vertonen, zoals een roodverschuiving.

De overige codons in de sequentie van de g/p-variant volgens de uitvinding zijn bij voorkeur zodanig dat zij coderen voor de overeenkomstige aminozuren van het 25 wildtype GFP, dan wel voor de bekende varianten hiervan. Hiertoe kunnen deze codons hetzelfde zijn als in de wild-type g/p-sequentie of bekende varianten, dan wel codons die hiermee equivalent zijn door de bekende gedegenereerdheid van de genetische code. Zo kan de g/p-variant volgens de uitvinding worden gecodeerd door een sequentie of een construct (hier "equivalente sequenties" genoemd) die/dat in het 101 2782 10 geheel of voor een of meer delen ervan bestaat uit codons/nucleotiden die verschillen van de wildtype ^-sequentie, maar die coderen voor dezelfde aminozuren, zodanig dat de sequentie als geheel codeert voor de aminozuursequentie van het wildtype-GFP met de hierboven aangegeven mutaties die de gfp-variant volgens de uitvinding 5 definiëren.

Zo kan een geheel of gedeeltelijk synthetische sequentie worden toegepast, die een verhoogd of verlaagd, en bij voorkeur verlaagd, gehalte aan A-T heeft, vergeleken met de wildtype g/p-sequentie. Het gebruik van een dergelijke synthetische, semi-synthetische of gedeeltelijk synthetische sequentie kan leiden tot een verbeterde 10 expressie in, en/of een verbeterde verenigbaarheid met, het beoogde gastheerorganisme, zoals hieronder nader besproken.

Daarnaast kan de g/p-variant volgens de uitvinding ook een of meer mutaties omvatten in de codons die overeenkomen met andere aminozuurposities dan 64,65, 99, 153, 163, 167 en 175, d.w.z. in die aminozuren die in de GFP-varianten volgens de 15 uitvinding hetzelfde kunnen zijn als in het wildtype. Deze mutaties kunnen een of meer inserties (zoals een insertie van valine of alanine tussen aminozuurpositie 1 en aminozuurpositie 2 in de wildtype sequentie), deleties en/of substituties van een of meer nucleotiden omvatten, dan wel een combinatie hiervan, zodanig dat de aldus verkregen mutante sequentie (hier "analoge sequentie" genoemd) codeert voor een 20 GFP-variant met een of meer gewijzigde, een of meer ingevoegde, en/of een of meer verwijderde aminozuren, steeds ten opzichte van de aminozuursequentie van het wildtype-GFP; of een combinatie van een of meer van dergelijke mutaties.

Hierbij zijn deze mutaties bij voorkeur zodanig, dat de aldus verkregen sequentie nog steeds codeert voor een fluorescerend, GFP-achtig eiwit. Met meer voorkeur is de 25 g/p-variant volgens de uitvinding dusdanig dat ten minste 50%, bij voorkeur ten minste 70%, met meer voorkeur ten minste 90% van de aanwezige aminozuren overeenkomen met de aminozuren op de overeenkomstige van het wildtype GFP (waarbij de aminozuurposities 64, 65,99, 153, 163, 167 en 175 buiten beschouwing worden gelaten, en een deletie en/of insertie van één aminozuur wordt gezien als een enkele 30 mutatie).

Een aantal op zichzelf bekende aminozuursubstituties -vergeleken met het wildtype GFP- die kunnen worden toegepast - alleen of in combinatie -in de uitvinding zijn weergegeven in Tabel 4.

101 2782 11 TABEL 4

Aminozuur Wild-type Mutatie

2 S G

80 Q R

123 I V

145 Y F ofH

146 N I

148 H R

202 S F

203 T I of Y

212 N K

231 H L

238 K E, N of Q

5 Andere mogelijke op zichzelf bekende, echter met minder voorkeur toegepaste substituties worden bijvoorbeeld beschreven in WO 95/21191, WO 96/23810, WO 96/27675, WO 97/11094, WO 98/06737, WO 98/21355, WO 98/36081, US-A-5,625,048, US-A-5,741,668, US-A-5,777,079.

De uitvinding omvat verder fragmenten van de variante ^-sequenties volgens 10 de uitvinding, d.w.z. nucleïnezuursequenties en/of constructen die voor een of meer, al dan niet aaneengesloten delen van de GFP-varianten volgens de uitvinding coderen. Deze fragmenten hebben echter bij voorkeur een zodanige grootte dat zij nog steeds coderen voor ten minste bij voorkeur ten minste 80%, met meer voorkeur ten minste 90% van de aminozuren van de GFP-variant volgens de uitvinding, en nog steeds ten 15 minste de hierboven beschreven mutaties volgens de uitvinding bevatten, d.w.z. op posities 64-67,99,153,163,167,175 van de overeenkomstige "volledige" GFP-variant volgens de uitvinding.

Met name omvatten dergelijke fragmenten varianten waarvan een of meer aaneengesloten codons vanaf het 3'- en/of het 5'-uiteinde zijn verwijderd, zodanig dat in 20 het gecodeerde eiwit een of meer van de aminozuren 1-20 en/of 218 - 238 zijn 101 2782 12 verwijderd, vergeleken met de widltype sequentie. Hierbij zijn bij voorkeur slechts een of meer van de aminozuren 1-7 en/of 229-238, met meer voorkeur slechts een of meer van de aminozuren 1-2 en/of 232-238 verwijderd.

Een bij voorkeur toegepaste nucleïnezuursequentie en aminozuursequentie die 5 coderen voor de ^-variant volgens de uitvinding zijn weergegeven in respectievelijk SEQ ID NO.1 en SEQ ID NO. 2. Zoals vermeld omvat de uitvinding tevens equivalente nucleïnezuursequenties die coderen voor dezelfde aminozuurvolgorde, en nucleïnezuursequenties met en of meer mutaties buiten de aminozuurposities 64-67, 99, 153, 163, 167, 175 in SEQ ID 1 en/of 2, alsmede fragmenten van al deze sequenties.

10 Een voorbeeld van een volgens de uitvinding bij voorkeur toegepaste vector is weergegeven in Figuur 2.

De (nucleïnezuursequenties en constructen die coderen voor de) ^-varianten volgens de uitvinding kunnen op een op zichzelf bekende wijze worden verkregen, zoals door synthese met een geautomatiseerde nucleïnezuur-synthetiseerinrichting; 15 door het aanbrengen van (punt)mutaties in een nucleïnezuur dat codeert voor een wild-type gfp en/of een van de bekende g/p-varianten; en/of door het op geschikte wijze combineren van delen van de nucleïnezuursequenties die coderen van het wild-type gfp-gen en de bekende gfp- varianten, dat wil zeggen door het gebruik van een of meer restrictie-enzymen en ligasen. Deze en andere geschikte technieken worden beschreven 20 in Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) of F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987), als ook in bijvoorbeeld WO 95/21191, WO 96/23810, WO 96/27675, WO 97/11094, WO 98/06737, WO 98/21355, WO 98/36081, US-A-5,625,048, US-A-5,741,668 en US-A-25 5,777,079.

De gfp- varianten volgens de uitvinding worden echter bij voorkeur vervaardigd door middel van een of meer PCR-reacties, waarbij de gewenste mutaties door het gebruik van gemodificeerde primers (d.w.z. met een geschikte "mismatch" t.o.v. de als matrijs ("template") gebruikte uitgangssequentie(s)) op de hierboven vermelde posities 30 in de door amplificatie verkregen nucleïnezuursequenties worden ingebouwd. Hierbij worden - zoals nader uiteengezet in het Experimentele Gedeelte - in de regel een of meer afzonderlijke PCR-reacties uitgevoerd, die ieder leiden tot een deel van de totale sequentie van de g/p-variant volgens de uitvinding, of leiden tot de gehele sequentie, 1012782 13 waarbij de primers met de gewenste mutatie(s) de uiteinden van de verkregen geamplificeerde fragmenten zullen vormen. Deze fragmenten worden vervolgens samengevoegd, eventueel met een of meer delen van de wildtype g^-sequentie of van de sequentie(s) van bekende gjp-varianten, waarbij de volledige g/p-variant volgens de 5 uitvinding wordt verkregen.

De PCR-reacties en de verdere bewerkingen, zoals het samenvoegen van de verschillende fragmenten, kunnen op een op zichzelf bekende wijze worden uitgevoerd, bijvoorbeeld zoals hieronder omschreven of met de technieken uit US-A-4,683,202; Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491 or PCR Protocols, 1990, Academic Press, San 10 Diego, California, USA. Voor de als matrijs in de PCR-reactie gebruikte uitgangssequentie(s) kunnen een of meer geschikte fragmenten van de wildtype gfp-sequentie worden gebruikt, en/of een of meer fragmenten van op zichzelf bekende gfp-varianten, die eventueel reeds een of meer van de gewenste mutaties kunnen omvatten.

De nucleïnezuursequentie van de g#?-variant volgens de uitvinding is bij 15 voorkeur zodanig dat deze verenigbaar is met de cellen, het weefsel of het organisme waarin deze tot expressie moet worden gebracht. Dit betekent met name dat -na expressie van het gen- een fluorescerend eiwit wordt gevormd/verkregen, bij voorkeur zonder toxische of afweerreacties.

Zo is het bekend dat expressie van de wild-type g#?-sequentie in planten zoals 20 Arabidopsis kan leiden tot een gedeeltelijk of zelfs geheel verstoorde vorming van het fluorescerende eiwit. Aangenomen wordt dat dit wordt veroorzaakt doordat Arabidopsis delen van de wild-type ^-sequentie na transcriptie "herkent" als intronsequenties, die vervolgens uitgesplitst worden. Dit kan worden ondervangen door het gebruik van een variante sequentie met -ten opzichte van de wildtype g^?-sequentie-25 een of meerdere gewijzigde codons die niet door het gastheerorganisme als (deel van een) intronsequentie worden herkend. Voorbeelden van geschikte gemodificeerde codoris worden gegeven in de in Tabel 1 genoemde stand der techniek, en omvatten bijvoorbeeld het gebruik van gewijzigde codons op base-posities 237-447,237-540. Ook kan een geheel synthetische sequentie met volledig gewijzigde codons ten 30 opzichte van de wild-type sequentie worden toegepast. G#?-varianten volgens de uitvinding met dergelijke gemodificeerde codons kunnen bijvoorbeeld worden verkregen door een of meer overeenkomstige sequenties te gebruiken als uitgangssequentie(s) tijdens de PCR-reactie, zoals hierboven beschreven.

101 2782 14

De door de g/p-varianten gecodeerde fluorescerende eiwitten kunnen vervolgens worden verkregen door de aldus verkregen sequentie tot expressie te brengen in een geschikt gastheerorganisme, bij voorkeur in een micro-organisme zoals een bacterie, en de GFP-variant op een op zichzelf bekende wijze te isoleren, waarvoor bijvoorbeeld 5 wordt verwezen naar WO 95/07463 en WO 96/23810.

De g/p-variant volgens de uitvinding en het hierdoor gecodeerde fluorescerende eiwit kunnen op dezelfde wijze en voor dezelfde toepassingen worden gebruikt als het wild-type gfp-gen en -eiwit en de reeds bekende varianten hiervan, dat wil zeggen als een label of markering in (micro)biologische, biochemische en/of moleculair 10 biologische technieken. Zo kan het door de g/p-varianten volgens de uitvinding gecodeerde eiwit worden gebruikt als een fluorescerende markering of label in in vitro essays en bepalingen, waaronder hybridisatie-essays en immunologische bepalingen (zoals ELISA's) en dergelijke.

De g/p-variant en het hierdoor gecodeerde eiwit zijn echter in het bijzonder 15 geschikt als markering en/of label voor toepassing in vivo, dat wil zeggen in eukaryotische of prokaryotische organismen zoals planten, dieren, mensen, bacteriën, schimmels, algen, gist en andere micro-organismen, alsmede in weefsels of cellen van deze organismen of hiervan afgeleide cellijnen.

Zo kan de g/p-variant volgens de uitvinding worden gebruikt als genetische 20 markering, dat wil zeggen om aan te geven dat een of meer nucleïnezuursequenties, genen en/of genetisch bepaalde eigenschappen zijn overgedragen in of naar een beoogd organisme. Voorbeelden zijn de transformatie van prokaryotische of eukaryotische cellen of organismen (waarbij de al dan niet gebruikte transformatievector naast de gewenste sequentie(s) tevens de g/p-variant volgens de uitvinding zal omvatten), of het 25 doorgeven van een of meer eigenschappen bij een kruising van de oudergeneratie naar de nakomelingen (waarbij de sequenties voor gfp-variant en de gewenste eigenschap zodanig zullen samenhangen dat aanwezigheid van de g^-variant in de nakomelingen indicatief is voor het verkrijgen van de gewenste eigenschap).

De g#?-variant volgens de uitvinding kan verder worden gebruikt als een 30 "reporter" om aan te geven dat een gewenste sequentie, een gewenst gen of een gewenste eigenschap in een organisme, weefsel of cel tot expressie wordt gebracht, waarbij de expressie van de g/p-variant en de gewenste sequentie/gen/eigenschap onder 1012782 15 regeling van dezelfde regelelementen zal staan, dan wel onder regeling van regelelementen die door dezelfde factor(en) worden geïnduceerd.

Een andere mogelijke toepassing is expressie-analyse, zoals onderzoek naar de werking van regelelementen zoals promoters en enhancers, bijvoorbeeld voor het 5 volgen/bepalen van de expressie in de tijd of onder invloed van inducerende factoren (m.i. v. schadelijke factoren zoals ziekten, stress, zware metalen of droogte), en/of de expressie in verschillende weefsels of organen of in verschillende ontwikkelingsstadia van een organisme.

Verder kan de gfp-variant bijvoorbeeld worden gebruikt voor locatie-analyse, 10 met name om na te gaan naar welke delen of weefsels van de plant, welke cellen of welke delen/organellen van de cel een bepaald genproduct of expressieproduct wordt gericht (bijvoorbeeld ten gevolge van de aanwezigheid van een bepaalde leadersequentie). Hierbij zal dit product in de regel als een fusie met de g/^-variant volgens de uitvinding tot expressie worden gebracht. Een ander voorbeeld van 15 dergelijke locatie-analyse omvat bijvoorbeeld het volgen in de tijd van het verspreiden van een virus of een soortgelijk pathogeen door een plant.

Voor verdere mogelijke toepassingen van het mutante gfp volgens de uitvinding wordt verwezen naar de bovengenoemde literatuur, in het bijzonder WO 95/07463, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737 en met name de toepassingen in planten 20 beschreven in WO 97/41228.

De variant volgens de uitvinding kan in deze organismen worden ingebracht in de vorm van een geschikt construct of een geschikte vector, waarmee dit organisme getransformeerd kan worden, waaronder bekende transformatie-vectoren zoals plasmiden.

25 Voorbeelden van geschikte technieken voor het transformeren van planten zijn bijvoorbeeld transformatie met Agrobacterium, of transformatie met "naakt" DNA, bijvoorbeeld door beschieten met deeltjes of door transformatie van protoplasten door bijvoorbeeld electroporatie of behandeling met PEG. Voorbeelden van geschikte vectorsystemen voor toepassing met Agrobacterium zijn bijvoorbeeld binaire vectoren 3 0 zoals pBI 121 en afgeleiden daarvan; co-integraatvectoren zoals pGV 1500 en afgeleiden van pBR322. Geschikte vectorsystemen voor transformatie met naakt DNA zijn bijvoorbeeld E.coli-vsctoren met hoog kopieergetal, zoals pUC-vectoren en pBluescript II (SK+) vectoren. Ook alle andere op zichzelf bekende systemen voor de transformatie 101 2782 16 van planten kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld zoals vermeld in WO 97/41228. Geschikte transformatiesystemen voor mensen en menselijke cellen, dieren en dierlijke cellen, alsmede bacteriën, gist(cellen), algen en virussen worden bijvoorbeeld beschreven in WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 5 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737 en WO 98/21355.

De constructen volgens de uitvinding kunnen, naast de nucleïnezuursequentie die codeert voor de g/p-variant volgens de uitvinding, tevens een promotor omvatten, die op werkzame wijze is verbonden met de nucleïnezuursequentie die codeert voor de gfp-variant volgens de uitvinding, waarmee wordt bedoeld dat de promotor in staat is 10 de expressie van de gfp-\ariant in het gewenste organisme te induceren/regelen. Hiervoor is ten minste vereist dat de g#?-variant zich in het juiste afleesraam en de juiste oriëntatie ten opzichte van de promotor bevindt.

De promotor kan iedere geschikte, in het gewenste organisme werkzame promotor zijn, waaronder constitutieve en induceerbare promotors. Voorbeelden van 15 geschikte promotors voor toepassing in planten en plantencellen zijn bijvoorbeeld constitutieve promoters zoals de nos-promoter, de CaMV 35S promoter, de actine promoter en de mas (mannopinesynthase) promoter of induceerbare promoters zoals de WIN ("wound inducible") promoter en de HMGR (HydroxymethylglutarylCoA reductase) promoter. Andere geschikte promoters voor toepassing in planten worden 20 bijvoorbeeld vermeld in WO 97/41228.

Geschikte promoters voor toepassing in mensen en menselijke cellen, dieren en dierlijke cellen, alsmede bacteriën, gist(cellen), algen en virussen worden bijvoorbeeld beschreven in WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737 en WO 98/21355.

25 Verder kunnen promotors worden gebruikt die slechts in een specifiek deel of weefsel van een organisme geïnduceerd worden, zoals alleen in de bladeren of de wortels van een plant; dan wel promotors die alleen tijdens een bepaalde ontwikkelingsfase van het organisme geïnduceerd worden; of promoters die alleen geïnduceerd worden onder specifieke omstandigheden, zoals het optreden van bepaalde 30 ziektenbeelden of afweerreacties. Voorbeelden van geschikte weefselspecifieke promoters zijn de patatin promoter, GBSS promoter en plastocyanine promoter, alsmede de weefselspecifieke promoters voor toepassing in planten vermeld in WO 97/41228; een voorbeeld van een promoter die geactiveerd wordt gedurende een 101 2782 17 bepaalde ontwikkelingsfase van de plant is de S AG12 promoter (van het Arabidopsis "senescence associated gene").

In het construct volgens de uitvinding kan de g#?-variant worden voorafgegaan door een of meer sequenties die coderen voor signaalei witten, zoals pre-, pro- of 5 prepro-sequenties, zodanig dat de variante GFP als een fusie met deze signaaleiwitten tot expressie wordt gebracht. Dit kan met name van belang zijn wanneer het construct volgens de uitvinding wordt toegepast in eukaryotische organismen zoals planten en dieren, en/of voor het verkrijgen van de post-translationele modificaties, zoals de modificaties die leiden tot de vorming van de chromofoor.

10 De signaalsequentie kan ook een sequentie zijn die ervoor zorgt het dat het expressieproduct specifiek gericht wordt op bepaalde delen en/of organellen binnen de cel. Voorbeeld is de N-eindstandige signaalsequentie MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEF in combinatie met de C-eindstandige sequentie HDEL, die ervoor zorgt dat het tot expressie gebrachte eiwit zich richt op het endoplasmatisch reticulum. Dit zou 15 mogelijke toxische of afweerreacties in de cellen, weefsels en/of organismen waarin het gfp-gen tot expressie wordt gebracht, kunnen voorkomen of verminderen. Andere voorbeelden van signaalsequences voor toepassing in planten worden bijvoorbeeld gegeven in WO 97/41228.

Voor de verdere regelelementen die in de constructen volgens de uitvinding 20 aanwezig kunnen zijn, zoals terminators, transcriptionele en/of translationele enhancers en integratiefactoren, worden bijvoorbeeld genoemd in WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737 en WO 98/21355.

Volgens een bijzondere uitvoeringsvorm codeert het construct volgens de 25 uitvinding voor een fusie van de g/p-variant met een of meer verdere gewenste genen, waarbij het variante GFP op geschikte wijze kan optreden als "reporter" voor de expressie van -of meer algemeen voor de aanwezigheid van- deze genen.

Deze genen kunnen bijvoorbeeld coderen voor eiwitten of peptiden die het getransformeerde organisme van een of meer verbeterde eigenschappen voorzien, zoals 30 resistentie tegen ziekten, stress, zware metalen en dergelijke. De fusies kunnen ook worden gebruikt voor expressie-analyse of onderzoek naar de biologische functie.

Voorbeelden van genen/eiwitten die als fusie met de GFP-variant volgens de uitvinding in planten of plantencellen tot expressie kunnen worden gebracht zijn 1012782 18 (omschreven als de uiteindelijke fusie) β-glucuronidase/GFP; plant plasmamembraan eiwit AIR1/GFP6, of phragmoplastine/GFP.

In het construct volgens de uitvinding kan een dergelijke fusie ook worden voorafgegaan door een of meer sequenties die coderen voor signaaleiwitten, zoals de 5 hierboven vermelde signaalsequenties, zodanig dat de GFP/eiwit-fusie als een verdere fusie met deze signaaleiwitten tot expressie wordt gebracht. Dit kan met name van belang zijn wanneer het construct volgens de uitvinding wordt toegepast in eukaryotische organismen zoals planten en dieren, en/of voor het verkrijgen van de post-translationele modificaties, zowel aan de GFP-variant als het gefuseerde eiwit, met 10 inbegrip van afsplitsing van het GFP en het eiwit.

De aanwezigheid van de gfp-variant in een cel, weefsel of gastheerorganisme kan op een op zichzelf bekende wijze worden aangetoond, met name door het gecodeerde GFP tot expressie te laten komen en de aanwezigheid hiervan vast te stellen, bij voorkeur op een op zichzelf wijze, zoals door middel van 15 fluorescentietechnieken. Hierbij wordt in de regel de GFP-variant volgens de uitvinding ingestraald met licht/straling van een geschikte golflengte, waarna de verkregen fluorescentie wordt bepaald, d.w.z. optisch, met een microscoop, of met geschikte apparatuur. Hierbij kan de mate van fluorescentie tevens een maat zijn voor de mate van expressie.

20 De uitvinding zal nu worden toegelicht aan de hand van het onderstaande

Experimentele Gedeelte.

Experimentele Gedeelte

Beginjaren negentig werd het wild-type (wt) gfp-gen uit de kwal (Aequorea 25 victoria) ontdekt en gekarakteriseerd. Sindsdien heeft het gebruik van dit gen belangrijke bijdragen geleverd in zowel wetenschappelijk als toegepast biotechnologisch onderzoek.

Het gfp-gen codeert voor Green Fluorescent Protein (GFP), een eiwit met een aantal unieke eigenschappen. Wt-GFP is een 27 kDa monomeer en is opgebouwd uit 30 238 aminozuren. Het eiwit straalt groen licht uit (maximale emissie bij ongeveer 510 nm) wanneer het wordt aangestraald met UV (maximale absorbtie bij ongeveer 395 nm) of blauw (maximale absorbtie bij ongeveer 470 nm) licht. Het licht-absorberende gedeelte van wt-GFP, de chromofoor, bestaat uit een gecircularizeerd tripeptide en kan 1012782 19 alleen fluoresceren wanneer het covalent is gebonden aan, en volledig wordt ingesloten door, de rest van het eiwit. De chromofoor is afgeleid van S65-Y66-G67 van de primaire eiwitsequentie en wordt gevormd door modificaties na translatie van het gfp-gen.

5 De functionaliteit van het gfp-gen, en hiervan afgeleide varianten, is reeds aangetoond in allerlei andere organismen, zoals bacteriën, schimmels, dieren, mensen en planten. De aangetoonde fluorescentie in deze organismen blijkt niet afhankelijk te zijn van bepaalde (toegevoegde) co-factoren of substraten (anders dan zuurstof). Bovendien blijkt GFP zeer stabiel te zijn. Zelfs bij hoge hitte (tot 65°C), extreme pH 10 (tussen 5.5 en 12), vele organische oplossingen en een aantal denaturerende stoffen blijft GFP fluoresceren.

Door al deze eigenschappen tesamen is GFP een ideale in vivo reporter voor gebruik in planten. Andere tot nu veel gebruikte reporters in planten, zoals beta-glucuronidase (GUS) en luciferase (LUC), vereisen de toevoeging van substraat om 15 reporter-activiteit te kunnen detecteren. In het geval van GUS is dit zelfs destructief voor het te analyseren materiaal door cytotoxische effecten.

Er zijn vele andere toepassingen met GFP denkbaar. Zo kan GFP bijvoorbeeld in plaats van GUS of LUC worden gebruikt als reporter voor hét selecteren van getransformeerde planten. Transformanten zijn makkelijker te identificeren op een niet-20 destructieve manier en grote aantallen planten kunnen sneller geanalyseerd worden, en de kostenbesparingen die hiermee bereikt zouden kunnen worden zouden het mogelijk kunnen maken om ook economisch minder interessante gewassen te transformeren.

GFP kan ook gebruikt worden als een zogenaamde fluorescerende markering (’’fluorescent tag”) voor andere eiwitten. Hierbij wordt gebruik gemaakt van de 25 eigenschap dat GFP functioneel kan blijven wanneer het gfp-gen in frame wordt gefuseerd aan het amino- of carboxy-eindstandige uiteinde van een ander eiwit. Subcellulaire activiteiten van zo’n op deze wijze gemarkeerd eiwit, zoals genexpressie, eiwit-eiwit-interacties, eiwit-“traffïcking” en eiwit-localizatie kunnen zodoende bestudeerd worden.

30 Een ander denkbare toepassing met GFP is het volgen van pathogenen in de plant op zowel macro- als microscopisch niveau. Zo zouden bijvoorbeeld virale infecties kunnen worden bestudeerd door van een virus manteleiwit-genen te vervangen met een g/p-gen.

101 2782 20

De bruikbaarheid van het originele (wt) gfp-gen in Arabidopsis, en waarschijnlijk andere planten, is beperkt door de aanwezigheid van een cryptisch intron, waarbij door aberante splicing een niet-functioneel GFP ontstaat. Dit probleem kan voor planten worden opgelost door het codon-gebruik aan te passen. Een andere 5 reden om het codon-gebruik aan te passen kan er in gelegen zijn dat, door verlaging van het relatief hoge A/T-gehalte in het wt-gfp-gen, betere expressie in planten wordt verkregen. Verder is het mogelijk gfp-varianten voor planten te voorzien met een signaalpeptide, waardoor GFP wordt gestuurd naar het lumen van het ER, bijvoorbeeld om een verondersteld toxisch effect in het cytoplasma of het nucleoplasma te 10 voorkomen, en/of om het regenereren van de getransformeerde planten beter te laten verlopen. Een mogelijk nadeel echter van lokalisatie of retentiesignalen is dat een dergelijk GFP eventueel niet meer voor lokalisatie-studies (microscopisch) binnen de cel gebruikt kan worden.

Een ander doel bij het ontwerpen van gfp- varianten is het minimaliseren van het 15 toxisch door aggregatie in de cel tegen te gaan. Hierbij kunnen zg. "soluble modified" (sm) gfp-varianten worden verkregen, die tevens kunnen zorgen voor verhoging van fluorescentie, omdat oplosbaar GFP wél en geaggregeerd GFP niet functioneel is.

G/p-varianten kunnen in wezen worden onderverdeeld in vier klassen, op basis van verschillende excitatie/emissie spectra: 1) GFP; 2) red-shift (RS)GFP; 3) YFP 20 (Yellow Fluorescent Protein) en 4) BFP (Blue Fluorescent Protein). Red shift- en Blue Fluorescent Protein-varianten kunnen bijvoorbeeld worden verkregen door mutaties waarbij de wt-aminozuren S65 en Y66 (maar in de regel niet G67) van de chromofoor worden gesubstitueerd. Emmissie van de kleur blauw, in plaats van groen, door Blue Fluorescent Protein-varianten wordt voornamelijk veroorzaakt door substitutie van wt-25 Y66 met met name H66 of W66 (oftewel mutatie Y66H en Y66W).

Voor alle genoemde klassen kan hierbij eventueel ook het chromofoor flankerende wt-aminozuur F64 worden gesubstitueerd.

GFP-varianten volgens de uitvinding van het Yellow Fluorescent Protein-type kunnen bijvoorbeeld worden verkregen door mutaties waarbij (teri opzichte van de 30 wildtype-sequentie) de aminozuren S65, V68, S72, en/of T203 worden gesubstitueerd.

Zoals reeds vermeld zullen deze "YFPs" zullen emitteren met een geel/groene kleur, in plaats van met de groene kleur van het wildtype.

1012782 21

De keuze voor een bepaalde GFP-variant zal afhangen van de toepassing waarvoor een bepaalde variant gebruikt wordt. In het geval van planten dient rekening gehouden te worden met autofluorescentie van plantendelen. Sommige uit de stand der techniek bekende GFPs en BFPs blijken in wortel niet of moeilijk te detecteren. smRS-5 GFP en smGFP zijn daarentegen wel detecteerbaar in wortel. Daarnaast kunnen redshift g#?-varianten intensere fluorescentie vertonen.

De bruikbaarheid van een variant volgens de uitvinding kan bijvoorbeeld op basis van de volgende criteria beoordeeld worden: 1- Aangepast codongebruik (geen cryptisch intron en verlaagd A/T-gehalte voor 10 hogere expressie in eukaryoten).

2- Red-shift (excitatie piek meer in overeenstemming met bandbreedte gebruikte filters, hogere excitatie-coefficient, snellere chromophore-formering, minder last van autofluorescentie in plantdelen) 3- Bij voorkeur geen signaalpeptiden (onbruikbaar wanneer een gefuseerd eiwit 15 gelokalizeerd moet worden) 4- Mutaties waarmee een hogere fluorescentie wordt verkregen (al dan niet door verhoging van de "oplosbaarheid" van GFP in de cel (geaggregeerd GFP is in de regel weinig of niet actief).

Geen van de in Tabel 1 vermelde, uit de stand der techniek bekende varianten 20 voldoet in afdoende mate aan al deze criteria.

Voorbeeld 1: Constructie g/b-variant volgens de uitvinding (smeg/pk

Uitgegaan werd van de bekende sequentie van het egfp-gen (van pEGFP, Clontech). In deze sequentie werden de zogenaamde "soluble modification"-mutaties 25 F99S, M153T, V163A en S175G en de "dual excitation peak" mutatie I167T

geïntroduceerd. De in de uitgangssequentie aanwezige mutatie H231L (betekenis onbekend) werd in de originele staat (L231H) terug gebracht. Een 6e mutatie, K238Q, ontstond door de gekozen strategie van kloneren waarbij een Λ/wNI-restrictiesite in het Qgfp-gen werd geïntroduceerd. Deze mutatie valt echter niet binnen het bij voorkeur 30 aangehouden minimale gebied van gfp (aminozuur 7 t/m 229) voor fluorescentie, zodat deze mutatie geen (negatieve) invloed heeft op het niveau van fluorescentie.

Om de mutaties te introduceren werden twee primersets (set “1” en set “2”) van ieder 2 primers ( d.w.z. primers “la/lb” en “2a/2b”) ontworpen, te weten: 101 2782 22

Primer la: 5 ’ -AATTCG A ACC ATCT C3TTC AAGGACGACGGC AACT AC-3’ 5 Primer lb: 5 ’ -TAGGCCTTGATCCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCGTGATA-3 ’

Primer 2a: 5 ’-CATATGGATCTTCGCGAACTTCAAGACrcGCC ACAACATCGA 10 GACGGCGGCGTG-3 ’

Primer 2b: 5 ’ - AAC AGCTACT GGT AC AGCTCGTCC AT GCC4 7GAGTGATCCCGG-3 ’ 15 Deze sequenties zijn tevens weergegeven in respectievelijk SEQ ID’s no 3 t/m 6. Deze primersets zijn ontworpen om aminozuren te substitueren in het als uitgangsproduct gebruikte egfp-gen van plasmide pEGFP (Clontech) d.m.v. PCR. De base(n) welke resulteren in de mutaties zijn vet en cursief weergegeven en zijn als volgt (vanaf 5’-uiteinde): primer la: F99S; primer lb: M153T ; primer 2a: V163A; 1167T; 20 S175G; primer 2b: K238Q; L231H. De onderlijnde basen geven de restrictie-sites in deze primers weer, en zijn (opnieuw vanaf het 5’-uiteinde): primer la: ZfcfBI; primer lb: SM; primer 2a: NdeI; Nrul; primer 2b: Alwl.

De nucleotidenvolgorden (bepaald met BaseClear) van de twee met deze 25 primersets verkregen PCR-producten zijn weergegeven in SEQ ID NO 7 (verkregen met primerset 1) en SEQ ID NO 8 (verkregen met primerset 2). De nucleotidenvolgorden van de gebruikte primers vormen het 5-’en 3’- uiteinde van deze PCR-ffagmenten.

Als "target"-sequenties voor primerset 1 en 2 fungeerden respectievelijk het 30 "midden"- en het 3'-gedeelte van egfp uit pEGFP. Met elke primerset werd vervolgens een PCR-reactie, inclusief een zogenaamde "hot"-start, uitgevoerd met behulp van de GeneAmp XL PCR kit (PE applied Biosystems). De met primerset 1 en 2 verkregen PCR-producten werden vervolgens gekloneerd in vector pCR®2.1 met behulp van de 101 2782 23 “Original TA Cloning Kit” (Invitrogen). De verkregen ligatieproducten werden door middel van electroporatie naar E.coli “ElectroMAX DH10B™-cellen" (GibcoBRL life technologies) getransformeerd. Hierbij werd het door “GibcoBRL life technologies” verstrekte transformatieprotocol gevolgd. De basevolgorde van de in pCR®2.1 5 gekloneerde PCR-producten werden bepaald door BaseClear (Leiden) en staan weergegeven in SEQ ID no 7 en 8..

De geamplificeerde gedeelten van egfp bleken, afgezien van de sequenties van de gebruikte primers met de mutaties, 100% identiek te zijn met de "targef'-sequenties van het egfp-gen in pEGFP. Het open leesraam van de nieuwe ^-variant werd 10 vervolgens gereconstrueerd door middel van een drie-punts ligatie waarbij de volgende drie fragmenten aan elkaar werden geligeerd: 1) een niet-gemodificeerd 5' gedeelte van het egfp uit pEGFP.

2) het gemodificeerde "midden"-deel van egfp (verkregen met primerset 1).

3) het gemodificeerde 3'-deel van egfp (verkregen met primerset 2).

15 Het niet-gemodificeerde 5' gedeelte van egfp werd verkregen uit pEGFP door middel van digestie met de restrictie-enzymen Asel en HihPl. Hierbij werd een fragment van ongeveer 0,47 kb geïsoleerd. Het tweede fragment werd verkregen uit de pCR®2.1 -vector met het gemodificeerde "midden"-deel van egfp. Na digestie hiervan met de restrictie-enzymen 5siBI en Stul werd een fragment van ongeveer 0,2 kb 20 geïsoleerd. Het derde fragment werd verkregen door digestie van de pCR®2.1 -vector met het gemodificeerde 3'-deel van egfp. Hiervoor werden de restrictie-enzymen Ndel en Nruï gebruikt waardoor een fragment (inclusief de pCR®2.1-vector) van ruim 4,1 kb kon worden geïsoleerd. Alle fragmenten werden verkregen door middel van standaard gelelectroforese- en isolatietechnieken. Voor isolatie van de fragmenten werd de 25 “QiaexII gel extraction kit” (Qiagen) gebruikt. Na ligatie van de drie fragmenten werd het ligatiemengsel door middel van electroporatie naar E.coli “ElectroMAX DH10B™"-cellen (GibcoBRL life technologies) getransformeerd. Hierbij werd het door “GibcoBRL life technologies” verstrekte transformatieprotocol gevolgd. Op de geïncubeerde platen werden, met behulp van een “Leica MZ FLIII” fluorescentie 30 stereomicroscoop, duidelijke fluoriserende kolonies waargenomen. Dit bewijst dat ligatie van de fragmenten heeft geresulteerd in een volledig open leesraam. Ook restrictie-analyses uitgevoerd op plasmide DNA geïsoleerd van fluoriserende kolonies wezen dit uit.

1012782 24

Het aldus verkregen plasmide, genaamd pKG1620, dat het het gfp-gen volgens de uitvinding, genaamd smegfp, bevat, is schematisch weergegeven in Figuur 2. De totale sequentie van pKG1620 is afgeleid van de gepubliceerde vector pCR®2.1 (base 438-4346), de gepubliceerde vector pEGFP (base 4347-4816) en de sequenties zoals 5 bepaald door BaseClear van de met primerset 1 (base 1-202) en 2 (base 203-437) verkregen PCR-producten.

In pKG1620 is het gfp-gen volgens de uitvinding gefuseerd aan een als voorbeeld gegeven lac-gen (daarnaast wordt in pKG1620 tevens de /ac-promoter toegepast). Het zal de deskundige duidelijk zijn dan dit lac-gen door een of meer 10 andere, van belang zijnde genen kan worden vervangen.

Het aldus verkregen smegfp vertoonde een dual excitatiepiek rond de 395 en 490 nm en een emissiepiek rond de 510 nm. Zeer goed bruiikbare filtersets voor de Leica MZ FLIK” fluorescentie stereomicroscoop voor toepassing met smegfp volgens de uitvinding zijn bijvoorbeeld voor filterset “GFP2” een excitatiefïlter en “Barrier”-filter 15 van respectievelijk 480/40 en 510 nm en voor filterset “GFP3” een excitatiefïlter en “Barrier”-filter van respectievelijk 470/40 en 525/50 nm.

Ook het doorkweken van kolonies met dit nieuwe construct, genaamd pKG1620, van plaat naar vloeibaar medium vormde geen probleem. Het verschijnsel bij GFP-werk waarbij E.coli kolonies soms niet willen "aanslaan", wordt meestal verklaard door 20 het toxisch effect van GPF-aggregatie in de cel. De zojuist beschreven observaties kunnen dus wijzen op een verbeterd oplosbaar GFP in E.coli.

Voorbeeld 2: Expressie van efp-fusie.

In dit voorbeeld werd het gfp-gen van Voorbeeld 1, genaamd smegfp, in frame 25 gefuseerd aan het carboxy-eindstandige uiteinde van een ander open leesraam. Hierbij bleek het smEGFP ook als fusie-eiwit nog steeds goed te fluoresceren.

101 2782 25 TABEL 1

GFP l.wildtype 2.Anderso 3.Davis 4.Haseloff 5.Clontech ó.Héim 7. Heim UITV

n gfp-Gen wt -gfp g/p-Vexl smRSgfp mg/p5-ER cgfp w7 w2 smeg/p exitatie 395 (470) ~4Ö5 "49Ö 395 & 470 490 433 (453) 333 (453) 395 & (max) nm 490 emissie 5ÏÖ 51Ö ~5ÏÖ 5ÏÖ TlÖ 475 (501) 180 lïÖ (max) nm cryptisch ja ja nee nee nee ja ja nee intron _ _ _ — x 17~ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ — 'r r _ _ _ _ _ J : "v __ — _ _ _ _ — ^

"Ï53 "M T T T T

_ __ _ __ _ _ _ _ _ - _ ; : x __ _ _ _ _ _ _ __ — j _ _ ; : : “k _ — — __ — — gemod. geen geen 237-447 237-540 geheel geen geen geheel codons (b.p) a) letters geven aminozuur aan (één letter code) 5 b) alle niet aangegeven posities zijn gelijk aan het wildtype 101 2782 26 c) golflengten zijn in nm; golflengten tussen haakjes geven ondergeschikte piek aan.

d) voor alle varianten is de chromofoor S, C of T65/Y66/G67 1. Wildtype beschreven door Prasher et al., 1992 5 2. Anderson et al, 1996

3. Davis/Vierstra; extra N-terminale sequentie: MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEF (F

i.pv. Ml) / extra C-terminale sequentie: HDEL

4. Haseloff 5. Handleiding van Clontech, Ine.

10 6. Heim & Tsien, 1996 7. Heim & Tsien, 1996

Uitvinding: 1 extra aminozuur (V) na Ml.

101 2782 27 T A B E L 1 (vervolg)

GFP 8. Heim 9. 10. Mitra ll.Cormac I2.Clontec 13. Pang l4.Quantu UITV

Clontech k h m g/p-Ge n p4-l cbfp bfp g/pmut2 cyfp S65Tpg/p pQB125 sm egfp exitatie 505 (395) "38Ö ~38(j ~48Ö "5Ï3 "490 "475 395 & 490 (max) nm emissie TÏ5 ~44Ö ~44Ö TfÖ ~527 ~51Ö ÜiÖ ^ÏÖ (max) nm cryptisch nee onbek. ja nee nee ja nee intron _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ — _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ ; _ _ — _ _ __ _ _ __ ; ___ _ — : "t __ ; "a __ _ — __ _ — __

"2Ö3 T

_ ; : : ~ __ "238 "Ë n o ~ gemod. geen onbek. onbek. nee onbek. geheel 504-708 geheel codons (b.p) a) letters geven aminozuur aan (één letter code) 1012782 28 b) alle niet aangegeven posities zijn gelijk aan het wildtype c) golflengten zijn in nm; golflengten tussen haakjes geven ondergeschikte piek aan.

d) voor alle varianten is de chromofoor S, C of T65/Y66/G67 58. Heim & Tsien, 1996 9. Handleiding van Clontech 10. Mitraetal., 1996 11. Cormack et al., 12. Handleiding van Clontech 1013. Pang et al., 1996: “ST-LSl”-intron tussen baseparen 379-380 14. Handleiding van Quantum Biotechnologies; 1 extra aminozuur (V) na Ml.

Uitvinding: 1 extra aminozuur (V) na Ml.

101 2782 29

SEQUENCE LISTING

<110> Keygene N.V.

5 <120> Verbeterde gfp-variant, bruikbaar als markering, en gfp-construct <130> BO 42497 10 <140> <141> <160> 7 15 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 720 <212> DNA

20 <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sme-gfp 25 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(6) <223> inserted codon GTG compared to wild-type gfp sequence 30 <400> 1 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 35 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg aaccatctct 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca cggccgacaa gcagaagaac 480 40 gggatcaagg cgaacttcaa gactcgccac aacatcgagg acggcggcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actcatggca tggacgagct gtaccagtag 720 45

<210> 2 <211> 239 <212> PRT

<213> Artificial Sequence 50 <220> <223> Description of Artificial Sequence: sme-GFP <220>

55 <221> UNSURE

<222> (2) <223> inserted Valine compared to wild-type GFP sequence <400> 2 60 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro lie Leu 1012782 1 5.. 10 15 30

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 5

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 10 50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gin Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 15 Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gin Glu 85 .90 95

Arg Thr lie Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 20

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 25 130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gin Lys Asn 145 150 155 160 30 Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly 165 170 175

Val Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 35

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gin Ser Ala Leu 195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 40 210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly lie Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Gin 225 230 235 45

<210> 3 <211> 22 <212> PRT

50 <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: N-terminal signal sequence 55 <400> 3

Met Lys Thr Asn Leu Phe Leu Phe Leu Ile Phe Ser Leu Leu Leu Ser 15 10 15 60 Leu Ser Ser Ala Glu Phe 20 101 2782 31 <210> 4 5 <211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence <220> 10 <223> Description of Artificial Sequence: primer la <400> 4 aattcgaacc atctctttca aggacgacgg caactac 37 15

<210> 5 <211> 39 <212> DNA

<213> Artificial Sequence 20 <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer lb <400> 5 25 taggccttga tcccgttctt ctgcttgtcg gccgtgata 39

<210> 6 <211> 54 30 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 2a 35 <400> 6 catatggatc ttcgcgaact tcaagactcg ccacaacatc gagacggcgg cgtg 54 40 <210> 7

<211> 43 <212> DNA

<213> Artificial Sequence 45 <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 2b <400> 7 aacagctact ggtacagctc gtccatgcca tgagtgatcc egg 43 50 101 2782

Claims

1. Variant van het g/p-gen, dan wel nucle'mezunrsequentie of genetisch construct die/dat voor deze variant codeert, omvattende ten opzichte van de sequentie van het wild- 5 type: - ten minste één mutatie in ten minste één van de codons die coderen voor aminozuurposities 99, 153 en/of 163, zodanig dat het door het variante gen gecodeerde eiwit een verbeterde oplosbaarheid vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; 10. ten minste één mutatie in ten minste één van de codons die coderen voor aminozuurposities 65, 66 en/of 67, zodanig dat het excitatiespectrum van het door het variante gen gecodeerde eiwit verschoven wordt naar het rode of blauwe uiteinde van het spectrum, vergeleken met het wildtype GFP; - ten minste één mutatie in ten minste een van de codons die coderen voor 15 aminozuurposities 163,167 en/of 175, zodanig dat het door het variante gen gecodeerde eiwit verbeterde "dual excitatiori'-karakteristieken vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; en bij voorkeur tevens - ten minste één mutatie in het codon dat codeert voor aminozuurpositie 64, zodanig dat het door het variante gen gecodeerde eiwit een versterkte fluorescentie vertoont, 20 vergeleken met het wildtype GFP; en hiermee equivalente of hieraan analoge sequenties, alsmede fragmenten hiervan.

2. Variant, nucleïnezuursequentie of genetisch construct volgens conclusie 1, omvattende, ten opzichte van de sequentie van het wild-type: 25. ten minste één mutatie in ieder van de codons die coderen voor aminozuurposities 99, 153 en/of 163, zodanig dat gecodeerde eiwit een verbeterde oplosbaarheid vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; - ten minste één mutatie in ten minste een van de codons die coderen voor aminozuurposities 65,66 en/of 67, en bij voorkeur in het codon dat codeert voor 30 aminozuurpositie 65, zodanig dat het excitatiespectrum van het gecodeerde eiwit verschoven wordt naar het rode uiteinde van het spectrum, vergeleken met het wildtype GFP; 1012782 - ten minste één mutatie in ieder van de codons die coderen voor aminozuurposities 163,167 en/of 175, zodanig dat het gecodeerde eiwit verbeterde "dual excitation"-karakteristieken vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; en - ten minste één mutatie in het codon dat codeert voor aminozuurpositie 64, zodanig 5 dat het gecodeerde eiwit een versterkte fluorescentie vertoont, vergeleken met het wildtype GFP; en hiermee equivalente of hieraan analoge sequenties, alsmede fragmenten hiervan.

3. Variant, nucleïnezuursequentie of genetisch construct volgens conclusie 1 of 10 2, waarbij de mutaties op posities 65,66 en/of 67 verder zodanig zijn, dat het gecodeerde eiwit tevens een versterkte fluorescentie (d.w.z. emissie) vertoont, vergeleken met het wildtype GFP, in het bijzonder bij golflengten tussen 450 en 550 nm.

4. Variant, nucleïnezuursequentie of genetisch construct volgens een der conclusies 1-3, waarbij de mutaties in de codons op posities 64, 65, 99, 153,163,167 en 175 een of meer substitities van een of meer nucleotiden omvatten, zodanig dat het mutante codon codeert voor een ander aminozuur als aanwezig op de betreffende positie in het wildtype GFP. 20

5. Variant, nucleïnezuursequentie of genetisch construct volgens een der conclusies 1-4, waarbij de mutaties coderen voor de volgende aminozuursubstituties, ten opzichte van het wildtype: 25 101 2782 Aminozuurpositie Wild-type Variant volgens de uitvinding ~64 F L of M

65. C, T, G of A 66 67

99. S

153. Tof A

163. A

167. T

175. G

6. Nucleïnezuursequentie of genetisch construct volgens een der conclusies 1-5, verder omvattende een of meer op zichzelf bekende elementen van 5 nucleïnezuursequenties of genetische constructen, zoals promoters of andere regelelementen, enhancers, integratiefactoren, signaalsequenties, en dergelijke.

7. Nucleïnezuursequentie of genetisch construct volgens een der conclusies 1-6, verder omvattende ten minste een verdere sequentie die codeert voor een gen, een 10 gewenste eigenschap, een eiwit of een polypeptide, waarbij het eiwit of polypeptide eventueel als een fusie met de ^-variant volgens de uitvinding tot expressie wordt gebracht.

8. Variant van het GFP-eiwit, zoals gecodeerd door een gfp-variant volgens een der 15 conclusies 1-7, of zoals verkrijgbaar door expressie van een nucleïnezuursequentie of genetisch construct volgens een der conclusies 1-7.

9. Toepassing van een gfp-variant, een nucleïnezuursequentie of een genetisch construct volgens een conclusies 1-7, en/of van een variant van het GFP-eiwit volgens 20 conclusie 8, als een label of markering in (micro)biologische, biochemische en/of moleculair biologische technieken. 1012782

10. Toepassing van een g/p-variant, een nucleïnezuursequentie of een genetisch construct volgens een conclusies 1-7, en/of een variant van het GFP-eiwit volgens conclusie 8, als een genetische markering of expressiemarkering in vivo, in het bijzonder in planten, mensen, dieren of in cellen of weefsels hiervan, of in hiervan afgeleide 5 cellijnen.

11. Toepassing volgens conclusie 10, omvattende het transformeren van een gastheerorganisme of een cel, deel of weefsel ervan, met een nucleïnezuursequentie volgens een der conclusies 1-7; en/of omvattende het tot expressie laten komen in het 10 gastheerorganisme van een gjp-variant volgens een der conclusie 1 -7.

12. Organisme, zoals een plant, een dier, een mens, een bacterie, een alg, een gist(cel) of een ander micro-organismen, alsmede weefsels of cellen van deze organismen, of hiervan afgeleide cellijnen, die een sequentie of construct volgens een der conclusies 1- 15. omvatten, en/of een GFP-variant volgens conclusie 8 tot expressie brengen. 1012782